aislamiento, caracterización e identificación molecular de
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
“Aislamiento, caracterización e identificación
molecular de microorganismos productores de
lipasas nativos del estado de Sinaloa”.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA:
SANDY ROCÍO HERNÁNDEZ LEYVA
GUASAVE, SINALOA, MÉXICO. DICIEMBRE DE 2016
II
III
IV
V
Agradecimientos a proyectos
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro
Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad
Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN) bajo la dirección de la Dra. Claudia Castro
Martínez y la Dra. Melina López Meyer. El presente trabajo fue apoyado económicamente a
través de los proyectos SIP20144369, SIP20150270 y SIP20160483. La alumna Sandy
Rocío Hernández Leyva fue apoyada con una beca CONACYT con clave 636079 y una beca
institucional del IPN.
VI
DEDICATORIA
Con todo mi cariño:
A Dios por ponerme y estar conmigo siempre en este largo caminar, rodeada
siempre de personas valiosas que supieron guiarme y apoyarme sin recibir nada a
cambio.
Con todo mi amor para mi familia, por ese apoyo incondicional de mis padres, Daniel
y Leonor, a mis hermanos, Daniela y Daniel los quiero mucho. Gracias esposo mío
José Eduardo por alentarme y nunca dejarme sola, te amo por siempre. A mi cuñado
y compadre Aldo por su gran apoyo, mis sobrinos por sus alegrías, a mis abuelos
Mamá Ova y Papá Balo, por siempre estar demostrándome su cariño y dándome
palabras de aliento para no caer, esto es para ustedes. LOS AMO A TODOS.
A mis amigas Arely, Laura Ivonne y Athziri por su cariño, amistad y por todo el apoyo
que me brindaron para realizar este proyecto, las amo mil.
A mis amigos y compañeros del CIIDIR: a mis carroñeros fav Denise y Crucencio,
Juan Carlos, Lorena, Cande, Melina, Jacqueline, Chemita, Karla, Chuyito, Marco y
Alejandro, gracias por hacer divertidas y llevaderas las jornadas de trabajo, gracias
por su amistad y por siempre estar allí.
Y a todas esas personas que forman parte de mi vida y que de alguna u otro manera
influyeron en este proceso, muchas gracias.
Para el gran amor de mi vida, mi hija Ariana, TE AMO por
siempre mi preciosura.
VII
AGRADECIMIENTOS
A Dios por ponerme en este camino, rodeada de personas valiosas que me guiaron y
apoyaron durante mi maestría.
Agradezco al Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral
Regional (CIIDIR-IPN Sinaloa), al Departamento de Biotecnología Agrícola
(BIOTECSIN) y al Laboratorio de Bioenergéticos por permitirme desarrollar mi
proyecto de investigación y ayudarme a crecer académicamente.
A mis directoras de tesis la Dra. Claudia Castro Martínez y la Dra. Melina López
Meyer por gran apoyo, paciencia, consejos y excelente dirección en mi trabajo de
tesis. Especialmente a la Dra. Claudia por abrirme las puertas de su laboratorio y
ayudarme a crecer tanto académica como personalmente, por su confianza y
amistad, muchas gracias.
Agradezco a mi comité tutorial, Dr. Carlos Ligne Calderón Vázquez, Dr. Ignacio
Eduardo Maldonado Mendoza, M.C. Jesús Ricardo Camacho Báez y M.C. Arturo
Fierro Coronado por su disponibilidad y aportaciones de conocimiento durante el
desarrollo de este proyecto.
Un agradecimiento especial a la Dra. Lelie Denise Ochoa Castro, la Dra. Karla
Yeriana Leyva Madrigal y M.C. Claudia María Ramírez por su gran apoyo y asesoría
en el proyecto de investigación.
A cada uno de mis compañeros y amigos del Laboratorio de Bioenergéticos,
Laboratorio Interacción Microorganismo-Planta y Laboratorio de Ecología Molecular
de la Rizósfera del CIIDIR Sinaloa, gracias por su apoyo y amistad, y por hacer que
mi estancia en este centro fuera más placentera. Agradezco a la señora Candy por
haberme recibido en su casa y alimentarme durante mi trabajo experimental
nocturno, muchas gracias.
Gracias también a mis compañeros de maestría Mireya, Zeiby, Arely, Athziri, Cruz y
Jesús por su amistad durante las clases, seminarios y fuera de este centro de
trabajo. A mis maestros gracias por sus aportaciones académicas.
VIII
ÍNDICE
Pág.
ÍNDICE ............................................................................................................................... VIII
ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................... XI
ÍNDICE DE CUADROS ....................................................................................................... XIII
GLOSARIO ......................................................................................................................... XIV
ABREVIATURAS ................................................................................................................ XVI
RESUMEN ......................................................................................................................... XVII
ABSTRACT ...................................................................................................................... XVIII
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1
2. ANTECEDENTES ............................................................................................................ 3
2.1 Enzimas .................................................................................................................... 3
2.1.1 Generalidades ................................................................................................... 3
2.1.2 Fuentes de obtención de enzimas ..................................................................... 3
2.1.3 Clasificación de enzimas ................................................................................... 5
2.2 Lipasas ..................................................................................................................... 5
2.2.1 Estructura y mecanismo de acción .................................................................... 6
2.2.2 Reacciones catalizadas por lipasas ................................................................... 7
2.3 Microorganismos productores de lipasas .................................................................. 8
2.4 Fuentes de aislamiento de microorganismos lipolíticos .......................................... 11
2.4.1 Aceite vegetal usado ....................................................................................... 11
2.4.2 Suelo contaminado con aceite ......................................................................... 12
2.4.3 Agua termal ..................................................................................................... 12
2.5 Importancia de las lipasas ...................................................................................... 13
2.6 Aplicaciones biotecnológicas de las lipasas ............................................................ 13
2.7 Biodiesel ............................................................................................................. 14
2.7.1 Uso de lipasas para la producción de biodiesel .................................................. 15
2.7.2 Catalizadores utilizados en la producción de biodiesel .................................... 16
2.7.2.1 Catalizador Alcalino ..................................................................................... 16
2.7.2.2 Catalizador Ácido ......................................................................................... 17
2.7.2.3 Catalizador Enzimático ................................................................................ 17
IX
3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 19
4. OBJETIVOS .................................................................................................................. 20
4.1. Objetivo General ....................................................................................................... 20
4.2. Objetivos específicos.................................................................................................. 20
5. HIPÓTESIS ................................................................................................................... 21
6. METODOLOGÍA ............................................................................................................ 22
6.1 Estrategia general de trabajo .................................................................................. 22
6.1. Localización de muestreo ........................................................................................... 22
6.1.1. Muestreo de aceite de desecho ....................................................................... 23
6.1.2. Muestreo de suelo ........................................................................................... 23
6.1.3. Muestreo de agua geotérmica ......................................................................... 23
6.2. Aislamiento de los microorganismos ....................................................................... 24
6.2.1. Muestras de suelo contaminado con aceite ..................................................... 24
6.2.2. Muestras de agua termal ................................................................................. 24
6.2.3. Muestras aceite de desecho ............................................................................ 24
6.2.4. Conservación de los aislados .......................................................................... 25
6.3. Determinación cualitativa de la actividad lipolítica de los microorganismos aislados
……………………………………………………………………………………………….25
6.4. Identificación molecular de los aislados bacterianos seleccionados ....................... 26
6.4.1. Extracción de ADN .......................................................................................... 26
6.4.2. Amplificación de ADN ...................................................................................... 26
6.4.3. Electroforesis ................................................................................................... 27
6.4.4. Purificación de los productos de PCR .............................................................. 27
6.4.5. Secuenciación y análisis .................................................................................. 27
6.4.6. Análisis Filogenético ........................................................................................ 28
6.5. Caracterización cinética de microorganismos lipolíticos......................................... 28
6.6. Efecto de diferentes tipos de inductores y fuentes de carbono sobre la actividad
lipolítica de los aislados ..................................................................................................... 29
6.6.1. Efecto de inductor ............................................................................................ 29
6.6.2. Efecto de fuente de carbono ............................................................................ 29
6.6.3. Efecto de las concentraciones de los factores nutricionales sobre la producción
lipolítica……….. ............................................................................................................. 30
6.6.4. Determinación cuantitativa de actividad lipolítica ............................................. 30
6.6.5 Determinación de la correlación entre la actividad lipolítica y la biomasa ........ 31
X
7. RESULTADOS .............................................................................................................. 32
7.1. Aislamiento de microorganismos de las diferentes fuentes ..................................... 32
7.1.1. Aislamiento de microorganismos ..................................................................... 32
7.1.2. Creación del banco de microorganismos aislados de diferentes fuentes ......... 32
7.2. Determinación cualitativa de los microorganismos anteriormente aislados ............. 33
7.3. Identificación molecular de los aislados bacteriano ................................................. 36
7.3.1. Análisis de las secuencias ............................................................................... 36
7.3.2. Análisis Filogenético ........................................................................................ 37
7.4. Caracterización cinética de los aislados ................................................................. 39
7.5. Análisis de la actividad lipolítica .............................................................................. 39
7.5.1. Efecto del inductor sobre la actividad lipolítica ................................................. 39
7.5.2. Efecto de la fuente de carbono ........................................................................ 43
7.6. Diseño factorial ....................................................................................................... 46
8. DISCUSIÓN ................................................................................................................... 51
8.1. Determinación cualitativa de los microorganismos anteriormente aislados ............. 51
8.2. Identificación molecular de los aislados bacterianos ............................................... 52
8.3. Análisis de la actividad lipolítica .............................................................................. 52
8.3.1. Efecto de inductor ............................................................................................ 52
8.3.2. Efecto de la fuente de carbono ........................................................................ 54
8.4 Diseño Factorial ...................................................................................................... 56
9. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 57
10. PERPESPECTIVAS ................................................................................................... 58
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 59
XI
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Representación esquemática de la conformación canónica α/β que presentan todas las lipasas conocidas
7
Figura 2. Esquema general de trabajo………………………………. 22 Figura 3. Muestras de aceite residual……………………………….. 23 Figura 4.
Toma de muestra de suelo contaminado con aceite de un taller mecánico…………………………………………...
23
Figura 5. Toma de muesra de agua termal en la Ciénega de Casal de diferentes estanques…………………………….
24
Figura 6. Criopreservación de microorganismos a -70°C…………. 25 Figura 7. Banco de microorganismos aislados de diferentes
fuentes………………………………………………………..
33 Figura 8. Determinación cualitativa de los aislados de diferentes
muestras de sustratos………………………………………
34 Figura 9. Microorganismos que presentaron mayor halo de
hidrólisis inoculados individualmente……………………..
35 Figura 10. Fragmentos amplificados de los aislados microbianos
de la región 16s del ARNr de aproximadamente 1400 pb, en gel de agarosa 1%................................................
36 Figura 11. Árbol filogenético basado en secuencias de la región
16S del ADNr, los números en las ramas indican los valores de bootstrap (>50 %). Los aislados de este estudio se representan en color rojo……………………...
38 Figura 12. Perfil cinético de crecimiento de los microorganismos
aislados en un tiempo de incubación de 48 h……………
39 Figura 13. Perfil cinético de la actividad lipolítica de Terribacillus
aidingensis a través del tiempo…………………………...
40 Figura 14. Perfil cinético de las actividades lipolíticas de Serratia
liquefaciens a través del tiempo…………………………...
41 Figura 15. Perfil cinético de actividades lipolítica de Bacillus
subtilis a diferentes tiempos……………………………….
42 Figura 16. Efecto de las fuentes de carbono sobre la actividad
lipolítica de Terribacillus aidingensis a diferentes tiempos……………………………………………………….
43 Figura 17. Cinética de producción de actividad lipolítica utilizando
diferentes fuentes de carbono para Serratia liquefaciens…………………………………………………..
44 Figura 18. Actividad Lipolítica de Bacillus subtilis con diferentes
fuentes de carbono a diferentes tiempos de incubación..
45 Figura 19. Gráfica de Pareto de todos los factores evaluados
sobre la actividad lipolítica (UI/mL)………………………
48
XII
Figura 20. Gráfica de Pareto de todos los factores evaluados sobre la productividad lipolítica máxima (UI/mL/h)………
49
Figura 21. Grafica de Pareto de todos los factores sobre la actividad específica (UI/DO595nm)………………………….
50
XIII
ÍNDICE DE CUADROS
Pág. Cuadro 1. Fuentes de obtención de enzimas………………………….. 4
Cuadro 2 Aplicaciones industriales de las lipasas…………………… 8 Cuadro 3. Principales microorganismos productores de enzimas
lipolíticas………………………………………………………. 10
Cuadro 4. Microorganismos con actividad lipolítica utilizando diferentes fuentes de carbono e inductores……………….
11
Cuadro 5. Rendimientos de biodiesel utilizando diferentes catalizadores…………………………………………………..
15
Cuadro 6. Total de aislados por zona de muestreo…………………… 32 Cuadro 7. Análisis cualitativo de actividad lipolítica de los 204
microorganismos aislados de las diferentes fuentes de sustratos……………………………………………………….
34
Cuadro 8. Selección de los mejores halos de hidrólisis pertenecientes a cada fuente de sustrato………………….
35
Cuadro 9. Análisis comparativo de las secuencias obtenidas con secuencias de referencia en el BLAST-NCBI……………..
37
Cuadro 10. Mejores actividades obtenidas de cada uno de los aislados con los inductores analizados……………………
42
Cuadro 11. Mejores actividades obtenidas de cada uno de los aislados con las diferentes fuentes de carbono analizadas……………………………………………………...
45
Cuadro 12. Resumen de las mejores actividades lipolíticas de cada uno de los aislados utilizando diferentes inductores……...
46
Cuadro 13. Resumen de las mejores actividades lipolíticas de cada aislado utilizando una fuente de carbono………….............
47
XIV
GLOSARIO
Ácido Graso: Es una biomolécula de naturaleza lipídica formada por una larga
cadena hidrocarbonada lineal, de diferente longitud o número de átomos de carbono,
en cuyo extremo hay un grupo carboxilo
Actividad enzimática: Es una medida de la cantidad de enzima activa presente y
del nivel de actividad de la misma, se expresa en Unidades Internacionales (UI) por
mL, considerando una unidad como la cantidad de enzima que libera 1 μmol de
sustrato por minuto.
Biocombustible: Son los biocombustibles obtenidos a partir de biomasa, pueden ser
sólidos como carbón de leña y madera, líquido como etanol, biodiesel y aceites de la
pirólisis, o gaseosos como el biogás (metano).
