histopatološke promene bubrega kod pacova soja wistar ... · namenjeni zaštiti ekonomski zna...

Click here to load reader

Post on 13-Oct-2019

1 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • UNIVERZITET U NIŠU

    PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

    Ana Lj. Petrović

    Histopatološke promene bubrega kod pacova soja Wistar tretiranih pesticidom Fastac 10 EC

    Master rad

    Niš, 2014.

  • UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

    DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

    Histopatološke promene bubrega kod pacova soja Wistar tretiranih pesticidom Fastac 10 EC

    Master rad

    Kandidat: Mentor: Ana Lj. Petrović 64 doc. dr Ljubiša B. Đorđević

    Niš, April, 2014

  • UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

    Histopathological changes in the kidney in Wistar rats treated with pesticides Fastac 10 EC

    Master thesis

    Candidate Mentor Ana Lj.Petrović 64 doc. dr Ljubiša B. Đorđević

    Niš, April, 2014.

  • Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Ljubiši Đorđeviću

    na razumevanju i nesebičnoj pomoći, koju mi je pružio prilikom izrade ovog

    master rada.

    Zahvaljujem se asistentici Mileni Aleksić na pomoći u realizaciji

    eksperimentalnog dela rada. Takođe veliku zahvalnost dugujem Tanji, Vesni

    i Vladi, zaposlenima u Vivarijumu Medicinskog fakulteta u Nišu, koji su

    pomogli u radu sa eksperimentalnim životinjama.

    Najveću zahvalnost dugujem svojoj majci koja mi je pružila veliku i

    neizmernu ljubav, podršku i razumevanje tokom studiranja. Kao i svim

    prijateljima koji su bili uz mene sve ovo vreme.

    Ovaj rad, kao i sve što sam postigla, dugujem osobi koja je čvrsto

    verovala u mene svih ovih godina. Osobi koja je bila moja snaga i uzor i u

    čiju čast ću i na dalje da sledim svoje ideale, a znam da bi danas bio

    ponosan na mene da je tu sa nama!

    Hvala ti, tata!

  • Sažetak

    Cilj ovog rada bio je ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida Fastac 10 EC

    na bubreg kod pacova soja Wistar. Fastac je insekticid sa kontaktnim i digestivnim

    delovanjem, čija je aktivna materija alfa-cipermetrin. Životinje su pesticidom tretirane

    oralno, putem sonde, u koncentraciji 1,2 µl/dnevno u periodu 7 i 14 dana u konstantnim

    uslovima. U tretmanu od 7 i 14 dana došlo je do povećanja telesne mase životinja. Kod

    tretiranih životinja u periodu od 7 i 14 dana izlaganje Fastac-u dovodi do smanjenja mase

    bubrega. Histološki na bubregu posle 7 dana nastaju prvi znaci toksičnog delovanja, koji

    se ogledaju u promeni izgleda bubrežnih kanalića. Posle 14 dana tretmana na bubregu se

    uočavaju drastične histološke promene, koje se ogledaju u degenerativnim promenama

    glomerula i bubrežnih tubula. Istraživanje je pokazalo da su priroda i intenzitet toksičnih

    simptoma proizvedenih delovanjem pesticida Fastac 10 EC vremenski zavisni.

    Ključne reči: Fastac 10 EC; alfa-cipermetrin; bubreg; Wistar pacovi;

  • Abstract

    The aim of this study was to investigate the influence of given concentrations of

    pesticides Fastac 10 EC of the kidney in Wistar rats. Fastac is an insecticide with contact

    and digestive action, whose active ingredient is alpha - cypermehrin. The animals were

    orally treated with the pesticide, by gavage, at a concentration of 1,2 µl/day over 7 and 14

    days in constant conditions. In the treatment of 7 and 14 days, there was an increase in

    body weight of the animal. In the treated animals over a period of 7 and 14 days,

    exposure of Fastac leads to a reduction in mass of the kidney. Histologicaly, on the

    kidney after 7 days occured the first signs of toxic effects, which are reflected in changes

    in appereance of renal tubules. After 14 days of treatment in the kidney is observed

    drastic histological changes, which are reflected in degenerative changes in glomerul and

    renal tubules. Research has shown that the nature and intensity of the toxic symptoms

    produced by the action of the pesticides FASTAC 10 EC, weather dependent.

    Keywords: Fastac 10 EC; alpha-cypermethrin; kidney; Wistar rats

  • Sadržaj 1.Uvod ........................................................................................................................... 1 1.1. Toksičnost pesticida .............................................................................................. 1 1.2. FASTAC................................................................................................................ 3 1.2.1. Hemijski sastav ............................................................................................... 4 1.2.2. Delovanje i upotreba ....................................................................................... 5 1.2.2.1.Delovanje................................................................................................ 5 1.2.2.2.Upotreba...........................................................................................................6 1.2.3.Dosadašnja istraživanja FASTAC-a................................................................ 6 1.3. Bubreg- građa i funkcija....................................................................................... 7 1.4. Nefrotoksičnost................................................................................................... 10

    2. Cilj rada .................................................................................................................11

    3. Materijal i metode .......................................................................................... 12 3.1. Materijal ............................................................................................................... 12 3.2. Metode............................................................................................................................. 12 3.2.1. Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima......................... 12 3.2.2. Priprema tkiva................................................................................................. 13 3.2.2.3. Fiksacija tkiva-funkcija.......................................................................... 14 3.2.2.4. Kalupljenje tkiva.................................................................................... 14 3.2.2.5. Sečenje tkiva.......................................................................................... 15 3.2.2.6. Bojenje................................................................................................... 16 3.2.2.6.1. Hematoksilin- eozin (H&E) metoda.......................................... 16

    4. Rezultati i diskusija ....................................................................................... 18 4.1. Ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida na bubreg pacova u periodu od 7 dana............................................................................................. 19 4.2. Ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida na bubreg pacova u periodu od 14 dana............................................................................................22

    5. Zaključak ............................................................................................................ 24

    6. Literatura ............................................................................................................ 25

  • 1

    1. Uvod

    Delovanje otrova na žive organizme proučava toksikologija. Toksikologija (od

    grčkih reči toksikon i logos) je nauka o nepovoljnim uticajima hemikalija na žive

    organizme. Ona proučava simptome, mehanizme, lečenje i otkrivanje biološkog trovanja

    — posebno trovanja ljudi. Glavni kriterijum toksičnosti hemikalije je doza, tj. stepen

    izlaganja supstanci (Amdur et al.,1993).

