02 fundamentos del analisis farmaceutico.pptx

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Fundamentos del Análisis Farmacéutico

Dr. Leon E. Goity

Facultad de Ciencias Departamento de Ciencias Farmacéuticas

Analítica Farmacéutica

Qué es un análisis químico-‐‑farmacéutico

•  Intenta identificar o cuantificar una o más sustancias en una muestra de interés farmacéutico

•  En el análisis farmacéutico la sustancia o sustancias de interés son normalmente principios activos, excipientes, contaminantes o metabolitos de drogas

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Sustancia a ser identificada o cuantificada

Analito


•  Las muestras en el análisis farmacéutico son generalmente: o  Materias primas o  Productos farmacéuticos terminados o  Muestras biológicas (sangre, orina) o  Alimentos


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Muestra

Uno o varios analitos

Matriz


¿Cuál es el analito?

¿En qué consiste la matriz?


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¿En qué consiste la matriz?


Análisis de iones Análisis bioquímico Análisis de fármacos en plasma

¿Matriz?


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Identificación

Confirmación de la identidad de los analitos

Análisis cualitativo


Cuantificación

Medición de la concentración exacta o la cantidad exacta del analito en la muestra

Análisis cuantitativo


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Paracetamol

Comprimidos de paracetamol 500 mg

Muestra

Ejemplo: En la industria

Se desea controlar el contenido del p.a.

Analito

Excipientes sólidos que conforman la muestra junto con el p.a.

Matriz


•  Procedimientos en el análisis

Muestreo Almacenamiento de la muestra

Preparación de la muestra

Determinaciones analíticas


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•  Muestreo o toma de muestra o  Las muestras deben ser tomadas de forma representativa de

todo el material de donde se tomó, para obtener una imagen correcta del caso en investigación

Se deben establecer estrategias para obtener la mejor representatividad del total


•  Muestreo o toma de muestra

Ej: Producción de un lote de paracetamol


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•  Almacenamiento de la muestra o  Se debe evitar cambios en la composición de la muestra en el período

de muestre y en análisis

o  Si ocurre un cambio en la composición de la muestra el resultado final no va a reflejar la composición original de la muestra

Temperatura controlada Ausencia de luz

Especial cuidado con muestras líquidas


•  Preparación de la muestra o  La preparación de la muestra debe permitir:

•  El análisis en un paso subsecuente •  Que la muestra sea compatible con el método o

instrumento analítico final •  Que el analito este presente en suficiente cantidad

para ser detectado •  Que las sustancias de la matriz que puedan causar

interferencia con el análisis sean removidas


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•  Preparación de la muestra

Comprimidos de paracetamol 500 mg

Muestra

•  Pulverización de los comprimidos •  Disolución de la muestra •  Filtrado


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Preguntas que los métodos de análisis farmacéutico responden

•  ¿Es correcta la identidad de la droga en el producto formulado?

•  ¿Cuál es el porcentaje del contenido declarado del fármaco presente en la formulación?

•  ¿Cuál es la estabilidad de la droga en la formulación y su estabilidad de almacenamiento (shelf-life)

•  ¿A qué razón la droga es liberada de la formulación para ser absorbida?

•  y estabilidad de una sustancia farmacológica en desarrollo?

Preguntas que los métodos de análisis farmacéutico responden

•  ¿La identidad y pureza de los excipientes cumplen las especificaciones para ser empleados en la formulación?

•  ¿Cuál es la concentración de impurezas en la materia prima de la droga?

•  ¿Cuál es la concentración del fármaco en una muestra de tejido o fluido biológico?

•  ¿Cuáles son los valores de pKa, coeficientes de partición, solubilidad

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ICH Intenational Conference on Harmonisation

www.ich.org •  La ICH estandariza los requerimientos para la

regulación de medicamentos en el mundo •  Una de la áreas cubiertas es la estandarización de

la validación de procedimientos analíticos •  La ICH indicó que los procedimientos analíticos que

requieren validación son: o  Ensayos de identidad o  Ensayos cuantitativos para impurezas o  Ensayos de límites para el control del impurezas o  Ensayos cuantitativos para el principio activo en muestras de fármacos o

materias primas u otros componentes en el producto farmacéutico

¿Cómo especificar cantidades y concentraciones?

