aislamiento, identificaciÓn y evaluaciÓn de la …

34
BIBLIOTECA DE POSGRADO - UNT UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSGRADO UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Aislamiento, identificación y evaluación de la resistencia antimicrobiana de Escherichia coli en pollos de engorde. Piura 2017 TESIS PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE: MAESTRO EN CIENCIAS MENCIÓN: PRODUCCIÓN Y SANIDAD ANIMAL Autor: Br. Chiara Vilchez, Fernando Ernesto Asesor: Dr. Saavedra Sarmiento, Heraclides Hugo TRUJILLO PERÚ 2019 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Upload: others

Post on 29-Jul-2022

9 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POSGRADO

UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS AGROPECUARIAS

Aislamiento, identificación y evaluación de la resistencia

antimicrobiana de Escherichia coli en pollos de

engorde. Piura 2017

TESIS

PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS

MENCIÓN:

PRODUCCIÓN Y SANIDAD ANIMAL

Autor: Br. Chiara Vilchez, Fernando Ernesto

Asesor: Dr. Saavedra Sarmiento, Heraclides Hugo

TRUJILLO –PERÚ

2019

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 2: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

ii

JURADO DICTAMINADOR

__________________________________

Dr. Pablo Javier Morachimo Borrego

PRESIDENTE

__________________________________

Ms. Mario Attilio Narro Saldaña

SECRETARIO

_____________________________________

Dr. Hugo Heraclides Saavedra Sarmiento

ASESOR

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 3: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

iii

DEDICATORIA

A Dios por darme salud, sabiduria y fortaleza.

A mis padres, por ser mi motivación.

A mis hermanos por su constante apoyo.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 4: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

iv

AGRADECIMIENTO

A mi asesor de tesis Dr. Hugo Heraclides Saavedra Sarmiento por su apoyo

incondicional y por ser guía en la realización de la tesis.

A mi mejor amiga, la Dra. Julia Celis Moreno por la constante motivación en mi vida

profesional.

A mis compañeros de la Empresa Chimu Agropecuaria S.A. que contribuyeron de

alguna forma a la realización de esta tesis.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 5: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

v

INDICE

DEDICATORIA ................................................................................................................... iii

AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... iv

ÍNDICE .................................................................................................................................. v

RESUMEN ........................................................................................................................... vi

ABSTRACT ........................................................................................................................ vii

I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1

II. MATERIALES Y METODOS..................................................................................... 12

III. RESULTADOS ............................................................................................................ 19

IV. DISCUSION ................................................................................................................. 22

V. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 24

VI. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 25

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ....................................................................... 26

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 6: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

vi

RESUMEN

El presente estudio tiene como objetivo aislar e identificar Escherichia coli en

lesiones de órganos internos en pollos de engorde, para evaluar su resistencia a los

antimicrobianos. Para lo cual se determinaron casos de Colibacilosis en base a los signos

clínicos en un total de 50 pollos. Se realizaron necropsias a los pollos seleccionados, y se

hizo hisopado del saco aéreo afectado, ya que la de la lesión encontrada en todos los casos

fue aerosaculitis y se introdujo el hisopo en un tubo de ensayo estéril conteniendo caldo

lactosado e incubado por 24 horas a 37°C. Luego el caldo fue sembrado en medio de cultivo

Agar VRB por 24 horas a 37°C, obteniendo como resultado que el 100 % de las muestras

fueron identificadas como colonias de Escherichia coli. Se tomó cada colonia y fue diluida

en un tubo de ensayo conteniendo cloruro de sodio, la suspensión fue cultivada en agar

Muller Hinton, se utilizaron discos de antibióticos de Sulfatrimetoprim 29 μg, Amoxicilina

25 μg, Oxitetraciclina 30μg, Enrofloxacina 5 μg. Doxiciclina 80 μg, y las placas fueron

cultivadas por 24 horas a 37°C. Basándose en el tamaño del halo de inhibición de

crecimiento de la cepa se determinó que las cepas aisladas de Escherichia coli tienen una

resistencia a 2 antimicrobianos de uso frecuente en la terapia como son la oxitetraciclina en

un 54% y doxicliclina en un 12 % del total de muestras; sólo el 24 % de las muestras mostró

una sensibilidad intermedia a la doxiciclina. El 100 % de las muestras mostraron una

sensibilidad a sulfatrimetoprim, amoxicilina y enrofloxacina, los cuales son los antibióticos

más eficaces para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por Escherichia coli en

pollos de engorde de la provincia de Piura.

PALABRAS CLAVES:

Antimicrobiano, cultivo, cepa, Escherichia coli, aerosaculitis, pollo

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 7: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

vii

ABSTRACT

The present study aims to isolate and identify Escherichia coli from internal organ lesions

in broilers to assess its resistance to antimicrobials. For this aim, cases of Colibacillosis were

determined based on clinical signs in a total of 50 broilers. Necropsies were performed on

the selected chickens, and swab samples were taken from the air sack because airsacculitis

was the common finding in all cases. Each swab was placed in a sterile test tube containing

lactose broth and incubated for 24 hours at 37 ° C, then plated in VRB Agar culture medium

for 24 hours at 37 ° C. 100% of the samples were identified as colonies of Escherichia coli,

then each colony was taken from the plate and diluted in a test tube containing sodium

chloride. This suspension was plated in Muller Hinton agar with antibiotic discs of

Sulfatrimethoprim 29 μg, Amoxicillin 25 μg, Oxytetracycline 30 μg, Enrofloxacin 5 μg and

Doxycycline 80 μg. The plates were cultured for 24 hours at 37 ° C. Based on the size of the

zone of inhibition it was determined that the isolated strains of Escherichia coli are resistant

to two antimicrobials frequently used in therapy: oxytetracycline (54%) and doxycycline

(12%), doxycycline (24%) shown intermediate sensitivity. Sulfatrimethoprim, amoxicillin

and enrofloxacin, shown a sensitivity of 100%, which indicate that these are the most

sensitive antibiotics for the treatment of bacterial infections caused by Escherichia coli in

broilers in the province of Piura.

KEYWORDS:

Antimicrobial, culture, strain, Escherichia coli, airsacculitis, broilers

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 8: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

1

I. INTRODUCCIÓN

La avicultura en el Perú es una de las actividades pecuarias con mayor crecimiento en la

última década. En la provincia de Piura hay una crianza de 1 233 000 pollos de carne al

mes (MINAGRI 2017). Si bien se presenta un crecimiento sostenido de la producción,

aún se tienen limitaciones principalmente del tipo sanitario, ocasionando grandes

pérdidas económicas. Dentro de los patógenos bacterianos de mayor importancia se

encuentra Escherichia coli, causante de la colibacilosis aviar.

La colibacilosis es un síndrome complejo caracterizado por lesiones multiorgánicas, tales

como aerosaculitis asociada a pericarditis, perihepatitis y peritonitis, que resulta en alta

morbilidad y mortalidad (Jansen et al., 2003). Este síndrome, causado por cepas

patogénicas de Escherichia coli, puede presentarse tanto de forma local como sistémica

(Barnes et al., 2008). Escherichia coli, es un habitante natural del tracto intestinal de las

aves, pero algunos serotipos pueden tornarse patógenos debido a la presencia de algunos

factores predisponentes (Apolo 2015).

