ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y CLASIFICACIÓN DE

LAS ENZIMAS

4.1. CONCEPTOS GENERALES

Toda reacción química, biológica o inorgá­nica, es un proceso en el que una o varias moléculas interactúan entre sí para transfor­marse en otras moléculas siguiendo una dirección determinada por leyes fisicoquí­micas (termodinámicas) hasta llegar a un es­tado de equilibrio:

A + B , ) C + D

Existen sustancias llamadas catalizadores que tienen la capacidad de acelerar las reac­ciones químicas sin alterarse al final de éstas y sin modificar el equilibrio químico; sólo acortan el tiempo en que se alcanza dicho equilibrio.

Los catalizadores se dividen en dos gru­pos: orgánicos e inorgánicos. Dentro de los primeros tenemos las enzimas y en el segun­do los iones H+, OH " o metálicos.

Las enzimas son moléculas producidas por las células de los organismos vivos con la función específica de catalizar reacciones químicas, las que sin ellas, ocurrirían muy lentamente.

Hasta hace pocos años se consideraba que todas las enzimas eran proteínas. Sin embar­

go, recientes investigaciones realizadas por Cech y colaboradores (Cech, T.R., Science, 236, 1532-39 (1987) han demostrado que moléculas de RNA pueden actuar como en­zimas con una elevada actividad catalítica. Se ha comprobado experimentalmente que la molécula de RNA L-19 derivada de un in-trón de un precursor de una RNAr de un pro-tozoario ciliado actúa como ribonucleasa y como RNA polimerasa. Esta enzima de RNA o RNA enzimático o ribozima muestra las mismas propiedades cinéticas que las otras enzimas tradicionales, un alto grado de especificidad y susceptibilidad a la inhibi­ción competitiva. Este descubrimiento pue­de tener importantes implicaciones sobre la evolución de las moléculas y puede contri­buir a aclarar el mecanismo de acción de los catalizadores.

La vida y el crecimiento celular requieren la continua síntesis de macromoléculas aco­plada a procesos proveedores de energía. El acoplamiento controlado de las reacciones químicas mediante la acción de enzimas es propiedad única de las células vivas. Entre las miles de sustancias presentes en una cé­lula, las enzimas constituyen la parte más importante de las proteínas celulares. Esen­cialmente, todas las reacciones bioquímicas son catalizadas por enzimas.

cia emplean coenzimas del tipo del NAD+ , NADP+, FAD, ácido lipoico y CoQ como aceptores de hidrógeno; otros aceptores in­cluyen al grupo hemo y al oxígeno molecular. En este grupo se incluyen deshidrogenasas y oxidasas de gran importancia en los proce­sos oxidativos de la respiración celular. La catalasa es única en el sentido de que el pe­róxido de hidrógeno (H2O2) sirve tanto co­mo donador y como aceptor. La catalasa funciona en la célula eliminando el peróxido de hidrógeno que es tóxico.

2.- Transferasas.- Muchos pasos impor­tantes del metabolismo requieren la transfe­rencia de una molécula a otra de grupos ámino, carboxilo, carbonilo, metilo, ácido, glucosilo, o fosforilo. Las coenzimas utili­zadas son el tetrahidrofolato (FH4) coenzima A (CoA-SH) y fosfato de piridoxal (PPal). Las aminotansferasas (transaminasas) transfieren grupos amino de un aminoácido a un cetoá-cido aceptor, dando lugar a la formación de un nuevo aminoácido y un nuevo cetoácido. Las cinasas catalizan la transferencia de un fosfato del ATP a grupos aceptores, alcohol o ámino, como ejemplo tenemos la glucocina-sa que forma glucosa-fosfato. La síntesis de glucógeno depende de glucosiltransferasas.

3.- Hidrolasas.- Catalizan el rompimiento de una molécula, con participación de agua, entre enlaces carbono y cualquier otro áto­mo. Este grupo de enzimas se puede conside­rar como una clase especial de transferasas en las que el grupo donador se transfiere al agua. La rotura del enlace peptídico es buen ejemplo de esta reacción llevada a cabo por peptidasas. Nombres triviales de algunas peptidasas incluyen pepsina, tripsina, qui-motripsina y dipeptidasa. Otras subclases son las esteraseis como la lipasa, colineste-rasa, y colesterol esterasa. Las fosfatasas eliminan grupos fosfatos, como la glucosa-6-fosfatasa y las fosfatasas acida y alcalina.

4.- liosas.- Catalizan el rompimiento no hidrolítico entre carbono-carbono, carbono-azufre y algunas carbono-hidrógeno. A este

grupo pertenecen las descarboxilasas. Aldehi­do nasas como la aldolasa, fumara y otras.

5.- Isomerasas.- Incluye a todas las enzi­mas que catalizan la interconversión de todo tipo de isómeros ópticos, geométricos, de posición y reacciones de oxidorreducción intramolecular. A este grupo pertenecen las racémosos, epimerasas y mutasas.

6.- Ligasas.- Catalizan la formación de enlaces entre carbono-oxígeno, nitrógeno y otros átomos a expensas de un enlace fosfa­to de alta energía del ATP. El término de sintetasas se reserva para este grupo particu­lar de enzimas. La piruvato carboxilasa es un buen ejemplo de una ligasa. También la acetil-CoA sintetasa, la aminoacil-RNAt sintetasa, enzimas activadoras de aminoáci­dos en la síntesis de proteínas.

En la Tabla 4.4 se describen algunas enzi­mas y su clasificación de acuerdo a la comi­sión de enzimas.

4.4 LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE LAS ENZIMAS

Las enzimas dentro de un organismo se en­cuentran distribuidas en los diferentes órga­nos y tejidos donde realizan su función específica. Dentro de una célula, algunas en­zimas se encuentran compartamentalizadas y ordenadas; ejemplo: en las células hepáti­cas, las enzimas de la glicólisis están locali­zadas en el citoplasma, en tanto que las enzimas del ciclo de Krebs en las mitocon-drias. Dentro de la mitocondria, las enzimas del ciclo del ácido cítrico se encuentran dis­puestas en forma secuencial, lo cual da al proceso ergopoyético de la célula la máxima eficacia.

4.4.1. Nivel celular. Sistema microsomal

La localización de una enzima particular en un tejido o célula es el fundamento de una

Tabla 4.4 Clasificación Internacional de las enzimas

Número Nombre sistemático Nombre trivial

1. Oxidorreductasas 1.1 Grupos CH-OH 1.1.1 NAD+ o NADP+ aceptor 1.1.1.1. Alcohol NAD+ oxidorreductasa: 1.1.3. O2 como aceptor 1.1.3.4. p-D-glucosa: oxígeno Oxidorreductasa

(FAD)

1.2. Grupos C=0 1.2.1.12. Gliceraldehído 3-P:NAD*

Oxidorreductasa (NAD+) 1.2.3.2. Xantina:oxígeno oxidorreductasa. 1.2.4.1. Piruvato: lipoato Oxidoreductasa

1.3. Grupos CH-CH 1.3.1.1. 4,5-Dihidrouracilo: NAD+ oxidorreductasa

1.4 Grupos CH-NH2 1.4.1.2 L-glutamato: NAD+ oxidorreductasa

1.5 Grupos C-NH-1.5.1.5 5,10-Metilenotetrahidrofolato:

NADP+ oxidorreductasa

1.6. Sobre NADH o NADPH como donador 1.6.2.1. NADH: citocromo C oxidorreductasa

1.9. Sobre grupos hemo donadores. 1.9.3.1. Citocromo C: oxígeno oxidorreductasa

1.11. Con H2O2 como aceptor 1.11.1.6 Peróxido de hidrógeno: H2O2

oxidorreductosa 2. Transferasas 2.1 Grupos de 1 carbono 2.1.1 metil transferasas 2.1.1.2 S-adenosil-metionina: guanidino-acetato

N-metil Transferasa

2.1.2 Hidroximetil y fomil transferasa 2.1.2.1 L-serina: FH4 5,10-hidroximetil trasferasa

Deshidrogenasa Alcohólica

Glucosa oxidasa

Triosa-P-deshidrogenasa

Xantino oxidasa Piruvato deshidrogenasa

Dihidrouracilo deshidrogenasa

Glutamato deshidrogenasa

Metilen-FH4-deshidrogenasa

Citocromo C reductasa

Citocromo oxidasa

Catalasa

Guanidometil transferasa

Serina hidroximetil transferasa

CONTINUA TABLA 4.4

Número

2.1.3 2.1.3.2

2.2

2.2.1.1

2.2.1.2

2.6.1 2.6.1.1 2.6.1.2

2.7.1 2.7.1.2 2.7.7.10

3. 3.1 3.1.1 3.1.1.7 3.1.2 3.1.2.1 3.1.3 3.1.3.9

3.2.1 3.2.1.1

3.4.4 3.4.4.1

3.5.1.5

3.6.1.3

4 4.1.1 4.1.1.1 4.1.2 4.1.2.7

Nombre sistemático

Carboxil o carbamoil transíerasas Carbamoil-P: L-aspartato transferasa

Transferencia de grupos aldehídicos o cetónicos

Sedoheptulosa 7-P: gliceraldehido glicolaldehído transferasa

Sedoheptulosa: 7-P: gliceraldehido Dihidroxiacetona transferasa

Aminotransferasas L-aspartato: 2-oxoglutarato aminotransferasa L-alanina: 2-oxoglutarato aminotransferasa

Fosfotransferasas ATP: glucosa 6-P transferasa UTP: galactosa 1-P uridil transferasa

Hidrolasas Enlace éster Carboxílico Acetilcolina acetil hidrolasa Tióester Acetil CoA hidrolasa Ester fosfórico Glucosa 6-P fosfohidrolasa

Glucósido hidrolasas a l -4 gluca-4glucano hidrolasa

Péptido hidrolasas

Urea amidohidrolasa

ATPfoshidrolasa

Liasas Carboxiliasas 2-oxo-ácido carboxil iasa Aldehidoliasas Cetona 1-Paldehidoliasa

