1

ABSORBSİYON SPEKTROSKOPİSİ

Ref. e_makaleleri, Enstrümantal Analiz, Ultraviyole ve Görü-nür (Visible) Spektrofotometre

Geçirgenlik (Transmittans)

Şekil-1'de paralel bir ışın demetinin, kalınlığı b ve konsantrasyonu c olan

absorblayıcı bir çözeltiden geçişi gösterilmiştir. Işının başlangıçtaki P0 gücü, foton-ların ortamdaki absorblayıcı taneciklerle etkileşimi sonucunda P’ye düşer. Çözel-tinin "geçirgenliği" T (%), gelen ışının çözelti tarafından geçirilen kesridir.

P T = (1) P0

PT = P0

P0A = log P

b

P0 P

örnek

P0 Pışıkkaynağı

dalga boyu seçici(monokromatör)

dedektör

b

(konsantrasyonu colan çözelti)

örnek

Şekil-1: Bir ışın demetinin absorblayıcı çözeltiden geçerken zayıflaması

2

Absorbans

Bir çözeltinin absorbansı aşağıdaki denklem ile verilir. Geçirmenin tersine, gelen ışın demetinin gücü arttıkça absorbans değeri de artar.

P0 A = - log T = log (2) P

Absorbtivite ve Molar Absorbtivite

Absorbans, ışının geçtiği ortamın yol uzunluğu (path length) ve absorblayıcı tane-ciklerin konsantrasyonu ile orantılıdır.

A = a b c (3)

Burada a orantı sabitidir ve "absorbtivite" adı verilir. a’nın büyüklüğü b ve c için kullanılan birimlere bağlıdır. Konsantrasyon mol/lt ve hücre (cell) kalınlığı cm ola-

rak alındığında, absorbtiviteye "molar absorbtivite" denir, ve harfi ile gösterilir. Bu durumda absorbans ifadesi aşağıdaki şekli alır.

A = b c (4)

P ve P0’ın Deneysel Olarak Ölçülmesi

Denklem (1) ve (2) kimyasal analizlerde doğrudan uygulanamazlar. P ve P0 'ın ölçülmesi, test edilen çözeltinin bir kap içinde bulunması zorunluluğu nedeniyle

doğru olarak yapılamaz. Işın ile numune kabının duvarları arasındaki etkileşim sonucunda, her iki yüzeyde de yansıma ve absorbsiyon yoluyla kayıplar olur. Ayrıca, ışın demeti çözeltiden geçerken büyük moleküllerin neden olduğu saçılma

olayıyla da gücünden kaybeder. Yansıma kayıpları da önemli miktarlarda olabilir; örneğin görünür ışın havadan cama veya camdan havaya dikey olarak geçerken yansıma kaybı % 4 dür. Bu etkileri gidermek için, P ve P0 ölçümlerinde birbirinin

aynı olan iki kap kullanılır. Bunlardan absorblayıcı çözeltinin bulunduğu kaptan geçen ışının gücü P olarak, sadece çözücünün bulunduğu kaptan geçen ışının gücü de P0 olarak ölçülür. Böylece gelen ışının kap duvarları nedeniyle uğrayaca-

ğı kayıplar her iki halde de aynı olacağından P0/P oldukça doğru olarak ölçülür; gerçek absorbansa çok yakın olan deneysel denklem aşağıdaki gibi yazılabilir.

Pçözücü P0 A = log = log Pçözelti P

3

Tablo-1: Absorbsiyon Ölçmelerinde Kullanılan Önemli Terimler ve Semboller

Terim ve Sembol (ASTM)

Tanım Alternatif terim ve sembol

Işın gücü, P, P0 Işının enerjisi, erg (ışın,

1 cm2 dedektör/s) Işının şiddeti, I, I0

Absorbans, A log P0/P Optik yoğunluk, D, Sönme, E

Geçirgenlik, T P/P0 Geçme, T

Işın yolu, b, cm - I, d

Absorbtivite, a, g/L A / b c Sönme katsayısı, k

Molar absorbtivite, mol/L

A / b c Molar sönme ketsayısı

Geçirgenlik (Transmittans) ve Absorbans Ölçülmesi

Geçirgenlik ve absorbans ölçmelerinin yapıldığı bir enstrumanın dedektörünün elektrik çıkışı G aşağıdaki denklemle verilir. K’, transdusere ışın çarpmadığı za-

manki "kara akım (dark current)", K orantı sabitidir.

G = KP + K’ (5)

Dedektörden çıkan elektrik enerjisi sinyalleri okuyucuya (veya kaydediciye) gelir.

Bu tip enstrumanların çoğunda okuyucu skalası doğrusaldır ve T, % 0-100 aralı-ğında olacak şekilde geçirgenlik değerine göre kalibre edilmişlerdir. Geçirgenlik değerinin ölçülmesi üç kademede gerçekleşir. İlk olarak gelen ışın demetinin önü-

ne bir kapak (engel) konularak dedektöre girmesi önlenir ve bu halde okuyucu ibresi sıfıra ayarlanarak gelen elektrik sinyalleri giderilir; bu kademeye "ölü akım" veya "T=% 0 ayarı" denir. Bundan sonra ışın demetinin önünden kapak kaldırılır

ve ışının içinde çözücü bulunan hücreden geçmesi sağlanır ve okuyucu ibresi 100'e ayarlanır; bu kademe "T = %100 ayarı"dır; bu ayarlamayla kaynağın çıkış gücü elektriksel olarak artırılmış veya azaltılmıştır. Alternatif olarak, ayarlanabilir

bir diyafram (veya bir kafes) veya optik takoz kullanılarak da ışın demetinin gücü değiştirilebilir. İkinci kademede yapılan ayarlamadan sonra Denklem(5) aşağıdaki gibi yazılabilir.

G0 = 100 = K P0 + 0.00

4

Ölçme işleminin son kademesinde solvent hücresi çıkarılarak yerine örnek hücre-si konur. Okuyucudan alınan değer

G = KP + 0.00 dır.

Bu denklem birinciye bölünerek,

P G = 100 = T x 100 P0

eşitliği çıkarılır. Geçirgenlik yüzdesi doğrudan okuyucudan gözlenir. Absorbsiyon

skalası da aynı cihaz üzerinde bulunabilir.