Se sabe que la colibacilosis aviar es una enfermedad secundaria y que el agente etiológico

es un oportunista; sin embargo, nuevas evidencias sugieren que cepas patogénicas pueden

actuar como agentes primarios y producir la enfermedad (Ewers et al., 2003;

Kariyawasam et al., 2006; Barnes et al., 2008).

En medicina veterinaria, es una práctica habitual el uso de antimicrobianos para la

prevención, control y tratamiento de enfermedades infecciosas. También su uso ha sido

extendido como promotores del crecimiento en aves.

La resistencia de los patógenos a los antibióticos es un grave problema que enfrenta la

avicultura en la actualidad; por lo tanto, conocer el patógeno será la base principal en la

lucha contra esta afección ya que permitirá utilizar el antibiótico correcto respetando los

tiempos de retiro.

Ante la evidencia que el principal agente microbiano de enfermedad bacteriana en pollos

de engorde es Escherichia coli, el objetivo del presente estudio fue aislar, identificar y

evaluar la resistencia antimicrobiana de Escherichia coli en pollos de engorde de la

provincia de Piura.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 9: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

2

1.1.Colibacilosis

La colibacilosis aviar es una enfermedad infecciosa ocasionada por Escherichia coli. La

importancia de la colibacilosis en animales radica en las grandes pérdidas económicas

que se generan debido a la disminución de determinados parámetros productivos, pérdida

de peso, aumento en los índices de conversión y de la mortalidad y por los elevados

costos de los tratamientos (Blanco et al., 2002).

La mayor parte de los cuadros clínicos de colibacilosis son de origen respiratorio, aunque

no se descarta que algunos sucedan al atravesar las bacterias la pared intestinal (Blanco

et al., 2002). La colibacilosis suele ser considerada como una enfermedad secundaria

(Barnes et al., 2003).

1.1.1. Agente causal

Escherichia coli (E. coli) es la especie tipo del género Escherichia. Que pertenece al

Filum Proteobacteria, en la Clase Gammaproteobacteria, Orden Enterobacteriales,

incluido en la Familia Enterobacteriaceae. cuyas características generales son las

siguientes (Blanco et al., 2002),

Bacilos Gram negativos, catalasa positivos y oxidasa negativos.

No formadores de esporas.

Anaerobios facultativos, con un amplio rango de temperatura de incubación.

Inmóviles o móviles mediante flagelos perítricos.

Necesidades nutricionales sencillas.

El criterio que se ha utilizado durante muchos años para diferenciar los E. coli

patógenos de los comensales, ha sido la determinación del antígeno somático, pero

ha sido necesario conocer la fórmula antigénica completa, así como la determinación

de otras características de virulencia, para considerar a una cepa como patógena. Las

cepas patógenas de E. coli se engloban en diferentes grupos o categorías, con unas

características y mecanismos de virulencia determinados que actúan conjuntamente

para potenciar su patogenicidad, produciendo infecciones y síndromes diferentes.

(Blanco et al., 2002)

1.1.2. Antecedentes

Desde finales del siglo pasado se conoce la capacidad de E. coli de producir

enfermedades en las aves domésticas. En 1885, Theodor Escherich consiguió aislar

E.coli en muestras clínicas humanas, denominándolo inicialmente como Bacterium

coli commune (Blanco et al., 2002)

En 1894, Lignieres describió una enfermedad en gallinas causada por E. coli y se

confirmó, mediante estudios in vivo, su patogenicidad en las aves. En 1897 se

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 10: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

3

detectan casos de pericarditis en pollos y pavos, con aislamientos de E. coli en

algunos casos. Claussen, en 1907, concluyó que en determinadas condiciones E. coli

podría atravesar la pared intestinal, adquiriendo factores que le confirieran virulencia

y causar septicemias en gallinas (Sojka et al., 1961). Esto ocurría especialmente

cuando las defensas del animal disminuían como consecuencia de enfermedades,

situaciones de hambre, sed, frío, malas condiciones de ventilación, etc. Es decir, ya

se puntualizaba sobre la importancia de las medidas de bioseguridad deficientes y los

factores predisponentes en el desarrollo de la colibacilosis (Blanco et al., 2002).

En 1947, Kauffmann propone una forma de diferenciar las cepas de E. coli en base a

la determinación de los antígenos de superficie. Esta forma de clasificación resultó

muy útil en los estudios epidemiológicos y de patogénesis de E. coli, facilitando la

diferenciación entre cepas virulentas e inocuas. Estudios realizados pusieron de

manifiesto la importancia de determinados serotipos (O1, O2 y O78) en la virulencia

de las cepas aviares. Sin embargo, la elevada diversidad de serotipos implicados en

los cuadros clínicos de colibacilosis ha hecho necesario el desarrollo de nuevas

técnicas que indiquen el grado de virulencia de las cepas, mediante la determinación

de genes de virulencia. La virulencia designa el carácter patogénico de un

microorganismo, es decir, su capacidad de causar enfermedad. (Blanco et al., 2002)

Estudios realizados en la década de 1980 sobre los mecanismos de patogenicidad de

E. coli confirman la teoría en la se defiende que aquellas cepas del microbiota normal

intestinal que presenten determinados factores de virulencia serían las responsables

de provocar enfermedad (Morris et al., 1985; Blanco et al., 1991). Hasta mediados

de la década de 1990, la gran mayoría de los estudios sobre colibacilosis se centraban

en la producción de broilers (producción avícola de carne). A pesar de la importancia

de la enfermedad, se desconocen muchos de los mecanismos de virulencia de las

cepas aviares de E. coli. En años recientes se han descubierto varios genes implicados

en mecanismos de virulencia de la bacteria, adquiriendo los E. coli patógenos aviares

la denominación específica de APEC, Avian Pathogenic Escherichia coli. (Blanco et

al., 2002)

Brito y col (2011) realizaron un estudio en Brasil sobre resistencia antimicrobiana y

patogenicidad de muestras de Escherichia coli aisladas de lesiones de celulitis en

pollos, donde verificaron la resistencia antimicrobiana y la patogenicidad de 48

muestras de Escherichia coli aisladas de celulitis de pollos de engorde. La resistencia

antimicrobiana se evaluó la a través del método de difusión del antibiótico

impregnado en disco y la patogenicidad bacteriana a través de pruebas en pollos de

un día de nacidos. Concluimos que todas las muestras de Escherichia coli fueron

patogénicas para los pollos y que los fármacos de mayor eficacia in vitro fueron el

florfenicol y el ceftiofur. Estas bacterias presentaron una alta resistencia a la

tetraciclina y a la doxiciclina.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 11: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

4

Medina E. (2011) realizó un estudio en España sobre Resistencia antimicrobiana en

aislados de Escherichia coli de aves, encontrando mayor porcentaje de resistencia a

la doxicilina.