Nombre trivial

Aspartato transcarbamilasa

Transcetolasa

Transaldolasa

Transaminasa glutámico oxalacética Transaminasa glutámico pirúvica

Glucocinasa UDP-galactosa pirofosforilasa

Colinesterasa

Tiolasa

Glucosa 6-fosfatasa

a-amilasa

Pepsina

Ureasa

ATPasa

Piruvato descarboxilasa

Aldolasa

CONTINUA TABLA 4.4

Número Nombre sistemático Nombre trivial

4.1.3 Cetoacidoliasas 4.1.3.7 Citrato oxalacetato liasa

4.2.1 Hidroliasas 4.2.1.2 L-malatohidroliasa

5 Isomerasas 5.1 Racemasas y epimerasas 5.1.1.1 Alanina recemasa 5.1.3.1 D-ribulosa 5-P, 3 epimerasa

5.2 Cis-trans isomerasas 5.2.1.1 Malea to cis-trans isomerasa

5.3.1 Aldo-ceto isomerasas 5.3.1.1 D-gliceraldehído 3-P cetol isomerasas

6 Ligasas 6.1.1 Aminoácido-RNA 6.1.1.1 L-tirosina: RNAt ligasa(AMP)

6.2.1 Acido tiol 6.2.1.1 Acetato: CoA ligasa (AMP)

6.3 Enlaces C-N 6.3.4.2 UTP: amonio ligasa (ADP)

6.4 Enlaces C-C 6.4.1 Piruvato: C 0 2 ligasa (ADP)

Citrato sintetasa

Fumarasa

Alanina racemasa Epimerasa

Maleato isomerasa

Triosa-P isomerasa

Tirosil-RNAt sintetasa

Acetil CoA sintetasa

CTP sintetasa

Piruvato carboxilasa

rama de la histoquímica denominada his-toenzimología. La distribución de las enzimas en los organelos subcelulares se estudian fraccionando en ultracentrífuga homogenei-zados de células. En células eucarióticas las enzimas se distribuyen en la membrana ce­lular, mitocondrias (matriz y espacios inter-membranas) lisosomas, vacuolas, retículo endoplásmico, etc. (tabla 4.5). En la mem­brana celular se encuentran enzimas que participan en el transporte de metabolitos y

las que regulan la acción de hormonas o neurotransmisores sobre los receptores membranales. En tanto que muchas enzimas se encuentran solubles en el citoplasma, otras se encuentran fijas ordenadamente en alguna membrana particular y funcionan en forma secuencial, como es el caso de las en­zimas oxidativas de la mitocondria. Gene­ralmente las vías anabólicas y catabólicas se localizan en organelos diferentes a fin de maximizar la economía celular.

Tabla 4.5 Localización intracelular de las principales enzimas y rutas metabólicas

Citoplasma Glucólisis: ruta de las hexosa monofostato; glucogénesis y glucogenóli-sis: síntesis de ácidos grasos; catabolismo de purinas y pirimidinas; pep-tidasas; aminotransferasas; aminoacilsintetasas

Mitocondria Ciclo de los ácidos tricarboxílicos; oxidación de ácidos grasos; oxida­ción de aminoácidos; alargamiento de ácidos grasos; síntesis de la urea; transporte electrónico y fosforilación oxidativa acoplada.

Lisosomas Lisozima; fosfaíasa acida; hidrolasas, incluyendo proteasas, nucleasas, glucosidasas, arilsulfatasas, lipasas, fosfolipasas y fosfatasas.

Retículo NADH y NADPH citocromo c reductasas; oxidasas de función mixta endoplasmático relacionadas con el citocromo b, y el citocromo P450; glucosa 6-fosfata-(microsomas) sa; nucleósido difosfatasa; esterasa, P-glucuronidasa, y glucuroniltrans-

ferasa; rutas de síntesis de proteínas; síntesis de fosfoglicéridos y triacilgliceroles, síntesis y reducción de esteroides

Golgi Galactosil y glucosiltransferasa; condroitina sulfotransferasa; 5-nucleo-tidasa; NADH-citocromo c reductasa, glucosa 6-fosfatasa

Peroxisomas Urato oxidasa; D-aminoácido oxidasa; a-hidroxiácido oxidasa; catalasa; oxidación de ácidos grasos de cadena larga

Núcleo Rutas de biosíntesis de DNA y RNA

a La NADH-citocromo b, reductasa se ha encontrado en el retículo endoplasmático, Golgi, membrana mitocondrial externa y en la envoltura nuclear. Varias de las enzimas señaladas en la tabla son comunes a uno o más organelos membranosos.

4.4.2. A nivel de organismo

La localización y distribución de enzimas que funcionan específicamente en determi­nados órganos es el fundamento de la enzi-mología clínica.

Dos subclases de aminotransferasas se lo­calizan en órganos distintos; la aspartato aminotransferas (antes transaminasa glutá-mico oxalacética, TGO) se localiza princi­pa lmente en miocard io y la a lanina aminotransferasa (antes transaminasa glutá-

mico pirúvica, TGP) se localiza en hígado. La creatina fosfocinasa se localiza en mús­culo estriado (esquelético y miocardio). La deshidrogenasa láctica posee varias isoenzi-mas, algunas de ellas específicas de deter­minado órgano; la LDH-1 (H4) se localiza en miocardio y la LDH-5 (M4) se localiza en hígado y músculo esquelético; otra variante isoenzimática la LDH-X se localiza en testí­culo. La amilasa y lipasa pancreáticas ayu­dan al diagnóstico de pancreatitis aguda cuando se elevan en suero (ver más adelan-

te). Las fosfatasas, con su localización parti­cular, la fosfatasa acida en próstata y la fos-fatasa alcalina en hígado y hueso, determinan la presencia de carcinoma pros­tético y óseo respectivamente, cuando se elevan en suero.

4.5 MECANISMO DE ACCIÓN

El mecanismo de acción de las enzimas se estudiará primero desde el punto de vista ge­neral de la catálisis y luego de cada sistema enzimático en particular.

4.5.1. Aspectos termodinámicas. Energía de activación

Conviene analizar previamente los concep­tos termodinámicos, que determinan el sen­tido de una reacción y su equilibrio, en virtud de que las enzimas sólo aceleran reac­ciones espontáneas o metaestables, termodi-námicamente posibles, las cuales pueden ocurrir aún en ausencia de enzimas pero muy lentamente. Las enzimas no catalizan reacciones que jamás sucederían espontá­neamente, es decir aquellas termodinámica-mente imposibles.

La realización y extensión de las reaccio­nes bioquímicas están controladas por el flu­jo energético. El estudio de esto, es el campo de las termodinámica, rama de la fisicoquí­mica, cuyos conceptos principales se esta­blecen en dos p r i n c i p i o s de la termodinámica llamados primero y segun­do, los cuales permiten comprender el senti­do de las reacciones químicas, si una reacción procediera de izquierda a derecha, si es reversible, y si hay que suministrarle energía para que ocurra, o si la libera y en qué magnitud.

La aplicación del primer principio de la termodinámica (principio de conservación de la energía) a las reacciones químicas ha

dado origen a la termoquímica que estudia la cantidad de calor que se absorbe o se des­prende en una reacción y permite calcular la energía libre (F) y la entalpia o contenido calórico (H). Si en la reacción se absorbe ca­lor, los productos tendrán más energía que los reactantes; los cambios de energía libre (AF) y de entalpia (AH) son positivos y se dice que la reacción es endergónica (o endo­térmica si es en forma de calor). En las reac­ciones en que se desprende calor, AF y AH son negativos y la reacción es exotérmica {exergónica en general).

AF = LFf productos - LFf reactantes

AH - LHf productos - LHf reactantes

Una reacción que es exotérmica en senti­do directo, será endotérmica en sentido in­verso. Se habla así de calor de formación y calor de reacción, ejemplo: en la fotosínte­sis, la energía solar permite la síntesis de glucosa (Ce H12 0¿) y es una reacción en­dergónica; la degradación metabólica de la glucosa por la célula, con formación de CO2 y H20 es una reacción exergónica, de la misma magnitud.

Energía

C6H12°6 + °2 6C02 + ÓHjO

Energía

El segundo principio de la termodinámica determina la dirección de una reacción quí­mica. Este principio establece que los proce­sos espontáneos tienden al equilibrio; esto determina que un cuerpo caliente ceda calor a otro más frío y no al revés, que el agua corra por un declive y no suba por una pendiente.

El cambio de energía libre (AF) o energía útil se correlaciona con la constante de equi­librio (Keq), la cual a su vez se rige por la ley de acción de masas. Para cualquier reac-

ción química: la ecuación que determina el cambio de energía libre respecto a la con­centración de reactantes y productos es la si­guiente:

Donde AF° es el cambio de energía libre en condiciones estándar: este valor es equi­valente al pKa de la ecuación de Henderson-Hasselbach (ver unidad 2). En el equilibrio, no hay cambio de energía libre y AF=0, por lo tanto:

AF° = -RT lnKeq

puestos orgánicos inflamables expuestos al aire, como la gasolina, que necesitan una chispa para su ignición y su transformación en CO2 y H2O. Esa barrera termodinámica es la energía necesaria para alcanzar el esta­do de transición como energía de activación (fig.4.1).

La energía de activación es la energía ne­cesaria para pasar las moléculas reaccionan­tes al estado de transición y que de ahí proceda la reacción. En ausencia de catali­zadores enzimáticos, muchas reacciones químicas proceden excesivamente lentas a la temperatura del organismo, no reaccionan con rapidez debido a que la energía cinética que poseen es insuficiente para superar esa barrera de energía. Al disminuir la energía de activación, las enzimas hacen que las re­acciones termodinámicamente posibles pro­cedan con rapidez en la célula pero no modifican la constante de equilibrio.

si AF° es negativo, el proceso se desarrollará espontáneamente, es decir es termodinámi­camente posible; si AF° es positivo, la reac­ción sólo transcurrirá si se le proporciona energía (tabla 4.6).

Existen sistemas de reacción que se pre­sentan en estado metaestable, es decir ter­m o d i n á m i c a m e n t e p o s i b l e ; pe ro n o espontáneo. Esto sucede con algunos com-

Tabla4.6 Relación entre Keq y AF° (a 25°C)

4.5.2. Cinética enzimática

Dado que las enzimas modifican la veloci­dad de las reacciones químicas, este capítulo tratará de los factores que inciden en la acti­vidad de una enzima. La cinética estudia la velocidad de cambio entre el estado inicial de reactantes y productos y su estado final. La velocidad cambia constantemente a me­dida que se aproxima al equilibrio (estado final) siendo cero en el equilibrio.

En un sentido cinético, los componentes iniciales del sistema enzimático (sustrato (S), cofactores y enzimas) se añaden a una serie de recipientes en un medio con fuerza iónica, temperatura y pH conocidos. La ve­locidad del cambio en la concentración del producto o del sustrato en función del tiem­po, expresa la velocidad de la reacción.