    1.1. Toksičnost pesticida

    Dejstvo otrova na organizam predstavlja interakciju otrova sa hemijskom i

    morfološkom građom organizma na molekularnom, ćelijskom, tkivnom i organskom

    nivou. Otrov je bilo koja supstanca koja uneta u organizam u određenoj količini i pod

    određenim uslovima izaziva strukturne ili funkcionalne poremećaje organizma i

    eventualno smrt.

    Ispitivanja na životinjama obuhvataju četiri osnovna testa toksičnosti koji se

    međusobno razlikuju prvenstveno po trajanju:

    (1) test akutne toksičnosti- dovoljna je jedna jedina doza uneta odjednom ili kao

    podeljena u periodu od najviše 24h.

    (2) test subakutne toksičnosti - ponovljena ekspozicija supstanci bar jednom dnevno u

    toku nekoliko, 14 ili 28 dana.

    (3) test subhronične toksičnosti. nastavljanje ogleda u trajanju od 30 do 90 dana.

    (4) testom hronične toksičnosti- svakodnevno unošenje supstanci u hrani (ili na neki

    drugi način) u toku više meseci jedne, dve ili više godina.

    Toksičnost je prvenstveno određena hemijskim sastavom pesticida. Pod

    pesticidima podrazumevamo proizvode hemijskog ili biološkog porekla, koji su

    namenjeni zaštiti ekonomski značajnih biljaka i životinja od korova, bolesti, štetnih

    insekata, grinja i drugih štetnih organizama. Većina pesticida (među njima i

    organohlorni) poseduju izrazitu sposobnost koncentrovanja i ispoljavaju aktivno biološko

    dejstvo na toplokrvne životinje (Stajkovac i saradnici, 2009).

  • 2

    U odnosu na štetne organizme, pesticidi se dele na tri osnovne grupe:

    • herbicidi – namenjeni za suzbijanje zeljastih i drvenastih korova, algi, mahovina,

    lišajeva i parazitnih cvetnica,

    • fungicidi – namenjeni za suzbijanje gljiva prouzrokovača biljnih bolesti

    • insekticidi – namenjeni za suzbijanje štetnih insekata,

    a kasnije su se razvile i podgrupe:

    • rodenticidi –suzbijanje glodara

    • akaricidi - suzbijanje grinja

    • nematocidi - suzbijanje valjkastih crva

    • moluskocidi - suzbijanje mekušaca: puževa

    • algicidi – suzbijanje algi

    • antihelmintici - suzbijanje glista

    • arboricidi - uništavanje drvenastih korova

    • atraktanti - sredstva koja privlače štetne insekte

    • defolijanti - izazivanje prevremenog opadanja lišća

    • desikanti - izazivanje uvenuća i sušenja biljaka

    • fumiganti – sredstva koja deluju gasnom fazom

    • hemosterilizanti – utiču na sterilitet imaga

    • repelenti – sredstva koja odbijaju štetne organizme od gajene biljke

    • regulatori rasta biljaka

    (http://www.agromarket.rs/srb/38/39/Zastita-bilja/Vise-o-Pesticidima)

  • 3

    1.2. FASTAC

    FASTAC ( u prevodu od engleske reči fast- brz, i tac- dodir ili dovoljno je samo

    da se ostvari kontakt i da insekt padne sa biljke) je insekticid sa kontaktnim i digestivnim

    delovanjem(http://www.agro.basf.rs/agroportal/rs/media/migrated/basf_bro_ure_2013/fl

    ajeri_2013/Fastac_2013.pdf). Ovo je značajna osobina kada se želi brzo sprečavanje

    oštećenja od insekata. Zbog izuzetne stabilnosti i otpornosti na spiranje kišom, Fastac 10-

    EC ostvaruje dugo insekticidno dejstvo. Zbog toga je Fastac 10 EC registrovan u velikom

    broju zemalja za suzbijanje širokog spektra štetočina koje sišu i grickaju useve. Fastac je

    visoko efikasan insekticid širokog spektra sa veoma brzim delovanjem u vrlo niskim

    dozama ( http://www.stovet.rs/vocarstvo/pesticidi/insekticidi/?prod_id=100000300565).

    Razlozi i prednosti upotrebe Fastac-a:

    • Fastac 10 EC je efikasan protiv većine ekonomski značajnih štetočina

    • Suzbija sve razvojne stadijume insekata

    • Uspešan protiv insekata rezistentnih na druge insekticide

    • Ispoljava repelentno i “anti-feeding” delovanje

    • Upotrebljava se u velikom broju raznovrsnih useva

    • Ne ispoljava fitotoksičnost u preporučenim dozama

    • Duže deluje nego klasični insekticidi

    • Visoko otporan na spiranje kišom

    • Niske doze umanjuju zagađenost okoline

    • Neznatno opasan za vrste koje nisu objekat tretiranja

    (http://www.agro.basf.rs/agroportal/rs/media/migrated/basf_bro_ure_2012/Jabuka_katalog2.pdf )

  • 4

    1.2.1. Hemijski sastav

    Fastac 10 EC je formulisan u obliku tečnog koncentrata za emulziju (EC) koja

    sadrži 100 g/l aktivne materije alfa-cipermetrina (Slika 1). Sadržaj aktivne materije:

    100g/l +/- 10% alfa- cipermetrina (tehnička čistoća minimum 90%). Ovo jedinjenje se

    smatra najaktivnijim piretroidom.