1.1.3. Zoonosis

E. coli es la especie bacteriana predominante del microbiota normal aerobia y

anaerobia facultativa del aparato digestivo de la mayor parte de los animales y del

hombre y, por tanto, se elimina por las heces al exterior. Se trata, dependiendo de los

serotipos, de una de las zoonosis alimentarias más frecuentes e importantes en el

hombre debido a la gravedad de los cuadros clínicos y al número de afectados,

pudiendo suponer un grave riesgo para la salud pública. En el hombre, la colibacilosis

entérica se produce por la penetración de Escherichia. coli a través de los alimentos

permaneciendo en el epitelio intestinal causando, en general, cuadros de diarrea que

en casos más graves pueden evolucionar a disentería, colitis hemorrágica (CH), el

síndrome urémico hemolítico (SUH) e incluso a púrpura trombocitopénica (PTT).

Estas cepas, constituyen la principal causa de infecciones urinarias (ITU), meningitis

neonatales, septicemias, peritonitis, mastitis, neumonía, etc. (Blanco et al., 2002).

1.1.4. Epidemiología de la colibacilosis

La mayor parte de los cuadros clínicos de colibacilosis son de origen respiratorio. La

colibacilosis suele ser considerada como una enfermedad secundaria que es

producida por diversos factores.

Tabla 1. Factores predisponentes para el desarrollo de una infección por E. coli

(Barnes et al., 2003)

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 12: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

5

Todos estos factores conllevan a una situación óptima para el desarrollo y

transmisión de la colibacilosis.

Además de ser considerada una enfermedad secundaria, Barnes et al., 2003,

describen la colibacilosis aviar como una entidad propia, defendiendo a E. coli como

un agente patógeno primario. Se trataría de una enfermedad septicémica

caracterizada por una mortalidad aguda y presencia de poliserositis, sin afectación en

la producción. Se ha logrado reproducir experimentalmente la enfermedad en aves

libres de microorganismos patógenos específicos (SPF) mediante inoculación por

aerosol de E. coli en sacos aéreos y también oralmente, determinando que los brotes

de elevada mortalidad no se encuentran relacionados necesariamente con otras

enfermedades predisponentes. Numerosos autores hacen referencia al origen cloacal

de las cepas patógenas causantes de septicemias en aves. Las cepas patógenas

presentan unas características diferenciales que no siempre poseen los aislados

comensales ni aquellas cepas con baja o escasa patogenicidad. Hay estudios en los

que se indica que el 10-15% de la población de bacterias coliformes intestinales

pertenece a serotipos patógenos (Barnes et al., 2003).

Las cepas patógenas pueden diseminarse ampliamente por la formación de aerosoles

a partir de las heces contaminadas y adherirse a las células del epitelio del tracto

respiratorio superior mediante fimbrias F1, iniciándose la colonización bacteriana.

En las aves, las zonas de intercambio de oxígeno de los sacos aéreos y de los

pulmones son dos puntos altamente susceptibles a la colonización e invasión

bacteriana debido a la inexistencia de macrófagos alveolares que puedan contener la

infección a este nivel y a que la barrera existente entre la región capilar aérea y la

sangre es extremadamente fina. Posteriormente se produce la diseminación de E. coli

por el torrente circulatorio y la colonización de órganos internos, gracias a la

capacidad de adhesión mediada por fimbrias P (que se expresan en el tracto

respiratorio inferior y en los órganos internos), es decir, en fases más avanzadas de

la infección (Barnes et al., 2003).

1.1.5. Patogenia

E. coli es una bacteria cosmopolita que coexiste con la biota intestinal por lo que se

disemina con facilidad en el medio ambiente de las aves. En el surgimiento de la

enfermedad influyen las condiciones de temperatura extrema, mala ventilación,

hambre, sed, sobrepoblación, exceso de polvo y de vapores de amoniaco y cualquier

otro factor que estrese a las aves y disminuya sus defensas. Es frecuente encontrar

infecciones con asociadas a estados inmunes depresivos cuando hay infección con el

virus de la enfermedad de Gumboro, pero la gran mayoría de casos Escherichia coli

se encuentra asociado a infecciones con Micoplasma (Mejía, 2012).

Las aves se infectan después de respirar las bacterias, mismas que se fijan en la

mucosa de las vías respiratorias superiores, colonizando el epitelio respiratorio

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 13: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

6

traqueal, después pasan a pulmones y sacos aéreos, causando en combinación con

micoplasma la enfermedad de los sacos aéreos o aerosaculitis. A su vez, esta

enfermedad se puede complicar en septicemia aguda, emigrando la bacteria a

diversos órganos parenquimatosos, produciéndose perihepatitis, pericarditis y

poliartritis, aunque el tipo de lesiones depende del curso de la enfermedad. Son

muchos los cuadros específicos en los cuales puede estar complicada la E. coli

(Lopez, 1975).

Las infecciones de E. coli en las aves se compone de cuatro etapas:

1. Colonización de las vías respiratorias.

2. Cruce del epitelio respiratorio y penetración de la mucosa de los órganos

respiratorios. Pude pasar las células superficiales de los sacos aéreos.

3. Supervivencia y multiplicación en el torrente sanguíneo y en los órganos internos.

4. Producción de efectos nocivos sobre las células de los órganos que invade y donde

se reproduce, con las consiguientes lesiones macroscópicas por las cuales se

identifica a la infección en aves: aerosaculitis, pericarditis, perihepatitis, artritis

purulenta, salpingitis (López, 1975).

1.1.6. Sintomatología y lesiones

La característica clínica más importante de la colibacilosis aviar es la colisepticemia

y se produce por la afectación de numerosos órganos internos como el corazón,

hígado, bazo, ovario, etc. Existe una gran diferencia entre las variedades de E. coli y

su habilidad para causar enfermedad, entre los dos extremos se encuentran todos los

rangos de patogenicidad. Los síntomas varían con el lugar preferente de localización

de la infección, reconociéndose las siguientes formas (Barnes et al., 2003):

Forma respiratoria

La colibacilosis aviar, suele iniciarse a nivel del tracto respiratorio. La alteración de

la mucosa del aparato respiratorio, debida a la acción de determinados agentes,

supone una importante vía de entrada para E. coli. Cuando E. coli atraviesa la mucosa

del tracto respiratorio y alcanza el torrente circulatorio, se origina una infección

sistémica generalizada o colisepticemia, donde se observan lesiones como

perihepatitis, peritonitis y pericarditis fibrinosa. A nivel respiratorio las lesiones se

localizan en la tráquea, pulmones y sacos aéreos, pudiendo presentar estos últimos

un aspecto opaco y con exudado caseoso de intensidad variable. Suele afectar a

animales jóvenes, de forma aguda, alcanzándose valores aproximados del 50% de

morbilidad y del 5-10% de mortalidad. Entre los síntomas clínicos que se

manifiestan, se puede observar dificultad respiratoria o disnea acompañada de

estertores. (Barnes et al., 2003).

Forma genital o reproductora

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 14: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

7

La principal vía de infección del oviducto suele producirse por contaminación fecal

a partir de la cloaca. También están descritas otras vías de infección como la

producida a partir del tracto respiratorio por invasión, diseminación y colonización

de órganos internos e incluso por el paso de las bacterias a través del lumen intestinal.