Biodiesel: Es un biocombustible sintético líquido que se obtiene a partir de lípidos
naturales como aceites vegetales o grasas animales, nuevos o usados, mediante
procesos industriales de esterificación y transesterificación, y que se aplica en la
preparación de sustitutos totales o parciales del petrodiésel o gasóleo obtenido del
petróleo.
Buffer: Es un sistema constituido por un ácido débil y su base conjugada, o por una
base y su ácido conjugado que tiene capacidad tamponante, es decir, que puede
oponerse a grandes cambios de pH (en un margen concreto) en una disolución
acuosa.
Catalizador: Es una sustancia capaz de acelerar una reacción química; no alteran el
balance energético final de la reacción, sino que sólo permite que se alcance el
equilibrio con mayor o menor velocidad
XV
Enzima: Son biocatalizadores complejos de gran especificidad, producidos por
células de organismos vivos, que aumentan la velocidad de reacciones biológicas.
Inductor: Sustancia que induce la síntesis enzimática.
Lipasas: Son enzimas que catalizan preferentemente la hidrólisis de triacilglicéridos
hasta ácidos grasos libres y alcoholes, además de otras reacciones que implican
ésteres carboxílicos tales como esterificación, acidólisis, interesterificacion y
alcohólisis.
Microorganismos lipolíticos: Microorganismos que poseen enzimas capaces de
hidrolizar grasa y aceites, incluyen bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos.
PCR: La reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés Polymerase
Chain Reaction), permite obtener millones de copias de un fragmento de ácido
desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola molécula original.
Sobrenadante: Parte superior clara de cualquier mezcla después de ser
centrifugada.
Sustrato: Es una molécula sobre la que actúa una enzima.
Transesterificación: Es el proceso de intercambiar el grupo alcoxi de un alcohol.
Tributirina: Es un éster compuesto de ácido butírico y glicerol, de sabor amargo y
olor similar a la mantequilla rancia.
Triglicérido: Es un tipo de glicerol que pertenece a la familia de los lípidos. Este
glicérido se forma por la esterificación de los tres grupos OH de los gliceroles por
diferentes o igual tipo de ácidos grasos, concediéndole el nombre de triglicérido.
XVI
ABREVIATURAS
BAR Bacteria aceite residual BAT Bacteria agua termal BSCA Bacteria suelos contaminado con aceite °C Grados centígrados cm Centímetros DO Densidad óptica g Gramos h Horas HCl Ácido Clorhídrico H3PO4 Ácido Fosfórico H2SO4 Ácido sulfúrico NaOH Hidróxido de Sodio KOH Hidróxido de Potasio L Litros LB Lysogeny Broth M Molar mL Mililitros min Minutos μl Microlitros µg microgramo Na2CO3 Carbonato de calcio nm Nanómetros Pb Pares de bases pNP para nitrofenol pNPA para nitrofenol acetato pNPB para nitrofenol butirato pNPL para nitrofenol laurato pNPP para nitrofenol palmitato PDA Agar papa dextrosa rpm Revoluciones por minuto UFC Unidades formadoras de colonia UI Unidades Internacionales v/v volumen/ volumen p/v peso/volumen
XVII
RESUMEN
La producción de biodiesel a partir de enzimas lipolíticas como catalizadores es una
alternativa atractiva al proceso convencional (con catalizadores químicos), ya que conlleva
menos etapas en el proceso, el cual son más amigables con el medio ambiente. Sin
embargo, los costos de estas enzimas son elevados, resultando una alternativa el uso de
microorganismos productores de lipasas. El objetivo del presente trabajo fue aislar,
caracterizar e identificar microorganismos con actividad lipolítica nativos del estado de
Sinaloa, para futuras aplicaciones biotecnológicas. Se aislaron un total de 204
microorganismos de diferentes sitios: suelo contaminado de aceite, aguas termales y aceite
vegetal usado, el 78.9% presentaron actividad lipolítica. Los mejores tres aislados (BAR02,
BSCA34 y BAT25) fueron seleccionados ya que presentaron la mayor actividad lipolítica en
medio sólido (halos de hidrólisis). Enseguida, los aislados se identificaron a nivel molecular, y
de acuerdo a las secuencias obtenidas los microorganismo correspondieron a Terribacillus
aidingensis (BAR02), Serratia liquefaciens (BSCA34) y Bacillus subtilis (BAT25).
Posteriormente, la capacidad de producción de lipasas de los aislados seleccionados fue
evaluada ante diferentes inductores (aceite de oliva, aceite de girasol, aceite vegetal usado y
Tween 80) y fuentes de carbono (glucosa, sacarosa, almidón y glicerol). El empleo de Tween
80 permitió obtener una mayor producción de la actividad lipolítica en cada aislado T.
aidingensis 0.0373 UI/mL, S. liquefaciens 0.226 UI/mL y B. subtilis 0.0449 UI/mL. Respecto a
la fuente de carbono, la glucosa tuvo un efecto positivo sobre la actividad en S. liquefaciens y
T. aidingensis, mientras que en B. subtilis la adición de una fuente de carbono disminuyó la
actividad lipolítica con 0.0290 UI/mL. También se demostró que la cepa de S. liquefaciens
presentó la mayor actividad lipolítica y fue seleccionada para continuar con los experimentos.
Finalmente, para evaluar el efecto de diferentes concentraciones de inductor (Tween 80),
fuente de carbono (glucosa) y fuente de nitrógeno (extracto de levadura) en S. liquefaciens,
se empleó un diseño factorial 23. Las variables de respuesta fueron la actividad lipolítica
(U/mL), la productividad máxima de actividad lipolítica (U/mL.h) y la actividad lipolítica
específica (U/UFC). Los resultados mostraron que a mayor concentración de glucosa y
extracto de levadura, es menor la actividad lipolítica, la productividad máxima y la actividad
lipolítica específica. Mientras que, altas concentraciones del inductor favorecen estas
variables. Además el experimento demostró que la actividad lipolítica no está correlacionada
con la concentración de biomasa en el medio en S. liquefaciens.
Palabras Claves: Biocombustibles, Biodiesel, Lipasas, Actividad Lipolítica.
XVIII
ABSTRACT
Biodiesel production from lipolytic enzymes as catalysts is an attractive alternative to
conventional process (with chemical catalysts), since it includes fewer steps, and is
environmental friendly. However, since the cost of these enzymes is high, the use of lipase
producing microorganisms becomes an alternative. The main goal of this study was to
isolate, characterize and molecular identify microorganisms with lipolytic activity, which are
native to Sinaloa state in order to be use in for future biotechnological applications. A total of
204 microorganisms were isolated from the next different sites: oil contaminated soil, hot
springs, and used vegetable oil, 78.9% of those microorganisms showed lipase activity. The
three isolates (BAR02, BSCA34 and BAT25) showed the highest lipolytic activity on solid
medium (hydrolysis halos) and were selected. Then, the isolates were identified at the
molecular level, and according to the sequences obtained they correspond to the
microorganism Terribacillus aidingensis (BAR02), Serratia liquefaciens (BSCA34) and
Bacillus subtilis (BAT25). Subsequently, lipase production capacity of the selected isolated
was evaluated under different inductors such as olive oil, sunflower oil, used vegetable oil
and Tween 80, and well as carbon sources such as glucose, sucrose, starch and glycerol.
The use of Tween 80 yielded a higher lipolytic activity compared to other inductors for each
isolated: T. aidingensis 0.0373 UI/mL, S. liquefaciens 0.226 UI/mL and B. subtilis 0.0449
UI/mL. Regarding to the carbon source, glucose had a positive effect on the activity S.
liquefaciens and T. aidingensis, while the lipolytic activity of B. subtilis decreased to 0.0290
IU/mL when supplemented with any carbon source. The strain of S. liquefaciens showed the
highest lipolytic activity and was selected in further experiments. Finally, to evaluate the effect
of different concentrations of inductor (Tween 80), carbon source (glucose) and nitrogen
source (yeast extract) in S. liquefaciens, a factorial design 23 was used. The response
variables were: lipolytic activity (U/mL), maximum productivity of lipolytic activity (U/mL.h) and
specific lipolytic activity (U/UFC). The results showed that the higher the concentration of
glucose and yeast extract the lower the lipolytic activity, maximum productivity and specific
lipolytic activity; while high concentrations of inducer favors these variables. Furthermore, the
experiment showed that lipolytic activity does not correlated with S. liquefaciens biomass
concentration.
Keywords: biofuel, biodiesel, lipase, lipolytic activity
1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas se consideran como catalizadores de la naturaleza. La mayoría de las
enzimas son producidas por la fermentación de materiales de base biológica. Los
lípidos constituyen una gran parte de la biomasa de la tierra, y enzimas lipolíticas
juegan un papel muy importante en la producción de estos compuestos insolubles en
agua. Las enzimas lipolíticas están involucradas en la degradación y por lo tanto en
la movilización de los lípidos dentro de las células de los organismos individuales, así
como la transferencia de lípidos de un organismo a otro.
Los beneficios particulares ofrecidos por las enzimas son principalmente
especificidad, condiciones suaves de reacción y reducción de residuos. Las enzimas
microbianas son a menudo más útiles que las enzimas derivadas de plantas o
animales a causa de la gran variedad de actividades catalíticas disponibles, los altos
rendimientos, la facilidad de manipulación genética, así como también el rápido
crecimiento de microorganismo en un medio de bajo costo, también son más
estables, su producción es más conveniente y más segura.
Actualmente, las enzimas lipolíticas están atrayendo una enorme atención por
su gran potencial biotecnológico. Constituyen el grupo más importante de
biocatalizadores para aplicaciones biotecnológicas. La producción de un alto nivel de
lipasas microbianas requiere no solo la sobreexpresión eficiente de los genes
correspondientes, sino también una comprensión detallada de los mecanismos
moleculares que regulan su plegamiento y secreción. Nuevas aplicaciones
biotecnológicas se han establecido con éxito el uso de lipasas para la síntesis de
biopolímeros, la producción de productos farmacéuticos enantiopuros, agroquímicos
y compuestos de sabor (Hasan et al., 2006).
También y debido a la alta demanda de los combustibles convencionales, una
fuente alternativa de energía para el transporte público es el biodiesel, éste se origina
a partir de recursos naturales renovables como el aceite de semillas oleaginosas
(soya, maíz, colza, oliva, girasol, jatropha, higuerilla, salicornia), aceite vegetal usado
y grasas animales mediante un proceso llamado reacción de transesterificación,
utilizando compuestos químicos o enzimas lipolíticas como catalizadores.
2
Por lo anterior, el presente trabajo tuvo como objetivo aislar, caracterizar e
identificar molecularmente microorganismos con actividad lipolítica nativos del estado
de Sinaloa. Para esto, el aislamiento se llevó a cabo a partir de las siguientes
fuentes de sustratos: suelos contaminados con aceites, aguas termales y aceites
vegetales usados, enseguida se identificaron a nivel molecular los aislados obtenidos
mediante la amplificación de la región 16S del ADNr. Finalmente, fueron
caracterizados los microorganismos seleccionados por medio de su cinética de
crecimiento y la actividad enzimática a nivel cuantitativo utilizando diferentes
inductores y fuentes de carbono.
3
2. ANTECEDENTES
2.1 Enzimas
2.1.1 Generalidades
En los seres vivos, generalmente las reacciones químicas son catalizadas por
moléculas de naturaleza proteica que reciben el nombre de enzimas. Las enzimas
aumentan la velocidad de las reacciones químicas al reducir la barrera de energía
libre que separa los reactivos de los productos por diversos mecanismos, que
dependen de la disposición de grupos funcionales en el sitio activo de la enzima,
región donde tiene lugar la catálisis. Los sustratos se unen al sitio activo de las
enzimas, que generalmente es una hendidura o cavidad en la molécula proteínica
grande. La forma y distribución de la carga del sitio activo de una enzima limitan los
movimientos y las condiciones permitidas del sustrato, haciendo que éste se asemeje
más al estado de transición. Es decir, la estructura del sitio activo se utiliza para
orientar la forma óptima del sustrato. La combinación del sustrato (reactivo) y la
enzima crea una nueva vía de reacción cuya energía del estado de transición es
menor que la reacción en ausencia de la enzima. Como consecuencia la velocidad
de la reacción se incrementa en grado significativo respecto a la de la reacción no
catalizada. Las enzimas, como todos los catalizadores, no alteran el equilibrio de la
reacción sino que aumenta la velocidad de aproximación hacía el equilibrio (Berg,
2008).
2.1.2 Fuentes de obtención de enzimas
Las enzimas son producto de las células y, por tanto, pueden obtenerse a partir de
cualquier ser vivo. Durante muchos años, la fuente principal de enzimas fueron
tejidos de plantas y órganos de animales (IIlanes, 2008). Actualmente, se siguen
empleando algunas de ellas (principalmente proteasas) con gran éxito (Cuadro 1), se
prefiere el uso de las enzimas producidas por microorganismos, debido que
presentan ciertas ventajas. El método de obtención de enzimas a partir del cultivo de
microorganismos mediante procesos fermentativos suele ser de menor costo, más
rápido y más sencillo que el método para obtener enzimas de fuentes vegetales o
animales, ya que está sujeta a una gran variación del rendimiento, lo que no ocurre
4
con las enzimas microbianas. Algunas enzimas de fuentes vegetales están
disponibles en ciertas temporadas del año y, por tanto, sujetas a las variaciones
estacionales, mientras que las enzimas microbianas se pueden producir durante todo
el año sin ninguno de estos obstáculos. Ciertos microorganismos son capaces de
crecer en condiciones ambientales extremas, por lo que sus enzimas suelen ser más
estables que las de origen vegetal o animal, además los microorganismos son más
fáciles de manipular genéticamente, para incrementar el rendimiento de la enzima
(Panesar et al., 2010).
Cuadro 1. Fuentes de obtención de enzimas
Enzima
No. E.C.
Fuente
Enzimas microbianas
α-Amilasa 3.2.1.1 Bacillus licheniformis, B, subtilis Invertasa 3.2.2.26 Saccharomyces cerevisiae β-galactosidasa 3.2.1.23 Kluyveromyces fragilis Celulasa 3.2.1.4 Aspergillus sp., Trichoderma sp. Pectinasa 3.2.1.15 A. niger Proteasa 3.4.24.4 Bacillus subtilis, Streptomyces
griseus Lipasa 3.1.1.3 Candida sp. Enzimas de plantas Bromelina 3.4.22.4 Piña Papaina 3.4.22.2 Papaya Enzimas de animales Quimotripsina 3.4.21.1 Pancreas Lipasa 3.1.1.3 Pancreas Lisozima 3.2.2.17 Huevo de pollo Quimosina 3.4.23.4 Estomago de terneros
Fuente: Panesar et al., 2010
Los microorganismos representan la mayor fuente de recursos
biotecnológicos. Son atractivos como fuentes de enzimas, especialmente porque se
pueden incrementar los niveles de enzima manipulando los mecanismos que regulan
su síntesis mediante distintos procedimientos. Los métodos tradicionales así como
las nuevas herramientas tales como la metagenómica para encontrar actividades
nuevas o mejoradas en la biodiversidad, ciertamente impactan en gran medida la
biotecnología enzimática actual (Fernández et al., 2010).
