clonaggio pcr amplificazione dna. vettori di clonaggio plasmidi virus trasposoni minicromosomi...
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•Clonaggio
•PCR
Amplificazione DNA
Vettori di clonaggio
Plasmidi
Virus
Trasposoni
Minicromosomi artificiali
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
sito di restrizione
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Uso degli enzimi di restrizione
•Clonaggio
•Mappa di restrizione
•Polimorfismi di restrizione (RFLP)
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Scelta e preparazione del vettore
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi
Analisi dei prodotti
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Vettori plasmidici
1.Origine di replicazione
2.Marcatore di selezione
3.Sito di restrizione unico
Elementi di un vettore plasmidico
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Scelta e preparazione del vettore
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi
Analisi dei prodotti
Preparazione del DNA da clonare
Frammento di DNA genomicoche può contenere regionitrascritte o non trascritte
cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’mRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta
frammentato conenzimi di restriz.
frammentazionemeccanica
DNA specifico
Collezione DNA(banca, genoteca)
Digestione clone già esistente
PCR
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
PREPARAZIONE del cDNA
RNA
DNA
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Scelta e preparazione del vettore
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi
Analisi dei prodotti
Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolaremediante ligasi di estremità coesive
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
GCTTAA
AATTC G
EcoRI
GAATTC
CTTA
AGGAATT
CCTT
AAG
DNA ligasi
AATTC G
GCTTAA
EcoRI
VETTORE
INSERTO
Unione, mediante ligasi,di estremità coesive create da un enzima di restrizione
GAATTCCTTAAG
G CTTAA
AATTC G
EcoRI
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
DNA ligasi
GAATTCCTTAAGVETTORE
G CTTAA
AATTC G INSERTO
•strategie
•controlli
Reazione di ligasi
Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolaremediante ligasi di estremità coesive
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
GCTTAA
AATTC G
EcoRI
GAATTC
CTTA
AGGAATT
CCTT
AAG
DNA ligasi
AATTC G
GCTTAA
EcoRI
VETTORE
INSERTO
trattamento del vettore con fosfatasi
GCTTAAp
pAATTC G
G A
ATTC
CTTA
ApGG
pAATT
C
CTT
AA G
DNA ligasi
pAATTC G
GCTTAAp
EcoRI
GCTTAA
AATTC G
fosfatasi
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
Clonaggio con singola digestione
Clonaggio con doppia digestione
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
AAGCTTTTCGAA
GCTTAA
AGCTT A
EcoRI
AAGCTT
TTCGAAGAATT
CCTT
AAG
DNA ligasi
AATTC G
ATTCGA
EcoRI HindIII
AAGCTTTTCGAA
HindIII
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Scelta e preparazione del vettore
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi
Analisi dei prodotti
Introduzione del DNA nella cellula ospite
Trasformazione: CaCl2
Impacchettamento e infezione fagica
In E.coli Elettroporazione
In cellule dieucarioti superiori
Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato
Liposomi
Elettroporazione
Microiniezione
DNA gun
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Scelta e preparazione del vettore
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi
Analisi dei prodotti
Vettori plasmidici
Strategie di selezione nel clonaggio
AMPICILLINA
AMPICILLINA
resistenza
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Scelta e preparazione del vettore
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi
Analisi dei prodotti
1200 bp
SacI
EcoRI
1.lisi cellulare
2.deproteinizzazione
3.concentrazione
Isolamento acidi nucleici
•Spettrofotometro (quantitativa)
•Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)
Analisi acidi nucleici
Spettro di assorbimento del DNA
220 240 260 280 300 320
0.5
1.0
1.5
lunghezza d’onda (nm)
Assorbanza(OD)
1 OD260=50g/ml
OD260/OD280=1,8-2,0
Elettroforesi di acidi nucleici
•Gel di agarosio
•Gel di acrilammide
Elettroforesi su gel di agarosio
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Migrazione del DNA su gel
Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità
inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del
numero di paia di basi.
Fattori che influenzano la migrazione
•Peso molecolare
•Concentrazione di agarosio
•Conformazione DNA
•Voltaggio applicato
•Intercalanti
•Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare
HindIII
Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting)
•Southern (blot)
•Northern (blot)
•Western (blot)
BLOTTING (TRASFERIMENTO)
Molecole trasferite
Sonda Gel
Southern DNADNA o RNA
Agarosio o acrilammide
Northern RNADNA o RNA
Agarosio o acrilammide
Western Proteine Anticorpi Acrilammide
Metodi di trasferimento
•Capillare
•Elettroblot
carta 3MM
membrana nylon
gel
supporto
}
carta 3MM
tampone
vaschetta
Assemblaggio del blot capillare
Fattori che influenzano l’ibridazione
•Temperatura
•Forza ionica
•pH