    Piretroidi su klasa organskih molekula, sintetskih analoga prirodnog piretrina,

    molekula izolovanog iz cveta biljke buhač (Chrysanthemum coccineum) koji uspeva na

    prostorima bivše Jugoslavije, u Dalmaciji i na Crnogorskom primorju

    (http://duochem.rs/insekticidi.html). U cvetu ove biljke nalaze se dve vrste piretrina koji

    su poznati kao piretrin 1 i piretrin 2 kao i cinerin 1 i cinerin 2. Piretrini su kontaktni

    otrovi koji deluju preko površine tela parazita. Kada prodru preko kutikule ili hitina

    vezuju se za ćelije nervnog sistema, oštećuju ih i nastaje paraliza parazita

    (http://vettehpet.wordpress.com/2012/03/19/ektoantiparazitici-najvazniji-predstavnici/).

    U ljudskom organizmu piretrini se slabo apsorbiraju u probavnom i disajnom

    traktu, tako što se brzo i dobro apsorbiraju iz probavnog trakta, dok je apsorpcija kroz

    kožu sporija. Brzo se metabolizuju reakcijama hidrolize i oksidacije i ne nakupljaju se

    znatnije u tkivima. Izlučuju se uglavnom urinom (Macan J., et al, 2006).

    Piretroidi su sintetska jedinjenja koja su sintetisana na bazi piretrina, ali su znatno

    efikasniji zato što im je otpornost prema svetlu veća pa se teško razlažu, a dejstvo im se

    produžava (http://vettehpet.wordpress.com/2012/03/19/ektoantiparazitici-najvazniji-

    predstavnici/). Piretroidi su takođe kontaktni otrovi sa brzim paralitičkim dejstvom, kome

    prethodi povećana mišićna razdražljivost i konvulzije parazita. Paralitički efekat piretrina

    brzo nastaje, ali postoji mogućnost da se neki insekti posle dejstva mogu oporaviti.

    (http://www.vet.bg.ac.rs/~farmakologija/Predavanja%20i%20vezbe/Predavanja/Predavanja%20Prof.%20

    Trailovic%20TOKS/Trovanja%20piretroidima.pdf ).

    Aktivna materija alfa-cipermetrin je lipofilna, što znači da ostvaruje neposredni

    kontakt za voštanim materijama kutikule biljaka, kao i regulatorom rasta biljaka.

    (http://www.agrosava.com/proizvodi/insekticidi/Fastac/detaljnije-o proizvodu.html).

  • 5

    Slika 1. Strukturna formula alfa- cipermetrina

    (http://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/structure/24.jpg)

    1.2.2. Delovanje i upotreba

    1.2.2.1. Delovanje

    Fastac 10 EC ima izraženo dejstvo na odrasle insekte i larve, ali poseduje i

    značajno delovanje na jaja sa tankom opnom. Fastac 10 EC u višim koncentracijama

    deluje repelentno (odbijajuće) na štetočine, a u manjim količinama izaziva "anti -

    feeding" efekat, odnosno insekti smanjuju ishranu. Pošto je aktivna supstanca

    FASTAC-a piretroid, on deluje tako da blokira transport Na jona kroz membranu

    nervnih ćelija pa je onemogućen prenos nervnih impulsa (deluju na permabilnost

    nervnih membrana). Što dovodi do nekordinisanih pokreta pri čemu nastaje paraliza,

    a nakon toga dolazi do uginuća. Vrlo je otrovan za insekte, a takođe uništava sintezu

    ATP-a kod vodenih organizama. Dok je za toplokrvne životinje slabo otrovan.

  • 6

    1.2.2.2. Upotreba

    Fastac EC 10 ima upotrebu u zasadu jabuke, za suzbijanje jabukinog smotavca

    (Cydia/Laspeyresia/Carpocapsa pomonella), u koncentraciji 0,015-0,018%, odnosno

    1,5-1,8 ml u 10 l vode. U zasadu kruške za suzbijanje obične kruškine buve (Psylla

    piri), u koncentraciji 0,018-0,02% , odnosno 1,8-2 ml u 10 l vode. U zasadu breskve,

    za suzbijanje breskvinog smotavca (Cydia/Laspeyresia/molesta), u koncentraciji

    0,012-0,015%, odnosno 1,2-1,5 ml u 10 l vode. U usevu kupusa, za suzbijanje

    kupusovog moljca (Plutella maculipennis), u količini 0,08-0,12 l/ha, odnosno 0,8-1,2

    ml na 100 m². Na ukrasnom bilju: u staklarama, za suzbijanje bele mušice leptiraste

    vaši (Trialeurodes vaporarium), u koncentraciji 0,02-0,025%, odnosno 2-2,5 ml na

    100 m². U polju, za suzbijanje tripsa (Thrips sp.) u koncentraciji 0,012-0,018%,

    odnosno 1,2-1,8 ml na 100 m².

    1.2.3. Dosadašnja istraživanja FASTAC-a

    FASTAC kao insekticid, ima izraženo dejstvo na odrasle insekte i larve, ali

    poseduje i značajno delovanje na jaja sa tankom opnom. Spektar delovanja FASTAC-a

    određuje njegova aktivnost prema mastima insekata. Iz ovih razloga ciljni insekti su

    gusenice Lepidoptera i larve Diptera, prema kojima on ima prednost u odnosu na druge

    insekticide (http://www.agrosava.com/proizvodi/insekticidi/Fastac/detaljnije-o-proizvodu.html).

    Studija je pokazala da je priroda i intenzitet toksičnih simptoma, proizvedenih od

    cipermetrina, da su dozno i vremeski zavisna. Ispitivanja na životinjama su pokazala da:

    akutna izloženost utiče na aktivnost centralnog nervnog sistema, dolazi do povećanja

    telesne mase životinja. Manja doza dovodi do smanjenja relativne težine bubrega u

    obimu, dok kod veće doze dolazi do blagog krvarenja, sakupljanja glomerula i nekroze

    bubrežnih tubula. Nema podataka o dugoročnoj toksičnosti, reproduktivne toksičnosti,

    kancerogenosti (Grewal K.K. et.al, 2010)

  • 7

    1.3. Bubreg- građa i funkcija

    Bubrezi ( lat: ren; gr: νεφρό, nephro ) su parni organi, koji predstavljaju centralni

    deo urinarnog sistema. Smešteni su u retroperitonealnom prostoru na zadnjem zidu

    abdomena, i nalaze se sa obe strane kičmenog stuba (u visini 12. grudnog i 1. i 2.

    slabinskog pršljena). Desni bubreg, potisnut jetrom, postavljen je malo niže u odnosu na

    levi. Bubreg je spreda pokriven parijetalnim peritoneumom, a osim toga sa svih strana ga

    okružuju tri omotača: bubrežna fascija (koja oblaže i nadbubrežnu žlezdu), masna čahura

    (capsula adiposa) i fibrozna čahura (capsula fibrosa) (Stefanović i saradnici,2004) .