5
2.1.3 Clasificación de enzimas
La Comisión de Enzimas (EC) de la Unión de Bioquímica (IUB) y Unión Internacional
de Química Pura y Aplicada (IUPAC) propusieron una clasificación de las enzimas en
seis grandes grupos, cuyas diferencias se basaban en la especificidad de reacción
de las diversas enzimas. Dentro de cada uno de estos grandes grupos se incluyen
subgrupos basados en especificidad del grupo funcional afectado por la reacción en
la naturaleza de la coenzima envuelta y finalmente en el sustrato específico
transformado. Existen seis grandes grupos de enzimas (Teijón et al., 2009).
1. Oxido-Reductasas: Catalizan reacciones de óxido-reducción
2. Transferasas: Catalizan transferencia de grupos químicos de un
compuesto a otro.
3. Hidrolasas: Catalizan el desdoblamiento hidrolítico de determinados
enlaces.
4. Liasas: Catalizan la ruptura no hidrolítica de determinados enlaces.
5. Isomerasas: Catalizan cambios geométricos o estructurales dentro de
una molécula.
6. Ligasas: Catalizan la unión de dos moléculas en un proceso acoplado a
la hidrólisis de un enlace pirofosfato del ATP o una molécula análoga.
Con el objeto de reducir la confusión la Comisión de Enzimas de la Unión
Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha diseñado un sistema lógico de
denominación y numeración:
(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/nomenclature/).
2.2 Lipasas
Las lipasas son enzimas cuyo modo de acción es influenciado por la naturaleza del
medio en que se encuentran y por la condición hidrofílica del mundo biológico, de
acuerdo con la definición de la Comisión de Enzimas de la IUPAC las lipasas
(Triacílglicerol éster hidrolasas, EC 3.1.1.3) son enzimas que catalizan
preferentemente la hidrólisis de triacilglicéridos hasta ácidos grasos libres y
6
alcoholes, además de otras reacciones que implican ésteres carboxílicos tales como
esterificación, acidólisis, interesterificacion y alcohólisis. Las lipasas pertenecen a la
familia de las hidrolasas, es decir hidrolizan los ésteres de ácidos grasos,
principalmente de cadena larga (García- Román, 2005).
Las lipasas fueron identificadas por primera vez por el microbiólogo C.
Eijkmann a principios del siglo XX, sus particulares características fueron descritas
inicialmente por Schonheyder y Volqvartz (1945), siendo Sarda y Desnuelle (1958)
los primeros en estudiarlas a profundidad, definiéndolas en términos cinéticos.
Una de las características más notorias que presentan este tipo de enzimas,
es el denominado “fenómeno de activación interfacial”, el cual sólo ha sido observado
en lipasas. Este fenómeno de activación interfacial se debe a un dominio hidrofóbico,
denominado “lid” que significa tapa, que se encuentra alrededor del centro activo de
la enzima, por lo que requiere una concentración crítica de sustrato para que se
produzca el movimiento “lid” haciendo accesible el sustrato al centro activo. Por ello,
las esterasas obedecen a la clásica cinética de Michaelis-Menten, mientras que las
lipasas presentan una cinética compleja no Micheliana (Akoh et al., 2004).
2.2.1 Estructura y mecanismo de acción
Con respecto a su estructura, todas las enzimas lipolíticas presentan el plegamiento
típico de las α/β hidrolasas (“α/β hydrolase fold) que consiste en una estructura
central formada por 8 láminas β interconectadas por hélices α (Figura 1). El centro
activo de estas enzimas, que está cubierto por una lid en las lipasas, tiene tres
aminoácidos catalíticos cuya posición dentro del plegamiento suele estar
conservada. Los tres aminoácidos que forman la triada catalítica son la serina
nucleofílica, un ácido aspártico o un ácido glutámico y una histidina (Navarro, 2012).
7
Figura 1. Representación esquemática de la conformación canónica α/β que presentan todas las lipasas conocidas (Schrag y Cygler, 1997).
El mecanismo de actuación de las lipasas es el mismo que en esterasas, está
basado en un sistema de intercambio de cargas y consta de cuatro pasos. Tras la
unión del sustrato, se produce el ataque nucleofílico por parte del grupo hidroxilo de
la serina catalítica sobre el enlace éster del sustrato. La serina es capaz de atacar al
sustrato gracias a protonación de la histidina, y ésta a su vez se estabiliza gracias al
puente de hidrogeno que se forma con el ácido aspártico. La actuación de estos dos
aminoácidos (histidina y glutámico) se conoce con el nombre de sistema de relevos
de cargas (charge relay), debido a las interacciones químicas que se producen entre
ambos se lleva a cabo la activación de la serina. Este ataque nucleofílico inicial forma
un tetraedro intermedio que es estabilizado por la presencia de dos glicinas cercanas
al centro activo, formando el centro oxyanionico. Este tetraedro es rápidamente
descompuesto con la ayuda de la histidina protonada, lo que provoca la liberación del
alcohol del enlace éster y la formación del complejo acyl-enzima. En presencia de
agua, el complejo acyl-enzima es atacado por una molécula de agua, con la ayuda
de la histidina formándose un segundo tetraedro intermedio. Inmediatamente
después de la formación del tetraedro intermedio se produce la liberación del ácido
graso y como consecuencia de ello la regeneración del centro activo (Stock et al.,
2004).
2.2.2 Reacciones catalizadas por lipasas
Una característica muy importante de las lipasas, es la capacidad que tiene de llevar
a cabo reacciones en la interfase de un medio orgánico y acuoso (Gupta et al., 2004;
Sharma et al., 2001). Algunas de las reacciones que catalizan las lipasas son:
8
hidrólisis, interesterificación, acidólisis, aminólisis, politransesterifiación, glicerólisis,
alcohólisis, acilación, esterificación y transesterificación.
En el Cuadro 2 se muestran las aplicaciones a nivel industrial de las lipasas en
diferentes áreas.
Cuadro 2. Aplicaciones industriales de las lipasas.
Industria Aplicación
Industria alimentaria Mejoramiento de sabores, tratamiento de carnes y quesos fermentados
Industria farmacéutica Síntesis orgánica de compuestos, producción de esteroides
Tratamiento terapéutico Reducción de peso
Aplicaciones cosméticas Cremas humectantes y cremas de afeitar
Tratamientos de aguas residuales con altos contenidos de grasas
Degradación y remoción de sustratos grasos
Industria de detergentes y biosurfactantes
Aditivo para detergentes para eliminación de manchas de grasas
Industria de Panificación Acondicionado y estabilizado de la masa (emulsificador).
Industria de Pulpa y Papel Control de desechos y contaminantes
Fuente: Jeager et al., 1994
2.3 Microorganismos productores de lipasas
Existe una gran variedad de microorganismos que secretan lipasas durante su
crecimiento en una gran variedad de sustratos principalmente en desechos o
residuos orgánicos, ya que éstos contienen una abundante fuente de nutrientes que
sirve como medio de cultivo para que los microorganismos sean capaces de producir
estas enzimas. Lo cual indica que el mismo ambiente natural nos ofrece un amplio
potencial para aislar nuevas fuentes de lipasas con propiedades novedosas. A partir
de estos nichos se han aislado bacterias, hongos filamentosos, levaduras y
actinomicetos, entre los que sobresalen los géneros Pseudomonas, Bacillus,
Rhodococcus, Staphylococcus, Rhizopus, Mucor, Candida, Asperiguillis y
Geotrichum sp., por su capacidad para producir lipasas extracelulares (Cuadro 3).
Esta característica facilita, la recuperación de estas enzimas a partir del medio de
9
cultivo (Ertugrul y Donmez, 2007). Dado que las lipasas se encuentran entre las
enzimas más ampliamente utilizadas en procesos biotecnológicos y en procesos
químicos, la investigación se ha enfocado en la búsqueda de nuevos
microorganismos con diferentes propiedades lipolíticas deseadas (Aceves y
Castañeda, 2012).
A pesar del gran número de microorganismos productores de lipasas, sólo
unas pocas especies de bacterias se han evaluado para la producción de etas
enzimas. Se han reportado algunas cepas productoras de lipasas tales como:
Acinetobacter sp., Achromobacter lipolyticum, Aeromonas hydrophila, Bacillus
sphaericus, Photobacterium lipolyticum, Morexella sp., Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas fragi, Psychrobacter okhotskensis, Serratia marcescens y
Staphylococcus epidermidis (Joseph et al., 2007).
Asimismo, se han evaluado diferentes especies de los mohos como
Aspergillus y Penicillium para la producción de lipasas extracelulares en medios de
cultivos sólidos y líquidos utilizando como agente inductor aceite de oliva (Yadav et
al., 1998).
Entre las levaduras, el género Candida es el microorganismo que presenta el
mayor potencial para la producción de lipasas y ha sido reportado en la literatura por
(Vakhlu y Kour, 2006). Las lipasas producidas por C. rugosa se han convertido en
unas de las más utilizadas por la industria, debido a su alta actividad en procesos
tanto de hidrólisis como de síntesis, por ejemplo en la producción de ácidos grasos a
partir de aceite de ricino.
10
Cuadro 3. Principales microorganismos productores de enzimas lipolíticas
Microorganismos productores de lipasas Referencias
Thermomyces lanuginose Cabrera et al., 2007
Penicillum spp. Gutiérrez et al., 2009
Geotrichum sp. Cai et al., 2009
Spirulina plantesis Demir y Tukel, 2010
Brevibacillus borstelensis Kumari, 2011
Rhizopus oryzae Lee et al., 2011
Geobacillus thermodentrificans Balan et al., 2012
Serratia marcenses Gupta y Gupta, 2012
Mucor miehei Gustafsson et al., 2012
Staphylococcus sp. Daoud et al., 2013
Bacillus subtilis. Emtenani et al., 2013
Stenotrophomonas maltophila Li et al., 2013
Mucor javanicus Galan et al., 2013
Pseudomonas sp. Patel, V. et al., 2014
Candida antarctica Anika et al., 2014
Terribacillus sp. Escobar-Niño et al., 2014
Pseudomonas cepacia Meng et al., 2014
Cohnella sp. Poopreydy et al., 2015
Streptomyces sp. Ayaz, Ugur y Boran, 2015
Aspergillus niger Salihu et al., 2015
Aspergillus terreus Hu et al., 2015
Geotrichum candidum Brabcová et al., 2015
Candida rugosa Mohamad et al., 2015
Candida cylindracea Kabbashi et al.,2015
Pseudomonas fluorescens Guldhe et al., 2015
Dentro de los trabajos realizados en el aislamiento, caracterización e
identificación molecular de microorganismos lipolíticos, podemos citar a Rodríguez
et al. (2013), quienes aislaron de muestras de aguas residuales una cepa identificada
como Aeromonas sp., evaluando la actividad enzimática lipolítica utilizando glucosa y
11
aceite de oliva como fuente de carbono e inductor respectivamente, reportando
actividad enzimática de 19.15 UI/ml. En el cuadro 4 se muestran microorganismos
con actividad lipolítica reportando diversidad de actividad lipasa, utilizando diferentes
fuentes de carbono e inductores.
Cuadro 4. Microorganismos con actividad lipolítica utilizando diferentes fuentes de carbono e inductores
Autor y año Microorganismo Fuente de carbono
Inductor Biomasa Actividad enzimática
Sanghamitra et al. (2009)
Bacteria Bacillus cereus
Almidón 2% Aceite de oliva 2% NP 33±0.567 U/mL
Thanagrit y Thidarat (2013)
Levadura Candida sp.
Glucosa 3% Aceite de palma 12.5%
18.77 g/L 1.200 U/mL
Rodrigues et al. (2013) Bacteria Aeromonas sp.
Glucosa 1% Aceite de oliva 3% 6.38 mg/mL
19.15 U/mL
Sharma et al. (2014) Bacteria Bacillus sp.
Glucosa 0.2% Aceite de oliva 1% 1.633 DO 0.612 U/mL
Salihu et al. (2015) Hongo Aspergillus niger
Sacarosa 0.4% Aceite de oliva 1.2%
Tween 80 1%
NP 4.46 U/mL 7.36 U/mL
2.4 Fuentes de aislamiento de microorganismos lipolíticos
La producción de lipasas es un proceso que en gran medida depende del
microorganismo empleado, así mismo también desempeñan un papel fundamental
en el proceso de producción de estas enzimas el tipo de cultivo y la composición del
medio de cultivo. (Aceves y Castañeda, 2012). Sin embargo existe una gran variedad
de sustratos de lo que se pueden aislar microorganismos que presentan enzimas
lipolíticas, como aceites vegetales (Escobar- Niño et al., 2014), suelos contaminados
con aceite (Ali et al., 2014), aguas termales (Bish, 2011) y alimentos deteriorados
(Sanseaga et al., 2016).
2.4.1 Aceite vegetal usado
Se toma poca atención a los residuos generados luego de cumplir su función
alimentaria, el óptimo aprovechamiento energético de estos aceites no atentaría de
manera alguna contra la seguridad alimentaria de la población. Por ello, una
alternativa de solución tecnológica para la correcta gestión de estos aceites de
desecho y su utilidad energética es su bioconversión utilizando microorganismos con
12
capacidad de lipólisis a través de la enzima lipasa (Mendoza-Canales, 2012). En el
aceite pueden existir microorganismos lipolíticos debido a que estos sitios
comprenden la presencia de triglicéridos de cadena larga que son sustratos
naturales de lipasas.
2.4.2 Suelo contaminado con aceite
Existe una gran diversidad de microorganismos que viven en el suelo. El número y
tipos de microorganismos presentes en el suelo dependen de diversos factores
ambientales como son los nutrientes, humedad, aireación, temperatura, pH, prácticas
agrícolas, etc. Existen del orden de varios miles de millones de bacterias por gramo
de suelo. La mayor parte son heterótrofos, siendo comunes los bacilos esporulados,
los actinomicetos que son los responsables del olor a tierra mojada, y en la rizósfera
(región donde el suelo y las raíces de las plantas interaccionan) especies de los
géneros Rhizobium y Pseudomonas (Sagar et al., 2013).
2.4.3 Agua termal
Microorganismos termófilos presentan de manera inequívoca una valiosa fuente de
enzimas altamente termoestables, con numerosas ventajas hacia aplicaciones
biotecnológicas debido a sus tasas de estabilidad y una alta reacción a temperaturas
elevadas (Stathopoulou et al., 2013).