En todos los procesos enzimáticos, la ve­locidad de la reacción depende de la concen­tración de enzima y de su sustrato. Si se aumenta progresivamente la concentración

de enzima, manteniéndose constante (pero en exceso) la concentración del sustrato, se ob­tiene una relación directa y lineal (fig. 4.7).

A concentración fija de enzima y concen­traciones crecientes de sustrato se obtiene una segunda relación interesante. Al princi­pio, la velocidad de la reacción aumenta proporcionalmente a la concentración de sustrato; a este punto, se le designa como re­acción de primer orden en virtud de que la velocidad depende de la concentración del sustrato (S) elevada a la primera potencia. Después, la velocidad de la reacción decrece progresivamente hasta que permanece cons­tante (Vmax) aun con elevadas concentra­ciones de sustrato (cinética de orden cero); esto se explica porque la enzima se ha "satu­rado" con sustrato (fig. 4.8).

En otras palabras, la enzima debe tener un número finito de sitios catalíticos para el sustrato y cuando están todos ocupados ya

no puede aumentar la velocidad de la reac­ción.

Modelo de Michaelis-Menten. Para expli­car matemáticamente este comportamiento Michaelis y Menten invocaron la existencia de un complejo intermedio enzima-sustrato:

E + S K

' [ES] • E + P K, K„

La formación del complejo enzima-sus­trato [ES] se dedujo de las siguientes obser­vaciones; a) fibrina tratada con tripsina y lavada posteriormente, seguía degradándo­se; b) la enzima sacarasa en presencia de sa­carosa resistía la desnaturalización térmica

comparada con la sacarasa sola. Por otro la­do, Keilin y Mann en 1937 comprobaron que la peroxidasa presenta un desplaza­miento de las bandas de absorción cuando se adiciona H2O2:

Ki Peroxidasa + H J O J ;==? [Peroxidasa - HJOJ]

En presencia de un donador de hidróge­nos (colorante oxidable) tiene lugar una re­acción posterior:

[Peroxidasa - H 2 0 2 ] + R-H2 K3 Pe­

roxidasa + 2H 2 0 + R

La observación en el espectroscopio de estas dos reacciones resultó una prueba con­vincente de que es correcta la hipótesis de la formación del complejo [ES].

La ecuación matemática que define la re­acción enzimática es una hipérbola que reci-b e e l n o m b r e d e e c u a c i ó n d e Michaelis-Menten:

_ Vmax [S] Km + [S]

El valor de Km (constante de Michaelis) que se expresa en moles/litro, resulta de las constantes de velocidad.

Km- - ¿ - - I Al

En términos prácticos, la Km es un valor que indica la afinidad de la enzima por el sustrato. Cuanto más baja sea Km, mayor es la afinidad. Las dos constantes de la ecua­ción de Michaelis Menten, Vmax y Km son únicas para cada enzima. Así, en este senci­llo modelo, la actividad de la enzima se pue­de separar en dos fases; fijación del sustrato seguida de su modificación química. Esta naturaleza bifásica se demuestra en el si­guiente ejemplo clínico: en una familia

aquejada de hiperuricemia y gota, un pa­ciente excretaba tres veces la cantidad nor­mal de ácido úrico por día y tenía también niveles elevados de fosforribosil pirofosfato (PRPP) en eritrocitos. Los ensayos indica­ron que la actividad PRPP sintetasa estaba aumentada tres veces; la Km de la enzima era normal pero la Vmax era tres veces ma­yor.

Nótese que si la velocidad (v) se hace igual a - Vmax, la Km se hace igual a [S] en

la ecuación de Michaelis-Menten, Por tanto, en una curva de saturación (fig. 4.8) el valor numérico de la Km puede deducirse en la gráfica en concentración de sustrato [S], cuando la velocidad es la mitad de la veloci­dad máxima.

Modelo de Lineweaver-Burk. Debido a que en la práctica la determinación de Km a partir de la curva de saturación de Michae­lis-Menten no es muy precisa, ya que la Vmax se hace asintótica, es necesario tomar el recíproco de la ecuación y transformarla en una línea recta:

i . Km 1 + 1 v Vmax [S ] Vmax

y = ax + b

La gráfica que se obtiene es la de Line­weaver-Burk o del doble recíproco (fig. 4.9), donde se puede calcular Km en la intersec­ción negativa de la abscisa.

Modelo de Eadie-Hofstee. Otra transfor­mación a la gráfica de Michaelis-Menten que permite calcular con mayor precisión la Km es la ecuación de Eadie-Hofstee:

V v Vmax

[S] ~~Km + Km

La gráfica obtenida se muestra en la fig. 4.10, donde la pendiente negativa es la inversa de Km.

4.5.2.1. Actividad enzimática

La actividad de una enzima se expresa habi-tualmente en términos de la cantidad de pro­ducto formado (o desaparición de sustrato) por cantidad determinada de enzima por unidad de tiempo. La unidad estándar de ac­tividad enzimática (U) es la cantidad de en­zima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto a 25 °C en condiciones óptimas de ensayo. La activi­dad específica se define como el número de unidades de enzima por miligramos de pro­teína (U/mg proteína). Sin embargo esto no indica si en la muestra la única proteína pre­sente es la enzima. Durante la purificación enzimática este valor va aumentando a me­dida que se van eliminando proteínas conta­minantes. El antiguo "número de recambio" recientemente sustituido por actividad mo­lecular o molar, se define como el número

4.1.1. Importancia de las enzimas

El estudio de las enzimas en medicina es ca­da vez más importante. Son múltiples las implicaciones que tienen las enzimas en el origen, diagnóstico, tratamiento y preven­ción de enfermedades. Muchas enfermeda­des se deben a la carencia o anormalidad en la síntesis de una determinada enzima (ga-lactosemia, fenilcetonuria, albinismo, pen-tosuria esencial y muchas otras que se revisarán más adelante). Estos errores están codificados en el genoma y se denominan: "errores innatos del metabolismo", "enfer­medades moleculares", "enfermedades he­reditarias" o "enfermedades bioquímicas". El diagnóstico de muchas enfermedades se puede'realizar con bastante precisión deter­minando la actividad de ciertas enzimas o isoenzimas que son indicadores de la des­trucción tisular de órganos específicos. Es­tas determinaciones son tan importantes que han dado lugar a una nueva especialidad: la enzimología clínica; que es el área de la me­dicina que utiliza las enzimas como auxilia­res diagnósticos.

Otras enfermedades se deben a la carencia de cofactores enzimáticos y la administra­ción de ellos produce la rápida curación de estas enfermedades carenciales, como suce­de con las vitaminas (procoenzimas) y algu­nos oligoelementos. En ocasiones son las propias enzimas las que se usan para el tra­tamiento de enfermedades, esta práctica se conoce como enzimoterapia. El empleo de enzimas proteolíticas para el tratamiento de hematomas y de enzimas digestivas en casos de dispepsia, son ejemplos del uso de enzi­mas como fármacos. El empleo de enzimas inmovilizadas es otra posibilidad de terapia cuando hay carencia de enzimas en un orga­nismo evitando así las reacciones de intole­rancia y asegurando la estabilidad y las condiciones óptimas para la actividad catalí­tica. Es indudable que la enzimoterapia tie­ne un futuro promisorio con las técnicas de

ingeniería genética que permiten introducir la información genética para la síntesis de la proteína ausente o defectuosa utilizando plásmidos o partículas viriformes.

Otra importante vinculación de las enzi­mas con la medicina, radica en el empleo ra­cional de fármacos. La mayor parte de los fármacos que se utilizan en el tratamiento de enfermedades tienen como mecanismo de ac­ción el modificar la actividad de una o varias enzimas, ya sea, actuando como inhibidor enzimático competitivo, no competitivo, acom-petitivo o mixto, secuestrando o liberando cofactores o induciendo la biosíntesis de al­gunas enzimas. La eficacia del tratamiento terapéutico y la magnitud de las reacciones indeseables (reacciones secundarias, contra­indicaciones, precauciones, interacciones farmacológicas), sólo se podrán lograr y prevenir en la medida que se conozca el me­canismo de acción de cada fármaco y las múltiples interacciones que pueden ocurrir con las enzimas.

4.1.2. Concepto de enzima, sustrato y producto

En una reacción enzimática se identifican tres componentes: la enzima (E) específica de la reacción, el sustrato (S) que es la molé­cula sobre la que actúa la enzima y el pro­ducto (P) molécula o moléculas resultantes de la acción de la enzima sobre el sustrato. Dado que muchas reacciones son reversi­bles, los productos de la reacción directa (que procede hacia la derecha) son los sus­tratos de la reacción inversa (que procede hacia la izquierda).

directa A+B . C+D

sustratos inversa productos

En reacciones secuenciales de una vía metabólica, el producto de una reacción ca-

de moles de sustrato transformado por un mol de enzima por minuto (mol/min/mol de enzima) (tabla 4.7). Debido a que muchas enzimas son oligoméricas, con un sitio cata­lítico en cada subunidad, la actividad molar se denomina actividad del centro catalítico: número de moles de sustrato por mol de su­bunidad activa o por sitio catalítico, por mi­nuto. La comisión de enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica ha propuesto una nueva unidad, el Katal (Kat) que se de­fine como la conversión de un mol de sus­trato por segundo; se puede expresar en milika tales (mKat) o microkatales (uKat).

Hasta que todos los laboratorios de análi­sis clínicos unan esfuerzos para estandarizar sus informes, es imperativo, que el médico se familiarice con las reglas locales en el ma­nejo de unidades de actividad enzimática.

4.5.3. Factores que afectan la actividad enzimática

La actividad enzimática es afectada por una serie de factores externos e internos que pueden ser físicos, químicos y biológicos: temperatura, pH, fuerza iónica, concentra­ción del sustrato, de la enzima, del producto e inhibidores. Estos efectos son tan impor­tantes in vivo como en condiciones de labo­ratorio; en el primer caso, debido a que la

Tabla 4.7 Actividad molecular de algunas enzimas

Enzima Actividad molar (moles de sustrato por mol de enzima

por minuto)

Anhidrasa carbónica 36,000 000 Catalasa 5,600 000 p-amilasa 1,100 000 p-galactosidasa 12 000 Succinato deshidrogenasa 1 150

actividad enzimática aumenta con los incre­mentos de temperatura, la velocidad de los procesos metabólicos crece notablemente durante la fiebre; si la fiebre continuara indefinidamente sería fatal. Muchos medi­camentos actúan como inhibidores competi­tivos de ciertas enzimas. Por otro lado, estos factores deben considerarse al realizar los ensayos in vitro para medir actividades enzi-máticas en el plasma de un paciente.

