ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----------o0o------------

PHÙNG THỊ PHƢƠNG

XÁC ĐỊNH GIÁN TIẾP CLOXACILLIN BẰNG

PHƢƠNG PHÁP PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ

(F-AAS)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60 44 29

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Luận

HÀ NỘI - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----------o0o------------

PHÙNG THỊ PHƢƠNG

XÁC ĐỊNH GIÁN TIẾP CLOXACILLIN BẰNG

PHƢƠNG PHÁP PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ

(F-AAS)

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2011

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................................. 5

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ........................................................................................... 7

1.1. Giới thiệu chung chất kháng sinh ........................................................... 7

1.1.1. Lịch sử ra đời ........................................................................................ 7

1.1.2. Phân loại ............................................................................................... 7

1.1.3. Đánh giá tác dụng ................................................................................ 8

1.2. Giới thiệu Cloxacilin .................................................................................. 8

1.2.1. Cấu tạo phân tử và tính chất ............................................................... 8

1.2.2. Đặc điểm và tác dụng ........................................................................... 9

1.2.3. Điều chế chung ................................................................................... 10

1.2.4. Giới hạn cho phép của Cloxacilin trong thực phẩm ........................ 11

1.2.5. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện

nay ................................................................................................................. 11

1.3. Các phƣơng pháp phân tích Cloxacilin ................................................. 14

1.3.1. Phương pháp quang học .................................................................... 14

1.3.2. Phương pháp điện hóa ....................................................................... 15

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE).. 16

1.3.4. Sắc ký bản mỏng (TLC) ..................................................................... 18

1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................... 19

1.3.6. Phương pháp phân tích vi sinh (ELISA) .......................................... 22

1.3.7. Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA) ......................................... 22

1.3.8. Phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử .............................................. 23

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 26

2.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu ......................................................... 26

2

2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu ................................................... 26

2.1.2. Phương pháp áp dụng ........................................................................ 26

2.1.3. Nội dung ngiên cứu ............................................................................ 27

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất ........................................................... 28

2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................... 28

2.2.2. Hoá chất .............................................................................................. 28

CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................... 30

3.1. Khảo sát điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa của Ag ......... 30

3.1.1. Khảo sát chọn vạch phổ hấp thụ ....................................................... 30

3.1.2. Khảo sát khe đo .................................................................................. 31

3.1.3. Khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng ............................................ 32

3.1.4. Khảo sát thành phần hỗn hợp khí cháy ............................................ 33

3.1.5. Khảo sát tốc độ dẫn mẫu .................................................................... 34

3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới phép đo phổ F – AAS của Ag. ..... 35

3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của các loại axit và nồng độ axit .................... 35

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng thành phần nền của mẫu ................................ 36

3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các cation .................................................. 39

3.3. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá phép đo F – AAS của Ag ........... 47

3.3.1 .Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính và xây dựng đường

chuẩn ............................................................................................................. 47

3.3.2. Kiểm tra hằng số trong phương trình hồi quy .................................. 50

3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)51

3.3.4. Tính nồng độ chất phân tích dựa trên dường chuẩn ....................... 52

3.4. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phƣơng pháp đo Ag ......................... 53

3.5. Tổng kết các điều kiện đo phổ F – AAS của Ag .................................... 55

3

3.6. Khảo sát các điều kiện phân huỷ Cloxacilin ......................................... 55

3.6.1. Ảnh hưởng của môi trường KOH đến hiệu suất phân huỷ

Cloxacilin giải phóng clo. ............................................................................ 56

3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất .......... 57

3.6.3. Ảnh hưởng của thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất ........ 58

3.6.4. Ảnh hưởng của thời gian đến kết tủa AgCl ...................................... 59

3.7. Giới hạn phát hiện ................................................................................... 60

3.8. Xác định Cloxacilin trong mẫu thực ...................................................... 61

3.8.1. Lấy mẫu .............................................................................................. 61

3.8.2. Xử lý mẫu ........................................................................................... 62

3.8.3. Chuẩn bị mẫu và phân tích mẫu ....................................................... 63

3.8.4. Xác định độ thu hồi ............................................................................ 65

3.9. Kết quả phân tích một số mẫu thực ....................................................... 66

KẾT LUẬN .......................................................................................................................... 68

4

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AAS Atomic absorption spectrometry

(Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử)

AbsAg Absortion of Siliver

(Độ hấp thụ quang của Ag)

AMO Amoxicillin

AMP Ampicilin

A6AP Acid 6-amino penicillanic

CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản)

CLO Cloxacillic

CZE Capillary zone electrophoresis

(Điện di mao quản vùng)

F-AAS Flame atomic absorption spectrometry

(Phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa)

HCL Hollow cathde lamp

(Đèn catốt rỗng)

LOD Limit of detection

(Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of quantity

(Giới hạn xác định)

RSD Relative standard deviation

(Độ lệch chuẩn tương đối)

OXA Oxacillin

SS Sum of square (tổng các bình phương)

5

MỞ ĐẦU

Từ lâu việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh bổ sung vào thức ăn gia súc

cho thấy chúng không những được dùng để chống nấm mốc mà còn có tác dụng

kích thích tăng trưởng, tăng cường hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm tỉ lệ chết và

còi cọc, tăng khả năng sinh sản. Tuy nhiên, sử dụng thức ăn có bổ sung kháng

sinh trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm,

lượng kháng sinh tồn dư này có thể gây dị ứng, gây bệnh cho con người khi sử

dụng sản phẩm đó. Đồng thời bổ sung kháng sinh vào thức ăn gia súc sẽ gây hiện

tượng nhờn thuốc phát triển các loại vi khuẩn độc hại kháng thuốc.

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh được sử dụng

tràn lan trong thức ăn cho lợn, gia cầm và tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt

là phổ biến. Các nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi đều sử

dụng kháng sinh không hợp lí (không xét nghiệm kháng sinh đồ, sử dụng theo

kinh nghệm không đúng liều lượng), một số cơ sở chăn nuôi không dùng thuốc

đúng quy định, bán chạy khi sử dụng thuốc không hiệu quả. Từ đó dẫn đến tồn

dư kháng sinh trong thực phẩm cao gấp hàng chục cho đến hàng nghìn lần so với

tiêu chuẩn quốc tế(CODEX).

Chính vì vậy, kháng sinh là một trong những đối tượng cần phải kiểm soát

dư lượng trong thực phẩm bởi những độc tính, những tác dụng phụ có thể gây ra

cho con người khi sử dụng thực phẩm có tồn dư lượng kháng sinh.

Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích mới để xác định dư lượng

kháng sinh trong thực phẩm là yêu cầu cần thiết.

Trên thế giới, phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) đã

được ứng dụng rất phổ biến. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: độ nhạy và độ

6

chọn lọc cao, có thể xác định nhiều ion trong cùng một dung dịch, cho phép phân

tích nhanh hàng loạt với độ chính xác và lặp lại cao, các thao tác tiến hành đơn

giản và thuận tiện, có thể tự động hoá quá trình phân tích. Ở nước ta phương

pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử đã là một trong các phương pháp tiêu

chuẩn để phân tích lượng vết các kim loại trong nhiều đối tượng khác nhau như:

đất, nước, không khí, thực phẩm,…Ngày nay bằng cách gián tiếp người ta đã xác

định hàng trăm chất hữu cơ và các phi kim với độ nhạy, độ chính xác cao. Với

các kết quả đó chúng tôi nhận thấy phương pháp AAS là một phương pháp thích

hợp để xác định gián tiếp Cloxacilin trong thực phẩm.

Vì vậy trong bản luận văn này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm điều

kiện phù hợp để xây dựng quy trình xác định Cloxacilin trong thực phẩm. Từ kết

quả thực nghiệm xây dựng một quy trình xác định gián tiếp Cloxacilin bằng

phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS).

7

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung chất kháng sinh (1,2,26)

1.1.1. Lịch sử ra đời

Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của

nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau

đó là hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển

mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc

kháng sinh khác.

Giới y học định nghĩa: Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá

sinh học, có tác dụng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ

thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh

tự nhiên.

1.1.2. Phân loại

Các chất kháng sinh được phân lọai dựa vào cấu tạo hoá học gồm các

nhóm sau:

- Kháng sinh β -lactam

- Kháng sinh Aminoglycosid

- Kháng sinh Tetracylin

- Cloramphenicol và dẫn xuất

- Kháng sinh Macrolid

- Kháng sinh Lincosamid

- Kháng sinh polypeptide

- Các kháng sinh khác: Rifamycin

8

1.1.3. Đánh giá tác dụng

Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh

thiên nhiên, không nguyên chất.

Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm

kháng sinh bán tổng hợp.

1.2. Giới thiệu Cloxacilin

Cloxacilin là một thành viên trong nhóm kháng sinh penicillin thuộc họ β-

lactamase

1.2.1. Cấu tạo phân tử và tính chất

a. Cấu tạo phân tử

NO

SCOONH

N

O

H H

CH3

CH3

COOH

Cl

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử cloxacillin

b. Tính chất vật lý

Thuốc ở dạng bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng, hơi có mùi, vị đắng

dễ hút ẩm. Dễ tan trong nước và methanol, tan trong etanol 96%, thực tế không

tan trong ethylacetat.

c. Tính chất hoá học

Tác dụng cản trở không gian đối với penicillinase là do nhân isoxazol

mang hai nhóm 5-methyl và 3-phenyl ở vị trí ortho đối với vị trí 4- nối với -CO-.

Do tác dụng hút điện tử của nhân isoxazol, kháng sinh này bền với axit và

hấp thụ tốt khi uống nên có thể dùng cả đường uống và đường tiêm.

9

Có hoạt phổ hẹp, chủ yếu trên vi khuẩn gram(+). Phổ IR được dùng phổ

biến để định tính phổ. Hấp thụ quang UV có cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân

phenyl.

Cloxacilin kém bền với ánh sáng. Vì vậy ta phải bảo quản chúng trong lọ

kín, tối tránh ánh sáng trực tiếp.

1.2.2. Đặc điểm và tác dụng

Cơ chế:

Cloxacilin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá

trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào

bị ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, Cloxacilin còn hoạt

hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết

quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu

kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn.

Kháng thuốc:

Thuốc đã bị nhiều loại vi khuẩn kháng lại do nó được sử dụng rộng rãi

trong điều trị cũng như làm thức ăn bổ sung như: vi khuẩn đường ruột, nhiều

chủng tụ cầu, liên cầu, phế cầu.

Độc tính:

Kháng sinh Cloxacilin có độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc:

dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là

sốc phản vệ.

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú.

Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc.

10

Ngoài ra Cloxacilin còn có tác dụng phụ là làm chuyển màu xỉn men răng,

giảm liên kết răng lợi, giòn xương và cản trở sự phát triển xương, răng ở trẻ em

trong thời kỳ phát trển (dưới 8 tuổi).

Chỉ định:

Dùng cho các nhiễm tụ cầu sinh penicillinase gây ra như các nhiễm khuẩn

đường niệu, đường hô hấp, ở các mô mềm, xương khớp, da...

Thường dùng theo đường uống. Thức ăn có ảnh hưởng tới hấp thu. Tiêm

đối với trường hợp bệnh nặng, cấp tính. Có thể phối hợp với các kháng sinh khác

đặc biệt là ampicillin, để mở rộng phổ tác dụng.

Uống 0,25-0,50g/lần4 lần/24 h. Nếu tiêm tương đương với liều uống.

Cloxacilin được dùng rất phổ biến.

1.2.3. Điều chế chung

Sinh tổng hợp:

Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc

Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp. Chiết xuất

dạng kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho hiệu suất cao thường gây đột biến

bằng mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn,

đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng

cho quá trình sinh tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào

là acid phenylacetic. Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được

quá trình lên men. Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid

→ polypeptide. Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men.

Bán tổng hợp:

Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic

(A6AP).

11

Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, Khi đó môi trường dồi

dào A6AP, chiết lấy trực tiếp.

Tách phần phenylacetyl ( C6H5-CH2-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng

acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi

trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thu HCl giải phóng ra trong phản ứng

được penicillin khác.

Tổng hợp hoá học:

Chưa được ứng dụng rộng rãi.

1.2.4. Giới hạn cho phép của Cloxacilin trong thực phẩm

Theo công văn số: 571 QLCL-CL1 ngày 14/04/2011 [4] của Cục quản lí

chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản cho phép mức dư lượng thuốc thú y tối đa

trong thực phẩm có nguồn gốc động vật để giết thịt bao gồm cả gia cầm và cá

nuôi ao, nuôi lồng như sau:

Bảng 1.1. Hàm lượng tối đa cho phép Cloxacilin trong thực phẩm [4]

Kháng sinh Loại thực phẩm mg/kg

Cloxacilin

Thịt 0,3

Mỡ 0,3

Gan 0,3

Thận 0,3

Sữa 0,03

1.2.5. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện

nay

Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các

cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với

12

các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi

(virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn

kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi

trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá

nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách.

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275

triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R.

Gonzales [5,27], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp

trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không

cần và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến

enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus

kháng vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ

pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm

2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc

tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.

Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với

phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế

giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [19] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người

bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng

kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến

10 tỉ đô-la.

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [10],

năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh,

71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới

5 ngày).

13

Theo [10] qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện

Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có

không ít trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất,

dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu,

thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám

đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh

đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng

sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy,

viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%,

Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết

và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng

kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo,

các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp

Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia

nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước

đang phát triển.

Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế hoạch toàn cầu để kiểm

soát sự đề kháng Kháng sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả

các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng

cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng

và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong

máu. Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành

của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc

giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất.

14

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta

sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của thuốc kháng sinh,

hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.

1.3. Các phƣơng pháp phân tích Cloxacilin

1.3.1. Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang

học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các

phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi

xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm. Tuy nhiên khả năng ứng dụng của

phương pháp này bị giới hạn vì trong dược phẩm thường chứa các tá dược có

khả năng hấp thụ ánh sáng tại vùng phổ phân tích, gây sự chen lấn phổ.

Các penicillin hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng

cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong

nhiều trường hợp, các penicillin được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để

phân tích.

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các kháng sinh β-

lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản

ứng quang hóa của các β-lactam.

A. Fernández-González và cộng sự [15] dùng Cu2+

thủy phân và tạo phức

với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện

thu được 4.10-7

M (0,16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy

cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc

uống, huyết thanh…

Theo [21], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống

bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của

15

kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra

phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l

và giới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP là 0,76 mg/l.

Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ

luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân

tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ

nhạy cao: PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l, 0.1 mg/l

CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS,

nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l.

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp,

các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng

sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất

phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất

phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp

này.

1.3.2. Phương pháp điện hóa

Nguyên tắc của phương pháp này là đo thế cân bằng của các điện cực

nghiên cứu để xác định nồng độ chất cần phân tích hoặc theo dõi sự biến thiên

nồng độ chất trong phản ứng chuẩn độ của nó.

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các kháng

sinh nhưng không phổ biến nhiều.

Theo [18], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích

AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong môi trường đệm axetat

0,1M pH=5,2.

16

C.M. Couto, J.L.F.C. Lima, M. Conceicao, B.S.M. Montenegro đã xác

định Chlortetracyclin bằng việc sử dụng phương pháp điện thế kết hợp với

phương pháp dòng chảy, dùng điện cực màng ống kép, màng là tinh thể đồng

nhất CuS/Ag2S. Khi đó Chlortetracyclin được xác định dựa vào việc tính độ

giảm nồng độ Cu(II) do tạo phức với Chlortetracyclin [6].

Saad.S.M.Hassan và M.H.Eldesouki đã xác định Chlortetracyclin trong

các chế phẩm dược có sử dụng điện cực chọn lọc ion cadmi. Phương pháp dựa

trên phản ứng khử nhóm nitro bằng cadmi kim loại, phản ứng xảy ra hoàn toàn

và định lượng trong môi trường axit HCl, ion cadmi giải phóng ra và được định

lượng bằng cách chuẩn độ với EDTA ở pH = 10. Hiệu suất thu hồi của phương

pháp là 99,3%, độ lệch chuẩn tương đối 0,5% [6].

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về

hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã

được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối

tượng mẫu khác nhau.

L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [25] sử dụng phương pháp điện

di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm

điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5. Tiến hành phân tích tại thế

điện di 10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép

tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng

dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện

từ 0,14 đến 0,27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0,25 đến 0,86%,

diện tích pic 1,3 đến 4,15%. Độ thu hồi trên 96%.

17

Biyang Deng và cộng sự [16] đã sử dụng phương pháp điện di với detector

điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp

0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ

lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/

mẫu.

Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng

sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone

electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8.

Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát

hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,

cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,

ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới

hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục

đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ

Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+250C, +4

0C và -18

0C). Kết

quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ

phòng sau khi pha loãng.

Theo [12], Chen và Gu đã tách đồng thời oxytetracylin, tetracylin,

chlortetracylin trong sữa, huyết thanh và nước tiểu bằng CE. Các mẫu được

deprotein bằng đệm succinat và các tetracylin ở dạng huyền phù được làm sạch

bằng cột sắc ký ái lực chelat kim loại. Các muối được giải hấp từ cột được loại

bỏ bằng trimetylsilan C18. Độ thu hồi của các kháng sinh tetracylin từ các mẫu

là 4084%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là 3,39,1%

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [25] sử dụng phương pháp CZE và detector

UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol,

18

dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng

thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước

( nước sông, nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30;

0,30; 0,9; 0,08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối

thấp hơn 10%.

Phương pháp MEKC cũng được M.I. Bail´on P´erez, L. Cuadros Rodr´

ıguez, C. Cruces-Blanco [25] xác định 9 loại kháng sinh gồm CLO, dicloxacillin,

OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược

phẩm. Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH =

8,5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV. Giới hạn phát hiện LOD 0,35 đến

1,42 mg/l, giới hạn định lượng 2,73 đến 5,74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời

gian lưu từ 1,5 đến 1,7%. Độ thu hồi từ 91 – 95,6%.

1.3.4. Sắc ký bản mỏng (TLC)

Sắc ký bản mỏng là khái niệm đưa ra phương pháp sử dụng lớp mỏng pha

tĩnh phủ trên một bản mỏng thuỷ tinh hay nhựa plastic. Pha động là các dung

môi khác nhau có thể là phân cực hoặc không phân cực hoặc dung dịch đệm.

Sau khi phủ lớp pha tĩnh lên bản mỏng, nạp chất phân tích vào một phía

sau của bản mỏng rồi cho bản mỏng tiếp xúc với pha động ở phía mẫu (nên thực

hiện trong hệ kín, không khí bão hoà pha động). Sau một thời gian nhất định, lấy

bản mỏng ra cho hiện chất phân tích. Tiến hành định tính và định lượng chất

phân tích.

Trong sắc ký bản mỏng pha tĩnh rất đa dạng: chất hấp phụ, trao đổi ion,

chất rây phân tử. Do vậy sắc ký bản mỏng cũng có đầy đủ bốn cơ chế tách là hấp

phụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử tuỳ thuộc vào pha tĩnh sử dụng.[6,12]

19

Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để

kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tỏ ra tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu

cùng một lúc song song rất tiện lợi. Khi TLC được trang bị phần phát hiện là

một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng. Phương pháp này

được sử dụng để phân tích các đối tượng khác nhau như: phân tích các cation

kim loại nặng, phân tích glucoza, tách các amin…trong công nghiệp, lâm sàng,

dược phẩm.

1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô

cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác

nhau, nhất là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu,

hoá học hợp chất thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân

tích lượng vết các chất.

Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh β -lactam bằng phương

pháp HPLC

Theo [28], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích

penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện

chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –

(C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong

sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg.

J.M. Cha và cộng sự [26] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-

lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18

(2,1 mm×50 mm, 2,5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol

(MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8

phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25 ml/phút;

20

nhiệt độ cột 450C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin,

CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước

bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử

lý.

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh

quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [16] C.Y.W Yang

và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích

AMO trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6 – 24/76;

detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5

μg/kg và 0,3 μg/kg. Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ

chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [18, 15] nên chỉ áp dụng với số ít

chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều

kháng sinh cùng lúc được.

Tác giả Chu Đình Bính trong luận văn thạc sĩ của mình đã ứng dụng kĩ

thuật HPLC để tách và xác định đồng thời Chloramphenicol, Dexamethason

acetate và Hydrocortison acetate trong mẫu dược phẩm. Cột tách sử dụng chất

nhồi cột là pha đảo Hypersil C18, 5 m pha động là MeOH/H2O/ACN: 33/47/20.

Các chất phát hiện tại bước sóng 248nm. Kết quả thu được có độ lặp lại, độ

chính xác, độ thu hồi tốt, và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tá dược trong

mẫu [3].

Trong [23, 24], Boison J.O. và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2

(250mm*4,6mm, 5nm)’; pha động: CAN –Na2S2O3 15,7mM trong đệm photphat

0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng

thời AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-

5 g/kg.

21

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ

dẫn… để phân tích các β-lactam.

Trong [17], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO,

OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91%.

Còn trong [28], WJ Blanchflower và cộng sự dùng diclometan và hexan để tách

penịillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, hiệu suất

đạt 89-117%.

Khi tách và làm giàu các -lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật SPE

thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C18) và trao đổi

ion dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ.

K. Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C18 và dung môi

rửa giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt

hiệu suất thu hồi 83-89%.

Còn trong [22] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu

AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt hiệu

suất thu hồi 77,1-95,9%.

Trong [20] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách

AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong

nước thải cho hiệu suất thu hồi 76-100%.

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp

như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương

pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với

nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ. Do đó việc kết hợp phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu

22

đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích -lactam do có độ nhạy, độ chính xác và

độ lặp lại cao.

1.3.6. Phương pháp phân tích vi sinh (ELISA)

Phương pháp này dựa vào khả năng phản ứng của chất phân tích trong

điều kiện phản ứng xảy ra được xúc tác bằng các loại enzyme đặc hiệu trong một

môi trường nuôi cấy thích hợp. Phản ứng thường tạo thành các hợp chất màu hay

các hợp chất có khả năng phát huỳnh quang.

Phương pháp này có ưu điểm là phân tích nhanh, độ nhạy cao nhưng độ

chính xác và độ lập không cao do bản thân phương pháp bị ảnh hưởng của các

điều kiện môi trường tiến hành phản ứng và các phản ứng cạnh tranh, độ chọn

lọc cũng kém.

D. S. Aga, R. Goldfish và P. Kuksrestha đã sử dụng phương pháp để xác

định Chlortetracyclin trong phân súc vật, theo dõi sự thay đổi của kháng sinh

trong đất được bón loại phân này. Kháng sinh được đo độ hấp thụ ở bước sóng

450 nm. Giới hạn phát hiện là 0,5ppm và khoảng xác định là 0,5ppm đến

200ppm [6].

1.3.7. Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA)

Dựa trên kĩ thuật bơm trực tiếp một thể tích mẫu xác định dung dịch mẫu

phân tích vào một dòng chất mang có thành phần thích hợp (thường chứa thuốc

thử phân tích), chảy liên tục với tốc độ không đổi. Chất phân tích trong dung

dịch mẫu tạo với thuốc thử trong dòng chất mang một vùng nhỏ chứa sản phẩm

tạo ra, có thể phát hiện theo một tính chất hoá lí nhất định, phù hợp nhất và được

dòng chất mang đưa đến bình dòng chảy của detector. Detector đo tín hiệu và

được máy ghi dưới dạng pic. Nếu trong điều kiện thuận lợi thích hợp thì chiều

23

cao hoặc diện tích pic tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích. Quá trình này

thường được thực hiện một cách tự động với tốc độ phân tích nhanh.

Kĩ thuật FIA được phát triển và sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

kiểm tra sản xuất và kiểm tra môi trường bởi các tính ưu việt của nó như: Kĩ

thuật phân tích nhanh, có độ nhạy, độ lập lại và độ chính xác tương đối cao, tốc

độ phân tích mẫu lớn 40 – 200 mẫu/giờ. Lượng mẫu tiêu hao ít, thích hợp cho

phân tích hàng loạt mẫu cùng đối tượng.

Tác giả Thiraporn Caaroenraks, Sanit Palaham, Kate Grudpan, Weena

Siangproh và Orawon Chailapakul đã xác định Chlotetracyclin trong thuốc với kĩ

thuật FIA. Hàm lượng Chlotetracyclin tìm được là 33,76 μA/mM [6]

1.3.8. Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

Khi ta chiếu đám hơi nguyên tử tự do một chùm sáng đơn sắc có năng

lượng phù hợp, có bước sóng trùng với vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên

tố cần phân tích, chúng sẽ hấp thụ tia sáng đó và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử.

Cơ sở phân tích định lượng theo AAS là dựa vào mối quan hệ giữa cường

độ vạch phổ hấp thụ với nồng độ nguyên tố cần phân tích theo phương trình:

Ak = k. bC ( 0< b 1)

Trong đó:

Ak: cường độ vạch phổ

k: hệ số thực nghiệm

C: nồng độ nguyên tố

b: hằng số bản chất

24

Sự phụ thuộc tuyến tính giữa Ak và C nằm trong khoảng nhất định. Đo

được Ak sẽ biết được C, ta có thể sử dụng phương pháp đường chuẩn hoặc them

chuẩn để định lượng nguyên tố cần phân tích.

Ưu điểm của phương pháp:

- Có độ nhạy và độ chọn lọc tương đối cao. Có thể xác định gần 60

nguyên tố với độ nhạy từ 4 510 10 %.

- Có độ nhạy cao nên trong nhiều phương pháp không cần làm giàu

nguyên tố cần xác định trước khi phân tích, tốn ít nguyên liệu mẫu, tốn ít thời

gian, thích hợp để xác định lượng nhỏ và vết.

Phép đo phổ hấp thụ AAS có thể phân tích được lượng vết của hầu hất các

kim loại và cả những hợp chất hữư cơ hay anion không có phổ hấp thụ nguyên

tử. Nó được ứng dụng rộng rãi trong các ngành: địa chất, công nghiệp hoá học,

hoá dầu, y học, sinh học, công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và thực

phẩm,…với độ chính xác và độ nhạy cao, đơn giản, thiết bị không quá cồng kềnh

và thích hơp cho phân tích hàng loạt.

Tuỳ thuộc vào kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu người ta phân biệt phổ hấp thụ

nguyên tử ngọn lửa (F-AAS) có độ nhạy đến 0,1ppm và phổ hấp thụ nguyên tử

không ngọn lửa (GF-AAS) độ nhạy cỡ ppb.

Saad.S.M.Hassan cùng các cộng sự xác định gián tiếp Chloramphenicol

trong một số bào chế thuốc mà không cần tách trước Chloramphenicol ra khỏi

mẫu. Phương pháp này dựa trên phản ứng khử định lượng Chloramphenicol bằng

cadmi kim loại trong môi trường axit HCl 0,05M, ion Cd2+

giải phóng ra sau

phản ứng được định lượng bằng phép đo phổ AAS ở bước sóng 228,8 nm. Hàm

lượng Chloramphenicol xác định được là dưới 3 mg, độ thu hồi là 99,5% và độ

lệch chuẩn tương đối là 1,1% [6]

25

Thạc sỹ Phạm Thị Quỳnh Lương [11] đã ứng dụng kĩ thuật AAS để định

lượng gián tiếp Chloramphenicol trong thuốc viên, thuốc nhỏ mắt và kem bôi da,

dựa vào phản ứng khử nhóm –NO2 bằng cadmi kim loại được tiến hành trong

môi trường axit theo phương trình:

R-NO2 + 6HCl + 2Cd R-NH2 + 3CdCl2 + H2O (a)

Sau đó đo phổ AAS của lượng ion Cd2+

sinh ra thì sẽ tính được hàm lượng

Chloramphenicol theo phản ứng (a). Điều kiện phản ứng là nồng độ axit 0,05M,

nhiệt độ tiến hành phản ứng là 90 1000C và thời giam để phản ứng xảy ra

khoảng 3045 phút. Kết quả cho thấy độ thu hồi tốt (96%), giới hạn định lượng

là 0,5ppm với sai số nằm trong khoảng cho phép 10%, độ lệch chuẩn trung

bình là 0,41.

Thạc sỹ Đặng Thị Thu Hà [6] đã nghiên cứu xác định gián tiếp Clo-

Tetracilin trong thực phẩm bằng phương pháp phổ hấp thu nguyên tử (F-AAS),

nhiệt độ phân huỷ là 1500C, thời gian là 30 phút.

26

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Kháng sinh sử dụng trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm và những

tồn dư của nó trong thực phẩm chăn nuôi sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh của

con người khi sử dụng thực phẩm này. Xa hơn nữa sẽ tạo sự kháng thuốc cho các

dòng vi khuẩn gây bệnh ở động vật và chúng có khả năng lan truyền sang cho

con người. Kết quả là khi con người bị nhiễm bệnh sẽ làm cho khả năng chữa trị

khó, lâu dài và phức tạp hơn.

Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn

đề cấp thiết đang được quan tâm. Trong đó chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong

mẫu thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Như

chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm

lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con

người.

Vì vậy đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là kháng sinh Cloxacilin trong

thực phẩm có nguồn gốc động vật.

Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là tiến hành nghiên cứu chọn các điều

kiện phù hợp để xây dựng được một quy trình xác định Cloxacilin trong thực

phẩm bằng phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS) nhằm góp phần vào việc

kiểm tra chất lượng thực phẩm có nguồn gốc động vật.

2.1.2. Phương pháp áp dụng

Phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) là phương pháp xác định

lượng vết của hầu hết các kim loại với độ chính xác cao, kết quả phân tích ổn

định. Với các anion, các á kim, các chất hữu cơ không có phổ hấp thụ thì phải

27

xác định gián tiếp thông qua một kim loại có phổ hấp thụ nguyên tử nhạy nhờ

một phản ứng hoá học trung gian có tính chất định lượng như: Phản ứng tạo kết

tủa, tạo phức, đẩy kim loại hay hoà tan kim loại…giữa kim loại đo phổ và chất

cần phân tích. Sử dụng phương pháp AAS có thể tiến hành phân tích hàng loạt,

có thể xác định đồng thời nhiều mẫu.

Do Cloxacilin không có phổ hấp thụ nguyên tử, chúng tôi tiến hành xác

định gián tiếp hàm lượng của nó thông qua phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của

Ag dư, sau khi đã li tâm tách bỏ kết tủa AgCl được tạo thành từ phản ứng có tính

chất định lượng giữa ion Ag+ với ion Cl giải phóng ra sau quá trình vô cơ hoá

Cloxacilin, vì một phân tử Cloxacilin có một nguyên tử Clo, theo phản ứng:

Cloxacilin -Cl + CO2 + H2O

-Cl + +Ag AgCl

Với điều kiện trang thiết bị có sẵn và những ưu điểm của phương pháp đo

phổ hấp thụ nguyên tử AAS nêu trên, chúng tôi đã sử dụng phương pháp này để

xây dựng một quy trình xác định Cloxacilin gián tiếp thông qua việc đo phổ F-

AAS của Ag.

2.1.3. Nội dung nghiên cứu

- Tối ưu hoá các thông số máy cho phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của Ag

- Tối ưu hoá các điều kiện nguyên tử hoá mẫu

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến phép xác định Ag bằng phương

pháp F-AAS như: loại axit, nồng độ axit, chất nền, các cation, các anion khác có

trong mẫu

- Khảo sát khoảng tuyến tính khi xác định Cloxacilin theo lượng dư Ag

- Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Đáng giá sai số và độ lặp lại của phương pháp

28

- Tối ưu hoá các điều kiện phân huỷ mẫu lấy -Cl trong Cloxacilin

- Yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng kết tủa Cloxacilin bằng ion Ag+

- Xây dựng quy trình phân tích

- Ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác định Cloxacilin trong một số mẫu

thực phẩm.

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất

2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ

- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử NovAA 400 của hãng Analytik

Jena (CHLB Đức) – Phòng máy bộ môn Hóa học phân tích – Khoa Hóa học –

ĐHKHTN – ĐHQGHN.

- Đèn HCL của các nguyên tố cần xác định, Ag

- Pipet 0,1 ml, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml

- Bình định mức 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml

- Cốc thủy tinh, ống đong, phễu, …

- Tủ sấy, tủ hút …

- Cân phân tích, cân kỹ thuật và một số thiết bị, dụng cụ khác

- Máy ly tâm, bếp đun cách thuỷ,…

2.2.2. Hoá chất

- Dung dịch chuẩn Ag 1000 mg/l trong HNO3 của Merck.

- Axit đặc HNO3 65% của Merck, KOH của Merck.

- Dung dịch nền CH3COONH4.

- Metanol tinh khiết dung cho phân tích.

- Chất chuẩn Cloxacilin bột tinh khiết.

- Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA, axit oxalic

29

* Dung dịch đệm:

Đệm McIlvaine pH = 4 0,5: Cân 28,4 gam Na2HPO4 cho vào bình định

mức 1 lít và hòa tan bằng nước cất rồi định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp. Cân

21 gam axit xitric monohydrat vào bình định mức 1 lít khác, hòa tan bằng nước

cất và định mức tới vạch, lắc kỹ. Lấy 1 lit axít xitric ở trên trộn với 625ml

Na2HPO4 trong bình 2 lít. Điều chỉnh pH tới 4 0,5 bằng cách thêm từng giọt

HCl 0,1M hoặc NaOH 0,1M. Dung dịch này sử dụng trong một tuần.

Dung dịch đệm McIlvaine – EDTA: Thêm 6,05 Na2EDTA.2H2O vào

1,625 lít đệm McIlvaine và trộn hỗn hợp tới khi tan hết. Dung dịch này sử dụng

trong một tuần.

Axit oxalic trong metanol: Hòa tan 1,26 gam axit oxalic trong bình định

mức 1 lít, pha loãng dung dịch tới vạch định mức bằng metanol và trộn đều hỗn

hợp. Dung dịch này được sử dụng trong một ngày.

30

CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa của Ag

Để quá trình phân tích đạt kết quả tốt, thì việc nghiên cứu chọn các thông

số đo phù hợp với phép phân tích định lượng một chất là một công việc hết sức

cần thiết và quan trọng trong kĩ thuật AAS.

Để tối ưu hoá các thông số máy tôi chọn các dung dịch sau để khảo sát:

- Dung dịch Ag 3 ppm trong HNO3 2% nền NH4Ac 1%

Giá trị đưa ra ở mỗi bảng là kết quả ba lần sau khi đã trừ blank (mẫu

trắng).

3.1.1. Khảo sát chọn vạch phổ hấp thụ

Mỗi loại nguyên tử của một nguyên tố hóa học chỉ có thể hấp thụ những

bức xạ có bước sóng mà chính nó có thể phát ra trong quá trình phát xạ. Nhưng

thực tế không phải mỗi loại nguyên tử có thể hấp thụ tất cả các bức xạ mà nó

phát ra, quá trình hấp thụ chỉ tốt và nhạy chủ yếu đối với các vạch đặc trưng hay

vạch cộng hưởng. Đối với một nguyên tố vạch phổ nào có khả năng hấp thụ càng

mạnh thì phép đo vạch đó có độ nhạy càng cao. Như vậy đối với một nguyên tố

các vạch phổ khác nhau sẽ có độ nhạy khác nhau, đồng thời với mỗi vạch này có

thể có rất nhiều các nguyên tố khác trong mẫu có những vạch phổ gần với vạch

phổ này, nó có thể chen lấn hay gây nhiễu tới vạch phổ của nguyên tố phân tích

làm cho việc đo cường độ vạch phân tích là rất khó khăn và thiếu chính xác. Vì

vậy ta khảo sát tìm ra vạch phổ có độ nhạy cao và hạn chế được ảnh hưởng của

các nguyên tố có vạch phổ lân cận.

Theo W.J.Price các vạch phổ đặc trưng của Ag:

Ag: 328,1 nm và 338,3 nm.

31

Kết quả khảo sát chọn vạch phổ của dung dịch Ag 3ppm trong HNO3 2%

nền NH4Ac 1% được chỉ ra trong bảng 3.1:

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát vạch đo phổ của Ag

Bước sóng

(nm)

Abs RSD

(%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung Bình

328,1 0,4152 0,4155 0,4152 0,4153 0,04

383,3 0,2771 0,2503 0,2680 0,2651 5,14

Trong các vạch phổ của Ag chúng tôi chọn vạch phổ có = 328,1 nm

cho phép đo phổ của Ag vì tại vạch phổ này, phép đo cho độ nhạy và độ ổn định

tốt nhất.

3.1.2. Khảo sát khe đo

Theo nguyên tắc hoạt động của hệ thống đơn sắc trong máy quang phổ

hấp thụ nguyên tử, chùm tia phát xạ cộng hưởng của nguyên tố cần xác định

được phát ra từ đèn catot rỗng sau khi đi qua môi trường hấp thụ sẽ được hướng

vào khe đo của máy, được trực chuẩn, được phân ly và sau đó chỉ một vạch phổ

cần đo được chọn và hướng vào khe đo để tác dụng vào nhân quang điện để phát

hiện và xác định cường độ của vạch phổ. Do vậy khe đo của máy phải được chọn

chính xác và phù hợp với từng vạch phổ, có độ lặp lại cao trong mỗi phép đo và

lấy hết được độ rộng của vạch phổ. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự hấp thụ

của bạc với dung dịch Ag+ nồng độ 3 ppm trong HNO3 2% nền NH4Ac 1% . Kết

quả được chỉ ra ở bảng 3.2:

32

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ rộng khe đo

Khe đo

(nm)

Abs

RSD

(%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

0,2 0,3652 0,3694 0,3720 0,3689 0,93

0,5 0,4112 0,4115 0,4121 0,4116 0,15

0,8 0,3832 0,3867 0,3889 0,3862 0,81

1,2 0,3891 0,3912 0,3935 0,3913 0,56

Kết quả khảo sát cho thấy trong các khe đo của Ag chúng tôi chọn khe đo

0,5 nm cho phép đo phổ của Ag vì tại vạch phổ này, phép đo cho độ nhạy và độ

ổn định tốt nhất.

3.1.3. Khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng

Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử dùng ngọn lửa trực tiếp (F-AAS) thì

nguồn phát tia bức xạ đơn sắc của nguyên tố cần xác định thường là đèn catôt

rỗng (HCL). Đèn HCL làm việc tại mỗi chế độ dòng nhất định sẽ cho chùm phát

xạ có cường độ nhất định. Cường độ làm việc của đèn catot rỗng (HCL) có liên

quan chặt chẽ tới cường độ hấp thụ của vạch phổ. Dòng điện làm việc đèn HCL

của mỗi nguyên tố là rất khác nhau. Mỗi đèn HCL đều có dòng giới hạn cực đại

(Imax) được ghi trên vỏ đèn. Theo lý thuyết và thực nghiệm phân tích phổ hấp

thụ nguyên tử, chỉ nên dùng cường độ trong vùng giới hạn từ 60 ÷ 80% Imax. Vì

nếu ở điều kiện dòng cực đại thì đèn làm việc không ổn định và rất chóng hỏng,

đồng thời phép đo có độ nhạy và độ lặp lại kém.

Với đèn HCL của bạc khảo sát tại máy quang phổ hấp thụ nguyên tử

NovAA - 400 tại phòng máy của bộ môn Hóa phân tích có Imax = 15 mA nên

33

chúng tôi đã tiến hành khảo sát cường độ đèn HCL trong vùng từ 60 ÷ 80% Imax.

Kết quả khảo sát cường độ đèn catốt rỗng với dung dịch với dung dịch Ag+ nồng

độ 3 ppm trong HNO3 2% nền NH4Ac 1% được chỉ ra ở bảng 3.3:

Bảng 3.3. Sự phụ thuộc phổ hấp thụ nguyên tử của Ag vào cường độ

đèn catốt rỗng

I (mA)

Imax=15mA

Abs

RSD (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung

bình

8 0,4051 0,4087 0,3994 0,4044 1,16

9 0,4011 0,4042 0,4059 0,4037 0,60

10 0,4131 0,4135 0,4128 0,4131 0,08

11 0,4002 0,4016 0,4037 0,4018 0,44

12 0,3985 0,3991 0,3984 0,3987 0,10

Kết quả chỉ ra ở bảng 3.3 cho thấy tại cường độ đèn bằng 10mA với phép

đo Ag cho độ hấp thụ quang lớn và độ ổn định cao. Vì vậy chúng tôi chọn cường

độ dòng đèn catốt rỗng bằng 10 mA cho phép đo Ag.

3.1.4. Khảo sát thành phần hỗn hợp khí cháy

Trong phép đo F – AAS, nhiệt độ của ngọn lửa là yếu tố quyết định quá

trình hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu. Nhiệt độ ngọn lửa đèn khí lại phụ thuộc vào

bản chất và thành phần của hỗn hợp khí đốt tạo ra ngọn lửa. Điều đó có nghĩa là

với mỗi một hỗn hợp khí đốt sẽ cho ngọn lửa có nhiệt độ khác nhau. Hai loại hỗn

hợp khí đã và đang được sử dụng phổ biến trong phép đo F – AAS là hỗn hợp

(không khí nén + Axetilen) và hỗn hợp (khí N2O + Axetilen). Với Ag nên dùng

ngọn lửa của hỗn hợp không khí nén và axetilen là phù hợp nhất. Để khảo sát

34

điều kiện tối ưu hóa ngọn lửa ta sử dụng dung dịch Ag 3 ppm trong HNO3 2%

nền NH4Ac 1% . Máy tự động điều chỉnh tốc độ dòng khí và chiều cao Burner

cho đến khi chọn được tín hiệu đo cao nhất và ổn định nhất. Kết quả khảo sát

được chỉ ra ở bảng 3.4:

Bảng 3.4. Khảo sát ảnh hưởng tốc độ dẫn khí đến độ hấp thụ của Ag

STT Tốc độ

(l/h)

Burner

(mm)

Gas/Ox Net Signal

1 80 6,0 0,230 0,0274

2 70 6,0 0,201 0,0311

3 60 6,0 0,172 0,0358

4 50 6,0 0,144 0,0374

5 40 6,0 0,115 0,0379

6 40 5,0 0,115 0,0382

7 45 5,0 0,129 0,0372

8 40 5,0 0,115 0,0367

Kết quả khảo sát ở bảng 3.4 cho thấy tại tốc độ dẫn khí C2H2 50 l/h ta thu

được các điều kiện tối ưu nhất. Vì vậy ta chọn thông số khảo sát tại tốc độ dẫn

khí là 50l/h và tỉ lệ C2H2/KK bằng 0,144.

3.1.5. Khảo sát tốc độ dẫn mẫu

Tốc độ dẫn mẫu cũng ảnh hương nhiều đến cường độ vạch phổ cần đo.

Đối với một hệ thống máy nhất định, tốc độ dẫn mẫu phụ thuộc vào độ nhớt của

mỗi loại dung dịch. Do đó tôi tiến hành khảo sát tốc độ dẫn mẫu của dung dịch,

kết quả thu được ở bảng 3.5:

35

Bảng 3.5. Khảo sát tốc độ dẫn mẫu

Tốc độ

(ml/ph)

Abs RSD

(%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB

3 0,3899 0,3822 0,3859 0,3860 1,11

3,5 0,3975 0,4022 0,4051 0,4016 0,96

4 0,4106 0,4109 0,4101 0,4105 0,12

4,5 0,3921 0,4051 0,4063 0,4012 2,01

5 0,3826 0,3912 0,3975 0,3884 2,03

5,5 0,3989 0,4019 0,3926 0,3978 1,19

6 0,3935 0,3970 0,3899 0,3935 0,91

Qua kết quả kháo sát được chỉ ra ở bảng 3.5 cho ta thấy tại tốc độ dẫn mẫu

4ml/ph cho phép đo có độ nhạy và độ ổn định cao nhất. Vì vậy ta chọn tốc độ

dẫn mẫu là 4ml/ph cho phép đo phổ của Ag.

3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới phép đo phổ F – AAS của Ag.

3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của các loại axit và nồng độ axit

Trong phép đo phổ F – AAS, với mẫu phân tích kim loại nặng thì dung

dịch mẫu phải được axit hóa để tránh hiện tượng tạo phức hidroxo, thủy phân

của ion kim loại. Nhưng nồng độ axit và các loại axit khác nhau trong dung dịch

mẫu lại luôn ảnh hưởng đến cường độ vạch phổ của nguyên tố phân tích thông

qua tốc độ dẫn mẫu, khả năng hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu.

Nói chung, các loại axit dễ bay hơi gây ảnh hưởng nhỏ, các loại axit khó

bay hơi và bền nhiệt gây ảnh hưởng lớn hơn. Các loại axit làm giảm cường độ

vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần phân tích theo thứ tự:

HClO4 < HCl < HNO3 < H3PO4 < HF

36

Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số loại axit có thể dùng

để hòa tan mẫu và tạo môi trường như HCl, HNO3, … ảnh hưởng tới cường độ

hấp thụ của Ag trên nguyên tắc giữ cố định nồng độ ion kim loại nhưng pha

trong các dung dịch axit có nồng độ biến thiên và khảo sát độ hấp thụ của

nguyên tố Ag 3 ppm từ dung dịch gốc. Kết quả khảo sát được chỉ ra ở bảng 3.6:

Bảng 3.6. Khảo sát nồng độ axit HNO3

HNO3 (%) Abs RSD

(%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

0 0,4098 0,4123 0,4106 0,4109 1,15

0,5 0,4034 0,4124 0,4136 0,4098 5,08

1 0,3979 0,3056 0,4082 0,4039 5,16

2 0,4179 0,4176 0,4170 0,4175 0,39

3 0,4093 0,4156 0,4120 0,4123 2,82

5 0,4013 0,4082 0,3956 0,4017 6,20

Theo kết quả khảo sát trên, chúng tôi chọn nồng độ axit mà tại đó độ hấp

thụ quang cao và ổn định, có độ lặp lại tốt tức là ít bị ảnh hưởng bởi nồng độ

axit. Ta thấy rằng, axit HNO3 với nồng độ 2% cho độ hấp thụ quang cao, ổn

định. Do đó ta chọn axit HNO3 2% làm môi trường axit hóa để đo phổ của Ag.

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng thành phần nền của mẫu

Trong một số trường hợp, các mẫu có chứa các nguyên tố nền dưới dạng

các chất bền nhiệt. Các chất này gây khó khăn, cản trở quá trình hóa hơi, nguyên

tử hóa mẫu, từ đó làm giảm độ nhạy của phương pháp phân tích và cường độ

vạch phổ. Để loại trừ ảnh hưởng của yếu tố này người ta có thể dùng nhiều biện

pháp khác nhau.

37

- Tăng thêm nhiệt độ nguyên tử hóa mẫu,

- Thêm vào mẫu các chất phụ gia có nồng độ phù hợp để ngăn cản sự xuất

hiện các hợp chất bền nhiệt,

- Tách bỏ nguyên tố nền khi hai phương pháp trên không đạt hiệu quả. Tất

nhiên biện pháp này rất hữu hạn.

Trong ba biện pháp này thì biện pháp thứ nhất chỉ được thực hiện trong

một chừng mực nhất định do sự hạn chế của trang thiết bị, bản chất của khí đốt.

Do đó chuyển mẫu sang các chất nền khác đây là một biện pháp được loại trừ

ảnh hưởng của các chất nền mẫu. Tuy nhiên đối với từng kỹ thuật đo mà thêm

vào các chất phụ gia khác nhau.

Trên cơ sở lý thuyết của phép đo F-AAS, chúng tôi tiến hành khảo sát với

chất nền CH3COONa (NaAc) và CH3COONH4 (NH4Ac) có nồng độ biến thiên

từ 0 – 5% đối với dung dịch Ag 3 ppm trong HNO3 2%. Kết quả được chỉ ra ở

bảng 3.7:

38

Bảng 3.7. Khảo sát ảnh hưởng thành phần nền của mẫu Ag

NH4Ac(%) Abs RSD (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

0 0,4007 0,3992 0,4034 0,4011 2,11

0,5 0,3956 0,3895 0,3877 0,3909 4,56

1 0,4081 0,4079 0,4074 0,4078 0,33

1,5 0,3898 0,3912 0,3935 0,3915 2,04

2 0,3995 0,4023 0,4011 0,4010 1,39

3 0,3972 0,3914 0,3901 0,3929 4,07

5 0,3890 0,3916 0,3923 0,3910 1,91

NaAc (%) Abs RSD (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

0 0,3911 0,3917 0,3921 0,3916 0,55

0,5 0,3885 0,3896 0,3882 0.3888 0,83

1 0,3884 0,3887 0,3877 0,3883 0,46

1,5 0,3984 0,3967 0,3974 0,3975 0,88

2 0,3926 0,3915 0,3923 0,3921 0,62

3 0,3901 0,3896 0,3912 0,3903 0,91

5 0,3927 0,3936 0,3931 0,3931 0,49

Kết quả khảo sát cho thấy nền NH4COOCH3 1% (NH4Ac) cho cường độ

cao nhất và ổn định nhất, độ lặp lại cao nhất trong số các nồng độ dung dịch đã

khảo sát. Do đó, từ đây chúng tôi chọn nền CH3COONH4 1% để làm dung dịch

nền trong phép đo phổ hấp thụ F – AAS cho nguyên tố Ag.

39

3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các cation

Một trong những yếu tố ảnh hưởng hóa học quan trọng trong phép đo phổ

hấp thụ nguyên tử F – AAS là ảnh hưởng của các cation.

Trong dung dịch mẫu phân tích, ngoài Cloxacilin còn có chứa rất nhiều

các cation khác nhau trong đó có các cation có hàm lượng lớn như K+, Na

+, Ca

2+,

Ba2+

, Mg2+

, … Do đó các cation có mặt trong mẫu phân tích có thể gây ra hiệu

ứng phức tạp đối với cường độ vạch phổ của nguyên tố phân tích. Vì vậy, chúng

tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các cation trong mẫu đối với cường độ vạch

phổ của Ag.

Để có cơ sở cho việc khảo sát ảnh hưởng của nguyên tố khác có mặt trong

mẫu phân tích, chúng tôi tiến hành khảo sát bán định lượng hàm lượng các

nguyên tố trong mẫu thịt lợn bằng phương pháp ICP-MS, kết quả được chỉ ra ở

bảng 3.8, còn các nguyên tố khác dưới giới hạn phát hiện (độ nhạy ICP-MS

0,1ppb):

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát hàm lượng các nguyên tố trong thịt lợn

TT Nguyên tố Hàm lượng

(ppm)

TT Nguyên tố Hàm lượng

(ppm)

1 Na < 0,001 7 Cu 0,026

2 K < 0,001 8 Pb 0,0083

3 Ca < 0,001 9 Zn 0,692

4 Ba 0,002 10 Al 0,011

5 Mg 11,5 11 Fe 0,117

6 Ni 0,007 12 Cr 0,039

40

Từ kết quả khảo sát sơ bộ thành mẫu phần phân tích, chúng tôi chia các

cation kim loại thành các nhóm như sau để khảo sát:

- Nhóm cation kim loại kiềm: K+, Na

+

- Nhóm cation kim loại kiềm thổ: Ca2+

, Mg2+

, Ba2+

- Nhóm cation kim loại hóa trị III: Al3+

, Fe3+

, Cr3+

- Nhóm cation kim loại nặng: Pb2+

, Cu2+

, Zn2+

, Ni2+

a. Khảo sát ảnh hƣởng của các cation kim loại kiềm

Mẫu nghiên cứu là dung dịch Ag 3 ppm trong HNO3 2% nền NH4Ac 1%

với sự có mặt của các cation kim loại kiềm ở khoảng nồng độ:

- Na+ với nồng độ từ 0 – 50 ppm

- K+ với nồng độ từ 0 – 50 ppm

Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.9:

Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của các cation kim loại kiềm

Mẫu C0 C1 C2 C3 C4

K+ (ppm) 0 10 20 30 50

Na+(ppm) 0 10 20 30 50

AbsTB-Ag 0,3987 0,3989 0,3991 0,3990 0,3989

RSD (%) 1,14 1,58 3,05 0,47 1,36

Kết quả khảo sát cho thấy với khoảng nồng độ K+, Na

+ như trên, khi có

mặt trong mẫu phân tích không làm ảnh hưởng đến phép đo phổ của Ag.

b. Khảo sát ảnh hƣởng của các cation kim loại kiềm thổ

Nhóm kim loại kiềm thổ được khảo sát trong dung dịch Ag 3 ppm trong

HNO3 2% nền NH4Ac 1% với sự có mặt của các cation kim loại kiềm thổ ở

khoảng nồng độ:

41

- Ca2+

với nồng độ từ 0 – 100 ppm

- Mg2+

với nồng độ từ 0 – 100 ppm

- Ba2+

với nồng độ từ 0 – 100 ppm

Kết quả khảo sát được chỉ ra ở bảng 3.10:

Bảng 3.10. Khảo sát ảnh hưởng của các cation kim loại kiềm thổ

Mẫu C0 C5 C6 C7 C8

Ca2+

(ppm) 0 10 40 80 100

Mg2+

(ppm) 0 10 40 80 100

Ba2+

(ppm) 0 10 40 80 100

AbsTB- Ag 0,3998 0,4002 0,4005 0,4010 0,4011

RSD (%) 1,38 2,51 0,79 2,29 1,59

Như vậy, với khoảng nồng độ Ca2+

, Mg2+

, Ba2+

như trên, khi có mặt trong

mẫu phân tích hầu như không làm ảnh hưởng đến phép đo phổ của Ag.

c. Khảo sát ảnh hƣởng của các cation kim loại hoá trị 3

Nhóm kim loại hoá trị 3 được khảo sát trong dung dịch Ag 3 ppm trong

HNO3 2% nền NH4Ac 1% với sự có mặt của các cation kim loại hoá tri 3 ở

khoảng nồng độ:

- Al3+

với nồng độ từ 0 – 50 ppm

- Fe3+

với nồng độ từ 0 – 100 ppm

- Cr3+

với nồng độ từ 0 – 10 ppm

Kết quả khảo sát được chỉ ra ở bảng 3.11:

42

Bảng 3.11. Khảo sát ảnh hưởng của các cation kim loại hóa trị III

Mẫu C0 C9 C10 C11 C12

Al3+

(ppm) 0 10 20 40 50

Abs TB 0,4007 0,4008 0,4011 0,4015 0,4012

RSD (%) 1,37 1,55 1,19 0,57 2,03

Mẫu C0 C13 C14 C15 C16

Fe3+

(ppm) 0 20 60 80 100

Abs TB 0,3981 0,3986 0,3991 0,3994 0,3989

RSD (%) 0,89 2,48 2,01 1,45 1,17

Mẫu C0 C17 C18 C19 C20

Cr3+

(ppm) 0 2 4 8 10

AbsTB- Ag 0,3983 0,4011 0,4010 0,3978 0,3985

RSD (%) 0,84 0,56 1,14 1,72 2,09

Kết quả khảo sát cho thấy, trong dung dịch mẫu phân tích khi có mặt của

các kim loại hoá trị 3 ở các khoảng nồng độ đã khảo sát hầu như không gây ảnh

hưởng đến phép đo phổ của Ag.

d. Khảo sát ảnh hƣởng của các cation kim loại hoá trị II

Mẫu nghiên cứu là dung dịch Ag 3 ppm trong HNO3 2% nền NH4Ac 1%

với sự có mặt của các cation kim loại nặng ở khoảng nồng độ:

- Pb2+

với nồng độ từ 0 – 10 ppm

- Cu2+

với nồng độ từ 0 – 10 ppm

- Zn2+

với nồng độ từ 0 – 10 ppm

- Ni2+

với nồng độ từ 0 – 10 ppm

43

Kết quả khảo sát được chỉ ra ở bảng 3.12:

Bảng 3.12. Khảo sát ảnh hưởng các cation kim loại hoá trị II

Kết quả khảo sát cho thấy, khi có mặt của các cation kim loại nặng với

khoảng nồng độ như trên thì việc đo phổ của Ag không bị ảnh hưởng.

e. Khảo sát ảnh hƣởng của tổng các cation

Trong các thí nghiệm trên chúng tôi đã kháo sát ảnh hưởng của từng

cation, tuy nhiên trong mẫu thực thì các cation này có mặt đồng thời. Do vậy,

chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các cation trên khi chúng có mặt

đồng thời trong dung dịch.

Dung dịch khảo sát là Ag 3 ppm trong HNO3 2% nền NH4Ac 1% cùng sự

có mặt của tất cả các cation đã khảo sát ớ trên với các nồng độ khác nhau. Kết

quả khảo sát được chỉ ra ở bảng 3.13:

Mẫu (ppm) C0 C21 C22 C23 C24

Pb2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Cu2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Zn2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Ni2+

(ppm) 0 2 4 8 10

AbsTB- Ag 0,4003 0,4006 0,4011 0,3997 0,3994

RSD (%) 2,48 1,78 0,19 1,47 2,25

44

Bảng 3.13. Khảo sát ảnh hưởng của tổng cation

Mẫu C0 C25 C26 C27 C28

K+ (ppm) 0 10 20 30 50

Na+

(ppm) 0 10 20 30 50

Ca2+

(ppm) 0 10 40 80 100

Mg2+

(ppm) 0 10 40 80 100

Ba2+

(ppm) 0 10 40 80 100

Al3+

(ppm) 0 10 20 40 50

Fe3+

(ppm) 0 20 60 80 100

Cr3+

(ppm 0 2 4 8 10

Pb2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Cu2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Zn2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Ni2+

(ppm) 0 2 4 8 10

AbsTB- Ag 0,3989 0,3993 0,4005 0,4010 0,3987

RSD (%) 1,79 0,61 2,02 1,51 2,04

Kết quả khảo sát cho thấy, sự có mặt đồng thời của các cation ở các

khoảng nồng độ đã khảo sát không làm ảnh hưởng đến phép đo phổ của Ag.

f. Khảo sát ảnh hƣởng của các anion

Trong mẫu thực, ngoài các ion có sẵn còn có nhiều anion phát sinh trong

quá trình xử lý mẫu như 2

4SO , 3

4PO ,… Do đó chúng tôi đã tiến hành nhiều thực

nghiệm để khảo sát ảnh hưởng của chúng tới độ hấp thụ quang của Ag. Dung

dịch khảo sát là Ag 3 ppm trong HNO3 2% và CH3COONH4 1%. Kết quả thực

nghiệm được chỉ ra ở bảng 3.14:

45

Bảng 3.14. Khảo sát ảnh hưởng của các anion

Mẫu C0 C29 C30 C31 C32

3

4PO (ppm) 0 20 30 40 50

2

4SO (pm) 0 20 30 40 50

AbsTB- Ag 0,4001 0,4005 0,3991 0,3989 0,4010

RSD (%) 2,05 1,92 3,07 2,35 0,84

Kết quả khảo sát cho thấy, với sự có mặt của các anion 2

4SO , 3

4PO như

trên trong dung dịch mẫu phân tích không làm ảnh hưởng đến phép đo phổ của

Ag.

g. Khảo sát ảnh hƣởng của tổng các cation và anion

Trong thực tế ở dung dịch mẫu thực thì các cation và anion này không tồn

tại một cách độc lập. Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các

cation và anion khi chúng có mặt đồng thời trong dung dịch. Dung dịch khoả sát

là Ag 3 ppm trong HNO3 2% và CH3COONH4 1%. Kết quả thực nghiệm được

chỉ ra ở bảng 3.15:

46

Bảng 3.15. Khảo sát ảnh hưởng của tổng cation và anion

Mẫu C0 C33 C34 C35 C36

K+ (ppm) 0 10 20 30 50

Na+

(ppm) 0 10 20 30 50

Ca2+

(ppm) 0 10 40 80 100

Mg2+

(ppm) 0 10 40 80 100

Ba2+

(ppm) 0 10 40 80 100

Al3+

(ppm) 0 10 20 40 50

Fe3+

(ppm) 0 20 60 80 100

Cr3+

(ppm) 0 2 4 8 10

Pb2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Cu2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Zn2+

(ppm) 0 2 4 8 10

Ni2+

(ppm) 0 2 4 8 10

3

4PO (ppm) 0 20 30 40 50

2

4SO (ppm 0 20 30 40 50

AbsTB- Ag 0,4111 0,4114 0,4108 0,4109 0,4105

RSD (%) 0,46 1,52 1,36 2,23 1,96

Kết quả khảo sát cho thấy, khi có mặt tổng cation và anion trong dung

dịch hầu như không làm ảnh hưởng đến phép đo phổ của Ag, mặc dù nồng độ

này đã lớn hơn thực tế nó có trong mẫu phân tích.

47

3.3. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá phép đo F – AAS của Ag

3.3.1 .Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính và xây dựng đường

chuẩn

Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, tín hiệu hấp thụ của vạch phổ phụ

thuộc vào nồng độ của các nguyên tố cần phân tích và được xác định theo

phương trình:

Aλ = k.Cb

Trong đó:

Aλ: Cường độ hấp thụ tại bước sóng λ

k: Hằng số thực nghiệm

C: Nồng độ nguyên tố trong mẫu phân tích đo phổ

b: Hằng số bản chất, phụ thuộc vào nồng độ C (0<b<1)

Trong một khoảng nồng độ nhất định và nhỏ thì b = 1, mối quan hệ giữa A

và C là tuyến tính theo phương trình có dạng y = ax. Khoảng nồng độ này được

gọi là khoảng tuyến tính của phép đo. Đối với các nguyên tố khác nhau thì giá trị

khoảng tuyến tính là khác nhau và phụ thuộc vào kỹ thuật đo.

Để xác định khoảng tuyến tính của Ag, chúng tôi chuẩn bị một dãy mẫu

chuẩn có nồng độ Ag biến thiên từ 0,5 ppm ÷ 10 ppm trong HNO3 2%,

CH3COONH4 1%, mỗi mẫu đo 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả thu được

được biểu diễn dưới bảng 3.16 (đã trừ đi mẫu trắng).

48

Bảng 3.16. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của Ag

Mẫu 1 2 3 4 5 6

CAg(ppm) 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0

AgAbs 0,0669 0,1413 0,2059 0,2745 0,4179 0,5538

RSD(%) 0,57 0,42 0,72 0,49 0,96 0,51

Mẫu 7 8 9 10 11 12

CAg(ppm) 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

AgAbs 0,6743 0,7620 0,8231 0,8301 0,8612 0,8673

RSD(%) 1,12 0,78 0,61 1,09 0,83 0,69

0 2 4 6 8 10

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0Abs

Ag

CAg

(ppm)

Hình 3.1. Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của bạc

49

Nhận xét: Qua kết quả thực nghiệm chỉ ra ở bảng 3.16 và hình 3.1 cho

thấy khoảng nồng độ tuyến tính của Ag là 0,5 ÷ 5 ppm. Từ đó ta có kết quả

đường chuẩn được chỉ ra ở bảng 3.17:

Bảng 3.17. Kết quả dựng đƣờng chuẩn

Mẫu 1 2 3 4 5 6 7

CAg(ppm) 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 5,0

AgAbs 0,0669 0,1413 0,2059 0,2745 0,4179 0,5538 0,6743

%RSD 0,57 0,42 0,72 0,49 0,96 0,51 1,12

Từ các kết quả ở các bảng trên, chúng tôi dùng phần mềm Origin của hãng

OriginLab để xác định phương trình đường chuẩn của Ag

0 1 2 3 4 5

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

CAg

(ppm)

AbsAg

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0,00351 0,00442

B 0,13588 0,00154

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99968 0,00621 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn của bạc

50

Vậy phương trình đường chuẩn là: Y = 0,0035 + 0,1359 . X

Tra bảng ta có t(0,95; 6) = 2,447

∆A = t(0,95; 6) . SA = 2,447 . 0,00442 = 0,0108

∆B = t(0,95; 6) . SB = 2,447 . 0,00154 = 0,0038

Ta có phương trình hồi quy đầy đủ như sau:

Y = (0,1359 ± 0,0038) . X + (0,0035 ± 0,0108)

3.3.2. Kiểm tra hằng số trong phương trình hồi quy

Để kiểm tra sai số hệ thống của phương pháp cần so sánh hằng số A của

phương trình hồi quy với giá trị 0.

Nếu xem A=0, phương trình trở thành: Y = B’. X

Các giá trị B’ được tính theo bảng 3.18:

Bảng 3.18. Các giá trị B’

X 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 5,0

Y 0,0669 0,1413 0,2059 0,2745 0,4179 0,5538 0,6743

B’ 0,1338 0,1413 0,1373 0,1372 0,1393 0,1384 0,1349

Và các giá trị liên quan đến hệ số B’ cũng lần lượt được chỉ ra ở bảng 3.19:

Bảng 3.19. Các giá trị liên quan đến B’

Mean Trung bình 0,1375

Standard Error Độ sai chuẩn 0,0009

Standard Deviation Độ lệch chuẩn 0,0024

Sample Virance Phương sai mẫu 6,510-6

Sum Tổng 0,9622

51

Nếu A ≠ 0 không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%, phương trình

hồi quy có dạng: '

( ' . ).B

Y B t S X

Ta có (0,1375 2,45.0,0009).Y X

(0,1375 0,0022).Y X

Áp dụng công thức: 2( . )i iSS Y A B X và 2

2

SSS

n

2' ( '. )i iSS Y B X và 2 ''

3

SSS

n

Ta có bảng giá trị sau:

Hàm Tổng các bình phương Bậc tự do Phương sai

'.Y B X SS’ = 2,3610-4

4 5,9010-5

.Y A B X SS = 1,9210-4

5 3,8410-5

Có Ftính 2 5

2 5

' 5,9 101,54

3,84 10

S

S

Fbảng(0,95; 4; 5) = 5,1922

Vậy Ftính < Fbảng(0,95; 4; 5) có nghĩa là sự sai khác giữa giá trị A và

0 không có ý nghĩa thống kê hay phương pháp không mắc sai số hệ thống.

3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

a. Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân

tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín

hiệu nền.

Vậy giới hạn phát hiện là:

LOD = y3. S 3.0,00620,14

0,1359B ppm

52

b. Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ được xem như là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống

định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu

của mẫu trắng hay tín hiệu nền và đạt độ tin cậy ≥ 95%.

LOQ được xác định theo công thức:

LOQ = y10. S 10.0,00620,46

0,1359B ppm

Vậy khoảng tuyến tính của phép đo là từ 0,5 ppm đến 5 ppm

3.3.4. Tính nồng độ chất phân tích dựa trên dường chuẩn

Từ phương trình hồi qui tìm được, khi mẫu định phân có tín hiệu phân tích

Y0 thì có thể tính được nồng độ chưa biết X0 theo công thức:

B

AYX 0

0

Theo định luật lan truyền sai số, độ lệch chuẩn của nồng độ X0 được tính:

S xo =

i

i xxB

yy

nB

Sy22

2

0

)(

)(11

Nếu mẫu chưa biết được phân tích lặp lại m lần thu được giá trị 0y thì:

S xo =

i

i xxB

yy

nmB

Sy22

2

0

)(

)(11

Trong đó:

Sx0 : độ lệch chuẩn ước đoán

Y0 : giá trị thực nghiệm thu được khi phân tích mẫu có nồng độ X0

n: số mẫu chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

m: số lần đo lặp của một mẫu phân tích

Kết quả phân tích mẫu chưa biết sẽ được viết dưới dạng: X0 t.Sx0 với bậc

tự do f = n – 2.

53

3.4. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phƣơng pháp đo Ag

Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo ta dựng đường chuẩn, pha 3

mẫu có nồng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính.

Thực hiện đo mỗi mẫu 8 lần.

Sai số tính theo công thức:

% X = Ai – At

   At

. 100

Trong đó:

%X: sai số phần trăm tương đối

Ai: độ hấp thụ quang của Ag đo được

At: độ hấp thụ quang của Ag tìm được theo đường chuẩn

Độ lặp lại của phép đo được xác định theo các đại lượng S2 và %RSD. Các

đại lượng này được tính theo công thức:

S2 =

2

Ai Atb 

n 1

và %RSD =  

Atb

S.100

Trong đó: Atb: độ hấp thụ quang trung bình của Ag

n: số lần đo

S: độ lệch chuẩn

%RSD: hệ số biến động của phép đo

Kết quả phân tích được chỉ ra trong bảng 3.20:

54

Bảng 3.20. Kết quả sai số và độ lặp lại của phép đo

Mẫu 1 2 3

CAg(ppm) 0,50 3 5

Abs 0,0714 0,4112 0,6830

Lần đo Ai %X Ai %X Ai %X

1 0,0672 6,30 0,4109 0,07 0,6945 1,68

2 0,0669 6,30 0,4096 0,39 0,6927 1,42

3 0,0684 4,20 0,4110 0,05 0,6911 1,19

4 0,0701 1,82 0,4118 0,14 0,6907 1,13

5 0,0709 0,70 0,4089 0,56 0,6859 0,42

6 0,0684 4,20 0,4083 0,71 0,6873 0,63

7 0,0692 3,08 0,4092 0,49 0,6978 2,17

8 0,0675 5,46 0,4114 0,05 0,6962 1,93

Atb 0,0686 2,58 0,4101 0,27 0,6920 1,32

S 0,0014 0,0013 0,0041

%RSD 2,04 0,31 0,59

Nhận xét: kết quả khảo sát cho thấy sai số và hệ số biến động của phép đo

đều nhỏ và nằm trong giới hạn cho phép. Hệ số biến thiên ở 3 vùng đều khá nhỏ,

vì vậy có thể kết luận sai số của phép đo nhỏ, độ lặp lại của phép đo tốt. Sai số ở

giữa đường chuẩn luôn nhỏ hơn ở 2 đầu đường chuẩn và tuân theo quy định phân

bố sai số Gause.

55

3.5. Tổng kết các điều kiện đo phổ F – AAS của Ag

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi thu được các điều kiện phù

hợp để đo phổ F – AAS của Ag được chỉ ra ở bảng 3.21:

Bảng 3.21. Tổng kết các điều kiện đo phổ F – AAS của Ag

Thông số máy

Các yếu tố Giá trị tối ƣu

Vạch phổ hấp thụ (nm) Ag – 328,1

Khe đo (nm) 0,5

Cường độ dòng đèn HCL (mA) 10 (66,67% Imax)

Chiều cao Burner (mm) 6

Tốc độ dẫn khí:

Không khí/axetylen (l/h) 50/7,2

Tốc độ dẫn mẫu(ml/phút) 4

Thành phần nền Nồng độ HNO3(%) 2

Nồng độ CH3COONH4 (%) 1

Giới hạn phát hiện (ppm) 0,14

Giới hạn định lượng (ppm) 0,46

Khoảng tuyến tính (ppm) 0,5 – 5

3.6. Khảo sát các điều kiện phân huỷ Cloxacilin

Cloxacilin là một chất không có phổ hấp thụ nguyên tử, vì vậy chúng tôi

tiến hành nghiên cứu để xác định gián tiếp Cloxacilin thông qua một nguyên tố

có phổ hấp thụ nguyên tử đó là Ag, vì trong phân tử Cloxacilin chỉ chứa duy nhất

một ion -Cl và tạo kết tủa khó tan với Ag. Thông qua việc đo phổ hấp thụ nhạy

của Ag, nhờ phản ứng hóa học trung gian giữa chất phân tích Cloxacilin qua Clo

56

và nguyên tố có phổ hấp thụ nhạy Ag, có tính chất hoàn toàn định lượng. Vì thế

phải nghiên cứu chọn điều kiện làm sao phải phá vỡ hết phân tử Cloxacilin giải

phóng ion -Cl để tạo kết tủa AgCl. Quá trình này quyết định đến hiệu suất của

phương pháp xác định Cloxacilin.

Trong quá trình phân huỷ này cứ một phân tử Cloxacilin cho một ion -Cl

và ta thu được một phân tử AgCl. Kết tuả AgCl được tạo thành màu trắng và có

tích số tan 1,56.10-10

, không tan trong HNO3 loãng. Vì thế ta phải khảo sát tìm

các điều kiện thích hợp phân huỷ Cloxacilin để tạo kết tủa định lượng AgCl từ

mẫu phân tích với hiệu suất cao và ổn định.

3.6.1. Ảnh hưởng của môi trường KOH đến hiệu suất phân huỷ

Cloxacilin giải phóng clo

Do tính chất của Cloxacilin dễ bị phân huỷ trong môi trường kiềm và đó

cũng là mục tiêu của chúng tôi nghiên cứu điều kiện để phân tử Cloxacilin bị

phân huỷ tách ra ion Cl- và tiến hành kết tủa ion Cl

- bằng Ag

+. Nồng độ KOH

không phù hợp có thể ảnh hưởng đến khả năng phân huỷ Cloxacilin do đó ảnh

hưởng đến hiệu suất kết tủa AgCl. Như vậy, cần nghiên cứu lượng kết tủa AgCl

tăng hay giảm khi nồng độ KOH thay đổi. Do đó chúng tôi khảo sát một dãy

mẫu có lượng Ag+ và Cloxacilin đem kết tủa là như nhau, nồng độ KOH làm môi

trường cho Cloxacilin phân huỷ thay đổi từ 0,1M2M.

Sau khi phân huỷ bằng KOH dung dịch được để nguội ở nhiệt độ phòng,

sau đó dùng HNO3 điều chỉnh môi trường để được pH = 3,8. Tiến hành kết tủa

AgCl, ly tâm lọc tách kết tủa, đưa các dung dịch lọc về cùng điều kiện nồng độ

HNO3 trong mẫu là 2% với nền NH4Ac 1%, đo lượng dư Ag và tính hiệu suất

phản ứng. Kết quả thực nghiệm được chỉ ra ở bảng 3.22:

57

Bảng 3.22. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ KOH

Nồng độ KOH(M) Hiệu suất (%)

0,1 71,40

0,5 80,36

1,0 89,92

1,5 86,24

2,0 81,56

Từ kết quả cho thấy để đạt được hiệu suất kết tủa cao thì chúng ta phải

tiến hành phân huỷ mẫu với nồng độ KOH 1M. Nếu môi trường KOH quá cao

thì dẫn tới hiệu suất kết tủa giảm.

3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất

Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất kết tủa Ag,

chúng tôi khảo sát một dãy mẫu với nồng độ Ag+ và Cloxacilin đem kết tủa là

như nhau, môi trường KOH như nhau là 1M, nhưng điều kiện nhiệt độ phân huỷ

Cloxacilin là khác nhau. Sau mỗi điều kiện khác nhau đem ly tâm, tách bỏ kết

tủa và đem đo Ag dư. Chúng tôi tiến hành đun cách thuỷ Cloxacilin ở các nhiệt

độ khác nhau trong thời gian như nhau là 20 phút. Kết quả khảo sát được trình

bày ở bảng 3.23:

58

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của nhiệt độ phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất

Nhiệt độ(0C)

Hiệu suất (%)

Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 TB

Nhiệt độ phòng 250C 72,84 71,98 72,50 72,44

500C 73,98 74,06 74,22 74,09

600C 79,16 79,26 79,12 79,18

700C 83,90 84,14 84,26 84,10

800C 89,96 90,06 90,10 90,04

900C 87,06 87,22 87,18 87,15

980C 85,74 85,90 86,06 85,90

Theo kết quả đo được, mẫu sau khi đun ở 080 C hiệu suất kết tủa cao

nhất. Vậy chúng tôi chọn đun cách thuỷ ở 080 C để phân huỷ Cloxacilin.

3.6.3. Ảnh hưởng của thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất

Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đun ở 800C phản ứng tạo kết tủa

AgCl, chúng tôi khảo sát một dãy mẫu với nồng độ Ag+ và Cloxacilin đem kết

tủa là như nhau, môi trường KOH là như nhau 1,0M, nhưng thời gian đun để

phân huỷ Cloxacilin thay đổi từ 5 30 phút. Kết quả khảo sát được chỉ ra ở bảng

3.24:

59

Bảng 3.24. Ảnh hưởng của thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất

Thời gian đun

(phút)

Hiệu suất (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB

5 32,70 32,94 33,01 32,88

10 45,32 45,48 45,53 45,44

15 68,36 68,52 68,55 68,48

20 89,76 89,87 89,80 89,81

25 87,15 87,21 87,35 87,24

30 82,19 82,33 82,48 82,33

Kết quả khảo sát ở bảng 3.24 cho thấy, sau khi tiến hành đun ở nhiệt độ

800C với khoảng thời gian là 20 phút thì cho ta hiệu suất kết tủa cao nhất. Vì vậy

chúng tôi chon thời gian đun ở nhiệt độ 800C là 20 phút.

3.6.4. Ảnh hưởng của thời gian đến kết tủa AgCl

Mẫu Cloxacilin sau khi phân hủy được đưa về nhiệt độ phòng là 250C và

tiến hành cho kết tủa với Ag+, nhưng qua thực nghiiệm cho thấy thời gian làm

muồi để tạo kết tủa AgCl khác nhau có ảnh hưởng tới lượng kết tủa thu được. Vì

vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến kết tủa AgCl.

Để tiến hành khảo sát, chúng tôi chuẩn bị một dãy mẫu có nồng độ Ag+ và

Cloxacilin là như nhau, sau khi đã tiến hành phân huỷ Cloxacilin trong điều kiện

đã nghiên cứu ở trên rồi đưa dung dịch về nhiệt độ phòng và dùng HNO3 điều

chỉnh môi trường để được pH=3,8 rồi tiến hành tạo kết tủa với Ag+, thời gian để

tạo kết tủa là khác nhau. Tiến hành kết tủa, ly tâm lọc tách kết tủa, đưa các dung

60

dịch lọc về cùng điều kiện nồng độ HNO3 trong mẫu là 2% với nền NH4Ac 1%,

đo lượng dư Ag. Kết quả khảo sát được chỉ ra ở bảng 3.25:

Bảng 3.25. Ảnh hưởng của thời gian đến kết tủa AgCl

Thời gian(phút) Hiệu suất kết tủa(%)

5 40,56

10 70,39

15 89,67

20 80,24

25 60,17

30 57,32

Qua kết quả khảo sát ở bảng 3.25 cho ta thấy để tạo kết tủa AgCl trong

thời gian 15 phút là tốt nhất. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian để kết tủa AgCl là

15 phút.

3.7. Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện của Cloxacilin ở đây có nghĩa là chúng tôi tiến hành

khảo sát nồng độ của cloxacilin nhỏ nhất mà ở đó hiệu suất kết tủa còn nằm ở

mức thấp cho phép phát hiện cloxacilin. Mỗi nồng độ chúng tôi tiến hành làm 03

mẫu và lấy kết quả là hiệu suất trung bình của 03 lần thí nghiệm. Kết quả được

ghi ở bảng 3.26:

61

Bảng 3.26. Giới hạn phát hiện Cloxacilin

Mẫu số Cloxacilin(ppm) Hiệu suất (%)

1 0,08 <1

2 0,09 44,32

3 0,10 60,45

4 0,20 83,21

5 0,30 88,54

6 0,40 90,43

7 0,50 91,12

8 0,60 90,79

9 0,70 91,02

10 0,80 91,09

Nhận xét: Từ kết quả trên cho ta thấy giới hạn phát hiện Cloxacillin là

0,08 ppm, tuy nhiên hiệu suất kết tủa thấp. Do đó, định lượng chính xác

cloxacilin trong dung dich mẫu thì nồng độ phải 0,3 ppm, vì đạt yêu cầu

85%.

3.8. Xác định Cloxacilin trong mẫu thực

3.8.1. Lấy mẫu

Qua một số tìm hiểu và xuất phát từ mục đích xác định hàm lượng Clo

trong mẫu thực phẩm (thịt gà, gan gà công nghiệp, thịt lợn, gan lợn nuôi tăng

trọng), chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở những khu vực chợ xung quanh địa bàn

tỉnh Vĩnh Phúc. Mẫu sau khi lấy được đựng trong túi nilon sạch và đưa về

phòng thí nghiệm. Rửa sạch, tráng lại nhiều lần bằng nước cất hai lần. Sau đó để

62

cho ráo nước rồi cân trọng lượng tươi.Tất cả các hộp đựng mẫu đều được dán

nhãn, ghi rõ tên mẫu, thời gian và địa điểm lấy mẫu.

Bảng 3.27. Danh sách địa điểm và thời gian lấy mẫu

STT Loại mẫu Địa điểm Thời gian

M1 Thịt gà Chợ thị xã Vĩnh Yên 15/08/2011

M2 Gan gà Chợ thị xã Vĩnh Yên 15/08/2011

M3 Thịt lợn Chợ thị xã Vĩnh Yên 15/08/2011

M4 Gan lợn Chợ thị xã Vĩnh Yên 15/08/2011

M5 Thịt gà Chợ Tam Dương 15/08/2011

M6 Gan gà Chợ Tam Dương 15/08/2011

M7 Thịt lợn Chợ Tam Dương 15/08/2011

M8 Gan lợn Chợ Tam Dương 15/08/2011

3.8.2. Xử lý mẫu

Chúng tôi tiến hành sử lý mẫu thực phẩm như sau:

Đối tượng xử lý mẫu của chúng tôi là xác định hàm lượng Cloxacillin

trong thực phẩm. Vì vậy chúng tôi đã tham khảo quy trình xử lý mẫu của FAO

và nghiệm lại để áp dụng.

Đối với mẫu thực phẩm: Rửa sạch, tráng nước cất, để ráo nước rồi xay

nhuyễn, sau đó cân 10,00 gam mẫu vào bình nón có nút nhám 50 ml, thêm 20 ml

đệm McIlvaine-EDTA và lắc mạnh bằng máy lắc ngang trong 30 phút. Gạn lấy

dịch trong vào bình nón khác, bã được chiết tiếp hai lần như trên mỗi lần bằng 5

ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA, gộp dịch trong vào bình nón, thêm 3 ml

axit tricloaxetic 0,5 g/ml vừa cho vừa lắc nhẹ trong khoảng 1 phút. Để bình nón

63

vào nước đá khoảng 15 phút, lọc thu lấy dịch trong vào bình nón 30 ml. Dịch lọc

sau đó được cho qua cột SPE-C18 (hoạt hóa bằng 6 ml MeOH, 6 ml nước cất).

Rửa cột SPE bằng 10 ml nước cất, hút chân không đến khô. Rửa giải bằng 2 ml

axit oxalic trong metanol. Dịch rửa giải chính là dung dịch dùng để xác định

Cloxacillin.

3.8.3. Chuẩn bị mẫu và phân tích mẫu

Chuẩn bị mẫu

Lấy dịch lọc mẫu thu được ở trên cho vào ống nghiệm 10ml. Cho tiếp V

(ml) KOH 2M sao cho có nồng độ là 1M, lắc đều, đậy nút đun ở nhiệt độ 080 C

trong khoảng 20 phút. Sau đó lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng, trung hoà mẫu

bằng HNO3 đến pH=3,8, rồi thực hiện phản ứng kết tủa ion Cl giải phóng ra

bằng 0,2 ml (V0) Ag1000 ppm (C0) trong khoảng 15 phút. Sau đó, ly tâm lọc bỏ

kết tủa AgCl và định mức dung dịch thành 50 ml (V1) bằng nước cất 2 lần. Lấy

5ml dung dịch V1, thêm 2ml HNO3 10% và 1ml NH4Ac 10% định mức thành

10ml, lắc đều và đem đo phổ của Ag dư.

Tiến hành phân tích

Đo phổ mẫu phân tích và mẫu chuẩn sau khi đã được chuẩn bị trong cùng

điều kiện.

- Cho máy chạy và đặt các thông số máy như đã chọn, để máy ổn định.

- Mở không khí nén và khí axetylen vào máy, kiểm tra và đặt tốc độ khí.

Bật ngọn lửa đèn khí.

- Kiểm tra toàn bộ các thông số máy và điều kiện đo

- Xét điểm zero của hệ thống máy đo

- Tiến hành đo phổ của Ag theo thứ tự lần lượt các mẫu:

+ Mẫu trắng

64

+ Mẫu để dựng đường chuẩn

+ Mẫu phân tích (mỗi mẫu được đo 03 lần để lấy giá trị trung bình)

Tính kết quả

- Dựng đường chuẩn theo hệ toạ độ AbsAg- CAg với AbsAg là hệ số hấp thụ tương

ứng với nồng độ Ag trong dãy mẫu.

- Dùng đường chuẩn xác định nồng độ Cx của Ag dư trong mỗi mẫu phân tích.

- Tính số mg Cloxacilin có trong 1ml của mỗi mẫu đưa vào phản ứng như sau:

Số mol Ag ban đầu cho vào phản ứng để kết tủa lượng ion Cl là n0:

-6C ×V 100 0

n = (mol)0 MAg

Số mol Ag dư trong mẫu sau khi lọc bỏ kết tủa AgCl là n1:

-6C ×V ×F 10x 1

n = (mol)1 MAg

10-6

: Là đơn vị chuyển từ microgram (μg ) sang gam (g).

F : Hệ số pha loãng.

MAg : Nguyên tử lượng của bạc (MAg = 107,87).

Theo phản ứng, cứ 1mol Ag+ thì phản ứng với 1mol -Cl .

- + 0 1Cl Ag phan ungn = n = n - n

Theo sơ đồ phản ứng cứ phân huỷ 1mol Cloxacilin thì thu được 1mol -Cl .

Số mol Cloxacilin xác định được là n2.

-6

0 0 x 12 0 1

Ag

(C ×V -C ×V ×F)×10n = n - n = (mol)

M

65

Vậy số mg Cloxacilin thu được là:

3

0 2 Cloxacilinm = n ×M ×10 (mg)

MCloxacilin: Phân tử lượng của Cloxacilin

3.8.4. Xác định độ thu hồi

Dựa vào việc thêm mẫu chuẩn vào mẫu thực, cùng với việc tiến hành làm

mẫu thực không có mẫu chuẩn song song, chúng tôi tính độ thu hồi như sau:

Độ thu hồi = 2

1

100%M

M

M1: Lượng Cloxacilin (ppm) biết trước thêm vào

M2: Lượng Cloxacilin (ppm) xác định được

Dựa vào đường chuẩn làm song song với mẫu thực chúng tôi thu được kết

quả của mẫu thêm chuẩn và đem so với giá trị cho vào, mỗi nồng độ làm 03 mẫu

và lấy kết quả trung bình. Ta có kết quả chỉ ra ở bảng 3.28:

Bảng 3.28. Độ thu hồi

Mẫu số M1 (ppm) M2 (ppm) Độ thu hồi (%)

1 0,10 0,051 51,00

2 0,20 0,157 78,50

3 0,30 0,260 86,67

4 0,40 0,350 `87,50

5 0,50 0,451 90,20

6 0,60 0,542 90,33

7 0,70 0,639 91,28

8 0,80 0,739 92,38

66

Qua kết quả khảo sát trên, với hàm lượng Cloxacillin nhỏ hơn 0,30 (ppm)

thì thu được hiệu suất thu hồi thấp. Do đó phương pháp này cho phép xác định

chính xác hàm lượng Cloxacillin đến 0,30 ppm (đảm bảo hiệu suất >85%). Vì

vậy khi tiến hành phân tích nên lấy lượng mẫu sao cho hàm lượng Cloxacillin

lớn hơn 0,30 ppm để có được kết quả phân tích tốt nhất.

3.9. Kết quả phân tích một số mẫu thực

Mẫu phân tích được xử lý theo quy trình ở mục 3.7.2, và mẫu đo được

chuẩn bị theo mục 3.7.3 sau đó tiến hành đo phổ F-AAS theo các điều kiện đã

chọn ở mục 3.4 để xác định nồng độ Ag dư. Kết quả được đưa ra trong bảng

3.29. Kết quả này là kết quả trung bình 8 mẫu, mỗi mẫu đo 3 lần, đã trừ blank

Sử dụng phương trình hồi quy thiết lập được ở mục 3.3, ta tính được nồng

độ Ag dư trong mẫu theo biểu thức: oo

Y AX

B

Độ lệch chuẩn: S xo = 2

0/

2 2

( )1 1

( )

Y X

i

i

Y YS

B m n B X X

7

1 0,33357

i

i

Y

Y

7

2

1

( )i

i

X X

15,3494

Với m=4, n=7, B= 0,1359; SX/Y = 0,0062. Thay các giá trị ở bảng trên vào

ta tính được S Xo; với t(0,95; 5)= 2,571

67

Bảng 3.29. Kết quả xác định lượng Cloxacilin trong mẫu (Đã lấy ở bảng 3.27)

Tên

mẫu oY

oX XoS .o XoX t S CCloxacilin

(mg/kg)

Mẫu 1 0,2745 1,9941 0,0022 1,9941± 0,0056 < LOQ

Mẫu 2 0,2749 1,9971 0,0031 1,9971 ± 0,0079 < LOQ

Mẫu 3 0,2754 2,0001 0,0031 2,0001 ± 0,0079 < LOQ

Mẫu 4 0,2752 1,9993 0,0025 1,9993 ± 0,0065 < LOQ

Mẫu 5 0,2753 2,0000 0,0031 2,0000 ± 0,0079 < LOQ

Mẫu 6 0,2737 1,9882 0,0033 1,9882 ± 0,0086 0,7256

Mẫu 7 0,2750 1,9978 0,0029 1,9978 ± 0,0076 < LOQ

Mẫu 8 0,2740 1,9901 0,0031 1,9901 ± 0,0080 0,3988

Qua kết quả trên cho thấy trong 08 mẫu thực phân tích thì có 02 mẫu là

xác định được hàm lượng Cloxacilin còn 06 mẫu thì đều nhỏ hơn giới hạn định

lượng. Tuy nhiên trong 02 mẫu xác định được hàm lượng Cloxacilin thì hàm

lượng Cloxacilin trong mẫu đều vượt quá giới hạn cho phép của Cloxacilin (theo

tiêu chuẩn SanPin).

68

KẾT LUẬN

Với mục đích nghiên cứu tìm điều kiện phù hợp, xây dựng quy trình xác

định gián tiếp cloxacilin trong thực phẩm bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên

tử F-AAS, chúng tôi đã được một số kết quả sau:

-Tối ưu hoá các điều kiện xác định Ag bằng phương pháp F-AAS.

- Khảo sát và chọn lọc được môi trường axit và chất cải biến nền thích hợp

cho mẫu phân tích.

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép xác định Ag bằng phương pháp

F-AAS.

- Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn

định lượng, giới hạn phát hiện của Ag bằng phương pháp F-AAS.

- Đánh giá sai số, độ lặp lại của phép đo Ag bằng phương pháp F-AAS.

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất kết tủa Cloxacilin bằng Ag

như: Nồng độ KOH, nhiệt độ kết tủa, các cation, anion có trong mẫu phân tích.

- Xác đinh giới hạn phát hiện của cloxacilin theo lượng dư Ag.

- Đã đưa ra được quy trình định lượng cloxacilin, trên cơ sở đó chúng tôi

tiến hành định lượng cloxacilin trong một số mẫu thực phẩm.

Với kết quả thu được chúng tôi thấy kỹ thuật F-AAS là một kỹ thuật thích

hợp để xác định cloxacilin trong mẫu thực phẩm với nhiều ưu điểm: Phân tích

nhanh, hàng loạt, độ chính xác tương đối cao, độ lặp lại tốt, ít bị ảnh hưởng bởi

thành phần mẫu.

Chúng tôi hy với những nghiên cứu của mình sẽ góp phần vào việc ứng

dụng kỹ thuật F-AAS để xác định gián tiếp các hợp chất hữu cơ trong thực

phẩm, đặc biệt trong lĩnh vực kiểm tra lượng dư tồn kháng sinh trong thực phẩm.

69

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Bộ Y Tế (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội

2. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất bản lần thứ 3, Nhà xuất bản Y

học, Hà Nội

3. Chu Đình Bính (2003), Tách và xác định đồng thời Chloramphenicol,

Dexamethason axetat và Hydrocortuson axetat trong mẫu thuốc bằng phương

pháp HPLC, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học KHTN Hà Nội

4. Cục quản lí Chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản, công văn số 571 QLCL-

CL1 ngày 14/04/2011, Tiêu chuẩn SanPiN 2.3.3.1078-01 (2011), quy định về

lượng dư thuốc thú y

5. Nguyễn Văn Đích (2005), "Không nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học và

đời sống, số 27

6. Đặng Thị Thu Hà (2007), Nghiên cứu xác định gián tiếp Clo-Tetracillin trong

thực phẩm bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử, Luận văn thạc sĩ, ĐH

Quốc Gia Hà Nội

7. Trần Thị Thu Hằng (2009), Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh

học bằng phương pháp điện di mao quản, luận văn thạc sĩ, ĐH Quốc gia Hà

Nội

8. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003),

Hoá học phân tích – Các phương pháp phân tích công cụ

9. Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, ĐH

Quốc gia Hà Nội

10. Ngọc Phương (2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo

laodong.com.vn, 10-10-2006.

70

11. Phạm Thị Quỳnh Lương (2002), Nghiên cứu xác định gián tiếp

Chloramphenicol trong thuốc bằng phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS),

Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học KHTN Hà Nội

12. Đàm Thị Minh Tâm (2006), Tách và xác định hàm lượng các Tetracyclin

trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Luận văn thạc

sỹ, Trường Đại học KHTN Hà Nội

TIẾNG ANH

13. Althea W. McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal

trends of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the

United States", Journal Nature medicine, 9: 424 – 430

14. Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), “Application of

capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of

cephalosporins”, Journal of Chromatography B, 775(2), pp 239-246

15. A. Fernandez-Gonzalez, R. Badia and M.E.Diaz-Gar (2003), “Micelle-

mediated spectrofluorinetric determination of ampicillin based on metal

ion-catalysed hydrolysis”, Analytica Chimica Acta, 484(2), pp 239-246

16. Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008),

"Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled

capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence

detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48(4),

1249-1253

17. D. Hurtaud, Deleeine B; Sanders P. (1994), “Particle beam liquid

chromatography-mas spectrometry method with negative ion chemical

ionization for the confirmation of oxacillin, cloxacillin and dicloxacillin

71

residues in bovine muscle”, Analyst, 199(12), 2731-2736

18. Daniela P. Santos, Marcio F. Bergamini and Maria Valnice B. Zanoni

(2008), “Voltammetric sensor for amoxicillin determination in human

urine using polyglutamic acid/glutaraldehyde film”, Sensors and

Actuators B: Chemical, 133(2), pp 398-403

19. D.P. Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule

on infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care

Medicin, 29(6):1101-1108

20. E. Benito-pena, A.I.Partal-Rodera, M.E.Leon-Gonzalez, M.C.Moreno-

Bondi (2005), “Evaluation of mixed mode solid phase extraction

cartridges for the preconcentration of beta-lactam antibiotics in

wastewater using liquid chromatography with UV-DAD detection”,

Analytical Chimica Acta, 556(2), 415-422

21. F. Belal, M. M. El-Kerdawy, S. M. El-Ashry and D. R. El-Wasseef

(2000), "Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and

amoxicillin in dosage forms", Il Farmaco, 55(11-12), pp 680-686

22. J.M. Cha, S. Yang, K.H. Carlson (2006), ,"Trace determination of β-

lactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid

chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry",

Journal of Chromatography A, 1115(1-2), 46-57

23. J.O.Boison, and Keng, L.J.Y. (1998), “Multiresidue liquid

chromatographic method for determining resideues of mono and dibasic

penicillins in bovine muscle tissues”, Journal of AOAC

International,81(6), 1113-1120

24. J.O.Boison, and Keng, L.J.Y. (1998), “ Improvement in the Multiresidue

72

liquid chromatographic analysis of residues of mono and dibasic

penicillins in bovine muscle tissues”, Journal of AOAC

International,81(6), 1267-1272

25. M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C. Cruces-Blanco, M. del Olmo

Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in

environmental aqueous samples using off-line and on-line

preconcentration in capillary electrophoresis", Journal of

Chromatography A, 185(2), pp 273-280

26. Nigel J.K Simpson (2000), Solid-phase extraction, Marcel Dekker, New

York

27. Richard P. Wenzel, M.D Michael B. Edmond, M.D., M.P.H (2000), "

Managing Antibiotic Resistance", New England Journal of Medicine,

343:1961-1963

28. WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay

for the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and

milk using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry",

Analyst, 119(12), 2595-2601