Beer Kanunu

Absorbtivite ve molar absorbtivite eşitlikleri (A = a b c, ve A = b c) "Beer kanu-nunun" birer ifadesidir. Bu bağıntıları mantıklı bir şekilde açıklayabiliriz.

Şekil-2'de görüldüğü gibi absorblayıcı bir blok (katı, sıvı, veya gaz) düşünelim; blok içinde n tane absorblayıcı tanecik (atomlar, iyonlar veya moleküller) bulun-sun. Bloğun yüzeylerinden birine dik olarak P0 gücünde paralel bir monokromatik

(tek renkli) ışın demeti gönderildiğinde ışın yüzeye çarpar, b uzunluğundaki absorblayıcı ortamdan geçer, ve gücü P ye düşmüş olarak bloku terk eder.

http://chem.ncue.edu.tw/liumy/contents/Ch13_2007.ppt

Şekil-2: Başlangıç gücü P0 olan bir ışının konsantrasyonu c mol/L, uzunluğu b

olan absorblayıcı bir çözeltiden geçerken zayıflaması (P < P0)

5

Bloğun alanı S ve kalınlığı dx (bölünemeyecek kadar küçük bir kalınlık) olan bir kesitini ele alalım. Bu kesitte dn tane absorblayıcı tanecik bulunduğunu ve her bir

taneciğin de fotonların yakalandığı bir yüzey olduğunu düşünelim.

Eğer bir foton tesadüfen bu yüzeylerden birine ulaşırsa hemen absorblanacaktır.

Kesit içindeki yakalayıcı yüzeylerin toplam alanı dS ile gösterilirse, yakalayıcı alanların toplam alana oranı dS/S’dir; bu oran, fotonların kesit içinde ortalama yakalanma ihtimaliyetini gösterir.

Kesite giren ışın demetinin gücü Px , her santimetrekarede 1 saniye içinde bulu-nan fotonların sayısı ile orantılıdır. dPx her saniyede tutulan miktarı gösterir, absorblanan kesir -dPx /Px dır. Bu oran fotonların ortalama yakalanma

ihtimaliyetine eşittir. Böylece,

dP dS x- = (6) Px S

bağıntısı yazılabilir. dS, kesitteki taneciklerin ışını yakalama yüzeylerinin toplam alanı olduğundan taneciklerin sayısı ile orantılı olmalıdır.

dS = a dn (7)

dn taneciklerin sayısı ve a orantı sabitidir, Orantı sabitine "yakalama kesiti" denir. (6) ve (7) denklemleri birleştirilerek sıfır ve n arasındaki toplamı alınır.

P dPx n a dn - dt = P0 Px n0 S

İntegrasyondan sonra bu ifade aşağıdaki şekilde yazılır.

P a n - ln = P0 S

Logaritma 10 tabanına dönüştürülür ve işaretin değiştirilmesi için kesir ters çevri-lerek aşağıdaki Denklem (8) elde edilir.

P a n 0log = (8) P 2.303 S

Burada n, blok içindeki taneciklerin toplam sayısıdır. Kesitin alanı S, bloğun hacmi V ve uzunluğu b ile tarif edilir.

6

V S = cm2 (8) denkleminde S yerine V/b konularak, b

P a n b 0log = (9) P 2.303 V

ifadesi çıkarılır. Burada n/V her santimetre karedeki tanecik sayısıdır ve birimi konsantrasyon birimleridir. n/V, mol/L cinsinden ifade edilebilir,

n tanecik 1000 cm /L 1000 n c = x = mol/L 6.02 x 1023 tanecik/mol V cm 6.02 x 1023 x V

Bu eşitlik Denklem(9) ile birleştirilirse

P 6.02 x 1023 x a b c 0log = eşitliği çıkarılır P 2.303 x 1000

Denklemdeki sabitler terimi içine alındığında Beer kanunu elde edilir.

P 0log = b c = A (10) P

Beer kanunu birden fazla absorblayıcı maddenin bulunduğu çözeltilere de uygu-

lanabilir. Çözeltide bulunan tanecikler arasında herhangi bir etkileşim olmadığı kabul edilerek çok maddeli bir sistemdeki toplam absorbsiyon:

A toplam = A1 + A2 + ..... + An (11)

şeklinde yazılır; 1, 2,..., n, absorblayıcı maddelerin türlerini gösterir.

Beer Kanununun Uygulanmasında Sınırlamalar

Absorblayıcı maddelerin sabit bir konsantrasyonunda, absorbans (A) ve yol uzun-luğu (b) arasında doğrusal bir orantı vardır ve istisnası yoktur. Diğer taraftan, b

nin sabit olması halinde absorbans ve konsantrasyon (c), arasında doğrusal bir orantı olması beklenir. Bu durum vardır, ancak orantının doğrusallıktan sapması ile de çok sık karşılaşılır. Bu sapmaların bazıları olayın temelini oluştururlar ve

kanunun gerçek sınırlarını belirlerler. Diğer bir kısım sapmalar ise ölçmelerin ya-pıldığı enstrumandan dolayı veya konsantrasyon değişikliklerinin kimyasal deği-şikliklere neden olduğu hallerde gözlenir; bunlar "kimyasal sapmalar" veya

"enstrumental sapmalar" şeklinde tanımlanırlar.

7

1. Beer Kanununun Gerçek Sınırları

Beer kanunu, sadece seyreltik çözeltilerin absorbsiyon davranışlarını açıklamada yeterlidir; bu anlamda sınırlayıcı bir kanundur.

Yüksek konsantrasyonlarda (genellikle 0.01M'ın üstünde) absorbsiyona neden olan tanecikler arasındaki ortalama uzaklık, her bir taneciğin komşu taneciklerin yük dağılımını etkileyebileceği bir seviyeye kadar küçülür. Bu etkileşim sonucu

taneciklerin verilen bir dalga boyundaki ışını absorblama yetenekleri değişir. Etki-leşmenin konsantrasyona bağlı olarak artması, absorbans ve konsantrasyon ara-sındaki doğrusal ilişkiyi bozarak sapmaya neden olur.

