FIZIOLOGIJA HEMOSTAZE

Désirée Coen

Hemostaza (gr. haimakrv, stasiszaustavljanje) predstavlja složen proces međusobno povezanih reakcija koje sudjeluju u zaustavljanju krvarenja nakon ozljede krvne žile. Ona predstavlja obrambeni mehanizam koji neprekidno štiti organizam od gubitka krvi iz intravaskularnog prostora.Normalni hemostatski odgovor na ozljedu krvne žile uključuje međudjelovanje trombocita te velikog broja čimbenika zgrušavanja i njihovih inhibitora s endotelom krvnih žila.Proces hemostaze se može podijeliti na primarnu i sekundarnu hemostazu koje se međusobno isprepliću. Rezultat primarne hemostaze je nastajanje trombocitnog ugruška na mjestu ozljede krvne žile. Sekundarnu hemostazu karakterizira nastajanje fibrinskog ugruška na mjestu nastalog trombocitnog ugruška.

PRIMARNA HEMOSTAZA

Primarna hemostaza uključuje:

a) kontrakciju krvne žileb) adheziju trombocitac) agregaciju trombocita

a) Kontrakcija krvne žile Kontrakcija krvne žile započinje neposredno nakon ozljede krvne žile i traje manje od jedne minute. Ona omogućuje smanjenje gubitka krvi u malim krvnim žilama, posebice u arteriolama. Serotonin i tromboksan A2 (TXA2) koji se oslobađaju iz trombocita te fibrinopeptid B koji se oslobađa u reakciji nastajanja fibrina imaju dodatni vazokonstrikcijski učinak.

b) Adhezija trombocitaOzljeda krvne žile ima za posljedicu izlaganje krvi subendotelnom vezivnom tkivu na kojeg se vrlo brzo nakon oštećenja endotela priljubljuju trombociti. Za adheziju trombocita na oštećeni endotel neophodan je von Willebrandov čimbenik (vWF), koji se istodobno veže na subendotelne strukture s jedne strane te na trombocite preko receptora za vWF koji se nalaze na površini membrane trombocita. Poznata su dva receptora za vWF: kompleks glikoproteina Ib-IX (GPIb-IX), koji predstavlja osnovni receptor, te kompleks glikoproteina IIb-IIIa (GPIIb-IIIa) koji je prisutan samo na aktiviranim trombocitima. Adhezija na kolagen je olakšana preko glikoproteina Ia (GPIa). Adhezija trombocita potiče niz metaboličkih reakcija koje započinju promjenom diskoidnog oblika trombocita u kuglasti, oslobađanjem sadržaja iz granula te agregacijom trombocita u prisutnosti oslobođenog ADP-a.

c) Agregacija trombocitaAgregacija, tj. sljepljivanje trombocita započinje neposredno nakon adhezije trombocita. Zbiva se pod utjecajen ADP-a i TXA2 oslobođenih iz trombocita te malih količina trombina koje nastaju vanjskim putem zgrušavanja. U agregaciji trombocita važnu ulogu ima fibrinogen. Molekule fibrinogena tvore most između aktiviranih trombocita vezanjem na kompleks GPIIb-IIIa koji predstavlja receptorsko mjesto za vezanje fibrinogena na membrani trombocita. Agregacija

trombocita rezultira nastajanjem trombocitnog ugruška na mjestu ozljede krvne žile. Ovaj proces je reverzibilan za razliku od procesa u kojem nastaje fibrinski ugrušak.Aktiviranje trombocita omogućuje otkrivanje fosfolipida, čimbenika 3 trombocita na membrani, koji su se nalazili s unutrašnje strane membrane, čime započinje sekundarna hemostaza.

SEKUNDARNA HEMOSTAZA

Sekundarna hemostaza uključuje aktiviranje sustava zgrušavanja krvi i učvršćivanje trombocitnog ugruška pomoću fibrinskih vlakana.

