CELIJSKE DEPOZICIJE I INKLUZIJE Molekularne osnove deponovanja (ugljeni hidrati, lipidi, proteini, joni pigmenti).

Mitohondrije, peroksizomi i plastidi: “ metabolicke organele” – poreklo, organizacija, slicnosti. Zasto depozicije i inkluzije? Kada se kaze “depozicije” pod tim pojmom se se podrazumeva

depo neke materije u celiji. Kada se upotrebi pojam “inkluzije” on naglasava da je depozicija u celiji, najcesce, nepririodno stanje ili pak, prolazno/trenutno stanje nefunkcionalnosti deponovanih materija.

Eukarioti- zivotinje- Depozicije se po poreklu mogu podeliti na: • Glikogen (kada se deponuje glukoza) • Lipidna tela (lipidne komponente- najcesce neutralni trigliceridi) • Proteinski kristaloidi (proteini) • Pigmenti • Joni

Osim po poreklu, depozicije i inkluzije mozemo svrstati po njihovoj lokalizaciji u celiji, odnosno njihovo prisustvo se primecuje u citoplazmi i sledecim organelama: • Nukleusu • Mitohondrijama • Peroksizomima • Specificnim vezikulama

Sada cemo ici redom. Celije unose glukozu, unose lipide, imaju metabolicke puteve kojima su u stanju da “sintetisu” depozicije glukoze, lipida i proteina. Glukoza je sutinski za celiju veoma nepozeljan molekul zato sto moze da vrsi glikozilaciju proteina i lipida i time znacajno remeti i strukturu i funkciju osnovnih gradivnih komponenti celije. Sa druge strane, glukoza stravicno remeti osmotski balans/ vodnu homeostazu, tako sto, nasavsi se slobodna u citolplazmi, privlaci velike kolicine vode i moze da dovede do prskanja celije. Dakle, glikozilacija proteina i remecenje vodne homeostaze su nepozeljni efekti glukoze. Zato je i za citav organizam od izuzetnog znacaja odrzavanje glukozne homeostaze. Koncentracija glukoze u nasoj krvi bi trebalo da se krece u okvirnim granicama (3,6-6,1 mmol/l). Koncentraciju glukoze regulisu odredjena tkiva/organi i to su: jetra (kao najznacajniji organ u regulaciji glukozne homeostaze), poprecno-prugasti misici i masno tkivo. To je trijada koja regulise nivo glukoze u krvi, a samim tim u tkivima i celijama. Drugi nivo regulacije odnosi se na ono sto smo vec studirali, a to je tzv. regulatorna endocitoza. Kada smo rekli da sve celije, osim eritrocita, vrlo kontrolisano unose glukozu, sto znaci da depozicije, ako zelite da ih studirate, morate potraziti u celijama jetre, poprecno-prugastih misica i adipocitama. (slika)

U ostalim celijama glukoza se deponuje samo sporadicno i na zahtev …???... tkiva. Primer su hondrocite (to na histologiji). Na slajdu na prethodnoj strani prikazan je presek jetre pacova koji je bio izgladnjivan i pacova koji je bio vise nego dobro ishranjivan, tako da mozete vrlo jasno da uocite razliku u prisustvu tamnoljubicaste boje u hepatocitama, odnosno njihovo odsustvo kod pacova koji je izgladnjivan. S obzirom da je jetra orga koji masivno deponuje glukozu da bi odrzaval homeostazu u krvi i samom organizmu, jasno je da u membrani hepatocita ima najveci broj receptora za insulin i glukozu, koji se sukcesivno smenjuju – kada u nasoj krvi nakon dobrog obroka, nakon velike kolicine ugljenih hidrata, dolazi do lucenja insulina, insulin odlazi do hepatocita, vezuje se za receptore i pokrece se proces unosenja glukoze onim glukoznim transporterimaa o kojima smo govorili i glukoza u ogromnim kolicinama ulazi u celije jetre. tako velika kolicina glukoze ne moze tako ostati, vec se deponuje u formi glikogena koji je karakteristican uglavnom za celije zivotinja. Glikogen se, na nivou SM-ije moze detektovati samo specificnom histohemijskom metodom i ona se naziva PAS metoda (perjodna kiselina + Shiff-ov reagens). PAS metodom se specificno/histohemijski glukoza boji ljubicasto. Kada pogledamo pod EM-om strukturu glikogena, mozemo videti da te oblasti hepatocita obojene PAS-om zapravo sadrze velike kolicine tamnih, crnih granulacija/cestica koje su nareckane po ivici, dakle nisu glikogenske granule, vec su glikogenske cestice, sto je forma deponovanja glikogena. Kada pogledamo molekulsku organizaciju glikogena, mi vidimo da nareckana, nepravilna povrsina koju susrecemo kod glikogenih cestica, zapravo potice od osobine deponovanja glukoze u granate molekulske forme/polimere, koji ujedno zahtevaju templat na osnovu koga se dalje ugradjuje

glukoza. Iz biohemije cete raditi template. To je glikogenin (zeleni protein) koji sadrzi u sebi odredjeni broj glukoznih subjedinica koje su vec povezane, a zatim se na njih nadodaju, odredjenim vezama, sve novi molekuli glikoze. U 3D, dobija se jedan razgranati polimer koji iako u sebi sadrzi prakticno samo glukozu, nije svojim glukoznim subjedinicama u direktnom kontaktu sa vodenom sredinom celije/citosolom, vec je, naprotiv, obavijen/ovijen proteinskim omotacima (ovde su nam prikazani proteini koji ovijaju glikogenu cesticu, samo nekoliko vrsta: plava, zelena i braon, a ima ih znatno vise). Medju tim proteinima omotacima glikogenske cestice nalaze se proteini koji dovode glukozu do glikogene cestice, proteini koji izvlace glukozu iz glikogenih cestica i proteini koji sluze da glikogene cestice vezu za aktinsku filamentoznu mrezu i na taj nacin ih pozicioniraju u odredjenom regionu citoplazme (3 tipa proteina na slici).

Lipidna tela su depozicije mahom neutralnih lipida – triglicerida, kazemo mahom triglicerida zato sto oni cine najveci postotak, ali se mogu naci jos i holesteroli u lipidnim telima. Lipidna tela najbolje studiramo na primeru celija koje su u organizmu specificno zaduzene za deponovanje lipida- adipociti. Histoloski, postoje 2 tipa adipocita. Jedni se nazivaju multilokularnim zato sto sadrze veci broj lipidnih tela u svojoj citoplazmi, to su mrki adipociti (na EM slici levo- mrki adipociti sa vecim brojem lipidnih tela). Kod mrkog adipocita, lipidna tela se razlikuju po velicini. Drugi tip adipoznog tkiva se naziva unilokularno, sto znaci da u svojoj citoplazmi sadrzi, najcesce, jedno veliko lipidno telo, toliko krupno da potiskuje citoplazmu i organele na periferiju celije, tako da je citoplazma svedena na jednu vrstu prstena oko izuzetno krupnog lipidnog tela. Kolicina i broj deponovanih lipidnih tela jako se odrazava na oblik i velicinu celije pa su multilokularni (mrki) adipociti najcesce poligonalne celije 3-4 puta manje od belih adipocita koji su, bukvalno, lopte. Iako cete u literaturi cesto da naidjete na termin lipidne kapi (lipid drops), ja vas molim da koristite termin lipidna tela, zato stone radi ni o kakvim kapima, vec se radi o struktuiranoj cestici u citoplazmi, najcesce, koja ima svoju prepoznatljivu strukturu- jezgro (narandzasto), sastavljeno uglavnom od triglicerida oko koga se nalazi jedan sloj fosfolipida, veoma slican sloju koji smo opisivali kada smo govorili o biomembranama. (slika - adipocit)

Ovo je jedno od poznatijih lipidnih tela. Njegov sastav je u najvecem postotku iz triglicerida, ali osim njih prisutan je i holesterol i to kako u polumembarni/jednom sloju fosfolipida, tako i unutar samog jezgra, pri cemu je holesterol u membrani neesterifikovan, a onaj u jezgru esterifikovan, ali to cete raditi iz biohemije. Izabrala sam nekoliko tipova celija da vam pokazem da iako su adipociti celije onog tkiva koje u organizmu glavno za lipidnu homeostazu, postoje i celije koje sintetisu vrlo specificne forme lipidnih tela. No, prvo da vidimo kako to radi adipocit (vidi sliku gore). U membrani SER-a u adipocitu se sintetisu lipidna tela, sto zanci da se trigliceridi deponuju izmedju dva monosloja membrane SER-a i, deponujuci se, formiraju jednu malu vezikulu koja se usmerava ka citoplazmi, pupi sa membrane SER-a noseci sa sobom jedan sloj i odatle lipidnom telu polumembrana: sta ce to lipidno telo biti, sta ce znaciti za celiju i u kom smeru ce se vrsiti pupljenje lipidne vezikule (buduceg lipidnog tela) zavisi od prisustva specificnog proteina. U slucaju adipocita, prvi protein koji se ugradjuje u tu polumembranu naziva se ADRP ili adipofilin (to su sinonimi). Adipofilin daje smer od SER-a ka citoplazmi adipocita jer se lipidna tela deponuju u citoplazmu ovih celija. Medjutim, adipofilin ne moze da dovede do fuzionisanja sitnih lipidnih tela u sve vece i vece, sto je relativno znacajno kod multilokularnih (mrkih) adipocita, a apsolutno vazno za bele adipocite gde je prisustno jedno veliko lipidno telo. Dakle, mora doci do visestrukih fuzija nasintetisanih i deponovanih lipidnih tela u citoplazmi. ADRP, nazalost, nema sposobnost da izdrzi fuziju sa drugim lipidnim telima i zato se kod adipocita zamenjuje perilipinom. kada se adipocit, koji je diferencirana celija, kada posmatramo ovaj proces, razvija iz svojih prekusorskih celija, vidimo da se u preadipocitima eksprimira adipofilin, a da se kroz program diferencijacije eksprimira/ukljucuje gen za perilipin, a iskljucuje gen za adipofilin. U zrelom/diferenciranom adipocitu adipofilin je zamenjen perilipinom (crveno obojen) koji je u velikoj kolicini prisutan u polumembrani lipidnog tela. Perilipin omogucava fuziju i kod multilokularnog adipocita prisutan je veliki broj po dijametru razlicitih lipidnih tela, a kod unilokularnog (belog) adipocita postoji jedno ogromno lipidno telo. Kako se masne kiseline izvlace iz ove depozicije?