Benzer bir durumla absorblayıcı konsantrasyonunun düşük, fakat diğer maddele-rin konsantrasyonlarının fazla olduğu, örneğin elektrolitler gibi, çözeltilerde karşı-laşılır. Bu halde iyonların absorblayıcıya çok yakınlaşması elektrostatik etkileşimle

absorblayıcının molar absorbtivitesini değiştirir; seyreltmeyle bu etki azaltılabilir.

Moleküler etkileşimin 0.01M'ın altındaki konsantrasyonlarda önemli olmamasına karşın, bazı büyük organik iyon ve moleküllerde özel haller gözlenir. Örneğin me-

tilen mavisi katyonunun 436 nm'deki molar absorbtivitesi, boya konsantrasyonu-nun 10-5 M'dan 10-2 M'a yükseltilmesiyle %88 oranında artar; hatta 10-6 M'dan küçük konsantrasyonlarda bile Beer kanununa sıkı bir bağlılık göstermez.

Beer kanunundan sapmalar, 'nin çözeltinin refraktif indeksine bağımlı olması hallerinde de gözlenir. Eğer konsantrasyon değişiklikleri çözeltinin refraktif indek-sini (n) önemli derecede değiştiriyorsa çözelti Beer kanunundan sapar. Bu gibi

sapmalarda Denklem(10)daki yerine

n (n2 +2)2

koyularak düzeltme yapılabilir. Genel olarak bu düzeltme çok büyük değildir ve 0.01M’dan düşük konsantrasyonlarda nadiren etkilidir.

2. Kimyasal Sapma

Çözelti ile absorblayan tanecikler arasındaki birleşme, ayrışma, veya reaksiyon

sonucunda Beer kanunundan sapmalarla karşılaşılır. Kimyasal sapmayı açıkla-mak için klasik bir örnek olan tamponlanmamış potasyum dikromat çözeltisindeki sapmayı inceleyelim. Çözeltideki reaksiyon aşağıdaki şekildedir.

8

Cr2O7-2 + H2O 2 HCrO4

- 2 H+ + 2CrO4-2

Pek çok dalga boyunda, dikromat iyonu ile iki kromat iyonunun molar

absorbtiviteleri oldukça farklıdır. Bu nedenle, herhangi bir çözeltinin toplam ab-sorbansı dimerik ve monomerik hallerinin konsantrasyonları oranına bağlıdır. Bu oran seyrelmeyle önemli derecede değişeceğinden absorbans ve toplam krom(VI)

konsantrasyonu arasındaki doğrusal orantı da bozulur. Bununla beraber, dikromat iyonunun absorbansı molar konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak kalır. Aynı durum kromat iyonları için de geçerlidir. Bu gerçek, kuvvetli asidik ortamda

(dikromat iyonları hakimdir) ve kuvvetli alkali ortamda (kromat iyonları hakimdir) krom(VI) çözeltisinin absorbansının ölçülmesiyle kolaylıkla kanıtlanabilir.

Sistemin Beer kanunundan sapması kimyasal dengedeki kaymadan dolayıdır. Bu

tür sapmalar, reaksiyonların denge sabitlerinden ve dikromat ve kromat iyonları-nın molar absorbtivitelerinden önceden doğru olarak bilinebilir.

ÖRNEK

1.02 x 10-4 M HIn çözeltisinden aynı miktarda iki örnek alınarak 0.2 N NaOH ve 0.2 N HCl ilavesiyle seyreltilir. İlave edilen NaOH ve HCl miktarları eşittir. Hazır-

lanmış olan iki numune, 1.00 cm'lik hücrelere konarak 430 ve 570 nm'de absorbansları okunur (HIn için Ka =1.42 x 10-5 dir).

Seyreltici A430 A570

0.2 M NaOH 1.051 0.049

0.2 M HCl 0.032 0.363

İndikatör konsantrasyonunun,

2 x 10-5 M - 16 x 10-5 M

aralığında değiştiği tamponlanmamış çözeltilerin iki dalga boyundaki absorbans değerlerini bulup, grafiğini çizelim.

Bu çözeltilerin absorbansları aşağıdaki denkleme dayanır.

HIn H+ + In-

9

[H+] [In-] K = = 1.42 x 10-5 a [HIn]

Kuvvetli baz ilavesi halinde indikatörün tamamı In- iyonuna disosiye olur, yani,

1.02 x 10-4 [In-] = 5.10 x 10-5 M 2

olur. Benzer şekilde, kuvvetli asitte

[HIn] 5.10 x 10-5 M

Bu maddelerin molar absorbtiviteleri (= A/bc) saptanabilir.

430 nm'de,

1.051 ’ = = 2.06 x 104 In 1.00 x 5.10 x 10-5

0.032 ’ = = 6.3 x 102 HIn 1.00 x 5.10 x 10-5

570 nm'de,

0.049 ’’ = = 9.6 x 102 In 1.00 x 5.10 x 10-5

0.360 ’’ = = 7.12 x 103 HIn 1.00 x 5.10 x 10-5

Tamponlanmamış 2.00 x 10-5 M HIn çözeltisindeki HIn ve In- konsantrasyonlarını hesaplayalım. Disosiyasyon reaksiyonundan görüldüğü gibi

[H+] = [In-]

[In-] + [HIn] = 2.00 x 10-5 tir.

Bu bağıntılar, Ka denkleminde yerine konur.

[In-]2 K = = 1.42 x 10-5 a 2.00 x1 0-5 - [In-]

[In-]2 + 1.42 x 10-5 [In-] - 2.84 x 10-10 = 0

[In-] = 1.12 x 10-5

10

[HIn] = 2.00 x 10-5 - 1.12 x 10-5 = 0.88 x 10-5

Bu hesaplamalardan sonra iki dalga boyundaki absorbanslar bulunabilir.

A430 = ’In b [In-] + ’HIn b [HIn]

A430 = 2.06 x 104 x1.00 x1.12 x 10-5 + 6.3 x 102 x1.00 x 0.88 x 10-5

A430 = 0.236

A570 = 9.6 x 102 x 1.00 x 1.12 x 10-5 + 7.12 x 103 x1.00 x 9.88 x 10-5

A570 = 0.073

Aynı hesaplar 4.00 x 10-5, 8.00 x 10-5, 12.00 x 10-5, 16.00 x 10-5 M indikatör kon-santrasyonları için de yapılır ve A430 ve A570 absorbans değerleri hesaplanır.