ZGRUŠAVANJE KRVI

Sustav zgrušavanja krvi je načinjen od niza povezanih proteolitičkih reakcija. Proteini plazme koji sudjeluju u sustavu zgrušavanja nalaze se u krvi kao prethodnici ili neaktivni oblici. Jednom kad započne faza zgrušavanja ovi proteini se prevode u aktivne oblike s enzimskim djelovanjem ili ko-čimbenike koji vode nastajanju trombina i fibrina.Nastajanje trombina predstavlja središnji događaj u mehanizmu zgrušavanja, jer jedino djelovanjem trombina iz topljivog fibrinogena nastaje netopljivi fibrin. Važnu ulogu u ovom procesu ima tkivni čimbenik (TF). Tkivni čimbenik (tromboplastin) se nalazi u ekstravaskularnim tkivima, na unutrašnjoj strani membrane na stanicama raznih organa: mozga, pluća, bubrega, jetre, slezene, te subendotelu krvnih žila. Može se pojaviti i na monocitima i makrofagima nakon specifičnog upalnog podražaja. Početni događaj koji vodi ka stvaranju hemostatskog čepa je izlaganje TF i stvaranje kompleksa TF/FVIIa lokaliziranog na ekstravaskularnim stanicama koje okružuju krvne žile (donja slika). Stvoreni kompleks aktivira FX u FXa i FIX u FIXa. FXa ostaje u blizini ekstravaskularnih stanica s kompleksom TF/FVIIa te aktivira FV u FVa što dovodi do stvaranja kompleksa FXa/FVa na stanici te taj kompleks aktivira male količine protrombina u trombin, sve u susjedstvu ekstravaskularnih stanica.

Ta mala količina trombina aktivira trombocite, FVIII, FV, FXI te odvaja FVIII od von Willebrandova faktoira. Stvoreni FIXa veže se na specifičan protein na površini aktiviranog

2

trombocita u susjedstvu svojeg ko-čimbenika FVIIIa Zgrušavanje se od tog trenutka odvija na površini aktiviranih trombocita (donja slika).. Aktivirani trombociti najprije vežu ko-čimbenike FVa i FVIIIa a zatim pripadajuće serinske proteaze, FIXa i FXa. FIXa sa svojim ko-čimbenikom FVIIIa privlači još FX iz cirkulacije i aktivira ga u FXa koji sa FVa stvara kompleks protrombinaze. Stvoreni kompleks pretvara velike količine protrombina u trombin koje su dovoljne za pretvorbu fibrinogena u fibrin. Dodatno, stvaranje trombina se može pojačati pomoću FXIa koji pretvara dodatni FIX u FIXa.

Pretvorba fibrinogena u fibrin može se podijeliti u nekoliko stupnjeva. Proces započinje djelovanjem trombina koji proteolitički cijepa peptidnu vezu Arg-Gly koja se nalazi blizu N-terminalnog dijela i lanaca fibrinogena, pri čemu nastaju po dvije molekule fibrinopeptida A i B i monomer fibrina. Fibrinopeptidi mogu nastati i djelovanjem nekoliko enzima zmijskog venoma na fibrinogen. Polimerizacijom fibrin monomera nastaje dvolančana struktura koja se naziva protofibril. Tako stvoreni fibrinski ugrušak nije stabilan jer su veze između monomera fibrina nekovalentne. Fibrinski ugrušak se stabilizira uvođenjem kovalentnih veza između glutamina i lizina na susjednim molekulama monomera fibrina. Ovu reakciju katalizira transglutaminaza (FXIIIa), nastala djelovanjem trombina na FXIII. Stabilizacija fibrina predstavlja ujedno i završni proces zgrušavanja. U plazmi se nalazi i određen broj inhibitora sustava zgrušavanja koji sprječavaju spontano započinjanje zgrušavanja i ograničavaju širenje stvorenog ugruška izvan područja ozljede. Svi inhibitori zgrušavanja su antiproteaze koje reagiraju samo s aktiviranim čimbenicima zgrušavanja. Najvažniji inhibitori su: antitrombin, protein C, protein S, 2-makroglobulin , 1-antitripsin, C1

inaktivator, 2-antiplazmin, inhibitor mehanizma tkivnog čimbenika i ko-čimbenik II heparina.