Kao i u slucaju glikogene cestice, u omotacu mora postojati enzim koji ce razlagati supstrat/jezgro lipidnog tela i oslobadjati masne kiseline koje se koriste onda bilo od strane samog adipocita, bilo da ulaze u krvotok i onda se iskoriscavaju od strane svih ostalih celija organizma.U slucaju lipidnih tela enzim koji to radi, lipaza, nije prisutan u omotacu/polumembrani lipidnih tela, vec je uz membranu, subsumembranski pozicionirana gde ceka pozitivan signal. Taj pozitivni signal moze biti hormonske prirode, kakav god da je- to nas sada ne zanima, na nivou adenocita ocitava se tako sto se kao sekundarni glasniknajcesce povisava koncentracija CAMP-a, recimo, kada smo pod stresom, luce se velike kolicine horadrenalina. Horadrenalin ima svoj receptor na membrani adipocita i vezujuci se za njega (adrenergicni receptor) dovodi do povecanja koncentracije CAMP-a i mi u stresu topimo svoje masne rezerve. Kada se povisi koncentracija CAMP-a, aktivira se jedna kinaza koja fosforise hormon-senzitivnu lipazu (da bi se to desilo mora doci nekakav stimulus), tako fosforisan enzim pristupa regionu lipidnog tela, bukvalno ulazi u ovu membranu. Kako, medjutim, hormon-senzitivna lipaza uopste fizicki dopre do jezgra, koje razlaze, kada joj na tom putu fizicki smeta perilipin? Tako sto se istom kinazom kojom se fosforise lipaza, istovremeno fosforise i perilipin. Fosfrolacija perilipina ima za posledicu razmicanje perilipina u polumembrani lipidnog tela i hormon-senzitivne lipaze slobodno pristupa supstratu.

(slika - hepatocit) Drugi primer – drugi tip celije koja sintetise lipidna tela jeste hepatocit. Kazemo “stvara lipidna tela”, zato sto je hepatocit tip celije koja stvara lipidna tela za depozicije u citoplazmi, vrlo slicno adipocitu, ali stvara i lipidna tela za ekskreciju. I hepatocit kao i adipocit, sintetise lipidna tela u membrani RER-a i SER-a koji su u kontinuitetu svojim membranama i cisternama. Trigliceridi, odnosno, neutralno lipidno jezgro se nagomilava, isto kao i u slucaju adipocita, unutar membrane tako da razmice slojeve levo i desno, ali je karakteristicno da se umesto adipofilina ili perilipina u hepatocitu sintetise jedna druga vrsta proteina koja prati polumembranu lipidnog tela, a naziva se APOB. Zasto je to bitno? Zato sto ta druga vrsta lipidnog tela mora da ima suprotan smer od onog koji daje perilipin. Dakle, ako zelite lipidno telo u citoplazmi, sintetisce se perilipin i vezikula ce pupiti ka citoplazmi; ako ne zelite ka citoplazmi, vec ka cisterni ER-a, imacete APOB. APOB se ugradjuje u polumembranu i dovodi do pupljenja lipidnog tela u cisternu ER-a. kada se napuni vecom kolicinom (ovde vam je prikazano samo jedno lipidno telo), sa cisterne SER-a pupi jedna velika, prava, membranska vezikula koja sadrzi veliki broj tih tela i odlazi u kompleks Goldzi. Kompleks Goldzi je organela koja je put lipidnog tela ka ekskreciji, ka spoljasnjoj sredini, jer ce se iz ove vezikule, putem egzocitoze, izluciti ova specificna lipidna tela van celije, odnosno uci ce u cirkulaciju da budu na taj nacin dalje transportovana do ostalih tkiva i organa. Kada se pod EM-om posmatraju razlicita lipidna tela koja se susrecu u hepatocitu, eritrocitu, limfi ili krvi, vidimo da postoji razlika u velicini tih lipidnih tela. Postoje hilomikroni, VLDL, LDL i HDL partikule.

(slika - epitelna celija mlecne zlezde)Treci primer koji se tice lipidnih tela jeste epitelna celija mlecne zlezde. Negde pred kraj trudnoce, pre porodjaja, aktiviraju se zlezdane mlecne celije ili epitelne celije mlecne zlezde, kako vise volite, pod uticajem hormona, odnosno aktiviranjeu gene za buducu sintezu odredjenih komponenti mleka koje ce poceti da se aktivno luci tek nedelju dana (individualno je) nakon porodjaja. Kada pogledamo hemijski sastav mleka videcemo da se u njemu nalaze proteini, voda, joni, tg (koji predstavljaju imunski odgovor bebe), ali ima i lipidnih tela. Ta lipidna tela u mleku bivaju izlucena od strane epitelnih celija mlecne zlezde na vrlo specifican nacin; ne na onaj nacin kojim se koristi hepatocit. Sada cemo opisati sintezu i sekreciju ovako specificnih lipidnih tela. Pocetak price je SER (kao i u prethodnim slucajevima). Dakle epitelne celije mlecne zlezde sintetisu lipidna tela za koja zeli da se nadju u citoplazmi, zato sto mora da ih specificno sekretuje, dakle ne moze da ih ubaci u cisternu i posalje u kompleks Goldzi kao hepatocit – njena funkcija je potpuno drugacija. Ona mora da ugradi polumembranu protein koji kaze: “smer pupljenja ovog lipidnog tela je ka citoplazmi” i ona ce iskoristiti isti protein koji koristi nezreli adipocit – to je ADRP ili adipofilin. U citoplazmi epitelne celije sada imate ogromnu kolicinu izuzetno sitnih lipidnih tela u cijoj membrani se nalazi ADRP. Kako sada da ta celija fuzionise ta sitna lipidna tela da bi dobila jedno krupnije koje ce uputiti ka celijskoj membrani i izvrsiti njegovu sekreciju? S obzirom da se ADRP ne sme zameniti perilipinom, jer bi to za ovo lipidno