MHIn [HIn] [In-] A430 A570

2.00 x 10-5 0.88 x 10-5 1.12 x 10-5 0.236 0.073

4.00 x 10-5 2.22 x 10-5 1.78 x 10-5 0.381 0.175

8.00 x 10-5 5.27 x 10-5 2.73 x 10-5 0.596 0.401

12.00 x 10-5 8.52 x 10-5 3.48 x 10-5 0.771 0.640

16.00 x 10-5 11.9 x 10-5 4.11 x 10-5 0.922 0.887

İndikatör konsantrasyonları (M) absorbans değerlerine(A) karşı grafiğe alındığın-da 430 ve 570 nm'deki dalga boyları için Şekil-3'deki eğri elde edilir. Eğrilerin

görünümü düz bir doğru değildir ve Beer kanunundan sapma vardır. Bu durum disosiyasyon veya asosiyasyona yatkın olan absorbsiyon sistemlerinden bekle-nen bir sonuçtur.

11 A

bsor

bans

İndikatör konsantrasyonu, M x 105 http://chem.ncue.edu.tw/liumy/contents/Ch13_2007.ppt

Kimyasal Sapmalar

= 430 nm: pozitif sapma;İndikatörün iyonize (In)formunu (iyonlaşmışfraksiyonla orantılıdır)tanımlar

= 570 nm: negatif sapma;disosiye olmamış asiti (HIn)tanımlar

Şekil-3: Hın indikatörünün tamponlanmış çözeltisi için Beer Kanunundan kimyasal sapma

3. Polikromatik (Çok Renkli) Işın ile Enstrumental Sapma

Işının gerçek monokromatik bir ışın olması halinde Beer kanununa sıkı bir bağım-lılık görülür ki bu da kanunun sınırlayıcı özelliklerinden biridir. Oysa tek bir dalga

boyunu içeren bir ışın nadiren pratik bir anlam taşır; çünkü, sürekli bir kaynaktan çıkan ışından istenilen dalga boyundaki ışın dışındakileri ayıran (yok eden) sis-temler de, bu dalga boyu etrafında az veya çok simetrik başka bandlar verirler

Polikromatik ışının Beer kanunu üzerindeki etkisini inceleyelim. Sadece iki dalga boyu (’ ve ’’) içeren bir ışını ele alalım ve bu dalga boylarının her biri için Beer kanunu yazalım.

’ için,

P’0 A’ = log = ’ b c veya, P’

12

P’ 0 = 10’bc P’

benzer şekilde, ’’ için de aşağıdaki bağıntı,

P’’ 0A’’ = log = ’’ b c veya, P’’

P’’ 0 = 10'’bc P’’

Bu karakterdeki ışınla bir absorbans ölçümü yapıldığında, çözeltiden çıkan ışın

demetinin gücü (P’ + P’’) solventten çıkanın ise (P’0 + P’’0) şeklinde gösterilebilir; ölçülen absorbans ise,

P’ + P’’ 0 0A =log M P’ + P’’

denklemiyle verilir. Denklemin değişik şekilde yazılması ve ’ = ’’ kabul edilmesiy-

le Beer kanunu elde edilir.

P’ + P’’ 0 0A = log M P’0 10-'bc + P’’0 10-'’bc

AM = log (P’0 + P’’0) – log (P’0 10-'bc + P’’0 10-'’bc)

’ = ’’ olduğunda,

AM = ’ b c olur.

Eğer molar absorbtiviteler birbirine eşit değilse AM ve konsantrasyon arasındaki ilişki, farkın büyümesiyle doğrusallıktan sapar. Bu ifade, ikiden daha fazla dalga

boyu içeren ışınlar için de geçerlidir (Şekil-4a).

Pratik çalışmalar, polikromatik bir ışının, absorblayıcı maddenin (dalga boyuna bağlı olarak) büyük absorbans değişikliklerine neden olmayacağı bir spektral böl-

ge içermesi halinde, Beer kanunundan önemli sapmalar olmayacağını göstermiş-tir. Bu gözlemler Şekil-4b'de görülmektedir.

13

1 = 10002 = 1000

1 = 15002 = 500

1 = 17502 = 250

Abs

orb

an

s

Konsantrasyon, M x 104

(a) 1 ve 2 dalga boylarındaki ışınlar için AM ve konsantrasyon arasındaki ilişkinin doğrusallıktan sapması

A bandıA bandıB bandı

B bandı

Abs

orb

an

s

Abs

orb

an

s

KonsantrasyonDalga boyu

(b): A bandı, band boyunca de fazla değişme olmadığından az bir sapma göste-rir, B bandındaki sapma bu bölgede önemli derecede değişmediğinden büyüktür

Şekil-4: Polikromatik ışının Beer Kanununa etkisi (http://chem.ncue.edu.tw/liumy/contents/Ch13_2007.ppt)

14

4. Başıboş Işının Varlığında Enstrumental Sapmalar

Bir monokromatörden çıkan ışın çeşitli iç yüzeylerden yansıyarak çıkış slitine kadar gelen saçılmış veya başıboş ışınlarla karışarak kirlenir. Başıboş ışının dal-

ga boyu esas ışından çok farklıdır ve ayrıca örnekten geçmeyebilir.

Başıboş ışının bulunduğu halde yapılan ölçmelerde gözlenen absorbans değeri aşağıdaki ifade ile verilir.

P0 +Ps A’ = log P + Ps

Ps, başıboş ışının gücünü gösterir. Şekil-5'de absorbans değerlerinin çeşitli Ps değerlerinde, konsantrasyona göre çizilen grafikleri verilmiştir.

Şekil-4 ve 5'deki eğriler, deneysel enstrumental sapmaların teorik değerlerden

daha küçük olduğunu göstermektedir; ayrıca enstrumental sapmaların daima negatif absorbans hataları verdiği de anlaşılmaktadır.