FIBRINOLIZA Nakon stvaranja fibrinskog ugruška na mjestu ozljede krvne žile dolazi do liziranja ugruška (tromba) uslijed aktiviranja fibrinolitičkog sustava. Aktiviranje fibrinolitičkog sustava se zbiva paralelno s aktiviranjem sustava zgrušavanja kako bi se spriječilo pretjerano stvaranje fibrina. Osnovne komponente fibrinolitičkog sustava čine plazminogen, plazmin, aktivatori plazminogena, inhibitori aktivatora plazminogena i antiplazmini.Osnovni fibrinolitički enzim je plazmin koji nastaje djelovanjem aktivatora plazminogena, posebice tkivnog aktivatora plazminogena (tPA). Plazmin može nastati i djelovanjem FXIIa na plazminogen, ali se smatra da je važnost ovog mehanizma nastajanja plazmina mnogo manja.Fiziološki supstrat plazmina je fibrin, ali može djelovati i na druge supstrate kao što su fibrinogen, FV i FVIII. Plazmin proteolitički cijepa peptidnu vezu između arginina i lizina, a inhibiraju ga 2-antiplazmin, 2-makroglobulin i 1-antitripsin.

3

Krajnji produkti razgradnje fibrina su D-dimeri.Za odvijanje normalne hemostaze neophodna je dinamička ravnoteža između sustava zgrušavanja i fibrinolitičkog sustava. Poremećaj ravnoteže nastajanja i razgradnje fibrina može dovesti do krvarenja ili tromboze.

4

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA ZGRUŠAVANJA

Renata Zadro

1. HEMOSTAZA

Pod hemostazom podrazumijevamo sve reakcije koje pridonose djelotvornom

zaustavljanju krvarenja. To uključuje zgrušavanje u užem smislu, ali i vazomotornu

reakciju koja uključuje vazokonstrikciju i smanjenje protoka krvi. Pod fiziološkim uvjetima

lokalno krvarenje s oštećenom krvnom žilom zaustavlja se stvaranjem krvnog ugruška uz

sudjelovanje različitih tvari zgrušavanja. U poremećenim stanjima unutar krvne žile

stvaraju se nakupine stanica i krvni ugrušci bogati fibrinom pa se intravaskularno

zgrušavanje može smatrati oblikom neregulirane hemostaze.

Hemostazu reguliraju humoralni stanični sustav, aktivatori i inhibitori, kao i mehanizmi

pozitivne i negativne povratne sprege. Poremećaji u toj regulaciji mogu dovesti do

neravnoteže koja se očituje ili kao krvarenje ili kao tromboza. Nadalje, postoje i

poremećaji koji su karakterizirani istovremenim zgrušavanjem i krvarenjem (diseminirana

intravaskularna koagulacija).

U dijagnostičke svrhe, sustav zgrušavanja može se pojednostavljeno podijeliti u dva dijela:

plazmatski faktori zgrušavanja i trombociti. Abnormalnost bilo kojeg dijela može dovesti do

poremećaja zgrušavanja. Kod utvrđivanja uzroka poremećaja zgrušavanja potrebno je

ustanoviti je li do poremećaja došlo zbog poremećenog stvaranja trombina i fibrinskog

ugruška ili zbog neadekvatnog broja i funkcije trombocita. U tu svrhu služe globalne

pretrage zgrušavanja protrombinsko vrijeme (PV) i aktivirano parcijalno tromboplastinsko

vrijeme (APTV), broj trombocita i vrijeme krvarenja.