Se han descrito casos de infecciones ascendentes desde el oviducto a la cavidad

peritoneal, cursando con peritonitis. (Barnes et al., 2003).

Es una enfermedad crónica y de curso lento, con una mortalidad en torno al 2-3%.

Los rendimientos productivos de las gallinas ponedoras disminuyen ya que se

produce una leve caída de la puesta. El oviducto presenta una notable congestión y

dilatación de la mucosa pudiendo encontrar un contenido purulento en el interior,

incluso masas caseosas, en animales mayores. (Blanco et al., 2002).

Otras presentaciones menos frecuentes de la colibacilosis son:

Enteritis: habitualmente suele existir una lesión primaria a nivel intestinal

debido a la acción de virus entéricos (Barnes et al., 2003), lo que se convierte

en un excelente factor predisponerte para E. coli. Se produce una fuerte

inflamación del intestino, enteritis catarral, acompañada de un engrosamiento

de la pared. El principal síntoma es una diarrea severa acompañada de

mucosidad excesiva.

Sinovitis y artritis: se produce una inflamación a nivel de los tendones y

articulaciones de las aves (Blanco et al., 2002). Puede afectar a los espacios

vertebrales causando espondilitis e incluso cursar con parálisis (Barnes et al.,

2003). Suele producirse tras una colisepticemia y en combinación con otros

microorganismos, como los pertenecientes a los géneros Staphylococcus (S.

aureus) y Mycoplasma (M. synoviae).

Coligranulomatosis: se presenta ocasionalmente y se caracteriza por la

aparición de nódulos de tamaño considerable en el hígado, ciego, duodeno y

mesenterio (Blanco et al., 2002). Aunque los síntomas y lesiones dependen

de la extensión del tejido afectado, suele diagnosticarse sólo a través de la

necropsia.

Onfalitis (infección del ombligo): la infección del huevo en formación se

produce gracias a la transmisión transovárica (Barnes et al., 2003)

generándose una infección del saco vitelino y una onfalitis (Blanco et al.,

2002), produciendo un incremento de la mortalidad embrionaria.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 15: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

8

1.1.7. Diagnóstico

El diagnóstico presuntivo de la colibacilosis puede realizarse en función de la

sintomatología y, aunque las lesiones clínicas son bastante significativas, siempre es

conveniente realizar la confirmación mediante el análisis microbiológico de las

muestras tomadas. El diagnóstico diferencial es de vital importancia ya que muchos

agentes infecciosos como Aerobacter spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Proteus

spp., Bacillus spp., han sido aislados a partir de lesiones compatibles con

colibacilosis. Así, la pericarditis puede producirse en infecciones por

Chlamydophilas pp., y en determinadas condiciones, por Pasteurellas pp. y

Streptococcus spp. M. gallisepticum y Chlamydophilas pp. han sido aislados a partir

de lesiones de aerosaculitis y Pasteurella spp., Salmonella, spp. Y Streptococcusspp.

podrían producir cuadros agudos de septicemia. (Barnes et al., 2003).

El diagnóstico de las colicepticemias y otras infecciones colibacilares en el

laboratorio se hace a base de heces fecales, secreciones faríngeas o traqueales,

muestras órganos internos como: pulmón, bazo, hígado, bilis contenido intestinal,

etc. (Blanco et al., 2002)

1.1.8. Aislamiento e identificación

Tras la toma de muestras, se procede al aislamiento en medios de cultivo, los más

utilizados son: Agar Columbia con 5% de sangre de cordero, excelente medio de

cultivo general (no selectivo) altamente enriquecido en el que se puede valorar la

capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos. Agar BHI “Brainheart

infusión agar”, medio muy nutritivo excelente para el crecimiento y aislamiento de

microorganismos exigentes y Agar Luria-Bertani (LB), de gran valor nutritivo y

óptimo para el crecimiento y mantenimiento de E.coli sobre todo en protocolos

moleculares Medios de cultivo selectivos diferenciales como el Agar McConkey (. Se

utiliza fundamentalmente para el aislamiento de miembros de la Familia

Enterobacteriaceae y diferenciación de E. coli de otros patógenos intestinales de la

misma familia. Los componentes selectivos lo constituyen el Cristal Violeta

(inhibidor de los microorganismos Gram positivos) y las Sales Biliares. (Blanco et

al., 2002).

Identificación con pruebas bioquímicas

Los medios para identificación de bacterias son empleados para detectar reacciones

bioquímicas, con carácter diferencial de grupos, géneros o especies microbianas,

mediante el viraje de color del indicador presente en el medio, demostrando algunas

de sus características. Alguna de las pruebas que se utilizan con mayor frecuencia

son las que determinan la producción de Indol a partir del triptófano, la fermentación

del 14 ácido fórmico (rojo de metilo y Voges-Proskauer) y la utilización del citrato

de simmons como única fuente de carbono (Blanco et al., 2002). Los medios

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 16: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

9

diferenciales son: TSI (Triple 9zúcar Hierro), Citrato de Simmons, SIM (Sulfuro-

Indol- Motilidad) y Agar Urea. Cuadro 3. Reacciones bioquímicas del E. coli con los

medios diferenciales TSI, Citrato de Simmons, SIM y Agar Urea

Métodos moleculares

Son técnicas moleculares destinadas a la identificación de pequeñas zonas de

heterogeneidad dentro del cromosoma bacteriano. Con el fin de complementar a los

métodos tradicionales de tipificación (serotipado,biotipado y fagotipado) se han

desarrollado, en los últimos años, una serie de técnicas moleculares basadas en la

caracterización del genotipo de los microorganismos mediante el análisis del ADN

cromosómico y plasmídico. Entre los métodos de tipificación basados en la

caracterización del ADN plasmídico podríamos citar la identificación de plásmidos

que contienen genes de virulencia. Más recientemente, se han desarrollado técnicas

moleculares destinadas a la identificación de pequeñas zonas de heterogeneidad

dentro del cromosoma bacteriano. Los métodos basados en el estudio del ADN

cromosómico utilizados en el presente estudio son los métodos basados en la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR) (Blanco et al., 2002).

1.1.9. Medidas preventivas y tratamiento

Para prevenir la colibacilosis es imprescindible conocer y eliminar las fuentes de

contaminación, así como evitar factores predisponentes que contribuyan a la

aparición de la enfermedad (Barnes et al., 2003). Estos parámetros, cuando no son

adecuados, tienen una gran repercusión en el bienestar animal e influyen

negativamente en la producción, incrementando la susceptibilidad a las infecciones

por E. coli (Blanco et al., 2002).

La prevención de la colibacilosis puede llevarse a cabo mediante el control y

vigilancia de los siguientes factores fundamentales (Barnes et al., 2003):

Manejo

Densidad de animales correcta, ventilación eficaz, ausencia de suciedad y polvo,

retirada periódica de gallinaza, intensidad lumínica y temperaturas adecuadas,

suministro de agua y pienso, programas de desinfección, desinsectación y

desratización adecuados. El polvo con contaminación fecal se considera una de las

principales vías de infección y diseminación de la enfermedad (Blanco et al., 2002).

