aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1

VirologiaAno Lectivo 2010/11

Técnicas DiagnósticoVirologia – Parte I

Testes imunológicos

Baseiam-se em reacções antigénio-anticorpo:

Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante

a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar

especificamente a um epítopo de um antigénio.

Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de

induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar

através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 2

Anticorpo

Cadeias de glicoproteícas :

Cadeias leves

Cadeias pesadas

Região constante – local de activaçãode outros elementos dos S. Imune;

Região variável – local de ligação aoantigénio

Anticorpo

Tipos de anticorpos

PoliclonaisObtidos a partir de diferentesclones de células;

MonoclonaisObtidos a partir de um únicoclone de plasmócitos

Classes de anticorpos no Homem

Imunoglobulinas Características

IgG Principal Ig séricaEnvolvida na activação do complemento e na opsonisação

IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda)Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados

IgA Presente no soro, secreções e mucosasTem funções de opsonização.

IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando comoreceptor de antigénios.Funções pouco definidas.

IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos eeosinófilos.Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.

Antigénio

Epítopo

Região do antigénio que reage com o anticorpo

Possibilidade de reacções cruzadas

Pequenas alterações na estrutura do antigénio,

entre outras factores, podem afectar

profundamente a ligação com o anticorpo

Aplicabilidade

Papel importante:

Tipo de amostra varia consoante o

que estamos a pesquisar

Diagnóstico

Monitorização

Tratamento

Técnicas de Imunologia

Reacções Imunoenzimáticas

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)

ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)

Imunoflurescência

Imunocromatografia

ImunoHisto/Citoquímica

Análise Proteínas: Western Blot

Reacções Imunoenzimáticas

Permite determinar a concentraçãodo analito

Calcular curva de calibração –interpolar a concentração damolécula a quantificar

Baseia-se numa reacção imunoenzimatica com detecção final emespectrofotometria

Tipos de ELISA

Sandwich

1. Poços revestidos com anticorpo especifico

2. Formação de complexos

3. Ac Secundário (conjugado com a enzima)

4. Adição do substrato

5. Medição por espectofotometria

Tipos de ELISA

Indirecto

1. Poços revestidos com antigénio especifico

2. Formação de complexos

3. Ac conjugado com enzima

Tipos de ELISA

Competitivo

1. Ac especificos incubam com a amostra

2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag

3. Ac secundário

Quantomaior aconcentração de analitomenor aabsorvância

Método automatizado

Permite fazer um análise quantitativa

Curva de calibração

Reacção imunoenzimatica com detecção final em fluorescência.

Teste, geralmente, automatizado onde é

necessário:

Um cone sensibilizado com Ag,

serve, tanto de fase sólida como

sistema de pipetagem

Uma barrete que contem os

reagentes necessários para a

realização da técnica

Imunoflurescência

Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos

O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência

A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência

Fluorocromos mais usados

Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC)

Rodamina

Imunoflurescência

Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi-

quantitativa

Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.

Tipos de Imunoflourecênca

Directa

Indirecta

Anti-complemento

Imunoflurescência Indirecta

Etapas

▫ Fixação (quando queremos

pesquisar Ac as laminas vêm

revestidas com o respectivo Ag);

▫ Ac primário

▫ Ac Secundário (marcado com um

fluorocromo);

▫ Reagente de contraste

Imunofluorescência anti-complemento

Etapas

▫ Inactivação do complemento endógeno

▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo

▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado

▫ Ac conjugado que se liga ao complemento

▫ Detecção por microscopia de fluorescência

Imunofluorescência

Resultados

Permite localizar o analito

EX: Membrana celular

Análise com o corante de contraste

Imunofluorescência

Resultados

Pesquisa de anticorpos: resultado positivo

(fluorescência verde)

Pesquisa de anticorpos: resultado negativo

Imunocromatografia

Teste qualitativo

Detecção antigénios virais ou anticorpos

Rápido e simples

Fase móvel: amostra diluida

Fase sólida: membrana revestida

Imunocromatografia

Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C

Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex

Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveisdevido às partículas de látex

Imunologia e citologia ou histologia

Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais,proteínas)

Diferenças de expressão de proteínas

Localização celular do antigénio

Método qualitativo (maior parte dos casos)

Quantificação relativa

Método directo

Ac primário marcado enzimaticamente reage directamentecom o antigénio

Método Indirecto

Ac primário que se liga ao antigénio

Ac secundário marcado enzimaticamente

Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)

Principio do método

PO+ H2O2+ Dador de electrões PO+ H2O2+ precipitado

Passos importantes

Fixação (sol. Alcoólica)

Permeabilizar (detergente)

Ac primário

Ac secundário conjugado

Substrato com agente cromogénio

Corante de contraste

Imunohistoquímica

Imunocitoquímica

Análise Proteínas

Western Blot

SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

Western Blot

Blotting

Western Blot

Detecção

1. Bloqueio da

membrana

2. Ac primário

3. Ac secundário

conjugado

4. Detecção

Western Blot

Aplicação

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