•  En la mayoría de los casos el análisis cuantitativo es llevado a cabo con el analito en solución o  Concentraciones molares:

•  M •  mM (10-3 M) •  µM (10-6 M) •  nM (10-9 M)

o  Concentraciones de masa por volumen: •  g/mL •  mg/mL •  µg/mL •  ng/mL

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•  En la mayoría de los casos el análisis cuantitativo es llevado a cabo con el analito en solución o  Concentraciones porcentuales:

•  % peso : %p/p •  % volumen : %v/v •  % peso/volumen : %p/v

o  Concentraciones ppm y ppb: •  ppm = (masa del soluto/masa solución) x 106 •  ppb = (masa del soluto/masa solución) x 109

•  En soluciones acuosas à ppm = mg/L

¿Cómo especificar cantidades y concentraciones?

•  Balanza analítica

El análisis farmacéutico se basa siempre en determinaciones exactas de masa de la sustancia o muestra a analizar

La mayoría de las balanzas poseen una capacidad máxima de 100 o 200 g

La sensibilidad de una balanza se define como el incremento de masa más pequeño que puede ser medido

Equipo básico de laboratorio

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•  Revisión complementaria

o  Qué tipo de sustancias no se deben pesar en una balanza analítica

o  Cuál es el correcto procedimiento de pesada en una balanza analítica

o  Qué condiciones debe tener el espacio físico en donde se ubicará una balanza

?


Balanza granataria


o  Cuándo se debe justifica usar balanza analítica y cuando se debe usar una balanza granataria


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•  Pipetas o  Volumétricas (aforadas o de transferencia) o  Graduadas o  Micropipetas


•  Matraz de aforo (volumétrico)


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Menisco

Posición correcta del menisco sobre la marca del calibración

Marca de calibración


•  Bureta o  Posibilita la lectura continua del volumen que es liberado al

recipiente

Banda de Schellbach


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•  Revisión complementaria para los laboratorios

o  Dominar completamente la preparación de soluciones o  Manejo de diluciones y concentraciones


Control de errores en los análisis

•  Para todo análisis cuantitativo debe siempre existir una estimación de cuán propenso es el procedimiento al error

•  El aceptar el resultado puede conducir a el rechazo o aceptación de un producto en la base de un análisis defectuoso

•  Por esta razón es usual realizar mediciones repetidas de la misma muestra para determinar el grado de concordancia entre ellas

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Error •  En todo análisis existirá incerteza asociada con las

medidas debidas a errores mínimos que ocurren en diferentes etapas del procedimiento.

•  El resultado analítico es un estimado del contenido (valor real) de analito en la muestra.

•  Es fundamental reducir las incertezas a mínimo, para asegurar que los resultados son lo más cercano posible al valor real.

Diferencia entre el valor medido y el valor

verdadero

Incertidumbre esperable en una medición o experimento

Error

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•  Tipos de error

Errores sistemáticos (determinados)

Errores aleatorios (indeterminados)

Pueden ser detectados y corregidos Ej: Pipeta mal calibrada

No pueden ser detectados y por lo tanto no pueden ser corregidos Ej: Llenado de pipetas Afectan la precisión de las mediciones

Afectan la exactitud de las mediciones

Errores brutos (gruesos)

Ocurre de forma ocasional por causa de descuido del operador en el procedimiento

Genera valores atípicos

Error

Tipos de error Un lote de comprimidos de paracetamol declaran tener 500 mg de paracetamol por comprimido; se presume que el 100% del contenido declarado es el valor real. Cuatro estudiantes realizan el mismo análisis de manera independiente y obtienen los siguientes porcentajes del contenido declarado en medidaS repetidas (quintuplicado)

Contenido del valor declarado de paracetamol (%)

Analista n1 n2 n3 n4 n5 Promedio

Estudiante 1 99,5 99,9 100,2 99,4 100,5 99,9

Estudiante 2 95,6 96,1 95,2 95,1 96,1 95,6

Estudiante 3 93,5 98,3 92,5 102,5 97,6 96,9

Estudiante 4 94,4 100,2 104,5 97,4 102,1 99,7

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Tipos de error

90 95 100 105

Estudiante 1

Estudiante 2

Estudiante 3

Estudiante 4

Promedio

Promedio

Promedio

Promedio

Porcentaje de la cantidad de parecetamol declarada

Las etapas del análisis han sido controladas de manera adecuada

Error sistemático

Errores aleatorios

•  Error absoluto

! = !! − !! !

•  Error relativo

!! =!! − !!!! ×!100!

Error

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Exactitud y precisión

Exactitud

Precisión

Expresa la cercanía del resultado con el valor real

Indica que tan cercanos los resultados de diferentes medidas son

Desviación estándar

Error absoluto

Exactitud y Precisión

90 95 100 105

Estudiante 1

Estudiante 2

Estudiante 3

Estudiante 4

Promedio

Promedio

Promedio

Promedio

Porcentaje de la cantidad de parecetamol declarada

Exacto y preciso

Preciso pero no exacto

No preciso ni exacto

Exacto pero no preciso

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Alta precisión Pobre exactitud

Alta precisión Alta exactitud

Pobre precisión Alta exactitud

Pobre precisión Pobre exactitud


Estudiante 1

Estudiante 2

Promedio

Promedio

Cantidad de parecetamol (mg)

?