Profilaxis y estatus sanitario

Debe minimizarse la incidencia de enfermedades como la coccidiosis, bronquitis

infecciosa, Enfermedad de Newcastle, Gumboro, M. gallisepticum, M. synoviae y

micosis ya que son enfermedades que predisponen al desarrollo de la colibacilosis.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 17: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

10

Por tanto, los programas de vacunación deben ser los adecuados para la explotación.

Existen en el mercado distintas vacunas inactivadas frente a E. coli (Ceva, Hipra,

Syva), pero es importante tener en cuenta que la vacuna sólo protegeeficazmente

frente a las cepas homólogas de E. coli y no frente a cepas heterólogas de otros

serotipos, quizá debido al elevado número de serotipos existentes (Buxadé et al.,

2000; Biarnés, 2006).

Debido a la problemática en cuanto al control de esta enfermedad mediante

vacunación, se han realizado estudios de valoración de los antígenos óptimos para la

elaboración de las vacunas, como adhesinas F1 y P, proteína receptora de aerobactina

y lipopolisacáridos (LPS) obtenidos de la cepa E. coli O78, indicando su relevancia

a la hora de proteger contra las infecciones del tracto respiratorio causada por cepas

patógenas de E. coli (Kariyawasam et al., 2002).

Los programas de nutrición

Es importante la aplicación de fórmulas nutricionales correctas para cada fase de

producción, así como un buen suministro de pienso a los animales. Un suministro

incorrecto del pienso podría provocar estrés en los animales favoreciendo la

aparición de enfermedades. La realización de controles del pienso y materias primas

es esencial para garantizar una buena calidad (Barnes et al., 2003).

La terapia antimicrobiana

Es una herramienta indispensable para reducir las importantes pérdidas ocasionadas

por las infecciones por E. coli en la industria avícola (Amara et al., 1995; Blanco et

al, 1997a; Zhao et al., 2005). E. coli posee la sensibilidad característica de las

bacterias Gram negativas, siendo parte de las cepas sensibles a penicilinas,

cefalosporinas, aminoglucósidos, tetraciclinas, cloranfenicol, colistina, sulfamidas,

trimetoprim y quinolonas (Blanco et al., 2002). Se ha demostrado que varios factores

contribuyen a la virulencia de las cepas aviares de E. coli, y muchos se encuentran

alojados en plásmidos de conjugación de gran tamaño. En ellos, también pueden

encontrarse genes responsables de resistencias a agentes antimicrobianos, y es

posible que el uso de éstos seleccione de manera específica las cepas de E. coli que

contienen estos plásmidos, aumentando así la persistencia de estas entre las aves

(Barnes et al., 2003).

Buxadé et al., (2000) señala que los casos de colibacilosis suelen ser recurrentes y

los lotes deben ser medicados con frecuencia a lo largo de su vida productiva.

Aparentemente, según algunos autores, la utilización masiva de antimicrobianos

junto con la práctica habitual de utilizarlos a concentraciones sub-inhibitorias con

fines profilácticos, ha incrementado considerablemente las resistencias bacterianas.

Es decir, el empleo inadecuado de antibióticos podría considerase como una

importante fuente de emergencia, selección y diseminación de resistencias.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 18: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

11

La utilización de antimicrobianos puede producir el efecto indeseado de seleccionar

cepas bacterianas resistentes a los mismos, ya sean o no patógenas. Este fenómeno

se puede producir sobre bacterias resistentes que de forma natural se encuentren en

el medio antes de que se produzca el tratamiento antimicrobiano o bien porque se

generan durante el proceso infeccioso y su tratamiento. Las bacterias responden ante

la presión selectiva ejercida por los antibióticos de forma que en el nuevo ambiente

sólo sobreviven los microorganismos más aptos en sentido evolutivo, es decir los

más resistentes (Johnson et al., 2004; Schroeder et al., 2004)

Estas resistencias están codificadas y reguladas a nivel genético y por tanto son

heredables. Además, y debido a los mecanismos de transmisión y recombinación

genética que poseen los procariotas, estos genes de resistencia pueden diseminarse

horizontalmente a otras bacterias, multiplicando exponencialmente el riesgo de

encontrar bacterias patógenas resistentes a los antibióticos en los animales y su

entorno (Barnes et al., 2003).

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 19: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

12

II. MATERIALES Y METODOS

2.1 Objeto de estudio

El objeto de estudio fueron los pollos de carne de la línea Cobb 500 de edad

comprendía entre 21 y 28 días, de los cuales se realizaron muestreos de lesiones

compatibles con colibacilosis

2.2 Instrumentación

2.2.1 Materiales de campo

Material Cantidad

Caja de cartón 10 unidades

Guantes estériles 25 unidades

Overol 1 unidad

Botas 1 par

Marcadores permanentes 2 unidades

Libreta de anotaciones 2 unidades

Lapiceros 1 unidad

Cámara fotográfica 1 unidad

2.2.2 Material de laboratorio

Material Cantidad

Placas Petri 100 unidades

Tubos de ensayo 50 unidades

Matraz Erlenmeyer 2 unidades

Gradillas 2 unidades

Asas y mangos de kolle 2 unidades

Mechero de alcohol 2 unidades

Hisopos estériles 150 unidades

Pinzas 2 unidades

Cloruro de Sodio 2 litros

Caldo lactosado 100 gramos

Agar Agar VRB (Violeta

cristal-Rojo neutro-Bilis-

Lactosa)

500 gr

Agar MullerHinton 500 gr

Alcohol de 96º 1 litro

Agua destilada 5 litros

Agua oxigenada 1 litro

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 20: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

13

Discos de actividad

antibiótica (Doxicilina,

oxitetraciclina, amoxicilina,

sulfatrimetoprim,

enrofloxacina).

50 unidades

2.2.3 Equipos

Equipo Cantidad

Autoclave 1

Incubadora 1

Refrigeradora 1

Balanza digital 1

Cocina eléctrica 1

Olla 1

Baño maría 1

Horno 1

Estufa 1

2.2.4 Material de oficina

2.2.5 Lugar

Los pollos fueron tomados en una empresa en la zona de Piura, que tiene una

población semanal de 250 000 pollos. La empresa cuenta con laboratorio de

análisis de muestras en la zona de Piura.

Material Cantidad

Lapicero marcador 4

Lápiz 1

Borrador 1

Calculadora 1

Regla 1

Laptop 1

Papel A4 100

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 21: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

14

2.3 Métodos y técnicas

2.3.1 Animales utilizados

Se seleccionaron pollos que tengan signos clínicos compatibles de

colibacilosis (depresión, postración y secreción nasal). Por cada centro

productivo se muestreó 5 pollos sin tratamiento antimicrobiano previo,

haciendo un total de 50 animales.

Se trabajó con una pequeña ficha de registro de muestra, donde consignaba

granja de procedencia, sintomatología clínica, brote o caso aislado, órgano

tomado para hisopado. (ver anexo)

Tabla 2. Ficha de registro de muestras de pollo de engorde (elaboración

propia)

FICHA DE REGISTRO DE MUESTRA

Granja:

Fecha:

Edad de las aves:

Sintomatología:

Brote (solo marcar): SI NO

Caso aislado (solo marcar): SI NO

Tratamiento (solo marcar): SI NO

Órgano hisopado:

El muestreo fuero realizado por conveniencia no fue realizado de forma

aleatoria ni al azar.

