AMINOACIDOS Y

PROTEINAS

TECNICATURA EN ANÁLISIS CLÍNICOS

2014

AMINOACIDOS

2014

Es cualquier molecular orgánica que posee por lo menos un grupo carboxilo (un acido orgánico) y un grupo amino (una base orgánica).

Forman a las proteínas.

Existen 20 aminoácidos estándar que forman las proteínas de la mayoría de los organismos.

Fórmula general

Carbono α, es un carbono quiral por lo tanto hay enantiomeros (isomeros ópticos).

Configuración:

Hay dos tipos:

d: dextrarotatorio

L:levorotatorio

Rotan la luz polarizada a la derecha y a la izquierda respectivamente.

L-Alanina D-Alanina

C

COO-

+H3N H

CH3

C

COO-

CH3

NH3+

H

La mayoria de los aminoacidos con actividad biológica son los del tipo “L” (forman parte de las proteínas).

Configuración:

-Para un aminoácido con más de un carbono asimétrico el cambio de configuración del carbono α de L a D da lugar a un diastereoisómero.

CO2

H3N H

CH2CH3

H3C H

CO2

H NH3

CH2CH3

H3C H

L-Isoleucina D-Isoleucina

Clasificación: Según la estructura

aa

NO POLARES

CON N BÁSICO

ALIFÁTICOS

AROMÁTICOS

POLARES SIN CARGA

CON GRUPOS ÁCIDOS

POLARES CON CARGA

No polares

Polares

Ácidos Básico

Aminoácidos alifáticos

Su característica fundamental es la hidrofobicidad de la cadena lateral (con excepción de la glicina (G)

Suelen ocupar el interior de las proteínas globulares, donde contribuyen a la estructura global de la proteína debido al efecto hidrofóbico (“micela proteica”)

Reactividad química muy escasa

COO-

CH3N+H

H

COO-

CH3N+H

CH3

COO-

CH3N+H

CH

H3C CH3

Glicina

Gly, G

Alanina

Ala, A Valina

Val, V

COO-

CH3N+H

CH2

CH

H3C CH3

COO-

CH3N+H

CH

H3C CH2

CH3

Leucina

Leu, L

Isoleucina

Ile, I

COO-

CH3N+H

CH2

COO-

CH3N+H

CH2

OH

COO-

CH3N+H

CH2

NH

Fenilalanina

Phe, F

Tirosina

Tyr, Y

Triptófano

Trp, W

Aminoácidos aromáticos

Función: Interviene en la producción del Colágeno, fundamentalmente en la estructura de la piel y el tejido conectivo y algunos neurotansmisores..

Función: Es un neurotransmisor directo y puede ser muy eficaz en el tratamiento de la depresión, en combinación con otros aminoácidos necesarios.

Función: Está inplicado en el crecimiento y en la producción hormonal, especialmente en la función de las glándulas de secreción adrenal. También interviene en la síntesis de la serotonina, neurohormona involucrada en la relajación y el sueño.

COO-

CH3N+H

CH2OH

COO-

CH3N+H

C OHH

CH3

Serina

Ser, S

Treonina

Thr, T

Hidroxiaminoácidos

Función: Junto con algunos aminoácidos mencionados, interviene en la desintoxicación del organismo, crecimiento muscular, y metabolismo de grasas y ácidos grasos.

Función: Junto con la con la L-Metionina y el ácido L- Aspártico ayuda al hígado en sus funciones generales de desintoxicación.

Tioaminoácidos

COO-

CH3N+H

CH2

SH

COO-

CH3N+H

CH2

CH2

S

CH3

Cisteína

Cys, C

Metionina

Met, M

Función: está implicada en la desintoxicación de los radicales libres. También contribuye a mantener la salud de los cabellos por su elevado contenido de azufre.

Función: Colabora en la síntesis de proteínas y constituye el principal limitante en las proteínas de la dieta. El aminoácido limitante determina el porcentaje de alimento que va a utilizarse a nivel celular.

Prolina

Pro, P

NH2+

COO-

Aminas secundarias (“Iminoácidos”)

Función: Está involucrada también en la producción de colágeno y tiene gran importancia en la reparación y mantenimiento del músculo y huesos.

COO-

CH3N+H

CH2

COO-

COO-

CH3N+H

CH2

CONH2

Ác.Aspártico

Asp, P

Asparragina

Asn, N

Aminoácidos dicarboxílicos y amidas

Función: Es muy importante para la desintoxicación del hígado y su correcto funcionamiento. Se combina con otros aminoácidos formando moléculas capaces de absorber toxinas del torrente sanguíneo.