Konsantrasyon, M x 103

Abs

orba

ns

Ps/P0 x %100

%0.0

%0.2

%1

%5

Şekil-5: Çeşitli miktarlarda sapmış ışının neden olduğu

Beer Kanunundan sapmalar

15

Spektrofotometrik Analizlerin Hassasiyetinde Cihaz Gürül-tüsünün Etkisi

(Bak. Enstrumantal Analizde Gürültü)

Spektrofotometrik analizin doğruluğu ve hassasiyeti, cihazdan gelen kararsızlıklar

ve gürültü nedeniyle çoğu zaman sınırlıdır. Cihaz gürültüsünün spektrofotometrik ölçmelerin hassasiyetine etkisini anlayabilmek için, önce bunların öğrenilmesi yararlı olacaktır.

Bir spektrofotometrik ölçme üç aşamada gerçekleştirilir: %0 T ayarı, %100 T ayarı ve örneğin %T değerinin ölçülmesi. Bu aşamaların her birinde oluşabilecek karar-sızlıklar birleşerek son okuma %T değerinde değişik okumalara neden olur. Bu

farklılık Beer kanunundan çıkarılabilir. Beer kanununu aşğıdaki şekilde yazalım.

1 - 0.434 c = - log T = ln T b b

Bu denklemin b ve c sabit olduğu haldeki kısmi türevi aşağıdaki gibidir.

- 0.434 c = T b T

Burada c, enstrumanda gürültü veya kararsızlık olması halinde T değerinin T kadar değişmesi durumundaki c konsantrasyonundaki değişikliktir. Bu denklemin ilk denklemle bölünmesiyle aşağıdaki eşitlik elde edilir.

c 0.434 T = x (12) c log T T

Üç ölçme kademesinde T'de olabilecek "relatif" kararsızlık (hata) veya gürültü

T/T ile, konsantrasyondaki hata ise c/c ile gösterilir. Gürültü T'nin en iyi ölçümü standart sapma sT ile saptanır; standart sapma, bir seri ölçme için şu şekilde veri-lir.

n (Ti - T)2 i=1 N -1

sT = T = (13)

16

Burada Ti , N defa yapılan ölçmelerde T için okunan değerlerin her biri, T ise tüm okumalar için hesaplanan ortalama değerdir. Denklem(12) den relatif standart

sapma konsantrasyon cinsinden ifade edilebilir (sc/c)

s 0.434 s c T = x (14) c log T T

Deneysel olarak sT bulunabilir; örneğin T için 20 okuma (N = 20) yapılmış olsun, bu değerler sT için verilen eşitlikte yerine konarak sT hesaplanır.

Denklem(14)'ün incelenmesinden, fotometrik bir konsantrasyon ölçümündeki kon-

santrasyonun geçirgenliğin büyüklüğü ile karmaşık bir bağıntıda olduğu görülür. Hatta gerçekteki durum Denklem(14)'dekinden daha da karmaşıktır çünkü sT 'de, pek çok koşulda T'ye bağımlıdır.

Rothmon, Crough ve İngle detaylı teorik ve deneysel çalışmalarında birkaç enstrumental kararsızlık kaynağını tarif etmişler ve bunların absorbans veya transmittans ölçümlerindeki net etkilerini göstermişlerdir. sT nin büyüklüğü,

T ile orantılıdır,

(T2 + T)1/2 ile orantılıdır,

T’den bağımsızdır.

Tablo-2'de bu kararsızlık kaynakları özet olarak verilmiştir. Her tip kaynağın kon-santrasyon hatasının büyüklüğüne etkisi açıkça görülmektedir.

Bir spektrofotometrik yöntemin hata analizinde ne tip hata kaynaklarının olabile-

ceği iyice bilinmelidir.

1. %0 T Kararsızlığı (Hatası)

Tablo-2'de görüldüğü gibi %0 T hatası transdüserler ve amplifikatörlerle ilgili üç tip

hatayı kapsar; adından da anlaşıldığı gibi, bunlar T = %0 ayarının yapılmasıyla ilgilidir. Bu tip hatar ışının dedektöre gitmesini engelleyen kapaktan ışın sızması, kapağın hareketiyle oluşan titreşim etkileri, ve transduser ve amplifier sistemlerin-

deki sıcaklık dalgalanmalarından kaynaklanır. Modern spektrofotometrelerde ci-hazın uç dalga boylarının dışındaki bölgelerde %0 T gürültüsü çoğu zaman önem-li değildir; uç dalga boylarında Denklem(5)'deki K’ değeri KP ve KP0 'a yaklaşır.

%0 T gürültüsü T’nin büyüklüğüne bağlı değildir.

17

Tablo-2: Spektrofotometrik Ölçmelerde Karşılaşılan Kararsızlık (Hata) Kaynakları

sT, T ‘den bağımsız sT = k’ T2 + T sT = k’’ T

%0 T gürültü Ölü akım vurma gürültüsü Ölü akım fazla gürültüsü Amplifikatör fazla gürültüsü Dedektör Johnson gürültüsü (sadece termal dedektörkerde)Sınırlı okuma rezolusyonu Amplifikatör vurma gürültüsü

Dedektör vurma gürültüsü (sadece foton dedektörü)

Kaynak fliker gürültü-sü Hücre durumu karar-sızlığı

Tablo-3: Çeşitli Düzensizlik Kaynakları İçin Geçirgenlik ve

Absorbansın Fonksiyonu Olarak Relatif Konsantrasyon Hataları

Relatif Hata Ölçmelerde Sınırlar Geçirgenlik,

T Absorbans, A T = % 0 veya

Johnson gürültüsü(a) Sinyal vurma gürültüsü(b)

Fliker gürültüsü(c)

0.95 0.022 6.2 8.4 5.8 0.90 0.046 3.2 4.1 2.8 0.80 0.097 1.7 2.0 1.3 0.60 0.222 0.98 0.96 0.59 0.40 0.398 0.82 0.61 0.33 0.20 0.699 0.93 0.46 1.18 0.10 1.00 1.3 0.43 0.13

0.032 1.50 2.7 0.50 0.09 0.010 2.00 6.5 0.65 0.06 0.0032 2.50 16.3 0.92 0.05 0.0010 3.00 43.4 1.4 0.04