Las muestras fueron tomadas en el periodo comprendido entre junio del

2017 y octubre del 2017.

2.3.2 Transporte de muestras y necropsia de aves

Cada 15 días se realizaban muestreos de pollos que aparentemente

podían tener contaminación bacteriana: secreción nasal, depresión y

depresión (pollos con características viables que resistan el transporte y

puedan llegar vivos a laboratorio para su procesamiento). Los pollos

seleccionados se trasladaron al laboratorio en una caja de cartón rotulada.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 22: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

15

Se realizó sacrificio humanitario a las aves, mediante el método de

dislocación cervical (método de sacrificio considerado por la sociedad

mundial para la protección animal, Charli Beatriz Ludtke, 2015).

Se realizó la necropsia y se evaluaron las lesiones observadas, según el

protocolo de necropsia descrito por Natalia Majó y Roser Dolz, 2011.

2.3.3 Procesamiento de muestras

Una vez que las muestras fueron identificadas, se procesaron el mismo día

siguiendo una modificatoria al procedimiento especificado por (Brito et

al, 2011), para la realización del ensayo “Investigación de E. coli en

muestras de origen aviar” y cuyo esquema se muestra en la siguiente figura

(Figura 1).

Figura N°1. Esquema de procedimiento de Investigación de E.Coli en

muestras de origen Aviar. (Brito et al, 2011)

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 23: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

16

Aislamiento microbiológico

Preenrequecimiento

Utilizando hisopos estériles, se realizó hisopado de la lesión encontrada

en cada órgano y se colocó el hisopo en un tubo de ensayo conteniendo 10

mililitros de caldo lactosado.

Se empleó el caldo lactosado, el cual es un medio rico en nutrientes, que

no contiene inhibidores, lo que facilita el crecimiento de las bacterias

orientando la presencia de coliformes, como E. coli, por el mecanismo

degradativo (CO2) con formación de burbujas debido a la fermentación de

lactosa ya que produce gas y acido. El extracto de carne y peptona, son la

fuente de carbono y nitrógeno, mientras que la lactosa es el hidrato de

carbono (Gutiérrez y Sánchez, 2017).

Los tubos conteniendo la muestra y caldo lactosado fueron colocados en

incubación por 24 horas a 37°C.

Medio selectivo

En el agar VRB es un medio selectivo que contiene sales biliares, violeta

cristal, rojo neutro con lactosa, que se emplea fundamentalmente como

medio selectivo y diferencial para la detección y enumeración de

coliformes (Cultimed 2002).

La presencia simultánea de violeta cristal y sales biliares asegura la

inhibición del crecimiento de las bacterias Grampositivas. A su vez la

fermentación de la lactosa da lugar por un lado a la formación de ácido,

que hace cambiar a rojo el indicador, y por otro a la precipitación de las

sales biliares alrededor de las colonias. Las colonias, presentan un color

rojo púrpura y aparecen rodeadas por una franja rojiza. (Cultimed 2002)

Para preparar el agar se suspendieron 41,5 g en 1 litro de agua destilada;

se calentó y agitó hasta ebullición y se llevó a hervir durante 1 minuto. No

fue necesaria la esterilización, se dejó enfriar a una temperatura de 44-

47°C.

Se transfirió a cada placa Petri 15 ml de medio líquido y homogenizar

suavemente girando lateralmente las placas en un sentido y otro. Dejar

enfriar hasta solidificación.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 24: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

17

Siembra

Se sumerge un hisopo estéril en el tubo de caldo lactosado incubado y se

siembra en las placas solidificadas. Se llevó a incubar a 37ºC durante 24

horas.

La identificación de colonias compatibles a E. coli se determinó por las

características de colonia, de bordes bien definidos y de color rojo.

2.3.4 Prueba de sensibilidad

Se determinó la sensibilidad in vitro de los aislados de E. coli frente a

diferentes antimicrobianos mediante el sistema de difusión con discos

impregnados con antimicrobianos (Brito y col 2011).

Se tomaron las colonias de cada cepa previamente identificadas, se suspenden

en 9 ml de cloruro de sodio y la suspensión bacteriana se homogeniza y se

incuba a 37ºC por 6 h.

Luego la suspensión se sembró con hisopo estéril en placas contenido 15 a 20

ml de agar Muller Hinton realizando estrías en todas direcciones. Las placas

se secaron en una estufa a 37°C por 10 minutos.

Los discos de antibióticos que se usaron en este ensayo se seleccionaron en

base a su frecuente utilización en la terapéutica aviar. Los antibióticos y

concentraciones: Sulfatrimetoprim 29 μg, Amoxicilina 25 μg, Oxitetraciclina

30μg, Enrofloxacina 5 μg. Doxiciclina 80 μg.

Estos se depositaron en condiciones de esterilidad sobre las placas y se

presionaron cuidadosamente para asegurar el completo contacto con la

superficie del agar.

Se distribuyeron cinco discos por placa con el fin de mantener una distancia

de 2,5 cm entre ellos.

Las placas se incubaron durante 24 h a 37ºC y en función del tamaño de los

halos de inhibición, las cepas fueron clasificadas como sensibles (S),

intermedias (I) o resistentes (R) según los criterios de interpretación que se

encuentran detallados en la tabla 3 (Brito y col 2011).

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 25: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

18

Tabla 3. Interpretación del diámetro de las zonas de inhibición para patógenos a los agentes

antimicrobianos (Brito y col 2011),

*Para el caso de la oxitetraciclina y doxiciclina se utilizaron concentraciones de 30 μg y 80

80 μg respectivamente, ya que es la presentación comercial de los discos de antibióticos, y

se utilizó como referencia el diámetro de zona de inhibición de las tetraciclinas, ya que

estos dos antibióticos pertenecen a la misma familia.

2.3.5 Análisis de datos

Se realizó un diseño estadístico descriptivo. Para determinar el comportamiento de

esta cepa frente a cada uno de los antibióticos, se empleó la Prueba exacta de Fisher.

Agente

antimicrobiano

Concentración Zona de inhibición (mm)

Sensible Intermedio Resistente

Amoxicilina 25μg ≥20 - ≤19

Enrofloxacina 5 μg ≥20 - ≤ 19

Penicilina 10 μg ≥29 - ≤ 28

Tetraciclina* 30 μg ≥19 15 – 18 ≤ 14

Sulfatrimetoprim 29μg ≥16 11 – 15 ≤ 10

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 26: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

19

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1.RESULTADOS

3.1.1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli

Durante el periodo de estudio, se procesaron 50 pollos correspondientes a 10 centros

productivos.

A partir de las necropsias realizadas, se obtuvo que el 100% de pollos presentó

aerosaculitis como única lesión interna a la sintomatología clínica presentada.

Tabla 4. Distribución de lesiones en órganos internos

Al realizar el protocolo de aislamiento e identificación para Escherichia coli. descrito

anteriormente, se obtuvieron 50 aislados identificados como Escherichia coli,

mediante el uso de agar selectivo VRB, que representa el 100% de las muestras

obtenidas.