4.5.3.1. Factores físicos y químicos

Temperatura. Las enzimas a temperaturas bajas muestran un aumento de su actividad al incrementar la temperatura, pero a altas temperaturas la enzima sufre desnaturaliza­ción térmica y la velocidad de la reacción disminuye (fig. 4.11).

La gráfica de velocidad frente a tempera­turas (Fig. 4.11) revela una curva en forma

de campana con un óptimo entre 40 y 45 °C para enzimas humanas, denominada tempe­ratura óptima. El incremento de velocidad al acercarse la temperatura óptima se debe a una mayor energía cinética de los reccionan-tes (sustrato). El factor que resulta por cada 10°C de incremento en la temperatura se de­nomina coeficiente térmico (Qio) y en las reacciones químicas habituales es de alrede­dor de 2, o sea, se duplica la velocidad de la reacción por cada 10°C de aumento en la temperatura. Muchos procesos fisiológicos, por ejemplo, la frecuencia de contracción de un corazón extirpado, muestran un (Qio) • 2. Por arriba de la temperatura óptima, la velo­cidad de reacción decrece por desnaturaliza­ción de la enz ima . Las enz imas de microorganismos adaptados a vivir en aguas termales muestran temperaturas óptimas cercanas al punto de ebullición del agua. Por el contrario en condiciones de hipotermia muchas reacciones enzimáticas están depri­midas lo que explica la baja demanda de oxígeno de algunos organismos durante pe­riodos de hibernación.

pH. Por ser proteínas, las enzimas poseen un punto isoeléctrico en el que su carga eléc­trica es cero; el pH del punto isoeléctrico, sin embargo, no es el pH de máxima activi­dad de la enzima (pH óptimo). Los cambios de pH afectan profundamente el carácter ió­nico de los grupos funcionales de la enzima y, por lo tanto, alteran la conformación de la proteína y con ello, el sitio catalítico. Ade­más de los efectos puramente iónicos, los valores altos o bajos de pH (ácidos o alcali­nos) provocan desnaturalización de la enzi­ma (fig. 4.12).

El pH óptimo de la mayoría de las enzi­mas se localiza entre los valores de 5 y 9. Sin embargo, algunas enzimas, por ejemplo, la pepsina o la arginasa son activas a valores depH alejados de este óptimo (Tabla 4.8).

El efecto nocivo de las radiaciones, sales y metales pesados (Ag, Pb, Hg) sobre la ac­tividad enzimática se debe a la acción desna-

turalizante sobre las proteínas en general. Esta propiedad es útil en el laboratorio clíni­co; las muestras de sangre son primero trata­das con ácidos como el tncloroacético, fosfotúngstico y otros para desnaturalizar y precipitar proteínas, la labilidad de la mayo-

Tabla 4.8 Valores óptimos de pH para algunas

enzimas

ría de las enzimas a estos agentes desnatura­lizantes permite determinar si una reacción es catalizada por una enzima.

4.5.3.2. Inhibidores enzimáticos

Aunque se requiere la molécula completa de la apoenzima para su actividad catalítica, existe una zona determinada donde se com­bina con él sustrato al que se llama sitio acti­vo o sitio catalítico. Este es un hueco molecular en la estructura terciaria de la en­zima con tres puntos de apoyo próximos en­tre sí (tres aminoácidos) aunque en la estructura primaria no estén próximos (fig. 4.13).

El peso molecular de la mayoría de los sustratos es muy pequeño comparado con el de las enzimas. Por ejemplo, la catalasa (PM 250,000) respecto al peróxido de hidrógeno (PM 34). Pueden afectarse ciertos aminoáci­

dos de una enzima sin que ello altere su acti­vidad catalítica siempre y cuando no se afecten los involucrados en el sitio activo.

Quizá la prueba más evidente de la locali-zación de sitios activos proviene de estudios con inhibidores. Un inhibidor enzimático es cualquier agente químico capaz de dismi­nuir la velocidad de una reacción sin desna­turalizar la enzima. Los inhibidores son compuestos que tienen la capacidad de unir­se a enzimas de tal forma que impiden la combinación enzima-sustrato. Existen dife­rentes tipos de inhibidores enzimáticos: competitivos, no competitivos e incompeti-tivos.

Inhibición competitiva. Está dada por una molécula parecida estructuralmente al sus­trato (isostérica) que se une al sitio catalítico pero no se transforma. Esta molécula forma un complejo reversible con la enzima (El) que compite continuamente con el sustrato por el sitio catalítico. La magnitud de la in-

hibición dependerá de: a) la concentración de inhibidor, b) la concentración de sustrato y c) las afinidades relativas (Km) entre inhi­bidor y sustrato por la enzima. El grado de inhibición competitiva es proporcional a la concentración de inhibidor (I); sin embargo, un aumento en la concentración de sustrato en presencia de una concentración fija del inhibidor llega a superar la inhibición.

Un ejemplo muy conocido es la inhibición competitiva de la succinato deshidrogenasa, cuyo sustrato natural, el succinato y el inhi­bidor, malonato, son parecidos (fig. 4.14).

Dado que sustrato e inhibidor compiten por el mismo sitio de la inzima, la Km mues­tra un incremento aparente en presencia del inhibidor. Esto se puede ver en la gráfica de Michaelis-Menten y en la de Lineweaver-Burk (fig. 4.15). La Km que se obtiene expe-rimentalmente es denominada Km aparente: la Vmax no varía.

Ejemplos de inhibición competitiva es la que se realiza al administrar ciertos fárma­cos. Si denominamos metabolitos a los sus­tratos fisiológicos presentes o producidos en el metabolismo celular, serán antimetaboli­tos, aquellos que impiden el aprovecha­miento y utilización de los metabolitos naturales debido a su parecido estructural.

Los animales superiores y muchos mi­croorganismos son incapaces de sintetizar algunos compuestos necesarios para su su­pervivencia, por lo que estos adquieren la categoría de nutrimentos esenciales. Estos compuestos pueden ser aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, etc.

Los organismos utilizan ciertos metabo­litos y enzimas para sintetizar estos com­puestos esenciales, estas enzimas pueden inhibirse por medio de antimetabolitos.

La investigación de los antimetabolitos se inició con la observación de Woods en 1940, quien comprobó que la inhibición del crecimiento bacteriano por sulfas era contra­rrestado por ácido paraaminobenzoico (PA-BA).

Los microorganismos que necesitan PA­BA para su crecimiento, lo utilizan como metabolito para sintetizar ácido fólico. Este crecimiento bacteriano puede inhibirse con antimetabolitos como las sulfas. Aquellos organismos que requieren ácido fólico pero que no lo puedan sintetizar a partir de PA­BA, no se afectarán por sulfas. La utiliza­ción eficaz de las sulfas para combatir infecciones en el hombre depende de este hecho. Dado que el hombre adquiere fola-to en forma exógena, las sulfanilamidas no son dañinas a las dosis que inhiben a las bac­terias.

Muchos antimetabolitos ejercen su acción a nivel de coenzimas o grupos prostéticos como los antifólicos como el metotrexate o alguna antivitaminas como la oxitiamina o la oxipiridoxina. Otro ejemplo es la inhibi­ción de ciertos tumores por 5-fluorouracilo y la de algunos virus como el herpes labial por yododesoxiuridina. Toda o gran parte de la farmacoterapia moderna está basada en los conceptos de inhibición enzimática.

Inhibición no competitiva. Este tipo de in­hibición es irreversible aun cuando se au­mente la concentración de sutrato. Es decir, no existe relación entre el grado de inhibi­ción y la concentración de sustrato. La inhi­bición solo depende de:

a) la concentración del inhibidor y b) la afinidad del inhibidor por la enzima. En

contraste con la inhibición competitiva, la formación del complejo enzima-inhibidor puede o no ocurrir en el sitio activo de la en­zima. El inhibidor no competitivo puede ser unamólecula(Ii) que no se une en el sitio ac­tivo sino cerca de él; puede unirse a uno de los tres puntos esenciales del sitio activo (I2), o incluso puede ser un análogo del sustrato (I3) pero que no puede ser desplazado por al­tas concentraciones del sustrato; puede ser un inhibidor (I4) que no intervenga en la forma­ción de ES, pero que provoque un cambio de conformación en la enzima de suerte que és­ta pierda su actividad catalítica (fig. 4.16).

Algunas enzimas tienen grupos sulfhidri-lo (-SH) esenciales para su actividad; un agente que reacciona con estos grupos es la yodoacetamida (I-CH2—CO-NH2):

E-SH+I-O^-CO-NHj -* E-S-CH^-CO-NHj+HI

Enzimas como la peroxidasa y catalasa, que contienen hierro como grupo prostético, son inhibidas por compuestos que forman complejos con el metal como el cianuro o el H2S. Los iones fluoruro y oxalato inhiben enzimas que requieren Ca+2 o Mg+2. El dii-sopropilfluorofosfato (DIPFP) inhibe enzi-

mas con grupos funcionales oxidrilo (Ser-OH) como la colinesterasa.

En la inhibición no competitiva no se alte­ra la Km pero sí la Vmax (fig. 4.17).

Inhibición incompetitiva o acompetitiva. Es una forma de inhibición no competitiva pero reversible. En ésta, el inhibidor se pue­de combinar con la enzima (El) o con el complejo enzima-sustrato ya formado (EIS) y la reacción puede retrasarse pero no impe­dirse. Se presenta sobre todo cuando hay más de un sustrato en la reacción. La modi­ficación en la gráfica de Lineweaver-Burk de la inhibición incompetitiva es la que se observa en la fig. 4.18.

Estrictamente, los productos de la reac­ción son inhibidores específicos de la reac­ción enzimática. En otros casos, el sustrato puede inhibir o activar su propia reacción (fig. 4.19).

Un ejemplo de inhibición por producto lo tenemos en la deshidrogenasa láctica (LDH) de la cual existen dos isoenzimas particula­res: en el músculo predomina la isoenzima M4, que no es inhibida por producto; en co­razón predomina la isoenzima H4 que es in­hibida por producto (lactato). Esta particularidad permite que en corazón se in-

Figura 4.17 Inhibición no competitiva;

hiba la LDH por lactato y el piruvato se deri­ve al ciclo de Krebs, productor de energía. Esta es una ventaja fisiológica que garantiza que el corazón tenga un aporte constante de energía para la contracción (ver unidad de Bioenergética).