(a) Denklem (14)den sT = 0.003 kullanılarak (b) Denklem (16)dan k’ = 0.003 kullanılarak (c) Denklem (18)den k’’ = 0.003 kullanılarak

18

2. Johnson Gürültüsü

Johnson gürültüsü, dirençli devre elemanlarındaki elektronların ısı tesiriyle hare-ketlenmelerinden kaynaklanır. Bu hareket, direnç elemanda belirli bir yönde ilerle-

yen elektronların ortalama sayısını aniden artırır veya azaltır. Jonhson gürültüsü akımın büyüklüğüne bağlı değildir; gerçekte, akım olmadığı zaman ortaya çıkar. Johnson gürültüsü, fotometreler ve spektrofotometrelerin tüm dedektör ve elekt-

ronik kısımlarında bulunur. Diğer gürültü kaynaklarına kıyasla çok küçüktür ve tüm pratik uygulamalarda ihmal edilebilir; İstisna, IR ışın veren ısıl dedektörleridir. Bu dedektörlerle çalışıldığında Johnson gürültüsü spektral ölçmelerin hassasiye-

tini sınırlayacak kadar etkili olur. Tersine UV ve görünür bölgelerdeki Johnson gürültüsü fototüplerde, fotomultiplier tüplerde, ve amplifikatörlerde olduğundan, ölçmeleri etkilemez.

3. %0 T ve Johnson Gürültüsünün Etkileri

Belirtildiği gibi Johnson gürültüsü ve %0 T gürültüsünün büyüklüğü, transmittansdan bağımsızdır. Yani, Denklem(14) deki sT, T’den "bağımsız" dır ve

sT nin sc ye etkisi saptanırken sabit kabul edilebilir. Bir cihazın sT değeri, bir absorbsiyon çözeltisinin 20-30 bağımsız ölçümleri için standart sapma hesapları yapılarak saptanır.

Tablo-3'deki 3.kolon hassasiyeti Johnson veya %0 T gürültüsü ile sınırlanmış bir spektrofotometrede karşılaşılan konsantrasyondaki relatif hatayı gösterir. Burada, transmittanstaki mutlak kararsızlık sT = ±0.003 veya %±0.3 T'dir. Bu veriler Şekil-

6'daki A eğrisini verir, görüldüğü gibi, c’nin relatif standart sapması, absorbans 0.4 dolayında olduğunda bir minimuma ulaşır. (Denklem-14'ün türevi sıfıra eşitlene-rek, minimumun 0.434 absorbansta veya 0.368 transmittansta gerçekleştiği görü-

lebilir.)

Ticari spektrofotometrelerin çoğunda transmittanstaki standart sapma ±0.0001 ile ±0.01 (T = %0.01 ile 1) arasında değişir; düşük değerlere yüksek-kaliteli

Ultraviyole görünür ışık cihazlarında rastlanırken fazla pahalı olmayan infrared cihazlarda yüksek değerler gözlenir. Tablo-3'deki ±0.003 değeri orta kaliteli %0 T veya Johnson gürültüsü olan cihazlar için tipiktir; konsantrasyon hataları 0.15 -1.0

aralığındaki absorbsiyonlarda relatif %1-2 kadardır. Daha kuvvetli absorbsiyon ortamlarında hata da büyük olacağından, ölçme işleminden önce örnek yeteri kadar seyreltilmelidir. Ancak absorbansın 0.1 den daha küçük olması durumunda

relatif hatalar %2'nin üstüne çıkar (Şekil-6).

19

Absorbans

Rel

atif

kons

antr

asyo

n ka

rarsız

lığı,

% (

s c/c

x 10

0)

Şekil-6: Çeşitli enstrumental kararsızlıklar için hata eğrileri; A: %0 T, B: sinyal vurma gürültüsü, C: Flicker gürültüsü (Tablo-3’deki verilere göre)

Bu yorumlarda, bir analizdeki sınırlayıcı kararsızlıkların, transmittanstan bağımsız

olduğu varsayılmıştır; bu tip kararsızlık, ısıl dedektörlü cihazlarda bulunur.

4. Okuma Resolusyonundan (Ayırma Yeteneğinden) Gelen Sınırlan-dırma

Bazı Ticari Spektrofotometrelerin hassasiyeti okuma aletlerinin resolusyonu ile

sınırlandırılmıştır. Örneğin, toplam skalasının ±% 0.5'i kadar bir hassasiyetle o-kumaya olanak veren bir cihazın kararsızlığı (sT) ±0,005 T dir. Bu kararsızlık T'ye bağımlı da değildir; Bu nedenle, konsantrasyondaki relatif hataya etkisi %0 T ve

Johnson gürültüsünde olduğu gibidir ve Denklem(14) ile tanımlanır. Bu denklem-de sT yerine 0,005 konularak konsantrasyon verileri hesaplanır, %1.5-3 arasındaki kararsızlık relatif geçirgenliği %10-80 aralığında sınırlandırılır.

5. Sinyal Vurma (Titreşim) Gürültüsü

Daha önce de işaret edildiği gibi vurma gürültüsü, bir fotomultiplier tüpün kato-dundan anoduna doğru, veya engelli-tip bir fotoselin bağlantıları boyunca olan

20

elektronların hareketiyle oluşan elektrik akımında gözlenir. Burada oluşan akım bir seri ayrı kuvantize değerlerin sonucudur (bir katottan elektronların emisyonu);

birim zamandaki çeşitli kuvantize değerler ortalama bir değerin etrafında rasgele dağılmıştır. Akımdaki dalgalanmalarının büyüklüğü akımın kare kökü ile orantılı-dır.

Daha önce incelenen gürültü tiplerinin tersine vurma gürültüsü, ölçülen miktarın büyüklüğünün artması ile beraber artar. Sonuç olarak Denklem(4) deki sT, T'nin fonksiyonudur. Vurma gürültüsünün sT ve sc ye etkisi, aşağıdaki örnekte görüldü-

ğü gibi, bulunabilir.

ÖRNEK

sT ve sc nin vurma gürültüsü ile ilişkisini gösteren bir bağıntının çıkarılması.