Las aguas minerales termales son un tipo de hábitats extremos en los que se
encuentran este tipo de microorganismos, debido a que presentan altas temperaturas
y elevadas concentraciones de sales, las cuales hacen que estas condiciones sean
desfavorables para la vida de muchos seres vivos. Desde hace tiempo se conoce
que estas aguas minerales, como cualquier ambiente acuático natural, poseen una
población microbiana autóctona que suele ser característica de cada tipo de agua y
que depende de sus propiedades fisicoquímicas (temperatura, pH, sales minerales,
nutrientes,etc.). La importancia de aislar microorganismos de este tipo de ambientes
radica principalmente en que las enzimas producidas por estos microorganismos
catalizan reacciones bioquímicas a altas temperaturas incrementando de esta
13
manera el rendimiento de los procesos industriales y disminuyendo el costo de
producción (Rubiano, 2006).
2.5 Importancia de las lipasas
Las enzimas lipolíticas han recibido un gran protagonismo debido a las ventajas que
presentan: poseen diversas actividades catalíticas, se pueden obtener en grandes
cantidades, se producen de forma regular, son estables y su proceso de producción
es más factible y seguro, debido a que los microorganismos son fáciles de cultivar
por sus simples exigencias nutritivas y su tiempo de generación más reducido
(Olempksa-Beer et al., 2006).
Este tipo de enzimas son de gran importancia en la industria por sus múltiples
aplicaciones debido a que llevan a cabo la degradación de sustratos con alto
contenido graso, y pueden participar en reacciones de esterificación en la industria
alimentaria, farmacéutica y cosmética. Las lipasas han sido encontradas en muchas
especies de animales (Carriere et al., 1994), plantas (Belguith et al., 2009) y
microorganismos (Olempska-Beer et al., 2006). Sin embargo, las lipasas microbianas
son mucho más versátiles y presentan características interesantes como estabilidad
en solventes orgánicos, actividad bajo diversas condiciones, alta especificidad de
sustrato, así como regio y enantioselectividad (Kempka et al., 2008).
2.6 Aplicaciones biotecnológicas de las lipasas
Hoy en día los procesos desarrollados en la industria que son catalizados por
enzimas son mucho más numerosos, debido a que presentan una serie de ventajas
frente a los catalizadores no biológicos convencionales. Las lipasas microbianas
constituyen uno de los grupos más importantes de biocatálisis por sus amplias e
importantes aplicaciones en la industria alimentaria, como la producción de grasas
con propiedades físicas y químicas deseables, además de contener una baja
proporción de grasas trans en el producto final, a diferencia de los procesos de
hidrogenación y transesterificación química.
El interés en la producción biotecnológica de las lipasas radica en sus diversas
aplicaciones como aditivos alimentarios en la modificación del sabor, síntesis de
14
ésteres con una importante actividad antioxidante, hidrólisis de grasas para la
fabricación de detergentes, tratamiento de aguas residuales específicamente en la
degradación y remoción de sustratos grasos (aceitosos), eliminación de lípidos y
aceites en la industria cosmética y farmacéutica (Burkert et al., 2004).
Asimismo, gracias a su capacidad para llevar a cabo reacciones de
transesterificación las lipasas han adquirido recientemente un papel muy importante
en la producción de biocombustibles, particularmente en la producción de biodiesel,
como resultado de la creciente demanda mundial en el uso de energía renovable
(Aceves y Castañeda, 2012).
2.7 Biodiesel
El biodiesel es un biocombustible sintético líquido que se obtiene a partir de lípidos
naturales como aceites vegetales (nuevos o usados) o grasas animales, mediante
procesos industriales de esterificación y transesterificación, y que se aplica en la
preparación de sustitutos totales o parciales del petrodiésel o gasóleo obtenido del
petróleo. El biodiesel se puede mezclar con gasóleo procedente del refino de
petróleo en diferentes cantidades (Legaz, 2010).
La producción y el consumo del biodiesel en el mundo se ha incrementado
notablemente en los últimos años, impulsando la búsqueda de nuevas fuentes de
energía y la disminución de la dependencia del abastecimiento de combustible de
otros países (Bozbas, 2008).
El biodiesel comercial es producido a partir de fuentes renovables de aceites,
que están compuestos de triglicéridos de ácidos grasos de cadena larga (de 14-20
carbonos pero pueden variar). Estos triglicéridos son convertidos a sus respectivos
ésteres alquilados por una reacción de transesterificación, utilizando alcoholes de
cadena corta (típicamente metanol), dando como subproducto glicerol (Li y Xie
2006). Normalmente, la mayoría del biodiesel es preparado utilizando catalizadores
básicos homogéneos como, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, así como
alcóxidos de potasio o sodio con los que no se forma glicerol como subproducto. Por
15
otro lado, el proceso de catálisis ácida es conveniente cuando los aceites contienen
un alto contenido de ácidos grasos libres y agua. La desventaja de este proceso es
que el tiempo de reacción es muy largo (48-96 h) (López et al., 2010).
2.7.1 Uso de lipasas para la producción de biodiesel
Industrialmente, los catalizadores más utilizados son los hidróxidos de sodio o
potasio, por ser baratos y muy reactivos. Sin embargo, la remoción de este
catalizador después de la reacción es técnicamente difícil y se utiliza una gran
cantidad de agua para separar y lavar el catalizador y los productos, lo cual
representa una desventaja. Además, uno de los requisitos para la utilización de estos
catalizadores es que los aceites utilizados como sustratos preferentemente deben no
contener ácidos grasos libres y el alcohol utilizado debe ser anhídro (<1% de agua)
con la finalidad de no formar jabón o emulsiones que pueden dificultar aún más la
fase de separación del biodiesel y el glicerol, lo cual añade un costo extra al precio
final del biodiesel (Mittelbach y Tritthart, 1988).
Generalmente, durante la reacción de transesterificación un catalizador es
utilizado con la finalidad de mejorar y aumentar la velocidad de reacción. Diversos
catalizadores han sido utilizados en el proceso de producción de biodiesel y cada tipo
de reacción de transesterificación presenta características muy particulares y su uso
depende de la calidad de la materia prima que se pretende utilizar. En el cuadro 5, se
observa el rendimiento de biodiesel utilizando diferentes catalizadores, partiendo de
una misma fuente de ácidos grasos (Moreno, 2013; Ortiz, 2012).
Cuadro 5. Rendimientos de biodiesel utilizando diferentes catalizadores
Catalizador
Fuente de biodiesel
Rendimiento de Biodiesel (%)
Rendimiento de Glicerol (%)
NaOH
Jatropha 74.7
20.1
KOH
Jatropha 94.1
4.3
Thermomyces lanuginosus
Aceite de palma refinado
97.8
1.6
C. antárctica R. miehei P. cepacia
Aceite de girasol enriquecido con oléico
98
1.1
Fuente: Perea et al., 2007; Ortiz, 2012; Shek, 2012; Moreno, 2013.
16
Aunque las lipasas son utilizadas generalmente para catalizar la hidrólisis de
ésteres carboxílicos, éstas también son utilizadas en un amplio rango de reacciones
de bioconversión, incluyendo la esterificación y transesterificación. Los
biocatalizadores investigados en la producción de biodiesel pueden ser clasificados
como lipasas libres, lipasas inmovilizadas y whole-cell (cultivos celulares con
actividad enzimática) (Mendoza, 2010).
El uso de enzimas libres a escala industrial es debatible debido a que su
funcionamiento presenta bajos rendimientos y altos costos ya que no se pueden
reutilizar. El costo de las lipasas y los altos tiempos de reacción son
significativamente mayores en comparación a la catálisis alcalina. Los largos tiempos
de operación y problemas de pérdida de actividad están siendo estudiados debido a
que los costos de la enzima son una barrera para desarrollar un proceso de
producción de biodiesel a escala industrial. Por otra parte, el uso de enzimas
inmovilizadas presenta ventajas tales como estabilidad, posibilidad de re-uso,
facilidad para la recuperación del glicerol y eliminación de la etapa de lavado del
biodiesel (Guncheva y Zhiryakova, 2011).
2.7.2 Catalizadores utilizados en la producción de biodiesel
Un catalizador es una sustancia capaz de acelerar una reacción química; no altera el
balance energético final de la reacción, sino que sólo permite que se alcance el
equilibrio con mayor o menor velocidad. Los catalizadores utilizados industrialmente
y para investigación para la producción de biodiesel, se pueden clasificar en función
al tipo de fase en donde ocurre la reacción, se dividen en heterogéneos y
homogéneos y a su vez en ácidos, alcalinos y enzimáticos (Pinto et al., 2005;
Kulkarni y Dalai, 2006; Ranganathan et al., 2008).
2.7.2.1 Catalizador Alcalino
Los catalizadores alcalinos son bases, el más utilizado es el NaOH aunque también
se utilizan: carbonatos y alcóxidos (metóxido, etóxido, propóxido y butóxido de
potasio y sodio). Utilizando este tipo de catalizadores químicos la reacción se realiza
17
4000 veces más rápido que utilizando la misma cantidad de catalizador ácido. Para
utilizar estos catalizadores, los glicéridos y alcohol deben cumplir ciertas
características como: bajo contenido de agua y de ácidos grasos libres, ya que la
presencia de grandes cantidades de estos ácidos grasos conduce a la saponificación
de la reacción (formación de jabón), consumiéndose al mismo tiempo el catalizador
y reduciendo la eficiencia catalítica. Por otro lado, estos ácidos grasos libres
presentes no son esterificados en su totalidad a diferencia de los que se encuentran
ligados como los triglicéridos, provocando con ésto una baja eficiencia en la
conversión de aceite a biodiesel, además de aumentar la temperatura óptima de
reacción (Pinto et al., 2005).
2.7.2.2 Catalizador Ácido
Los catalizadores ácidos pueden ser H2SO4, HCl, H3PO4 y ácidos orgánicos
sulfónicos. Cuando existe una alta cantidad de catalizador ácido no hay problema de
saponificación, pero la reacción es más lenta comparándola con la alcalina, muy
corrosiva y requiere de temperaturas y presiones más altas y extremas (Fukuda et
al., 2001). A nivel industrial, el proceso alcalino requiere de un número mayor de
etapas para obtener los productos deseados, provocando corrosión en los equipos
del proceso.
2.7.2.3 Catalizador Enzimático
En la naturaleza existen catalizadores biológicos de origen protéico llamados
biocatalizadores, comúnmente conocido como enzimas; también existen ácidos
ribonucléicos con capacidad catalítica llamados ribozimas. Actualmente el uso de
biocatalizadores ha ido en aumento debido a la rapidez, altas eficiencia, menos
toxicidad y el requerimiento de condiciones más suaves para llevar a cabo
reacciones químicas, comparados con los catalizadores químicos (Sharma et al.,
2001).
En el proceso de transesterificación, las enzimas utilizadas como catalizador,
son las lipasas. Estas enzimas están implicadas en la biosíntesis de lípidos (Gupta et
al., 2004) y actúan sobre compuestos grasos haciéndolos más solubles ya que
18
hidrolizan los triglicéridos que conforman los aceites (Pinto et al., 2005), además son
producidas por la mayoría de los organismos y para la aplicación industrial se
obtienen a partir de microorganismos fácilmente manipulables, principalmente
hongos y bacterias. Estos microorganismos pueden producir enzimas tanto
intracelulares como extracelulares, siendo en su mayoría extracelulares (Sharma et
al., 2001).
19
3. JUSTIFICACIÓN
Las enzimas microbianas son más utilizadas que las derivadas de las plantas o
animales, debido a su diversidad de actividades catalíticas, altos rendimientos y su
producción más fácil y segura. Los microorganismos productores de enzimas
lipoliticas han sido aislados principalmente de: suelos agrícolas, aceites vegetales
contaminados, aguas termales, compostaje, aguas residuales, etc.
Con la finalidad de responder a la creciente demanda de biocombustibles,
avances en los procesos bioquímicos están siendo desarrollados, los cuales cada
vez están ganando gran atención a nivel mundial. Bajo este contexto, las enzimas
han sido empleadas de diversas formas: por ejemplo para aprovechar la materia
prima disponible en la naturaleza (biomasa lignocelulósica), para la producción de
bioetanol y para superar los problemas asociados al uso de catalizadores químicos
convencionales en la obtención de biodiesel.
En los últimos años, diversos y numerosos estudios han mostrado un
interesante aumento en el desarrollo y producción de biocombustibles como
alternativa sustentable a los combustibles de origen fósil, ya que pueden contribuir
principalmente a: disminuir las emisiones de gases contaminantes a la atmósfera,
reducir el uso de combustibles convencionales los cuales presentan un aumento de
precios constante, diversificar las fuentes de energía que garanticen el suministro
demandado a nivel mundial, así como crear valor agregado en el sistema agrícola y
proveer empleos en zonas rurales.
Actualmente, la búsqueda de nuevos microorganismos productores de
enzimas hidrolíticas utilizadas en la fabricación de biocombustibles es un aspecto
importante a considerar, ya que permitirá obtener nuevos y mejores procesos de
producción. Por lo anterior, el presente proyecto propone el aislamiento y estudio
cinético y enzimático de microorganismos con actividad lipolítica, los cuales podrían
ser empleados para la obtención de biodiesel.
20
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Aislar, caracterizar e identificar molecularmente microorganismos nativos del estado
de Sinaloa con actividad lipolítica en muestras de aguas termales, aceites vegetales
usados y suelos contaminados con aceite.
4.2. Objetivos específicos
1. Generar una colección de microorganismos aislados a partir de diferentes
fuentes (aguas termales, aceites vegetales usados y suelos contaminados con
aceites).
2. Determinar a nivel cualitativo la producción de lipasas de la colección obtenida y
seleccionar los tres mejores aislados.
3. Identificar a nivel molecular los microorganismos que presenten la mejor
actividad lipolítica (extracción de ADN y comparación de Base de Datos).
4. Evaluar el efecto de tipos de inductores y fuentes de carbono sobre la actividad
lipolítica de los microorganismos previamente seleccionados e identificados.
5. Caracterizar cinéticamente el efecto de diferentes concentraciones de inductor,
fuente de carbono y fuente de nitrógeno sobre la actividad lipolítica del mejor
microorganismo seleccionado.
21
5. HIPÓTESIS
Aguas termales, aceites vegetales usados y suelos contaminados con aceite
contienen microorganismos con actividad lipolítica, la cual se induce al emplear una
fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y un inductor durante la fermentación.