¿Qué ocurre si no sabemos el valor real?

¿Cómo se sabe cuál de los dos estudiantes obtuvo el valor verdadero?

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•  Algunos factores que inducen imprecisión e inexactitud o  Pesaje y transferencia incorrectos de los analitos y los estándares o  Extracción ineficiente del analito desde una matriz o  Uso incorrecto de pipetas, buretas o matraces de aforo para la medida

de un volumen o  Medición inapropiada empleando instrumentos no calibrados o  Falta de uso de blancos analíticos o  Eliminación insuficiente de excipientes que interfieren con el análisis


•  Réplicas

o  Para reportar un resultado se deben considerar múltiples medidas sobre la misma muestra

Expresión de resultados

Necesidad de realizar replicas

El valor central de una serie debería ser más confiable que cualquiera de los resultados

individuales

La variación de los resultados proporciona una medida de la incertidumbre asociada al

resultado central

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Expresión de resultados Distribución Gaussiana

•  Se presume que cuando se realiza una serie de medidas (y) de la misma muestra, éstas se distribuirán en torno a una media (µ) con comportamiento Gaussiano (distribución paramétrica)

•  Prácticamente todos los resultados deben encontrarse a 3σdistancia de la media •  68% dentro de σ distancia a ambos lados de µ (límite de confianza de 68%) •  95 % dentro de 2 σ distancia a ambos lados de µ (límite de confianza de 95%) •  99,7 % dentro de 3 σ distancia a ambos lados de µ (límite de confianza de 99,7%)

•  Para nuestros fines se definirá como: o  µ al promedio de las réplicas o  σ a la desviación estándar (s)


Promedio

Desviación estándar grados de libertad

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Expresión de resultados •  Desviación estándar

Desviación estándar relativa


Estudiante Promedio (% del contenido declarado)

s (% del contenido declarado)

RSD (68% límite de confianza)

1 99,9 0,5 0,5 % 2 95,6 0,5 0,5 % 3 96,9 4,0 4,4 % 4 99,7 4,0 4,0 %

•  La precisión de un análisis se expresa usualmente como ± RSD considerando los límites de confianza empleados en el criterio. Cuando el límite de confianza no se ha especificado se puede asumir un 68%.

•  La ventaja de expresar la precisión de este modo es que elimina unidades

y expresa la precisión como porcentaje de la media

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Estadística de resultados •  Mediana

o  Es el valor central de un conjunto de medidas repetidas o  En una cantidad impar de datos existe una misma cantidad de

datos por sobre y bajo la mediana o  Para una cantidad de datos, se considera la mediana como la

media aritmética de los dos valores centrales

…En distribuciones Gaussianas la media es muy similar o igual a la mediana

•  Intervalo de confianza o  Si se realiza un número infinito de medidas de una muestra y las

medidas no están sujetas a errores sistemáticos, entonces el promedio será igual al valor real (µ) de la muestra y la desviación estándar será igual a la desviación estándar verdadera (σ)

o  Número de replicas es limitado (3 – 6, generalmente) o  Se debe calcular el intervalo (de confianza) en el cual es

probable que el valor real (µ) se encuentre.

Estadística de resultados

valor t según el nivel de confianza

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Estadística de resultados 95% probabilidad que µμ esté en el intervalo de confianza

•  Comparación de promedios con t-Test


Contenido de paracetamol (mg/mL) Muestra 1 Muestra 2 24,02 24,36

¿Son estos resultados diferentes?

…Qué falta saber para responder esta pregunta

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•  Comparación de promedios con t-Test


Desviación estándar

Las desviaciones estándar son pequeñas debido a la precisión del análisis

Las desviaciones estándar son grandes debido a la baja precisión del análisis

•  Para poder comparar se debe realizar un Test-t


Desviación estándar agrupada

t calculado

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•  El valor de t calculado se compara con el valor t de las tablas de Student considerando como grados de libertad: n1 + n2 – 2

•  Si t calculado > t teórico entonces existirá una probabilidad de que los valores de las medidas sean diferentes.

•  La probabilidad dependerá del nivel de confianza seleccionado.

•  Si t calculado es menor o igual a t teórico, entonces las medias no serán significativamente diferentes


•  Exclusión de valores atípicos


Réplica Concentración (mg/mL) 1 24,3 2 23,7 3 24,7 4 32,2 5 23,9 6 24,2 ?