Según los resultados obtenidos en el presente estudio, podemos catalogar a

Escherichia coli, como el principal agente patógeno de infecciones bacterianas en

pollos de engorde criados en la zona de Piura.

Órgano Tipo d lesión Muestras

procesadas

Porcentaje

Hígado Perihepatitis 0 0%

Peritoneo Peritonitis 0 0%

Saco aéreo Aerosaculitis 50 100%

Pericardio pericarditis 0 0%

Tráquea Traqueítis 0 0%

TOTAL 50 100%

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 27: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

20

Grafica 1. Porcentajes de cepas de Escherichia coli aisladas de muestras de órganos

internos de pollos de engorde en la Provincia de Piura.

3.2 PRUEBA DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS

Para evaluar los perfiles de resistencia de las cepas de Escherichia coli, se realizaron

pruebas de sensibilidad in vitro frente a 5 agentes antimicrobianos de uso frecuente

para el tratamiento de infecciones bacterianas en pollos

Tabla 2. Resultados de sensibilidad in vitro de Escherichia coli frente a 5

antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones bacterianas en

pollos de engorde en la Provincia de Piura.

ANTIBIÓTICO Sensible Intermedio Resistente

N° % N° % N° %

Oxitetracicina 23 46,0 - 27 54

Sulfatrimetoprim 50 100 - -

Doxiciclina 32 64,0 12 24 6 12

Amoxicilina 50 100 - -

Enrofloxacina 50 100 - -

Como podemos ver en la tabla 2, el 66% de las muestras fueron resistentes a dos

antibióticos. El 54 % del total de las cepas de Escherichia coli fueron resistentes a

oxitetraciclina, y el 12 % de las cepas resultaron resistentes a doxiciclina. El 12% de

las cepas mostraron sensibilidad intermedia a la doxiciclina. Respecto a los

resultados de sensibilidad, se encontró que tres de los 5 medicamentos

(Sulfatrimetoprim, amoxicilina y enrofloxacina) mostraron una sensibilidad del

100% (Grafica 2).

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 28: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

21

Grafica2. Porcentajes de sensibilidad de Escherichia coli frente a los antibióticos

comúnmente empleados en el tratamiento de infecciones bacterianas en pollos de

engorde en la Provincia de Piura.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 29: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

22

IV. DISCUSION

4.1 DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli

El 100% de pollos evaluados presentaron aerosaculitis. como única lesión interna.

Barnes et al. (2003) manifiesta que la colibacilosis suele ser considerada como una

enfermedad secundaria, originada por un estado de inmunodepresión debida a otras

enfermedades víricas o bacterianas como Bronquitis Infecciosa, Enfermedad de

Newcastle, Enfermedad de Gumboro, Micoplasmosis, Clostridiosis, etc. La

presencia de lesiones primarias, como daños en los cilios traqueales y alteraciones

en el sistema respiratorio, facilitaría la entrada, colonización y diseminación

secundaria de E. coli. Además de un origen infeccioso, pueden existir otros factores

que incrementan la susceptibilidad de las aves para padecer una infección por E. coli

También puede haber factores capaces de disminuir dicha susceptibilidad como

factores inmunológicos (inmunidad activa y pasiva, adición de inmunoestimulantes),

fisiológicos (genética, aves adultas, hembras, estrés moderado, etc.) y nutricionales

(aporte de proteínas, vitamina A, D, C y E, carotenos, selenio, etc.). Blanco et al.

(2002) manifiesta que la mayor parte de los cuadros clínicos de colibacilosis son de

origen respiratorio, aunque no se descarta que algunos sucedan al atravesar las

bacterias la pared intestinal. Barnes et al. (2003) también manifiesta que la

colibacilosis aviar, suele iniciarse a nivel del tracto respiratorio. La alteración de la

mucosa del aparato respiratorio, debida a la acción de determinados agentes, supone

una importante vía de entrada para E. coli. Cuando E. coli atraviesa la mucosa del

tracto respiratorio y alcanza el torrente circulatorio, se origina una infección

sistémica generalizada o colisepticemia, donde se observan lesiones como

perihepatitis, peritonitis y pericarditis fibrinosa. A nivel respiratorio las lesiones se

localizan en la tráquea, pulmones y sacos aéreos, pudiendo presentar estos últimos

un aspecto opaco y con exudado caseoso de intensidad variable. Suele afectar a

animales jóvenes, de forma aguda, alcanzándose valores aproximados del 50% de

morbilidad y del 5-10% de mortalidad.

Al realizar el aislamiento e identificación para Escherichia coli, se obtuvieron 50

aislados identificados como Escherichia coli, que representa el 100% de las muestras

obtenidas. Debido a que el presente estudio se ha realizado por conveniencia (no al

azar) es por eso por lo que se obtiene un alto porcentaje de presentación de

Escherichia coli. En el Perú un estudio realizado por Carranza et al (2012) encontró

el 37.96 % de las muestras procesadas que resultaron positivas a Escherichia coli

provenientes de pollos broiler aparentemente sanos, donde se obtuvieron 41 colonias

positivas (41/ 108) a Escherichia coli.

En Ecuador, Apolo (2015) analizaron un total de 275 muestras de órganos de pollos

con sintomatología respiratoria y lesiones compatibles con colibacilosis; tras el

análisis microbiológico de las muestras se aislaron 204 cepas de E. coli que equivale

al 74.2% del total de las muestras.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 30: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

23

Gomis et al. (2001), lograron un porcentaje de aislamiento de E. coli del 70,7%, (58

de 82 aves) a partir de lesiones compatibles con colibacilosis, como pericarditis,

aerosaculitis y perihepatitis.

4.2 DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS

Se realizaron pruebas de sensibilidad in vitro frente a 5 agentes antimicrobianos de

uso frecuente para el tratamiento de infecciones bacterianas en pollos, el 66% de las

muestras fueron resistentes a dos antibióticos. Apolo (2015) encontró una resistencia

de 49,5%, asimismo manifiesta que en un estudio realizado por Bravo et al, en Perú

en pollos broiler (2014), encontraron datos que tienen mucha similitud con los

encontrados en esta investigación, sin embargo, sus porcentajes son superiores en

resistencia con un 54%.

El 54 % del total de las cepas de Escherichia coli fueron resistentes a oxitetraciclina,

y el 6 % de las cepas resultaron resistentes a doxiciclina. Apolo (2015) encontró una

resistencia de 89.7% para la oxitetraciclina y de 68.6% para la amoxicilina. Apolo

(2015) manifiesta que el antibiótico Oxitetraciclina (reportado por Valencia el 2012)

encontró valores de 94% de resistencia y Martinez et al, en México (2012) encontró

valores de resistencia menores con un 78.1% de resistencia. La elevada resistencia

observada para diferentes aislamientos de E. coli a antibacterianos como

oxitetraciclina y doxiciclina refleja la amplia utilización y el mal uso que se ha dado

en los últimos años.

El 12% de las cepas mostraron sensibilidad intermedia a la doxiciclina. Apolo (2015)

encontró un resultado similar de sensibilidad intermedia e de 13.2% para la

doxiciclina.