    Građa bubrega:

    Ako se bubreg raseče od vrha do dna, makroskopski se mogu uočiti dve

    karakteristične zone: spoljašnja zona ili kora (cortex renis) i unutrašnja zona ili

    srž (medulla renis). Kora bubrega sastoji se od parenhima između renalnih piramida i

    kapsule (bubrežni labirint), kao i dela parenhima koji prodire između piramida

    (Bertinijeve kolumne) gradeći bubrežne stubove (Teofilovski—Parapid & Maliković,

    1997).

    Mikroskopski posmatrano, svaki bubreg sadrži oko million sopstvenih jedinica-

    nefrona. Nefron (nephron) predstavlja osnovnu morfološku i funkcionalnu jedinicu

    bubrega. Osnovni delovi nefrona su bubrežno telašce (corpusculum renale) i bubrežni

    kanalić (tubulus renalis). Unutar telašca se nalazi mreža arterijskih kapilara (rete

    mirabile), označena kao glomerul, i dvolisna vezivna kapsula, čiji listovi ograničavaju

    prostor u kome se filtrira primarna mokraća (Stefanović i saradnici.,2004). Bubrežni

    kanalići se sastoje od izuvijanog proksimalnog dela i izuvijanog, distalnog dela. Ova dva

    dela su povezana tankim kanalom, tzv. Henle-ovom petljom (Štajn & Žikić,1990).

  • 8

    Slika 2. Nefron - histološki preparat: 1. Glomerul, 2. Proksimalni tubul, 3. Distalni tubul ( http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/63/Histology-kidney.jpg)

    Funkcija bubrega:

    Bubrezi imaju čitav dijapazon po život značajnih uloga i utiču na rad svih ostalih

    organa i organizma u celini. Osnovna funkcija ovih organa je formiranje

    konačne mokraće, ali pored toga oni imaju višestruku ulogu u održavanju homeostaze u

    organizmu. To podrazumeva:

    • regulaciju ravnoteže vode i elektrolita,

    • regulaciju osmolarnosti telesnih tečnosti i koncentracije elektrolita,

    • regulaciju acido-bazne ravnoteže,

    • izlučivanje otpadnih produkata metabolizma i štetnih hemikalija,

    • regulaciju arterijskog pritiska,

    • sekreciju različitih hormona,

    • sintezu glukoze i sl.

    Mehanizam stvaranja mokraće obuhvata tri fundamentalna procesa: glomerularnu

    filtraciju, tubularnu reapsorpciju i tubularnu sekreciju (Petrović, 1991) . Obavljajući ovu

    primarnu ulogu, bubrezi takođe vrše i druge funkcije. Oni veoma precizno podešavaju

    izlučivanje vode i elektrolita prema njihovom unosu, održavajući na taj način stalnost

    unutrašnje sredine.

  • 9

    Oni imaju glavnu ulogu u izlučivanju otpadnih produkata metabolizma (urea,

    keratin, mokraćna kiselina, bilirubin), raznih toksina, lekova i dodataka hrani.

    Regulacijom izlučivanja vode i Na imaju presudnu ulogu u dugoročnoj regulaciji

    arterijskog pritiska. Zajedno sa plućima i puferima telesnih tečnosti, bubrezi učestvuju u

    regulaciji acido-bazne ravnoteže, jer mogu da odstrane iz organizma

    razne kiseline (sumpornu, fosfornu i dr). Pošto sintetišu i sekretuju oko 90% ukupnog

    eritropoetina, oni direktno utiču i na stvaranje, tj. broj crvenih krvnih zrnaca. Tokom

    prolongiranog gladovanja bubrezi u procesu glikoneogeneze, od različitih prekursora,

    stvaraju glikozu (Gauyton & Hall, 2003) .

  • 10

    1.4. Nefrotoksičnost

    Nefrotoksičnost je jedan od najčešćih problema sa bubrezima i nastaje kada je telo

    izloženo na lek ili toksin koji izaziva oštećenje bubrega. Bubreg je organ koji služi kao

    kanal za eliminisanje otrova. Većina otrova, unetih u toksičnim dozama, mogu izazvati

    bubrežne povrede, lezije čija posledica može biti pojava nefrita i promene u mokraći.

    Tako npr. kod akutnih trovanja živom bubreg će brzo biti oštećen. Kao posledica

    toksičnog delovanja žive već posle dan- dva može da dođe do potpune anurije i velike

    albuminurije. U izvesnim slučajevima, kao kod saturnizma, do jasnih ozleđenja bubrega i

    do bubrežne insuficijencije i eventualnog nefrita može doći tek posle dužeg vremena

    (Mokranjac M., 2001).

    Hemijski indukovana nefrotoksičnost varira u zavisnosti od veličine i trajanja

    izloženosti: npr. jetra tipično pretrpi štetu od velikih akutnih doza, a bubrezi su ranjivi

    tokom proširenog izlaganja niskim dozama. Postoje nekoliko fizioloških razloga koji

    predisponiraju bubrege za hemijsku toksičnost: npr. jak izraz ksenobiotičkih transportera

    u luminalnoj membrani čine bubrege veoma osetljive na nefrotoksikante od njega, što

    znači da lokalna koncentracija otrova može ozbiljno prevazići svoje nivoe u cirkualciji

    krvi. Ksenobiotik uzrokovan bubrežnom povredom često čini njeno prisustvo poznato

    preko promena u količini ili kvalitetu urina: simptomi mogu uključivati hiperprodukciju u

    razblaženom urinu (poliurija), izlučivanje urina u malim količinama (anurija) ili prolaz

    umazane krvi urina (hematurija). Promene u sastavu urina koje ukazuju na renalna

    oštećenja uključuju izgled glukoze (glukozurija) ili krvnih proteina u urinu (proteinurija).