Existen algunas aplicaciones prácticas, desde el punto de vista clínico, de la inhibi­ción enzimática. El suero contiene enzimas como las fosfatasas acidas producidas por di­ferentes tejidos, hay una producida por la próstata, que se eleva en el carcinoma prosté­tico. El ácido L-tartático inhibe competitiva­mente la actividad de la enzima prostática, pero tiene poco efecto sobre las fosfatasas acidas de eritrocitos, hígado, riñon y bazo. El formaldehído al contrario, inhibe la de eritrocitos, pero no a la enzima prostática. Los iones calcio inhiben no competitiva­mente muchas fosfatasas acidas, de aquí la necesidad de agregar quelantes a muestras de sangre destinadas a este ensayo. El etanol y ciertos narcóticos son también inhibidores

laelis-Menten (a) y Lineweaver-Burk (b).

no competitivos de la fosfatasa acida, lo cual debe tomarse en cuenta al interpretar los re­sultados.

4.6 REGULACIÓN ENZIMÁTICA

En el tubo de ensayo, las enzimas funcionan en un sistema cerrado y se acumula el pro­ducto de la reacción. Sin embargo, en la cé­lula, los productos de la reacción no se acumulan ya que son utilizados como sus­tratos de otra enzima, y los productos de ésta son sustratos de otra enzima y así sucesiva­mente hasta llegar al llamado producto final. La secuencia de reacciones entre un sustrato inicial y su producto final se denomina vía metabólica, la cual puede presentar ramifi­caciones que constituirán otras vías metabó-licas.

Aunque todas las reacciones catalizadas por enzimas son reversibles en el tubo de ensayo, en la célula, la característica secuen-

cial de las vías metabólicas hace que el flujo del metabolismo celular sea irreversible y permanentemente dinámico. El carácter di­námico de los organismos vivos establece que el verdadero equilibrio metabólico se al­canza sólo con la muerte de la célula. La cé­lula viva es un sistema abierto, en equilibrio dinámico (estado estacionario), mantenido por un flujo unidireccional de metabolitos. El estado estacionario equivale al concepto de homeostasis, propuesto por Claudio Ber-nard a finales del siglo XIX, que indica que los organismos mantienen su medio interno-constante a pesar de las amplias variaciones en alimentación, actividad física, temperatu­ra externa, etc. (fig. 4.20).

En un sistema tan complejo como la célula debe haber mecanismos de regulación o con­trol de la multitud de reacciones simultáneas que ocurren, reacciones que son, en su mayo­ría, catalizadas por enzimas. En todas las áreas de las ciencias biomédicas se encuentran ejemplos de regulación normal o anormal: muchas células cancerosas exhiben anorma­lidades en la regulación de sus enzimas.

El conocimiento de los factores que regu­lan la acción de las enzimas es, por tanto, esencial para entender el mecanismo de ho­meostasis celular y para comprender a nivel molecular las enfermedades.

La regulación metabólica de una vía tiene lugar mediante la modulación de la activi­dad enzimática de una o más enzimas clave de la ruta, llamada enzima limitante de la vía, que generalmente corresponde a la pri­mera enzima. Uno de los primeros ejemplos de regulación fue la síntesis de CTP (citidi-na trifosfato) a partir de aspartato y carba-milfosfato (fig. 4.21).

La primera enzima del proceso de síntesis de CTP, la aspartato transcarbamilasa (a), se inhibe específicamente con CTP y UTP, productos finales del proceso. Se considera que la acción de CTP y UTP ocurre en un si­tio regulador distinto del sitio catalítico por­que: 1) CTP o UTP y aspartato difieren

mucho en estructura, tamaño y distribución de cargas; 2) la inhibición por CTP o UTP puede abolirse sin pérdida de actividad cata­lítica; 3) el ATP, que no afecta la velocidad enzimática, puede impedir la inhibición por CTP o UTP, quizá por competencia con el sitio regulador y 4) pueden fraccionarse dos subunidades una que une aspartato y otra que une CTP o UTP.

Pardee, Jacob, Monod y Changeaux, estu­diaron este tipo de inhibición y la llamaron inhibición alostérica (allos=otro) en virtud de que el sitio regulador es distinto del sitio activo (isostérico, de isos=igual).

Conviene distinguir este tipo de inhibi­ción con la inhibición por producto, la cual sigue la ley de acción de masas. Las reaccio­nes enzimáticas, como cualesquiera otra, obedecen esta ley. Si a la reacción:

Glucosa -6-P + H 2 0 -» Pi + glucosa

se le agrega inicialmente glucosa libre o fos­fato, disminuye su velocidad; esto como ya se mencionó se considera inhibición compe­titiva o isotérica. A la inhibición alostérica se le llama también inhibición por producto final, por retroalimentación o regulación re­troactiva ("feedback").

4.6.1. Regulación alostérica

La actividad catalítica de algunas enzimas reguladoras es afectada por ciertas molécu­las que producen un cambio en la actividad enzimática, pero que no se modifican por la acción enzimática. Estas moléculas se deno­minan efectores, modificadores o modula­dores; por lo general, estos tienen poca o ninguna semejanza estructural con el sustra­to. Monod, en 1963 observó esta falta de re­lación estructural inhibidor-sustrato y propuso denominar a este tipo de moléculas, efectores alostéricos. Un efector alostérico cambia la conformación de la enzima, de

manera que cambia la afinidad hacia el sus- inverso. El sitio alostérico donde se une el trato. Los efectores alostéricos positivos (+) efector positivo se conoce como centro acti-incrementan la afinidad enzima-sustrato y vador. El efector negativo se une a un centro los efectores alostéricos negativos (-) hacen lo inhibidor. Una enzima alostérica, es una en-

talizada por una determinada enzima, deno­minado metabolito, se convierte en el sustra­to de la subsiguiente reacción

B metabolito

4.1.3. Funciones generales

4.13.1. Catálisis enzimática

Se ha señalado que una enzima incrementa la velocidad de la reacción química pero sin modificar la constante de equilibrio ni el sentido de la reacción, es decir, sin variar las propiedades termodinámicas del sistema.

En un sistema catalizado por una enzima, un sustrato (A) con determinado nivel ener­gético, conocido como estado inicial, tiene que alcanzar un nivel energético superior o estado de transición antes de convertirse en un producto (B) con un nivel energético co­

rrespondiente al estado final. Para que la re­acción tenga lugar, las moléculas reaccio­nantes deben alcanzar un nivel de energía suficiente para vencer la barrera energética y entrar al estado de transición. La diferen­cia entre la energía libre de los reactantes y el estado de transición se denomina energía de activación. La función de un catalizador (inorgánico o enzima) consiste en disminuir la energía de activación, lo que conduce a acelerar la reacción debido a que los reac­tantes pueden alcanzar más fácilmente el es­tado de transición (fig. 4.1).

4.1.4. Catalizadores inorgánicos y biológicos

Los catalizadores inorgánicos son general­mente átomos en estado iónico o metales con propiedades similares a las atribuidas a un catalizador biológico pero, a diferencia de los catalizadores biológicos, no poseen la

REACCIÓN

Figura. 4.1. Energía de activación de una reacción no catalizada (I) y una reacción catalizada (II).

zima cuya actividad en el sitio catalítico puede ser modulada por la presencia de efectores en los sitios alostéricos (fig. 4.22).

En el ejemplo de la aspartato transcarba-milasa, el sitio catalítico radica en subunida-des diferentes, a las del sitio alostérico; esta enzima posee dos protómeros catalíticos y tres o cuatro reguladores. Aunque una enzi­ma monomérica puede, teóricamente, expe­rimentar efecto alostérico, en la práctica sólo se han encontrado dos enzimas alostéri-cas monoméricas: ribonucleósido difosfato reductasa y piruvato -UDP-n-acetil-gluco-saminatransferasa. La mayoría de las enzi­mas alostéricas son oligoméricas.

La cinética de interacción entre sustrato, enzima e inhibidor alostérico sigue una cur­va sigmoidea. Los efectos alostéricos nega­tivos desplazan la curva hacia la derecha, indicando aumento de la Km con pérdida de afinidad enzima-sustrato. En presencia de un efector positivo se alcanza la 1/2 Vmax a una concentración menor de sustrato y se des­plaza la gráfica de Michaelis-Menten hacia la izquierda (fig. 4.23).

Las enzimas alostéricas permiten el control fino de la actividad metabólica mediante pe­queñas fluctuaciones en el nivel de sustratos.

Es frecuente la confusión entre los térmi­nos de alosterismo y coopera ti vidad. La cooperatividad se define como la influencia que tiene la fijación de un ligando a un pro­tómero sobre la fijación del ligando a un se-gundo protómero de una proteína oligomérica. Anteriormente se ha discutido, en el capítulo de proteínas de transporte, la cooperatividad en la fijación de oxígeno a la hemoglobina. En la hemoglobina el centro de fijación del oxígeno de cada subunidad corresponde al centro del sustrato y no a un sitio alostérico; por lo tanto, el cambio con-formacional que induce el oxígeno sobre los protómeros de hemoglobina, técnicamente no es un efecto alostérico.

Las enzimas alostéricas se dividen en dos clases según la influencia del efector alosté­rico sobre la Km y la Vmax. En la clase K, el efector afecta la Km pero no la Vmax. Para las enzimas de la clase V, el efector alostéri­co abate la Vmax sin afectar la Km aparente.

Figura 4.22 Representación esquemática de la regulación alostérica, S = sustrato; i = inhibidor; a = activador,

No obstante que las enzimas K dan gráficas parecidas a la inhibición competitiva, no es adecuado utilizar los términos competitivos y no competitivos con sistemas enzimáticos absteneos porque el mecanismo del efector de un inhibidor alostérico sobre una enzima V o K es diferente al de un mecanismo com-petivo o no competitivo sencillo. Puesto que los inhibidores alostéricos actúan en un sitio diferente (alostérico) el modelo cinético ya no es válido.

El hecho de que los centros inhibidores y activadores alostéricos están separados en­tre sí como del centro catalítico, se ilustra en el estudio de un paciente con gota cuyos eri­trocitos tenían altos niveles de fosforribosil-pirofosfato (PRPP). En este paciente, se encontró que la PRPP sintetasa tenía una Km y Vmax normales. Sin embargo, mostraba menor sensibilidad a los inhibidores alosté­ricos normales AMP, ADP, GDP y 2, 3-DPG. Los productos finales endógenos de la ruta (ATP, GTP) no eran capaces de inhibir alostéricamente a la enzima y se acumula­ban el PRPP y el ácido úrico. Aparentemen­te una mutación había producido un cambio

en el centro inhibidor (I). En la fig. 4.24 que ilustra el caso, se muestran los diferentes si­tios de unión para sustrato (S) activadores (A), e inhibidores (I).

