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Aula de enzimologia
Tema Estratégias de purificação de
enzimas
Prof. Adriane M. F. MilagresDepartamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo – USPadriane@debiq.eel.usp.br
CONTEÚDO:
1. Extração da enzima (intra ou extracelular)2. Clarificação do meio3. Concentração 4. Métodos cromatográficos5. Critério de Pureza
tecidos
células
Homogeneização (para romper tecidos e células)
por pressão(prensa francesa)
liquefação(Potter)
Homogenadoou
Extrato bruto
Material de partida
Material na fonte
por ultra-som comdetergente
Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.
Extração de enzimas intracelulares
Proteínas de membrana
,.
Proteínas integrais da membrana
detergente micelas
Complexos não micelares
Dependendo da concentração
Detergentes não iônicos
Triton X-100(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
SDSDodecil sulfato de
sódio
CetabCetyltrimethylammonium
bromide
Detergentes iônicos
Octilglicosídeo(octyl-b-D-glucopyranoside)
Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (fase reversa)
Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
Propriedades das proteínas e seu efeito no desenvolvimento de estratégias de purificação
Alguns procedimentos de purificação devem incluir uma etapa prévia de remoção de cor dos extratos.
Cor pode ser devida à produção de pigmentos pelos microrganismos ou pela presença de substratos complexos usados no meio de crescimento (lignocelulósicos, efluentes, etc.)
Substâncias responsáveis da cor podem ligar-se fortemente às proteínasdificultando sua separação e diminuindo sua atividade
Remoçao da cor por adsorção: DEAE-celulose
PVP (Polivinilpirrolidona)Carvão ativado
Remoção de cor dos extratos
Estrutura do PVPP Adsorção de catequinas a PVPP
Carvao ativado
1) Precipitação
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:- adição de sais (Precipitação salina)- adição de solventes- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
Solu
bilid
ade
da h
emog
lobi
na (S
/S’)
KCl
NaCl
MgSO4
(NH4)2SO4
K2SO4
Concentração do Sal,, Molar
Salting-in X Salting-out
Métodos de concentração de proteínas
Solu
bilid
ade,
log
Fibrinogênio Pseudoglobulina
MioglobinaAlbumina
Hemoglobina
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar
Sais se dissociam em solucão aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.
Proteínas apresentam diferente sensibilidade para a precipitação salina.
- precipitam primeiro: proteínas maiores proteínas mais hidrofóbicas
possuem camadas de solvatação maiores ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar.
Precipitação com Sulfato de amônio
Porcentagem de Saturação = concentração do sal em solução como uma porcentagem da concentração máxima possível a uma dada temperatura
Vol específico = volume ocupado por 1 g de sal (ml/g)= recíproco da densidade
Ex. O volume específico do sulfato de amonio sólido é 0,565 ml/g. A sua solubilidade a 0oC é 706 g/1000 g água.
Calcular a) concentração de sulfato de amonio numa solução saturada a 0oC:
a) 1000 + (706) (0,565) ml = 1399 ml 706g/1399 ml = 505 g/l 505/ 132,14 = 3,82 M
b) quantidade de sulfato de amônio sólido que deve ser adicionado a 0oC a 560 ml de uma solução 40% saturada para levá-la a 60% de saturação?
Podemos deduzir uma equação simples que dará a quantidade de sulfato de amônio que deverá ser adicionado a 1000 ml de solução
0,505 g/ml = 100% de saturação (ou 1)
S2= (massa inicial de sulf. Amonio) + (massa de sulf amonio adic.) (vol final ) (0,505 g/ml)
S2 = (1000 ml). (0,505 g/ml).S1 + m.S2 [(1000ml + 0,565ml/g . (m) ]. 0.505 g/ml
S2 = 505.S1 + mS2 505 + 0,285m
S2.505 + 0,285S2m = 505S1 + mS2
Precipitação fracionada
m = (S2 – S1)505 1- 0,285
Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
Membrana de celofane
solvente
solução a ser dialisada
Aos precipitados obtidos com sal ou solvente, adiciona-se água.
