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A COSA SERVE il CLONAGGIO del DNA??A COSA SERVE il CLONAGGIO del DNA??CREARE ‘COPIE IDENTICHE’ (= CLONI) DI UN

FRAMMENTO DI DNA

DIFFERENZE con la PCR:

• è una reazione in vivo

• sfrutta l’apparato di replicazione del DNA della cellula ospite (batteri)

• è un processo più accurato

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?

PREMESSE:

1) I BATTERI→ CELLULE PROCARIOTICHE:

assenza nucleo

singola molecola circolare di DNA

possono acquisire “facilmente” piccole molecole di DNAesogeno

2) I VETTORI

piccole molecole circolari di DNA che portano pochigeni

possono “facilmente” essere acquisiti dalle cellulebatteriche

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?PREMESSE:

3) GLI ENZIMI DIRESTRIZIONE

Estremità piatte

Estremità coesive

ENDONUCLEASI che tagliano ilDNA in corrispondenza dispecifiche sequenze di basi

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?1. IL DNA DA CLONARE VIENE

TAGLIATO CON ENZIMI DIRESTRIZIONE

4. IL VETTORE RICOMBINATEVIENE INSERITO IN UNACELLULA BATTERICA E AL SUOINTERNO SI DUPLICA(TRASFORMAZIONE)

2. INSERITO IN UN VETTORETAGLIATO CON GLISTESSI ENZIMI

3. LIGASI

ENZIMA di RESTRIZIONE

PLASMIDE

LIGASI

PLASMIDE RICOMBINANTE

CELLULA BATTERICA

Le FASI deL CLONAGGIOLe FASI deL CLONAGGIO

1. Preparazione del terreno di coltura e delle piastre di crescita

2. Preparazione del DNA da clonare

→ purificazione

→ creazione delle estremità coesiva

3. Inserzione del DNA da clonare in un vettore

4. Inserzione del vettore nell’ospite → TRASFORMAZIONE

5. Piastramento delle cellule

6. Crescita

7. Recupero dei CLONI

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PIASTRA DI CRESCITA TRASFORMAZIONE DI CELLULE BATTERICHE

1. DNA NUDO E VETTORI DI CLONAGGIO

2. CELLULE “COMPETENTI”

3. VALUTAZIONE DEL PROCESSO DITRASFORMAZIONE (resistenza antibiotico)

TRASFORMAZIONE E CELLULE COMPETENTITRASFORMAZIONE E CELLULE COMPETENTI

La trasformazione batterica è una tecnica dibiologia molecolare messa a punto perfacilitare l'introduzione di plasmidi neibatteri, processo che in natura avviene inmisura minima. Questo si ottienemodificando alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e delle membrane cellularicon l'impiego di sostanze chimiche (CaCl2),utilizzando rapidi sbalzi di temperatura o discariche elettriche ad alto voltaggio(elettroporazione); ne deriva unapermeabilizzazione, transitoria, delle celluleal DNA esogeno.

Tutti i metodi chimici si basanosull’osservazione che batteri trattaticon soluzioni di ioni bivalentilasciano entrare DNA “nudo” in modopiù efficiente. Si ipotizza chel’aggiunta di ioni bivalenti (Ca++),maschera le cariche negative del DNAfavorendone l’ingresso nella cellula(E. coli).

TRASFORMAZIONE CHIMICA (CaCl2)TRASFORMAZIONE CHIMICA (CaCl2)

La presenza di un campo elettricodestabilizza le membrane di E. coli edinduce la formazione di pori transientidel diametro di alcuni nanometri. Lemolecole di DNA passano attraversoquesti pori applicando impulsi divoltaggio elevato.

ELETTROPORAZIONEELETTROPORAZIONEGHIACCIO

37 - 45 °C

Formazione di elettropori

GENE GUN

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PROBLEMATICHE RELATIVE AI VETTORIPROBLEMATICHE RELATIVE AI VETTORI

PUO’ SUCCEDERE CHE…

1) La cellula non acquisisce il VETTORE e quindi neanche il DNA da clonare:TRASFORMAZIONE FALLITA

2) Il vettore si richiude su se stesso senza acquisire il DNA da clonare: la cellulaingloba il vettore richiuso PRIVO del DNA da clonare

VETTORI DI CLONAGGIOLa grande maggioranza degli esperimenti diclonaggio utilizza il batterio E. coli per lapropagazione dei frammenti di DNA clonati(OSPITE).

VANTAGGI di E. coli:1. Facile da coltivare in laboratorio2. La sua genetica è ben conosciuta3. Il suo genoma è interamente mappato e

sequenziato

VETTORI DI CLONAGGIOSequenza di DNA capace di replicarsi in manieraautonoma che può essere utilizzata per trasferireframmenti di DNA esogeno. Quelli più utilizzatisono basati su DNA di plasmidi o sul DNA delbatteriofago lambda.

Vettori di clonaggio: utilizzato per amplificare, inun sistema in vivo, un frammento di DNA.

Vettori di espressione: utilizzato per esprimere ungene contenuto nel frammento di DNA clonato.

VETTORI DI CLONAGGIOCaratteristiche:—Replicazione autonoma—Caratteristica selezionabile che permette didistinguere cellule trasformate da quelle nontrasformate—Presenza di almeno un sito di restrizione

PLASMIDISono elementi extra-cromosomiali naturali chevengono ereditati in maniera stabile da unagenerazione all’altra conservando le lorocaratteristiche individuali.

•Plasmidi rilassati (10-200) utilizzano, per lareplicazione, proteine dell’ospite

•Plasmidi stringenti (1-2) sintetizzano fattoriproteici necessari per la replicazione

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PLASMIDI MODIFICATI:

pBR322Rappresenta il primo vettore (4.363 bp) costruitoutilizzando componenti di plasmidi naturali:

•Origine di replicazione•Resistenza ad antibiotici•Siti di clonaggio

pBR322

pBR322

INATTIVAZIONE INSERZIONALE

Resistenza agli antibiotici:

Solo i batteri che hanno integrato un plasmide contenente il gene checodifica per la resistenza alla Kanamicina possono crescere su

terreno nutritivo in presenza di antibiotico

PLASMIDI pUCAlto numero di copie:

mutazione in ori produce 500-600 copie

MCS: multiple cloning site(polylinker)

MCS

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OPERONE lac di E. coli:l’esempio classico

PLASMIDI pUCAlto numero di copie:

mutazione in ori produce 500-600 copie

MCS: multiple cloning site(polylinker)

MCS

PLASMIDI pUCScreening blu-bianco

PLASMIDI pUCScreening blu-bianco

α-complementazione

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PLASMIDI pUC PLASMIDI pUC

ALTRI TIPI DI VETTORI (15-20 Kb) = vettori ottenuti

genoma delbatteriofago λ.

Kb) = plasmidi che contengono isiti cos di λ utili per l’impacchettamento di DNA inun fago λ

=plasmidi che contengono l’origine direplicazione del fago f1.

VETTORI λ COSMIDI