4.6.2. Represión e inducción

El mecanismo de control alostérico de la actividad enzimática es también aplicable a sistemas de regulación a nivel génico. Se ha mencionado al inicio de la unidad III que la expresión de la función genética se realiza a través de las enzimas (un gene - una enzi­ma). Los estudios iniciales sobre la regula­ción de la síntesis de proteínas enzimáticas permitieron reconocer tres tipos de enzimas: constitutivas, inducibles, y reprimibles.

4.6.2.1. Enzimas constitutivas y enzimas inducibles

Las enzimas constitutivas están presentes en concentraciones constantes durante la vida de la célula, probablemente debido a una re-

Figura 4.24 Inhibición alostérica o por retroalimentación.

lación constante entre síntesis y degradación de la enzima, generalmente son las enzimas de las principales vías metabóücas como las de la vía glucolítica.

Las enzimas inducibles, son aquéllas cuya concentración en la célula normalmente es baja y a medida que se requiere mayor canti­dad de enzima, la velocidad de síntesis au­menta con respecto a su degradación. Es decir, la inducción implica síntesis de novo lo cual se ha demostrado puesto que siste­mas donde la síntesis de proteínas está blo­queada, no responden al estímulo inductor. Él ejemplo de inducción de síntesis enzimá-tica, más estudiado, es el sistema de la P-ga-lactosidasa de E. coli.

Usualmente E. coli crece en un medio simple, que contiene glucosa y sales, y pue­de fabricar todos sus constituyentes esenciales a partir de este medio. En estas condiciones, el cultivo sólo contiene trazas de P-galacto-sidasa. Cuando estos microorganismos se transfieren a un medio con lactosa, como úni­

ca fuente de carbono, en breve empiezan a aparecer cantidades apreciables de galactó-sido permeasa, (3-galactosidasa y tiogalactó-sidotransacetilasa (fig. 4.25). Si se quita la lactosa del medio y se vuelve a dar glucosa, se suspende la síntesis de dichas enzimas.

Con este tipo de control la célula no in­vierte energía en sintetizar enzimas para ac­tuar sobre un sustrato no presente. El fenómeno se denomina inducción enzimáti-ca coordinada.

El tercer tipo de enzimas es el de las re-primibles. La síntesis de estas enzimas se suspende si está presente en abundancia el producto final de la vía metabólica donde funcionan. Uno de los sistemas mejor estudia­dos es el que conduce a la síntesis de histidi-na en Salmonella. El aminoácido histidina se forma por una secuencia de 10 reacciones a partir de PRPP. Cuando se agrega histidina al medio se reprimen los 15 genes que codi­fican para 9 enzimas. El fenómeno se deno­mina represión enzimática coordinada.

Debe subrayarse que la inducción y repre­sión son mecanismos de control sobre sínte­sis de enzima y no sobre actividad de la enzima; por lo tanto, es distinto de la inhibi­ción por producto final (retroacción o feed-back). En general, la retroinhibición es un mecanismo de control ejercido a corto pla­zo, con un efecto inmediato sobre la ruta metabólica, mientras que la represión nece­sita más tiempo pero con efectos permanen­tes al reducir el número de moléculas de enzima.

4.6.3. Teoría del operan

En 1961, F. Jacob y J. Monod propusieron un modelo ingenioso para explicar la induc­ción y represión de la síntesis enzimática. Por este trabajo y otras contribuciones reci­bieron el premio Nobel de medicina 1965.

De acuerdo a su teoría, la regulación de las enzimas involucradas en la inducción y represión tiene lugar a nivel de la transcrip­ción. Los genes que transcriben un RNA mensajero (RNAm) policistrónico, que a su vez codifica para las enzimas coordinada­

mente inducidas o reprimidas se denominan genes estructurales. Por "mapeo" genético del cromosoma involucrado se ha demostra­do que estos genes estructurales se localizan adyacentes, uno con otro, en el cromosoma involucrado. El modelo presupone que la transcripción de genes estructurales está controlada por un gene operador y un sitio promotor (donde se une la enzima RNA po­limerasa), formando una unidad funcional llamada operan. Otro gene, llamado regula­dor que codifica para una proteína represora del gene operador, se puede localizar en un sitio distante del gene operador (fig. 4.26). Para mayor comprensión de estos aspectos se recomienda revisar los conceptos genéti­cos de la unidad IX.

El operón Lac. de E. Coli, es uno de los más estudiados, consta de 3 enzimas induci-bles controladas por 3 genes estructurales (Z, Y y A). El amino terminal de la p-galac-tosidasa se sitúa del lado del operador. Así, la síntesis de RNAm transcurre desde el operador a través del operón completo. Este fenómeno de polaridad se ha encontrado pa­ra el operón del triptófano (operón Tri) y otros. La proteína represora que actúa sobre el operador y que impide la acción de la RNA polimerasa y por tanto, la formación del RNAm de todo el operón Lac es un tetrá-mero de casi 150,000 daltones que se sinteti­za continuamente. Cuando se dan inductores como la lactosa o análogos se deforma el re­presor, y el operón Lac se transcribe y traduce.

El control del operón Lac tiene otro ele­mento efector positivo, el AMP cíclico (AMPc). Células con glucosa disponible tie­nen bajos niveles de AMPc. Al inducir con lactosa, el AMPc se une a una proteína cata-bólica activadora del gene (CAP, un dímero con PM de 45,000 daltones, y este complejo se une al sitio promotor en el DNA de tal manera que la RNA polimerasa puede ini­ciar la síntesis de RNAm. Así, la expresión del operón Lac requiere del inductor (lacto­sa) y de AMPc.

Figura 4.26 Inducción enzimática en el operón LAC de E, coli. L = lactosa; CAP = proteína catabólica activadora del gene operador.

En sistemas reprimibles, el gene regula­dor elabora una proteína represora que regu­larmente no interactúa con el operador. Cuando se da el correpresor (por ejemplo, histidina), se combina éste con la proteína y se forma una sustancia efectivamente represo­ra que bloquea al gene operador (fíg. 4.27). Esto representa también un ahorro de ener­gía para la célula ya que si existe histidina, no tiene objeto la producción de enzimas pa­ra su síntesis.

El operón His. de Salmonella typhimu-rium coordina la expresión de genes estruc­turales (G, D; C, B, H, A, F, I, E.) que codifican para 9 enzimas, que actuando coordinadamente, participan en la biosínte-sis de histidina. La histidina es también un inhibidor alostérico de la primera enzima de la secuencia biosintética.

Aunque los genes y mecanismos regula­dores mencionados sólo han sido demostra­dos en procariotes, se supone que también se

presentan en organismos eucariotes. Sin em­bargo, hay que ser prudentes en extrapolar los conocimientos adquiridos de una a la otra clase de células (eucariotes). En esta úl­tima, los mecanismos de regulación son más complejos y tienen separados físicamente la transcripción de los genes de la traducción. Además, los RNAm eucarióticos son mono-cistrónicos en contraposición a los RNAm policistrónicos de las células procariotas.

Aspectos Clínicos de las Enzimas

La aplicación clínica de las enzimas anterior­mente se restringía a su empleo como auxi­liares en el diagnóstico; posteriormente se

vislumbró la posibilidad de emplearlas en el tratamiento de algunas enfermedades, cam­po que está en exploración muy activa. Las enzimas se utilizan también como reactivos clínicos para detectar otro tipo de moléculas cuyas concentraciones son bajísimas en el plasma o tejidos.

4.7.1. Como reactivos en el laboratorio clínico

La disponibilidad de enzimas puras a pre­cios razonables ha convertido a algunas de ellas en reactivos de enorme valor para el la­boratorio de análisis. Puede determinarse enzimáticamente la concentración de un

compuesto en una mezcla cuando se dispone de una enzima específica capaz de transfor­marlo rápidamente en un producto.

Muchas determinaciones enzimáticas pueden acoplarse con reacciones que utili­zan NAD+ o NADP+ como coenzimas, en virtud de que NADH y NADPH absorben a 340nm mientras que NAD+ y NADP+ no ab­sorben a esa longitud. Cuando el NAD+ se reduce, se incrementa proporcionalmente la densidad óptica; cuando el NADH se oxida, disminuye la densidad óptica (fig. 4.28).

Con este ensayo se puede determinar urea, al acoplar la acción de la enzima urea-sa con la glutamato deshidrogenasa (GDH).

La glucosa se determina oxidándola a glu-conato en presencia de la enzima glucosa oxidasa, con H2O2 como subproducto. Aco­plando la reacción con peroxidasa, el H2O2 oxida la O-dianisina a un compuesto colori­do (principio de la glucocinta).

Para determinar alcohol etílico, se con­vierte éste en acetaldehído por medio de la enzima deshidrogenasa alcohólica (ADH):

el aumento en absorbancia a 340 nm es pro­porcional a la concentración de alcohol.

Aprovechando la especificidad enzimáti-ca e inmunológica por un sustrato, se ha ideado un método altamente específico lla­mado enzimoinmunoensayo (EIA). El fun­damento de este método es similar al radioinmunoensayo (RÍA), basado en el principio de la unión competitiva, y en la se­lectividad y sensibilidad de la respuesta an-tígeno-anticuerpo. En los últimos años existen disponibles comercialmente las eri­zarías inmovilizadas para usarse en sistemas de determinación automatizados.

4.7.2. Como elementos diagnósticos

Una importante función de un laboratorio clínico, es la de cuantificar las alteraciones bioquímicas en el individuo enfermo, como la determinación de enzimas en líquidos ex-tracelulares (plasma y suero, orina, jugo gástrico, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido sinovial), y en algunos tejidos o células sanguíneas.

4.7.2.1. Enzimas órgano específicas

En condiciones normales, las enzimas invo­lucradas en los procesos metabólicos (glu-cólisis, fosforilación, transaminación, oxidación, etc.) se sintetizan en las células y la mayoría ejerce su función en su interior. Si las células permanecen intactas, las enzi­mas intracelulares no pasan al torrente san­guíneo, sin embargo, como resultado de una lesión celular producida por agentes infec­ciosos, toxinas bacterianas, o incluso por el proceso de envejecimiento celular normal, se producen daños en las membranas celula­res que permiten el "escape" de enzimas a la circulación. Este escape de enzimas de las células al plasma se produce también cuan­do mueren éstas como ocurre en el infarto

de miocardio y la hepatitis infecciosa. En personas normales sanas, las enzimas de ori­gen intracelular están presentes en plasma en cantidades muy bajas pero mensurables.