telo u ovoj celiji znacilo “STOP u citoplazmi”, ova celija iskoriscava jone kalcijuma koji sluze kao fuzogeni faktor i dovode do, inace nemoguce, fuzije lipidnih tela koja sadrze u svojoj polumembrani adipofilin. Zato je jako bitno, za buduce majke, da unose pred kraj trudnoce velike kolicine kalcijuma. Ako se Ca ne uzima, organizam/mlecna zlezda ce ga potraziti u prvom depou, a to su zubi i kosti. Cak se moze osetiti i bogato iskoriscavanje CA ako ga ne unosimo u dovoljnoj kolicini – grcevi u misicima – to je posledica smanjenja Ca u krv. Dakle, CA joni potpomazu fuziji lipidnih tela i dobija se sve vece i vece lipidno telo koje aktinskim citoskeletom biva gurno ka membrani celije. Aapikalni deo membrane celije, okrenut ka lumenu/kanalicu …???... mora da sadrzi posebne vrste integralnih membranskih proteina i posrednike koji ce omoguciti da kada ovo lipidno telo pridje celijskoj membrani, bude jednostavno prikopcano za celijsku membranu i ovim vrlo specificnim tipom sekrecije zapravo dobijate jednu visemembransku srukturu u mleku (lipidno telo), koje sadrzi triglicerinsko i holesterno jezgro, polumembranu od fosfolipida, ADRP za koji je vezana i ova zelena loptica- ksantin oksidaza je posrednik u vezivanju ADRP-a i butirofilina (crveni stapic, integralni protein). Ovaj specifican nacin sekrecije se naziva apokrini (vise na histologiji) Proteini se u celiji sintetisu na poliribozomima koji mogu biti vezani za membranu ER-a i …???... RER-a ili mogu biti nevezani, znaci, kada se nalaze u okcima aktinske 3D mreze kada ih oznacvamo slobodnim poliribozomima. Proteini se najcesce, bilo strukturni, bilo funkcioni, odmah upucuju ka svom kompartmentu, bilo da je to membrana ili matriks sinteze. Ukoliko, medjutim, dodje do zastoja u nakakvom prirodnom transportnom putu u celiji ili je taj protein trenutno funkciono neaktivan, dolazi do povezivanja proteina, istovrsnih, u prostoru i formiranja jedne vrste kristaloida ili parakristalne resetke koja je tako karakteristicna za proteine. Zato kazemo da se proteini u celiji nalaze kao depozicije ili inkluzije u formi proteinskih kristaloida. Koje su to organele ili kompartmenti celije u kojima susrecemo proteinske kristaloide? Mogu se naci, isto kao i lipidna tela i glikogene cestice, u citoplazmi (slusacete na histologiji o takozvanim Reinke-ovim kristalima koji se nalaze u Lajdigovim celijama testisa), zatim se proteinski kristali mogu naci u cisternama RER-a, nekada su to cak dzinovski kristaloidi, zatim u peroksizomima (gde se cak, potpuno pogresno, oznacavaju kao nukleoid – vise o tome malo kasnije), ili se mogu naci u nukleusu (ovde su najcesce znakovi viralne infekcije, odnosno, sinteze i deponovanja proteina kapsida virusa koji jos nije spreman da napusti celiju domacina, pa proteine za svoje kapside deponuje u nukleusnom matriksu). Sto se tice ostalih depozicija, odnosno inkluzija, mozemo reci da se u celijama depozicija rezidualnih tela tipa lipofuscina moze smatrati inkluzijom, to su staracke pege; u matriksu mitohondrija mozemo uociti nepravilne, tamne cestice koje jako lice na glikogene, ali nisu – to su depozicije kalcijumovih jona i to najcesce u formi kalcijum-fosfata, pa su zato insolubilite?? i vidimo ih kao nareckane cestice, dok su u keratinocitima prirodno, kao depozicija vrsi deponovanje melanina u formi melanozoma. Melanin, kao prirodni pigment, sintetisu posebni tipovi celija u nasoj kozi. To su melanocite. One se nalaze, kada posmatrate epitel koze, u bazi (vidi sliku – mrko obojene celije), odmah uz stratum basale/obavijajuci epitelski sloj. Karakteristicno je da melanocite imaju vrlo nepravilnu formu, odnosno na apikalnom delu, uslovno receno, onom koji je okrenut ka visim slojevima koze sadrze brojke, dugacke evaginacije, takozvane dendrite, kojima zalaze duboko u keratinizirani viseslojni epitel, dakle zalaze izmedju keratinocita sve vise i vise po slojevima nase koze, ne bi li u keratinocitima isporucivali melanin u formi melanozoma. Melanin je jako toksican, osim sto je zastitnik nase koze od svetlosnog zracenja i mora u kerotinocitima biti spakovan u ovakve membranske vezikule koje nastaju …???... se tako sto keratinocit jednom vrstom endocitoze, specificnim tipom, zahvata melaninske cestice iz melanocita i unosi ih u sebe – dakle, jedna vrsta fagocitoze delova druge celije. Na taj nacin dolazi do deponovanja melanina u keratinocitama. Melanin se kao supstancija koja je obojena, kao depozicija pigmenta, susrece jos u CNS-u kod nas u supstanciji nigri i to je takozvani neuromelanin. Neuromelanin je biohemijski jako interesantan zato sto se sintetise na potpuno drugaciji nacin nego u melanocitama. Koliko je melanin toksican govori vam podatak da upravo promena sintetskog programa, nagomilavanje neuromelanina u supstanciji nigri ili oksidativno ostecenje koje dovodi do curenja neuromelanina u okolnu sredinu uzrokuje Parkinsonovu bolest (odumiranje neurona u toj oblasti, pocinje sa tremorom, i nazalost, letalan je ishod). Osim melanina i joni Fe mogu davati crnu/mrku obojenost celijama. S obzirom

da je gvozdje jako znacajno za nas organizam (ono se reciklira iz ostarelih eritrocita, nakon 120 dana zivota, eritrociti odlaze u slezinu gde eritrofagocitozom bivaju unisteni od strane specificnih makrofaga) i toksicno samo po sebi ono odmah mora biti vezano za nekakav protein i na taj nacin inaktivirano. Ta forma, Fe+protein, naziva se feritin i to su vrlo sitne, crne granule, koje se uocavaju kao prasina po citoplazmi makrofaga koji su fagocitirali eritrocite. Njihova citoplazma je ispunjena ogromnom kolicinom sitnih, crnih granula – to je feritin (proteinski kristaloidi u cisterni GER-a). Da li to predstavlja hormonalno, ili mozda, patofiziolosko stanje i zasto se to desava? Prosto ne znam sta da vam odgovorim posto je vrlo tanka linija izmedju hormonalnog i patoloskog stanja. Celija uvek ima neki opseg, neku homeostzu. Ovde je konkretno slucaj ukidanja transporta ka kompleksu Goldzi, zbog necega je taj transport prekinut i ti proteini koji se sintetisu na membranama GER-a, ulaze u cisternu, nemaju kuda dalje i jednostavno tu se deponuju. Ostaju li tako trajno? Nakon ovako masovne depozicije primeceno je da u jednom trenutku celija krene sa transportom. Ono sto ja nigde u literaturi nisam nasla to je kako se sada ti proteini izvlace iz te resetke? Jasno je kako se proteini/polipeptidi ?? pozicioniraju, kada oni naprave strukturni model, da je naprave, ali sta je to sto ih izvuce iz te resetke? …???... odvede dalje, to zaista ne znam. Taj slucaj kristaloida, radicemo malo kasnije. U peroksizomima je slican kristaloidu u GER-u, u cisterni, zato sto se u matriksu peroksizoma deponuju kristaloidi kada ne radi taj protein. Znaci, urat-oksidaza, jednostavno ne funkcionise, i imate formiranje parakristalnog tela i cim dobijete supstrat, tog trenutka pocinje da radi. To mi je, recimo, logicnije jer se odmah kristal rasformira.(slika - polifosfatne granule)Prokarioti mogu deponovati, komparirano sa depozicijama i inkluzijama u celijama zivotinja, glikogene cestice, ali napominjem jako su retke vrste koje ga deponuju. Zatim, mogu deponovati lipidna tela, pri cemu se ovde lipidna tela sintetisu u kojoj membrani? U celiskoj membrani. Protein koji upucuje lipidna tela ka citoplazmi ove celije naziva se fibrilin. Osim lipidnih tela i glikogena, najcesce prokariotske celije deponuju polifosfatne granule. Sto se tice vrst depozicije, mozemo reci da se kod prokariota tilakoidne membrane mogu smatrati nekom vrstom membranskih depozicija u biologiji celije, zato sto se, u slucaju ovakve vrste organizacije prokariotske celije, veliki broj membrana pojavljuje u celiji da bi ti organizmi/te bakterije vrsile fotosintezu. (slika - tilakoidne membrane) Sa citoloske strane gledano, ovo bi bio primer depozicije membrana u celiji. Pre nego sto predjemo na mitohondrije, hloroplaste i peroksizome, sto se tice biljnih celija, pretpostavljam da svi znate da je ono sto je depozicija glukoze u celijama biljaka zapravo skrob – to su skrobna zrna. Ona se privremeno deponuju u hloroplastima u listu, a trajno se deponuju u onim delovima biljke koji su zaduzeni za masivnu depoziciju skroba (krtole). Sto se tice lipidnih tela, i celije biljaka deponuju lipidna tela. Ona se mogu naci u citoplazmi ali i u plastidima u velikoj kolicini i tada govorimo o oleoplastidima (vraticemo se na njih kasnije). kada se deponuju u plastidima, kada nastaju oleoplasti, koristi se protein oleozin, a kada se deponuje u citoplazmi koristi se protein fibrilarin (nemojte ga mesati sa fibrilinom koji je karakteristican za prokariote; znaci fibrilarin i fibrilin). Biljne celije mogu deponovati i proteine u plastidima i to su onda proteoplasti. Dakle:Velike kolicine skroba – AmiloplastiVelike kolicine lipidnih tela – OleoplastiVelike kolicine proteina – ProteoplastiVelike kolicine pigmenata – Hromoplasti, odnosno, cetinari mogu deponovati/ sintetisati jednu vrstu smolastih materija, to su onda Leukoplasti.