    Nivoi specificnih proteina kao što je albumin (albuminurija) koji je korisni pokazatelji

    nefrotoksičnosti u kliničkom okruženju. Ksenobiotička trovanja doprinose oko jedne

    polovine akutnih i horničnih bubrežnih neuspeha, dok izmedju 10% i 15% intenzivne

    nege prijemno se uključuju akutnom bubrežnom insuficijencijom. Pošto su se stope

    mortaliteta za akutne bubrežne insuficijencije jedva pomerile za proteklih 50 godina,

    potrebe za osnovnim i kliničkim istraživanjima u ovoj oblasti su i dalji visoki. Bubrežni

    kapacitet treba da eliminiše te strane hemikalije kao i metabolički otpadne proizvode

    (npr. urea, amonijak i mokraćna kiselina) je takođe od ključnog značaja za telesno

    zdravlje (Burcham, 2013).

  • 11

    2. Cilj rada

    Cilj ovog rada bio je da se:

    • Ispita uticaj date koncentracije tečnog koncentrata emulzije Fastac-a od 1,2 µl

    doze 0,4 ml u periodu od 7 dana na bubreg pacova.

    • Ispitivanje uticaja date koncentracije tečnog koncentrata emulzije Fastac-a od 1,2

    µl doze 0,4 ml u periodu od 14 dana na bubreg pacova.

    • Utvrde efekti na histološku strukturu bubrega kod tretiranih životinja.

  • 12

    3. MATERIJAL I METODE 3.1. Materijal U eksperimentima korišćeni su sledeći materijali:

    1. Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, težine oko 380- 490g

    2. Pesticid FASTAC 10- EC (BASF Agro B.V., Switzerland)

    3. Organ pacova- bubreg

    Metode

    - Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima

    - Žrtvovanje životinja

    - Priprema tkiva:

    � Fiksacija tkiva

    � Kalupljenje tkiva

    � Sečenje tkiva

    � Bojenje tkiva

    3.2.1. Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima

    Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar , težine od 380 do 490g, tretirane

    su u dva vremenska perioda. Prvo tretiranje je trajalo 7 dana, u kome su životinje

    tretirane FASTAC-om u koncentraciji 1,2 µl koji je razblažen u 10ml destilovane vode.

    Ukupno je bilo 5 životinja od kojih su 3 tretirane pesticidom, jedna destilovanom vodom

    i jedna ne tretirana praćena kao kontrola. Drugo tretiranje je trajalo 14 dana, u kome je

    nastavljeno tretiranje životinja FASTAC-om sa koncentracijom od 1,2 µl razblaženog u

    10ml destilovane vode. Pesticid je apliciran oralno preko sonde. Životinje su dozirane sa

    po 0,4 ml rastvora određene koncentracije svakog dana u isto vreme. Eksperimentalne

    životinje čuvane su na temperaturi od 22-23 C, sa slobodnim režimom ishrane i režimom

  • 13

    dana od 12:12h svetlost/tama. Nakon tertiranja životinje su žrtvovane, davanjem veće

    doze anestezije.

    3.2.2. Priprema tkiva

    � Priprema parafinskih uzoraka:

    • Uzorak: što svežiji

    • Fiksacija: čuva (fiksira) strukturnu organizaziju

    • Dehidratacija: zamena vode u tkivu alkoholom

    • Prosvetljavanje: zamena alkohola ksilolom

    • Kalupljenje: zamena ksilola medijumom za kalupljenje

    • Sečenje i bojenje

    Ciljevi preparacije:

    • Održati uzorak u stanju koje je što približnije nativnom (prirodnom).

    • Očuvati što više karakteristika uzorka.

    Priprema tkiva:

    Hemijska fiksacija Etanol ili aceton ksilol parafin MIKROTOM - Formaldehid -Serija rastvora rastuće

    - Paraformaldehid koncentracije: 70%, 95%, - Metanol 100% - Buenov fiksativ

    Slika 3. Priprema tkiva

  • 14

    3.2.2.3. Fiksacija tkiva-funkcija

    Funkcija fiksacije tkiva je održavanje odgovarajućeg odnosa između ćelija, takođe

    je ključna za prezervaciju tkivne strukture i sprečavanje ćelijske autolize od strane

    enzima, ćelijske razgradnje, degradacije tkiva i degeneracije proteina. Fiksacija tkiva

    može biti:

    Fizička: Hemijska:

    - Toplota-mikropropagacija - Potapanje u fiksativ

    - Mikrotalasi-glikosal - Perfuzija

    - Zamrzavanje

    3.2.2.4. Kalupljenje tkiva

    Dovođenje tkiva u dovoljno čvrsto stanje kako bi moglo da se seče–kalupljenjem

    u parafin ili plastične smole. Nakon fiksacije, tkivo se ispira vodom. Zatim se vrši

    dehidratacija odnosno uklanjanje vode iz tkiva kroz seriju alkohola rastuće koncentracije.

    Nakon toga se vrsi prosvetljavanje tkiva, potapanjem u rastvarač za sredstvo za

    kalupljenje (ksilol). Zatim se vrši impregnacija parafinom i na kraju kalupljenje u

    rastopljen parafin na 58 ˚C.

    Slika 4. Kalupljenje tkiva

  • 15

    3.2.2.5. Sečenje tkiva

    Sečenje tkiva omogućuje se pomoću mikrotoma (Slika 5). Mikrotom je aparat koji

    služi za sečenje ekstremno malih preseka tkiva (≥ 5 mm). U stanju je da načini

    izvanredno tanke komade tkiva tako da se mogu preparirati za mikroskopsko ispitivanje.

    Koristi se za pripremu uzoraka u mikroskopiji koji se posmatraju na klasičnom

    transmisionom svetlosnom, konfokalnom ili elektronskom mikroskopu. Mikrotom se

    upotrebljava za sečenje različitih preparata tkiva ukalupljenih u parafinski medijum.