Función: Interviene específicamente en los procesos metabólicos del Sistema Nervioso Central (SNC).

COO-

CH3N+H

CH2

CH2

CONH2

Glutamina

Gln, Q

Aminoácidos dicarboxílicos y amidas

COO-

CH3N+H

CH2

CH2

COO-

Ác.Glutámico

Glu, E

Función: Tiene gran importancia en el funcionamiento del Sistema Nervioso Central y actúa como estimulante del sistema inmunologico.

Función: Nutriente cerebral e interviene específicamente en la utilización de la glucosa por el cerebro.

COO-

CH3N+H

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

COO-

CH3N+H

CH2

CH2

CH2

NH

C+H2N

NH2

COO-

CH3N+H

CH2

HN

NH+

Lisina

Lys, K

Arginina

Arg, R

Histidina

His, H

Aminoácidos dibásicos

Función: Es uno de los más importantes aminoácidos porque, en asociación con varios aminoácidos más, interviene en diversas funciones, incluyendo el crecimiento, reparación de tejidos, anticuerpos del sistema inmunológico y síntesis de hormonas.

Función: tiene una gran importancia en la producción de la Hormona del Crecimiento, directamente involucrada en el crecimiento de los tejidos y músculos y en el mantenimiento y reparación del sistema inmunologico.

Función: En combinación con la hormona de crecimiento y algunos aminoácidos asociados, contribuyen al crecimiento y reparación de los tejidos con un papel específicamente relacionado con el sistema cardio-vascular.

Los aminoácidos se clasifican como esenciales y no esenciales en la dieta humana; son aminoácidos esenciales aquellos que se requieren en la dieta ya que no se pueden biosintetizar. Los ocho aminoácidos esenciales son:

Clasificación:

Aminoácidos esenciales Aminoácidos no esenciales

Histidina Alanina

Leucina Arginina

Isoleucina Asparagina

Lisina Acido Aspartico

Metionina Cisteína

Fenilalanina Glutamina

Treonina Acido glutámico

Triptofano Glicina

Valina Prolina

Serina

Tirosina

Aminoácidos esenciales

Aminoácidos que el organismo no puede sintetizar y lo tenemos que ingerir en la dieta. Esto quiere decir que nuestro organismo puede sintetizar varios aminoácidos a partir de lo que ingerimos.

isoleucina leucina

lisina metionina

fenilalanina treonina

triptófano valina

Histidina sólo en niños

La fenilalanina no puede metabolizarse para convertirse en tirosina.

Se acumula fenilalanina y sus productos metabólicos en sangre y ciertos tejidos del cuerpo.

Produce: irritabilidad, vómitos, se incrementa el tono muscular. En casos severos puede ocasionar desordenes cerebrales (retardo mental).

Puede ser corregido mediante una dieta controlada.

Prueba de tamiz neonatal

fenilcetonuria

PROTEINAS

2014

En péptidos, polipéptidos y proteínas los aminoácidos se unen unos a otros mediante enlaces amida. El enlace amida entre un grupo amino de una aminoácido y el carboxilo de otro se denomina enlace peptídico.

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NOMENCLATURA

Se nombran desde el extremo N-terminal al C-terminal, usando la terminación il, excepto para el último aa.

Ej: ser-asp-tyr-lis-ala-cys

seril-aspartil-tirosil-lisil-alanil-cysteína

Es un endulcolorante formado por la unión de dos aminoácidos (Acido aspartico y fenilalanina) unidos por enlace peptídico. Es 200 veces mas dulce que el azúcar de caña (sacarosa). Los dos aminoácidos que forman el aspartame se encuentran de manera natural en muchos alimentos como las frutas y verduras.

Aspartame

• Este tipo de edulcolorantes se usa en una gran variedad de productos dietéticas (refrescos, polvos para preparar bebidas, yogurts, chicles, etc). No se ha demostrado algún efecto nocivo sobe la salud.

DEFINICIÓN

Biopolímeros de aminoácidos de mas de 6000 daltons, indispensables para la procesos vitales de los seres vivos.

Están formadas por C, H, O, N y S

FUNCIONES

Por su naturaleza química

SIMPLES

CONJUGADAS

CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEINAS

Por la forma que adopta

FIBROSA

GLOBULAR

Por su función Biológica

ENZIMAS

PROTEÍNAS DE TRANSPORTE

CONTRÁCTILES Y MÓTILES

DE DEFENSA

REGULADORAS

NUTRIENTES

HORMONAS

CLASIFICACION

Las proteínas tienen 4 niveles de organización:

PRIMARIA

SECUNDARIA

TERCIARIA

CUATERNARIA

ESTRUCTURA PRIMARIA

•Hace referencia a: •La identidad de aminoácidos. •La secuencia de aminoácidos. •La cantidad de aminoácidos.