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•  Para evitar tentaciones debemos usar el Test-Q


1º Ordenar los datos

ó



2º Calcular el valor Q

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3º Comparar con Q teórico

Si Q calculado > Q teórico El valor puede ser descartado

Presentación de resultados analíticos

•  Los resultados deben basarse siempre en réplicas •  El resultado debería ser presentado

preferentemente como intervalo de confianza •  De manera alternativa la media puede ser

reportada junto a la desviación estándar •  Cualquier valor atípico debería ser excluido antes

de determinar el resultado. •  El resultado debe ser informado con una correcta

cantidad de dígitos

a > precisión, > cantidad de dígitos

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•  Estrategia para determinar la cantidad de dígitos en un resultado o  Calcular el valor promedio y la desviación estándar o  Anotar el promedio : a x 10n o  Anotar la desviación estándar : b x 10n o  Alinear a sobre b o  Trazar una línea a la derecha del primer dígito distinto a 0 de b o  Remover los dígitos a la derecha de esta línea en a o  Si el primer dígito removido en a y b es ≥ 5, luego el valor es

aproximado


Los resultados deben ser expresado sólo en cifras significativas entregando sólo el primer dígito incierto

•  Estrategia para determinar la cantidad de dígitos en un resultado


Ejemplo

Promedio: 23,3720 mg Desviación estándar: 0,2395 mg

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Los resultados deben ser expresado sólo en cifras significativas entregando sólo el primer dígito incierto


42,25 ± 0,05 mL

Primera cifra incierta

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•  Cifras significativas


25,43 mL 0,02545 L 4 cifras

significativas

Ceros al principio no son significativos, sólo sitúan el punto decimal

Ceros al final pueden como no pueden ser significativos

2,0 L 2000 mL

2,0 x 103 mL


o  Estudiar del texto guía “cifras significativas en los cálculos numéricos”


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•  Pesada por diferencia o  Pesar por diferencia se emplea para minimizar los errores de pesaje en un

procedimiento analítico

•  La muestra se pesa en un recipiente adecuado (Ejemplo navetas de pesar o papel para pesar)

•  La muestra se transfiere inmediatamente al recipiente en el cual se realizará el análisis o se disolverá

•  El recipiente de pesaje se vuelve a pesar y la diferencia entre los pesos antes y después de la transferencia entregará el peso de la muestra.

Algunas terminologías y conceptos atingentes….

•  Fuentes de impurezas en la industria farmacéutica o  Durante la manufactura de las materias primas, impurezas pueden aparecer:

•  Presentes en los reactivos de síntesis •  Resultado de cantidades residuales de intermediarios químicos

empleados en el proceso sintético y de reacciones no deseadas •  Resultado de reactivos, solventes y catalizadores empleados en la

manufactura o  Durante la formulación del medicamento, impurezas pueden ser introducidas:

•  Material particulado de la atmosfera, maquinaria, dispositivos y contenedores utilizados

•  Impurezas presentes en los excipientes •  Contaminación cruzada entre diferentes procesos que emplean el mismo

equipamiento •  Contaminación microbiana •  El fármaco pude reaccionar con algún excipiente •  Impurezas debidas al empaque


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•  Procesos conducentes a la desviación del contenido real del declarado en una formulación o  Mezclado incompleto de un fármaco con los excipientes de una

formulación para ser comprimida o llenada en cápsulas o  Inestabilidad física de la forma famracéutica: Comprimidos que se

desintegran fácilmente, cremas o suspensiones que se separan

o  Descomposición química del fármaco resultando de: su reacción en el aire, agua, luz, empaque o con los excipientes

o  Partición del fármaco en el material de empaque


Algunas terminologías y conceptos atingentes…. •  Análisis y determinación

Análisis

Muestra

Determinación Sustancia que se desea medir o cuantificar

La sangre se analiza, los electrolitos o el colesterol se determinan

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Algunas terminologías y conceptos atingentes…. •  Replicado de muestra y replicado de medición

Replicado de muestra

Asegurar que el resultado es

representativo de la muestra

Replicado de medición

Asegurar que el resultado no es

afectado por errores aleatorios serios

Algunas terminologías y conceptos atingentes…. •  Interferencia

Algunas sustancias pueden interferir en el resultado al contribuir a la respuesta medible

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Algunas terminologías y conceptos atingentes…. •  Muestras ciego (muestras blanco)

Es una muestra que no contiene la sustancia o sustancias a ser determinadas

Sin embargo, contiene todas o la mayor cantidad posible de las otras sustancias presentes en la muestra

…El análisis químico es fundamental en nuestro campo laboral

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