22
Recolección de muestras de la
región
Aislamiento de
microorganismos
Determinación cualitativa de actividad
lipolítica
Caracterización cinética
de crecimiento
Seleccionar los 3 aislados con
mayor actividad
lipolítica
Identificación molecular de los aislados con mayor actividad
lipolítica
6. METODOLOGÍA
6.1 Estrategia general de trabajo
Figura 2. Esquema general de trabajo
6.1. Localización de muestreo
Para llevar a cabo el aislamiento de microorganismos con potencial lipolítico se
tomaron muestras de las siguientes fuentes de sustrato.
1) Aceite residual (vegetal de cocina usado)
2) Suelos contaminados con aceites de la región
3) Aguas termales ubicadas en la Ciénega de Casal perteneciente al municipio
de Salvador Alvarado en el estado de Sinaloa.
23
6.1.1. Muestreo de aceite de desecho
Las muestras de aceite de desecho se recolectaron de un local que se dedica a la
elaboración de frituras. Se tomaron muestras en frascos de vidrio y plástico (Figura
3) y se transportaron en una hielera a 4°C al laboratorio de Bioenergéticos
perteneciente al CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa para su posterior uso.
Figura 3. Muestras de aceite residual
6.1.2. Muestreo de suelo
Para la toma de muestra de suelo se clavó una pala a 30 cm de profundidad del
suelo y se tomó la muestra, la cual fue depositada en una bolsa de polietileno
transparente hermética con cierre dentado (Figura 4) y se transportó al laboratorio de
Bioenergéticos en CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa para su posterior uso.
Figura 4. Toma de muestra de suelo contaminado con aceite de un taller mecánico
6.1.3. Muestreo de agua geotérmica
Las muestras de agua termal, se tomaron usando recipientes de plástico estériles de
un litro y bolsas de polietileno transparente hermética con cierre dentado (Figura 5) y
fueron transportadas en nevera portátil a temperatura ambiente al laboratorio de
Bioenergéticos CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa para su posterior uso (Rubiano, 2006).
24
Figura 5. Toma de muestra de agua termal en la Ciénega de Casal de diferentes estanques
6.2. Aislamiento de los microorganismos
6.2.1. Muestras de suelo contaminado con aceite
A partir de las muestras de suelo contaminado con aceite se realizaron diluciones
seriadas, diluyendo 1g de muestra en 900 µl de agua destilada estéril, a partir de
esta dilución se realizaron diluciones seriadas de 10-1 hasta la dilución 10-5, de ésta
se tomaron 100 µl y se llevaron a cabo siembras en superficie en placa Petri con
agar Luria Borth (LB) (Anexo 1-a) para bacterias y Agar Dextrosa de Papa (PDA)
(Anexo 1-b) por triplicado y se incubaron a 30°C por 24 h, con la finalidad de
favorecer el crecimiento de los microorganismos (Bertani, 2004).
6.2.2. Muestras de agua termal
Las muestras de agua termal se inocularon en medio Luria Bertani (LB) a pH 6 y se
pasaron a incubar aeróbicamente en una incubadora con agitación a 60°C y 150 rpm
por 18 h. Posteriormente se tomó una muestra y se pasó a sembrar en medio LB-
agar, se incubó a 60° durante 18 h. Finalmente las colonias individuales fueron
aisladas en medio LB-agar hasta que se lograron obtener colonias simples y
uniformes (Pinzón et al., 2010).
6.2.3. Muestras aceite de desecho
Se tomó 1g de cada muestra de aceite de desecho, se disolvió en 5 ml de agua
ultrapura, se filtró con un tamiz. Del filtrado se tomó 1 ml que se pasó a un medio
mínimo a un pH de 7.2. La muestra fue incubada durante 48 h a 30°C y 150 rpm.
Posteriormente se tomaron muestras y se hicieron diluciones en serie, se sembraron
25
en LB-agar por el método en placa. Las placas inoculadas se incubaron durante 48 h
a 30°C (Kumar et al., 2012).
6.2.4. Conservación de los aislados
Los microorganismos aislados fueron criopreservados en placas de 96 pozos con
capacidad de 250 μl, 98 μl del cultivo de microorganismos (un aislado por cada pozo)
y 42 μl de glicerol al 50% para una concentración final de glicerol al 15%. Las placas
fueron cerradas con tapas de aluminio adhesivas estériles y se colocaron a -70°C,
esto se realizó por triplicado (Figura 6) (Cordero-Ramírez, 2008).
Figura 6. Criopreservación de microorganismo a -70°C
6.3. Determinación cualitativa de la actividad lipolítica de los
microorganismos aislados
Para la determinación cualitativa de la actividad lipolítica, los microorganismos se
reactivaron en medio LB para bacterias y PD para hongos, posteriormente fueron
evaluados por el método propuesto por Anderson (1936) en agar gliceril tributirato
(tributirina). Para esta prueba se prepararon placas Petri con agar y LB para
bacterias y PDA para hongos conteniendo tributirina al 1% (p/v), con un espesor de 5
mm aproximadamente y se incubaron a 30 °C por 24 h para muestras de suelo y
aceite residual y 60°C para los termófilos (Lizano, 2012), transcurrido el tiempo de
incubación, la actividad lipolítica fue determinada utilizando la fórmula (Rodríguez et
al., 2002): C= A-B, donde:
26
A= diámetro de la colonia más el halo de hidrólisis en cm
B= diámetro de la colonia en cm
C= diámetro del halo de hidrólisis
6.4. Identificación molecular de los aislados bacterianos seleccionados
6.4.1. Extracción de ADN
Para la identificación de los aislados bacterianos se siguió la metodología de Shi et
al., (1997).Las bacterias fueron crecidas en medio LB líquido 16 horas con agitación
(200 rpm). Se tomó un alícuota de 2 ml y se centrifugó por 3 min a 12,000 rpm en
una micro-centrífuga. El sobrenadante se eliminó y la pastilla se resuspendió en 300
µl de reactivo de DNAzol (Invitrogen no. Cat. 10503027) utilizando un vórtex para
inducir el lisado de las células. Posteriormente se centrifugó por 10 min a 12,000 rpm
y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. Se agregaron 300 µl de etanol
absoluto frío (-20°C) y se agitó suavemente por inversión tres o cuatro veces. Se
incubó a -20°C por 10 min para permitir la participación de ADN. La mezcla se
centrifugó a 4 min a 12,000 rpm y se eliminó el sobrenadante. Se realizaron dos
lavados con 200 µl de etanol (70%), mezclando suavemente por inversión y se
centrifugaron por 3 min a 12,000 rpm. Se decantó y se secó la pastilla de ADN por no
más de un minuto para posteriormente ser resuspendida en 40 µl de agua ultrapura.
6.4.2. Amplificación de ADN
Se utilizó la técnica de PCR y oligonucleótidos universales para procariotas para una
región del gen del ADNr 16S bacteriano. Se prepararon reacciones de volumen total
de 25 µl con 1 µl de ADN genómico como templado extraído con DNAzol (de acuerdo
al procedimiento de la sección 6.4.1.), 2.5 µl de buffer 10 X de PCR (provisto por el
fabricante), 2.0 µl de la solución stock 50 mM de MgCl2 , 0.50 µl de una mezcla 10
mM de desoxirribonucleótidos dA, dG, dC y dT (dNTPs), 1 µl de una solución 10 µM
de cada uno de los oligonucleótidos F2C (5’-AGATTTGATCATGGCTC-3’) y C (5’-
CGGGCGGTGTAC3’) y 0.25 µl de Taq Polimerasa 5U/µl (Invitrogen no. Cat.
10342046). La reacción se realizó en hielo. El tamaño del producto esperado fue de
aproximadamente 1400 pb. La amplificación se realizó en un termociclador (Veriti AB
27
96 Well) utilizando el siguiente programa: un paso de desnaturalización a 95°C por 4
min; 32 ciclos de 1 min de desnaturalización a 95°C; 1 minuto de anillamiento a 60°C;
1.3 minutos de elongación a 72°C; y finalmente un paso a 72°C por 7 minutos.
6.4.3. Electroforesis
Los productos de PCR (5 µl) se separaron por electroforesis en gel de agarosa al
1%, utilizando bromuro de etidio (0.02 µg/ml) para la tinción de ADN y las bandas se
visualizaron bajo luz ultravioleta.
6.4.4. Purificación de los productos de PCR
Los productos amplificados se purificaron con el kit comercial QIAquick® PCR
Purification (Marca QUIAGEN catalogo No. 28106) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante, las cuales se describen a continuación: se tomó un volumen de PCR de
50 μl y se depositó en un tubo de Eppendorf de 1.5 ml, se le añadió un volumen 250
μl de solución PB del kit, se homogenizó en el vórtex y se centrifugó por unos
segundos a temperatura ambiente para bajar toda la solución al fondo del tubo,
posteriormente se pasaron los 300 μl a una columna y su tubo colector (provistas por
el fabricante), se centrifugó a temperatura ambiente a 13,000 rpm por un minuto. Se
desechó el líquido del tubo colector, se adicionaron 750 μl de solución PE del kit y se
centrifugó a 13,000 rpm a temperatura ambiente por un minuto, se decantó el líquido
del tubo colector y se repitió la centrifugación a 13,000 rpm a temperatura ambiente
por un minuto, el tubo colector se desechó y se colocó la columna en un tubo
Eppendorf de 1.5 mL nuevo, enseguida se adicionó 50 μl de solución EB del kit y se
dejó incubar por dos minutos a temperatura ambiente, se centrifugo a 13,000 rpm
durante un minuto, se repitió la centrifugación y se recuperó el ADN diluido en la
solución EB del kit. La cuantificación del ADN se realizó en un espectrofotómetro
NanoDrop TM 2000 (marca Thermo Scientific), utilizando la solución EB como blanco.
6.4.5. Secuenciación y análisis
La secuenciación del ADN amplificado por PCR, purificado y cuantificado, se realizó
en el laboratorio de Servicios Genómicos de LANGEBIO CINVESTAV- IPN Unidad
28
Irapuato. Las secuencias obtenidas se sometieron a un proceso de edición,
verificando la calidad de las secuencias y corrigiendo posibles errores de lectura o
artefactos creados durante la secuenciación. La edición de las secuencias se realizó
con la ayuda del programa Chromas versión 2.6. Las secuencias editadas se
sometieron a comparación con secuencias reportadas en el banco de genes
(GenBank), del Centro Internacional para la Información en Biotecnología (NCBI-
National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
empleando el programa BLAST-N de dicha página, para conocer el nivel de identidad
genética existente con secuencias ya reportadas y depositadas en el banco de
genes.
6.4.6. Análisis Filogenético
Para la elaboración del árbol filogenético, se utilizó la secuencia de la región 16S del
ADNr (generada con la amplificación con los oligonucleótidos F2C y C) de cada uno
de los aislados BAR02, BSCA34 y BAT25, más las secuencias de diferentes
aislamientos reportados en la base de datos del NCBI, estas secuencias se alinearon
mediante la opción BLAST. Para el análisis filogenético, las secuencias consenso se
alinearon y se compilaron en un archivo Fasta, se alinearon utilizando el programa
con Muscle incluido en el programa MEGA7, se analizaron con el método Tamura (3
parámetros) y Gama (4 categorías), se utilizó la prueba de Máxima Verosimilitud y
para determinar los valores de confianza dentro de los agrupamientos dentro del
árbol resultante, se estimó un análisis de bootstrap con 1000 repeticiones con el
Software MEGA7. Los gap/missing se consideraron como completas delecciones. La
edición del árbol se realizó con el programa FigTree versión 1.4.0 para Windows.
6.5. Caracterización cinética de microorganismos lipolíticos
Una vez determinada la actividad cualitativa de la enzima, se seleccionaron los tres
mejores halos de hidrólisis, posteriormente a cada uno de ellos se le realizó una
caracterización cinética, midiendo su crecimiento en DO595nm, así como su actividad
enzimática a nivel cuantitativo y el efecto de tipos de inductores y diferentes fuentes
de carbono sobre la actividad lipolítica.
29
6.6. Efecto de diferentes tipos de inductores y fuentes de carbono
sobre la actividad lipolítica de los aislados
Se evaluó el efecto de los diferentes tipos de inductores y fuentes de carbono sobre
la actividad lipolítica de los aislados seleccionado. Los inductores que se evaluaron
fueron: aceite de oliva, aceite de girasol, aceite vegetal usado y Tween 80. Las
fuentes de carbono fueron: glucosa, sacarosa, almidón y glicerol. Ambos
componentes fueron adicionados al medio en emulsión en 1% (v/v) (p/v).
6.6.1. Efecto de inductor
Para realizar el efecto de diferentes tipos de inductores y fuentes de carbono sobre la
actividad enzimática, se eligió un diseño de bloques completos al azar, el
experimento se desarrolló de la siguiente manera, en matraces de 250 mL, se
pusieron 50 mL de medio de cultivo LB y se le adicionó el 1 % (v/v) de los diferentes
inductores seleccionados (aceite de oliva, aceite de girasol, aceite vegetal usado y
Tween 80), se tomaron alícuotas de 1mL cada 3 horas por un tiempo de incubación
de 48 h. Posteriormente se determinó la cantidad de enzima libera al medio,
mediante un ensayo colorimétrico.
6.6.2. Efecto de fuente de carbono
Una vez seleccionado el inductor, se procedió a analizar la adición de una fuente de
carbono al medio de cultivo. Diferentes fuentes de carbono (glucosa, sacarosa,
almidón y glicerol) fueron añadidos individualmente al medio a una concentración del
1% (p/v), Tween 80 fue usado como control experimental, para estudiar el efecto de
las diferentes fuentes de carbono sobre la producción lipolítica. Lo anterior se realizó
en matraz de 250 mL que contenía 50 mL de medio de cultivo en emulsión con el
mejor inductor (Tween 80) más la fuente de carbono, se tomaron muestras
periódicas cada 3 h por un tiempo de incubación de 48 h. Posterior a esto, se realizó
la determinación de la cantidad de enzima liberada al medio mediante un ensayo
colorimétrico.
30
6.6.3. Efecto de las concentraciones de los factores nutricionales sobre
la producción lipolítica
Se aplicó un diseño factorial 23 con cuatro puntos centrales, los factores fueron los
diferentes nutrientes: inductor, fuentes de carbono y fuente de nitrógeno a un nivel
bajo (0.5%) y uno alto (1.5%), las concentraciones de los puntos centrales fueron en
el 1% (valores óptimos). Las variables de estudio fueron las concentraciones (0.5 –
1.5%), mientras que las variables de respuesta fueron la actividad enzimática
(UI/mL), productividad lipolítica (UI/mL/h), actividad específica (UI/DO595nm) y
actividad específica (UI/UFC), se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) por
medio del Software Design Expert Versión 7, a un nivel de significancia del 95%. El
efecto de las concentraciones de los factores nutricionales sobre la actividad lipolítica
fueron evaluadas mediante un método de hidrólisis del pNPL.