Ao precipitado obtido com variação de pH, retornar ao pH original.
início finalt
2) Precipitação com solvente orgânicoAcetona, etanol, metanol, n-propanol, dioxano, etc.
•Tamanho da molécula• pI
enzima microrganismo solvente Recuperação (%)
Fator de Purificação
Referencia
Alfa-amilase Bacillus subtillis
Acetona 90 5,4 El-Hellow e El-Gazaerly,
1996Metanol 62 5,4
etanol 83 5,2xilanase Trichoderma
harzianum E-58acetona 55 - Tan et al,
1987
Aspergillus terreus
acetona 17 3,7 Rogalsky et al. 1983
% etanol = V etanol x 100................ Vtampao + Vamostra + Vetanol
Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a
camada de solvatação das proteínas.
Água DimetilformamidaMetanolEtanolAcetonaClorofórmioBenzeno
78.5 1.8548.9 3.9632.6 1.6624.3 1.6820.7 2.724.8 1.152.3 0.00
Solvente ConstanteDielétrica
MomentoDipolar
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico.
Proteína P.I.Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam a camada de solvatação menos organizada.
MÉTODO PRINCIPIO COMENTARIO
Precipitação por força iônica “salting out”,com sais inorgânicos(Sulfato de amônio)
Diminuição da solubilidade das proteínas, alteração da solvatação
Inclue etapas sucessivas de precipitação e centrifugação (elevadas velocidades)
Precipitação por solventes orgânicos(Acetona, TCA)
Incremento nas forças de atração entre as proteínas
Rendimento pode ser baixo, caso nao sejam mantidas temperaturas muito baixas (-10oC)
Liofilização Congelação seguida de sublimação a alto vácuo
Método muito utilizado com amostras biológicas que podem ser inativadas em altas To. Amostras devem ter baixos conteúdos de sáis
UltrafiltraçãoRemoção de pequenas partículas sob pressão através de membranas de cortes específicos
Método rápido, que além de concentrar permite separar frações de diferente MM
Métodos de concentração de proteínas
Purificação por cromatografiaTIPO PRINCIPIOEXCLUSÃO MOLECULAROU FILTRAÇÃO EM GEL
Separação física das proteínas em função do tamanho molecularTécnica permite determinar Massa Molar das proteínas estudadas
TROCA IÔNICA Separação das proteínas em função da sua carga. Através de interações eletrostáticas as proteínas se ligam em forma reversível a um suporte cargado
AFINIDADE Separação de proteínas em função das propriedades de afinidade da proteína de interesse por um ligante específico unido à faseestacionaria da coluna
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)FPLC (Fast Protein LiquidChromatography)
Técnicas que utilizam os principios já descritos, porém com uma elevada eficiencia de separação em reduzidos períodos de tempo. Aparelhos utilizados sao automáticos e colunas podem ser re-utilizadas
C
once
ntra
ção
Tempo ou volume
Coletor de frações
FUNCIONAMENTO BÁSICO DE UMA COLUNA CROMATOGRÁFICA
Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada
com a resina, com base em propriedades moleculares como:
• massa molecular• carga elétrica• solubilidade• afinidade
CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL
PROPRIEDADES IMPORTANTESLimite de Exclusão Moléculas pequenas não podem difundir no interior dogel Moléculas > ao limiteeluiram rapidamente do gelEx: Sephadex G-50Limite de exclusao = 30.000Moléculas com MM > 30.000eluiram diretamente sem entrarnas partículas do gel
Faixa de SeparaçãoSephadex G-50 faixa de : 1.500-30.000Moléculas dentro dessa faixaserão separadas neste gel
Volume de VazioEspaço total que rodeia as partículas do gel na coluna empacotada que é determinado através do volume de solvente requerido para eluir um soluto que é completamente excluído daColunaEx.: Blue Dextran (MM= 2.000.000)
Abs
orbâ
ncia
a 2
80 n
m
volume
Med
ida
da a
tiv. b
ioló
gica
Moléculas maiores
Moléculas menores
Kav
Mas
sa m
olec
ular
(kD
)
20 40 60 80 100 120 mL
25 50 75 100 125 mL volume de eluição
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molar.