•La variación en un solo aa hace que cambie su función biológica. •Los aa se unen por UNIONES PEPTÍDICAS.

ESTRUCTURA SECUNDARIA

Interacciones entre aa que se encuentran próximos en la cadena.

La cadena no es lineal, adopta formas en el espacio.

Los aa interaccionan por puentes H.

Tipos de estructuras secundarias:

HÉLICE ALFA

HOJA PLEGADA BETA

AL AZAR.

ESTRUCTURA SECUNDARIA

ESTRUCTURA SECUNDARIA

HELICE ALFA

Los grupos R de los aa se orientan hacia el exterior.

Se forman puentes de H entre el C=O de un aa y el NH- de otro que se encuentra a 4 lugares.

Hay 3.6 aa por vuelta.

Ej: queratina.

HOJA PLEGADA BETA

Los grupos R se orientan hacia arriba y abajo alternativamente.

Se establecen puentes H entre C=O y NH- de aa que se encuentran en segmentos diferentes de la cadena.

Ej. Fibroína (seda)

ESTRUCTURA TERCIARIA

Una cadena con estructura secundaria adquiere una determinada disposición en el espacio por interacciones entre aa que se encuentran en sitios alejados de la cadena.

Proteínas globulares: se pliegan como un ovillo.

Proteínas fibrosas: tiene aspecto alargado.

Ej: mioglobina

ESTRUCTURA TERCIARIA

ESTRUCTURA TERCIARIA

ESTRUCTURA CUATERNARIA

Surge de la asociación de varias cadenas con estructuras terciarias.

Intervienen las mismas interacciones que en la estructura terciaria.

Tipos de proteínas según su estructura 3ª

GLOBULARES.- Poseen un alto grado de plegamiento y dan lugar a formas esferoides. FIBROSAS.- El plegamiento de la cadena polipeptídica es menor, por lo que presentan formas alargadas.

PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS

Solubilidad: generalmente las globulares son solubles en agua y las fibrosas no.

Desnaturalización: pérdida de su estructura tridimensional, y por tanto de su función biológica, debido a: presión, temperatura y pH. Desnaturalización reversible e irreversible.

Especifidad: algunas proteínas son exclusivas de ciertas especies, incluso hay pequeñas variaciones entre individuos de la misma especie (una proteína puede tener la misma estructura tridimensional, la misma función y tener una secuencia peptídica ligeramente diferente). Además las enzimas reconocen variaciones tan pequeñas entre dos moléculas distintas como su estereoisomería.

Desnaturalización-Hidrólisis

Desnaturalización de una proteína: pérdida de la conformación nativa y de sus propiedades originales (ej. coagulación por calor de las proteínas de la clara del huevo).

Hidrólisis de una proteína: escisión en aminoácidos (ruptura de un enlace covalente por adición de agua).

Desnaturalización de la ribonucleasa: enzima con puentes disulfuros reducidos y sin actividad enzimática

ANEMIA FALSIFORME

Proteínas plasmáticas

Concentración media: 7.2 g/100 ml

Funciones Principales: •Mantenimiento de la Volemia: factor regulador del intercambio de líquido entre la sangre circulante y el espacio intersticial.

•Capacidad de amortiguar el pH: acción buffer debido a los restos de histidina que pueden ceder o aceptar protones. •Transporte - de sustancias endógenas (hormonas, ácidos grasos,iones). - de sustancias exógenas (antibióticos, drogas, toxinas). •Participación en eventos de coagulación y fibrinólisis

* Participación en eventos de inmunidad (inmunoglobulinas y el sistema del complemento).

Síntesis: • La síntesis de la mayor parte de las proteínas plasmáticas tiene lugar en el hígado

• Los linfocitos B son los responsables de la síntesis de las inmunoglobulinas

Degradación/Pérdidas:

• El catabolismo tiene lugar en muchas células (endoteliales, fagocitos mononucleares, fibroblastos cutáneos)

• Pérdidas por filtración glomerular

• Pérdidas a través de la pared intestinal

Balance proteico

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

FÍSICOS

Absorbancia del enlace peptídico a

190 nm.

Absorbancia de los aminoácidos aromáticos a 280 nm

QUÍMICOS

Reacción de Kjeldahl

Método de Lowry

Reactivo de Biuret

Método de Bradford

Qué relación existe entre Absorbancia y Concentración ?