En el diagnóstico de la alteración de un órgano específico en un proceso patológico sería ideal que se pudiesen identificar enzi­mas específicas para cada órgano; no obs­tante, esto es poco probable ya que el metabolismo de muchos órganos es muy pa­recido. Esta correlación ocurre sólo para al­gunas enzimas, por ejemplo la alcohol deshidrogenasa o la sorbitol deshidrogena­sa que son casi exclusivamente de origen hepático, la acetilcolinesterasa de eritroci­tos, la fosfatasa acida de próstata, y la fosfa­tasa alcalina de osteoblastos. Una de las aspiraciones del diagnóstico clínico es pre­cisamente lograr la asociación de una enzi­ma específica en plasma o sangre con cada tejido o situación patológica. Un grado ma­yor de conocimiento de esta relación se está consiguiendo con el estudio de determina­das isoenzimas.

4.7.2.2. Isoenzimas

El interés médico por las isoenzimas fue es­timulado por el conocimiento de que los

sueros humanos contenían varias isoenzi­mas de la deshidrogenasa láctica y que sus proporciones relativas cambian significati­vamente en ciertos estados patológicos.

Las isoenzimas que han sido estudiadas para aplicaciones diagnósticas son la deshi­drogenasa láctica, la creatinfosfocinasa y la fosfatasa alcalina (revisar subcapítulo 4.2.4).

4.7.2.3. Perfiles enzimáticos

El plasma circulante contiene cantidades apreciables de enzimas que tienen su origen en las células de diferentes tejidos del orga­nismo; éstas pueden dividirse en tres gru­pos:

1) Enzimas que realizan una función es­pecífica en el plasma llamadas también enzi­mas plasmáticas funcionales. Se encuentran en alta concentración y están involucradas en funciones como la coagulación de la sangre (trombina y otras), disolución de la fibrina (plasmina) y modificación de quilomicrones (lipoproteinlipasa).

2) Enzimas elaboradas por células espe­ciales y secretadas a un conducto o dentro de un tejido especial, por ejemplo amilasa, li-pasa, fosfatasa acida y fosfatasa alcalina.

3) Enzimas que realizan su función en las células que las originan y cuyas actividades constituyen el proceso vital celular.

El segundo y tercer grupo de enzimas se de­nominan también enzimas plasmáticas nojun-donales y su presencia en plasma en cifras mayores que las normales sugiere una veloci­dad aumentada de destrucción celular. Su cuan-tificación constituye para el médico una prueba valiosa de diagnóstico y pronóstico clínico.

4.7.3. Alteraciones enzimáticas como causa de enfermedad

Muchas enzimas se encuentran en casi todas las células aunque algunas se encuentran predominantemente en ciertos tejidos. Aun cuando la enzima sea específica de un tejido particular, niveles elevados de ésta en plas­ma solo indican daño celular pero no el tipo de proceso patológico. Por ejemplo, después de cirugía mayor o de un trauma extenso, se elevan los niveles de LDH-5, TGO y CPK a partir del músculo esquelético dañado, si se presenta insuficiencia circulatoria debida a insuficiencia cardiaca o choque, y especial­mente después de paro cardiaco, se elevan notablemente algunas enzimas pero su valo­ración no permite establecer la causa de la insuficiencia o del paro.

Puede localizarse el tejido dañado para confirmar un diagnóstico de dos formas:

a) Por determinación del perfil isoenzi-mático, ejemplo: las isoenzimas de la LDH (fig.4.29).

b) Por valoración de más de una enzima, ejemplo: hígado y corazón contienen altos niveles de aminotransferasas, antes llama­das transaminasa glutámico pirúvica (TGP) y glutámico oxalacética (TGO) pero el híga­do contiene más TGP que TGO mientras que en el corazón sucede al revés. En otro ejem­plo se utiliza la valoración de isoenzimas de la LDH y CPK para determinar la evolución de un infarto de miocardio (fig. 4.30).

Existen causas de elevación no específica de niveles enzimáticos que pueden ser; a) fisiológicas, como en el recién nacido; los niveles de TGO están elevados moderada­mente en el periodo neonatal. Los niveles de fosfatasa alcalina son altos hasta después de la pubertad por la actividad osteoblástica. En el último trimestre del embarazo están elevados los niveles de fosfatas alcalina de origen placentario. b) inducidas por drogas. Ciertas drogas como difenilhidantoína y barbitúricos pueden inducir la producción de enzimas, como la fosfata alcalina. Los niveles de gama-glutamiltransferasa se corre­lacionan con ingestión de alcohol, c) eleva­ciones artificiales. En general las muestras hemolizadas son inadecuadas para valora­ciones enzimáticas. Aun cuando los eritroci­tos lisados no contengan la enzima por valorar, contienen otras que interfieren y producen falsas positivas.

Creatinfosfocinasa (CPK). Esta enzima se encuentra distribuida en músculo cardia­co, esquelético y cerebro. La enzima catali­za la siguiente reacción:

CPK

CREATINFOSFATO + ADP -* CREATINA + ATP

Esta se acopla a otras dos, para determinar cuantitativamente el NADPH:

ATP + GLUCOSA -+ GLUCOSA-6-P + ADP

GLUCOSA -6-P+ NADP+ -» 6-p-glucorolactona + NADPH+H+

La enzima CPK, es un dímero que consta de 3 isoenzimas: CPK-1 (BB) de cerebro; CPK-2 (MB) y CPK-3 (MM) de músculo. Se eleva marcadamente en infarto de mio­cardio, en la misma proporción que la TGO y en distrofias musculares sobre todo la de tipo Duchenne; moderadamente en lesiones musculares, cirugía, ejercicio físico intenso, accidentes cerebrovasculares, hipotiroidis-

Figura 4.29 Patrones normal y patológico de las isoenzimas de la LDH en suero humano. A: paciente con infarto de miocardio; B: suero normaj; C: paciente con enfermedad hepática.

mo (la tiroxina afecta el catabolismo de la enzima) alcoholismo (miositis alcohólica) episodios psicóticos agudos, y artificialmen­te en muestras hemolizadas.

a-amilasa (AMS). La enzima está presen­te en jugo pancreático, saliva, trompas de Falopio y músculo. Se excreta por orina en virtud de su bajo peso molecular. Los nive­les urinarios se elevan paralelamente a los niveles plasmáticos, a menos que exista in­suficiencia renal. El ensayo se realiza por acción de suero, plasma u orina sobre amilo-pectina marcada con un colorante azul. La intensidad del color azul liberado es propor­cional a la cantidad de enzima.

La amilasa se eleva notablemente (5 a 10 veces) en casos de pancreatitis aguda (en ocasiones en carcinoma de páncreas), ure­mia grave y cetoacidosis diabética severa; moderadamente en casos de úlcera péptica perforada, colecistitis, obstrucción intesti-

Fig. 4.30. Patrón isoenzimático de CPK y LDH después de un infarto de miocardio.

La isoenzima CPK2 (MB) aumenta hasta un máximo dentro del primer día del infarto, CPK3, sigue más

lenta alrededor de un día, a la CPK2. El nivel total de LDH aumenta muy lentamente. El incremento de

LDH 1 y LDH 2, dentro de las 12-24 h junto con un incremento de CPK2; es diagnóstico del infarto de

miocardio.

alta especificidad de éstos ni la capacidad para disminuir la energía de activación (ta­bla 4.1). Una enzima puede acelerar una re-

4.2.2.1. Cofactores coenzimáticos

La mayoría de las coenzimas son formas acción 105 veces más que un catalizador modificadas de las vitaminas (ver unidad de inorgánico. nutrición). Entre las reacciones catalizadas

4.2. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS

4.2.1. Holoenzima y apoenzima

La parte proteica de la enzima desprovista de los cofactores se denomina apoenzima. No todas las enzimas requieren cofactores para ser activas, pero en las que los requie­ren, la apoenzima es catalíticamente inacti­va. La adición del cofactor a la apoenzima da lugar a la holoenzima, o sea la enzima completa y activa.

4.2.2. Cofactores

Otros componentes de la enzima con bajo peso molecular, termostables y no proteicos, unidos a la apoenzima se llaman coenzimas, si la unión es débil y se separa con facilidad de la apoenzima, o grupos prostéticos, si es­tán firmemente ligados a la apoenzima. Los cofactores (coenzima o grupos prostéticos) son en general moléculas pequeñas, orgáni­cas e inorgánicas, que requiere la enzima pa­ra su actividad.

por enzimas que requieren coenzimas están las de oxidorreducción, las de transferencia de grupo, las de isomerización y las que for­man enlaces covalentes. Las reacciones hi-drolíticas no requieren de coenzimas.

La coenzima puede considerarse como un cosustrato, por ejemplo, en las reacciones de oxidorreducción, una molécula de sustrato es oxidada (deshidrogenada) y una molécula de coenzima es reducida (hidrogenada) (fig. 4.2).

De modo similar, en las reacciones de transaminación, el fosfato de piridoxal (PPal) actúa como segundo sustrato en dos reacciones combinadas (fig. 4.3).

Relación entre vitaminas y coenzimas. Las vitaminas del complejo B forman par­

te de numerosas coenzimas. Tal es el caso de la nicotinamida, riboflavina, tiamina, áci­do pantoténico, ácido fólico y cianocobala-mina. Coenzimas de oxidorreducción, derivadas de la vitamina nicotinamida son el nicotkiamida-adenina-dinucleótido (NAD+), y el nicotinamida-adenina-dinucleótido-fos-fato (NADP+). (fig. 4.4). La vitamina C y las vitaminas liposolubles no tienen actividad coenzimática conocida.

nal, embarazo ectópico roto, parotiditis, cálcu­los salivales, administración de morfina (es­pasmo del esfínter de Oddi) y macro-amila-semia.

Fosfatasa alcalina (ALP). Incluye isoen-zimas que hidrolizan fosfatos a pH alcalino. Se encuentran en hueso, hígado, pared intes­tinal, glándula mamaria lactante y placenta.

En huesos se localiza en los osteoblastos (la enzima es necesaria para los depósitos de fosfato en hueso). Los niveles normales en el adulto provienen específicamente de hí­gado, en niños de la fracción ósea por la ac­tividad osteoblástica. En el embarazo se elevan los niveles normales debido a la isoenzima termoestable de la placenta.

El método usado en la valoración es el de Bassey Lowry-Brock que utiliza la siguiente reacción.

pH 8.5-10 p-NITROFENOLFOSFATO — • p-NTTROFENOL + Pi

La enzima se eleva en enfermedades he­páticas con elementos colestáticos junto con la enzima 5'-nucleotidasa (NTP) que parece tener también origen hepático. Se eleva tam­bién en enfermedades óseas con actividad osteoblástica elevada: osteomalacia y raqui­tismo, hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, osteocarcinoma y osteosarcoma; en el raquitismo, la fosfatasa se eleva aun antes de que aparezcan síntomas de la enfermedad.