    Slika 5. Mikrotom (http://www.leicabiosystems.com/uploads/pics/RM2125_RTS_0061_grip_02.jpg)

  • 16

    3.2.2.6. Bojenje

    Bojenje je uglavnom zasnovano na specificnom vezivanju boja, upotrebi

    obeleženih antitela i aktivnosti enzima. Po završetku bojenja, preseci se sprovode

    kroz alkohole rastuće koncentracije i ksilol, montiraju u nekom od medijuma za

    montiranje, pokriju pokrovnim staklom i tako nastaje trajni preparat.

    3.2.6.1. Hematoksilin- eozin (H&E) metoda

    Ova metoda predstavlja jedno od najčešćih histoloških bojenja. Bazofilne

    strukture (jedra) boji plavo, crno ili sivo, a acidofilne strukture (citoplazma) u roze ili

    crvenu boju. Sam hematoksilin nije boja. On se oksidiše u hematein koji boji jedra (Slika

    6). Eozin je kisela boja i boji citoplazmu ćelija (Slika 7).

    Slika 6. Harisov hematoksilin

    Slika 7. Eozin

  • 17

    Način rada:

    Za analizu, životinjama su uzeti organi: jetra, slezina, bubreg i kostna srž. Za

    fiksaciju korišćen je 4% formalin u kome tkivo stoji nekoliko dana (najmanje tri dana).

    Nakon toga vrši se kalupljanje tkiva sledećim redosledom: prvo ide dehidratacija tkiva

    serijom alkohola, zatim natapanje i izbeljivanje tkiva posrednim sredstvima kao što je

    ksilol. Nakon toga vrši se prožimanje i kalupljenje tkiva parafinom u termostatu. Kada se

    kalupljenje završi, vrši se pravljenje preseka ukalupljenog tkiva koje se vrši pomoću

    mikrotoma, tako da preseci budu debljine 4-5 mikrona. Napravljeni preparati se zatim

    boje odgovarjućim bojenjima, a jedno od osnovnih i rutinskih je H - E bojenje Harisovim

    hematoksilinom i eozin bojom.

    Ovu metodu bojenja radili smo na sledeći način:

    Preparati koji su prethodno bili u ksilolu, zbog uklanjanje parafina, dovode se do

    rehidratacije (od etanola opadajućih koncentracija do destilovane vode). Tako da se

    ispiraju prvo 100% alkoholom, pa 96% alkoholom i na kraju destilovanom vodom.

    Nakon serije ispiranja, preparati se boje hematoksilinom i tako stoje 10 minuta. Nakon

    isteka vremena vrši se ispiranje tkiva destilovanom vodom, pa tekućom vodom 5 minuta,

    pa opet destilovanom vodom. Zatim se vrši bojenje eozinom, i tako stoje 2 minuta.

    Nakon isteka vremena vrši se dehidratacija i prosvetljavanje. Ispire se destilovanom

    vodom, zatim 96% alkoholom i na kraju 100% alkoholom. Kada se ispiranje završi,

    preparati se suše 15-20 minuta. Kada se preparati osuše, vrši se montiranje kanada

    balzamom, nakon čega sledi mikroskopiranje.

  • 18

    4. Rezultati i diskusija

    Ispitivanjem uticaja date koncentracije od 1,2µl pesticida Fastac na bubreg

    pacova u periodu od 7 i 14 dana došlo je do sledećih zapažanja. Pre početka

    eksperimenta izmerena je telesna masa pacova (Tabela 1), isto tako i na kraju

    eksperimenta nakon tretmana od 7 i 14 dana, pri čemu je izmerena masa bubrega i

    preračunat somatski indeks (Si) (Tabela 2). Poređenje ovih vrednosti ukazuje na

    smanjenje bubrega u obe eksperimentalne grupe u odnosu na kontrolu.

    Fastac 10 EC u dozi od 1,2µl/dnevno u periodu od 7 dana proizvodi blage do

    umerene toksične simptome i promene u ponašanju životinja. U odnosu na kontrolu i

    grupu tretiranoj česmenskom vodom životinje tretirane Fastac-om pokazale su

    promenu, koja je bila odlikovana većim unosom hrane, a samim tim i blagim

    povećanjem telesne mase (Tabela 2). U tretmanu od 14 dana, životinje izložene

    Fastac 10 EC u dozi od 1,2µl/dnevno pokazuju efekte toksičnosti, koja se odlikuje

    dijareom, hematurijom, većim unosom hrane, a samim tim i povećanjem telesne

    težine (Tabela 2). U svim eksperimentalnim grupama sve životinje su preživele.

    Telasna masa pacova (g)

    Kontrola Česmenska voda Pesticid Fastac

    7 dana 440 460 460

    14 dana 430 490 470

    Tabela 1. Prikaz apsolutne telesne mase životinja pre eksperimenta.

  • 19

    Tabela 2. Prikaz mase životinja, mase bubrega i somatskog indeksa (Si) na kraju eksperimenta.

    4.1. Ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida na bubreg pacova u periodu

    od 7 dana

    Na histološkim preparatima bubrega kod kontrolne grupe (Slika 4.1. i Slika

    4.2.) kao i grupe životinja tretiranih česmenskom vodom (Slika 4.3. do Slike 4.6.)

    zapaža se normalna morfološka i histološka građa organa, koja se ogleda u jasno

    izdiferenciranom kortikalno medularnom regionu. Glomeruli su normalnog izgleda, a

    tubularni delovi su sa normalno očuvanim i funkcionalnim epitelom.

    Slika 4.1. Glomeruli 20x HE Slika 4.2. Presek bubrežnih kanalića

    20x HE

    Posle 7 dana Posle 14 dana Telesna masa

    pacova ( gr)

    Masa bubrega (gr)

    Si (%) Telesna masa

    pacova (gr)

    Masa bubrega ( gr)

    Si (%)

    Kontrola 460 2.08 0.50 490 2.47 0.50 Česmenska

    voda 480 2.44 0.50 520 2.51 0.49 Pesticid Fastac 510 2.57 0.45 580 2.69 0.46

  • 20

    Slika 4.3. Presek dela bubrežnih Slika 4.4. Glomeruli u bubrežnom parenhimu kanalića 20x HE 20x HE

    Slika 4.5. Izgled bubrežnih Slika 4.6. Glomeruli 40x HE kanalića 40x HE

    Analiza preparata bubrega tretiranih životinja Fastac-om u periodu od 7 dana

    (Slika 4.7. do Slika 4.11.) pokazuje da u oblasti glomerula postoje infiltrati tečnosti,

    bubrežni tubuli izgledaju dilatirano. Jedra epitelnih tubularnih ćelija su uvećana i

    hiperhromna, što ukazuje na njihovu pojačanu metaboličku aktivnost. Po periferiji,

    između tubula, zapažaju se infiltrati makrofagnih ćelija što ukazuje na povečanu

    imunološku aktivnost i inflamatorni proces.