Curva de calibração
traçado da medida de atividade biológica nas frações
Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao.
Ler a massa correspondente
Observar a
escala log
Resinas para Gel-Filtração
Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70Sephadex G-25 Dextrana 1 - 5Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600
Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1 - 6Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400
Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000
NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO(kD)
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories
Moléculas pequenas
Moléculas pequenas
Proteínas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas
indica quais os tamanhos das partículas que podem entrar nos poros da resina e serem fracionados. Acima ou abaixo da faixa, não há separação.
Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr.
Kav = Ve-Vo Vt-Vo
Ve – volume de eluição de uma certa proteínaVt – volume total da colunaVo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com massa acima da resolução da resina
onde:
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA
PROPRIEDADES
- As colunas de troca iônica podem apresentar carga (+) ou (-) segundoo grupo funcional ligado à matrizda colunaDEAE-Celulose : dietilaminoetilCM-Celulose : carboximetil
- Resina aniônica (+) : troca anions- Resina cationica (-) : troca cátions- Resinas trocadoras podem ser fortes ou fracas
- Proteína ligada reversivelmentena resina pode ser eluida da colunapor aumento da força ionica ou mudanças no pH
- Método de eluição mais utilizado é o gradiente de NaCl Logo da eluição a proteína de interesse encontra-se purificada e concentrada
- Para escolher o tipo de resina, anionica ou cationica, deve se considerar o pI da proteína de interesse
- Para proteínas com um pI inferior a 7 ou desconhecido recomenda-se a utilizaçao de um trocador aniônico forte
Tipos de Resina de troca Iônica
Tipos de Resina de troca Iônica
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕESDowex 1 Fortemente básica Ø - CH2N+(CH3)3 Troca aniônica
resina de polistirenoDowex 50 Fortemente básica Ø - SO3
-H Troca Catiônicaresina de polistireno
DEAE-celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas - CH2CH2N+(C2H5)2 ácidas e neutras
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas - CH2COOH básicas e neutras
DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração básico - CH2CH2N+(C2H5)2 e troca iônica de proteínas
ácidas e neutrasCM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração
ácido - CH2COOH e troca iônica de proteínas básicas e neutras
* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio- Gel: Bio Rad Laboratories
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre (imidazol)
IMAC - Cromatografia de afinidade com metal imobilizado
•interação entre as proteínas e os ions metálicos imobilizados num suporte sólido. •suportes contendo ions de Cu2+ ,Ni2+ , Zn2+ ou Co2+ são apropriados para o fracionamento de proteínas com base no seu conteúdo relativo de resíduos de histidina, cisteína, cadeias laterais aromáticas de aminoácidos e de grupos N-terminal acessíveis de aminoácidos. • cauda de his
Ligante grupo-específico
Especificidade
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina
heparina Fatores de coagulação, lipases, hormônios, receptores estoróides, etc
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos de His expostos
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo- análogos de substratos ou inibidores de enzimas- agonistas ou antagonistas de receptores- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
3 passos cromatográficos consecutivos usados para purificar uma proteína. Em A, resultados de uma coluna de troca iônica; B, Filtração em gel e C, Cromatografia de afinidade.
Cromatografia de interação hidrofóbica
É um processo de partição que explora a interação entre aminoácidos apolares de uma proteína e uma matriz de caráter hidrofóbico.
Proteínas em solução salina concentrada “perdem” parte da camada de solvatação para os sais, expondo na superfície regiões ricas em aminoácidos apolares, que interagem com uma matriz hidrofóbica
Três estratégias para eluição:
1. diminuir a concentração de sal2. diminuir a polaridade da fase móvel3. adicionar detergente
Força da interação hidrofóbica aumenta com o tamanho da cadeia de C na resina:
Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8)
PProteína altamente hidrofílica
PProteína menos hidrofílica
camada de H2O
solvatação
Hmatriz hidrofóbica
volume
[Pro
teín
a]
[sal]
Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é
inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces- sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade).
Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse.