6.6.4. Determinación cuantitativa de actividad lipolítica
La producción de la actividad lipasa de cada aislado seleccionado fue evaluada por
el método colorimétrico de Nawani et al. (1998) modificado y utilizando para-nitrofenil
laurato (p-NPLaurato) como sustrato.
La actividad lipolítica se llevó a cabo de la siguiente manera, en un tubo
Eppendorf de 2 ml se adicionaron 100 µl de extracto enzimático crudo
(sobrenadante), 800 µl de buffer de fosfatos 0.05 M (pH 7.2) (Anexo 2A) y 100 µl de
0.01M de p-NPLaurato (Anexo 2B) disuelto previamente en alcohol etílico absoluto.
La reacción se llevó a temperatura ambiente (para los aislados BAR02 y BSCA34) y
a 60°C (para aislado BAT25) durante un tiempo de incubación de 15 minutos,
transcurrido el tiempo se añadieron 250 µl de Na2CO3 0.1M (Anexo 2C) para detener
la reacción, la mezcla fue centrifugada a 14,000 rpm por 10 minutos, se tomaron 200
µL de la solución y se colocaron en placas de 96 para tomar la lectura de la
absorbancia generada a una longitud de onda de 420 nm en un espectrofotómetro, la
cual fue reemplazada en la ecuación de la línea recta arrojada por la curva patrón de
pNP previamente realizada (Anexo 3), para obtener las concentraciones de actividad
lipolítica liberada al medio durante el cultivo de los aislados.
31
Una unidad de actividad lipasa es definida como la cantidad de enzima que
libera 1 µmol de p-NP desde pNP-Laurato como sustrato en 15 minutos bajo
condiciones de ensayo estándares.
6.6.5 Determinación de la correlación entre la actividad lipolítica y
la biomasa
Para determinar si existe una correlación entre la actividad lipolítica y el crecimiento o
la biomasa del microorganismo, se realizó el siguiente experimento: en matraces de
250 mL que contenían 50 mL de medio LB más el 1% p/v de Tween 80 y glucosa,
como inductor y fuente de carbono respectivamente. Se pusieron en incubadora con
agitación a 200 rpm por 48 horas, tomando muestras periódicas cada 3 horas. La
actividad se midió con la metodología mencionada en el apartado 6.6.4 de este
trabajo y la biomasa se determinó realizando diluciones seriadas y sembrando en
placa con medio sólido mediante la técnica de la microgota.
32
7. RESULTADOS
7.1. Aislamiento de microorganismos de las diferentes fuentes
7.1.1. Aislamiento de microorganismos
En el cuadro 6 se muestra el número de microorganismos aislados de cada una de
las diferentes fuentes de sustratos y zona de muestreo. Donde estudios recientes
han demostrado que la mayoría de los microorganismos lipolíticos y sus enzimas se
obtienen del suelo, donde se encuentran bacterias muy activas en el reciclaje de
nutrientes como las pertenecientes al género Bacillus y otros géneros relacionados.
Cuadro 6. Total de aislados por zona de muestreo
Zona de muestreo Coordenadas Fuente de sustrato Número de aislados
Ciénega de casal, Salvador Alvarado
N25°35'3.16"
O108°3'22.79"
Agua termal
85
Tamazula, Guasave.
N25°26’50.87”
O108°27’6.94”
Suelo
103
Guasave, Sinaloa.
N25°32’45.87”
O108°28’54.31”
Aceite vegetal usado
16
En total se aislaron 204 microorganismos del total de las diferentes muestras,
las cuales fueron aisladas en medio LB y PDA. De acuerdo al método de aislamiento
y a la observación macroscópica de las colonias se podría sugerir que los aislados
son bacterias y hongos, teniendo 198 y 6 respectivamente.
7.1.2. Creación del banco de microorganismos aislados de
diferentes fuentes
Una vez aislados los microorganismos, se obtuvo una colección de 204 aislados de
los cuales 198 fueron criopreservados en medio LB y se mantienen a -70°C en
placas de 96 pozos colocando un aislado por cada pozo. El resto de los aislados son
hongos, los cuales se aislaron en medio PD y se mantienen a -70°C en tubos de
rosca de criopreservación. Las placas y tubos fueron almacenadas por triplicado en
diferentes ultracongeladores (Figura 7).
33
Figura 7. Banco de microorganismos aislados de diferentes fuentes
7.2. Determinación cualitativa de los microorganismos anteriormente
aislados
Una vez aislados las bacterias y los hongos de las diferentes muestras de sustrato
de diferentes regiones del estado de Sinaloa, se realizó la determinación cualitativa
de la actividad lipolítica, la cual se llevó a cabo en placas Petri con una emulsión del
medio Agar-LB y usando tributirina como revelador del halo de hidrólisis de la
presencia de la enzima.
Se realizó la determinación cualitativa de actividad lipolítica a los 204
microorganismos, los resultados obtenidos se agruparon de acuerdo a la medición
del mayor diámetro del halo observado.
Los resultados mostraron que 161 microorganismos aislados presentaron
potencial lipolítico, lo cual corresponde al 78.9% del total de los aislados. De estos, 9
presentaron el mayor halo de hidrólisis, mientras que 15 tuvieron buena capacidad
para degradar la tributirina. Por otra parte, los resultados muestran que el mayor
porcentaje de los microorganismos aislados tuvieron regular (53%) potencial
lipolítico, mientras que el 14.1% de los aislados incluyendo a los seis hongos,
presentan escasa capacidad lipolítica. Así mismo se pude observar que 43 de los
microorganismos aislados no presentaron actividad lipolítica, correspondiendo al
34
21.1%, siendo la mayoría de estos aislados de la muestra de las aguas termales
(Cuadro 7). Los resultados obtenidos nos revelan que existe una elevada presencia
de microorganismos capaces de degradar ácidos grasos.
Cuadro 7. Análisis cualitativo de actividad lipolítica de los 204 microorganismos aislados de las diferentes fuentes de sustratos
Actividad lipolítica
Rango de halos de
hidrólisis (cm)
Número de
microorganismos
Porcentaje de
microorganismos (%)
Muy buena ≥1.40 9 4.4
Buena 1.20-1.39 15 7.4
Regular 1.00-1.19 108 53
Escasa 0.80-0.99 29 14.1
Ausencia de actividad 0.50-0.79 43 21.1
Total 204 100
La Figura 8, muestra algunos de los microorganismos que obtuvieron la mayor
capacidad lipolítica. Se pueden observar zonas claras alrededor del pozo de
inoculación, los cuales representan la degradación de la tributirina al 1% que
contenía el medio, como única fuente de carbono.
Figura 8. Determinación cualitativa de los aislados de diferentes muestras de
sustratos
Posteriormente los nueve aislados que presentaron un halo de hidrólisis mayor
o igual a 1.4 cm de diámetro, fueron crecidos en medio líquido y se inocularon en
35
pozos en cajas de Petri, dejándose incubar por 96 horas (Figura 9). Lo anterior se
realizó para seleccionar los mejores tres aislados.
Figura 9. Microorganismos que presentaron mayor halo de hidrólisis inoculados individualmente
El microorganismo que presentó la mayor actividad lipolítica fue el aislado
nombrado como BAR002, perteneciente a la muestra de aceite residual de un local
de frituras, de la misma manera presentaron buena actividad otros cuatro aislados:
BAR013, BAR014, BSCA034 y BAT025 (BAR=bacteria aceite residual;
BSCA=bacteria suelo contaminado con aceite; BAT= bacteria agua termal). Estos
resultados muestran que los microorganismos con buena capacidad lipolítica están
presentes en las distintas zonas de muestro y son capaces de crecer en ambientes
con diferentes características. Los microorganismos seleccionados se etiquetaron
como BAR02, BSCA34 Y BAT25 obteniendo diámetros de 1.7 cm, 1.5 cm y 1.4 cm
respectivamente a las 96 horas de incubación (cuadro 8).
Cuadro 8. Selección de los mejores halos de hidrólisis pertenecientes a cada fuente de sustrato
Mejores Diámetro (cm)
BAR02
BSCA34
BAT25
1.7
1.5
1.4
36
7.3. Identificación molecular de los aislados bacteriano
La amplificación de los productos de PCR de la región 16S del ADNr de las
bacterias, generó un fragmento de aproximadamente 1400 pb, utilizando los
oligonucleótidos F2C y C (Figura 10).
Figura 10. Fragmentos amplificados de los aislados microbianos de la región 16s del ADNr, de aproximadamente 1400 pb, en gel agarosa 1 %
7.3.1. Análisis de las secuencias
El análisis por BLAST para las secuencias de los aislados BAR02, BAT25 y BSCA34,
indicó que pertenecen al género Terribacillus (99%), Bacillus (100%) y Serratia
(100%) de identidad respectivamente (cuadro 9). Estos resultados del BLAST
corresponden a un alineamiento local que conduce a identificaciones putativas. Por
lo tanto, para tener mayor confiabilidad en la identificación se realizó un análisis
filogenético con secuencias de referencia reportadas anteriormente en GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
37
Cuadro 9. Análisis comparativo de las secuencias obtenidas con secuencias de referencia en el BLAST-NCBI
7.3.2. Análisis Filogenético
El análisis filogenético de los aislados se realizó con base en 1300 pb de la región
16S del ADNr e incluyó además de las secuencias obtenidas en este trabajo, 17
secuencias representativas de diferentes especies, principalmente de los géneros
identificados por el BLAST. El árbol filogenético presentó tres ramas o
agrupamientos, el primero fue representante del género Bacillus, el segundo
presentó referencia al género Terribacillus, y el tercero correspondió al género de
Serratia. Cada uno de los aislados se asoció filogenéticamente a una rama diferente,
el aislado BAT25, se identificó como miembro de la especie B. subtilis, el aislado
BAR02 se asoció filogenéticamente con miembros de la especie T. aidingensis y por
último el aislado BSCA34 se colocó en la rama perteneciente a la especie de S.
liquefaciens (Figura 11).
Cepa Longitud de secuencia
(nt)
Cepa con relación más cercana (BLAST)
GenBanck (acceso)
Identidad (%)
Superposición (nt)
BAR02 1305 Terribacillus aidingensis AB748965 99 1290
BAT25 1304 Bacillus subtilis Lmb042 KT986107 100 1304
BSCA34 1284 Serratia liquefaciens B314 KJ781956 100 1283
38
Figura 11. Árbol filogenético basado en secuencias de la región 16S del ADNr, los números
en las ramas indican los valores de bootstrap (>50 %). Los aislados de este estudio se
representan en color rojo.
39
7.4. Caracterización cinética de los aislados
Los resultados de la caracterización cinética de los tres microorganismos
seleccionados, se muestra en la gráfica siguiente (Figura 12), midiendo su
crecimiento en densidad óptica (DO595nm).
Figura 12. Perfil cinético de crecimiento de los microorganismos aislados en un tiempo de
incubación de 48 h
7.5. Análisis de la actividad lipolítica
De acuerdo a los resultados obtenidos en la determinación cualitativa de la actividad
lipolítica, se seleccionaron los 3 mejores aislados que presentaron el mayor halo de
hidrólisis en agar- tributirina, los resultados de la caracterización de la actividad
lipolítica en medió líquido a nivel matraz se muestran a continuación, donde se midió
el efecto que tienen los diferentes tipos de inductores y fuentes de carbono sobre la
actividad lipolítica, utilizando un diseño completamente al azar.
7.5.1. Efecto del inductor sobre la actividad lipolítica
A cada uno de los tres microorganismos, se les evaluó el efecto de los inductores
sobre la actividad lipolítica. Los resultados para cada aislado se muestran a
continuación:
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
DO
59
5 n
m
Tiempo (horas)
Serratia liquefaciens Terribacillus aidingensis Bacillus subtilis
40
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
3 6 9 12 18 20 22 24 26 28 30 46 48
Act
ivid
ad L
ipo
lític
a U
/mL
Tiempo de incubación (h)
Oliva Girasol Tween 80 Usado
Los resultados obtenidos para Terribacillus aidingensis se presentan en la
figura 13, donde se observa que la producción de la actividad lipolítica se inicia
desde las 3 h al emplear indistintamente alguno de los inductores y va en
incremento. La mayor producción de enzima fue observada cuando se empleó
Tween 80 como inductor, teniendo su máximo valor a las 28 h con 0.0373 UI/mL, en
cuanto al aceite de oliva, girasol y aceite vegetal usado mostraron un
comportamiento similar, teniendo una máxima producción lipolítica a los tiempos 24,
30 y 24, con 0.0139, 0.0132 y 0.0107 UI/mL respectivamente, no mostrando
diferencias significativas.
Figura 13. Perfil cinético de la actividad lipolítica de Terribacillus aidingensis a través del tiempo
Para Serratia liquefaciens, se observa (Figura 14) que la producción de
enzima empleando el aceite de girasol como inductor, es constante durante las
primeras 20 h logrando una actividad lipolítica máxima de 0.143 UI/mL, después de
este tiempo la producción disminuye. Con respecto al Tween 80, la producción de
enzima incrementa a las 46 h obteniendo una actividad de 0.226 UI/mL. En el aceite
de oliva y el aceite vegetal usado la producción es menor presentando actividades de
0.057 y 0.033 UI/mL a las 12 y 22 h de incubación respectivamente.
41
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
3 6 9 12 18 20 22 24 26 28 30 46 48
Act
ivid
ad L
ipo
lític
a U
/mL
Tiempo de incubación (h)
Oliva Girasol Tween 80 Usado
Figura 14. Perfil cinético de las actividades lipolíticas de Serratia liquefaciens a través del
tiempo
Por último se probó el efecto de los inductores en el microorganismo aislado
del agua termal: Bacillus subtilis, donde una vez más se hace notorio que la actividad
enzimática es mayor cuando en el medio está presente el Tween 80, alcanzando una
máxima actividad de 0.0449 UI/mL a las 18 h de incubación, seguido del aceite
vegetal usado con 0.0353 UI/mL. Por otra parte el aceite de girasol y el aceite de
oliva mostraron una producción similar sin diferencias significativas, con actividades
de 0.0239 y 0.0295 UI/mL ambos a las 22 h de incubación (Figura 15).
42
Figura 15. Perfil cinético de actividades lipolítica de Bacillus subtilis a diferentes tiempos
En el siguiente cuadro (cuadro 10) se describe un resumen de las mejores
actividades obtenidas para cada aislado con su respectivo tipo de inductor.