Fosfatasa acida (ACP). Se encuentra en próstata, hígado, eritrocitos, plaquetas y hue­so. El método de determinación es similar al de las fosfatasas alcalinas excepto el pH ópti­mo que es de 5. El principal uso de la valora­ción es el diagnóstico de carcinoma prostático metastásico. Aunque es difícil detectar sólo la fracción prostática, esta fracción tiene la pro­piedad de ser inhibida por el L-tartrato. Nor­malmente, la fosfatasa acida de la secreción prostática drena a los conductos prostáticos y aparece poco en sangre. En el carcinoma

prostático, particularmente si es metastási­co, se elevan los niveles de ACP debido al aumento de células prostáticas ectópicas.

4.7.4. Como agentes terapéuticos

Algunas enzimas se han utilizado como me­dicamentos en la terapia de problemas médi­cos específicos.

La estreptocinasa, preparada a partir de estreptococos, es útil para disolver coágulos de sangre formados en las extremidades infe­riores. Esta enzima activa el plasminógeno el cual se transforma en plasmina que es una proteasa que ataca la fibrina y la degrada.

Utilizando fibrinolisina y estreptodornasa (una DNAsa) por vía oral o tópico se puede eliminar el material fibrinoso y purulento de heridas infectadas o necrosadas. Varias en­zimas proteolíticas como tripsina y quimo-tripsina al igual que la estreptocinasa, se utilizan en el tratamiento de la trombosis.

Algunas enzimas digestivas (peptidasas, lipasas, amilasa, nucleasa y celulasas), se usan en la deficiencia enzimática por pan­creatitis crónica, pancreatectomía y trastor­nos gastrointestinales.

La terapia con asparaginasa se usa en al­gunos tipos de leucemia adulta. En virtud de que las células tumorales tienen un requeri­miento nutricional de asparagina, con aspa­r ag inasa los n i v e l e s de asparagina disminuyen sensiblemente lo que lleva a disminuir la viabilidad del tumor.

En el capítulo de ácidos nucleicos se estu­diarán algunas enfermedades en las que está alterada la codificación de algunas enzimas; su deficiencia o falta de actividad, es la cau­sa de la enfermedad. En el futuro será posi­ble el reemplazo enzimático por ingeniería genética en individuos con deficiencia gené­tica que afecte la síntesis de una enzima da­da.

C H L - C H - COO" 0 I

OH

Lactato ( Sustrato reducido

C H , - C - C O O ~ 3 II

O

Piruvato ( Sustrato oxidado )

NAD

coenzima oxidada

NADH + H +

( coenzima reducida )

Fig. 4.2. El NAD (nicotín-adenín-dinucleótido) actuando como cosustrato en una reacción de oxidorreducción

COO" I OH-NH9 I 2

CH? I

CH 9 I ¿

COOH Glutamato

COO" i c=o I

CH« I 2

CH« I ¿

COOH oe-Cetaglutarato

COOH

C H - N H 9 I 2

Alanina

COOH I C = 0

C H 3

Piruvato

Fig. 4.3. Transferencia de grupos ámino con PPal (fosfato de piridoxal) como cosustrato.

Clasificación de coenzimas

Las coenzimas pueden clasificarse como sigue:

Para la transferencia de grupos distintos del H: Uridina difosfato (UDP) Pirofosfato de Tiamina (TPP) Fosfato de Piridoxal (PPal) Coenzima A (CoA-SH) Acido tetrahidrofólico (TH4) Biotina Coenzimas de cobamida (B12) Acido Lipoico S-Adenosil metionina (S AM)

Para la transferencia de H: NAD+,NADP+

FAD,FMN Acido Lipoico Coenzima Q

Algunos autores clasifican estructuralmente a las coenzimas como: coenzimas nucleotí-dicas y no nucleotídicas. Al primer grupo pertenecen los nucleósidos di y trifosfato que participan en reacciones de transferen­cia como AMPC, AMP, ADP, ATP, S-ade-nosil metionina, NALV, NADP+, FAD y coenzima A. El resto serían las coenzimas no nucleotídicas.

Otra sería la clasificación funcional que las agrupa en coenzimas vitamínicas y no vitamínicas.

4.2.2.2. Grupos prostéticos

Funcionan también como cofactores o co-sustratos enzimáticos pero, a diferencia de las coenzimas, se encuentran firmemente unidos a la apoenzima, ejemplos clásicos de grupos prostéticos son el FAD (flavinade-nin-dinucleótido) y el grupo hemo. En los citocromos, el grupo prostético hemo está unido fuertemente y requiere ácidos fuertes para disociarse del citocromo.

42.23. Complementos

Algunos cofactores enzimáticos no pertene­cen a coenzimas o grupos prostéticos deri­vados de vitaminas sino que representan elementos minerales por ejemplo, la lisina-oxidasa es una enzima que necesita cobre y la anhidrasa carbónica que requiere cinc.

4.2.3. Sitio activo

Una propiedad muy importante de las enzi­mas es su especificidad. Todas las enzimas, por el hecho de ser micelas, son capaces de adsorber moléculas pequeñas en su superfi­

cie, lo cual favorece la interacción de los sustratos y su reacción. Sin embargo, la es­pecificidad reside en una determinada re­gión de la superficie enzimática llamado sitio activo (fig. 4.5).

4.2.3.1. Tipos: Catalíticos, reguladores

El modelo original de sitio catalítico para referirse al sitio activo, propuesto por Émil Fisher en 1894 representaba la interacción sustrato-enzima en términos de la analogía entre llave-cerradura. Sin embargo el mo­delo de Fisher consideraba al sitio catalítico rígido y las proteínas en solución son flexibles

Fig. 4.5. Sitio activo de una enzima. Ajuste inducido por un cambio conformacional en la estructura de la enzima antes y después de la unión del sustrato.

por esto, Koshland en 1967 emitió un modelo del sitio catalítico flexible, al que llamó de ajuste inducido (fig. 4.5). En este modelo, el sustrato induce un cambio conformacional en la estructura terciaria de la proteína enzi-mática como hace la mano en el guante. Este modelo permite también explicar la influencia de otros sitios, llamados reguladores o alos-te'ricos, que modifican la actividad de la en­zima al provocar cambios conformacionales en el sitio catalítico; esto se discutirá más adelante al hablar de efectores alostéricos.

4.2.4. Enzimas oligoméricas e isoenzimas

Existen enzimas que constan de una sola ca­dena polipeptídica integrando un monóme-ro. A este grupo pertenecen la lisozima, ribonucleasa, tripsina y otras.

Otro grupo de enzimas contienen dos o más subunidades asociadas por enlaces no convalentes. A este grupo pertenecen algu­nas enzimas de la glicólisis, las isoenzimas y las enzimas alostéricas (Tabla 4.2).

Las isoenzimas o isozimas son diferentes proteínas con la misma actividad enzimática que se originan en diferentes tejidos y presen­tan un desplazamiento electroforético diferen­te. Las isoenzimas difieren en su composición de aminoácidos por lo que sus diferencias están determinadas genéticamente.

Las isoenzimas más estudiadas por sus aplicaciones clínicas son la deshidrogenasa

láctica, la creatina fosfocinasa y la fosfatasa alcalina. El caso más ilustrativo es el de la deshidrogenasa láctica, enzima tetramérica, que posee dos subunidades distintas: H (de corazón) y M (de músculo). Estas dos subu­nidades se combinan de cinco formas dife­rentes para formar cinco isoenzimas: H4, H3M, H2M2, HM3 y M4 (Fig. 4.6).

La isoenzima M4 predomina en músculo esquelético y en hígado, la izoenzima H4 predomina en miocardio (Tabla 4.3). La dife­rencia cinética entre estas dos isozimas se ex­plica en otros capítulos.

4.2.5. Complejos multienzimáticos

Algunas reacciones requieren de múltiples enzimas asociadas que participan secuen-cialmente para transformar un sustrato, ejemplos de este tipo son la piruvato deshi­drogenasa con un peso molecular de 4.8 mi­llones y la sintetasa de ácidos grasos.

4.3. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

4.3.1. Nombres sistemáticos y nombres triviales

En un principio se designó a las enzimas con nombres triviales según el sitio anatómico

Tabla 4.2 Enzimas oligoméricas

Enzimas Número de

subunidades PM de cada subunidad

peso molecular Total

de procedencia, como la ptialina, la pepsina, tripsina pancreática, etc. Después se les de­nominó añadiendo al nombre del sustrato sobre el que actuaban, el subfíjo asa; así las que hidrolizan el almidón (latín amilum), amilasa, las que hidrolizan las grasas o lípi-dos, lipasas, las que hidrolizan proteínas, proteasas. Más tarde se les dio el nombre según la reacción química catalizada, ejem­plo: deshidrogenaseis, oxidaseis, descarboxi-lasas, adiaseis, esteraseis, etc.

4.3.2. Clasificación digital de las enzimas

En el año de 1961, la Unión Internacional de Bioquímica (UIB) adoptó el sistema de cla­sificación y nomenclatura propuesto por su Comisión de Enzimas (E.C.) basado en el ti­po de reacción química y su mecanismo de acción. Según éste, cada enzima tiene un nú­mero clave de 4 dígitos de manejo interna­

cional, de manera que independientemente del país y el nombre trivial que se le dé en cualquier idioma, la deshidrogenasa alcohó­lica será la enzima E.C. 1.1.1.1.

El primer dígito identifica la clase a la que pertenece la enzima. Las enzimas se clasifi­can en las seis clases siguientes:

1.- Oxidorreductasas; 2.- Transferasas; 3.-Hidrolasas: 4.- Liasas; 5.- Isomerasas: y 6.-Ligasas, el segundo dígito identifica la sub­clase, el tercero la sub-subclase y el cuarto dígito para la enzima específica. El nombre sistemático de la deshidrogenasa alcohólica es alcohol: NAD+.oxidorreduetasa (E.C.l. 1.1.1.) El primer dígito es por ser una oxidorredue­tasa, el segundo porque el dador electrónico es un alcohol, el tercero porque el aceptor es la coenzima NAD+ y el cuarto por el número de orden de la enzima.

1.- Oxidorreductasas.- Estas enzimas ca­talizan reacciones de oxidación y reducción muy importantes en biología. Con frecuen-