CARATERIZAÇÃO DAS FRAÇÕES ELUIDAS DAS COLUNASCROMATOGRÁFICAS
Quantificação de proteinas nos volumes eluidos das colunas por espectrofotometria Leitura da Abs em 280 nm (UV), rápido e simples
Determinação das atividades enzimáticas nas frações que apresentam proteína (Abs280nm) são determinadas as atividades enzimáticas de interesse
Algumas proteinas apresentam propriedades espectrais caracteristicas que permitem seu seguimento durante a cromatografia Peroxidases : Banda Soret (Abs em 406-409 nm) Lacases : Abs em 600 nm (cor azul)
TABELA DE PURIFICAÇÃO
ETAPA ATIVIDADE(UI)
PROTEÍNA (mg)
A.E.(U/mg)
RENDIM.(%)
PURIFICAÇÂO (Vezes)
Extrato Inicial
5.300 295 18 100 1
Precipitação(Acetona)
5.215 183 29 99 1.6
DEAE-Sepharose
3.281 55 59 62 3.3
Sephacryl S-200 HR
3.021 45 67 57 3.7
Mono S 1.708 6.6 259 32 14.5
TÉCNICA UTILIZADA COMO CRITÉRIO DE PUREZATÉCNICA UTILIZADA COMO CRITÉRIO DE PUREZA
ELETROFORESEELETROFORESE
A eletroforese é uma técnica relativamente simples e rápida e de alto valor informativo, que consiste na migração de molécula ionizadas de acordo com suas cargas elétricas e massa molar, submetidas a um campo elétrico
- O suporte mais utilizado para conduzir a eletroforese é o gel de poliacrilamida, em condições nativas (PAGE) e desnaturantes
(SDS-PAGE)
- Sistema SDS-PAGE serve para a determinação da massa molar das proteínas presentes em uma amostra
H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- Sódio dodecil sulfato
Desnaturação de proteínas por SDS
A porção hidrocarboneto do detergente interage com as
regiões hidrofóbicas da proteína, dispondo o grupo sulfato
carregado na superfície, em contacto com o meio aquoso. A
repulsão entre os grupos fosfato desestabiliza os laços não covalentes que mantém a estrutura 3D da proteína,
desnaturando-a.
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
O desenho ao lado mostra o tipo mais comum de cuba para PAGE. Na cuba, o gel é polimerizado entre duas placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm uma da outra.
catodo
anodo
tampão
Poços para as amostras
amostra
Placas de vidro
1 mm
tampão
gel
- O SISTEMA PAGE É USADO PARA A ANÁLISE DO PADRÃO DE PROTEÍNAS NATIVAS PRESENTES NUMA AMOSTRA
A quantidade de bandas que aparecem no gel é um indicativo da pureza de uma amostra
SDS-PAGE- permite determinar a massa molecular de proteínas
Mobilidade relativa
Mas
sa m
olec
ular
(kD
)
Mobilidade relativa =
distância percorrida pela banda Xdistância percorrida pelo marcador da corrida
97.4
87.0
45.0
29.0
21.012.5 6.5
(-)
(+)
Curva de calibração de SDS-PAGE Proteínas padrões em um SDS-PAGE
Mr
Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE)
• 1975 - surge a 2D-PAGE . Trabalhos de O´Farrel; Klose ; MacGillivray et al.
Etapas Básicas: 1- Focalização Isoelétrica (IEF)
2-Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
2D-PAGE: etapas principais
• Preparação da amostra• Focalização Isoelétrica• SDS-PAGE • Detecção• Digitalização e análise de imagem
Material para leitura:
1. Purificação de Produtos Biotecnológicos , Editora Manole, Adalberto Pessoa Jr, Beatriz Kilikian (coordenadores) .
2. Eletroforese de isoenzimas e proteínas afins; fundamentos e aplicações em plantas e microrganismos – Acelino Couto Alfenas, 1998, 574p.
Terminamos aqui a aula de purificação do curso de Enzimologia
Na aula prática, vocês terão oportunidade de ver alguns tipos de cromatografia funcionando.
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