Vurma gürültüsü, geçirgenlik veya absorbans ölçmelerinde yapılan üç işlemde de vardır. %0 T ayarındaki gürültü P ve P0 ölçümlerindeki gürültülere göre daha kü-

çüktür, çünkü, gürültü artışı sinyalin kare kökü ile orantılıdır. Bu nedenle T'deki kararsızlığı P ve P0 ölçmelerindeki gürültü belirler. T bu iki değerle çevrildiğinden relatif standart sapması, P ve P0'ın relatif standart sapmalarından elde edilebilir.

Buna göre,

sT sP sP0 ()2 = ()2 + ()2 T P P0

Vurma gürültüsü ölçülen değerin karekökü ile orantılı olduğundan,

sP = k P

sP0 = k P0

yazılabilir, k orantı sabitidir. Bu iki eşitliğin ilk denklemde yerine konulmasıyla sT denklemi çıkarılır.

sT 1 1 k2 P0 ()2 = k2 ()() = ( +1) veya, T P P0 P0 P

T k 1 + 1 T

sT =P0

21

Normal olarak, bir seri T ölçmeleri sırasında P0 önemli derecede değişmez. Bu durum göz önüne alınatak sT bağıntısı aşağıdaki şekilde yazılır.

1 + 1 = k’ T + T2

TsT = T k’

(15)

k' = k P0 ,

Denklem(15), (14)’de yerine konularak Denklem(16) bulunur.

sc 0.434 k’ T + T2 0.434 k’x= c log T T log T

1 + 1 T (16)

Tablo-3'de 4.kolondaki veriler Denklem(16) ile hesaplanmıştır. Verilerin grafiği

Şekil-6'daki B eğrisi ile gösterilmiştir. Hassasiyeti, Johnson veya %0 T gürültü-sünden çok vurma gürültüsünün sınırladığı durumda, çalışılabilen (doğru olarak) absorbans aralığı daha geniştir. Johnson veya %0 T gürültüsünün sınırladığı ci-

hazlarda olduğu gibi, vurma-sınırlı cihazlarda da %95'ten büyük geçirgenliklerde (A<0.02) güvenilir konsantrasyon değerleri alınamaz.

Sinyal vurma gürültüsü, Ultraviyole ve görünür ışık fotometre ve

spektrofotometrelerde yapılan transmittans veya absorbans değerlerinin doğrulu-ğunu bazen sınırlarlar. Bu durum infrared cihazlarda önemsiz seviyelerdedir.

6. Flicker Gürültüsü

Fotometreler ve spektrofotometrelerdeki Flicker gürültüsü, büyük ölçüde, ışın kaynağından ileri gelir. Flicker gürültüsünün büyüklüğü teorik olarak bulunamaz. Kaynaktan gelen kararsızlıklar

sT = k’’ T eşitliği ile tarif edilir (17)

Denklem(14) bu değerin yerine konulmasıyla aşağıdaki şekilde yazılır.

sc 0.434 = k'' (18) c log T

Tablo-3 5.kolonda ve Şekil-6'daki C eğrisinde Flicker gürültüsünden kaynaklanan konsantrasyon hatası, yüksek absorbanslarda hızla düşer ve sıfıra ulaşır.

22

Düşük absorbansta bir spektrofotometrik ölçmedeki toplam kararsızlık, çoğunluk-la, Flicker gürültüsü ile daha önce incelenen gürültülerin toplamından oluşur; diğer

üçünün katkısının az olduğu durumlar nadirdir.

7. Hücrenin Durumundan Gelen Kararsızlık

Tüm hücrelerde ufak tefek kusurlar vardır. Bu nedenle, kaynakla hücrenin değişik

kısımlarının yüz yüze gelmesiyle farklı yansıma ve saçılma kayıpları olur; ölçülen transmisyonda da bu farka uygun değişikliklerin olması kaçınılmazdır. Yüksek-kaliteli hücrelerde bu tip kusurlar en düşük düzeydedir. Hücrelerin çizilmiş ve kirli

olması halinde geçirgenliğin hücrenin durumuna olan bağımlılığı önemli derecede artar.

Rothman, Crouch, ve Ingle hücrenin durumundan gelen kararsızlıkların, kaynak

Flicker gürültüsüyle ayni davranışta olduğunu göstermişlerdir; yani, sT, geçirgenlik ile orantılıdır ve konsantrasyon kararsızlığı Denklem(18)'le verilir. Hücrelerin te-mizlenmesi ve yerleştirilmesinde çok dikkatli davranılması halinde bile hata kay-

nakları yok edilemez. Spektrofotometrik ölçmelerde doğruluğu etkileyen (sınırla-yan) en önemli faktör hücrelerin durumudur. Bu etkiyi azaltacak bir yöntem, kalibrasyon ve analiz süresince hücrelerin yerinden hiç çıkarılmamasıdır; hücrele-

rin yıkanması, çalkalanması, ve yeni standartlar ve örneklerin konulması, hücreler çıkarılmadan bir şırınga ile yapılır. Bu işlemler sırasında hücrelere dokunmaktan ve sarsmaktan kaçınılmalıdır.

Sonuç olarak, özetlenirse, bir spektrofotometrik analizde karşılaşılan rasgele ha-talar çeşitli değişkenlerden kaynaklanır; bunlar, enstrumanın dizaynı, dalga boyu

aralığı, kaynağın şiddeti ve kararlılığı, transdüserin hassasiyeti, slit genişlikleri, ve analitin konsantrasyonudur. Kaydedici cihazlarda, spektrum kaydedilirken bu de-ğişkenlerin bazıları değişebileceğinden durum daha da karmaşık bir hal alır.

İnfrared cihazlar, en çok Johnson gürültüsüyle (dedektörlerinden dolayı) ve hücre yapısı ile sınırlandırılırlar. IR çalışmalarda, çoğunlukla, ışık yolu çok kısa olan dar hücreler kullanılır. Bu nedenle hücrenin bir kısmındaki örnek kalınlığı, diğer kısım-

larındakinden farklı olur. Ayrıca, IR hücreler çok kolay bozulur ve atmosferden etkilenirler; yüzeylerin durumuna göre geçirgenlik farklılıklar gösterir. Kaynak Flicker’i de IR ölçmelerdeki kararsızlığı artırır, fakat Johnson gürültüsü ve hücre

kararsızlıklarına göre önemsizdir.