MITOHONDRIJEMitohondrije su bile vidjene u XIX veku i opisane su u literaturi prvi put od strane Altmana 1893., koji ih je nazvao bioblastim, zato sto je, posmatrajuci ove organele pod SM-om koji je tada postojao, vrlo ispravno primetio nekoliko cinjenica o mitohondrijama, odnosno primetio je da se radi o strukturama koje menjaju oblik, koje se umnozavaju i koje obojenjem pokazuju dve razlicite faze, odnosno dve razlicite ivice, kako se on izrazio.S obzirom da je njemu bila najupecatljivija osobina ovih struktura da se dele, da se umnozavaju u celiji, on ih je nazvao bioblastima; smatrao je da su to celijski paraziti koji su naselili celiju i zive

i umnozavaju se u njoj sto na neki nacin nije daleko od istine kada znamo pretpostavljeno poreklo mitohondrija (endosimbiozom od bakterija).Drugi publikovani podatak koji se tice ove organele susrecemo vrlo brzo, 1898. godine, odnosno susrecemo Bendino?? podelu ovih struktura. On je posmatrao razlicite celijske tipove i on navodi da ove strukture pod SM-om mozete videti kao fibrile – mitos, ili kao granule/loptice – kondriome, sto je spojeno i nastao je pojam mitohondrija. Da li mi danas pod SM-om mozemo da posmatramo mitohondrije? Naravno da mozemo. Postoje celije u kojima su mitohondrije bogato skoncentrisane i prilicno krupne. Njihov dijametar je 1-1.5 mikrometara, a primeceno je da u nekim tipovima celija mogu da rastu i 2-3 mikrometra. Na slici levo imate prikazano kakomitohondrije izgledaju kada ih posmatrate pod SM-om u hepatocitama. Kada je pronadjen EM-op mitohondrije su pokazale potpuno drugaciju strukturuu odnosu na ono sto se pretpostavljalo. Prvi put se videlo da se radi o celijskim organelama koje su uspostavljene, odnosno struktuirane dvema membranama, koje se respektivno oznacavaju kao spoljasnja i unutrasnja mitohondrijalana membrana za koju je karakteristicno da je naborana, odnosno da ima drasticno uvecanu povrsinu u odnosu na spoljasnju mitohondrijalnu membranu koja je najcesce glatka ili ravna. Unutrasnja membrana zatvara unutrasnjost ili matriks mitohondrije, koji se na EM-opu vidi kao bledo siv, fino granuliran i ponekada se u njemu nalaze granulacije koje su vise tipa cestice – to su oni vec pomenuti, depoi Ca fosfata. Izmedju spoljasnje i unutrasnje membrane nalazi se jedan prostor koji najcesce izgleda svetlo, prazno, koji nije mnogo sirok i koji se naziva intermembranskim ili medjumembranskim prostorom. Na sonovu preseka napravljenih pod EM-om mogu se uociti strukture/profili/oblici koji odgovaraju loptama, odnosno izduzenim strukturama, pa se pretpostavilo da i u slucaju EM-opa mozemo govoriti o mitosu/koncastim mitohondrijama i kondriomama/loptastim mitohondrijama, pri cemu treba imati u vidu da su poprecni preseci ovako izduzenih mitohondrija zapravo kruzici.Dakle, jedna prilicno nesigurna metodologija za utvrdjivanje oblika mitohondrija u celiji. Jos vecu zabunu u klasifikaciji oblika mitohondrija unela je publikacija koja je pokazala da se mitohondrije mogu granati, sto je sve dovelo do razvijanja metodologije kojom mozemo da proniknemo u 3D organizaciju ove organele. Podaci koji su prikupljeni, iz in vitro studija, dakle, gajenja celija u kulturi, specificnim bojenjem mitohondrija da bi se uocila njihova pozicija, pravac pruzanja, velicina i kombinacija sa metodom elektrontomografije, sto znaci da je neko veoma strpljiv seo i sekao celiju od pocetka do zavrsetka, zatim je svaki taj presek (20 nm) posmatrao pod EM-om, uneo u kompijuter i iskoristio softver koji spaja u 3D te preseke da bi se utvrdilo pruzanje i eventualno granatost mitohondrija. (slika)Do cega su nas doveli ti podaci? Do toga da danas govorimo jos i o mitohondrijalnom retikulumu – o vecem broju izduzenih, koncastih, osnovnih mitohondrijalnih profila, sa kojih se pruzaju, privremeno, loptaste ili kratke koncaste strukture i to su oni profili koje vidjamo pod EM-om kao izduzene, elipsoidne i kao kruzice na poprecnim presecima. Mitohondrije su vrlo plasticne organele, po svojoj strukturi, sto znaci da mozemo u prostoru sukcesivno pratiti veoma brzu promenu oblika mitohondrija, odnosno mitohondrijalnog retikuluma.Danas mozemo reci da kada analiziramo svaku celiju naseg tela ponaosob mozemo da razdvojimo nekoliko morfoloskih, odnosno, citoloskih nivoa na kojima posmatramo ove organele. Prvi nivo je da utvrdimo da li postoji strukturni tip, odnosno, da opisemo strukturu ove organele. Istorijski gledano, pronalaskom EM-opa, analizirane su prvo celije zivotinja i celije biljaka, samo kao dva razlicita tipa eukariotske organizacije celije i pronadjeno je da se mitohondrije zivotinja drasticno razlikuju po strukturi od mitohondrija biljaka.( slika -strukturni tipovi)Vidite kako je razlicita organizacija nabora unutrasnje mitohondrijalne membrane. U slucaju zivotinja radilo se o dugackim membranskim grebenima koji su oznaceni kao cristae mitochondriales. U slucaju biljnih celija, te evaginacije/nabori unutrasnje mitohondrijalne membrane, mnogo su vise licile na membranske tubule ili cak, membranske vrecice/vezikule pa je taj tip od strane Palade-a oznacen kao tubulo-vezikularni tip. Dvadeset godina je vladalo misljenje da postoje dva strukturna tipa:1. Takozvane zivotinjske mitohondrije (nepravilno receno) sa kristama mitohondriales i2. Biljni strukturni tip sa tubulo-vezikularnim evaginacijama mitohondrijalne membrane

Medjutim, koriscenjem elektron-tomografije doslo se do potpuno novog uvida u organizaciju ovih nabora, odnosno, postalo je jasno da je strukturni tip samo jedan, da su nabori unutrasnje mitohondrijalne membrane kako god prosireni u prostoru (u unutrasnjosti matriksa, manje ili vise zapravo, jednom porom) jednim malim otvorom u komunikaciji sa intermembranskim prostorom. Dakle, ponisten je model grebena/cristae mitochondriales koji nam govori da je jedna široka površina kojom komunicira prostor unutar tog nabora sa intermembranskim prostorom (kod kriste to je èitava ova dubina/visina; kod tubula, to bi bio jedan krug/ jedna poveæa pora). Pravi strukturni tip mitohondrija bilo da se radi o æeliji životinja, bilo o æeliji biljaka je sredina izmedju ova dva tipa. Komunikacija inter-prostora, unutrašnjih prostora tog nabora sa intermembranskim prostorom je na nivou pojedinaènih pora. Dakle, govorimo ne o strukturnim tipovima, nego o funkcionim tipovima mitohondrija, dakle- prevazilazimo ovaj model organizacije tako što ispitujuæi sve moguæe tipove æelija, i u organizmima životinja i u organizmima biljaka, komparativno posmatramo i njihov broj i njihovu poziciju i njihov oblik i lokalizaciju njihovih krista; želimo da znamo da li u drastièno razlièitim tipovima æelije funkcija tih æelija, odnosno pripadnost tkivu, diktira u kakvu æe se strukturu ona ?? razviti zato što fukncija to zahteva. (slika)Kada krenemo da analiziramo mišiæne æelije (bilo da su popreèno-prugaste ili kardiocite), æelije bubražnih kanaliæa, nervni završeci, masno tkivo, adrenalna žlezda, spermatozoid ili žlezda, zakljuèujemo da zaista u prekusorskim æelijama u tim tkivima, vidimo samo jedan strukturni tip, a od njega se tokom diferencijalnog programa razvija specifièan izgled, dužina, debljina i unutrašnja organizacija mitohondrijalne membrane. Kada govorimo o mitohondrijama kao organelama, sa punim pravom, govorimo o funkcionim tipovima. (slika - funkcioni tipovi)U æelijama životinja, u našim æelijama, možemo primetiti da postoje mitohondrije koje su bile oznaèene kao krista tipovi, danas mi govorimo o ortodoksnoj organizaciji mitohondrija, dakle jedan funkcioni tip je ortodoksna organizacija, kakva se susreæe u npr hepatocitama. Podvarijanta ovakve organizacije, ortodoksne, je kondezovana mitohondrija – mitohondrija koja ima preuvelièanu funkciju, tako da se produkt njene funkcije gomila u intermembranskom prostoru, ne može da napusti spoljašnju mitohondrijsku membranu i samim tim, potiskuje matriks koji postaje tamniji, kondenzovaniji jer je komprimovan?? i zato se ovakav tip oznaèava kao kondenzovana mitohondrija. Vidite da su strelice usmerene od kondenzovane ka ortodoksnoj i od ortodoksne ka kondenzovanoj, što naglašava iako vidino ortodoksnu strukturu u jednom trenutku, dinamizam mitohondrijske populacije je jako veliki; u sledeæem trenutku zbog drugaèije funkcije videæemo je kao kondenzovanu.Mitohondrije su, zapravo, pravi primer organela èija struktura zavisi od funkcije odnosno, funkcija zahteva odredjenu strukturu. Zato mi govorimo o organizaciji – da bi smo izbegli razlièitosti u jednoj jedinoj organeli.Drugi funkcioni tip je tip mitohondrije koja se susreæe u mrkom masnom tkivu, kod mrkih adipocita. Možete videti da su ovde evaginacije unutrašnje mitohondrijske membrane dugaèke i izuzetno brojne i da se ponekad spajaju u prostoru i protežu sa jednog do drugog pola iste mitojhondrije.Treæi funkcioni tip su takozvane nabubrele mitohondrije (obrnuto od kondenzovanih). Ovo su mitohondrije koje su karakteristiène za program umiranja æelije. Inaèe, mitohondrije se smatraju regulatorima života i smrti æelije. Vidite da su nabubrele mitohondrije uveæale svoj volumen, došlo je do smanjivanja i dezorganizacije unutrašnje mitohondrijalne membrane, matriks je postao izrazito svetao, a sve to na raèun ulaska vode u mitohondrijalni matriks. Poslednji funkcioni tip koji sam odabrala jesu tubulo-vezikularne mitohondrije (odnosno, ono što je iniciralo èitavu prièu mukotrpnog, višedeceniskog traganja za pojedinaènim tipovima mitohondrija je bilo otkriæe da i u našem organizmu/ organizmu životinja postoje tubulo-vezikularne mitohondrije, koje su se smatrale biljnim tipom mitohondrija, ali samo u jednom tkivu). Najbolje su proučene steroidogene ćelije naših nadbubrežnih žlezda, koje sintetišu glukokortikoide, ali steroidogene ćeilije se susreću i kao rasejane u okviru polnih organa (Lajdigove ćelije u testisima (testosteron), ćelije …???... ovarijuma (sinteza estrogena, odnosno progesterona)). U tim ćelijama susreće se samo tubulo-vezikularni tip zato što se mitohodnrije ovde posvećuju sintezi prekursora steroidnih hormona.