Cuadro 10. Mejores actividades obtenidas de cada uno de los aislados con los inductores analizados
Aislado Inductor Actividad lipolítica UI/mL
Tiempo (h)
Terribacillus aidingensis
A. Oliva A. Girasol A.V. Usado Tween 80
0.0139 0.0132 0.0107 0.0373
24 30 24 28
Serratia liquefaciens
A. Oliva A. Girasol A.V. Usado Tween 80
0.057 0.143 0.033 0.226
12 20 22 46
Bacillus subtilis
A. Oliva A. Girasol A.V. Usado Tween 80
0.0295 0.0239 0.0353 0.0449
22 22 24 18
De acuerdo a los resultados obtenidos, se eligió el Tween 80 como mejor inductor de
la producción de actividad lipolítica.
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
3 6 9 12 18 20 22 24 26 28 30 46 48
Act
ivid
ad L
ipo
lític
a U
/mL
Tiempo de incubación (h)
Oliva Girasol Tween 80 Usado
43
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
3 6 9 12 18 20 22 24 26 28 30 46 48
Act
ivid
ad L
ipo
lític
a U
/mL
Tiempo de incubación (h)
T80+Glicerol T80+Sacarosa T80+Almidón T80+ Glucosa Tween 80
7.5.2. Efecto de la fuente de carbono
Una vez seleccionado el inductor, se evaluó el efecto de diversas fuentes de
carbono sobre la producción de actividad lipolítica en los tres aislados, utilizando
glucosa, sacarosa, almidón y glicerol en una concentración del 1% (p/v). Medio LB
con Tween 80 (1%) sin fuente de carbono adicional se tomó como control. Los
resultados se muestran a continuación.
La actividad lipolítica aumenta en Terribacillus aidingensis cuando se le es
adicionada una fuente de carbono como la glucosa, ya que en la gráfica (figura 16)
se observa que a partir de las 18 h el medio que contiene a la glucosa aumenta
significativamente la producción de la enzima, consiguiendo una actividad de 0.129
UI/mL a las 46 h de incubación, siendo esto 3.5 veces más actividad que lo obtenido
con el Tween 80 como control, posteriormente dos horas más la producción de la
actividad lipolítica empieza a decrecer. El glicerol, la sacarosa y el almidón reportan
valores de 0.0171, 0.0266 y 0.0522 UI/mL respectivamente, muy por debajo por lo
obtenido con la glucosa.
Figura 16. Efecto de las fuentes de carbono sobre la actividad lipolítica de Terribacillus aidingensis a diferentes tiempos
44
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
3 6 9 12 18 20 22 24 26 28 30 46 48
Act
ivid
ad L
ipo
lític
a U
/mL
Tiempo de incubación (h)
T80+Glicerol T80+ Glucosa T80+Almidón T80+Sacarosa Tween 80
En la producción lipolítica de Serratia liquefaciens es mayor en presencia de
glucosa (Figura 17), presentando desde las 6 h una diferencia significativa con las
otras fuentes de carbono, obteniendo su máxima actividad a las 18 h con un valor
0.214 UI/mL, posteriormente la actividad decrece conforme avanza el tiempo. Sin
embargo, si se compara el medio que contiene la glucosa adicionada con el control,
se observa que no presentan diferencias significativas en cuanto a producción
enzimática, sin embargo con la glucosa se obtiene la mayor producción en un menor
tiempo. Por otra parte el glicerol, almidón y sacarosa no presentan diferencias
significativas en todo el análisis, reportando sus valores máximos 0.0807, 0.107 y
0.0899 UI/mL a las 48, 46 y 48 h de incubación respectivamente.
Figura 17. Cinética de producción de actividad lipolítica utilizando diferentes fuentes de carbono para Serratia liquefaciens
En lo que respecta a Bacillus subtilis, el control (Tween 80) siguió teniendo un efecto
positivo sobre la actividad enzimática, observamos que cuando se le adiciona una
fuente de carbono al medio, la actividad enzimática tiende a decrecer. En la gráfica
18 se observa que el aislado tiene un comportamiento muy variado a distintos
tiempos, sobresaliendo entre las fuentes de carbono la glucosa con una actividad
lipolítica de 0.0290 UI/mL a las 28 h de incubación. Por otra parte el glicerol, la
45
sacarosa y el almidón, obtuvieron su mayor actividad a las 48, 30 y 28 h de
incubación, con 0.0240, 0.0182, 0.0237 UI/mL respectivamente.
Figura 18. Actividad Lipolítica de Bacillus subtilis con diferentes fuentes de carbono a diferentes tiempos de incubación
En el cuadro 11 se muestra un resumen de las mejores actividades obtenidas
por cada uno de los aislados.
Cuadro 11. Mejores actividades obtenidas de cada uno de los aislados con las diferentes fuentes de carbono analizadas
Aislado Fuente de carbono Actividad lipolítica UI/mL
Tiempo (h)
Terribacillus aidingensis
Glicerol Glucosa Sacarosa Almidón
Tween 80
0.0171 0.129 0.0266 0.0522 0.0365
20 46 48 30 28
Serratia liquefaciens
Glicerol Glucosa Sacarosa Almidón
Tween 80
0.0807 0.214 0.107 0.0899 0.200
48 18 46 48 46
Bacillus subtilis
Glicerol Glucosa Sacarosa Almidón
Tween 80
0.0240 0.0290 0.0182 0.0237 0.0366
48 28 30 28 46
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
3 6 9 12 18 20 22 24 26 28 30 46 48
Act
ivid
ad L
ipo
lític
a U
/mL
Tiempo de incubación (h)
T80+Glicerol T80+Sacarosa T80+Almidón T80+ Glucosa Tween 80
46
De acuerdo a los resultados obtenidos, se eligió a la glucosa como mejor
fuente de carbono de la producción de actividad lipolítica, y se seleccionó a S.
liquefaciens como mejor microorganismo para culminar con los objetivos.
Posteriormente se analizó como influyen las concentraciones de los factores
seleccionados, adicionando una fuente de nitrógeno (extracto de levadura) sobre las
variables de respuesta (actividad lipolítica (UI/mL); productividad lipolítica máxima
(UI/mL/h); actividad específica (UI/DO595 nm) y actividad específica (UI/UFC),
utilizando un diseño factorial de 23 con cuatro puntos centrales.
7.6. Diseño factorial
Se aplicó un diseño factorial 23 con cuatro puntos centrales. Las variables de estudio
fueron las concentraciones, mientras que las variables de respuesta fueron la
actividad enzimática (UI/mL), productividad lipolítica (UI/mL/h), actividad específica
(UI/DO595nm), con el fin de determinar la sensibilidad de los factores calculados se
realizó un análisis de varianza (ANDEVA) por medio del Software Design Expert
Versión 7.0, a un nivel de significancia del 95%. Los valores de los factores se presentan
en la Tabla 1.
Cuadro 12. Nivel los factores y valores reales para el diseño experimental
Factores Valor bajo
(-1)
Valor alto
(+1)
Inductor (Tween 80) (% v/v) 0.250 0.750
Fuente de Carbono (glucosa) (% p/v) 0.250 0.750
Fuente de nitrógeno
(extracto de levadura) (%p/v)
0.050 0.150
En el cuadro 13, se muestran los valores obtenidos por tratamiento para cada
una de las variables de respuesta analizadas actividad enzimática (UI/mL),
productividad lipolítica (UI/mL/h), actividad específica (UI/DO595nm).
47
Cuadro 13. Análisis estadístico de los datos obtenidos con un nivel de significancia
del 95%.
Tratamiento
Inductor
%
Carbono
%
Nitrógeno
%
Variables de respuesta
Actividad
Lipolítica
(UI/mL)
Actividad
específica
(UI/DO)
Productividad
lipolítica
máxima
(UI/mL/h)
1 0.5 0.5 0.1 0.0858 0.0831 0.0024
2 1.5 0.5 0.1 0.0900 0.0752 0.0045
3 0.5 1.5 0.1 0.0584 0.1511 0.0016
4 1.5 1.5 0.1 0.0910 0.2505 0.0025
5 1 1 0.2 0.0952 0.5840 0.0020
6 1 1 0.2 0.1109 0.7601 0.0023
7 0.5 0.5 0.3 0.0611 0.1585 0.0017
8 1.5 0.5 0.3 0.0461 0.1092 0.0023
9 0.5 1.5 0.3 0.0810 0.2375 0.0017
10 1.5 1.5 0.3 0.0587 0.1495 0.0012
11 1 1 0.2 0.0958 0.5840 0.0020
12 1 1 0.2 0.1115 0.7601 0.0023
Como se observa en el cuadro 13 la mayor actividad lipolítica fue de 0.1109
UI/mL utilizando los valores centrales (1%), por otra parte la actividad específica
reporta su máximo valor de 0.7601 UI/DO595nm utilizando los valores centrales (1%). Y
por último la mayor productividad lipolítica máxima, se observó con el tratamiento
dos: mayor concentración de inductor (1.5%), menor concentración de fuente de
carbono (0.5%) y menor concentración de fuente de nitrógeno (0.5%), reportando el
máximo valor de 0.0045 UI/mL/h.
48
Inductor ( I )
F. carbono (Fc)
F. Nitrógeno (Fn)
I * Fc
I * Fn
Fc * Fn
I * Fc * Fn
( I )2
( Fc )2
( Fn)2
Efecto estandarizado
0.05 0.05
La Figura 19 se refiere a la actividad lipolítica UI/mL, y como se observa, la
fuente de nitrógeno (Fn), la interacción entre el inductor y la fuente de nitrógeno
(I*Fn) y la fuente de carbono (Fc2) tienen un efecto significativo sobre la actividad
lipolítica, mientras que el inductor no fue significativo.
Figura 19. Gráfica de Pareto de todos los factores evaluados sobre la actividad lipolítica (UI/mL).
La Figura 20 representa la productividad lipolítica máxima UI/mL.h y se
observa que la fc, fn, las interacciones entre inductor-fc e inductor-fn, tienen efecto
significativo negativo sobre la variable, sin embargo la máxima concentración de
inductor (1.5%) tiene un efecto significativo positivo, además se observa que es
necesaria la presencia de una mínima cantidad de fuente de carbono y fuente de
nitrógeno.
49
Inductor ( I )
F. carbono (Fc)
F. Nitrógeno (Fn)
I * Fc
I * Fn
Fc * Fn
I * Fc * Fn
( I )2
( Fc )2
( Fn)2
Efecto estandarizado
0.05 0.05
Figura 20. Gráfica de Pareto de todos los factores evaluados sobre la productividad lipolítica máxima (UI/mL/h).
Por último, y de acuerdo en la gráfica (Figura 21) la mayor concentración de
fuente carbono tiene efecto negativo sobre la actividad específica, es decir la relación
entre la actividad lipolítica y una medida indirecta de la biomasa (DO595nm) mientras
que los demás factores no mostraron efecto significativo sobre la variable analizada.
50
Inductor ( I )
F. carbono (Fc)
F. Nitrógeno (Fn)
I * Fc
I * Fn
Fc * Fn
I * Fc * Fn
( I )2
( Fc )2
( Fn)2
Efecto estandarizado
0.05
Figura 21. Grafica de Pareto de todos los factores sobre la actividad específica (UI/DO595nm).
51
8. DISCUSIÓN
8.1. Determinación cualitativa de los microorganismos anteriormente
aislados
De un total de 204 microorganismos, 161 de ellos presentaron actividad
lipolítica. Posteriormente se seleccionaron los mejores tres aislados que presentaron
el mayor halo de hidrólisis utilizando tributirina como inductor en placa. Varios
autores han aislado y caracterizado a nivel cualitativo la actividad enzimática lipolítica
de microorganismos provenientes de diferentes hábitats, utilizando diferentes
métodos de aislamiento. Los resultados obtenidos en este investigación son
comparables con lo que reporta Bisht (2011), quien aisló bacterias de muestras de
aguas termales en agar-tributirina a 50 °C, mostrando halos de hidrólisis que
oscilaban entre 0.96 y 1.3 cm de diámetro a las 96 horas de incubación, donde de
acuerdo a la escala para actividad lipolítica reportada en este trabajo, las zonas de
aclaramiento de los microorganismos aislados por Bisht (2011), presentan escasa y
regular actividad, comparado con los obtenidos en esta investigación.
Estudios similares reporta Lubna et al., (2014), aislaron un total de 56
microorganismos de diferentes muestras de suelo contaminado con aceite, de los
cuales 22 de ellos presentaban capacidad lipolítica comprobando dicha actividad por
la presencia de zonas claras alrededor de la colonia, mediante el ensayo con rojo
Congo, observando que las 22 cepas presentaban diferentes niveles de actividad,
por lo que las clasificaron de acuerdo al diámetro de la zona de aclaramiento en la
placa. Reportando los siguientes resultados; cuatro aislados mostraron una actividad
lipolítica significativa (4.2 -5.6 cm), 7 de los aislados presentaron una alta actividad
(2.9-4 cm) y 11 aislados presentaron una actividad lipolítica moderada (2.2 -2.8 cm).
Por otra parte Facchin et al., (2013), aislaron un total de 1100
microorganismos lipolíticos, de muestras de aguas residuales de diferentes efluentes,
sin embargo solo se seleccionó una biblioteca de 35 cepas. Estos aislados fueron
sembrados sobre agar spirit blue, suplementado con el 3 % de tributirina como
inductor de las lipasas. De las 35 cepas evaluadas cuatro presentaron un halo de
52
hidrólisis alrededor de la colonia ≥ 5 cm, 15 cepas mostraron una mediana actividad
enzimática con un halo <5 cm y resto de los aislados 16, mostraron baja actividad
lipolítica con diámetros <2 cm a los 15 días de incubación. Por último Lizano (2012)
caracterizó una cepa de Pseudoalteromonas atlantica aislada de la bahía de
paracas, la cepa fue sembrada en agar- tributirina (0.5% p/v), presentando el
microorganismo un halo de hidrólisis de 1.2 cm de diámetro a las 48 horas de su
incubación.
8.2. Identificación molecular de los aislados bacterianos
A los tres microorganismos seleccionados se les realizó la identificación molecular, y
de acuerdo al análisis del BLAST los aislados pertenecen al género Terribacillus
(99%), Bacillus (100%) y Serratia (100%) de identidad respectivamente. Algunos
autores como Facchin et al., (2013) identificaron al género Terribacillus (número de acceso
en GenBank KC310807) de una colección de 35 cepas aisladas de diferentes tanques de
aguas residuales; por otra parte Gupta y Gupta (2012) reportaron al género Serratia especie
S. marcescens (número de acceso al GenBank JQ2786601) aislado de muestras de
excremento de macacos de cola de león en el sur de la India. Así mismo Olusesan et al.,
(2011) aislaron e identificaron a Bacillus subtilis (número de acceso en GenBank
AY305275) a partir de una fuente termal de Malasia, todos ellos reportando a estos
microorganismos como productores de enzimas lipolíticas.
8.3. Análisis de la actividad lipolítica
8.3.1. Efecto de inductor
A continuación se presenta un resumen de las actividades lipolíticas obtenidas en
cada uno de los aislados (Cuadro 12), comparando resultados con otros autores que
han reportado el efecto de diferentes inductores sobre la actividad lipolítica.
53
Cuadro 12. Resumen de las mejores actividades lipolíticas de cada uno de los aislados utilizando diferentes inductores
Autor Microorganismo Mejor Inductor Actividad lipasa (UI/mL)
Hernández-Leyva Terribacillus aidingensis Tween 80 (1%) 0.037
Hernández-Leyva Serratia liquefaciens Tween 80 (1%) 0.226
Hernández-Leyva Bacillus subtilis Tween 80 (1%) 0.049
Long et al., (2007) Serratia marcescens Tween 80 (5 g/L) 3.342
Sharma et al.,
(2014) Bacillus sp. Tween 80 (.1%) 0.612
Como se demostró en los resultados antes mencionados, se obtiene una mayor
producción de la actividad lipolítica cuando se adiciona como inductor el Tween 80 al
medio de cultivo. Long et al., (2007) analizaron el efecto de diferentes
concentraciones (0- 15 g/L) de Tween 80 como inductor de la enzima lipasa
proveniente de Serratia marcescens, reportando actividad lipolítica de 0.340 UI/mL,
utilizando pNPA (para nitrofenol acetato) como sustrato específico en el ensayo
enzimático, siendo un sustrato de cadena corta (C2), destacando que esta
investigación se realizaron los experimentos enzimáticos con pNPL (C12). En otra
investigación donde se caracterizó a Bacillus sp. por Sharma et al., (2014)
analizaron el efecto del Tween sobre la producción de lipasas, utilizaron Tween 80 a
una concentración de 0.1 % con 150 rpm a 30°C por 24 h., reportaron actividad
enzimática lipasa de 0.612 UI/mL, donde además de Tween 80, el medio contenía
extracto de levadura como fuente de nitrógeno y aceite de oliva como fuente de
carbono, lo obtenido por Bacillus subtilis en esta investigación, es menor (0.612 vs
0.049 UI/mL). El Tween 80 es un detergente de polioxietileno no iónico, con una
parte hidrófoba, la cual por lo general consta de una cadena de alquilo y una parte
hidrófila que está hecha de unidades de óxido de etileno no cargado (Sharma et al.,
2014). Los reportes de la actividad lipolítica acerca del Tween 80 como inductor de la
producción de la enzima lipasa puede deberse principalmente a que el Tween 80
estimula la biosíntesis y la secreción de lipasa, ya que aumenta la permeabilidad
celular y facilita la exportación de lipasa a través de la membrana celular, además en
54
su estructura contiene un enlace éster, el cual funciona como inductor natural para la
lipasa, sugiriendo que las lipasas tiene preferencia por ésteres de cadena larga (C18)
(Golaki et al., 2015).
Por otra parte Facchin et al., (2012), evaluaron el efecto de diferentes aceites
como posibles inductores de la actividad lipolítica en Terribacillus sp. seleccionando
al aceite de oliva como mejor inductor, reportando actividad de 0.960 U/mL, sin
embargo este resultado puede deberse al sustrato para lipasas utilizado, ya que
emplearon p-NPB (para nitrofenol butirato) el cual es un ácido graso de cadena corta
(C4) y sustrato específico de esterasas más que de lipasas.
8.3.2. Efecto de la fuente de carbono
En el cuadro siguiente (Cuadro 13) se muestra el resumen de las actividades
lipolíticas obtenidas con la adición de una fuente de carbono en cada uno de los
aislados, así como su comparación con otros autores.
Cuadro 13. Resumen de las mejores actividades lipolíticas de cada aislado utilizando una fuente de carbono
Autor Microorganismos Mejor fuente de
carbono Actividad lipasa
(U/mL)
Hernández –Leyva Terribacillus aidingensis Glucosa 0.129
Hernández –Leyva Serratia liquefaciens Glucosa 0.214
Hernández –Leyva Bacillus subtilis Disminuyó la actividad 0.036
Long et al., (2007) Serratia marsences Glucosa (15 g/L) 0.196
Rajeshkumar et al.,
(2013) Bacillus subtilis Glucosa (1%)
Disminuyó la actividad lipolítica
Trabajos similares han sido reportados acerca del efecto que tiene la adición de una
fuente de carbono sobre la producción de la actividad lipolítica de ciertos
microorganismos, por ejemplo Long et al., (2007) optimizaron el medio de cultivo de
Serratia marcescens, evaluando diferentes fuentes de carbono como glucosa,
maltosa, almidón, sacarosa y dextrina a una concentración de 15 g/L, fuentes de
nitrógeno extracto de levadura, peptona, licor de maíz y extracto de carne 15 g/L y
55
Tween 80 como inductor 5 g/L y reportaron la mayor actividad 5.852 UI/mL con
dextrina como fuente de carbono, extracto de carne como fuente de nitrógeno y
Tween 80 como inductor, por otra parte cuando se utilizó la glucosa como fuente de
carbono, la actividad tuvo un decremento reportando actividad de 0.196 UI/mL.
por ejemplo Gupta y Gupta (2013), probaron el efecto que tienen las fuentes de
carbono sobre la producción lipolítica en Serratia marcescens, adicionando al medio
glucosa, sacarosa y fructosa, a una concentración de 0.5 %, reportando la máxima
producción lipolítica de 8.9 U/mL cuando se le adiciona glucosa al medio de cultivo,
utilizando pNPP como sustrato especifico en el ensayo enzimático, un número
variado de fuentes de carbono han sido reportados como un mejora para la
producción máxima de lipasa.
Por otro lado, lo reportado por Rajeshkumar et al., (2013), analizaron el efecto
de la glucosa como fuente de carbono (1%) en presencia de aceite de oliva como
inductor sobre la producción lipolítica en Bacillus subtilis y observaron que la
presencia de una fuente de carbono como lo es la glucosa la producción es
altamente influenciada de manera negativa, es decir, inhibe la producción de la
lipasa, debido a la represión catabólica, resultados similares se obtienen para
Bacillus subtilis en esta investigación. Por otra parte Boonchaidung y Papone (2013),
evaluaron el efecto de fuentes de carbono como glucosa, fructosa, sacarosa y
almidón, suplementado con aceite de girasol en Candida sp. Y reportaron que la
levadura presentaba una actividad lipolítica de 1.045 U/mL en presencia de glucosa
como fuente de carbono en una concentración de 3%.
Cuando las bacterias son expuestas a diferentes fuentes de carbono, prefieren
aquellos carbohidratos que son más fáciles de degradar y que les proporcionan los
mejores rendimientos para su crecimiento y desarrollo. Los resultados obtenidos en
esta investigación presentaron variabilidad de actividad enzimática en comparación
de otros autores y esto puede deberse a lo que Weinhandl et al. (2014) reportan, la
glucosa es una fuente de carbono y energía necesaria para el microorganismo, sin
embargo al ser un sustrato de fácil asimilación, puede inhibir la expresión de ciertos
genes implicados en la síntesis de proteínas de interés. El mecanismo de control
56
global que gobierna y coordina la utilización de fuentes de carbono de manera
sistemática y organizada se denomina represión catabólica por carbono (RCC),
Kwakman y Postma (1994), describen que el mecanismo de RCC puede operar a
distintos niveles (transcripción, procesamiento de RNA, traducción y modificación de
proteínas), generando respuestas que afectan directa o indirectamente a la actividad
de las enzimas sensibles al fenómeno (exclusión de inductores, represión
transcripcional o interrupción de la traducción de proteínas). Además existen
promotores que son reprimidos en ausencia de glucosa y necesitan ser inducidos por
una fuente de carbono alterna para obtener una expresión completa. Fuentes de
carbono fermentables como galactosa, sacarosa, almidón y maltosa por mencionar
algunas y algunas otras fuentes de carbono no fermentables como glicerol o etanol,
pueden ser considerados como inductores alternativos para la regulación de genes
de expresión, ya que los genes particulares que están involucrados en el
metabolismo, se reprimen, siempre que la fuente de carbono preferida como la
glucosa está disponible.
8.4 Diseño Factorial
El objetivo de realizar el diseño factorial fue evaluar el comportamiento de diferentes
componentes del medio de cultivo sobre la actividad lipolítica y el crecimiento de
bacterias productoras de lipasas, se evaluaron diferentes concentraciones de: fuente
de carbono y nitrógeno e inductor. Con este diseño se pudo determinar los factores
predominantes y la existencia de eventuales interacciones entre los factores
evaluados.
Como se observa en la Figuras 19, 20 y 21 el factor que tiene más efecto significativo
negativo sobre las variables de respuesta fue la fuente de carbono, esto puede
deberse a una represión de la maquinaria enzimática (lipasas) de los
microorganismos evaluados por elevadas concentraciones de glucosa empleadas..
Weinhandl et al. (2014) la glucosa es una fuente de carbono y energía necesaria
para el microorganismo, sin embargo al ser un sustrato de fácil asimilación, puede
inhibir la expresión de ciertos genes implicados en la síntesis de proteínas de interés.
57
9. CONCLUSIONES
Fueron aislados 204 microorganismos de diferentes regiones del estado de
Sinaloa, de los cuales el 78.9% presentaron actividad lipolítica.
Se obtuvo una colección de microorganismos (161 aislados) con capacidad
de producir enzimas lipolíticas a diferentes niveles mediante el método en
placa. Fueron seleccionados los aislados BAR02, BSCA34 y BAT25 ya que
presentaron la mayor actividad lipolítica, con el mayor diámetro de hidrólisis
alrededor de la colonia.
La amplificación de la región 16S del ADNr por electroforesis, permitió la
identificación del género y la especie de los aislados seleccionados, arrojando
tanto el análisis BLAST como el Filogenético a: Terribacillus aidingensis
(BAR02), Bacillus subtilis (BAT25) y Serratia liquefaciens (BSCA34).
En la evaluación de los inductores y fuentes de carbono sobre la actividad
lipolítica, el Tween 80 representó el mejor inductor en los tres aislados y la
glucosa fue la mejor fuente de carbono evaluada en los tres microorganismos
seleccionados.
El diseño factorial empleado demostró que las concentraciones máximas
utilizadas de fuente de carbono (glucosa) y fuente de nitrógeno (extracto de
levadura) disminuyen la actividad lipolítica y la productividad lipolítica en
Serratia liquefaciens. Mientras que, la máxima concentración de inductor
empleada favoreció estas variables de respuesta.
También el estudio demostró que la actividad lipolítica de Serratia liquefaciens
NO esta correlacionada al crecimiento del microorganismo y a la
concentración de biomasa (< biomasa >actividad).
58
10. PERPESPECTIVAS
Mejorar y optimizar los valores de las actividades lipolíticas presentadas por
los tres mejores microorganismos obtenidos.
Identificar el gen que produce las lipasas de las bacterias evaluadas.
Purificación y caracterización bioquímica de las lipasas obtenidas.
Sobre expresar en sistemas heterólogos la lipasas en estudio.
Emplear los extractos enzimáticos, así como enzimas purificadas en la
producción de biodiesel.
59
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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12. ANEXOS
Anexo 1a. Medio de cultivo
a) Medio LB (Lysogeny Broth) (Bertani, 2004).
Componente Cantidad g/L
Triptona 10.0
Extracto de levadura 5.0
Cloruro de sodio (NaCl) 5.0
Sulfato de magnesio heptahidratádo (mgSO4.7H2O) 0.4
Para el medio de cultivo LB sólido se agrega agar (15 g/L). Se esteriliza por 15
minutos a 121°C.
b) Medio Agar Dextrosa de Papa (PDA) Fluka.
Componente Cantidad g/L
Extracto de papa 4.0
Dextrosa 20.0
Agar 15.0
Para el medio de cultivo LB sólido se agrega agar (15 g/L). Se esteriliza por 15
minutos a 121°C.
Anexo 2. Preparación de soluciones para la actividad lipolítica cuantitativa
Anexo 2A. Buffer de fosfatos 0.05 M pH 7.2
Pesar 0.3447 g de NaH2PO4 y pesar 0.6648 g de Na2HPO4.7H2O y disolverlos en 60
mL de agua destilada, controlar el pH de la solución resultante y ajustar el valor del
pH a 7.2 agregando pequeños volúmenes de Na2HPO4.7H2O. Llevar a 100 mL con
agua destilada en matraz aforado.
Anexo 2B. p-NPLaurato 0.01 M
Pesar 0.00421 g y disolver en 1 mL de alcohol etílico absoluto.
68
Anexo 3C. Carbonato de sodio 0.1 M (25 mL)
M=n/L despejamos n n= M.L = (0.1 M) * (0.0025 mL) n=0.0025 m= (n)*(PM) = (0.0025)*(105.993) m= 0.265 g Pesar 0.265 g para 25 mL
Anexo 3. Curva Patrón de pNP
Para llevar a cabo la determinación de actividad lipolítica, es necesario preparar una
curva patrón de pNP a partir de una solución stock de nitrofenol.
a) Preparación de la solución stock de pNP
Se preparó una solución inicial de 1 mL con una concentración de 7.18x10-4 mol/L.
se pesaron 10 mg de pNP y se disolvieron en 1 mL de etanol.
b) Preparación de soluciones de pNP a diferentes concentraciones (mol/L)
A partir de la solución stock de pNP 7.18x10-4 mol/L y por dilución con etanol, se
preparó una gama de soluciones del reactivo a distintas concentraciones, tal y como
se indica en el cuadro siguiente. Las diluciones se realizaron en tubos eppendorf, una
vez realizadas las mezclas se agitaron en vortex para homogenizar la solución.
Preparación de soluciones de pNP a diferentes concentraciones (mol/L).
Tubo Concentración molar
Etanol (μl)
Buffer (μl)
pNP (μl)
1 0.00000575 90 900 10
2 0.0000115 80 900 20
3 0.0000172 70 900 30
4 0.0000230 60 900 40
5 0.0000287 50 900 50
6 0.0000345 40 900 60
7 0.0000402 30 900 70
8 0.0000460 20 900 80
9 0.0000517 10 900 90
10 0.0000575 0 900 100
69
y = 10418x + 0.0086 R² = 0.995
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004 0.00005 0.00006 0.00007
Ab
sorb
anci
a D
O 4
00
nm
Concentración pNP (mol/L)
Curva patrón pNP