Globalnim pretragama zgrušavanja ispitujemo aktivnost svih faktora zgrušavanja osim

FXIII, i njima obuhvaćamo vanjski, unutarnji i zajednički put zgrušavanja (Slika 1.1.).

Vanjski sustav uključuje reakcije tkivnog faktora i FVII koje vode do pretvorbe FX u

aktivirani FX (FXa). Unutarnji sustav se sastoji od FVIII, IX, XI i XII, prekalikreina i

visokomolekularnog kininogena (HMWK). Zajednički put uključuje FV i FX, protrombin

(FII), fibrinogen i FXIII.

Protrombinskim vremenom obuhvaćamo faktore vanjskog i zajedničkog puta zgrušavanja:

FII, V, VII, X i fibrinogen pa je to važna pretraga za utvrđivanje manjka navedenih

čimbenika zgrušavanja te za praćenje oralne antikoagulacijske terapije.

5

Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme ovisno je o aktivnosti faktora unutarnjeg i

zajedničkog puta zgrušavanja. APTV može biti produženo zbog nedostatka jednog ili više

spomenutih faktora ili zbog prisutnosti inhibitora koji ometaju funkciju tih faktora. Razina

faktora koja utječe na produženje APTV iznosi 25-40%.

Slika 1.1. Pojednostavljeni dijagram sustava zgrušavanja koji je rezultat enzimske pretvorbe svakog faktora zgrušavanja (sivo označeno) u njegov aktivirani oblik (bijelo označeno) uz prisutnost fosfolipida (PL) i kalcijevih iona (Ca2+).

Analiza broja trombocita izvodi se danas kao sastavni dio krvne slike kako bi se

ustanovila trombocitopenija koja se definira kao broj trombocita < 150 x 109/L.

6

Kalikrein

F F

Unutarnji put

Vanjski put

F

F XI F XIa

HMWK

F IX F IXa F F IXa i F VIIa i

F XaF X

PL

PL Ca2

+

F II F IIa

F Xa i

PL Ca2

+

fibrinogen fibrin

Zajednički put

Ca2

+

Vrijeme krvarenja je pretraga probiranja u ispitivanju funkcije trombocita. To nije globalna

pretraga sustava zgrušavanja. Vrijeme krvarenja je produženo ne samo zbog poremećaja

u funkciji trombocita nego i u slučajevima nedostatka ili funkcionalne abnormalnosti

proteina plazme poput von Willebrandovog faktora (vWF) koji je potreban za normalnu

interakciju trombocita sa stijenkom krvne žile. Vrijeme krvarenja može također biti

produženo u teškoj hipofibrinogenemiji. Ta pretraga nije dobar pokazatelj kirurškog

krvarenja i odgovora na hemostatsku terapiju.

1.1. PRIJEOPERACIJSKE PRETRAGE PROBIRANJA koje se rabe u ispitivanju poremećaja zgrušavanja su globalne pretrage PV, APTV i fibrinogen.

U Tablici 1.1. prikazani su referentni intervali pojedinih faktora zgrušavanja,

minimalna razina pojedinih faktora za održanje hemostatske funkcije te na koje globalne

pretrage nedostatak pojedinih faktora utječe.

Tablica 1.1. Referentni intervali pojedinih čimbenika zgrušavanja, minimalna razina za održanje hemostatske funkcije te utjecaj nedostatka faktora na globalne pretrage

FAKTOR REFERENTNI INTERVAL

Minimalna razina za krvarenje

niskog rizika

UTJECAJ NA KOAGULACIJSKE

PRETRAGE

PV APTV

Fibrinogen 1,8-4,1 g/L 0.5-1 g/L N ili ↑ N ili ↑II 70-146% 30-40% ↑ ↑V 62-150% 30-40% ↑ ↑VII 67-143% 10-20% ↑ NX 70-152% 30-40% ↑ ↑VIII 50-149% 30-40% N ↑IX 55-163% 30-40% N ↑XI 67-127% 20-30% N ↑XII 49-141% - N ↑Antitrombin 85-137% - N NProtein C 74-149% - N N