Sustancia absorbente

Haz emergente (Is) Haz incidente (I0)

Pérdida por reflexión

b

Absorbancia

A = log Io/Is = ε . b . C

ε : Absortividad molar (coeficiente de extinción molar) constante para cada sustancia

b : longitud de la trayectoria (en cm)

C : concentración (en M)

Concentración

Abso

rbanc

ia

Ley de Lambert-Beer

“la reducción de la energía radiante (ABSORBANCIA) de un haz de radiación monocromática es proporcional a la intensidad del haz y a la cantidad de sustancia (CONCENTRACIÓN) absorbente situada en su trayectoria”

MÉTODO DE BRADFORD Fundamento

Para que la concentración de una sustancia pueda ser determinada en base a su propiedad de absorber energía radiante, debe existir una correspondencia lineal entre su concentración y la magnitud de su absorción. La sustancia debe cumplir la ley de Lambert-Beer.

Muestra de Proteínas +

- Coomasie Brillant Blue G-250

- Se une a proteínas por interacciones hidrofóbicas e iónicas - Esta unión estabiliza la forma Aniónica del colorante, produciendo cambio

de color

Reactivo Reactivo Forma catiónica Forma aniónica Marrón claro Azul (465 nm) (595 nm)

ELECTROFORESIS

Soporte:

- Electroforesis en papel - Electroforesis en gel

La velocidad de las moléculas depende de dos factores: - Fuerza ejercida por el campo eléctrico sobre la molécula (importa la

carga) - Resistencia al movimiento o fuerza de fricción (depende de tamaño y

forma de la molécula)

- Polímero inerte - Forma una red porosa y actúa como tamiz

Polimerización de acrilamida y bis-acrilamida.

El porcentaje de acrilamida/bis-acrilamida determina el tamaño de los poros formados y, por lo tanto el rango de separación del gel

Menor porcentaje poro más grande separo proteínas de gran tamaño

Poliacrilamida

Proteínas

Electroforesis Desnaturalizante (SDS-PAGE)

Electroforesis en gel de poliacrilamida

PAGE (polyacrilamide gel electrophoresis)

Nativa Desnaturalizantes

Proteínas se desnaturalizan y se les otorga carga (-), por lo que migran en función de su tamaño

Muestras se desnaturalizan por:

•Calor

•Agente reductor (Beta-mercaptoetanol o DTT): destruye puentes disulfuro

•Sodiododecilsulfato (SDS): detergente que desnaturaliza y se une a las proteínas, otorgándoles carga (-)

Electroforesis Nativa (no desnaturalizante)

Proteínas migran en su conformación nativa, en función

de su carga, tamaño y forma

- una molécula de SDS se une cada 2 aa

- se bloquea la carga propia de la proteína

- queda con carga (-) proporcional a su masa

Electroforesis en gel de poliacrilamida

PAGE (polyacrilamide gel electrophoresis)

Cátodo

Buffer inferior

Ánodo

Aplicación de muestra Buffer superior

Calles o pocillos

Al finalizar, se realiza la tinción de bandas definidas con colorante para proteínas (coomasie blue)

SDS-PAGE

Proteínas migran en función de su tamaño

15 kDa

30 kDa

Electroforesis en gel de poliacrilamida

PAGE (polyacrilamide gel electrophoresis)

Western Blot - Transferencia a filtros

Inmovilización de proteínas sobre membranas sintéticas, seguido de la detección especial de las mismas con anticuerpos.

Trabajar con las proteínas fijadas sobre una membrana tiene diversas ventajas: 1) Son más rápidas de teñir y desteñir; 2) se detectan cantidades menores de proteínas, pues se concentran en la superficie y no se diluyen en todo el espesor del gel; 3) las membranas son mucho más fáciles de manipular que el propio gel.

A. Electroforesis en gel de poliacrilamida

B. Transferencia a membrana (blotting)

Western Blot - Transferencia a filtros

B. Transferencia a membrana (blotting)

1. Inmovilización de proteínas sobre membrana por electrotransferencia

-Tinción de proteínas en la membrana

(rojo Ponceau)

2. Bloqueo de los lugares de unión a proteínas de la membrana (con BSA o leche) para evitar la unión no específica de anticuerpos.

3. Incubación con anticuerpo primario contra la proteína de interés

4. Incubación con anticuerpo secundario contra el anticuerpo primario, unido a marcadores:

5. Revelado de las bandas de proteínas marcadas con el complejo de anticuerpos

- Enzimas: peroxidasa, fosfatasa alcalina

- Átomo radiactivo

gel

(-)

(+)

membrana

- Lavados

- Lavados

5.1 -Enzimas acopladas a los anticuerpos secundarios:

5.2 –Radioquímicos acoplados a los anticuerpos secundarios: