Introduccion

La Secuenciación Sanger es un método de secuenciación de ADN en el que el ADN diana se

desnaturaliza y se hibrida con un cebador de oligonucleótidos, que se extiende entonces gracias a la

ADN polimerasa usando una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs normales) y de

terminaciónes de cadena-trifosfatos de didesoxinucleótidos (ddNTPs).Los ddNTPs carecen del grupo

3 'OH al cual se añade el dNTP siguiente de la cadena de ADN en crecimiento. Sin el 3 'Oh, no se

pueden añadir más nucleótidos, y la ADN polimerasa se cae. Los cadenas de ADN resultantes recién

sintetizadas serán de diferentes longitudes, dependiendo de que tamaño tenia la cadena cuando se

incorporó al azar un ddNTP.

La mayoría de la secuenciación del ADN se ha automatizado. Las reacciones método de Sanger de

terminación de cadena se utilizan todavía, pero el vertido, el proceso, y la lectura de los geles de

poliacrilamida se han sustituido por métodos automatizados. En lugar de etiquetar los productos de

las 4 reacciones de secuenciación (con un desoxinucleótido radiactivo), cada uno de los

didesoxinucleótidos está marcado con un marcador fluorescente diferente. Cuando se excita con un

láser, los 4 tipos diferentes de productos se detectan y la intensidad de la fluorescencia de los datos

se traduce en un "pico". Así, todas las reacciones de las cuatro cadenas de terminación se pueden

realizar en el mismo tubo, y ejecutarse en un solo carril en un gel. Una máquina escanea el carril con

un láser. La longitud de onda de fluorescencia de la etiqueta de conjugado ddNTPs puede ser

interpretado por la máquina como una indicación de el lugar en el cual tubo lugar la reacción (ddG,

ddA, ddT, o ddC) en una banda de ADN particular.

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Materiales para la secuenciación de ADN

Patrón de ADN

Mix dNTP

Agua destilada

Buffer de amplificación

Primers Delantero, trasero

Mix para PCR

Taq ADN polimerasa

Enzima EXO-SAP

Columna de purificación

Mezcla tinte

Sephadex

Buffer de corrido

Secuencia de polímero

Placa de secuencia

Septa de placa

Método para la secuenciación de ADN

A. Preparar plantilla de ADN genómico

a. El ADN genómico se preparó de acuerdo con los protocolos estándar para el aislamiento de ADN de

alto peso molecular

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b.La concentración de ADN genómico se determinó por la incorporación de tinte A260,o un análisis

espectrofotométrico equivalente.

c. De acuerdo a la concentración determinada, el ADN genómico se diluye con agua estéril, agua

desionizada o Tris 10 mM, pH 8,0 con el fin de obtener una concentración de ADN de entre 30-60 ng /

mL.

d. A continuación, el ADN diluido se dividió en alícuotas y se almacenó a -15 ° C a -25 ° C.

e. La calidad del ADN se determinó mediante el cálculo de la relación A260/A280.

Nota: Para obtener ADN de alta calidad, la proporción A260/A280 está obligado a estar en entre 1,7 a

1,9

B. Amplificación por PCR

Preparación de reacción de PCR:

i. Se prepara la mezcla de reacción.

ii. Si el número de muestras a analizar es más que 5, se recomienda preparar una

mezcla maestra. Dependiendo del volumen calculado, combinar los componentes y

aplicar el vortex suavemente.

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Reactivos a utilizar:

• PCR Master Mix ............................... 12,5 l

El PCR Master Mix incluye los productos químicos necesarios para la reacción en cadena de

la polimerasa como el MgCl2, dNTPs, la Taq polimerasa y la solución tampón.

• Cebador ..................... 2,5 l

Cebador para ser usado en la reacción que tiene que ser diseñado apropiadamente para la

región de ADN genómico de interés.

• Cebador inverso ...................... 2,5 l

El cebador inverso se utilizá en la reacción y tiene que ser diseñado apropiadamente para la

región de ADN genómico de interés.

