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INSTITUTO VALENCIANO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS DEPARTAMENTO DE PROTECCIÓN VEGETAL Y BIOTECNOLOGÍA
Técnicas serológicas y moleculares para el diagnóstico del virus de los anillos necróticos de los Prunus (PNRSV)
en rosal (Rosa spp.)
TRABAJO FINAL DE CARRERA
Jose Daniel Castillero Gracia
Mayo 2003
I V I ANSTITUTO ALENCIANO DE NVESTIGACIONES GRARIAS
A Ester y a mi familia
¿Qué hay en un nombre? ¡Lo que llamamos rosa exhalaría el mismo grato perfume con cualquiera otra denominación!
Shakespeare,
Romeo y Julieta. Acto II. Escena II.
Agradecimientos. Quisiera expresar mi agradecimiento:
A Mariano Cambra, codirector de este trabajo, por su apoyo, inestimables consejos, buen
humor y por su constante ayuda en mi aprendizaje. A Concepción Jordá, codirectora de este trabajo, por dirigirme desde la universidad y por
sus inestimables revisiones y consejos. A Edson Bertolini, por todo lo que he aprendido de él, su gran ayuda, y especialmente por
su paciencia infinita. A Jaime García de Oteyza, por todos los buenos ratos que hemos pasado juntos en el IVIA
y por su apoyo en todo momento. Al resto de mis compañeros del Laboratorio de Virología e Inmunología: Antonio, Luis,
Maite, Mª Carmen, Paco y Tere. Y a Consuelo, por su abnegación y buen humor en el trabajo de laboratorio.
A todos los vecinos del Laboratorio de Bacteriología. A mis padres y mis hermanas, y el resto de mi familia, sin los cuales no habría podido
llegar a este punto y a mi novia Ester y a mis amigos, que me ayudaron mucho en momentos difíciles y sacrificaron muchos momentos que les pertenecían a lo largo de mi carrera.
A los amigos que hice en Turku y Orlando, y que hicieron de mis estancias en el extranjero
unas de las experiencias más inolvidables de mi vida. A todos los profesores de la ETSIA, amigos, compañeros y familiares que de un modo u
otro siempre me brindaron su apoyo. Un agradecimiento especial para los autores de novelas de ciencia-ficción como Ann
Benson, Robin Cook, Michael Crichton, Richard Preston, Bernard Werber y tantos otros que despertaron en mi la pasión por la genética, y en especial por los virus.
Mi reconocimiento al Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) por poner a
mi disposición sus instalaciones y servicios.
Autor: Ca Especialida
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I
Índice
1. Introducción. 1
1.1. EL CULTIVO DEL ROSAL. 1
1.2. ENFERMEDADES DEL ROSAL. 4
1.2.1. Enfermedades del rosal causadas por hongos, bacterias y nemátodos. 4
1.2.1.1. Hongos. 4
1.2.1.2. Bacterias. 8
1.2.1.3. Nemátodos. 8
1.2.2. Virosis y otras afecciones transmisibles por injerto. 9
1.2.2.1. El mosaico del rosal. 9
1.2.2.1.1. Historia, distribución geográfica e importancia económica. 9
1.2.2.1.2. Agentes causales: PNRSV, ApMV y ArMV. 10
1.2.2.1.3. Sintomatología. 10
1.2.2.1.4. Modos de transmisión. 11
1.2.2.1.5. Métodos de lucha. 12
1.2.2.1.6. Métodos de detección. 14
1.2.2.2. Otras virosis: TSV, SLRSV, TRSV, TMV, TomRSV. 14
1.2.2.3. Otras afecciones transmisibles por injerto. 15
1.3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE VIRUS DE VEGETALES. 17
1.3.1. Técnicas clásicas. 17
1.3.2. Técnicas serológicas: ELISA. 18
1.3.3. Técnicas moleculares: Hibridación molecular, PCR. 20
1.3.3.1. Hibridación molecular. 20
1.3.3.2. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 22
1.3.4. Técnicas combinadas. 24
II
Índice _
1.4. EL VIRUS DE LOS ANILLOS NECRÓTICOS DE LOS PRUNUS (Prunus necrotic
ringspot virus, PNRSV). 25
1.4.1. El género Ilarvirus. 25
1.4.1.1. Estructura y organización genómica de los Ilarvirus. 26
1.4.2. El virus de los anillos necróticos de los Prunus (PNRSV). 28
1.4.2.1. Distribución geográfica e importancia económica. 28
1.4.2.2. Historia y clasificación taxonómica. 28
1.4.2.3. Estructura y organización genómica. 29
1.4.2.4. Gama de hospedadores. 30
1.4.2.5. Sintomatología y transmisibilidad. 30
1.4.2.6. Métodos de lucha. 32
1.4.2.7. Métodos de detección. 32
2. Justificación y objetivos. 35
2.1. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO. 35
2.2. OBJETIVOS. 36
3. Material y métodos. 37
3.1. MATERIAL VEGETAL . 37
3.2. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES. 37
3.3. EXTRACCIÓN DEL ARN. 38
3.4. OBTENCIÓN DE SONDAS MARCADAS CON DIGOXIGENINA. 40
3.4.1. Selección y alineamiento de secuencias. 40
3.4.2. Obtención de sondas a partir del ARN extraído. 41
3.4.2.1. Selección y preparación de los cebadores. 41
3.4.2.2. Comprobación del funcionamiento de los cebadores y obtención de c-
ADN de PNRSV. 42
III
Índice
3.4.2.2.1. Electroforesis y revelado. 43
3.4.2.3. Obtención de la sonda mediante una PCR de marcaje con dUTP-
digoxigenina. 44
3.4.2.4. Comprobación de la existencia de la sonda y dilución. 44
3.4.3. Obtención de sondas a partir del clon de ARN4 de PNRSV. 46
3.4.3.1. Comprobación del funcionamiento de los cebadores y del clon. 46
3.4.3.2. Obtención de la sonda mediante una PCR de marcaje con dUTP-
digoxigenina y comprobación. 47
3.5. MÉTODOS DE DETECCIÓN VIRAL . 47
3.5.1. Detección de PNRSV en tejido infectado de rosal mediante ELISA-DAS. 47
3.5.2. Detección de PNRSV en tejido infectado de rosal mediante hibridación tipo
“dot-blot” y de impresiones en membranas. 48
3.5.3. Detección de PNRSV en tejidos infectados mediante RT-PCR e IC-RT-PCR. 50
4. Resultados. 53
4.1. DETECCIÓN DE PNRSV EN ROSAL MEDIANTE ELISA-DAS. 53
4.1.1. Análisis mediante ELISA-DAS de diluciones seriadas de extractos de tejidos
de rosal infectados. 53
4.1.2. Análisis rutinario mediante ELISA-DAS de muestras de rosal. 54
4.2. DETECCIÓN DE PNRSV EN ROSAL MEDIANTE HIBRIDACIÓN MOLECULAR
NO RADIOACTIVA. 58
4.2.1. Obtención de la sonda a partir del ARN extraído. 58
4.2.1.2. Comprobación del funcionamiento de los cebadores y obtención de c-
ADN de PNRSV. 58
IV
Índice _
4.2.1.3. Obtención de la sonda mediante una PCR de marcaje con dUTP-
digoxigenina. 59
4.2.1.4. Comprobación de la existencia de la sonda y dilución. 60
4.2.2. Obtención de las sondas a partir del clon de ARN4 de PNRSV. 60
4.2.2.1. Comprobación del funcionamiento de los cebadores y del estado
del clon. 60
4.2.2.2. Obtención de las sondas mediante una PCR de marcaje con dUTP-
digoxigenina. 61
4.2.3. Detección de PNRSV mediante hibridación molecular no radioactiva. 62
4.2.3.1. Detección mediante hibridación “dot-blot” de muestras con la sonda
PNRSV-A. Comprobación de su especificidad y ajuste de las
condiciones _de hibridación. 62
4.2.3.2. Aplicación de la sonda PNRSV-A a la detección de PNRSV por
hibridación molecular de impresiones de tejidos en membranas. 64
4.2.3.3. Detección con las sondas PNRSV-B y PNRSV-C. 66
4.3. DETECCIÓN DE PNRSV EN ROSAL MEDIANTE RT-PCR. 67
4.4. DETECCIÓN DE PNRSV EN ROSAL MEDIANTE IC-RT-PCR Y COMPARACIÓN
CON LA TÉCNICA ELISA-DAS. 69
5. Discusión. 71
6. Conclusiones. 73
7. Anejos. 75
7.1. ENFERMEDADES DEL ROSAL CAUSADAS POR HONGOS, BACTERIAS Y
NEMÁTODOS. 75
7.1.1. Hongos. 75
7.1.1.1. Oidio de la rosa “powdery mildew” ( Sphaerotheca pannosa ). 75
V
Índice
7.1.1.2. Mancha negra del rosal “black spot” ( Diplocarpon rosae ). 76
7.1.1.3. Roya del rosal “rust” ( Phragmidium mucronatum ). 76
7.1.1.4. Verticilosis “verticillium wilt” ( Verticillium spp. ). 77
7.1.1.5. Mildiu del rosal “downy mildew” ( Peronospora sparsa ). 77
7.1.1.6. Chancros producidos por Coniothyrium spp. 78
7.1.1.7. Chancro castaño “brown canker” ( Cryptosporella umbrina ). 78
7.1.1.8. Podredumbre gris “botrytis blight” ( Botrytis cinerea ). 79
7.1.1.9. Chancro producido por Nectria cinnabarina. 79
7.1.1.10. Antracnosis ( Sphaceloma rosarum ). 80
7.1.1.11. Manchas foliares producidas por Cercospora sp. 80
7.1.2. Bacterias. 81
7.1.2.1. Tumores o agallas de la corona “crown gall” ( Agrobacterium
tumefaciens ). 81
7.1.3. Nemátodos. 81
7.1.4. Virus y otras afecciones de etiología viral. 82
7.1.4.1. Mosaico del rosal (PNRSV, ApMV, ArMV). 82
7.1.4.2. Rayado anular del rosal “rose ring pattern”. 83
7.1.4.3. Enanismo primaveral del rosal “rose spring dwarf”. 83
7.1.4.4. Enrollado de las hojas del rosal “rose leaf curl”. 84
7.1.4.5. Roseta del rosal “rose rosette disease, RRD”. 84
7.2. MEDIOS, TAMPONES Y REACTIVOS. 85
7.2.1. Agua fisiológica tamponada (AFT) x 10. 85
7.2.2. Tampón de extracción de frutales. 85
7.2.3. 0,5 M Na2EDTA. 86
7.2.4. 1 mM Na2EDTA. 86
VI
Índice _
7.2.5. 50xTAE (Tris-Acetato). 86
7.2.6. Gel de agarosa 2 %. 87
7.2.7. 1 M Tris-HCl. 87
7.2.8. 1xTE. 87
7.2.9. 2 mM dUTP-digoxigenina. 88
7.2.10. Solución de bloqueo. 88
7.2.11. Tampón de inmunoimpresión. 88
7.2.12. Solución acuosa de bromuro de etidio. 89
7.2.13. 20xSSC. 89
7.2.14. SDS 10%. 89
7.2.15. Tampón de hibridación. 90
7.2.16. Tampón de carga. 90
7.2.17. Tampón carbonato. 90
7.2.18. Tampón lavador. 91
7.2.19. Tampón sustrato F.A. 91
7.2.20. Solución de lavado I. 91
7.2.21. Solución de lavado II. 91
7.2.22. Agua fisiológica tamponada - Tween 20 (AFT-T). 92
7.3. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE VIROSIS Y OTRAS ENFERMEDADES
TRANSMISIBLES POR INJERTO EN ROSAL SEGÚN OEPP/EPPO (1997) 93
8. Bibliografía. 95
9. Índice de tablas. 111
10. Índice de ilustraciones. 113
11. Abreviaturas empleadas. 117
1
Introducción 1. Introducción. 1.1. EL CULTIVO DEL ROSAL.
Fig. 1.1. “Rose X”, Arthur Russell. 2000. Representación artística de la flor del rosal.
La rosa es la planta de jardín más popular así como la flor cortada cultivada en invernadero
más importante de todo el mundo.
Se supone que la aparición de la rosa data de la era del Paleolítico, hace unos 35 millones de
años, como así lo confirman los fósiles encontrados en las Montañas Rocosas de Colorado
(EE.UU.) mostrando hojas de rosal. Se pueden considerar dos líneas en la historia de la rosa: la
occidental (Mediterráneo / Europa) y la oriental (Asia). Ambas líneas se fundieron dando lugar a
los cultivares hoy existentes cuando las rosas de té procedentes de China, fueron cruzadas con
híbridos pre-existentes en Europa en el siglo XIX. Actualmente, aproximadamente 200 especies
botánicas de rosas son nativas del hemisferio norte, aunque no se conoce la cantidad real debido a la
existencia de poblaciones híbridas en estado silvestre. Existe toda una compleja genealogía derivada
de siglos y siglos de hibridaciones, que han conducido a la inmensa variedad de rosales hoy
cultivados. No es en absoluto exagerado afirmar que los rosales son las plantas ornamentales con
más dilatada historia de cuantas se tiene conocimiento en nuestro tiempo.
El rosal puede utilizarse para extracción de esencias, para cultivo en maceta o parterres y
para flor cortada, siendo este último el uso de mayor interés económico mundial. Otros usos
2
Introducción _
minoritarios incluyen bebidas y alimentación. Las rosas ornamentales y las rosas de esencia
pertenecen a dos diferentes categorías, de manera que lo que hoy es conocido como “la típica
esencia de rosas”, es aquella perteneciente a una flor que raramente se comercializa, y que se
engloba básicamente en una de las siguientes especies: Rosa damascena Mill. o Rosa centifolia L.
Las rosas pertenecen a la división Angiospermae, clase Dicotiledoneae, subclase
Archiclamidae, orden rosales, suborden rosinae, familia rosaceae, subfamilia rosidae y tribu rosae.
Todas las rosas pertenecen al género Rosa, el cual a su vez está dividido en cuatro subgéneros:
Hulthemia, Eurosa, Platyrhodon y Hesperhodos, estando el subgénero Eurosa dividido a su vez en
diez secciones (Krüssmann, 1986).
La propagación del rosal se puede llevar a cabo por semillas, estacas o injertos de vareta o de
yema, siendo éste último el más utilizado a nivel comercial, ya que las plantas con raíz propia son
bastante pequeñas y necesitan un tiempo considerable para producir a nivel comercial. Los rosales
se suelen cultivar en invernaderos, en maceta o mediante sistema hidropónico, siendo éste último
caso especialmente relevante en flor cortada. La reproducción por semilla está limitada a la
obtención de nuevos cultivares y a cultivos como el de rosas en miniatura o tapizantes.
Como patrones más comunes para los injertos de yema se suelen utilizar, según las
condiciones de cultivo: Rosa indica L. “Manetti”, Rosa odorata (Andr.) Sweet, Rosa multiflora
Thunb. ex Murr., Rosa canina L. “Innermis”, Rosa indica L. “Major” y Rosa laxa Retz. El material
para los patrones se obtiene por multiplicación vegetativa de plantas libres de virus y otros tipos de
enfermedades.
En cuanto al cultivo del rosal, se busca una densidad de plantación de 7 a 10 plantas por m2.
Es una planta que prefiere terrenos arcillosos sin exceso, de buena percolación y bien
aireados. Se considera como temperatura óptima de crecimiento una temperatura entre 17 y 25 ºC.
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4
Introducción _
1.2. ENFERMEDADES DEL ROSAL.
1.2.1. ENFERMEDADES DEL ROSAL CAUSADAS POR HONGOS, BACTERIAS Y
NEMÁTODOS.
1.2.1.1. Hongos.
A continuación se citan algunas de las enfermedades de etiología fúngica más importantes o
más frecuentes haciendo una breve descripción de sus características.
El oidio de la rosa “powdery mildew” es probablemente la enfermedad más extendida de los
rosales de invernadero, jardín y campo. Aunque la enfermedad fue descrita por primera vez en
1819, sus síntomas se conocían ya mucho tiempo antes, y actualmente está presente en todos los
países en que se cultivan rosas. Las condiciones óptimas para el desarrollo de la enfermedad son
unos 20 ºC y 100 % de humedad relativa. En los periodos iniciales de la infección pueden
observarse pequeñas manchas rojizas en el haz de las hojas, pasando posteriormente a desarrollarse
el micelio blanquecino del hongo, preferentemente sobre hojas jóvenes que se distorsionan. Está
causado por Sphaerotheca pannosa (Wallr. ex Fr.) Lév. var. rosae Wor. (Fotos: Anejos 7.1.1.1).
La mancha negra del rosal ”black spot” es la enfermedad más importante del rosal en todo el
mundo. Requiere de la presencia de agua para que se inicie la infección y una temperatura de
alrededor de 24 ºC. Es transmisible por ácaros. No es un grave problema en rosales cultivados en
invernaderos porque se pueden controlar los ácaros y el grado de humedad, sin embargo, se
encuentra generalmente presente en las rosas cultivadas al aire libre. Los síntomas son manchas
negras de entre 2 y 12 mm de diámetro en el haz de las hojas, circulares y con bordes característicos
radiados. Se produce un amarilleo de la hoja hasta su completa abscisión. Causado por Diplocarpon
rosae Wolf, la forma perfecta de Marssonina rosae (Lib.) Lind. (Fotos: Anejos 7.1.1.2).
5
Introducción
La roya del rosal “rust” está causada por hongos del género Phragmidium, de los cuales,
nueve se han encontrado en los rosales. Los más comunes son Phragmidium mucronatum (Pers.)
Schlecht. y Phragmidium tuberculatum Mull. Se encuentra distribuida por todo el mundo, aunque se
da de una manera más notable en zonas frías y con elevada humedad. La enfermedad aparece en
primer lugar en hojas y otras partes verdes de la planta como pústulas anaranjadas. Los tallos
jóvenes y los sépalos también se infectan y se distorsionan. (Fotos: Anejos 7.1.1.3).
La verticilosis “verticillium wilt”, fue descrita por primera vez en el este de los Estados
Unidos en 1924, y ahora se conoce en el resto de Estados Unidos, Canadá, Europa, América del Sur
y Nueva Zelanda, pero debido a la amplia gama de hospedadores que posee el agente causal, se
supone que puede afectar a todos los rosales del mundo. Es un problema en los rosales cultivados en
invernadero, y al aire libre para flor cortada, y puede afectar también a los rosales de jardín ya que
suele estar presente en todo tipo de suelos. Los síntomas iniciales característicos son el
marchitamiento de hojas en los extremos de tallos jóvenes, lo que posteriormente da lugar a una
marchitez general de las hojas, que se vuelven amarillas, luego marrones, y finalmente mueren. La
marchitez se desarrolla desde la base de la planta hacia la parte superior. Los agentes causales son
Verticillium albo-atrum Reinke & Berth. y Verticillium dahliae Kleb. (Fotos: Anejos 7.1.1.4).
El mildiu del rosal “downy mildew” fue descrito por primera vez en 1862 en Inglaterra
(R.U.), y actualmente se encuentra ampliamente distribuido, principalmente en el hemisferio norte.
Todos los cultivares de rosal son susceptibles a la enfermedad, aunque con un nivel de afección
variable. El óptimo desarrollo de la enfermedad se produce con una humedad superior al 85 % y una
temperatura de 18 ºC. Los síntomas aparecen en hojas, tallos, pedúnculos, cálices y pétalos. Las
hojas desarrollan manchas irregulares de color rojo púrpura a marrón oscuro y se van volviendo
amarillas, dejando algunas “islas” de tejido verde normal. La caída de hojas puede llegar a ser
importante. Es causado por Peronospora sparsa Berk. (Fotos: Anejos 7.1.1.5).
6
Introducción _
El chancro carbonoso “brand canker” y el chancro común o del injerto “common canker” del
rosal, se describieron a finales del s. XIX. El primero afecta principalmente a los rosales cultivados
al aire libre y el agente causal es Coniothyrium wensdorffiae Laub. La infección se produce cuando
se dan condiciones invernales. Los síntomas se reducen a los tallos, de tal manera que inicialmente
aparecen pequeñas manchas rojizas oscuras que se van desarrollando y adquiriendo unos márgenes
color púrpura y un interior marrón conforme las células van muriendo. Puede llegar a producir la
muerte del tallo afectado. El segundo afecta tanto a los rosales cultivados al aire libre como a los de
invernadero y probablemente se encuentra distribuido por todo el mundo. El agente causal es
Coniothyrium fuckelii Sacc. forma imperfecta de Leptosphaeria coniothyrium (Fckl.) Sacc.
Requiere de la presencia de heridas para penetrar en el hospedador. Los síntomas inicialmente
aparecen como pequeñas manchas rojas amarillentas en el tallo, que posteriormente se van
expandiendo. El tejido afectado se seca y se encoge. Llega a producir la muerte de la planta por
encima del chancro (Fotos: Anejos 7.1.1.6).
El chancro castaño “brown canker” afecta principalmente a rosales cultivados al aire libre.
Esta muy extendido y puede ser importante. Fue descrito en primer lugar en Estados Unidos en
1917. Los síntomas iniciales son pequeñas manchas de color rojo a púrpura, que se van extendiendo
dando lugar a superficies necróticas de bordes color púrpura. El agente causal es Cryptosporella
umbrina (Jenkins) Jenkins & Wehm., encontrándose también la forma imperfecta de este hongo,
Diaporthe umbrina Jenkins (Foto: Anejos 7.1.1.7).
El moho negro “black mold” no se encuentra muy extendido. Se describió por primera vez
en Australia en 1936, y también se ha descrito en Estados Unidos y Escocia (R.U.). Afecta a las
superficies de corte reciente e injertos, provocando la inviabilidad de los mismos. Inicialmente
aparece como un micelio blanquecino que se va volviendo de color negro conforme se produce la
esporulación. Está causado por Chalaropsis thielavioides Peyronel.
7
Introducción
La podredumbre gris “botrytis blight” se encuentra ampliamente distribuida por todo el
mundo y afecta a todo tipo de rosales. Para el desarrollo óptimo de la enfermedad se requiere una
temperatura de 15 ºC y una elevada humedad relativa. Puede llegar a ser problemática. Las
infecciones pueden no ser visibles en el momento del corte de las flores, pero se desarrollan muy
rápidamente en las condiciones de almacenamiento y transporte debido a la humedad. Aparece un
micelio grisáceo en el desarrollo del hongo. Está causada por Botrytis cinerea Pers. ex Fr. (Fotos:
Anejos 7.1.1.8).
Algunos patógenos distintos a los anteriores producen chancros o decaimiento. Los
patógenos más importantes al respecto son: Botryosphaeria ribis Gross & Doug var. chromogena
Shear, N. E. Stevens & M. S. Wilcox; Cryptosporium minimum Laub; Gryphosphaeria corticola
(Fckl.) Hoehn. (forma imperfecta Coryneopsis microsticta (Berk. & Br.) Grove); Nectria
cinnabarina Tode ex Fr. (Fotos: Anejos 7.1.1.9); Didymella sepincoliformis (de N.) Sacc.;
Glomerella cingulata Penz.; Cylindrocladium scoparium Morg.; y Diaporthe eres Nits. (forma
imperfecta Phomopsis mali (Schultz & Sacc.) Roberts).
Otras enfermedades producidas por hongos, pero de menor importancia son: la antracnosis
del rosal, producida por Sphaceloma rosarum (Pass.) Jenkins (Fotos: Anejos 7.1.1.10); la
podredumbre del cuello y marchitez producida por Phytophthora megasperma Drechsler; las
manchas foliares producidas por Alternaria alternata (Fr.) Keissler y las producidas por Cercospora
spp. (Fotos: Anejos 7.1.1.11); las manchas en los pétalos producidas por Bipolaris
(Helminthosporium) setariae (Saw.) Shoemaker; la marchitez producida por Physalospora fusca N.
E. Stevens y otros hongos; las podredumbres de la raíz producidas por Armillaria mellea Vahl. ex
Fr. y otros hongos; y la mancha de alga producida por el alga Cephaleuros virescens Kunge.
8
Introducción _
1.2.1.2. Bacterias.
Las enfermedades bacterianas de mayor relevancia en rosal son los tumores o agallas de la
corona y la raíz en cabellera, ambas causadas por bacterias del género Agrobacterium.
Los tumores o agallas de la corona “crown gall”, las produce la bacteria Agrobacterium
tumefaciens (Smith & Town.) Conn (aislada por primera vez en Margarita en Estados Unidos en
1904). Afecta a más de 60 familias de plantas dicotiledóneas incluyendo las rosáceas. Suele
aparecer en verano, debido a la presencia de heridas en la planta, necesarias para que la bacteria
penetre en el tejido. Afecta a rosales de todo el mundo (Fotos: Anejos 7.1.2.1).
La raíz en cabellera es producida por la bacteria Agrobacterium rhizogenes (Riker et al.)
Conn, y fue descrita en rosal por primera vez en 1934 en Estados Unidos. El desarrollo de la
enfermedad es máximo con el óptimo desarrollo de la planta y unas temperaturas del suelo de
alrededor de 20 ºC. No cobró importancia hasta la década de 1950 al producir graves pérdidas en los
rosales de California. Actualmente carece de importancia económica.
1.2.1.3. Nemátodos.
Constituyen un problema para los rosales en todo el mundo. Son parásitos de plantas que se
encuentran ampliamente distribuidos y poseen una amplia gama de hospedadores. La magnitud de
los problemas causados por nemátodos en rosal no se conoce bien, puesto que los síntomas que
producen pueden estar producidos por muchos otros factores, y además las distintas variedades de
rosal responden de diferente manera a estos parásitos. De los muchos nemátodos que se han
encontrado afectando al rosal se pueden destacar: Xiphinema, Meloidogyne, Pratylenchus,
Macroposthonia y Helicotylenchus (Fotos: Anejos 7.1.3).
9
Introducción
1.2.2. VIROSIS Y OTRAS AFECCIONES TRANSMISIBLES POR INJERTO.
1.2.2.1. El mosaico del rosal.
1.2.2.1.1. HISTORIA, DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA E IMPORTANCIA ECONÓMICA.
El mosaico del rosal es una enfermedad causada por uno o más virus, que afecta a los rosales
y que se ha encontrado en todos los países en que se cultivan.
Parece ser que no hay ningún dato sobre rosas infectadas con el mosaico del rosal antes de la
década de 1920, cuando “Dr. Huey” se hizo popular en Estados Unidos como patrón de rosal. Se
supone que la enfermedad apareció en rosal debido a algún injerto en dicho patrón, probablemente
infectado a partir de algún árbol frutal.
Ya que el mosaico del rosal no causa habitualmente la muerte de la planta, y en ocasiones no
produce un efecto perjudicial a primera vista, muchos agricultores tienden a desentenderse del
problema. Cuando aparecen síntomas en las hojas de algunas plantas, la rama afectada se elimina y
así la planta no muestra esos síntomas durante una temporada. Si los síntomas del mosaico del rosal
se redujeran a la aparición ocasional de hojas cloróticas o deformadas, no habría que preocuparse en
exceso de la enfermedad, pero el caso es que se ha descrito que el mosaico del rosal produce otros
síntomas que económicamente pueden ser más importantes en este cultivo.
En Europa, un estudio publicado por Moury et al. (2001), indica que sólo el PNRSV está
presente en los rosales comerciales europeos, y lo hace en un 4 %, aunque sugiere que el porcentaje
puede ser mayor puesto que aislados de PNRSV que muestren síntomas suaves, que sean
asintomáticos, que se multipliquen lentamente o que tengan una distribución heterogénea en la
planta podrían haber escapado a su detección mediante las técnicas empleadas.
10
Introducción _
1.2.2.1.2. AGENTES CAUSALES: PNRSV, ApMV Y ArMV.
El Mosaico del Rosal es una enfermedad que engloba a varios virus que producen una
sintomatología similar en los rosales. Estos virus son los Ilarvirus, Prunus necrotic ringspot virus
(PNRSV) y Apple mosaic virus (ApMV), y a veces el Nepovirus Arabis mosaic virus (ArMV)
también está presente. Pueden, en algunos casos, haber también más virus implicados en el mosaico
del rosal, como el Nepovirus Strawberry latent ringspot virus (SLRSV) (Secor et al., 1977).
En Europa, Moury et al. (2001) indican que sólo el PNRSV está presente en los rosales
comerciales europeos, sin tener en cuenta otras enfermedades de tipo vírico. Así, en España,
también se ha encontrado PNRSV asociado al mosaico del rosal (Cambra et al., 1989).
1.2.2.1.3. SINTOMATOLOGÍA.
Los síntomas característicos de la enfermedad en hojas son: líneas cloróticas, manchas
anulares, moteados, amarilleos formando una red y mosaicos amarillos (Horst R. K., 1995).
También pueden mostrar fenómenos de bandeado de venas (Manners, 1985). Estos síntomas a
menudo van atenuándose conforme la hoja va creciendo, pudiendo desaparecer por completo
(Fotos: Anejos 7.1.4.1).
Otros síntomas muy importantes son: deformación floral, reducción en la producción floral,
reducción del tamaño de la flor, reducción del calibre del tallo en la unión del injerto, reducción del
vigor, caída otoñal temprana de hojas, menor supervivencia de la mata, aumento de la sensibilidad a
los daños por frío y una mayor dificultad de establecimiento tras el trasplante (Secor et al., 1977;
Cochran, 1982, 1984; Thomas, 1982, 1984).
Los síntomas son muy variables según los distintos cultivares y se encuentran enormemente
influenciados por las condiciones ambientales y los distintos periodos de crecimiento. Hay
cultivares que pueden presentar síntomas muy fuertes y otros que prácticamente no muestran
11
Introducción
síntomas. Las plantas infectadas pueden mostrarse aparentemente sanas la mayor parte del año. Los
síntomas más severos son observados con buen tiempo en la primavera, siendo menos severos
durante el verano. La concentración viral en el rosal es normalmente baja y variable, y la
distribución viral suele ser heterogénea (Albouy y Devergne, 1998).
Estos síntomas también pueden atribuirse a muchas otras causas como al excesivo empleo de
plaguicidas, deficiencias nutricionales, altas temperaturas o a prácticas culturales inadecuadas, por
lo que es necesario el empleo de métodos de diagnóstico de laboratorio.
1.2.2.1.4. MODOS DE TRANSMISIÓN.
Debido a que el mosaico del rosal es una enfermedad que puede estar producida por distintos
virus, en cuanto a la transmisión hay que considerar a cada uno de ellos por separado.
No hay evidencias de que el PNRSV se transmita de manera natural en campo o invernadero
o a través de polen o semilla (Cochran, 1972; Moury et al., 2001), y aunque en algún caso se ha
detectado en el polen y estambres de algunas variedades de rosal infectadas (Sweet, 1980; Thomas,
1980), la transmisión no se ha podido demostrar y aparentemente es rara. Distintos ensayos han
fallado incluso al tratar de transferirlo mecánicamente (mediante herramientas de cultivo, tijeras de
poda, etc.) (Cochran, 1982). Tampoco se conoce ningún vector aéreo. El único modo conocido de
transmisión es la propagación vegetativa. En el caso del ApMV en el rosal no se ha demostrado
tampoco la transmisión por polen o semilla.
En el caso del ArMV y del SLRSV, se ha demostrado su transmisión por semilla en Rosa
rugosa y Rosa multiflora (Thomas, 1983), infectando hasta el 50 % de las semillas. Además, son
transmitidos por el nemátodo Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky) Thorne, pudiendo una
planta infectada transmitir el virus al 80 % de las plantas de su alrededor en 4 años.
Una planta que se infecta en su propagación, permanecerá infectada durante toda su vida, y
12
Introducción _
una planta sana en su propagación permanecerá de igual manera sana excepto si un brote infectado
es injertado en ella. Contribuyen a esta rápida dispersión la obtención de brotes y esquejes a partir
de plantas infectadas en producción (Cochran, 1984).
1.2.2.1.5. MÉTODOS DE LUCHA.
Debido a que la única manera conocida de transmisión del PNRSV en rosal es la
propagación vegetativa, la lucha contra esta enfermedad puede llevarse a cabo mediante la
utilización de material certificado libre de virus obtenido mediante la aplicación de un programa de
termoterapia a las plantas afectadas y posterior multiplicación, o mediante el saneamiento por
cultivo de tejidos in vitro. La aplicación de estos programas debería ser suficiente para la completa
erradicación del PNRSV del rosal, que no del mosaico del rosal.
En el caso del ArMV y del SLRSV, en que la transmisión es importante por semillas y
nemátodos, habrán de tomarse las medidas necesarias para evitar estos contagios mediante la
utilización de plantas y semillas certificadas y desinfectando los suelos en que se cultivan las
plantas.
En el caso de los programas de termoterapia (Manners, 1985) sus objetivos son la
producción de plantas madre de cultivares libres de virus, el proveer de plantas madre y esquejes
libres de virus a los invernaderos y el mantenimiento de rosales libres de virus en colección para
preservar el germoplasma de los cultivares tratados.
El tratamiento que se realiza es el siguiente: el material infectado es injertado en plantas
sanas de la variedad “Fortuniana”, “Odorata”, u otras variedades vigorosas y que estén libres de
virus. Posteriormente estas plantas se colocan en un ambiente controlado donde la temperatura se
mantiene constante a 38 ºC de 21 a 35 días. El tratamiento no cura a la planta, pero se puede obtener
material sano de la siguiente manera: yemas axilares de la planta tratada son injertadas en material
13
Introducción
sano. Muchas de estas yemas están libres de virus. Una vez están creciendo se debe comprobar que
no están infectadas mediante el uso de plantas indicadoras u otros métodos serológicos o
moleculares de detección. Se utilizan diversos métodos principalmente:
- Injerto de yemas en rosales libres de virus de la variedad “Mme. Butterfly”, que muestra
unos síntomas de mosaico muy brillantes cuando es infectada por primera vez, o en otras variedades
que también muestran unos síntomas muy fuertes como son “Ophelia”, “Rapture”, “American
Beauty” o “Reine des Violettes”. Suelen injertarse en otoño, y en la primavera siguiente se observan
los síntomas en las hojas.
- Injerto de yemas en cerezo japonés (Prunus serrulata Lindl.) de la variedad “Shirofugen”.
Los cerezos y los rosales no son compatibles por injerto, y éste siempre muere, pero si la yema está
infectada, la rama injertada muestra síntomas apareciendo un exudado pegajoso y gomoso,
necrosándose el área cercana al punto de injerto.
- Aplicación de métodos serológicos (ELISA) y moleculares (detallados posteriormente).
Todos los programas de termoterapia son muy similares, variando en ocasiones las plantas
indicadoras utilizadas, como Rosa multiflora cv. Burr, la cantidad y tipo de análisis que se realizan
tras la aplicación del calor, o el tiempo de permanencia a una determinada temperatura (Holmes,
1960; Bjarnson et al., 1985).
El cultivo in vitro se puede utilizar también tras los programas de termoterapia como parte
del procedimiento de regeneración del rosal.
En 1997 la “European and Mediterranean Plant Protection Organization (OEPP/EPPO)”
aprobó un esquema de certificación para patógenos del rosal incluyendo virus. Según este esquema,
las plantas candidatas a ser plantas madre (utilizadas para la propagación genotípica), deben
mantenerse bajo observación en aislamiento durante por lo menos un año, y durante ese tiempo se
deben analizar dos veces para PNRSV, ApMV, ArMV y SLRSV, con un intervalo de varios meses
14
Introducción _
entre los análisis. Uno de los análisis se debe llevar a cabo durante la primavera, el periodo del año
más favorable para la detección (OEPP/EPPO, 1997).
1.2.2.1.6. MÉTODOS DE DETECCIÓN.
Debido a que el mosaico del rosal es una enfermedad que puede venir causada por la acción
de distintos virus, los métodos de detección se basan bien en el injerto de brotes de los rosales
infectados en plantas indicadoras (bioensayos), o bien en la utilización de técnicas de detección
serológicas o moleculares para los distintos virus (Anejos 7.3).
En cuanto a plantas indicadoras, las más utilizadas, debido a la claridad y severidad con la
que muestran los síntomas, son: las variedades de rosal “Mme. Butterfly”, “Ophelia” o “Rapture”;
Rosa indica var. vulgaris L. cv. CE10, Prunus serrulata Lindl. cv. Shirofugen, Prunus persica (L.)
Batsch. cv. GF305 y Cucumis sativus L..
La tendencia actual es la de intentar detectar los distintos virus que pueden producir esta
enfermedad mediante técnicas específicas para cada uno de ellos, basadas principalmente en las
técnicas ELISA, PCR e hibridación molecular.
1.2.2.2. Otras virosis: TSV, SLRSV, TRSV, TMV, TomRSV.
Distintos virus han sido aislados ocasionalmente en el rosal (Anejos 7.3), entre ellos el
Ilarvirus Tobacco streak virus (TSV), que fue observado en rosas (Rosa setigera Michx.) de
Estados Unidos induciendo síntomas severos incluyendo manchas cloróticas irregulares, clorosis de
nervios y distorsión de hojas, llegando a producir la muerte de la planta (Fulton, 1970a; Converse y
Bartlett, 1979). Se ha encontrado en rosales silvestres de varios lugares de Oregón (EE.UU.). En
rosas cultivadas su incidencia es muy baja, ya que debido a los síntomas que ocasiona, es muy
difícil que una planta infectada con este virus sea seleccionada para propagación.
15
Introducción
El virus Strawberry latent ringspot virus (SLRSV) se detectó infectando rosas en jardines e
invernaderos del Reino Unido, al igual que el ArMV, y ambos han sido económicamente
importantes en este país (Cammack, 1966; Harrison, 1967; Ikin y Frost, 1974; Thomas, 1984).
También han sido citados en los Países Bajos (Van Hoof y Caron, 1974, 1975).
Más raramente los virus Tomato ringspot virus (TomRSV) (Halliwell y Milbrath, 1962),
Tobacco mosaic virus (TMV) (Hicks y Frost, 1984), y Tobacco ringspot virus (TRSV) (McDaniel
et al., 1971), han sido descritos en rosal.
1.2.2.3. Otras afecciones transmisibles por injerto.
Constituyen toda una serie de enfermedades de las que se desconoce el agente causal, y que
han sido transmitidas de unos rosales a otros mediante injerto. Suelen estar reducidas a ciertas áreas
muy concretas.
El rayado anular del rosal “rose ring pattern” afecta a rosales cultivados de California y
Oregón (EE.UU.). Los síntomas pueden confundirse con los producidos por el mosaico del rosal,
puesto que son similares, pero éste virus no produce una reacción necrótica en el cerezo Shirofugen,
y en ocasiones pueden no aparecer síntomas aparentes en los rosales infectados. No hay evidencia
de transmisión natural (Secor y Nyland, 1978). Rosa multiflora cv. Burr puede también utilizarse
para la detección de esta enfermedad (Fotos: Anejos 7.1.4.2).
La discontinuidad en la coloración de los pétalos del rosal “rose flower break” apareció en
Inglaterra (R.U.), Nueva Zelanda y Australia. Se conoce poco sobre su agente causal y su
importancia económica, pero la enfermedad reduce severamente la calidad de las flores. Los
síntomas son una distorsión de los márgenes de los pétalos y un desarrollo intenso de color en los
nervios. En ocasiones va asociada al rayado anular del rosal (Hunter, 1966; Ferrar y Frost, 1972;
Ikin y Frost, 1974) (Foto: Anejos 7.1.4.2).
16
Introducción _
El enanismo primaveral del rosal “rose spring dwarf” se ha encontrado en todo tipo de
rosales en California (EE.UU.), y parece que no se transmite de manera natural. No es una
enfermedad sensible a las temperaturas utilizadas en la termoterapia (Traylor et al., 1971; Slack et
al., 1976a). Rosa multiflora cv. Burr puede utilizarse para la detección de esta enfermedad. Los
síntomas aparecen en primavera cuando emergen las primeras hojas dando lugar a una apariencia de
pequeñas rosetas tras la brotación de cada yema (Fotos: Anejos 7.1.4.3).
El enrollado de las hojas del rosal “rose leaf curl” se encuentra distribuido en Estados
Unidos, y la dispersión natural de la virosis es muy lenta. Sus síntomas en hojas se asemejan a los
de una intoxicación por etileno (Slack et al., 1976b; Secor et al., 1977), con una reducción en el
tamaño de las hojas, epinastia y necrosis de brotes, así como el curvado de las hojas jóvenes (Fotos:
Anejos 7.1.4.4).
La roseta del rosal “rose rosette” afecta de manera natural a rosales silvestres en California y
Texas (EE.UU.). Es una enfermedad endémica del oeste de Estados Unidos, y su paso de especies
silvestres a especies cultivadas allí es muy común. El agente causal parece que es transmitido por
ácaros (Epstein y Hill, 1995), pero su etiología viral aún no ha sido determinada (Secor et al., 1977;
Amrine et al., 1988; Rohozinski et al., 2001). Rosa multiflora cv. Burr puede utilizarse para la
detección de esta enfermedad, dando lugar a hojas distorsionadas y arrugadas con pigmentación
rojiza y escobas de bruja. La planta habitualmente muere (Fotos: Anejos 7.1.4.5).
El estriado del rosal “rose streak” afecta a algunos rosales de Europa y Estados Unidos, y se
sospecha que puede estar causado por un virus llamado “Rose streak virus” (RSV) (Secor et al.,
1977). Otra enfermedad como la marchitez del rosal “rose wilt”, parece ser supuestamente viral
(Grieve, 1931; Fry y Hammet, 1971; Hammet, 1971), aunque actualmente no está muy aceptada
como tal. Aparecen anillos marrones y bandeado de nervios, así como caída prematura de hojas. Los
síntomas foliares pueden ir acompañados de la presencia de anillos en tallos y frutos.
17
Introducción
Se conocen también distintas proliferaciones florales del rosal “rose flower proliferation”
que se caracterizan por una desmedida proliferación floral. Se describieron en Italia y en Inglaterra
(R.U.), siendo la causa de estas enfermedades desconocida (Gualaccini, 1963; Ikin y Frost, 1974).
Por último hay que nombrar al rizado del rosal “rose frisure” de síntomas similares a las rosetas
descritas anteriormente y del que se desconoce su agente causal (Devergne y Goujon, 1975).
Existen distintos métodos de detección para todas ellas (Anejos 7.3).
1.3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE VIRUS DE VEGETALES.
No existe un método directo de control de las enfermedades virales en las especies vegetales
a las que infectan. La detección de la infección para efectuar selección sanitaria (eliminar plantas
enfermas) constituye una de las principales vías de control de las enfermedades virales.
Los métodos basados en la observación de la sintomatología y en los ensayos biológicos de
infección de hospedadores experimentales pueden ser indicativos del virus o grupos de virus que
están implicados en la enfermedad. Sin embargo, para una diagnosis definitiva, se requiere de la
utilización de otros métodos de laboratorio, más específicos.
1.3.1. TÉCNICAS CLÁSICAS.
Se trata de técnicas basadas en la observación del virus o de sus efectos directos en la planta
afectada o en otros hospedadores. Son las denominadas técnicas clásicas: observación de síntomas
en el campo, detección de distintos efectos citopáticos, observación de las partículas virales al
microscopio electrónico y ensayos de infectividad en diversos hospedadores.
18
Introducción _
1.3.2. TÉCNICAS SEROLÓGICAS: ELISA.
Se han utilizado muchas técnicas serológicas para la detección de virus de plantas, entre las
que podemos destacar: Técnicas de aglutinación (aglutinación de cloroplastos, microaglutinación
bajo aceite, aglutinación en tubo y coaglutinación), técnicas de precipitación (inmunodifusión doble
o de Ouchterlony e inmunodifusión radial o de Mancini), inmunofluorescencia (IF),
radioinmunoensayo (IR), técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) y técnicas
inmunoenzimofluorescentes (ELFA).
Lo que hoy se conoce como técnicas inmunoenzimáticas, empezó a desarrollarse con los
trabajos de Avrameas y Uriel (1966) que concibieron la idea de marcar antígenos y anticuerpos con
enzimas para ser usados en técnicas convencionales como la inmunodifusión doble. Posteriormente,
se ajustó este tipo de técnicas para su realización sobre soportes sólidos tales como tubos (Engvall y
Perlmann, 1971, 1972) o microplacas de poliestireno (Voller et al., 1974) concibiendo lo que hoy se
conoce como ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). El método ELISA se utilizó por
primera vez como método de diagnosis en la virología vegetal en 1976 (Voller et al.) y
posteriormente Clark et al. (1976) y Clark y Adams (1977) confirmaron el evidente interés
aplicando el método a varios virus vegetales (Sánchez-Vizcaíno y Cambra, 1981).
El ensayo immunoenzimático ELISA, se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados
con una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa, principalmente), de forma que los conjugados
resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes
(antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoabsorbente), la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, podrá ser
fácilmente revelada mediante la adición de un substrato específico de tal manera que al actuar la
enzima, producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectofotómetro o colorímetro (Sánchez-Vizcaíno y Cambra, 1981).
19
Introducción
Para la realización del test ELISA se han desarrollado varios modelos según sea la fijación al
soporte insoluble y la unión del enzima conjugado (Figura 1.3):
Fig. 1.3. Representación esquemática de los distintos ensayos inmunoenzimáticos ELISA.
Fijación del antígeno a la placa de poliestireno
Formación del complejo antígeno-anticuerpo conjugado
Producción de color al añadir el substrato específico
Pocillo poliestireno
Anticuerpo Anti-inmunoglobulinas
Enzima conjugado al anticuerpo
Anticuerpo anti-CP
Partícula viral
ELISA DIRECTO
Formación del complejo antígeno-anticuerpo anti-CP
Formación del complejo antígeno-anticuerpo anti-CP-
anticuerpo anti-inmunoglobulinas
Producción de color al añadir el substrato específico
ELISA INDIRECTO
Fijación del anticuerpo anti-CP a la placa de poliestireno
Formación del complejo antígeno-anticuerpo anti-CP
Formación del complejo antígeno-anticuerpo conjugado
Producción de color al añadir el substrato específico
Formación del complejo antígeno-anticuerpo
Formación del complejo antígeno-anticuerpo anti-CP-
anticuerpo anti-inmunoglobulinas
Producción de color al añadir el substrato específico
ELISA-DAS
ELISA-DASI (HADAS o Triple Sandwich)
20
Introducción _
Muchas otras variantes de la técnica ELISA han sido descritas, como las descritas utilizando
membranas porosas como soporte llamadas “dot-ELISA”, “immunoblot”, “dot immunobinding-
DIA” e “inmunoimpresión-ELISA”; esta última ofrece la gran ventaja de no tener que realizar
extractos del material vegetal al poder utilizar las improntas o huellas que un corte de material
vegetal deja sobre una membrana de nitrocelulosa o de nylon al presionar contra ella.
1.3.3. TÉCNICAS MOLECULARES: HIBRIDACIÓN MOLECULAR, PCR.
1.3.3.1. Hibridación molecular.
La hibridación molecular sobre soporte sólido se utilizó por primera vez como método de
diagnosis en la virología vegetal en el caso de patógenos tipo viroide (Owens y Diener, 1981) y
posteriormente, se aplicó a la detección de virus de ARN y ADN en tejidos vegetales (Garger et al.,
1983; Maule et al., 1983). La técnica está basada en los experimentos de Gillespie y Spiegelman
(1965).
La detección de virus por hibridación molecular se realiza mediante la unión del ácido
nucléico del genoma viral con moléculas de ácido nucléico complementarias (sonda), que han sido
marcadas con un isótopo radioactivo u otra molécula no radioactiva (biotina, digoxigenina) que
permite detectar la hibridación.
El método más común de hibridación molecular es la denominada hibridación tipo “dot-
blot” basada en la aplicación directa de los ácidos nucleicos sobre un soporte sólido (membranas de
nylon o nitrocelulosa) y su posterior hibridación con sondas de secuencia complementaria a la
secuencia viral. El marcaje de las sondas permite la visualización de las moléculas hibridadas
mediante diferentes métodos de detección. En primer lugar se inmobiliza el ADN o ARN de la
muestra desnaturalizado sobre un soporte o membrana, normalmente mediante luz ultravioleta, de
forma que se impide la autohibridación, que puede ocurrir en medio líquido. A continuación se
21
Introducción
introduce la membrana en una solución de prehibridación y posteriormente en una solución con las
sondas de ácidos nucleicos complementarias y marcadas. Tras la hibridación, es necesario lavar los
filtros para eliminar los productos que no han reaccionado. Los híbridos muestra-sonda se pueden
detectar por distintos métodos de revelado (autorradiografía, colorimétrico, quimioluminiscente,
bioluminiscente o fluorescente).
Hasta hace unos años, la mayoría de las técnicas de hibridación desarrolladas en biología
molecular utilizaban sondas marcadas con precursores radioactivos (fundamentalmente 32P y 32S),
pero debido a los riesgos inherentes que conlleva el uso de la radioactividad, y a la dificultad de su
utilización en sistemas de diagnóstico rutinario, el uso de sondas marcadas radioactivamente ha
quedado restringido a laboratorios muy especializados, por lo que se desarrollaron métodos de
detección utilizando precursores marcados no radioactivamente (Pallás et al., 1997).
La utilización de precursores no radioactivos para marcar los ácidos nucleicos ha permitido
que la técnica de hibridación molecular sea cada vez más utilizada en el campo de la diagnosis viral.
Entre estos precursores no radioactivos, los más usados son los derivados de las moléculas biotina y
digoxigenina, siendo la biotina la primera molécula que se utilizó para marcar no radioactivamente
ácidos nucleicos (Chan et al., 1985; Forster et al., 1985) y aplicada en el diagnóstico de virus
(Habili et al., 1987) y viroides (Candresse et al., 1990). Los ácidos nucleicos biotinilados son
reconocidos con gran afinidad por la avidina o por su análogo microbiano la estreptoavidina,
aunque la presencia de biotina endógena en la planta o la presencia de glicoproteinas que unen
avidina o biotina puede producir un inaceptable ruido de fondo. Por ello, se ha extendido de forma
muy importante el uso del esteroide de origen vegetal digoxigenina como precursor para marcar
ácidos nucleicos no radioactivamente. Esta molécula se une mediante un brazo espaciador de 7
residuos de carbono a nucleótidos de uridina, los cuales son incorporados a la molécula que servirá
como sonda. Las sondas marcadas con digoxigenina (Martin et al., 1990) se aplicaron primero al
diagnóstico de virus de ADN (Crespi et al., 1991; Haber et al., 1992) y posteriormente a virus de
22
Introducción _
ARN (Más et al., 1993; Dietzgen et al., 1994). En la actualidad su uso se ha extendido a una amplia
gama de virus.
Habitualmente, en la hibridación molecular no radioactiva se pueden utilizar dos tipos de
sondas. En el caso de las sondas de ADN, el nucleótido marcado es incorporado a la molécula
utilizando cebadores al azar, o mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En las sondas de ARN, el nucleótido marcado es incorporado mediante una reacción de
transcripción in vitro utilizando la ARN polimerasa adecuada. También pueden utilizarse como
sondas oligonucleótidos marcados enzimáticamente en su extremo 3’. Una vez hibridada la sonda,
la utilización de un anticuerpo frente a la molécula de digoxigenina, conjugado con una enzima
(fosfatasa alcalina o peroxidasa), permite la posterior visualización usando el substrato adecuado
(colorimétrico, quimioluminiscente, bioluminiscente o fluorescente).
La hibridación molecular es una técnica que tiene la ventaja de poder detectar el genoma
viral en todas sus formas (en cadena simple o doble, encapsidado o no), proporcionando por tanto
un método específico y sensible que permite una rápida detección (Roy et al., 1988).
La combinación de la hibridación molecular y la técnica de impresión de tejidos o
inmobilización en membranas requiere un procesamiento mínimo de las muestras y ha facilitado el
diagnóstico rutinario tanto de virus (Más y Pallás, 1995) como de viroides (Romero-Durbán et al.,
1995; Stark-Lorentzen et al., 1997).
1.3.3.2. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La amplificación de material genético mediante la reacción en cadena de la polimerasa a
través de cebadores específicos y su posterior análisis electroforético en geles de agarosa o
poliacrilamida, ha sido ampliamente utilizada en la virología vegetal como método de diagnóstico
viral (Henson y French, 1993). El método PCR fue patentado por Kary Mullis (K. B. Mullis, U. S.
23
Introducción
patent 4,683,195 1987; U. S. patent 4,683,202 1987) y sus colaboradores (Saiki et al., 1985; Mullis
et al., 1986; Mullis and Faloona, 1987), aunque el principio fue descrito por Khorana y sus
colaboradores más de diez años antes (Kleppe et al., 1971; Panet y Khorana, 1974). Gracias a ello
Mullis consiguió el Premio Nobel de Química en 1993.
El fundamento de la técnica de PCR reside en la utilización de una ADN polimerasa
termoestable que, en presencia de cebadores específicos localizados en los extremos del fragmento a
amplificar y de secuencia idéntica (cebador sentido) o complementaria (cebador antisentido) a la
secuencia viral, permiten una amplificación exponencial del fragmento determinado tras varios
ciclos de desnaturalización, hibridación y polimerización del ADN molde (Saiki et al., 1988). Los
productos de la reacción de amplificación son posteriormente analizados electroforéticamente lo
que permite determinar el tamaño del fragmento de ADN amplificado. El hecho de que las
moléculas sintetizadas en uno de los ciclos de amplificación puedan servir como molde para el
siguiente, permite realizar una amplificación exponencial del fragmento molde consiguiendo,
teóricamente, del orden de un millón de copias a partir de una inicial en 20 ciclos de reacción (220).
Cuando el material genético de partida es de tipo ARN se requiere la incorporación de la
reacción de transcripción reversa en combinación con la PCR (reverse transcriptase, RT-PCR). Este
método ha sido ampliamente utilizado para la detección de virus de plantas a partir de fracciones de
ácidos nucleicos parcialmente purificadas (Vunsh et al., 1990; Kawasaki, 1990; Rowhani et al.,
1995).
Otra aproximación con el objeto de aumentar la sensibilidad de la PCR es el hecho de añadir
un ciclo extra utilizando cebadores internos. Éste método se denomina Nested-PCR o RT-Nested-
PCR, según se aplique a ADN o ARN. Ha sido aplicado en diversos campos (Lee et al., 1994;
Gundersen y Lee, 1996), y puede realizarse en un solo tubo (Olmos et al., 1999).
Otras aplicaciones de la PCR son las llamadas “multiplex”, que permiten la detección
simultánea de varios segmentos de ADN o ARN (multiplex-PCR, multiplex-Nested-PCR,
24
Introducción _
multiplex-RT-PCR, multiplex-RT-Nested-PCR), y la PCR Cooperativa (Co-PCR, Co-RT-PCR),
que permite una gran sensibilidad llevando a cabo la reacción con una sola manipulación (Olmos et
al., 2002).
1.3.4. TÉCNICAS COMBINADAS.
A pesar de la alta sensibilidad mostrada por el método PCR o RT-PCR, la diagnosis viral a
partir de tejido parcialmente purificado puede bloquearse debido a la presencia de componentes del
extracto que inhiban a las enzimas del proceso de amplificación (transcriptasa inversa o DNA
polimerasa termoestable). Con el objeto de solucionar este tipo de problemas sin la necesidad de
obtener fracciones enriquecidas de material genético o diluir en exceso el extracto con la
consiguiente pérdida de sensibilidad, se han desarrollado varias alternativas basadas en la
realización de un paso inicial de captura del agente viral mediante anticuerpos específicos
(InmunoCaptura-PCR, IC-PCR; Wetzel et al., 1992) o a través de la unión directa del virión a una
placa de poliestireno (DB-PCR; Rowhani et al., 1995). En ambos casos se requiere de la utilización
de placas de poliestireno similares a las utilizadas en el método ELISA, o de tubos, en los que tras
fijar el virión se realiza directamente la reacción PCR o RT-PCR.
Con el propósito de disponer de métodos de análisis lo más simples posible, se ha
desarrollado un método que combina la sensibilidad y especificidad de la IC-PCR con un método
que requiere un mínimo procesamiento de muestras al evitar la fase de trituración (Olmos et al.,
1996). Este método consiste en inmobilizar dianas mediante impresión directa de secciones de
material vegetal o escachado directo en papel Whatman 3MM y la liberación de dicho material
mediante tratamiento con Tritón X-100 (Print Capture-PCR, PC-PCR o Squash Capture-PCR, SC-
PCR). El extracto resultante se analiza entonces mediante una IC-PCR o IC-RT-PCR convencional.
25
Introducción
1.4. EL VIRUS DE LOS ANILLOS NECRÓTICOS DE LOS PRUNUS (Prunus
necrotic ringspot virus, PNRSV).
1.4.1. EL GÉNERO ILARVIRUS.
El género Ilarvirus (acrónimo de isometric, labile y ringspot) pertenece a la familia
Bromoviridae, familia que está compuesta por cinco géneros: Alfamovirus, Bromovirus,
Cucumovirus, Ilarvirus y Oleavirus (Roossinck et al., 2000). El miembro tipo del género Ilarvirus
es el Tobacco streak virus (TSV). Los virus pertenecientes a este género se enumeran en la tabla
1.1.
Tabla 1.1: Clasificación de los virus pertenecientes al género Ilarvirus (Roossinck et al., 2000)
Subgrupo Virus Acrónimo Subgrupo 1 Virus del estriado del tabaco
(Tobacco streak virus) TSV
Virus del mosaico de la hortensia (Hydrangea mosaic virus)
HdMV
Subgrupo 2 Virus 2 del espárrago
(Asparagus virus 2) AV-2
Virus del variegado de los cítricos (Citrus variegation virus)
CVV
Virus del moteado del olmo (Elm mottle virus)
EMoV
Virus latente de la espinaca (Spinach latent virus)
SpLV
Virus de la hoja rugosa de los cítricos (Citrus leaf rugose virus)
CiLRV
Virus del mosaico del manzano tulare (Tulare apple mosaic virus)
TAMV
Subgrupo 3 Virus del mosaico del manzano
(Apple mosaic virus) ApMV
Virus del choque del arándano (Blueberry shock virus)
BlShV
Virus latente del humulus japonica (Humulus japonicus latent virus)
HJLV
Virus de los anillos necróticos de los Prunus (Prunus necrotic ringspot virus)
PNRSV
26
Introducción _
Subgrupo 4 Virus del enanismo del ciruelo
(Prune dwarf virus) PDV
Subgrupo 5 Virus de los arabescos del
ciruelo americano (American plum line pattern virus)
APLPV
Subgrupo 6 Virus del moteado de la
parietaria (Parietaria mottle virus)
PMoV
Son virus que se caracterizan por poseer una estructura isométrica, ser extremadamente
lábiles al calor y en general ocasionar típicos síntomas en anillo. El término “Ilarvirus” se utilizó
originariamente para referirse a un grupo de virus que afectaba a frutales de hueso, eran virus
inestables en extractos y poseían una forma del virión esférica. El conjunto de los Ilarvirus fue
inicialmente dividido en dos grupos, A y B, división basada en ciertas propiedades serológicas
(Sheperd et al., 1975; Loesch-Fries et al., 1977; Matthews, 1979) pero fue abandonada
posteriormente, estableciéndose los 7 subgrupos reflejados en la tabla 1.1 (Roossinck et al., 2000).
Las propiedades estructurales y funcionales de los virus de este género no se empezaron a
estudiar hasta la década de 1990, debido a la característica inestabilidad de sus componentes.
1.4.1.1. Estructura y organización genómica de los Ilarvirus.
Los viriones presentan una estructura quasi-esférica o ligeramente pleomórfica. Sedimentan
en cuatro componentes particulados con coeficientes de sedimentación comprendidos entre 75 y 125
S y con un diámetro de entre 23 y 33 nm, conteniendo a los ARNs 1, 2, 3 y 4 (Francki et al., 1985;
Bol, 1999). Las nucleoproteínas están formadas por varias unidades de una única proteína de
cubierta (CP) de masa molecular comprendida entre 24 y 30 x 103 Daltons. Cada virión parece estar
formado por 180 moléculas de CP que se hallan distribuidas en un sistema de simetría quasi-
27
Introducción
icosaédrica T = 3. También algunos miembros presentan estructuras baciliformes de hasta 73 nm de
longitud (estructura icosaédrica T = 1).
Poseen un genoma tripartito de ARN de simple cadena y polaridad positiva (ARN1, ARN2 y
ARN3), junto con un ARN subgenómico del ARN3 (ARN4), y algunos también presentan otros
ARNs de menor tamaño. El ARN1 es monocistrónico y codifica para una replicasa (P1); el ARN2
es monocistrónico codificando para una polimerasa (P2 ), aunque en ciertos miembros del género es
bicistrónico y de el se forma un ARN subgenómico (ARN4a) que codifica una proteína (2b)
implicada en la dispersión sistémica del virus y la inducción de la enfermedad en ciertos
hospedadores (Ding et al., 1995); el ARN3 es bicistrónico y contiene los genes (3a y 3b) que en dos
pautas de lectura abierta (ORFs) codifican para la proteína de movimiento (MP) y la proteína de la
cubierta (CP), aunque ésta última no se expresa directamente a partir del ARN3, sino que lo hace a
partir del ARN mensajero subgenómico monocistrónico ARN4. Otros ARNs de menor tamaño,
también han sido detectados en distintos miembros del género, como el ARN5 del PNRSV (Di
Terlizzi et al., 2001).
En el extremo 3’ terminal, en las regiones no traducidas (UTRs), los distintos ARNs
presentan una estructura secundaria característica en forma de tallos flanqueados por el
tetranucleótido AUGC implicada en la interacción CP-ARN (Reusken y Bol, 1996; Bol, 1999). Para
que se inicie la infección viral se requiere que se produzca la unión de la CP a estos sitios
específicos de los ARNs (Bol, 1999; Jaspars, 1999). Se ha comprobado que la presencia del ARN4,
o de pequeñas cantidades de la proteína de la cubierta es necesaria para que se produzca la
infección. Es el fenómeno denominado “activación genómica” (Bol et al., 1971; Baer et al., 1994).
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29
Introducción
descrito por primera vez por Cochran en 1950.
Taxonómicamente se engloba dentro de los virus de ARN de polaridad positiva, en la
familia Bromoviridae y en el subgrupo III del género Ilarvirus. Los aislados del PNRSV pueden
agruparse en tres grupos diferentes: PV32, PE5 y PV96 (Aparicio et al., 1999), en concordancia con
los grupos propuestos anteriormente.
1.4.2.3. Estructura y organización genómica.
Tal como aparece en la figura 1.4, se observan en las micrografías electrónicas de
preparaciones purificadas de PNRSV partículas quasi-isométricas de unos 23 nm de diámetro
(Fulton, 1970b) que sedimentan en tres tipos de componentes particulados (T, M y B) con unos
coeficientes de sedimentación de 72 s, 90 s y 95 s, respectivamente (Loesch y Fulton, 1975).
Junto a las formas quasi-isométricas del virión, también se ha observado la presencia de
partículas baciliformes (estructura T = 1) de una longitud de hasta 73 nm similares a las descritas
para el AMV. Cada componente nucleoprotéico está formado por 180 moléculas de una única CP de
masa molecular relativa que varía entre 27 y 29 KDa (Crosslin y Mink, 1992). Estas moléculas
aparecen distribuidas en un sistema quasi-icosaédrico de simetría T = 3.
El genoma del PNRSV, como se ha comentado para el género Ilarvirus, está constituido por
tres ARNs virales (ARN1, ARN2 y ARN3) y un ARN subgenómico (ARN4) idéntico al extremo 3’
del ARN3. Sus tamaños moleculares son de aproximadamente 3.3x102 nucleótidos para el ARN1,
2.5x102 para el ARN2, 1.9x102 para el ARN3 y 0.6x102 para el ARN4. El ARN1 es monocistrónico
y codifica para una replicasa (P1); el ARN2 es monocistrónico codificando para una polimerasa
(P2); el ARN3 es bicistrónico y contiene los genes (3a y 3b) que en dos pautas de lectura abierta
(ORFs) codifican para la proteína de movimiento (MP) y la proteína de la cubierta (CP), aunque
ésta última no se expresa directamente a partir del ARN3, sino que lo hace a partir del ARN
30
Introducción _
mensajero subgenómico monocistrónico ARN4. Otro ARN de menor tamaño, también ha sido
detectado (ARN5) (Di Terlizzi et al., 2001).
Como se ha explicado que ocurre en general para los Ilarvirus, en el extremo 3’ terminal, en
las regiones no traducidas (UTRs), los distintos ARNs presentan una estructura secundaria
característica de forma que para que se inicie la infección viral se requiere que se produzca la unión
de la CP a estos sitios específicos de los ARNs (Bol, 1999; Jaspars, 1999). También se han
descubierto unas estructuras en forma de horquilla justo antes del inicio de la codificación para el
ARN4 que están implicadas en la síntesis del ARN subgenómico (Jaspars, 1998; Aparicio y Pallás,
2002). También se produce el fenómeno denominado “activación genómica” (Bol et al., 1971;
Gonsalves y Fulton, 1977; Baer et al., 1994).
En cuanto a efectos citopáticos, existen poco estudios, y se ha demostrado que provocan
cambios citológicos menores (Martelli y Russo, 1985).
1.4.2.4. Gama de hospedadores.
Este virus infecta de manera natural al lúpulo (Humulus lupulus L.), y probablemente a todas
las especies de Prunus (Nyland et al., 1974; Ogawa y English, 1991; Mink, 1991). También afecta
al rosal (Rosa spp.), aunque no se cree que lo infecte de manera natural (Manners, 1997).
Experimentalmente ha sido transmitido a una amplia gama de hospedadores herbáceos (véase el
apartado 1.4.2.7).
1.4.2.5. Sintomatología y transmisibilidad.
Los síntomas producidos por el PNRSV aparecen tras el primer o segundo año después de la
infección, en la etapa “aguda” o “de choque” de la enfermedad. Posteriormente, con el tiempo,
algunos aislados dejan de producir síntomas mientras que otros son recurrentes.
31
Introducción
En general, los síntomas ocasionados por el PNRSV varían desde una ausencia total de éstos
hasta la total necrosis de las hojas (Nyland et al., 1974), y dependen mucho del hospedador en
cuestión. Pueden aparecer en las hojas como moteados, anillos, líneas irregulares, mosaicos tipo
hoja de roble, deformaciones y áreas cloróticas que pueden derivar en necrosis y en un agujereado
típico. En ciertos hospedadores los síntomas pueden llegar a producir un retraso en la apertura de las
yemas o la no apertura de las mismas al igual que en las flores, pérdida de hojas; muerte de brotes y
raíces, reducción en el crecimiento de los árboles jóvenes, reducción en el número de frutos
(Nemeth, 1986; Mink, 1991); reducción en el rendimiento y calidad de los frutos (Scott et al.,
1989); disminución del desarrollo, acortamiento de los pedicelos y distorsión de las flores, rayado
del color de los pétalos y decaimiento terminal. En el lúpulo no produce síntomas apreciables.
En el rosal, la sintomatología se reduce a anillos y rallados cloróticos, mosaicos
amarillentos, moteados y deformaciones, además de una disminución en su desarrollo, reducción
del vigor, problemas en el transplante, retrasos en la floración, reducción en el número y tamaño
delas flores, incremento del número de flores deformadas y adelanto de la caída de hojas otoñal
(Thomas, 1981b, 1982, 1984) (Fotos: Anejos 7.1.4.1). La aparición de los síntomas depende mucho
del estadío de la planta, apareciendo de una manera más clara en la etapa de floración de primavera.
Los síntomas varían ampliamente con la estación y el cultivar, la concentración viral en el rosal es
normalmente baja y variable, y la distribución viral suele ser heterogénea (Albouy y Devergne,
1998).
Se ha determinado que el PNRSV se transmite por polen (Nyland et al., 1974; Howell y
Mink, 1988; Uyemoto et al., 1992), semilla (Fulton, 1970b), multiplicación vegetativa o prácticas
culturales (Pethybridge et al., 1998) y posiblemente trips (Greber et al., 1992). En el rosal sólo se ha
demostrado que se transmita mediante injerto (Manners, 1997; Moury et al., 2001), aunque en algún
caso se ha detectado en el polen y estambres de algunas variedades de rosal infectadas (Sweet,
1980; Thomas, 1980).
32
Introducción _
1.4.2.6. Métodos de lucha.
La lucha contra el PNRSV en rosal se lleva a cabo bien mediante la utilización de material
vegetal certificado (libre de virus) (OEPP/EPPO, 1997) o bien, si se parte de material infectado,
mediante la aplicación de un programa adecuado de termoterapia (Bjarnson et al., 1985; Manners,
1985). Esto es debido a que el PNRSV en el rosal sólo se transmite por propagación vegetativa, y no
se requieren medidas de seguridad adicionales.
En el caso de otros cultivos, en que la transmisión es importante por polen, semillas, trips o
por prácticas culturales, habrán de tomarse las medidas necesarias para evitar estos contagios
evitando que florezcan las plantas madre, mediante la utilización de plantas y semillas certificadas,
colocando mallas antitrips y desinfectando el material que se utiliza en las estas prácticas.
1.4.2.7. Métodos de detección.
Las infecciones por PNRSV pueden ser detectadas mediante la utilización de plantas
indicadoras (bioensayo), de tal manera que desarrollen alguna sintomatología visible tras la
inoculación o injerto del material. Las más utilizadas son: Prunus persica (L.) Batsch. cv. GF305
(Cardin y Devergne, 1975), Prunus serrulata cv. Shirofugen (Fleisher et al., 1971) o Prunus
tomentosa Thunb. También puede ser transmitido a distintos hospedadores herbáceos, siempre en
periodos primaverales. Entre los más utilizados están: el pepino (Cucumis sativus L.), Cyamopsis
tetragonoloba (L.) Taubert, Chenopodium amaranticolor (Coste & A. Reyn.) Coste & Reyn.,
Chenopodium quinoa Willd., Gomphrena globosa L., Momordica balsamina L. y Nicotiana
clevelandii A. Gray.
Normalmente al realizar la transmisión a estos hospedadores, se inocula en primer lugar el
pepino (la transmisión del virus es más favorable en estas plantas) y desde pepino se inoculan las
plantas herbáceas correspondientes.
33
Introducción
Los bioensayos son muy sensibles, pero requieren de largos periodos de tiempo para
observar los resultados y son económicamente costosos.
El PNRSV, al igual que otros Ilarvirus, tiene la propiedad de acumularse en tejidos con una
importante actividad de crecimiento, por lo que éstos tejidos serán los más propicios para utilizarlos
como material de partida en la detección. Además, esto hace que los intentos por eliminar el virus
mediante cultivo “in vitro” de meristemos o plántulas, normalmente fallen si no van asociados a
termoterapia (Boxus, 1984 ; Navarro et al., 1982).
En el rosal el título o carga viral es particularmente bajo en verano, mayor en primavera y de
un nivel intermedio en invierno (Moury et al., 2000). Además, el mejor momento para el análisis es
la floración y brotación de la planta (Dal Zotto et al., 1999), con lo que la época del año en que se
realicen los análisis y el estado fenológico de la planta, cobran mucha importancia.
En rosal, el método más extendido y de más fácil aplicación para la detección del PNRSV es
el método ELISA-DAS (Clark et al., 1976; Barbara et al., 1978; Thomas, 1980; Barbara, 1981;
Wong y Horst, 1988), aunque también se ha aplicado ELISA-DASI (Boari et al., 1998). El análisis
debe realizarse preferiblemente en primavera en hojas jóvenes. En verano, pueden aparecer
reacciones inespecíficas que históricamente fueron reducidas absorbiendo el conjugado enzimático
con extracto de hojas de plantas sanas antes de su aplicación a las placas ELISA (Thomas, 1980;
Stein et al., 1987). El número de hojas que deben ser analizadas para obtener un 99% de
probabilidades de detectar el PNRSV de una planta infectada, es de 5 en un periodo favorable
(primavera), y 18 en uno no favorable (verano) (Moury et al., 2000). En el resto de hospedadores
también es detectado mediante la utilización de la técnica ELISA (Mink, 1980; Mink y Aichele,
1984; Torrance y Dolby, 1984; Scott et al., 1989; Pusey y Yadava, 1991).
También se ha desarrollado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con una
transcripción reversa (RT) (Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) para la
detección del PNRSV (Spiegel et al., 1996; Mackenzie et al., 1997; Rosner et al., 1997; Rowhani et
34
Introducción _
al., 1998; Hammond et al., 1999), que no se ha aplicado con éxito en el rosal; la IC-RT-PCR
(Rowhani et al., 1995) y la IC-RT-PCR + Nested PCR (Helguera et al., 2001).
En rosal la Inmunocaptura-RT-PCR (IC-RT-PCR) se ha aplicado, y parece ser unas 100
veces más sensible que ELISA-DAS (Candresse et al., 1998; Moury et al., 2000). Debido a la
observación de que el PNRSV se multiplica activamente en los tejidos jóvenes, el aplicar el ELISA-
DAS o IC-RT-PCR a plántulas crecidas in vitro en vez de a las plantas madre directamente mejora
su sensibilidad en algunos casos de 104 a 105 veces (Moury et al., 2000).
También existen métodos para la detección del PNRSV basados en la hibridación molecular:
"dot-blot" mediante el uso de precursores radioactivos con sondas de cARN (Crosslin et al., 1992;
Scott et al., 1992) o de precursores no radioactivos como la digoxigenina o la biotina con sondas de
cARN tras microinjerto in vitro (Heuss-LaRosa et al., 1995; Heuss et al., 1998, 1999). No se han
descrito aplicaciones de la técnica directamente en tejidos de rosal.
También puede detectarse mediante Inmunoelectromicroscopía (Immunospecific electron
microscopy-ISEM) (Milne y Luisoni, 1977; Thomas, 1981a), dos veces más sensible que ELISA-
DAS, pero con la desventaja de necesitarse equipo de microscopía electrónica y operadores
especializados.
35
Justificación y Objetivos 2. Justificación y Objetivos. 2.1. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO.
Debido a la importancia económica del cultivo del rosal como primer cultivo ornamental de
jardín y de flor cortada del mundo, la lucha contra los patógenos que le afectan tiene una gran
relevancia, y entre ellos destacan los virus. La lucha contra ellos se realiza empleando técnicas
serológicas y moleculares que permitan su diagnóstico y detección, y por tanto, la posterior
eliminación de la planta afectada.
De los virus que afectan al rosal, el de mayor importancia es el PNRSV, el cual, como ocurre
con otros virus como el ApMV, el ArMV o el SLRSV, produce su enfermedad viral más extendida:
el mosaico del rosal.
La enfermedad del mosaico del rosal provoca diferentes síntomas en los rosales afectando
tanto a la producción de flores como al aspecto externo de la planta, dos de las características más
importantes para la comercialización de esta especie, lo que hace que disminuya el valor de
mercado de las plantas afectadas.
El PNRSV se detecta actualmente mediante la utilización de la técnica ELISA-DAS
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Double Antibody Sandwich), que requiere de la realización
de extractos de los tejidos vegetales y supone un problema para el análisis rutinario en campo.
Recientemente se ha aplicado también en rosal la técnica IC-RT-PCR (Immunocapture-Reverse
Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), más laboriosa.
Se pretende por tanto, poner a punto alguna técnica que no presente estos inconvenientes de
manejo, como ocurre en este trabajo con la hibridación molecular de impresiones en membranas.
Además se pretende poner a punto otras técnicas de detección de PNRSV en el rosal: hibridación
molecular tipo “dot-blot” y RT-PCR, y compararlas con ELISA-DAS y IC-RT-PCR.
36
Justificación y Objetivos _
2.2. OBJETIVOS.
Con el presente trabajo se pretenden alcanzar los siguientes objetivos:
1.- Poner a punto técnicas serológicas y moleculares de detección de PNRSV en rosal:
ELISA-DAS, RT-PCR, IC-RT-PCR e hibridación molecular.
2.- Analizar muestras de campo ensayando extractos (clarificados o no), impresiones y ARN
extraído de extractos.
3.- Comparar y evaluar las técnicas más apropiadas para su uso en rosal.
37
Material y Métodos
3. Material y Métodos.
3.1. MATERIAL VEGETAL.
Las plantas de rosal y melocotonero analizadas fueron obtenidas de distintos orígenes (tabla
3.1).
Tabla 3.1. Orígen de las plantas analizadas.
Nº de plantas Procedencia Especie Identificación 86 Viveros Plantas Continental
(Posadas, Sevilla, España) Rosal N1-N20 y 1-67
11 Colección IVIA (Valencia, España)
Rosal I-D, I-M, I-A, PN-Sa, X, 6.3, 7.9, 4.8, 69, PN-Vi, 78.
5 Viveros Plantas Orero (Sevilla, España)
Melocotonero 1, 2, 3, 4 y 5.
3 Invernadero de Moncada (Valencia, España)
Rosal S1, S2, S3.
3 Estación Experimental de Aula Dei – CSIC (Zaragoza, España)
Rosal 1380, 1408 y I-Ma.
3 Colección IVIA (Valencia, España)
Ciruelo Pollizo CP 9.1, CP 9.2 y CP 9.3.
2 Colección IVIA (Valencia, España)
GF305 R y PN-GF.
1 Viveros Maillan-Ferrer (Francia)
Rosal I-La.
3.2. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES.
Los extractos vegetales de plantas de rosal se obtuvieron a partir de hojas y partes del tallo,
siempre tendiendo a seleccionar los tejidos más jóvenes. Con tijeras de poda se trocearon los tejidos
elegidos en pequeños trozos, siempre limpiando las tijeras con alcohol entre muestra y muestra. Una
vez troceada cada muestra, se siguió un proceso distinto según si su destino era la detección por
hibridación o por PCR, o la detección mediante ELISA-DAS:
A) Hibridación, RT-PCR e IC-RT-PCR: Se introdujo la muestra troceada en una bolsa de
38
Material y Métodos _
malla gruesa (PlantPrint Diagnostics S.L.) a la que se le añadió tampón de extracción de frutales
(Anejos 7.2.2) en una proporción de 1:20 (p:v), se marcó y se puso en hielo. Con ayuda de un
martillo, se machacó el contenido de la bolsa y se vertió en tubos Eppendorf de 1.5 ml (Scharlab S.
L., 0274092.5N), evitando la entrada de restos de material vegetal en los mismos. Se marcaron y se
colocaron en hielo. Los que no se utilizaron enseguida fueron congelados a –20 ºC.
B) ELISA-DAS: Se introdujo la muestra troceada en tubos colocados en una gradilla con
hielo con ayuda de un embudo de plástico. La colocación de los tubos en la gradilla fue la misma
que la de los pocillos de la placa ELISA. Se añadió a esos tubos tampón de extracción de frutales
(Anejos 7.2.2) en una proporción del 1:20 (p:v), y se homogeneizaron (Polytron, Kinematica A.G.)
uno a uno, siempre limpiando bien con agua el aparato entre muestra y muestra. Los extractos se
mantuvieron a 4º C en hielo hasta su uso.
Se utilizó el tampón de extracción de frutales debido a que este posee sustancias
antioxidantes como el PVP y el DIECA que evitan la oxidación del material vegetal.
3.3. EXTRACCIÓN DEL ARN.
Para la extracción del ARN total de los tejidos de rosal, para posteriormente poder aplicar
los métodos de detección por hibridación molecular o PCR, se utilizó el “RNeasy Plant Mini Kit”
(Qiagen, 74904). El protocolo llevado a cabo fue el descrito por MacKenzie et al. (1997), se detalla
gráficamente en la figura 3.1 y a continuación se describe:
1.- En 200 µl del extracto preparado anteriormente se añadieron 450 µl del tampón RLT
(Qiagen), un tampón de lisis que contiene β-Mercaptoetanol y Isotiocianato de guanidina (GITC), el
cual posee un gran poder de lisis celular. Se agitó vigorosamente.
39
Material y Métodos
2.- Se dispensó el lisado en una columna de filtrado (QIAshredder spin column, Qiagen) y se
colocó en un tubo colector (Qiagen) de 2 ml. Se centrifugó (Biofuge Pico, Heraeus Instruments)
durante 2 minutos a 13.000 xg. Cuidadosamente se transfirió el sobrenadante de la fracción que
atravesó la columna a un nuevo tubo de 1.5 ml sin alterar el precipitado del tubo. Se desechó la
columna y el tubo de 2 ml.
Con la columna de filtrado (QIAshredder spin column, Qiagen) se consigue eliminar los
restos de tejido y homogeneizar el lisado, aunque una pequeña cantidad de restos atravesarán la
columna y formarán un precipitado en el tubo tras la centrifugación.
3.- Se añadieron al tubo con el lisado clarificado, 250 µl (0.5 V) de etanol absoluto (96-100
%), y se mezcló inmediatamente con una pipeta.
4.- Se dispensó toda la muestra a una nueva columna para retener el ARN total (RNeasy
mini column, Qiagen). Se cerró la columna y se centrifugó durante 15 segundos a 10.000 xg. Se
descartó la fracción que atravesó la columna, pero se conservó el tubo.
5.- Se añadieron 700 µl del tampón RW1 (Qiagen) a la columna. Se cerró y se centrifugó
durante 15 segundos a 10.000 xg para lavarla. Se desechó la fracción que la atravesó y el tubo de 2
ml.
6.- Se transfirió la columna a un nuevo tubo de 2 ml. Se añadieron 500 µl del tampón RPE
(Qiagen), que contiene etanol, a la columna. Se cerró la columna y se centrifugó durante 15
segundos a 10.000 xg para lavarla. Se descartó la fracción que la atravesó, pero no el tubo.
7.- Se añadieron otros 500 µl del tampón RPE a la columna. Se cerró la columna
fuertemente y se centrifugó durante 2 minutos a 10.000 xg para secar la membrana de silica-gel que
contiene la columna. Se desechó la fracción que atravesó la columna y el tubo de 2 ml.
Es importante el paso de secado de la membrana para evitar que quede etanol residual en ella
y así interfiera produciendo inhibiciones en la PCR. Hay que tomar precauciones al retirar la
columna del tubo que la contiene, para no tocar la fracción que atraviesa la columna y así evitar el
40
Material y Métodos _
contacto con el etanol.
8.- Se colocó la columna en un nuevo tubo de 2 ml. Se centrifugó durante 1 minuto a
velocidad máxima, eliminando así toda posibilidad de que quedaran restos del tampón RPE. Se
desechó la fracción que atravesó la columna y el tubo.
9.- Se transfirió la columna a un nuevo tubo de 1.5 ml. Se añadieron 50 µl de agua libre de
ARNasas (Rnase-free water, Qiagen) directamente a la columna. Se cerró y se centrifugó durante 1
minuto a 10.000 xg para su elución.
Se obtuvieron así unos 50 µl de ARN disuelto en agua.
Fig. 3.1. Diagrama de flujo para la extracción de ARN total. En el esquema se representa el proceso seguido para la
extracción de ARN total según el "RNeasy Plant Mini Kit" de Qiagen.
3.4. OBTENCIÓN DE SONDAS MARCADAS CON DIGOXIGENINA.
3.4.1. SELECCIÓN Y ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS.
En primer lugar se seleccionó el ARN4 como el ARN idóneo para realizar la detección del
virus, acudiendo a la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information)
41
Material y Métodos
(Benson et al., 2002), ya que para que el virus sea infectivo es imprescindible la presencia de este
ARN en el hospedador. Se consultó la base de datos del NCBI de manera que se obtuvo la
secuencia del ARN de interés. Se escogió la secuencia completa del ARN que codifica para las
proteinas de movimiento y de la cubierta del PNRSV, aislado 30/4 obtenido de Prunus persica (L.)
Batsch., publicada por Scott S. W., Zimmermann M. T. y MacKenzie D. J. en 1996 en las bases de
datos EMBL (European Molecular Biology Laboratory), GenBank (del NCBI) y DDBJ (DNA
DataBank of Japan), todas ellas pertenecientes al NSDC (Nucleotide Sequence Database
Collaboration) (gi | 1575050 | gb | U57046.1 | PNU57046[1575050]).
Con el programa BLASTN 2.2.2 (Altschul et al., 1997), aplicación informática para el
alineamiento de secuencias, se comprobó que entre las secuencias registradas en la base de datos
que mostraban una mayor similitud se encontraba la secuencia de la proteina de la cápsida del
aislado PV32 del Apple mosaic virus (ApMV) publicada por Sánchez-Navarro J. A. y Pallás V. en
1993 en dichas bases de datos (gi | 432432 | gb | U03857.1 | AMU03857[432432]) (Sánchez-
Navarro y Pallás, 1994). Se comprobó que este aislado se había reconocido como PNRSV unos
años después, de modo que se pudo comprobar que la secuencia seleccionada para obtener las
sondas no presentaba excesiva similitud con secuencias de otros organismos.
3.4.2. OBTENCIÓN DE SONDAS A PARTIR DEL ARN EXTRAÍDO.
3.4.2.1. Selección y preparación de los cebadores.
Se consultó la literatura para elegir cebadores que ya hubieran sido utilizados y probados en
otros estudios para el ARN4, y se determinó probar los iniciadores utilizados por Saade et al. (2000)
en melocotonero (Tabla 3.2). Los cebadores fueron encargados a Roche Diagnostics S. L.
42
Material y Métodos _
Tabla 3.2. Secuencia de los cebadores PNRSV1 y PNRSV2. Los cebadores PNRSV1 y PNRSV2 fueron utilizados
para la amplificación de parte del ARN4 del PNRSV con el objeto de obtener la sonda PNRSV-A.
Nombre Secuencia 5’-3’ Nucleótidos Purificación
PNRSV1 GAACCTCCTTCCGATTTAG 19 HPLC (HPR3)
PNRSV2 GCATCCCATTTGGGGCATC 19 HPLC (HPR3)
Mediante los resultados obtenidos a partir del programa BLASTN 2.2.2, se compararon las
secuencias de los cebadores elegidos con las secuencias de los distintos aislados del virus,
comprobando que la correspondencia era la correcta y que no habían demasiadas diferencias entre
las secuencias de los diferentes aislados del virus en el tramo de la secuencia que iba a ser utilizada
como sonda.
Los cebadores se recibieron a unas concentraciones de 79,2 µM (PNRSV1) y 79,9 µM
(PNRSV2). Se diluyeron a 100 µM para poder trabajar más cómodamente, por lo que se añadió a
cada uno de los tubos que contenían los cebadores, 792 µl (PNRSV1) y 799 µl (PNRSV2) de agua
MiliQ esterilizada en autoclave. Como se suelen utilizar pequeñas cantidades de los cebadores, para
disminuir los posibles errores en las medidas y evitar que se contaminen por su uso continuado, se
utilizaron alícuotas de los mismos a una concentración de 25 µM. Para ello, se añadieron 75 µl de
agua y 25 µl de la solución a 100 µM a un nuevo tubo.
3.4.2.2. Comprobación del funcionamiento de los cebadores y obtención de c-ADN de PNRSV.
Se comprobó el funcionamiento de los cebadores seleccionados haciendo una RT-PCR de
material infectado, de manera que se obtuvo así el c-ADN posteriormente utilizado en la obtención
de la sonda. El cóctel que se utilizó viene reflejado en la tabla 3.3. Se mezcló el cóctel en un tubo
Eppendorf de 2 ml (Sarstedt, 72.694.100) en una cabina de flujo laminar. De ahí, se repartieron 20
μl del cóctel y 5 μl del ARN extraído de cada muestra (Apartado 3.3.) a cada tubo de 200 μl y se
43
Material y Métodos
llevaron los tubos a un termociclador (Genius, Techne). Se programó el termociclador según la tabla
3.4.
Tabla 3.3. Cóctel para RT-PCR del PNRSV.
Cóctel (20 μl) Concentración de uso
Concentración de partida
Agua milliQ Tampón 10x (Promega, M1901) 1 x 10 x Mg Cl2 (Promega, A3511) 2,5 mM 25 mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech Inc., 27-2035-01) 250 μM 5 mM Cebador 1 (sentido) 1 μM 25 μM Cebador 2 (antisentido) 1 μM 25 μM AMV* Reverse Transcriptase (Promega, M5108) 1 u 10 u / μl Taq* DNA polimerasa (Promega, M1865) 0,5 u 5 u / μl
* AMV = Avian myeloblastosis virus ; Taq = Thermus aquaticus.
Tabla 3.4. Programa de termociclado para la RT-PCR del PNRSV.
Programa Ciclos Temperatura (ºC) Tiempo General para RT 1 42 45 min 94 2 min PCR del PNRSV 30 a 40 94 35 seg 52 35 seg 72 35 seg General 1 72 10 min
Para observar los resultados obtenidos a partir de la RT-PCR, se realizó una electroforesis en
gel de agarosa (2%) (Anejos 7.2.6).
3.4.2.2.1. ELECTROFORESIS Y REVELADO.
Una vez obtenido el gel (Anejos 7.2.6), por cada pocillo del mismo se añadieron 8 μl del c-
ADN de cada tubo mezclados con 1 μl de tampón de carga (Anejos 7.2.14). En el primer pocillo, y
a modo de referencia, se añadieron 5 μl del marcador elegido. Se colocó el gel en una cubeta para
electroforesis (Bio-Rad, Wide Mini-Sub Cell G.) y se conectó a una corriente de 110 voltios (Bio-
Rad, Power-Pac 300).
44
Material y Métodos _
El revelado del gel se realizó mediante tinción con solución acuosa de bromuro de etidio
(Anejos 7.2.12), durante unos 15 minutos, para posteriormente iluminarlo mediante luz ultravioleta
(Spectroline TC-312 A a 312 nm) y registrarlo con una cámara fotográfica.
3.4.2.3. Obtención de la sonda mediante una PCR de marcaje con dUTP-digoxigenina.
A partir del tubo en el que se obtuvo una mayor cantidad de ADN de la RT-PCR del
apartado 3.4.2.2 y mediante una PCR de marcaje con un nucleótido marcado, se obtuvieron las
sondas marcadas con digoxigenina. Se utilizó el cóctel para PCR de marcaje de la tabla 3.5. Por
cada tubo de 200 μl se emplearon 20 μl de cóctel y 5 μl de ADN. Como negativo se utilizó agua en
vez de ADN. Se siguió el programa de termociclado dado por la tabla 3.6. La electroforesis y el
revelado se siguieron al igual que en el apartado 3.4.2.2.1.
Tabla 3.5. Cóctel para la PCR de marcaje del PNRSV.
Cóctel (20 μl) [ ] uso [ ] partida Agua milliQ Tampón 10x (Promega, M1901) 1 x 10 x Mg Cl2 (Promega, A3511) 1,5 mM 25 mM dNTPs-dig (Anejos 7.2.9) 250 μM 2 mM Cebador 1 (sentido) 1 μM 25 μM Cebador 2 (antisentido) 1 μM 25 μM Taq DNA polimerasa (Promega, M1865) 0,5 u 5 u / μl
Tabla 3.6. Programa de termociclado para la PCR del PNRSV.
Programa Ciclos Temperatura (ºC) Tiempo General 94 5 min PCR del PNRSV 30 a 40 94 35 seg 52 35 seg 72 35 seg General 1 72 10 min
3.4.2.4. Comprobación de la existencia de la sonda y dilución.
Para comprobar el marcaje de la sonda se realizó una detección colorimétrica de una
45
Material y Métodos
dilución seriada de la sonda en membrana de nylon. Los pasos seguidos fueron:
1.- Se realizó una dilución seriada de la sonda (1/5, 1/10, 1/15, 1/20, 1/50, 1/100, 1/500,
1/1000, ...) en agua milliQ, con las diluciones que se consideraron oportunas.
2.- En las membranas de nylon cargadas positivamente (Roche Diagnostics GmbH,
1209272) se añadieron gotas de 1 μl de cada muestra de la dilución y se dejaron secar al aire.
3.- Se trataron las membranas con luz ultravioleta durante 4 minutos y medio utilizando un
transiluminador, para fijar los ácidos nucleicos.
4.- Se bloqueó la membrana utilizando los tampones del “Dig Wash and Block Buffer Set”
(Roche Diagnostics GmbH, 1585762). En este caso, se usó la solución de bloqueo (Anejos 7.2.10).
Se dejaron las membranas en pequeñas bandejas con esta solución en un agitador orbital (Heidolph
poly max 1040) durante 30 minutos.
5.- Se desechó la solución anterior y se añadieron anticuerpos anti-digoxigenina-AP (Roche
Diagnostics GmbH, 1093274) diluidos a 1/5.000 en solución de bloqueo. Se incubaron las sondas
en esta solución en el agitador orbital durante 30 minutos.
6.- Se lavaron las membranas 3 x 5 minutos, con tampón lavador, desechando cada vez el
tampón anterior.
7.- Dejamos las membranas durante 2 minutos con tampón de inmunoimpresión (Anejos
7.2.11).
8.- Se añadió el sustrato, que consiste en una pastilla de sustrato AP del “Multicolor
Detection Set” (Roche Diagnostics GmbH, 1465341) disuelta en tampón de inmunoimpresión. Se
dejó el tiempo necesario hasta que se observó la intensidad de color apropiada. Se paralizó la
reacción por dilución con agua.
Una vez comprobado el marcaje de la sonda, se diluyó, puesto que una menor concentración
es suficiente para obtener unos buenos resultados. Para ello se midió la concentración de la sonda
46
Material y Métodos _
por densidad óptica y según el valor ahí obtenido, se llevó a una concentración de 25 a 100 ng/ml
diluyendo la sonda en tampón de hibridación sin formamida (Anejos 7.2.15). Se almacenó a –20 ºC.
3.4.3. OBTENCIÓN DE SONDAS A PARTIR DEL CLON DE ARN4 DE PNRSV.
3.4.3.1. Comprobación del funcionamiento de los cebadores y del clon.
El clon de ARN4 de PNRSV PV-32 fue cedido amablemente por el Dr. Vicente Pallás
(Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, CSIC, Valencia, España) y se utilizó a la
dilución 1:100 como muestra. También fueron cedidos cebadores adecuados (VPC, VP33 y VP78)
(Tabla 3.7) para obtener sondas a partir del clon. Se realizó una PCR para comprobar el
funcionamiento de los cebadores y el estado de los plásmidos.
Tabla 3.7. Secuencia de los cebadores VP78, VPC y VP33. Los cebadores VP78 (Roche Diagnostics S. L.) y VP33
(Gibco BRL) fueron utilizados para la amplificación de parte del ARN4 del PNRSV con el objeto de obtener la sonda
PNRSV-B, y los cebadores VPC (Gibco BRL) y VP33 para la sonda PNRSV-C.
Nombre Secuencia 5’-3’ Nucleótidos Purificación
VP78 GAACCTCCTTCCGATTTAG 19 HPLC (HPR3)
VPC CTTGCCATGGTTTGCCGAATTTGC 24 Standard
VP33 CCGGCTGCAGCTTCCCTAACGGGGC 25 Standard
El cóctel que se utilizó para realizar la PCR del clon con los cebadores elegidos, es el
descrito en la tabla 3.8 y se siguió el programa de termociclado dado por la tabla 3.6. Como
negativos se utiliza el mismo cóctel pero sin el clon.
47
Material y Métodos
Tabla 3.8. Cóctel para la PCR del PNRSV.
Cóctel (20 μl) [ ] uso [ ] partida Agua milliQ Tampón 10x (Promega, M1901) 1 x 10 x Mg Cl2 (Promega, A3511) 1,5 mM 25 mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech Inc., 27-2035-01) 250 μM 5 mM Cebador 1 (sentido) 1 μM 25 μM Cebador 2 (antisentido) 1 μM 25 μM Taq DNA polimerasa (Promega, M1865) 0,5 u. 5 u. / μl.
La electroforesis y el revelado se desarrollaron como se detalla en el apartado 3.4.2.2.1.
3.4.3.2. Obtención de la sonda mediante una PCR de marcaje con dUTP-digoxigenina y
comprobación.
Una vez comprobado el correcto funcionamiento de los cebadores y del clon, se procedió a
la obtención de la sonda mediante una PCR de marcaje con dUTP-digoxigenina. Se procedió como
en el apartado 3.4.2.3, pero como material de partida para la amplificación se utilizó el clon de
ARN4 a una dilución 1:100.
Posteriormente se comprobó el marcaje de la sonda como se explica en el apartado 3.4.2.4.
3.5. MÉTODOS DE DETECCIÓN VIRAL.
3.5.1. DETECCIÓN DE PNRSV EN TEJIDO INFECTADO DE ROSAL MEDIANTE
ELISA-DAS.
El método ELISA-DAS se aplicó como sigue: las placas de poliestireno (Nunc, 475094) se
marcaron y tapizaron con 200 µl / pocillo del anticuerpo policlonal anti-PNRSV (Loewe) a una
dilución de 1:200 en tampón carbonato (Anejos 7.2.17). Tras incubar durante 4 horas a 37 ºC, las
placas se lavaron 3 veces con tampón lavador (Anejos 7.2.18) y se secaron con papel de celulosa.
48
Material y Métodos _
Las muestras se prepararon previamente como se explica en el apartado 3.2. Se añadió
entonces la muestra, 190 µl / pocillo, y se dejaron incubar las placas durante 16 h a 4 ºC. Tras
volver a lavar 3 veces con tampón lavador, se incubaron durante 3 h a 37 ºC con 190 µl / pocillo del
correspondiente anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (Loewe) a una dilución de 1:200 en
AFT (Anejos 7.2.1).
Finalmente, y para el revelado, se lavaron de nuevo las placas 3 veces con tampón lavador,
se secaron y se incubaron con el substrato 4-nitrofenilfosfato (Roche, 107905) a una concentración
de 1 mg / ml en tampón substrato F. A. (Anejos 7.2.19). La lectura de las muestras se realizó a los
30, 60 y 90 min midiendo su absorbancia a 405 nm en un lector de placas Labsystems Multiscan
Ascent. Las muestras se consideraron positivas cuando su valor fue al menos 3 veces el obtenido
para los correspondientes controles sanos.
3.5.2. DETECCIÓN DE PNRSV EN TEJIDO INFECTADO DE ROSAL MEDIANTE
HIBRIDACIÓN TIPO “DOT-BLOT” Y DE IMPRESIONES EN MEMBRANAS.
A) Hibridación “dot-blot”:
Las muestras se prepararon según se explica en el apartado 3.2, y la hibridación molecular
utilizando sondas marcadas con digoxigenina y su posterior detección inmunológica se realizó como
sigue:
Se utilizaron membranas de nylon cargadas positivamente en las que se puso una gota (1 ó 2
µl) del ARN extraído (o directamente del extracto de la planta clarificado o no), y se dejaron secar
al aire. Los ácidos nucleicos se fijaron entonces a la membrana mediante tratamiento con luz
ultravioleta (330 mj) durante 4 min y medio utilizando un transiluminador.
Se realizó en primer lugar un bloqueo de los sitios de inespecíficos de unión, incubando la
membrana en un horno de hibridación (Roller-blot Hybridiser HB-30) a 68 ºC durante 1 o 2 horas
49
Material y Métodos
con unos 10 ml de solución de prehibridación sin formamida. A continuación se retiró la solución
de prehibridación y se añadió la de hibridación, con la misma composición que la anterior pero
conteniendo la sonda dig-ADN. La membrana se incubó con dicha solución a 68 ºC durante 16 a 24
horas. Tras realizar la hibridación, la membrana se lavó 2 x 5 min a temperatura ambiente con la
Solución de lavado I (Anejos 7.2.20) y a continuación 2 x 15 min a 65 ºC con la Solución de lavado
II (Anejos 7.2.21).
Utilizamos ahora los tampones del “Dig Wash and Block Buffer Set” de Roche. La
detección inmunológica se realizó incubando la membrana 2 x 15 min con el “washing buffer” y 1 x
5 min con el “maleic acid buffer”, para posteriormente incubarla durante 1 hora con la solución de
bloqueo (Anejos 7.2.10). A continuación se incubó la membrana durante 30 min con una solución
anti-digoxigenina-fosfatasa-alcalina diluida a 1/10.000 en la solución de bloqueo. Para eliminar el
exceso de anticuerpos no unidos, la membrana se lavó 2 x 15 min con el tampón lavador y 2 x 15
min con el tampón ácido maléico. Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente.
El revelado de la membrana se realizó utilizando dos tipos diferentes de substratos: el
substrato colorimétrico y el quimioluminiscente. Para la detección colorimétrica, la membrana se
equilibró durante 2 min con tampón de inmunoimpresión (Anejos 7.2.11) y posteriormente se le
añadió el sustrato, que consistió en una pastilla de substrato AP del “Multicolor Detection Set”
(Roche), disuelta en tampón de inmunoimpresión. Se incubó a temperatura ambiente el tiempo
necesario hasta que se observó la intensidad de color apropiada. Se paró la reacción con agua.
En los ensayos en los que se utilizó el método de detección quimioluminiscente, la
membrana se equilibró durante 15 min con el tampón de detección. Manteniendo la membrana
húmeda en todo momento, se descartó la solución anterior y la membrana se colocó entre dos
plásticos. Se le añadió CSPD (Roche, 1755633) diluido 1:100 en el tampón de detección, se
quitaron las burbujas y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Se expuso entonces la
membrana a una película fotográfica (Kodak X-OMAT UV) durante 40 a 45 min en oscuridad.
50
Material y Métodos _
La película se reveló utilizando las soluciones reveladoras y fijadoras.
B) Hibridación de impresiones de tejidos en membranas:
El método que se sigue es exactamente el mismo que en el caso anterior, la única diferencia
es que no se realiza ningún extracto del tejido de la planta, sino que se presiona con él
(normalmente partes del tallo o de las hojas) sobre la membrana de nylon de manera que el tejido
deja una impresión en ella. Las membranas así imprimidas se procesan como en el caso anterior.
3.5.3. DETECCIÓN DEL PNRSV EN TEJIDOS INFECTADOS MEDIANTE RT-PCR E IC-
RT-PCR.
A) RT-PCR:
La preparación de las muestras de tejido se llevó a cabo como se explica en los apartados 3.2
y 3.3. El proceso se realizó conjuntamente en un solo tubo, y se utilizó ARN total extraído de las
plantas correspondientes. El cóctel que se utilizó viene reflejado en la tabla 3.3. Se mezcló el cóctel
en un tubo de 2 ml en una cabina de flujo laminar. De ahí, se repartieron 20 μl del cóctel y 5 μl del
ARN extraído de cada muestra (Apartado 3.3) a cada tubo de 200 μl y se llevaron los tubos a un
termociclador que se programó según la tabla 3.4.
Para observar los resultados obtenidos a partir de la RT-PCR, se efectuó una electroforesis
en gel de agarosa (2%) (Anejos 7.2.6). En melocotonero y ciruelo se siguió el mismo procedimiento
de manera que sirvió como referencia a los distintos experimentos realizados.
En los distintos ensayos en rosal, se utilizaron diferentes aditivos para mejorar el
rendimiento de la reacción y reducir la influencia de los posibles inhibidores del extracto de rosal en
la misma. Estos aditivos fueron: dimetil sulfóxido (DMSO), albúmina de suero bovino (BSA),
51
Material y Métodos
glicerol, polietilenglicol (PEG), Tween 20® y leche desnatada (BLOTTO, Bovine Lacto Transfer
Technique Optimizer).
También se realizó otro ensayo en el que tras la extracción de ARN total por Qiagen y
precediendo a la reacción de RT-PCR se aplicó a las muestras una precipitación con amonio-
acetato. El protocolo que se siguió partiendo de unos 50 μl de ARN total extraído, fue el siguiente:
1.- Se llevó el volumen de la solución a 300 μl con TE (Anejos 7.2.8). Se añadieron 200 μl
de acetato de amonio 5 M estéril y 1 ml de etanol absoluto que se mezclaron bien.
2.- Se incubó durante 1 hora o hasta toda la noche, a -20 ºC.
3.- Se centrifugó durante 10 min a 13.000 xg. Se desechó el sobrenadante y se reservó el
precipitado.
4.- Se añadió 1 ml de etanol absoluto al precipitado y se centrifugó a 13.000 xg durante 5
min. Se desechó el sobrenadante.
5.- Se añadieron 500 μl de etanol al 80 % y se centrifugó a máxima velocidad durante 5
min. Se desechó el sobrenadante y se invirtieron los tubos para dejarlos secar a temperatura
ambiente.
6.- Tras completamente secos se resuspendieron en 50 μl de agua milliQ.
B) IC-RT-PCR:
La preparación de las muestras de tejido se llevó a cabo como se detalla en el apartado 3.2.
En la etapa de tapizado, se utilizaron tubos de 500 μl que se tapizaron con 100 μl / tubo de
los anticuerpos policlonales anti-PNRSV (Loewe) a una dilución de 1:200 en tampón carbonato
(Anejos 7.2.17). Se incubaron durante 3 horas a 37 ºC o toda la noche a 4 ºC. Se lavaron entonces
los tubos una vez con AFT-T (Anejos 7.2.22).
52
Material y Métodos _
En la etapa de captura, los tubos con el material de muestra se centrifugaron durante 15 min
a 5.000 xg a 4 ºC de manera que se eliminó así buena parte de los restos sólidos de tejidos. Se
añadieron 100 μl de cada extracto clarificado a cada tubo correspondiente de 500 μl y se dejaron
incubar durante toda la noche a 4 ºC o 3 horas a 37 ºC. Se lavaron los tubos 3 veces con AFT-T
(Anejos 7.2.22) y se les dió un pulso de centrífuga de manera que pudiera descartarse el líquido que
hubiera podido quedar en el tubo.
Finalmente, se precalentaron los tubos durante 15 min a 65 ºC y se les añadió el cóctel de la
RT-PCR (tabla 3.3). Se llevaron al termociclador y se les aplicó el programa de la tabla 3.4.
Para observar los resultados obtenidos a partir de la IC-RT-PCR, se efectuó una
electroforesis en gel de agarosa (2%) (Anejos 7.2.6).
53
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 1/10 1/100 1/1000
Abs
orba
ncia
a 4
05 n
m (9
0 m
in)
Diluciones del extracto original 1:20 (p/v)
I-La I-La clarificado I-Ma Sano
Resultados
4. Resultados.
4.1. DETECCIÓN DE PNRSV EN ROSAL MEDIANTE ELISA-DAS.
4.1.1. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA-DAS DE DILUCIONES SERIADAS DE EXTRACTOS
DE TEJIDOS DE ROSAL INFECTADOS.
Se realizaron diluciones seriadas de extractos positivos de rosal en extractos de rosal
negativo para estudiar la sensibilidad de la técnica en la detección de PNRSV en rosal. Para la
obtención de los extractos vegetales se siguió el apartado 3.2 de Materiales y Métodos, y para la
detección mediante ELISA-DAS el método detallado en el apartado 3.5.1. Los resultados se
representan en los gráficos 4.1 y 4.2.
Gráfico 4.1. Valores de absorbancia a 405 nm obtenidos mediante ELISA-DAS utilizando tejidos de
rosal infectado. Valores de absorbancia a 405 nm (eje de abscisas) obtenidos a partir de diluciones seriadas de extractos
de tejidos de rosal infectado 1:20 (p/v) (eje de ordenadas). Los valores obtenidos son la media de dos medidas diferentes
tras incubar durante 90 minutos con el substrato 4-nitrofenilfosfato.
I-La: Extracto de rosal de Viveros Maillan-Ferrer (Francia).
I-La clarificado: Extracto clarificado de rosal de Viveros Maillan-Ferrer (Francia).
I-Ma: Extracto de rosal de la Estación Experimental de Aula Dei – CSIC (Zaragoza, España).
54
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
1 1/2 1/8 1/32 1/100 1/500
Abs
orba
ncia
a 4
05 n
m (9
0 m
in)
Diluciones del extracto original 1:20 (p/v)
S1 S2 S3 Sano
Resultados _
Gráfico 4.2. Valores de absorbancia a 405 nm obtenidos mediante ELISA-DAS utilizando tejidos de
rosal infectado. Valores de absorbancia a 405 nm (eje de abscisas) obtenidos a partir de diluciones seriadas de extractos
de tejidos de rosal infectado 1:20 (p/v) (eje de ordenadas). Los valores obtenidos son la media de dos medidas diferentes
tras incubar durante 90 minutos con el substrato 4-nitrofenilfosfato.
S1: Extracto de rosal de Invernadero de Moncada (Valencia, España)
S2: Extracto de rosal de Invernadero de Moncada (Valencia, España)
S3: Extracto de rosal de Invernadero de Moncada (Valencia, España)
En el caso de gráfico 4.1, las tres muestras fueron positivas cuando se detectaron a partir del
extracto original 1:20 (p/v), pero no fue así cuando se utilizaron diluciones de dicho extracto 1/10 o
mayores.
En el caso del gráfico 4.2, se detecto el virus hasta la dilución 1/32 para las muestras S2 y S3
y hasta la dilución 1/8 para la muestra S1. Estos resultados se compararon posteriormente con los
obtenidos mediante la técnica Inmunocaptura-RT-PCR (apartado 4.4).
4.1.2. ANÁLISIS RUTINARIO MEDIANTE ELISA-DAS DE MUESTRAS DE ROSAL.
Se utilizó la técnica ELISA-DAS para la detección de PNRSV en 86 plantas de los Viveros
55
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
Abs
orba
ncia
a 4
05 n
m (9
0 m
in)
Muestras
Placa A (primeras 19 muestras)
Resultados
Plantas Continental (muestras N1-N20 y 1-67), 3 plantas con síntomas recolectadas en invernadero
en Moncada (Valencia) (muestras I-D, I-M y I-A) y 2 con síntomas de mosaico de la Estación
Experimental Aula Dei (Zaragoza)– CSIC (1390 y 1408), según se detalla en el apartado 3.5.1 de
Material y Métodos (figura 4.1):
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
22,22,42,62,8
Abs
orba
ncia
a 4
05 n
m (9
0 m
in)
Muestras
Placa A (segundas 19 muestras)
56
Resultados _
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
22,22,4
1 2 5 6 7 8 9 10 13 15 18 19 20 21 - +
Abs
orba
ncia
a 4
05 n
m (9
0 m
in)
Muestras
Placa B (primeras 14 muestras)
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
3 4 11 12 14 16 22 28 51 52 53 54 55 - +
Abs
orba
ncia
a 4
05 n
m (9
0 m
in)
Muestras
Placa C (primeras 13 muestras)
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
22,22,4
24 25 26 27 29 30 31 32 33 39 40 41 42 45 - +
Abs
orba
ncia
a 4
05 n
m (9
0 m
in)
Muestras
Placa B (segundas 14 muestras)
57
Resultados
Figura 4.1. Valores de absorbancia obtenidos mediante ELISA-DAS utilizando tejidos de rosal. Valores
de absorbancia a 405 nm (eje de abscisas) obtenidos a partir de extractos de tejidos de rosal 1:20 (p/v) (eje de
ordenadas). Los valores obtenidos son la media de dos medidas diferentes tras incubar durante 90 minutos con el
substrato 4-nitrofenilfosfato. Se hicieron tres placas (A, B y C) y en cada pocillo se depositaron 190 µl del
correspondiente extracto.
Tras el revelado de las placas consideraron positivas las muestras “I-D” y “I-A” de la placa
“A”. Así mismo, ciertas muestras arrojaron unos valores cercanos al límite, por lo que se aplicó de
nuevo el método ELISA-DAS a las muestras positivas y dudosas a partir de nuevo extracto,
confirmándose únicamente como positivas las muestras “I-D” y “I-A”.
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 - +Abs
orba
ncia
a 4
05 n
m (9
0 m
in)
Muestras
Placa C (12 muestras restantes)
58
Resultados _
4.2. DETECCIÓN DE PNRSV EN ROSAL MEDIANTE HIBRIDACIÓN
MOLECULAR NO RADIOACTIVA.
4.2.1. OBTENCIÓN DE LA SONDA A PARTIR DEL ARN EXTRAÍDO.
4.2.1.2. Comprobación del funcionamiento de los cebadores y obtención de c-ADN de PNRSV.
Se comprobó el funcionamiento de los cebadores seleccionados haciendo una RT-PCR de
material infectado mantenido en la colección del IVIA según se detalla en el apartado 3.4.2.2 de
Material y Métodos.
Se analizaron 15 muestras: 1 a 6, 8 y 10 de tejido de rosal; 7, 9 y 11 de tejido de ciruelo
pollizo y 2 controles negativos (el 12 rosal sano, y el 13 con el cóctel pero con agua en vez de ARN
purificado) (figura 4.2).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 - -
Figura 4.2. Análisis electroforético en gel de agarosa al 2% de los productos de amplificación por RT-PCR.
Realizado para comprobar el funcionamiento de los cebadores PNRSV1 y PNRSV2, y para obtener c-ADN de PNRSV.
Como se observa en la figura 4.2, sólo se obtuvieron resultados positivos con las muestras
de ciruelo pollizo, dando lugar a una banda única correspondiente a 357 pares de bases. Así pues, no
se logró amplificar de tejido de rosal.
2000 bp
600 bp
357 bp
59
Resultados
4.2.1.3. Obtención de la sonda mediante una PCR de marcaje con dUTP-digoxigenina.
A partir del tubo 9 (Figura 4.2) que es en el que se observó una mayor cantidad de c-ADN
procedente de la RT-PCR del apartado 4.2.1.2 y mediante una PCR de marcaje se obtuvo la sonda
PNRSV-A marcada con digoxigenina (figura 4.3). Se utilizó el cóctel de la tabla 3.5 y el programa
de termociclado de la tabla 3.6.
Las muestras 1 a 4 eran alícuotas del tubo 9 (figura 4.2) y son las que se sometieron a la
PCR. La 5 era un control negativo de agua y la 6 es el propio tubo 9 sin someter a PCR y que se
utilizó como referencia.
M 1 2 3 4 - 6
Figura 4.3. Análisis electroforético en gel de agarosa al 2% de los productos de amplificación de la PCR
de marcaje. Realizada para obtener la sonda PNRSV-A marcada con digoxigenina.
Se obtuvo una sola banda por carril correspondiente a la sonda de 357 pares de bases
marcada con digoxigenina. Se guardaron entonces los tubos 1 a 4 en un mismo tubo, constituyendo
la sonda PNRSV-A.
357 bp
200 bp
600 bp
2000 bp
60
Resultados _
4.2.1.4. Comprobación de la existencia de la sonda y dilución.
Se realizó una dilución seriada de la sonda que se depositó en membrana de nylon y se
detectó colorimétricamente (figura 4.4) según se detalla en el apartado 3.4.2.4 de Material y
Métodos.
1 1/10 1/50 1/100 1/500 1/1000
Figura 4.4. Detección colorimétrica de una dilución seriada de la sonda PNRSV-A. Realizada para
comprobar el marcaje.
Se obtuvieron resultados positivos para todas las diluciones probadas (1, 1/10, 1/50, 1/100,
1/500 y 1/1000).
Una vez obtenida la sonda, por densidad óptica se determinó que su concentración era de
825 ng/μl. Se diluyó en tampón de hibridación sin formamida, dejándola a una concentración de
1,8975 μg/ml, para su almacenamiento a -20 ºC.
4.2.2. OBTENCIÓN DE LAS SONDAS A PARTIR DEL CLON DE ARN4 DE PNRSV.
4.2.2.1. Comprobación del funcionamiento de los cebadores y del estado del clon.
A partir del clon en la dilución 1:100, se hizo una PCR utilizando los cebadores de la tabla
3.7, para comprobar el funcionamiento de los mismos y el estado de los plásmidos. Se hizo una
PCR utilizando los cebadores VP78 y VP33 y otra utilizando los cebadores VPC y VP33 (figura
4.5) tal y como se detalla en el apartado 3.4.3.1 de Material y Métodos.
Los iniciadores VP78 y VP33 se utilizaron con el clon en las muestras 1 y 2, y sin el clon en
las 3 y 4; y los iniciadores VPC y VP33 se utilizaron con el clon en las 5 y 6, y sin el clon en 7 y 8.
61
Resultados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M Ø Ø
Figura 4.5. Análisis electroforético en gel de agarosa al 2% de los productos de amplificación por PCR.
Realizado para comprobar el funcionamiento de los cebadores VP78, VPC y VP33, y el estado del clon de ARN4 de
PNRSV.
4.2.2.2. Obtención de las sondas mediante una PCR de marcaje con dUTP-digoxigenina.
A partir del clon en la dilución 1:100, se hizo una PCR de marcaje utilizando los cebadores
de la tabla 3.7, para obtener las sondas marcadas PNRSV-B (366 bp) y PNRSV-C (864 bp) según
sedetalla en el apartado 3.4.3.2 de Material y Métodos.
Se hicieron unas diluciones seriadas de las sondas que se depositaron en membranas de
nylon y se detectaron colorimétricamente (figura 4.6) según el apartado 3.4.2.4 de Material y
Métodos.
1 1/10 1/50 1/100 1/500 1/1000
Figura 4.6. Detección colorimétrica de diluciones seriadas de las sondas PNRSV-B y PNRSV-C.
Realizada para comprobar el marcaje.
Se obtuvieron resultados positivos para todas las diluciones probadas (1, 1/10, 1/100, 1/500
y 1/1000). Las sondas se diluyeron a 3 μl/ml para una conservación a -20 ºC hasta uso.
864 bp
366 bp
PNRSV-B
PNRSV-C
62
Resultados _
4.2.3. DETECCIÓN DE PNRSV MEDIANTE HIBRIDACIÓN MOLECULAR NO
RADIOACTIVA.
4.2.3.1. Detección por hibridación “dot-blot” de muestras con la sonda PNRSV-A.
Comprobación de su especificidad y ajuste de las condiciones de hibridación.
Para probar el funcionamiento de la sonda, se realizó una hibridación molecular del ARN
extraído de las muestras positivas CP 9.1 (1), CP 9.2 (2), CP 9.3 (3), CP 9.2 + rosal sano (4), CP 9.3
+ rosal sano (5), PN-GF (6), y la muestra 7 como control negativo (figura 4.6). Las muestras 4 y 5
se analizaron para ver si el extracto de tejido de rosal afectaba al ARN de PNRSV presente en las
muestras positivas de ciruelo pollizo. Se siguió el apartado 3.5.2 de Material y Métodos.
Conjuntamente se realizó una RT-PCR de las mismas muestras a modo de comparación (figura 4.7)
siguiendo el apartado 3.5.3 de Material y Métodos.
M 1 2 3 4 5 6 7
Figura 4.7. Hibridación molecular y RT-PCR de muestras positivas de ciruelo y GF305. Realizada para
comprobar el correcto funcionamiento de la sonda PNRSV-A.
Tanto en el gel como en la membrana se observó como las muestras 1 a 6 de material vegetal
eran positivas y como se obtuvo una banda de ADN amplificado del tamaño de 357 pares de bases.
357 bp
600 bp
1500 bp
2000 bp
63
Resultados
Con el objeto conseguir la detección de PNRSV por hibridación “dot-blot” en muestras de
rosal se hizo una hibridación (figura 4.8) del ARN extraído de las muestras que se detallan (tabla
3.1) siguiendo el apartado 3.5.2 de Material y Métodos:
1.- CP 9.1 2.- CP 9.2 3.- CP 9.3 4.- 4.8
5.- 6.3 6.- 7.9 7.- 69 8.- 78
9.- X 10.- X 11.- PN-Vi 12.- PN-Sa
13.- PN-Sa 14.- CP 9.2 + 78 15.- CP 9.3 + 69 16.- PN-GF
17.- R 18.- - 19.- - 20.- -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 4.8. Membrana de nylon cargada positivamente resultado de la hibridación molecular “dot-blot”
con la sonda PNRSV-A de ARN extraído de muestras de rosal, ciruelo y GF305. Realizada para aplicar la detección
con la sonda PNRSV-A a muestras de rosal.
Como se observa en la figura 4.8, todas las muestras (1 a 17) fueron positivas.
Para comprobar la especificidad de la sonda, esta fue utilizada con ARN extraído de
muestras infectadas por distintos virus (figura 4.9) siguiendo el apartado 3.5.2 de Material y
Métodos. Las muestras utilizadas en la hibridación fueron: (1) Cucumber Mosaic Virus (CMV), (2)
Cherry leaf roll virus (CLRV), (3) Strawberry latent ringspot virus (SLRSV), (4) Citrus tristeza
virus (CTV) aislado T388, (5) Plum pox virus (PPV) D, (6) Plum pox virus (PPV) M, (7) Rosal X,
(8) Ciruelo CP 9.3, (9) y (10) controles negativos.
64
Resultados _
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 6 7 8 9 10 Figura 4.9. Membranas de nylon cargadas positivamente resultado de la hibridación molecular “dot-
blot” con la sonda PNRSV-A de ARN extraído de muestras de tejidos infectados por distintos virus. (A) 0%
formamida, izquierda. (B) 50% formamida, derecha. Realizada para comprobar la especificidad de la sonda PNRSV-A.
Como se observa en la figura 4.9, todas las muestras de la membrana de la izquierda
resultaron positivas, por ello, se procedió a ajustar las condiciones de la hibridación, haciéndolas
más restrictivas, evitando de este modo el cruce de la sonda con el ARN de otros virus distintos al
PNRSV. Se utilizó tampón de hibridación (Anejos 7.2.15) con 50 % de formamida y se siguió el
mismo procedimiento de hibridación que para el caso anterior, con las mismas muestras (figura
4.9).
Se observaron como positivas las muestras 7 y 8, diferenciándose de manera clara con
respecto al resto de muestras.
4.2.3.2. Aplicación de la sonda PNRSV-A a la detección de PNRSV por hibridación molecular
de impresiones de tejidos en membranas.
Con el objetivo de detectar el PNRSV a partir de impresiones de tejidos de rosal, se llevaron
a cabo hibridaciones moleculares de impresiones, de extractos clarificados, y de extracciones de
ARN de muestras de rosal, ciruelo y GF305, siguiendo el apartado 3.5.2 de Material y Métodos
(figura 4.10 y tabla 4.3).
65
Resultados
1 6 11 16 20
2 7 12 17 21
3 8 13 18 22
4 9 14 19 23
5 10 15 24
25
Figura 4.10 Detección mediante hibridaciones moleculares con la sonda PNRSV-A de PNRSV en
distintas muestras de tejidos. Hibridaciones realizadas para intentar la detección de PNRSV a partir de impresiones en
membranas. Las muestras positivas deben mostrar un color azul.
Tabla 4.3. Detección mediante hibridaciones moleculares con la sonda PNRSV-A de PNRSV en distintas
muestras de tejidos. Hibridaciones realizadas para intentar la detección de PNRSV a partir de impresiones de rosal en
membranas.
Muestra Identificación Resultado Muestra Identificación Resultado
1 Impresiones PN-GF - 13 ARN extraído X + 2 Extracto clarificado PN-GF - 14 ARN extraído CP 9.3 + 3 Impresiones GF305 (sano) - 15 ARN extraído CP 9.3 + 4 Impresiones Ciruelo pollizo (sano) - 16 Extracto clarificadoC. P. 9.1 - 5 ARN extraído PN-GF + 17 ARN extraído C. P. 9.1 + 6 Impresiones R - 18 ARN extraído X + 7 Extracto clarificado R - 19 ARN extraído C. P. 9.3 + 8 Impresiones GF305 (sano) - 20 Impresiones 69 - 9 Impresiones Ciruelo pollizo (sano) - 21 Impresiones 79 -
10 ARN extraído R + 22 Extracto clarificado 69 - 11 Impresiones C. P. 9.3 - 23 Extracto clarificado 79 - 12 Extracto clarificado C. P. 9.3 - 24 ARN extraído 69 +
25 ARN extraído C. P. 9.3 +
Como se puede observar con estos resultados, las impresiones y las gotas de los extractos de
66
Resultados _
tejidos dejan unas marcas de color rojizo muy fuerte en las membranas, lo que hace que sea muy
difícil observar mediante la detección colorimétrica si son positivas o no. Sólo resultaron positivas
(color azul) las muestras de ARN extraído de tejidos infectados, resultando además bastante débiles.
Se intentaron variar algunas condiciones de hibridación como aumentar el tiempo de la misma, o la
concentración de la sonda, pero nunca se llegaron a detectar más que muestras de ARN extraído,
nunca muestras directas del extracto o impresiones.
Se probó también la hibridación molecular con revelado por quimioluminiscencia con esta
sonda, para evitar así el color dejado por los extractos en las membranas, siguiendo el apartado 3.5.2
de Material y Métodos, y no se obtuvo ningún resultado positivo. Además aparecieron cruces de la
sonda con ARN de otros virus que no nos interesan.
4.2.3.3. Detección con las sondas PNRSV-B y PNRSV-C.
Con las sondas PNRSV-B y PNRSV-C se realizaron también pruebas de detección de
PNRSV en ARN extraído de muestras infectadas con distintos virus mediante hibridación molecular
con revelado por quimioluminiscencia, siguiendo el apartado 3.5.2 de Material y Métodos (figura
4.11).
SONDA PNRSV-B SONDA PNRSV-C
Ø 1 2 3 4 5 6 Ø Ø 1 2 3 4 5 6 Ø
Ø 7 8 9 10 Ø Ø Ø Ø 7 8 9 10 Ø Ø Ø
1 = C.P. 9.3, 2 = PN-Sa, 3 = PN-Vi, 4 = Rosal sano, 5 = I-La, 6 = clon 1/100, 7 = SLRSV, 8 = CLRV, 9 =
CMV, 10 = PPV.
Figura 4.11 Detección mediante hibridaciones moleculares con las sondas PNRSV-B y PNRSV-C de
PNRSV en muestras de tejidos afectados por distintos virus. Realizada para comprobar la especificidad de la sonda.
67
Resultados
Se observó en estas placas fotográficas (figura 4.11) que las sondas fueron específicas,
detectando sólo algunas de las muestras que se consideraron positivas (C.P. 9.3, I-La y PN-Vi
débil), y sin cruzar con ningún otro ARN viral distinto al ARN de PNRSV.
Se procedió entonces a intentar detectar el virus en extractos directos de la planta o en
impresiones (figura 4.12).
Los resultados fueron claros. En este caso ambas sondas fueron específicas y funcionaron
bien, pero su sensibilidad fue baja, ya que sólo llegaron a detectar el virus a partir del ARN extraído
de la planta, pero nunca a partir de extractos directos o impresiones.
De febrero a junio los resultados obtenidos fueron los aquí mostrados, a partir de estas
fechas, de Julio a Noviembre, no se obtuvo ningún resultado positivo en el análisis de las mismas
muestras.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1, 2, 3, 4, 5, 6 = impresiones rosal sano; 7 = ARN de C.P. 9.3; 8 = ARN de GF305 PNRSV+; 9 = agua; 10 = ARN de
CLRV; 11 = ARN de SLRSV; 12 = impresiones rosal Lab; 13 = impresiones rosal 78; 14 = impresiones rosal 69; 15 =
impresiones rosal 48; 16 = impresiones rosal 63; 17 = impresiones rosal PNRSV-Samantha; 18 = impresiones rosal 79;
19 = impresiones rosal X; 20 = ARN de SLRSV; 21 = ARN de CMV.
Figura 4.12 Detección mediante hibridaciones moleculares con las sondas PNRSV-B y PNRSV-C de
PNRSV en distintas muestras de tejidos infectados. Aquí se analizan impresiones, extractos clarificados y ARN
extraído de plantas, y se comparan entre sí.
4.3. DETECCIÓN DE PNRSV EN ROSAL MEDIANTE RT-PCR.
Se intentó la detección de PNRSV en rosal mediante la técnica RT-PCR siguiendo el
68
Resultados _
apartado 3.5.3 de Material y Métodos, utilizando los iniciadores PNRSV1 y PNRSV2, y añadiendo
al cóctel de reacción en algunos casos aditivos que pudieran favorecer la reacción de amplificación
o evitar la acción nociva de posibles inhibidores presentes en el extracto de rosal (figura 4.13).
Como control positivo se utilizó extracto del ciruelo pollizo C.P. 9.3.
Como positivo debe aparecer una banda de 357 bp. Como se puede observar en la figura
4.13, en rosal se obtuvo un resultado muy débil al añadir 0.5 % de Tween 20®, y no se obtuvo
ningún resultado en el resto de casos (0.25 % de Tween 20® y 5 % de DMSO). También se probó
añadiendo ciertas cantidades de otros aditivos por separado, como 10 % de glicerol, 5 % PEG, 0.05
% de BSA o 1 % de BLOTTO, sin obtenerse ninguna banda para muestras de rosal.
M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7
M 1 2 3 4 5 6 7
1 = C.P. 9.3, 2 = I-La, 3 = 79, 4 = PN-Vi, 5 = PN-Sa, 6 = Rosal sano.
Figura 4.13. Detección mediante RT-PCR de distintas muestras de tejidos infectados con PNRSV. (A)
añadiendo al cóctel de reacción 0.5 % deTween 20®. (B) añadiendo al cóctel de reacción 0.25 % deTween 20®. (C)
añadiendo al cóctel de reacción 5 % de DMSO.
69
Resultados
Se hizo también una RT-PCR de muestras sometidas a una precipitación con amonio-acetato
tras la extracción del ARN según el apartado 3.5.3 de Material y Métodos, pero tampoco se obtuvo
resultado positivo alguno. Aplicando la misma técnica RT-PCR sin aditivos, en otros cultivos, como
el caso del melocotonero (muestras 1 a 5 de la tabla 3.1), sí que se obtuvieron resultados positivos.
4.4. DETECCIÓN DE PNRSV EN ROSAL MEDIANTE IC-RT-PCR Y
COMPARACIÓN CON LA TÉCNICA ELISA-DAS.
I-La I-La Clarificado
M 1 2 3 4 5 6 M 1 7 5 8 9 10 11 12
I-Ma S1
M 1 7 5 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6
Figura 4.14. Detección mediante IC-RT-PCR de distintas muestras de tejidos de rosal infectados con
PNRSV. El amplificado obtenido al utilizar los cebadores VP78 y VP33 es de 366 bp. Clave: (1) directa del extracto
original 1:20 (p/v), (2) 1/2, (3) 1/8, (4) 1/32, (5) 10-2, (6) 1/500, (7) 10-1, (8) 10-3, (9) 10-4, (10) 10-5, (11) 10-6, (12) rosal
sano.
70
Resultados _
Se realizó una detección mediante IC-RT-PCR de PNRSV en diluciones seriadas de
muestras de rosal (figura 4.14), siguiendo el apartado 3.5.3 de Material y Métodos.
Como puede observarse en la figura 4.14, la última dilución positiva del extracto original
1:20 (p/v) correspondió a 10-1 (I-La clarificado y I-Ma), 1/2 (I-La), 1 (S1). En la tabla 4.4 se
comparan las muestras que han sido analizadas tanto por ELISA-DAS como por IC-RT-PCR.
Tabla 4.4. Comparación de las detecciones mediante ELISA-DAS e IC-RT-PCR de distintas muestras de tejidos
de rosal infectados con PNRSV. Las diluciones se realizaron a partir del extracto original 1:20 (p/v).
Extracto Método 1 10-1 10-2 10-3
I-La
ELISA-DAS IC-RT-PCR
+ +
- -
- -
- -
I-La (clarificado) ELISA-DAS IC-RT-PCR
+ +
- +
- -
- -
I-Ma
ELISA-DAS IC-RT-PCR
+ +
- +
- -
- -
S1
ELISA-DAS IC-RT-PCR
+ +
- -
- -
- -
Tal y como se observa en la tabla 4.4, algunas muestras sólo resultaron positivas por uno de
los dos métodos empleados, ELISA-DAS e IC-RT-PCR. Analizando el porcentaje de coincidencia
entre ambas técnicas resultó del 87.5 % (figura 4.15). No obstante, el PNRSV fue detectado en dos
muestras únicamente mediante IC-RT-PCR.
IC-RT-PCR + -
+ 4 0 - 2 10 16
% Coincidencia = (14/16)·100 = 87.5 %
Figura 4.15. Comparación y porcentaje de coincidencia de las detecciones mediante ELISA-DAS e IC-RT-PCR
de distintas muestras de tejidos de rosal infectados con PNRSV. Las diluciones se realizaron a partir del extracto
original 1:20 (p/v).
ELISA-DAS
71
Discusión
5. Discusión.
Se han evaluado métodos serológicos y moleculares para la detección del virus PNRSV en
tejidos de rosal. El método ELISA-DAS, funcionó correctamente tal y como se describió
anteriormente (Clark et al., 1976) y se comprobó que presenta los mejores resultados cuando se
aplica en una época adecuada como primavera, siendo especialmente baja la detección en verano
coincidiendo con Moury et al. (2000), lo que se puede aplicar también al resto de técnicas aquí
empleadas, y puede explicar que, en muchos casos, al aplicar estas técnicas en épocas de calor, los
resultados fueran negativos.
La RT-PCR no resultó adecuada ni en simple ni con ninguno de los aditivos empleados en la
detección de PNRSV en rosal, en cambio la IC-RT-PCR en la que se realiza un paso previo de
inmunocaptura tras el que se aplican una serie de lavados, sí que dió lugar a resultados positivos,
coincidiendo con Moury et al. (2001), y se consiguió una sensibilidad 10 veces mayor que ELISA-
DAS en algunos casos. Candresse et al. (1998) sugiere que la presencia de inhibidores de la
transcriptasa inversa AMV o de la Taq polimerasa puede explicar estos hechos en otros casos. La
posible solución para la aplicación de la RT-PCR pasaría por el empleo de un adecuado método de
purificación del ARN extraído previo a la aplicación de la RT, o por la utilización de enzimas que
no pudieran ser inhibidas.
Por lo tanto se propone para la detección rutinaria de PNRSV en rosal, la utilización del
método ELISA-DAS, empleando la IC-RT-PCR, más laboriosa, para las muestras dudosas por
ELISA-DAS o cuando el número de muestras a analizar no sea muy elevado o cuando se trate de
plantas madre.
Se puso a punto una técnica para el diagnóstico de PNRSV mediante hibridación molecular
tipo “dot-blot” de ARN extraído de tejidos con sondas de cADN (sondas PNRSV-B y PNRSV-C) y
detección por quimioluminiscencia. Esta técnica no pudo aplicarse para la detección en extractos o
72
Discusión _
impresiones en membranas actuando directamente sobre el virión, demostrando la poca sensibilidad
de la técnica utilizando estas sondas en estos casos, y tampoco resultó adecuada la aplicación de la
técnica con detección colorimétrica debido al fuerte color que producen los extractos de la planta en
las membranas, lo que impide la correcta distinción entre resultados positivos y negativos. Una
posible solución para aplicar esta técnica en impresiones sería el uso de sondas de cARN, utilizadas
con éxito en otras especies (Crosslin et al., 1992; Heuss-LaRosa et al., 1995), aunque su obtención
es más laboriosa que la de las sondas de cADN.
6. Con
det
qu
mo
uti
con
nclusion
La técnica
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La RT-PC
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Primavera
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73
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rosal.
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s
a
R
n
a
as
e
74
75
Anejos
7. Anejos.
7.1. ENFERMEDADES DEL ROSAL CAUSADAS POR HONGOS,
BACTERIAS Y NEMÁTODOS.
7.1.1. HONGOS.
7.1.1.1. Oidio de la rosa “powdery mildew” ( Sphaerotheca pannosa ).
(1) Fuerte crecimiento de micelio blanquecino en el haz de las hojas.
(2) Síntomas de enrollado y distorsión de las hojas.
(3) Síntomas en tallo y espinas.
1 2 3
76
Anejos __
7.1.1.2. Mancha negra del rosal “black spot” ( Diplocarpon rosae ).
(4) Lesiones tempranas en hoja.
(5) Acérvulo del hongo en una lesión en hoja.
7.1.1.3. Roya del rosal “rust” ( Phragmidium mucronatum ).
(6) Pústulas naranjas en el envés de las hojas.
(7) Pústulas naranjas en el envés de las hojas (más aumentos).
(8) Manchas cloróticas en el haz de las hojas.
4 5
6 7 8
77
Anejos
7.1.1.4. Verticilosis “verticillium wilt” ( Verticillium spp. ).
(9) Marchitamiento y amarilleo general de las hojas.
(10) Marchitamiento general de un ramo con brote floral.
(11) Hojas cloróticas tras la infección.
7.1.1.5. Mildiu del rosal “downy mildew” ( Peronospora sparsa ).
(12) Manchas irregulares de color púrpura a marrón oscuro en el haz de las hojas.
(13) Manchas irregulares en el haz de las hojas (más aumentos).
9 10 11
12 13
78
Anejos __ 7.1.1.6. Chancros producidos por Coniothyrium spp..
(14) Chancros en varios tallos de rosal en maceta.
(15) Chancro en tallo.
(16) Chancro en tallo.
7.1.1.7. Chancro castaño “brown canker” ( Cryptosporella umbrina ).
(17) Chancro castaño en tallo.
14 15
16
17
79
Anejos
7.1.1.8. Podredumbre gris “botrytis blight” ( Botrytis cinerea ).
(18) Capullo floral con crecimiento del micelio y esporulación del hongo.
(19) Lesiones en pétalos.
(20) Pequeña pudrición marrón en pétalos florales.
7.1.1.9. Chancro producido por Nectria cinnabarina.
(21) Chancro en el tallo con esporodoquios.
(22) Chancro del tallo (más aumentos).
18
19 20
21 22
80
Anejos __
7.1.1.10. Antracnosis ( Sphaceloma rosarum ).
(23) Manchas foliares marrones muy extendidas.
(24) Pequeñas manchas foliares.
7.1.1.11. Manchas foliares producidas por Cercospora sp..
(25) Manchas circulares con márgenes de color púrpura a marrón rojizo y centro gris.
(26) Manchas oscuras en hojas.
25 26
23 24
81
Anejos
7.1.2. BACTERIAS.
7.1.2.1. Tumores o agallas de la corona “crown gall” ( Agrobacterium tumefaciens ).
(27) Tumor en la corona de la planta o justo bajo la superficie.
(28) Tumor en la parte aérea del tallo.
7.1.3. NEMÁTODOS.
(29) Decaimiento general y enanismo de la planta (derecha) comparada con una planta sana
(izquierda).
(30), (31) Tumores producidos en raíces afectadas por nemátodos del género Meloidogyne.
27 28
29 30 31
82
Anejos __
7.1.4. VIRUS Y OTRAS AFECCIONES DE ETIOLOGÍA VIRAL.
7.1.4.1. Mosaico del rosal (PNRSV, ApMV, ArMV).
(32) Síntomas foliares incluyendo mosaicos, manchas en anillo y moteados.
(33) Mosaico en hoja.
(34), (35) Manchas en anillo.
(36) Moteado en hoja.
(37) Amarilleo formando una red en hoja.
32 33 34
35 36 37
83
Anejos
7.1.4.2. Rayado anular del rosal “rose ring pattern”.
(38) Rayado anular en hoja.
(39) Discontinuidad de color floral en pétalos.
7.1.4.3. Enanismo primaveral del rosal “rose spring dwarf”.
(40) Desarrollo de las yemas en forma de rosetas de hojas.
(41) Crecimiento del tallo en zig-zag.
(42) Síntomas en Rosa multiflora cv. Burr.
38 39
40 41 42
84
Anejos __
7.1.4.4. Enrollado de las hojas del rosal “rose leaf curl”.
(43) Enrollado de hojas y necrosis.
(44) Enrollado de hojas terminales.
7.1.4.5. Roseta del rosal “rose rosette disease, RRD”.
(45) Tallos atrofiados.
(46) Rosetas en hojas de rosal infectado.
(47) Síntoma de escoba de bruja.
43
44
45 46
47
85
Anejos
7.2. MEDIOS, TAMPONES Y REACTIVOS.
7.2.1. AGUA FISIOLÓGICA TAMPONADA (AFT) x 10:
♦ Agua milliQ
♦ Cloruro sódico (NaCl) (Riedel de Haën, 31434) 8 % (p/v)
♦ Difosfato ácido de sodio dodecahidrato (PO4H2Na · 12 H2O)
(Fluka, 71650) 2.7 % (p/v)
♦ Difosfato ácido de sodio dihidrato (PO4H2Na · 2 H2O) (Probus,
173010) 0.4 % (p/v)
♦ Azida de sodio (NaN3) (optativo) (Panreac, 162712) 0.2 % (p/v)
♦ Ajustar a pH 7.2 – 7.4
♦ Conservar a 4 ºC
7.2.2. TAMPÓN DE EXTRACCIÓN DE FRUTALES:
♦ Agua milliQ
♦ Agua fisiológica tamponada (AFT) x 10 (Anejos 8.3.1) 10 % (v/v)
♦ Polivinilpirrolidona (PVP) (Sigma, PVP-10) 2 % (p/v)
♦ Dietilditiocarbamato sódico trihidrato (DIECA)
((C2H5)2NCS2Na/C5H10NNaS2) (Scharlau Chemie, S0 0270) 0.2 % (p/v)
♦ Ajustar a pH 7.2 – 7.4
♦ Conservar a 4 ºC
86
Anejos __
7.2.3. 0,5 M Na2EDTA:
♦ Agua milliQ
♦ Ácido etilendiaminotetraacético disódico dihidratado
(Na2C10H16N2O8·2H2O) (Panreac, 131026) 18.612 % (p/v)
♦ Ajustar a pH 8
♦ Autoclavar
♦ Temperatura ambiente
7.2.4. 1 mM Na2EDTA:
♦ Agua milliQ
♦ Ácido etilendiaminotetraacético disódico dihidratado
(Na2C10H16N2O8·2H2O) (Panreac, 131026) 0.037 % (p/v)
♦ Ajustar a pH 8
♦ Autoclavar
♦ Temperatura ambiente
7.2.5. 50xTAE (Tris-Acetato):
♦ Agua milliQ
♦ Tris hidroximetil aminometano ((CH2OH)3CNH2) (Riedel de
Haën, 33742) 24.2 % (p/v)
♦ 0,5 M Na2EDTA (Anejos 8.3.3) 10 % (v/v)
♦ Ácido acético glacial (C2H4O2) (Riedel de Haën, 33209) 5.71 % (v/v)
♦ Temperatura ambiente
87
Anejos
7.2.6. GEL DE AGAROSA 2 %:
♦ Agua milliQ
♦ 50xTris-Acetato (50xTAE) (Anejos 8.3.5) 1 % (v/v)
♦ Agarosa (Pronadisa, 8022) 2 % (p/v)
♦ Llevar a ebullición
♦ Dejar a temperatura ambiente
7.2.7. 1 M Tris-HCl:
♦ Agua milliQ
♦ Tris hidroximetil aminometano ((CH2OH)3CNH2) (Riedel de
Haën, 33742) 12.114 % (p/v)
♦ pH 7.4, 7.6 o 8.0
♦ Autoclavar
♦ Temperatura ambiente
7.2.8. 1xTE:
♦ Agua milliQ
♦ 1 M Tris-HCl (pH 8.0, 7.6 o 7.4) (Anejos 8.3.7) 1 % (v/v)
♦ 0,5 M Na2EDTA (Anejos 8.3.3) 0.2 % (v/v)
♦ Autoclavar
♦ Temperatura ambiente
88
Anejos __
7.2.9. 2 mM dUTP-digoxigenina:
♦ Agua milliQ
♦ dATP (Amersham Pharmacia, 27-2035-02) 2 mM
♦ dCTP (Amersham Pharmacia, 27-2035-02) 2 mM
♦ dGTP (Amersham Pharmacia, 27-2035-02) 2 mM
♦ dTTP (Amersham Pharmacia, 27-2035-02) 1.9 mM
♦ dUTP-digoxigenina (Amersham Pharmacia) 0.1 mM
7.2.10. SOLUCIÓN DE BLOQUEO:
♦ Agua milliQ
♦ 10xMaleic Acid Buffer (Dig Wash and Block Buffer Set,
Roche Diagnostics GmbH) 10 % (v/v)
♦ 10xBlocking Solution (Dig Wash and Block Buffer Set, Roche
Diagnostics GmbH) 10 % (v/v)
7.2.11. TAMPÓN DE INMUNOIMPRESIÓN:
♦ Agua milliQ
♦ Tris hidroximetil aminometano ((CH2OH)3CNH2) (Riedel de
Haën, 33742) 1.211 % (p/v)
♦ Cloruro sódico (NaCl) (Riedel de Haën, 31434) 0.584 % (p/v)
♦ Cloruro magnésico (MgCl2) (Riedel de Haën, 63063) 0.102 % (p/v)
♦ PH 9.5
♦ Temperatura 4º C
89
Anejos
7.2.12. SOLUCIÓN ACUOSA DE BROMURO DE ETIDIO:
♦ Agua milliQ
♦ Bromuro de etidio (C21H20BrN3) (Sigma, E8751) 1 % (p/v)
♦ En oscuridad
♦ Temperatura 4º C
7.2.13. 20xSSC:
♦ Agua milliQ
♦ Cloruro sódico (NaCl) (Riedel de Haën, 31434) 17.53 % (p/v)
♦ Citrato sódico dihidratado (C6H8O7Na3·2H2O) (Sigma, S4641) 8.82 % (p/v)
♦ PH 7.0
♦ Autoclavar
♦ Temperatura ambiente
7.2.14. SDS 10%:
♦ Agua milliQ
♦ Dodecil sulfato sódico en cristales (CH3(CH2)11OSO3Na)
(Sigma, L4509) 10 % (p/v)
♦ PH 7.2
♦ Calentar a 68 ºC
♦ Temperatura ambiente
90
Anejos __
7.2.15. TAMPÓN DE HIBRIDACIÓN:
♦ 5xSSC (Anejos 8.1.13)
♦ N-laurilsarcosina (Sigma, L5000) 0.1 %
♦ SDS (Anejos 8.1.14.) 0.02 %
♦ Blocking reagent (Roche, 1096176) 1%
7.2.16. TAMPÓN DE CARGA:
♦ Agua milliQ
♦ Glicerol (C3H8O3) (Merck, 1.04092.1000) 50 % (v/v)
♦ Ácido etilendiaminotetraacético disódico dihidratado (EDTA)
(Na2C10H16N2O8·2H2O) (Panreac, 131026) 0.037 % (p/v)
♦ Azul de bromofenol (C19H10Br4O5S) (Sigma, B5525) 0.4 % (p/v)
♦ Temperatura 4 ºC
7.2.17. TAMPÓN CARBONATO:
♦ Agua milliQ
♦ Carbonato sódico (Na2CO3) (Panreac, 131648) 0.159 % (p/v)
♦ Bicarbonato sódico (NaHCO3) (Merck, 6329) 0.293 % (p/v)
♦ PH 9.6
♦ Azida de sodio (NaN3) (opcional) (Panreac, 162712) 0.02 % (p/v)
91
Anejos
7.2.18. TAMPÓN LAVADOR:
♦ Agua milliQ
♦ Cloruro sódico (NaCl) (Riedel de Haën, 31434) 8 % (p/v)
♦ Difosfato ácido de sodio dodecahidrato (PO4H2Na · 12 H2O)
(Fluka, 71650) 2.7 % (p/v)
♦ Difosfato ácido de sodio dihidrato (PO4H2Na · 2 H2O) (Probus,
173010) 0.4 % (p/v)
♦ Tween 20 1 % (v/v)
7.2.19. TAMPÓN SUSTRATO F.A.:
♦ Agua milliQ
♦ Dietanolamina (HOCH2CH2)2NH) 10 % (v/v)
♦ pH 9.8
7.2.20. SOLUCIÓN DE LAVADO I:
♦ Agua milliQ
♦ 2xSSC (Anejos 8.1.13.)
♦ SDS (Anejos 8.1.14.) 0.1 %
7.2.21. SOLUCIÓN DE LAVADO II:
♦ Agua milliQ
♦ 0.1xSSC (Anejos 8.1.13.)
♦ SDS (Anejos 8.1.14.) 0.1 %
92
Anejos __
7.2.22. AGUA FISIOLÓGICA TAMPONADA - TWEEN 20 (AFT-T):
♦ Agua milliQ
♦ Cloruro sódico (NaCl) (Riedel de Haën, 31434) 8 % (p/v)
♦ Difosfato ácido de sodio dodecahidrato (PO4H2Na · 12 H2O)
(Fluka, 71650) 2.7 % (p/v)
♦ Difosfato ácido de sodio dihidrato (PO4H2Na · 2 H2O) (Probus,
173010) 0.4 % (p/v)
♦ Azida de sodio (NaN3) (optativo) (Panreac, 162712) 0.2 % (p/v)
♦ Tween 20® 0.05 % (v/v)
♦ Ajustar a pH 7.2 – 7.4
♦ Conservar a 4 ºC
93
Anejos
7.3. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE VIROSIS Y OTRAS ENFERMEDADES
TRANSMISIBLES POR INJERTO EN ROSAL SEGÚN OEPP/EPPO (1997).
ENFERMEDAD MÉTODO
Apple mosaic virus (ApMV) E, Cs, BU
Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) E, Cs, SH, BU
Tobacco streak virus (TSV) E, Nt
Arabis mosaic virus (ArMV) E, Cq, BU
Strawberry latent ringspot virus (SLRSV) E, Cq
Tobacco ringspot virus (TRSV) E, Cq, Nc
Tomato ringspot virus (TomRSV) E, Cq, Nc
Rose streak MB
Rose leaf curl MB
Rose rosette BU
Rose spring dwarf BU
Rose ring pattern BU
Rose flower break V
Rose flower proliferation V
Rose frisure V
Clave: E = ELISA, V = inspección visual, Cs = Cucumis sativus, Nt = Nicotiana tabacum, Cq =
Chenopodium quinoa, MB = Rosa cv. Madame Butterfly, BU = Rosa multiflora cv. Burr, SH =
Prunus serrulata cv. Shirofugen, Nc = Nicotiana clevelandii.
94
95
Bibliografía
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Journal of Virological Methods 33: 355-365.
Wong S. M., Horst R. K. (1988). Comparisons of direct and indirect enzyme immunosorbent
assays for the detection of apple mosaic virus and prunus necrotic ringspot virus in rose.
Acta Horticulturae 234: 249-256.
Wong S.-M., Horst R. K., Langhans R. W. (1988). Symptomatology and occurrence of Apple
mosaic and Prunus necrotic ringspot viruses on rose in New York. Acta Horticulturae 234:
437-450.
111
Índice de tablas
9. Índice de tablas.
1. TABLA 1.1: Clasificación de los virus pertenecientes al género Ilarvirus (Roossinck et
al., 2000). 25
2. TABLA 3.1: Origen de las plantas analizadas. 37
3. TABLA 3.2: Secuencia de los cebadores PNRSV1 y PNRSV2. 42
4. TABLA 3.3: Cóctel para RT-PCR del PNRSV. 43
5. TABLA 3.4: Programa de termociclado para la RT-PCR del PNRSV. 43
6. TABLA 3.5: Cóctel para la PCR de marcaje del PNRSV. 44
7. TABLA 3.6: Programa de termociclado para la PCR del PNRSV. 44
8. TABLA 3.7: Secuencia de los cebadores VP78, VPC y VP33. 46
9. TABLA 3.8: Cóctel para la PCR del PNRSV. 47
10. TABLA 4.3: Detección mediante hibridaciones moleculares con la sonda PNRSV-A de
PNRSV en distintas muestras de tejidos. 65
11. TABLA 4.4: Comparación de las detecciones mediante ELISA-DAS e IC-RT-PCR de
distintas muestras de tejidos de rosal infectados con PNRSV. 70
12. TABLA 8.1: Métodos de detección de virosis y otras enfermedades transmisibles por
injerto en rosal según OEPP/EPPO (1997). 93
112
113
Índice de ilustraciones
10. Índice de ilustraciones.
1. FIGURA 1.1: “Rose X”, Arthur Russell. 2000. 1
2. FIGURA 1.2: Consumo de flores de rosal estimado para el 2003 en la Unión Europea
(Fuente: Flower Council of Holland ). 3
3. FIGURA 1.3: Representación esquemática de los distintos ensayos inmunoenzimáticos
ELISA. 19
4. FIGURA 1.4: Micrografía electrónica de partículas de PNRSV x 300.000 aumentos. 28
5. FIGURA 3.1: Diagrama de flujo para la extracción de ARN total. 40
6. GRÁFICO 4.1: Valores de absorbancia a 405 nm obtenidos mediante ELISA-DAS
utilizando tejidos de rosal infectado. 53
7. GRÁFICO 4.2: Valores de absorbancia a 405 nm obtenidos mediante ELISA-DAS
utilizando tejidos de rosal infectado. 54
8. FIGURA 4.1: Valores de absorbancia obtenidos mediante ELISA-DAS utilizando
tejidos de rosal. 57
9. FIGURA 4.2: Análisis electroforético en gel de agarosa al 2% de los productos de
amplificación por RT-PCR, realizado para comprobar el funcionamiento de los
cebadores PNRSV1 y PNRSV2 y para obtener c-ADN de PNRSV. 58
10. FIGURA 4.3: Análisis electroforético en gel de agarosa al 2% de los productos de
amplificación de la PCR de marcaje, realizada para obtener la sonda PNRSV-A
marcada con digoxigenina. 59
11. FIGURA 4.4: Detección colorimétrica de una dilución seriada de la sonda PNRSV-A. 60
12. FIGURA 4.5: Análisis electroforético en gel de agarosa al 2% de los productos de
amplificación por PCR, realizado para comprobar el funcionamiento de los cebadores
VP78, VPC y VP33, y el estado del clon de ARN4 de PNRSV. 61
114
Índice de ilustraciones _
13. FIGURA 4.6: Detección colorimétrica de diluciones seriadas de las sondas PNRSV-B
y PNRSV-C. 61
14. FIGURA 4.7: Hibridación molecular y RT-PCR de muestras positivas de ciruelo y
GF305, realizada para comprobar el correcto funcionamiento de la sonda PNRSV-A. 62
15. FIGURA 4.8: Membrana de nylon cargada positivamente resultado de la hibridación
molecular “dot-blot” con la sonda PNRSV-A de ARN extraído de muestras de rosal,
ciruelo y GF305, realizada para aplicar la detección con la sonda PNRSV-A a muestras
de rosal. 63
16. FIGURA 4.9: Membranas de nylon cargadas positivamente resultado de la hibridación
molecular “dot-blot” con la sonda PNRSV-A de ARN extraído de muestras de tejidos
infectados por distintos virus, realizada para comprobar la especificidad de la sonda
PNRSV-A. 64
17. FIGURA 4.10: Detección mediante hibridaciones moleculares con la sonda PNRSV-A
de PNRSV en distintas muestras de tejidos, hibridaciones realizadas para intentar la
detección de PNRSV a partir de impresiones en membranas. Las muestras positivas
deben mostrar un color azul. 65
18. FIGURA 4.11: Detección mediante hibridaciones moleculares con las sondas PNRSV-
B y PNRSV-C de PNRSV en muestras de tejidos afectados por distintos virus,
realizada para comprobar la especificidad de la sonda. 66
19. FIGURA 4.12: Detección mediante hibridaciones moleculares con las sondas PNRSV-
B y PNRSV-C de PNRSV en distintas muestras de tejidos infectados. Aquí se analizan
impresiones, extractos clarificados y ARN extraído de plantas, y se comparan entre sí. 67
20. FIGURA 4.13: Detección mediante RT-PCR de distintas muestras de tejidos infectados
con PNRSV. 68
115
Índice de ilustraciones
21. FIGURA 4.14: Detección mediante IC-RT-PCR de distintas muestras de tejidos de
rosal infectados con PNRSV. 69
22. FIGURA 4.15: Comparación y porcentaje de coincidencia de las detecciones mediante
ELISA-DAS e IC-RT-PCR de distintas muestras de tejidos de rosal infectados con
PNRSV. Las diluciones se realizaron a partir del extracto original 1:20 (p/v). 70
23. FIGURAS ANEJOS: Distintas fotografías mostrando diferentes enfermedades que
afectan al rosal. 75
116
117
Abreviaturas utilizadas
11. Abreviaturas empleadas.
ADN: Ácido deoxirribonucleico.
AFT: Agua fisiológica tamponada.
AFT-T: Agua fisiológica tamponada - Tween 20.
AMV: (Alfalfa mosaic virus), virus del mosaico de la alfalfa.
(Avian myeloblastosis virus), virus de la mieloblastosis aviar.
APLPV: (American plum line pattern virus), virus de los arabescos del ciruelo
americano.
ApMV: (Apple mosaic virus), virus del mosaico del manzano.
ArMV: (Arabis mosaic virus), virus del mosaico del arábide.
ARN: Ácido ribonucleico.
ATP: Adenosín trifosfato.
AV-2: (Asparagus virus 2), virus 2 del espárrago.
BLOTTO: (Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer), leche desnatada.
BlShV: (Blueberry shock virus), virus del choque del arándano.
bp: Pares de bases.
BSA: Albúmina de suero bovino.
cADN: Ácido deoxirribonucleico clonado.
cARN: Ácido ribonucleico clonado.
CiLRV: (Citrus leaf rugose virus), virus de la hoja rugosa de los cítricos.
CLRV: (Cherry leaf roll virus), virus del enrollado del cerezo.
CMV: (Cucumber mosaic virus), virus del mosaico del pepino.
Co-PCR: (Cooperative-Polymerase Chain Reaction), reacción en cadena de la
polimerasa cooperativa.
Co-RT-PCR: (Cooperative-Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction),
reacción en cadena de la polimerasa cooperativa precedida de una
reacción de transcripción inversa.
CP: (Coat Protein), proteína de cubierta.
CSPD: 3-(4-metoxiespirol{1,2-dioxietano-3,2’-(5’-
cloro)triciclo[3.3.1.1.3,7]decan}-4-il) fenilfosfato.
CTP: Citosina trifosfato.
118
Abreviaturas empleadas _
CTV: (Citrus tristeza virus), virus de la tristeza de los cítricos.
CVV: (Citrus variegation virus), virus del variegado de los cítricos.
dATP: Deoxiadenosina trifosfato.
DB-PCR: (Direct Binding-Polymerase Chain Reaction).
dCTP: Deoxicitosina trifosfato.
DDBJ: DNA Databank of Japan.
dGTP: Deoxiguanosina trifosfato.
DIA: (Dot Immunobinding Assay).
DIECA: Dietilditiocarbamato sódico trihidrato.
DMSO: Dimetil sulfóxido.
DNA: (Deoxyribonucleic Acid), Ácido deoxirribonucleico.
dNTP: Deoxinucleótido trifosfato.
dTTP: Deoxitimidina trifosfato.
dUTP: Deoxiuracilo trifosfato.
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético.
EE.UU.: Estados Unidos.
ELFA: (Enzyme-Linked Fluorescent Assay).
ELISA: (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), ensayo de enzimas
conjugadas inmunoabsorbidas.
ELISA-DAS: (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Double Antibody
Sandwich), ensayo de enzimas conjugadas inmunoabsorbidas
mediante doble anticuerpo.
ELISA-DASI: (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Double Antibody Sandwich
Indirect), ensayo indirecto de enzimas conjugadas inmunoabsorbidas
mediante doble anticuerpo.
EMBL: European Molecular Biology Laboratory.
EMoV: (Elm mottle virus), virus del moteado del olmo.
GITC: Isotiocianato de guanidina.
h: Horas.
HdMV: (Hydrangea mosaic virus), virus del mosaico de la hortensia.
HJLV: (Humulus japonicus latent virus), virus latente del humulus japonica.
IC-PCR: (Immunocapture-Polymerase Chain Reaction), reacción en cadena de
la polimerasa tras un paso de inmunocaptura.
119
Abreviaturas utilizadas
IC-RT-PCR: (Immunocapture-Reverse Transcriptase-Polymerase Chain
Reaction), reacción en cadena de la polimerasa precedida de una
reacción de transcripción inversa y tras un paso de inmunocaptura.
IF: Inmunofluorescencia.
IR: Radioinmunoensayo.
IVIA: Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias.
KDa: Kilodaltons.
M: Molar.
min: Minutos.
mj: Milijulios.
ml: Mililitros.
mM: Milimolar.
MP: (Movement Protein), proteína de movimiento.
NCBI: National Center for Biotechnology Information.
ng: Nanogramos.
nm: Nanómetros.
NSDC: Nucleotide Sequence Database Collaboration.
ORF: (Open Reading Frame), pauta de lectura abierta.
PC-PCR: (Print Capture-Polymerase Chain Reaction).
PCR: (Polymerase Chain Reaction), reacción en cadena de la polimerasa.
PDV: (Prune dwarf virus), virus del enanismo del ciruelo.
PEG: Polietilenglicol.
PMoV: (Parietaria mottle virus), virus del moteado de la parietaria.
PNRSV: (Prunus necrotic ringspot virus), virus de los anillos necróticos de
los Prunus.
PPV: (Plum pox virus), virus de la sharka.
PVP: Polivinilpirrolidona.
RSV: (Rose streak virus), virus del estriado del rosal.
RT: (Reverse Transcriptase), transcripción inversa.
RT-PCR: (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), reacción en
cadena de la polimerasa precedida de una reacción de transcripción
inversa.
R.U.: Reino Unido.
120
Abreviaturas empleadas _
s: Svedbergs.
seg: Segundos.
SC-PCR: (Squash Capture-Polymerase Chain Reaction).
SLRSV: (Strawberry latent ringspot virus), virus de los anillos latentes de la
fresa.
SpLV: (Spinach latent virus), virus latente de la espinaca.
TAMV: (Tulare apple mosaic virus), virus del mosaico del manzano tulare.
Taq: Thermus aquaticus.
TE: Tris-EDTA.
TMV: (Tobacco mosaic virus), virus del mosaico del tabaco.
TRSV: (Tobacco ringspot virus), virus de la mancha anular del tabaco.
TSV: (Tobacco streak virus), virus del estriado del tabaco.
TomRSV: (Tomato ringspot virus), virus del anillado necrótico del tomate.
u: Unidades.
UPV: Universidad Politécnica de Valencia.
UTR: (Untranslated Region), región no codificante.
xg: Unidades de fuerza centrífuga relativa.
µg: Microgramos.
µl: Microlitros.
µM: Micromolar.