  • 21

    Slika 4.7. Infiltracija u oblasti Slika 4.8. Infiltracija makrofaga u glomerula 20x HE oblasti bubrežnih kanalića 40x HE

    Slika 4.9. Izgled glomerula 40x HE Slika 4.10. Oblast dilatiranih bubrežnih

    kanalića 40x HE

    Slika 4.11. Bubrežni kanalići 20x HE

  • 22

    4.2. Ispitivanje uticaja date koncentracije pesticida na bubreg pacova u periodu

    od 14 dana

    Histološki preparati bubrega kod životinja tretiranih Fastac-om tokom 14 dana

    (Slika 4.12. do Slika 4.17.) ukazuju na izraženu nefrotoksičnost ovog pesticida.

    Kortikalni region bubrega je jako istanjen. Na glmerulima se zapažaju degenerativne

    promene. U medularnom delu se zapažaju polja sa obilnim fibroznim tkivom, koje

    zamenjuje oštećene tubule. U samim tubulima i njihovom epitelu evidentni su

    nekrotični procesi.

    Slika 4.12. Degenerativna promena Slika 4.13. Fokalna polja nekroze na glomerulu (desno gore) 20x HE bubrega 10x HE

    Slika 4.14. Oštećenje glomerula Slika 4.15. Izgled nekrotičnog polja 40x HE (gore na slici) 20x HE

  • 23

    Slika 4.16. Hemoragija na mestu oštećenog Slika 4.17. Deo bubrežnih kanalića

    glomerula (gore desno) 40x HE sa vezikularnim promenama i gotovo

    otsutnim epitelom 40x HE

    Poređenje histoloških nalaza svih eksperimentalnih grupa ukazuje na

    progresivne degenerativne promene koje su posledica izlaganja Fastac-u. U

    fiziološkom smislu to je i očekivano, tako da kod životinja tretiranih 7 dana

    infiltracije u oblasti glomerula i dilatiranost tubula ukazuju na veću mobilizaciju

    bubrega u cilju što brže eliminacije ksenobiotika. Kod produženog izlaganja od 14

    dana došlo je do dodatnog aktiviranja svih kapaciteta organizma i na biohemijskom

    nivou u svim ćelijskim elementima. Izlučujući pesticid i njegovi metaboliti izazvali su

    jak oksidativni stres, koji je uticao na aktivnost lizozoma, čijim prskanjem su

    izazvane nekrotične pojave u oblasti bubrežnih tubula. Ovo je i razlog pojavi

    hematurije kod tretiranih životinja. Nekrozom se gube funkcionalni bubrežni elementi

    koje fokalno zamenjuje fibrozno tkivo, a što sve zajedno za posledicu ima smanjenje

    mase bubrega.

  • 24

    5. Zaključak

    Na osnovu iznetih rezultata ispitivanja uticaja Fastac-a na bubreg pacova mogu se izvesti sledeći zaključci:

    � U tretmanu od 7 i 14 dana došlo je do povećanja telesne mase životinja.

    � Kod tretiranih životinja u periodu od 7 i 14 dana izlaganje Fastac-u dovodi do smanjenja mase bubrega.

    � Histološki na bubregu posle 7 dana nastaju prvi znaci toksičnog delovanja, koji se ogledaju u promeni izgleda bubrežnih kanalića.

    � Posle 14 dana tretmana na bubregu se uočavaju drastične histološke promene, koje se ogledaju u degenerativnim promenama glomerula i bubrežnih tubula.

    � Istraživanje je pokazalo da su priroda i intenzitet toksičnih simptoma proizvedenih delovanjem pesticida Fastac 10 EC vremenski zavisni.

  • 25

    6. Literatura

    1. Amdur MO, Doull J, Klaassen, CD. (1993): Cassarett and Doull's Toxicology:

    The Basic Science of Poisons. New York: McGraw-Hill, Inc. Lewis M. Gash

    MDD

    2. Burcham C. Philip (2013): An introduction toxicology- School of Medicine and

    Pharmacology The University of Western Australia, 176-185.

    3. Grewal K K, Sandhu G S, Kaur R, Brar R S, Sandhu H S. Toxic impacts of

    cypermethrin on behavior and histology of certain tissues of albino rats. Toxicol

    Int 2010;17:94-8

    4. Gauyton, AC., Hall, E.J., (2003). Medicinska fiziologija, Beograd: Savremena

    Administracija

    5. http://www.agromarket.rs/srb/38/39/Zastita-bilja/Vise-o-Pesticidima

    6. http://www.agro.basf.rs/agroportal/rs/media/migrated/basf_bro_ure_2013/flajeri_

    2013/Fastac_2013.pdf

    7. http://www.agrosava.com/proizvodi/insekticidi/Fastac/detaljnije-o proizvodu.html

    8. http://www.agro.basf.rs/agroportal/rs/media/migrated/basf_bro_ure_2012/Jabuka

    _katal og2.pdf

    9. http://duochem.rs/insekticidi.html

    10. http://www.stovet.rs/vocarstvo/pesticidi/insekticidi/?prod_id=1000003005654..

    11. http://www.vet.bg.ac.rs/~farmakologija/Predavanja%20i%20vezbe/Predavanja/Pr

    edavanja%20Prof.%20Trailovic%20TOKS/Trovanja%20piretroidima.pdf

    12. http://vettehpet.wordpress.com/2012/03/19/ektoantiparazitici-najvazniji-

    predstavnici/

    13. Mokranjac ST. M. (2001): Toksikološka hemija, Beograd.

    14. Macan J, et al. HEALTH EFFECTS OF PYRETRINS AND PYRETROIDS Arh

    Hig Rada Toksikol 2006;57:237-243

    15. Petrović, V.M., (1991): Uporedna fiziologija 1.deo. Zavod za udžbenike i

    nastavna sredstva, Beograd.