7

1.2. ALGORITMI PRETRAGA KOD NEJASNOG KRVARENJA

Poremećaj: sepsa,

šok,

oslobađanje tromboplastinskih tvari u politraumi, tumorima, leukemijama,

izvantjelesna cirkulacija,

hemoliza,

autoimune bolesti,

masivno oštećenje jetre

Sumnja na:

POTROŠNA KOAGULOPATIJA (diseminirana intravaskularna koagulacija)Diseminirana intravaskularna koagulacija (DIK) je poremećaj u kojem istovremeno

dolazi do stvaranja ugruška u mikrocirkulaciji (potrošnje faktora zgrušavanja i trombocita) i

otapanja nastalog ugruška (aktivacije fibrinolitičkog sustava). Zbog stvaranja

mikrougrušaka dolazi do nekroze organa, šoka i potrošnje faktora zgrušavanja te

krvarenja sa sekundarnom hiperfibrinolizom. Laboratorijski se poremećaj bilježi kao

smanjenje broja trombocita, koncentracije fibrinogena, sniženja aktivnosti FVIII i FXIII.

Povišene vrijednosti kompleksa trombin-antitrombin i protrombinskog fragmenta 1+2

ukazuju na pojačano stvaranje trombina. Istovremeno se nalaze u cirkulaciji razgradni

produkti fibrinogena i fibrina: fibrinopeptid A, fibrin monomer, a povišeni D-dimeri i

kompleks plazmin-antiplazmin ukazuju na prisutnost reaktivne fibrinolize.

Preporučene su sljedeće pretrage u rutinskoj dijagnostici i praćenju DIK-a:

Pretraga RezultatPV produljeno

APTV produljenoFibrinogen sniženTrombociti sniženiAntitrombin snižen

D-dimeri povišeni

8

9

PRAĆENJE HEPARINSKE TERAPIJE

Heparin se u terapiji i prevenciji tromboembolijskih bolesti rabi u

visokomolekularnom i niskomolekularnom obliku. Visokomolekularni (nefrakcionirani)

heparin je smjesa mukopolisaharida različite duljine lanaca koja ubrzava inaktivaciju

aktiviranih koagulacijskih faktora Xa i trombina (IIa). Niskomolekularni heparin jače ubrzava

reakciju inaktivacije FXa. Obje vrste heparina trebaju za svoje djelovanje prirodni inhibitor

zgrušavanja antitrombin. Nefrakcionirani heparin se rabi u visokim (30.000-50.000

IU/24sata) i niskim ili profilaktičkim dozama (do 15.000 IU/24 sata). Terapija visokim

dozama naročito se prati laboratorijski uporabom APTV-a koji je 1,5-2 puta veći u

terapijskom rasponu. Niske, profilaktičke doze najčešće ne zahtijevaju laboratorijsku

kontrolu ako se isključila sklonost krvarenju prije davanja terapije.

Poremećaj u smislu povišene koncentracije heparina u cirkulaciji nalazi se u slučaju: predoziranja heparinom,

- kumulacije,

- trombocitopenije,

greške u vađenju krvi,

- heparina iz katetera.

Laboratorijski nalazi:

Pretraga RezultatPV normalno

APTV produljenoFibrinogen normalanTrombociti sniženiAntitrombin normalan

10

FIBRINOLITIČKI SUSTAV

Fibrinolitički sustav krvi čini plazminogen koji se može aktivirati u plazmin čija je

uloga razgradnja fibrina u topljive razgradne produkte fibrina. Postoje dva fiziološka

aktivatora plazminogena: aktivator plazminogena tkivnog tipa (t-PA) i aktivator

plazminogena urokinaznog tipa (u-PA). Razgradnja fibrina u cirkulaciji odvija se nakon

aktivacije plazminogena s pomoću t-PA. Inhibicija fibrinolitičkog sustava odvija se na

razini aktivatora plazminogena (inhibitori aktivatora plazminogena - PAI) ili na razini

plazmina (antiplazmini) (Slika 2.1.).