23

Çeşitli UV ve görünür ışık fotometreler ve spektrofotometreler arasında farklı dav-ranışlar görülür. En iyi kaliteli cihazlardaki sınırlayıcı rasgele hata kaynağı hücre

durumundan gelen kararsızlıktır. Bu cihazlarda hücrelerin doldurulup boşaltılma işlemlerinin, hücreyi yerinden çıkarmadan yapılması hatayı azaltan önemli bir önlemdir; yine de, hücre kararsızlığı bu cihazların performansını sınırlar.

Absorbsiyon Ölçmelerine Slit Genişliğinin Etkisi

Bir spektrofotometrenin birbirini takip eden absorbsiyon bantlarını ayırma yeteneği kullanılan slit genişliğine bağlıdır. Karmaşık bir spektrumda detayları görebilmek için dar slitler gerekir. Şekil-7'de geniş slit kullanılması halinde spektral detayların

nasıl kaybolduğu görülmektedir. Bu örnekte didmiyum camının spektrumu ince-lenmiştir; slit ayarları 0.5, 9 ve 20 nm genişlikte bandlar verecek şekilde değişti-rilmiştir.

Paraseodyum klorür çözeltisinin 1.0, 0.5 ve 0.1 mm slit açıklıklarında çizilen spektrumları Şekil-8'da verilmiştir. Burada pik absorbans değerlerinin, slit genişli-ğinin artmasına parelel olarak yükseldiği görülmektedir. Slit açıklığının 0.14 mm

den daha küçük olması hallerinde, absorbansın slit genişliğine bağlı olmadığı da deneylerle saptanmıştır.

350 450 550Dalga boyu, nm

350 450 550Dalga boyu, nm

350 450 550Dalga boyu, nm

Geç

irgen

lik, %

band genişliği 0.5 nm band genişliği 9 nm band genişliği 20 nm100

80

60

40

20

0

Şekil-7: Spektral detaylara band genişliğinin etkisi; örnek didmiyum camıdır

24

Abs

orb

an

s

bant genişliği = 0.34 nmslit genişliği = 0.1 mm

bant genişliği = 1.7 nmslit genişliği = 0.5 mm

bant genişliği = 3.4 nmslit genişliği = 1.0 mm

http://chem.ncue.edu.tw/liumy/contents/Ch13_2007.ppt

Dalga boyu, nm Dalga boyu, nmDalga boyu, nm

pik yüks. 53.1

pik yüks. 63.4pik yüks. 67.1

pik yüks.27.2

pik yüks.27.1

pik yüks.23.4

pik yüks.22.0

pik yüks.22.2

pik yüks.15.9

Şekil-8: Slit genişliği ve band genişliğinin pik yüksekliğine etkisi

Şekil-7'nin dikkatle incelenmesi, burada da benzer bir etkinin olduğunu gösterir.

Değişik slit genişliklerinde, iki spektrum takımında da (Şekil-7 ve 8) her bir pikin altında kalan alanın aynı olduğu, sadece slit genişliğine göre piklerin yayvan veya dik bir şekilde bulunduğu görülmektedir.

Bu açıklamalara göre, dar absorbsiyon bandlarının gerekli olduğu kantitatif ölçme-lerde küçük slit açıklıklarıyla çalışılmalıdır. Slit açıklığı, pik yüksekliği sabit kalın-caya kadar yapılan slit ayarı değişikliği ile saptanır. Slitin gereğinden fazla daral-

tılması, spektrofotometrenin bandları ayırma gücünü azaltır.

25

Bir Spektrofotometrenin Uç Dalga Boylarındaki Ölçümle-rine Saçılmış Işının Etkisi

Saçılmış ışın da Beer Kanununda enstrumental sapmaya neden olur. Ölçmelerin, bir cihazın alt ve üst dalga boyu limitlerine yakın dalga boylarında (uç dalga boyla-rı) yapılması halinde, başıboş ışının etkisi daha da önemli bir duruma gelir ve

yanlış absorbsiyon pikleri oluşur. Örneğin, cam optikli, tungsten kaynaklı, ve fotosell hücreli görünür ışıkta çalışan bir spektrofotometrede 380 nm’nin altındaki dalga boylarında pencereler, hücreler, ve prizma ışın absorblamaya başlar, böy-

lece transdusere giden ışının enerjisi zayıflar. Kaynak çıkışı düşer ve fotoelektrik sistemin hassasiyeti azalır; 500-650 nm arasındaki bölgede %100 T ayarı için gerekli ışın gücü %1- 2 kadar azalır.

Abs

orba

ns

B: UV-Göünür spektrofotometreA: Göünür spektrofotometre

htt

p:/

/ch

em

.ncu

e.ed

u.t

w/l

ium

y/co

nte

nts

/Ch

13

_2

00

7.p

pt

Dalga boyu, nm

Şekil-9: Ceryum(4)ün; A cam optikli, b kuvartz optikli spektrofotometreler ile alın-mış spektraları; A’daki hatalı pik uzun dalga boylarındaki başıboş ışının geçme-

sinden oluşur

26

Görünür bölgenin uç dalga boylarında elde edilen hatalı piklere bir örnek Şekil-9'da verilmiştir. B eğrisi ceryum(4) çözeltisinin 200-700 nm aralığında hassas bir

ultraviole-görünür spektrofotometrede alınmış spektrumudur. A eğrisi aynı çözel-tinin daha basit bir görünür spektrofotometredeki eğrisidir. A eğrisinde görülen pik maksimumu, cihazın 400 nm'den büyük dalga boylarındaki başıboş ışını algıla-

masından oluşmuştur; bunlar seryum(4) iyonları tarafından absorblanmamışlardır.

Aynı etki ultraviyole-görünür ışık spektrofotometrelerde 200 nm'nin altındaki dalga boylarında ölçme yapıldığında görülür.

Yararlanılan Kaynaklar

Principles of Instrumental Analysis, D.A.Skoog, D.M. West, II. Ed. 1981