Jasno je da su pozicija i broj mitohondrija diktirani ćelijskim tipom i trenutnim zahtevom ćelije za produkcijom glavnog mitohondrijalnog produkta, a to je ATP. Do dana današnjeg se najviše vezuje sinteza ATP-a iako mitohondrije mogu da izlučuju signale ćelijske smrti u citoplazmu, tokom programa ćelijskog umiranja, iako se u mitohondriji odigravaju beta oksidacija masnih kiselina i krebsov ciklus, iako se u mitohondriji odigrava sinteza prekusora steroidnih hormona. Produkcija ATP-a je zaista glavna mitohondrijalna funkcija, tako da se mitohondrije svojim brojem i pozicijom udružuju sa onim organelama i citoplazmatičnim strukturama kojima je ATP neophodan.U slučaju mišićnih ćelija, to će biti sarkomere, pa su mitohondrije izmedju sarkomernih nizova.U slučaju kanalića bubrega mitohondrije će biti uz bazu ćelije, odnosno uz duboke invaginacije ćelijske membrane bubrežnih kanalića zato što se tu nalaze pumpe za natrijum i kalijum, tu se vrši rebalans natrijumskih jona, pa je za pumpe potrebna velika količina ATP-a.Mitohondrije su aksonima locirane uz hemijske sinapse; one su spiralne oko flageluma spermatozoida jer je potrebna energija za njegovo kretanje. Mitohondrije su u adipocitima, a naročito u steroidogenim ćelijama udružene sa membranama SER-a i lipidnog tela. U steroidogenim ćelijama tubulo-vezikularne mitohondrije su udružene sa SER-om i lipidnim telom, zato što se u lipidnom telu nalaze substrati za sintezu steroidnih hormona, a medjuprodukti u sintezi steroidnih hormona se fizički prebacuju sa SER-a na mitohondriju i nazad, tako da se često ne može pod EM-om razlučiti gde prestaje da bude spoljašnja mitohondrijalna membrana, a pocinje membrana SER-a.Pre nego krenemo na funkciju, jos malo o strukturi. Dosadasnja prica uglavnom je bila posvecena strukturi/organizaciji unutrasnje mitohondriske membrane. Pod specificnim uslovima na toj, unutrasnjoj mitohondriskoj membrani, ka matriksu mitohondrije uocava se prisustvo brojnih, ciodastih struktura – ATP sintaze – zatim, sitne granule, fina granulisanost, prisutne u velikom broju u mitohondrijskom matriksu su, zapravo, mitoribozomi. Mitohondrije poseduju nekoliko kopija celularne DNK i sa posebnim, prokariotima slicnim, mitoribozomima u stanju su da sintetisu, delimicno nezavisno, proteine za sopstvenu upotrebu. Osim toga, u matriksu, koji je pramenkast, tamnos siv ili svetlo siv u zavisnosti od regiona koji gledate, nalaze se i svi enzimi krebsovog ciklusa i beta oksidacije masnih kiselina. Osim po drasticnoj razlici u izgledu izmedju spoljasnje i unutrasnje mitohondrijalne membrane, one se drasticno razlikuju i po hemijskom sastavu, sto znaci da ne samo da je razlicita kompozicija u lipidima spoljasnje i unutrasnje mitohondrijalne membrane, vec je u mnogome razlika u proteinima.Konkretno: u unutrasnjoj mitohondrijalnoj membrani susrece se kardiolipin, koji je karakteristican za membrane bakterijskih celija i to je jedan od dodatnih podataka koji nam ukazuje da su mitohondrije zaista nastale u celiji kao organele procesom endosimbioze od purpurnih bakterija. U spoljasnjoj membrani se nalazi ogroman broj proteinskih kanala/transportera i cak je neki autori poistovecuju sa onom membranom celijskog zida koja sadrzi ogromne kolicine porina kod G- bakterija. ovde kompozicija, medjutim, dva sloja u spoljasnjoj mitohondrijalnoj membrani uopste nije ista kao kompozicija membrane celijskog zida. Ako se secate, kod G- bakterija dva monosloja su se drasticno razlikovala po hemijskom sastavu. Ovde to nije slucaj. Toliko o strukturi mitohondrija.Struktura nam govori da s obzirom da poseduju molekule DNK, da su delimicno nezavisne od jedarnog genoma, mitohondrije mogu da se dele, kao sto je ta njihova osobina sadrzana u onome „bioblasti“, mitohondrija zaista mogu da uvecavaju broj u celiji tako sto ce se aktivno deliti. (slika)To deljenje mitohondrija moze da ide na dva nacina. Jedan je da ako imate izduzenu, dakle, koncastu ili loptastu mitohondriju, primecujete sukcesvnu konstrukciju negde otprilike na centru i dobijate dve nove, samostalne mitohondrije ili se moze sa postojeceg mitohondrijalnog retikuluma, dakle u celijama koje se gaje u kulturi, mitohondrije se radije organizovane u retikulum, nego u klasicne koncice i loptice, primecuje se da dolazi do odvajanje bocno, dakle, do jedne vrste fisije ili pupljenja i otcepljivanja od majcinskog stabla retikuluma pojedinacnih loptastih ili koncastih mitohondrija. Kada prestane zahtev za njihovom povecanom funkcijom, a mitohondrije se dele i uvecavaju svoj broj zato sto na taj nacin uvecavaju aktivnu radnu povrsinu; Zapazeno je da se one ne unistavaju procesom autofagije, nego se radije vracaju u izvorni retikulum obrnutim procesom – procesom fuzije. Proces fuzije i proces fisije posredovani su

specificnim proteinima koji se nalaze i u spoljasnjoj i u unutrasnjoj mitohondrijskoj membrani (vidite kako oni izgledaju, kako se organizuju da bi doslo do podele, ista ovakva agregacia se vrsi, samo u suprotnom smeru, kada dolazi do fuzije). Mitohondrije poseduju svoj skelet, mitoskelet, koji je organizovan isto onako, iz istih proteina koje smo pominjali kod citoskeleta prokariotske celije, dakle FtsZ, MreB i Mbl proteini. Zasto mitohondrije menjaju svoju strukturu?Zbog svoje funkcije, i mi cemo se bas zbog tog glavnog mitohondrijalnog toka u funkciji, dakle – sinteza ATP-a, posvetiti proucavanju onih ciodastih struktura, odnosno ATP sintazi. (slika)Eksperiment koji je Efraim Reker izvrsio je jedan od prvih primera da se klasicne biohemijske metode kombinuju sa metodima biologije celije. On je rutinskim centrifugiranjem iz homogenizovanog tkiva izolovao mitohondrije, zatim ih je, u epruveti, tretirao …???... koji je doveo do rastvaranja spoljasnje mitohondrijalne membrane koji je zatim, takodje centrifugiranjem, odstranio. Unutrasnja mitohondrijska membrana koja je ostala intakta, zaokruzivala je matriks, je podvrgnuta ultrazvuku, on je dovodio do stvaranja ruptura/rupa u unutrasnjoj mitohondrijskoj membrani. Ultrazvuk je doslovce busio unutrasnju mitohondrijalnu membranu. Na taj nacin stvarali su se veliki komadi unutrasnje mitohondrijske membrane (jer je njena povrsina ogromna i oni su se u epruveti, u rastvoru, odmah, spontano zatvarali u takozvane izvrnute vezikule. „Izvrnute“, zato sto ono sto se nalazilo strukturno okrenuto ka matriksu, sada je u epruveti bivalo okrenuto ka spoljasnjoj sredini. Svaki ovaj korak, dakle, odstranjivanje spoljasnje membrane, stvaranje ruptura na unutrasnjoj membrani, formiranje vezikula, E. Reker je pratio vizuelno, pod EM-om da bi bio siguran da je dobio ciste membranske vezikule koje su po strukturi bile izvrnute. Zasto mu je to bilo znacajno? Njega je zanimalo, s obzirom da je znao da mitohondrija produkuje ATP, koji strukturni domen unutrasnje mitohondrijalne membrane je odgovoran za sintezu ATP-a. On je delovao ureom na izvrnute vezikule cime je izvrsio fizicko razdvajanje ciodastih struktura i golih membrana (vidi sliku). Kada je, nezavisno, pokupio?? supstrate golim vezikulma i ciodastim strukturama, zakljucio je da unutrasnja mitohondrijska membrana sluzi za elektron-transfer, odnosno, da se elektron-transportni lanac nalazi u unutrasnjoj mitohondrijalnoj membrani kao komponenta oksidativne fosforilacije/procesa sinteze ATP-a, a da su ciodaste strukture in vitro razlagale ATP/radile kao ATPaze. Kada je izvrsio rekonstrukciju ovih struktura, odnosno ponovo dobio izvrnute ciodaste vezikule, ponudivsi ponovo supstrate, dobio je u epruveti sintezu ATP-a.Dakle ciodaste strukture su ATP sintaze, a unutrasnja mitohondrijalna membrana vrsi transport elektrona. Dakle, elektron-transpotni lanac i sinteza ATP-a kuplovani su na nivou ATP sintaze (ove ciodaste strukture, videcete iz biohemije, ona ima vrlo kompleksnu strukturu). (slika) ATP sintaza kao svaki intramembranski kompleks, ima svoj membranski deo/domen i domen okrenut ka matriksu (F1). To je zapravo jedna protonska pumpa. Napomena: to sto su sintaze nema veze sa tim da li rade kao ATPaze ili ATP sintetaze. Zasto su sintaze naucite na biohemiji!!! To je jako bitna stvar. Ovo je ATP sintaza kada je u membrani i sintetise ATP, a kada je odvojena od membrane radi kao ATPaza. ATP sintaza, sada govorimo o funkciji sinteze ATP-a kada je ovo jedna ugradjena, ciodasta struktura u unutrasnju mitohondrijsku membranu. Micelova hemiosmotska teorija kaze da tokom elektronskog transportnog lanca dolazi do stvaranja gradijenta protona i taj gradijent protona se iskoriscava da se ti protoni vracaju kroz ovu protonsku pumpu/ATP sintazu, a da se prolaz protona iskoriscava za sintezu ATP-a. Jedino sto je bilo nepoznato nakon otkrivanja ove strukture, bilo je da li se citav ovaj kompleks vrti/rotira u unutrasnjoj mitohondrijalnoj membrani ili je statican. Dugo, dugo se verovalo da je on nepokretan, sto je u suprotnosti sa ovakvim tipom, F-tipom protonske pumpe, koja je izvorno, evolutivno potekla iz flageluma prokariota, koji rotira upravo zahvaljujuci prelasku protona kroz pumpe smestene u bazalnim telima ili prstenovima kod flageluma. Tako da je elegantnim eksperimentom u kom je AF?? zakacen za Fo subjedinicu pokazano da dolazi do rotacije u membrani tokom sinteze ATP-a, sto je citoloski jako interesantno, da ovako glomazan kompleks rotira tokom svoje funkcije.Mitohondrije, posedujuci nekoliko kopija svoje mitohondrijalne DNK su delimicno nezavisne od jedarnog genoma, ali sustinski gledano nema deobe mitohondrija niti njihove pojacane funkcije u celiji bez signala iz jedra. Celija vrlo finim kontrolnim mehanizmima drzi bioblaste pod kontrolom, tu vrstu „parazita“ u celiji. Kohabitacija mitohondrija, evolutivna, sa ostatkom celije,

zapravo je nastala iz vrlo sebicnih razloga izmedju prokariotske celije i eukariotske celije koja je usvojila. Endosimbioza je nastala zbog obostrane zastite i obostrane koristi; za celiju eukariota to je znacilo produkciju ATP-a, ogromnu kolicinu energije, dakle, mogla je dalje da se razvija u membranskom smislu, a za prokariotsku celiju to je znacilo da je zasticena i odbranjena od spoljasnje sredine, pa je kao takva prezivela evolutivne tokove. Ako je, dakle, mitohondrija kao organela, zavisna od jedarnog genoma, taj odnos se najbolje ogleda na nivou proteina. Ako jedro diktira sintezu iRNK koje odlaze u citoplazmu i na citoplazmaticnim ribozomima sintetisu proteine koji su mitohondrijalni proteini, onda je jasno do koje mere je kontrola jedr/celije uspostavljena nad mitohondrijama. Nama ostaje da se sada citoloski pozabavimo na koji nacin ti proteini sintetisani u citoplazmi uopste dodje do mitohondrija i kako prodju njne kompartmente: dve membrane i intermembranski prostor, konkretno ako govorimo o matriksnim proteinima. A jasno je da mitohondrija ima potrebu za proteinima: spoljasnje membrane, intermembranskog prostora, unutrasnje membrane i matriksa, ima mnogo kompartmenata koji traze odredjene proteine da bi mitohondrija mogla da funkcionise. Suma sumarum, ja cu vam samo principijelno objasniti kako dolazi do importa proteina (slika).Svi proteini koji su mitohondrijalni, a sintetisu se u citoplazmi celije, moraju da, najcesce, na N-terminusu sadrze jedan kratak niz AK koji se naziva signalnom sekvencom, tj. mitohondrijalno lokalizujucom sekvencom. Drugim recima, taj niz AK na N-terminusu ili vrlo blizu njega, „priziva“ (odmah po sintezi) proteine pratioce iz sistema saperona koji ne dozvoljavaju tom proteinu da se savije u nativnu konformaciju, nego da ostane u linearnoj formi sto je bitno da bi mogao da prodje kroz mitohondrijalne membrane. Ta serkvenca ima svoje receptore u membrani mitohondrije, prvenstveno spoljasnjoj, tako da kada sekvenca pridje spoljasnjoj membrani mitohondrije, zakaci se za nju i indukuje promenu u proteinskoj organizaciji spoljasnje, a zatim i unutrasnje mitohondrijalne membrane, odnosno – radi se o jednom vrlo slozenom, kaskadnom mehanizmu multimerizacije proteina prvo u spoljasnjoj, a zatim i u unutrasnjoj membrani. Radi se o proteinskim/translokonskim kompleksima koji se oznacavaju kao TOM i TIM. Odnosno, to su translokonski kompleksi spoljasnje, odnosno unutrasnje mitohondrijalne membrane. TOM i TIM kompleksi se nagrade u spoljasnjoj i unutrasnjoj mitohondrijalnoj membrani, spoje u prostoru, sto mi na mikrografijama ocitavamo kao tackastu fuziju membrana i time se formira jedan celoviti, hidrofilni kanalkroz koji prolazi protein. Taj protein zatim „upadne“ u matriks – tu postoje enzimi koji odseku signalni domen (signalne - peptidaze??) i protein se pomocu mitohondrijalnih saperona savije u nativnu konformaciju. Naravno, ovde su jos problemi kako se proteini inseriraju u unutrasnju membranu, kako u spoljasnju, ili kako dospevaju u intermembranski prostor, ali to cete raditi na nekom visem kursu eukariotima??, tako da vas time necu zamarati.

PEROKSIZOMI(slika)Peroksizomi su organele uspostavljene jednom membranom. Na nivou flourescentne mikroskopije kada su obelezeni proteini matriksa, izgledaju kao brojne tacke posute po citoplazmi celije, a kada pogledate EM-iju, na primer hepatocita, sto se zakljucuje po brojnim glikogenim cesticam, vidite da se radi o jednoj membranskoj vezikuli ispunjenoj sivim, pramenkastim materijalom i nema teorije da razlikujete t ood bilo koje druge okolne vezikule koja izgleda sasvim slicno. Dakle, za identifikaciju peroksizoma moraju se koristiti specificne histohemijske metode. Tim specificnim histohemijskim metodama pokazalo se kao i za mitohondrije, da se peroksizomi radije nalaze u peroksizomalnom retikulumu – vezikularnom pulu, tacnije receno: tubulo-retikulo-vezikularna struktura.Zasto „tubulo“ – zato sto konstatuje citav niz, citav set membranskih tubula, zasto „retikulo“zato sto su ti tubuli povezani uzastopno u formi retikuluma/mreze i zasto „vezikulo“ – zato sto se tubuli mestimicno prosiruju u loptaste formacije koje nama izgledaju kao membranske vezikule (sa tubularnim „repicem“; na vezbama cete videti lepu mikrografiju peroksizoma).Postoji proteinski kristaloid, ali samo u peroksizomima koji sadrze urat-oksidazu. To je enzim koji se nalazi u matriksu peroksizoma i koji kada nema supstrat kristalise u takozvani nukleoid,

nepravilno potpuno, jer to nije nukleoid, vec je proteinski kristaloid. Peroksizomi koliko god da su neinteresantni na citoloskom nivou (vezikula sa jednom membranom i sivim matriksom, eventualno kristaloid i to je sve), pokazuju vrlo jasnu razlicitost po funkciji. Za razliku od mitohondrija, koje su imale strahovitu bliskost strukture i funkcije, peroksizomi su pravi primer organela gde na strukturi jednostavno ne mozete primetiti razlike u funkciji. To mozete samo ako analizirate kakvi enzimi sacinjavaju matriks peroksizoma.Sta sadrzi matriks? Sta rade peroksizomi? (slika)U zavisnosti od toga koji organizam ili cak i celiju u nasem telu posmatramo, peroksizom pokazuje razlike u enzimskom sastavu iako, izvorno, ti enzimi vrse jednu vrstu oksidacije. Znaci, peroksizomi su vrlo slicni mitohondrijama po funkciji, posto su evolutivno, cak, slican nacinnastali, iako potpuno razlicito izgledaju. U peroksizomima se odigrava oksidacija alfa-amino kiselina i 8 oksidacija masnih kiselina (beta-oksidacija), pri cemu peroksizomi oksidiraju one teze masne kiseline (duze, granate masne kiseline), za razliku od mitohondrija koje koriste samo one lakse masne kiseline za razgradnju. Tako da se cesto peroksizomi i mitohondrije udruzuju i strukturno i funkciono, odnosno, peroksizomi odrade za mitohondrije onaj prvi deo beta-oksidacije, eliminisu nezgodne delove masnih kiselina i onda ih prebace u mitohondrije, gde se na racun beta oksidacije stvaraju redukovani, oksidisani oblici koji se posle koriste za sintezu ATP-a. To vazi za celije organizama kao sto smo mi, dakle, vidite da se kod zivotinja uglavnom vrsi oksidacija u matriksu, pri cemu se oslobadja jedno jako opasno jedinjenje – vodonik peroksid, zato se i zovu peroksizomi. Vodonik – peroksid se uklanja istog trenutka kada nastane jednim jako brzim enzimom koji se naziva katalaza i koji je marker-protein za peroksizome. Koji god peroksizom da posmatrate, nije bitno sta on radi, on ce uvek sadrzati katalazu u sebi. osim ovih glavnih funkcija, u organizmima zivotinja peroksizomi mogu da sintetisu holesterol, odnosno plazmalogen, sto se cesto zaboravlja.Dalje, kod tripanozoma se glikoliza odigrava u peroksizomima, pa ih zovemo glukozomima; kod kvascaperoksizomi oksidiraju metanol i amine, a kod gljiva je skoro otkriven jedan vrlo neobican zadatak peroksizoma – kod njih je primeceno da nakon ostecenja celije/zida, dolazi do prelaska peroksizoma tom delu i izlucivanja odredjenih materija cime se stvara jedan cep, odnosno – oni imaju ulogu u zaceljivanju mehanickih povreda.U slucaju biljnih tkiva susrecemo dve strukturne forme peroksizoma i to je jedini slucaj da se peroksizomi razlikuju po strukturi. Jedan tip koji potpuno lici na peroksizom zivotinja se nalaze npr. u listovima, a u semenima koja su uljasta, koja sadrze lipidne forme depozicije, se susrecu specijalizovane forme peroksizoma koje se nazivaju glikoksizomi, zato sto mogu da vrse gliksalatni ciklus, odnosno da iz lipida se dobiju ugljeni hidrati, sto nas organizam ne moze. (slika - biogeneza peroksizoma)Sto se tice porekla i biogeneze peroksizoma, tu su stvari jos uvek kontraverzne. Naime, postoje mnogi autori koji jos uvek veruju (kazem namerno „veruju“ jer ne postoje pouzdani naucni dokazi) da su peroksizomi organele nastale na slican nacin kao mitohondrije i plastidi, ali za razliku od njih nisu imali sposobnost da zadrze sopstveni genom, vec su ga ugradili u DNK domacina. Nikakvih konkretnih molekulsko bioloskih i fizioloskih dokaza nema za to. Sto se tice biogeneze, nastanka peroksizoma u jednoj celiji, mozemo reci da tokom deobe majke celije, cerke celije dobijaju od majke nesto ste se zove peroksizomalni pul i da se iz njega, kako celija raste i diferencira se i ima potrebu da peroksizom vrsi odredjenu funkciju, specificnu za to tkivo, onda se matriks tog peroksizoma puni enzimima specificnim za to tkivo. Zato je prisutna takva heterogenost u funkciji, a identicna je struktura organele, ali poreklu u smislu biogeneze (postanka u celiji) dati su od strane Hovikofa i Siha, 1964. godine i oni su vrlo pravilno zapazili da se, kada posmatraju EM-iju celije, peroksizom kao organela uvek pojavljuje u blizini GER-a i SER-a i to upravo u oblasti gde se oni nastavljaju jedan na drugi (gde su njihove membrane i cisterne u kontinuitetu). Nakon veceg prekida (gap-a) u istrazivanju peroksizoma kao organele, tek 1985. Lazarov i saradnici daju pretpostavljenu shemu biogeneze peroksizoma uzimajuci u obzir podatke Hovikofa i Siha, kao i podatke iz oblasti molekularne biologije koji kazu da se proteini iz matriksa peroksizoma sintetisu za polizomima u citoplazmi, sto znaci da se ti proteini na neki nacin moraju provuci kroz membranu i ubaciti u matriks postojeceg peroksizoma. Taj peroksizom raste i kada dovoljno naraste, on se , jednostavno, podeli na dva nova, cime se

uspostavlja dovoljno velika povrsina za rad, koja ce zadovoljiti potrebu celije. Jedino sto su morali da ubace kao jednu pravu pretpostavku bilo ke to kako se proteini provuku kroz membranu, jer 85. godine nije se bas mnogo znalo o transportu kroz biomembrane putem proteinskih kanala. Oni su sasvim lepo pretpostavili, ove crvene linije koje vidite na shemi su, zapravo proteini koji se, kazu oni takodje sintetisu u citoplazmi, ugradjuju u membranu postojeceg peroksizoma i putem njih se ubacuju enzimi. Na koji nacin se vrsi ova takozvana fisija peroksizoma nisu umeli da objasne.Danas znamo da biogenezu peroksizoma mozemo objasniti koristeci i jedne i druge podatke, da se zaista novonastala celija od majke opskrbljuje preperoksizomalnim pulom koji zapravo predstavlja male parazite membranske vezikule, jednu vrstu peroksizomalnih „duhova“, koji se zatim, po potrebi celije, sa odredjenom funkcijom, pune razlicitim setovima enzima. (slika)Danas se zna da celija moze tokom odgovora na odredjenu funkciju menjati setove enzima koje salje u peroksizome, na primer, u jednom trenutku to ce biti samo enzimi koji ce vrsiti beta-oksidaciju, a u drugom trenutku celija ima potrebu da sintetise plazmalogen, pa ce se set enzima brzo zameniti. Podaci kojima danasnje, jos uvek, hipoteze objasnjavaju poreklo/biogenezu peoksizoma na zahtev u celiji koriste puno EM-iju vidi se da postoji profil GER-a koji se nastavlja u jednu tubularnu membransku strukturu za koju se pretpostavlja da ce puniti peroksizom ili dopunjavati njegove membranske profile, jer se danas zna da preperoksizomalni pul obuhvata tubularne i vezikularne membranske profile poreklom od GER-a i SER-a u kontinuitetu, zatim se u toj oblasti prosto nadodaju komponente celijske membrane, odnosno membrane peroksizoma, cime dolazi do uvecanja membrana, zatim se te membrane pune proteinima – u njih inseriraju proteini zaduzeni za transport matriksnih enzima i nakon toga, sintezom matriksnih enzima, dolazi do ulaska proteina/enzima, cime potpuno raste profil peroksizoma, to je onaj tubul koji se prosiruje (zato sto se konstantno puni proteinima); nakon toga dolazi do otkidanja od maticnog kompartmenta i deljenja na dva peroksizoma. Tom podelom peroksizoma, mi u celiji uocavamo, ovakvom vrstom biogeneze dve pojave: jedna je da se uvecava broj peroksizoma i da je ta celija biohemijski funkcionalna po pitanju, recimo oksidacije masnih kiselina.Sta se desava sa peroksizomima kada zavrse svoju funkciju? Desavaju se dve stvari koje ne isklucuju jedna drugu: moze se desiti da, ukoliko peroksizoma ima previse, jedan deo ode autofagijom, a drugi deo gubi svoje matriksne proteine i vraca se u svoj preperoksizomalni pul. Na taj nacin celija je sposobna da kroz cikluse, na zahtev funkcije, kreira/vrsi biogenezu peroksizoma, odnosno da ih povlaci iz citoplazme celije i da ih vraca u preperoksizomalni pol. Ako je ova prica tacna, a sa 90% se moze reci da je tacna, ostaje nam jos da vidimo koji je molekulski sastav unosenja proteina matriks, odnosno enzima peroksizoma, a kao primer uzimamo unos katalaze (na slici na levoj strani). Ono sto je karakteristicno za unosenje proteina u peroksizm, a za razliku od unosenja u mitohondriju, jeste to da peroksizomalni proteini najcesce sekvencu nose na C–terminusu (kod mtn-na ili blizu N–terminusa) i druga vazna razlika je da peroksizomalni proteini poseduju receptor u citoplazmi koji prepoznaje lokalizujucu sekvencu C–terminusa, prikaci se za nju i ta molekularna kompozicija citoplazmatskog receptora i peroksizomalnog proteina (ovde katalaze) dolazi do membrane peroksizoma. (slika)U membrani peroksizoma postoje specificni integralni membranski proteini koji se oznacavaju kao peroksini. Citoplazmatski receptor na jednom svoj kraju prepoznaje peroksine, znaci odigrava se obostrano prepoznavanje, sto indukuje otvaranje (širenje aidrofilne pore/kanala u membrani peroksizoma), èime je omoguceno prolazenje ovog kompleksa i njegov ulaz u matriks peroksizoma. Dospevsi u matriks peroksizoma, ovaj kompleks se razdvaja, znaèi receptor se ponovo vraæa u citoplazmu i ciklus je uspostavljen. Zapamtite, iako je u osnovi mehanizam isti morate imate lokalizujucu sekvencu/lok.niz AK-a, integralne membranske proteine koje formiraju kanal kroz koji taj protein prolazi, u slucaju importa peroksizomalnih proteina imamo lok. Sekvencu na C-terminusu i postoji citoplazmatski receptor koji zajedno sa proteinom ulazi u matriks. Zašto je to tako, nema za sada objašnjenja!Biljke – tu smo veæ dotakli postojanje specifiènih organela koje se nazivaju plastidi. One se cesto uzimaju kao analog mth-a u celijama zivotinja iako se sasvim lepo u biljnoj celiji pored plastida, nalaze i mitohondrije. Postoje nekoliko vrsta plastida (slika).

Postoji mnogo razlicitih kategorizacija plastida na:• Leukoplaste (neobojene)• Hromoplaste (obojene)• Fotosintetske (hloroplasti)• Nefotosintetske.Meni se cini da je najlogicnije da podelu napravimo kombinovano, znaci i po funkciji i po strukturi sto znaci da se hloroplasti npr. Po funkciji svrstavaju u fotosintetske plastide a po strukturi se mogu zvati hromoplastima, jer su obojeni. Svi plastidi, a oni su tkivno specificni (u laticama-hromoplasti, u krtolama deponojuce plastide-amiloplaste, u listovima-hloroplasti), svi poticu od jednog, izvornog oblika koji se naziva proplastid, koji po svojoj strukturi jako lici na malu mth sa redukovanim kristama. Dakle, proplastid poseduje spoljasnju, glatku membranu i unutrasnju membranu koja poseduje nekoliko kratkih evaginacija ka unutrasnjosti koju zatvara i koja se naziva stroma. U zavisnosti od toga ka kom ce tkivu celija otici i u kom ce se smeru diferencirati, videcemo razlicite fomre plastida. Ako celija odlazi ka tkivima koja su deponujuca dobicemo amiloplast. Plastid koji ce u stromi sadrzati veliku kolicinu skrobnih zrna, ili cemo dobiti proteoplast-znatno redji sa velikim brojem proteinskih tela u stromi ili ce biti leukoplasti (borovi/crnogorice) koji su stromi sadrze smolaste materije karakteristicne za cetinare. Ako govorimo o obojenim delovima biljke, onim regionima koji sadrze odredjene pigmente, mozemo zapaziti prisustvo hromoplasta koji u stromi deponuju razlicite pigmente. Najcesce se, medjutim, u citologiju studira i opisuje gradja hloroplasta, fotosintetskog plastida koji je karakteristican za mezofil listova i koji se citoloski razmatra u dve forme. (slika)S obzirom da je fotosintetski plastid, razmatra se gradja zrelog fotosintetskog plastida-hloroplasta i fotosintetskog nezrelog plastida koji se naziva etioplast. Naime, biljku mozete drzati na svetlu a mozete je drzati i u mraku. Taj tretman se zove etiolman. Kada pogledate gradju plastida u listovima takve biljke, pod etiolmanom, primeticete da umosto hloroplasta vidite profile membranskih, dugackih tubula koncentrisanih u centru strome, to je dakle etioplast. Ako biljku ponovo vratimo na svetlo, primeticemo da se etioplasti restruktuiraju I ponovo dobijamo formu hloroplasta (fotosint. zrelog plastida). Hloroplasti se nalaze u listovima biljaka, daju im onu zelenu boju, zbog pristustva hlorofila. Kada histološki pogledamo list, vidimo da æelije mezofila sadrže zelena zrnca. To je zato što su hloroplasti dimenzija do 7 mikro metra, pa se jako lepo vide i pod SM-om. A pod EM-om se najbolje studira i razluèuje organizacija membrana koja je veoma složena, možemo reæi da je ovo primer najsloženije organizacije membrana u živom svetu. Hloroplasti su soèivasti. Postoje glatka spoljašnja i unutrašnja membrana, a unutrašnost koju ta membrana zatvara ispunjava dobro organizovan memb. sistem koji nazivamo sistemom tilakoida. Zapravo, radi se o jako dugaèkim memb. tubulima koji se paralelno postavaljaju u vidu lamela, pri èemu uoèavamo dve vrste tilakoidnih membrana. Jedne su oznaèene kao tilakoidi strome (jako dugaèke memb. tubule, koje se protežu èitavom dužinom hloroplasta), a na njima mestimièno uoèavamo membranske kesice koje su pakovane kao novèiæi u fišeku i te tilakoide nazivamo tilakoidima granuma. Dugo se za njih mislilo da su oni zaista kao novèiæi, da su to nezavisne membranske kesice koje se slaæu jedne na drugu u vis, na tilakoid strome, danas se više, meðutim, govori o ovakvoj organizaciji granuma, dakle, možete primetiti da ono što zovemo memb. kesicom / novèiæem su zapravo, prošireni profili kraj jednog tilakoida strome koji se nastavlja i prikopèava za drugi tilakoid strome. Kada pogledamo molekulsku organizaciju tilakoida možemo videti da su prikopèavajuæe komponente za ove membrane ovi kompleksi koji hvataju sve post.-antena kompleksi i sada kada se vratimo na problem etiolmana / etioplasta, možemo se na nivou citologije zapitati kako je moguæe da ovaj proplastid u listu koji nije osvetljen „dogura“ do ove strukture i tu stane. Tokom diferencijacije ka hloroplastima koja bi trebala da ide u listu, proplastid jednostavno sa unutrašnje membrane odvaja vezikule i memb. tubule (ali potpuno odvaja, te kao u sluèaju mth da one ostaju u formi kristi / tubula), potpuno ih odvaja, u stromi se te memb. vezikule odnosno tubule sada udružuju, daju jako dugaèke memb. tubule koje onda formiraju neku parakristalnu središnju formaciju. Dakle, vidite ovo što lièi na saæe jeste presek kroz te tubule koje su koncetrisane u centru strome ovog etioplasta. Šta je to u svetlu da od etioplasta dovede do formiranja pravih tilakoida strome i granuma? Tokom diferencijacije od proplastida do etioplsasta tu dolazi do ugradnje ATP sintaze, hlorofila,

ugraðuju se molekuli u tu membranu i zato se ona izdužuje i odvaja i kreæe put strome i tu odjednom staje (jer ste ugradaili ove komponente: ljubièastu, zezelnu, crvenu, ali fale antena kompleksi). Antena kompleksi æe se sintetisati i ugraditi u membrane samo kada imate podsticaj u vidu svetlosti. Funkcija hloroplasta: S obzirom da su fotosintetske organele, to znaèi da sunèevu energiju iskorišæavaju za sintezu ATP-a, odnosno sintezu glukoze. Glukoza se prevodi u skrob vrlo kratkotrajno u stromi, to je tokom dana, a onda se noæu skrob razlaže i šalje dalje do organa koji su zaduženi za depoziciju skroba. Primeæujete i da u membrani tilakoida postoje ATP sintaze. One su potpuno indentièno organizovane kao ATP sintaze u MTH-a i postoji e- - transportni lanac. Tu, naravno, postoje i hlorofili i obojeni molekuli i još neki drugi. Osim što postoji ovako složen sistem tilakoidnih membrana u stromi se može uoèiti prisustvo plastoskeleta. Plastoskelet je analog bakterijskog citoskeleta o kome smo prièali. u stromi se nalazi cirkularna DNK i plastoribozomi koji su slièniji prokariotskim nego eukariotskim, po sedimentacionoj konstanti. Hloroplasti mogu da se dele, èime se njihov broj uveæava i naravno u stromi postoje brojni proteini, zato se dobija ovako homogeno-siva boja strome. Što se tièe peroksizoma biljaka postoje „dve vrste“, radi se zapravo o dva razlièita tkiva u biljnom organizmu (slik).Jedan tip peroksizoma koji se naziva ortodoksni se susreæe u listu. On je veštaèki zacrnjen na ovoj mikrografiji zato što je primenjena histo-hem. metoda dokazivanja peroksidaze, pa je ponuðen supstrat-diaminobenzilin i vodonik peroksid tako da se dobila nerazstvorna crna materija. Inaèe matriks peroksizoma u listu je siv, homogeno kao u æel.životinja i èak se èeto uoèava kristaloid. Ono što možete primetiti jeste to da se peroksizom u listu kombinuje, strukturno i funkciono, sa druge dve organele, hloroplastom i mth, jer su ove tri organele funkciono povetzane. Drugi tip peroksizoma susreæe se u semenima bogatim lipidnim depozicijama (uljanim semenima). U njima se nalazi forma peroksizoma koja se naziva glioksizom, to su ovi crni profili. Ovako neobièno izgledaju kao da proždiru region gde se nalaze lipidne komponente, zato što je voo peroksizom koji se posmatra u aktiviranom semenu, koja se sprema da daje biljne organe. Inaèe bismo ih uoèavali kao lotpice u neaktiviranom semenu. Glioksizomu su dobili taj naziv zato što se u njima odigrava glioksilatni ciklus u kome se iz lipida dobijaju šeæeri. Naši peroksizomi to ne mogu da rade.-