• G / C Enhancer ................................... 5 l

Cataliza la unión de los cebadores para la región de ADN de interés.

• El ADN genómico (30-60 l) ................ 2,5 l

Después de que todas las reacciones se añadan, se procede a agitar en el vórtex suavemente

el tubo para PCR con el fin de mezclar adecuadamente los productos químicos.El volumen total es de

25 l.

• Coloque los tubos de PCR en ciclo térmico.

Coloque el ciclo térmico en las condiciones de temperatura y tiempo de activación,para la

activación, amplificación y extensión de acuerdo a los tipos de productos químicos utilizados y el

ADN genómico de la región de interés.

Un protocolo de PCR ilustrativo es el siguiente:Activación: No se repite95 ° C ..................... 10 'Amplificación: 40 repeticiones95 ° C ..................... 40''62 ° C ..................... 1 '72 ° C ..................... 50''Elongación: No repetir72 ° C ..................... 7 'Mantenimiento:4 ° C ∞ .

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C. Determine la cantidad de ADN

a. Con el fin de determinar la cantidad de producto de PCR mezclar 5 l de producto de PCR

con carga de tinción.

b. Preparar gel de agarosa al 2% y realizar la electroforesis.

c. . Cargar el marcador de ADN de bajo peso en un pocillo de gel de agarosa.

d. Visualizar el gel bajo iluminador UV y analizar la imagen adquirida.

e. Limpie protocolo de producto PCR

f. Centrifugue brevemente los tubos de PCR antes de su uso.

g. Etiquete nuevamente los tubos PCR de acuerdo a los nombres de muestra.

h. Añada 5 l de producto de PCR.

i. Añada 2 l de enzima específica para limpiar los componentes no utilizados de la PCR en el

tubo.

j. El volumen total debe ser de 7 l.

k. Coloque los tubos en el termociclador.

l. Establezca las condiciones en función de la enzima que se utiliza para limpiar los excesos

de reactivos.

un protocolo ilustrativo es el siguiente:

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Incubación enzimática: 37 ° C ..................... 30 '

Inactivación de enzimas: 80 ° C ..................... 15 '

Mantenimiento: 4 ° C ∞.

D. Preparación de la reaccion de secuenciación

Los componentes de la reacción y la cantidad de productos químicos son:

• Mezcla de tinción ......................... 2 l

• Buffer de Secuenciación ......................... 2 l

• Primers ......................... 2 l

• Producto de PCR ......................... 2 l

• ddH2O ......................... 2 l

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El Volumen total es de 10 l. Agite en el Vortex los tubos para mezclar los componentes correctamente

y centrifugar brevemente.

Colocar los tubos en el ciclo térmico y establecer las condiciones.

Un ejemplo ilustrativo de las condiciónes para la PCR es el siguiente:

Activación: No se repiten

96 ° C ..................... 1 '

Extensión: 25 ciclos

96 ° C ..................... 10''

50 ° C ..................... 5''

60 ° C ..................... 4 '

Mantenimiento:

4 ° C ∞ ......................

E. Purificación del producto de extensión

Los productos amplificados se purifican mediante el uso de dos puntos de Sephadex.

Preparación de las columnas de purificación:

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a. Añadir 750 l de ddH2O a las columnas incluyendo Sephadex

b. Realice Vortex hasta que el polvo de Sephadex se disuelva correctamente y mantener a temperatura

ambiente durante 30 min.

c. Centrifugar las columnas durante 2 minutos a 4600 rpm

d. Desechar el agua en el tubo de recogida y asegurar que no queda agua.

e. Añadir todo producto de la PCR en el centro de la columna.

f. Centrifugar durante 2 minutos a 4600 rpm.

F. Realizar electroforesis capilar

a. Añadir todo el producto purificado en una placa de 96 pocillos.

b. Cubrir la placa con Septa.

c. Colocar la placa en un soporte de placa.

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d. Coloque la placa en el instrumento de secuenciación del ADN.

e. Espere a que el instrumento realice la electroforesis y recoga los datos.

f. Analice los datos.

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