    16. Petrović, V.M., (1995): Uporedna fiziologija 2.deo. Zavod za udžbenike i

    nastavna sredstva, Beograd.

  • 26

    17. Stefanović N., Antić S., Vasović Lj., Čukuranović R., Pavlović S., Arsić S.

    (2004): Anatomija čoveka za studente farmacije. Medicinski fakultet, Niš.

    18. Stajkovac, J., Amidžić, B., Biočanin, J.: 1st International Conference

    ″ECOLOGICAL SAFETY IN POST-MODERN ENVIRONMENT″ 26-27. Juny

    2009. Banja Luka,RS, BiH

    19. Teofilovski- Parapid G., Maliković A. (1997). Anatomija čoveka. Farmaceutski

    fakultet, Beograd.

    20. Štajn A., Žikić R. (1990). Vežbe iz fiziologije životinja. Prirodno–matematićki

    fakultet, Kragujevac.

  • 27

    Biografija kandidata

    Ana Petrović je rođena 4. septembra 1988. godine u Knjaževcu. Osnovnu školu

    ,,Timočki Partizani“ u Knjaževcu završava 2003. godine sa odličnim uspehom, i iste godine

    upisuje Gimnaziju u Knjaževcu, prirodno-matematički smer. Nakon završetka srednje škole,

    2007. godine upisuje osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu

    Univerziteta u Nišu, Departman za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije

    završava 2011. godine sa zvanjem ,,biolog“. Iste godine upisuje master akademske studije na

    Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, smer -

    Biologija. Master akademske studije završava 2014. godine sa zvanjem ,,master biolog“.

  • 28

    ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

    КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

    Редни број, РБР:

    Идентификациони број, ИБР:

    Тип документације, ТД: монографска

    Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

    Врста рада, ВР: мастер рад

    Аутор, АУ: Aна Петровић Ментор, МН: Љубиша Ђорђевић

    Наслов рада, НР: Хистопатолошке промене бубрега код пацова соја Wistar третираних пестицидом Fastac 10 EC

    Језик публикације, ЈП: српски

    Језик извода, ЈИ: енглески

    Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

    Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

    Година, ГО: 2014.

    Издавач, ИЗ: ауторски репринт

    Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

    Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/цитата/табела/слика/графика/прилога)

    27 страна; 24 слика; 2 табеле

    Научна област, НО: Биологија

    Научна дисциплина, НД: Физиологија животиња

    Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Fastac 10 EC; alfa-cipermetrin; bubreg; Wistar pacovi;

    УДК 591.8: [ 599.324.2 + 591.46 + 632.95.02 ]

    Чува се, ЧУ: библиотека

    Важна напомена, ВН:

    Извод, ИЗ: Циљ овог рада био је испитивање утицаја дате концентрације пестицида Fastac 10 EC на бубрег код пацова соја Wistar. Fastac је инсектицид са контактним и дигестивним делованјем, чија је активна материја алфа-циперметрин. Животиње су пестицидом третиране орално,путем сонде, у концентрацији 1,2 µl/дневно у периоду 7 и 14 дана у константним условима. Код третираних животиња у периоду од 7 и 14 дана излагање Fastac-у доводи до смањења масе бубрега. Хистолошки на бубрегу после 7 дана настају први знаци токсичног деловања, који се огледају у промени изгледа бубрежних каналића. После 14дана третмана на бубрегу се уочавају драстичне хистолошке промене, које се огледају у дегеративним променама гломерула и бубрежних тубула. Истраживање је показало да су природа и интезитет токсичних симптома произведених деловањем пестицида Fastac 10 EC временски зависни.

    Датум прихватања теме, ДП: 16.4.2014

    Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Др Перица Васиљевић

    Члан: Др Јелка Црнобрња-Исаиловић

    Члан, ментор: Др Љубиша Ђорђевић

  • 29

    ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

    KEY WORDS DOCUMENTATION

    Accession number, ANO:

    Identification number, INO: Document type, DT: monograph

    Type of record, TR: textual / graphic

    Contents code, CC: Master thesis

    Author, AU: Ana Petrović

    Mentor, MN: Ljubiša Đorđević

    Title, TI: Histopathological changes in the kidney in Wistar rats treated with pesticides Fastac 10 EC

    Language of text, LT: Serbian

    Language of abstract, LA: English

    Country of publication, CP: Republic of Serbia

    Locality of publication, LP: Serbia

    Publication year, PY: 2014

    Publisher, PB: author’s reprint

    Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

    Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/a

    27 pages ; 24 pictures; 2 tables

    Scientific field, SF: Biology

    Scientific discipline, SD: physiology of animals Subject/Key words, S/KW: Fastac 10 EC ; alpha - cypermethrin ; kidney ; Wistar rats

    UC 591.8: [ 599.324.2 + 591.46 + 632.95.02 ]

    Holding data, HD: library

    Note, N:

    Abstract, AB: The aim of this study was to investigate the influence of given concentrations of pesticides Fastac 10 EC of the kidney in Wistar rats. Fastac is an insecticide with contact and digestive action, whose active ingredient is alpha - cypermehrin. The animals were orally treated with the pesticide, by gavage, at a concentration of 1.2 ml/day over 7 and 14 days in constant conditions. In the treated animals over a period of 7 and 14 days, exposure of Fastac leads to a reduction in mass of the kidney. Histologicaly, on the kidney after 7 days occured the first signs of toxic effects, which are reflected in changes in appereance of renal tubules. After 14 days of treatment in the kidney is observed drastic histological changes, which are reflected in degenerative changes in glomerul and renal tubules. Research has shown that the nature and intensity of the toxic symptoms produced by the action of the pesticides FASTAC 10 EC, weather dependent.

    Accepted by the Scientific Board on, ASB: 16.04.2014.

    Defended on, DE:

    Defended Board, DB: President: Dr Perica Vasiljević

    Member: Dr Jelka Crnobrnja-Isailović

    Member, Mentor: Dr Ljubiša Đorđević