Respecto a los resultados de sensibilidad, se encontró que tres de los 5 medicamentos

(Sulfatrimetoprim, amoxicilina y enrofloxacina) mostraron una sensibilidad del

100%. Apolo (2015) obtuvo resultados diferentes, una sensibilidad de 20.6% para

sulfatrimetoprim, 14.7% para amoxicilina y 38.2 para enrofloxacina. Esto puede

ocurrir debido a que en la zona de crianza de Piura no es común el uso de antibióticos

en el proceso de crianza debido a los tiempos de retiro que son prolongados y la corta

edad al momento de la venta (35 a 40 días) y a las condiciones climáticas de las zonas

(zona calurosa durante casi todo el año) que no acentúan los procesos respiratorios.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 31: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

24

V. CONCLUSIONES

Del 100 % de las muestras, se identificó Escherichia coli, que demuestra que es el

principal agente causante de infecciones bacterianas en pollos de engorde de la

provincia de Piura.

Las cepas de Escherichia coli aisladas mostraron una mayor resistencia a 2

antimicrobianos de uso frecuente en la terapia como son la oxitetraciclina y

doxiciclina en un 54 % y 12 % respectivamente. Sin embargo, solo un antibiótico

mostro sensibilidad intermedia, siendo este la doxiciclina con un 24 %. La

sulfatrimetoprim, amoxicilina y enrofloxacina, mostraron una sensibilidad del 100%.

Se concluye que los antibióticos sulfatrimetoprim, amoxicilina y enrofloxacina son

eficaces para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por Escherichia coli

en pollos de engorde de la provincia de Piura

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 32: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

25

VI. RECOMENDACIONES Y/O PROPUESTAS

El Servicio Nacional de Sanidad Agraria SENASA en coordinación con las empresas

productoras de pollo de carne deben promover el estudio de sensibilidad y resistencia de

microorganismos de importancia zoonótica, además de aplicar medidas para el control de

tiempos de retiros de uso de los antimicrobianos en la terapéutica animal.

El estudio de agentes patógenos debe realizarse utilizando métodos oficiales, las técnicas

microbiológicas como el método empleado en el presente estudio no alcanzan la sensibilidad

de los métodos cuantitativos, como PCR; sin embargo, por su adecuada confiabilidad, fácil

ejecución y bajos costos, deberían ser consideradas en nuestro país para emplearse como

métodos de rutina en la vigilancia de enfermedades como la colibacilosis aviar.

Es necesario que médicos veterinarios sean los únicos profesionales encargados en el manejo

de medicamentos de uso animal, prestando especial énfasis al uso adecuado de los

antimicrobianos y al cumplimiento de los tiempos de espera. Además de tomar las medidas

adecuadas de manejo y control en los planteles avícolas que permitan minimizar el efecto

patológico del E. coli en las aves.

Se recomienda realizar estudios y análisis similares al menos una vez por año a fin de tener

datos sobre el comportamiento de la sensibilidad y resistencia frente a los antimicrobianos

de Escherichia coli en pollos de carne, además de replicar este estudio en las demás regiones

avícolas del país para tener una base de datos que permita determinar cuál es la mejor

alternativa en el momento de realizar una antibioterapia.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 33: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

26

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Adams, R. (2003). Avicultura y patología aviar. 2ª ed. Ed. Acribia. España. 133

p.

2. Apolo J. (2015). Aislamiento de Escherichia Coli en pollos de engorde con

afección respiratoria y determinación de la sensibilidad frente a los antibióticos

utilizados en el cantón balsas. Ecuador. 88 p.

3. Blanco, J., Blanco, M., Blanco, J. E., Mora, A., Alonso, M. P., González, E. A.,

Bernárdez, M. (2002). “Enterobacterias: características generales. Género

Escherichia” Manual de Microbiología Veterinaria, capítulo 21. España. 301-

325 p.

4. Barnes, H., Vaillancourt, J., Gross, W. (2003). “Colibacillosis” Diseases of

Poultry. 11th Edition, Section II. España. 18 p.

5. Botana, L. (2002). Farmacología y terapéutica veterinaria. McGraw-Hill

interamericana. España. 550 p.

6. Brito, FRF Jaenisch,, GA Oliveira, Soares, , BG Brito. (2011). Resistencia

antimicrobiana y patogenicidad de muestras de Escherichia coli aisladas de

lesiones de celulitis en pollos. Argentina. 3 p.

7. Buxadé, C. (2000). La gallina ponedora. 2ª Edición. Ed. Mundi-Prensa. España.

639 p.

8. Cultimed. (2020). Manual Básico de Microbiología. Disponible en:

http://www.ictsl.net/downloads/microbiologia.pdf

9. Ewers C, Janssen T, Wieler LH. (2003). Avian pathogenic Escherichia coli

(APEC). Alemania. 381-395 p.

10. Gomis, S., Riddell, C., Potter, A., Allan, B. (2001). “Phenotypic and genotypic

characterization of virulence factors of Escherichia coli isolates from broiler

chickens with simultaneous occurrence of cellulitis and other colibacillosis

lesions”. The Canadian Journal of Veterinary Research. Canada. 6 p.

11. Gutiérrez M. y Sánchez A. (2017). Detección y caracterización de Escherichia

coli patógeno en carne de pollo por reacción en cadena de la polimerasa.

Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú. 66 p.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

Page 34: AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA …

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

27

12. Jansen T, Philipp HC, Voss M, Preisinger R, Wieler L. (2003). Multiplex PCR is

the first technique to allow the specific and sensitive detection of avian

pathogenic Escherichia coli (APEC). Lohmann Information. Alemania. 5 p.

13. López, J. (1975). “Escherichia coli: mecanismos de patogenicidad”, Ciencia

Veterinaria. 39 p. Disponible en:

http://www.fmvz.unam.mx/fmvz/cienciavet/revistas/CVvol1/CV1v1c01.pdf

14. Ludtke Ch. (2015). Sacrificio humanitario de aves. World Animal Protection,

Brasil. 116 p. Disponible en:

https://www.portaleducativobienestaranimal.org/sites/default/files/Libro_Steps_

sacrificiohumanitario_aves_0.pdf

15. Majó N. y Dolz R. (2011). Atlas de la necropsia aviar. Diagnostico macroscópico

y toma de muestras. Editorial Servet. España. 82 p.

16. Medina Landaeta.2011. Resistencia antimicrobiana en aislados de

Escherichiacoli de conejos tratados por vía oral con diferentes pautas de

doxiciclina. Universidad Complutense de Madrid. Tesis doctoral

17. MEJIA, B. 2012. Colibacilosis aviar una enfermedad compleja. Parte II: la

enfermedad en aves. Disponible en:

http://patologiaaviarmidiagnostico.blogspot.com/2012/01/colibacilosis-aviar-

una-enfermedad.html

18. Sumano, H. (2006). Farmacología veterinaria. 3ª ed. Ed McGraw-Hill

interamericana. España. 980 p.

19. Trolldenier, H. (1980). Antibióticos en medicina veterinaria. Editorial Acribia.

España. 276 p.

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/