Trombolitička terapija predstavlja postupak kojim se postiže ponovna prohodnost krvne

žile uporabom fibrinolitika koji se sustavno ili izravno uvode u nastali ugrušak, a

nadopunjuje se antikoagulacijskom, antitrombocitnom i mehaničkom terapijom.

Svi aktivatori plazminogena imaju svojstvo induciranja djelovanja plazmina na fibrin iz

ugruška s manjim ili većim stupnjem fibrinogenolize (litičko stanje). Plazminogen i

aktivatori plazminogena vežu se na fibrin u ugrušku. Fibrin omogućuje pretvaranje

plazminogena u plazmin koji razlaže fibrin u razgradne produkte. Uporabom terapijskih

doza aktivatora plazminogena sav se plazmatski plazminogen pretvara u plazmin, čime se

ne može postići potpuni neutralizirajući kapacitet antiplazmina pa to dovodi do djelomične

fibrinogenolize. Istovremeno, uporabljeni aktivator plazminogena pretvara plazminogen na

ugrušku u plazmin, posljedica čega je ubrzana tromboliza.

Slika 1.2. Fibrinolitički sustav

Plazminogen Plazmin

PAI

Aktivatoriplazminogena

Antiplazmini

FDPFibrin

11

PAI – inhibitor aktivatora plazminogenaFDP – razgradni produkti fibrina - inhibicija

Laboratorijsko praćenje trombolitičke terapije

Za razliku od antikoagulacijske terapije kao što je heparinska terapija, doziranje

aktivatora plazminogena je standardizirano bilo na ukupnu dozu ili prema tjelesnoj težini i

samo trajanje infuzije može varirati. Glavni razlog praćenja trombolitičke terapije

laboratorijskim analizama bio bi dokumentiranje da je dana doza postigla litičko stanje.

Jednom kad se postigne litičko stanje, nema potrebe regulirati dozu aktivatora

plazminogena jer izmjene na temelju laboratorijskih pokazatelja ne bi ni poboljšale

trombolizu ni smanjile rizik komplikacija od krvarenja.

Laboratorijski pokazatelji događaja koji nastaju nakon uvođenja aktivatora plazminogena u

cirkulaciju pokazuju i predskazuju vaskularne događaje koji su od kliničkog značenja

(Tablica 1.2.).

Tablica 1.2. Odnos između vaskularnih i hematoloških parametara trombolize i mogućih laboratorijskih pokazatelja tih događaja

Vaskularni Hematološki Laboratorijski pokazatelji

Protočnost krvne žile tromboliza Hipofibrinogenemija, povišeni D-dimeri, FDP

Krvarenje razgradnja hemostatskog čepa ili matriksa

Produljeno vrijeme krvarenja, hipofibrinogenemija

Protočnost nije postignuta ili ponovna začepljenost krvne žile

hiperkoagulabilno stanje Povišeni fibrinopeptid A, protrombinski fragment 1+2, TAT, FM, fibrinogen

Ponovno krvarenje(nova ozljeda)

hipokoagulabilno stanje Produljeno vrijeme krvarenja, litičko stanje

Laboratorijski nalazi:

Pretraga RezultatPV produljeno

APTV produljenoFibrinogen sniženTrombociti normalniPlazminoge

nsnižen

D-dimeri povišeni 12

1.3. TROMBOFILIJA

Trombofilija se definira kao sklonost arterijskoj ili venskoj trombozi i može biti

nasljedna ili stečena, a posljedica je poremećaja prirodnog antikoagulacijskog ili

fibrinolitičkog sustava. Poznati uzroci nastanka trombofilije prikazani su u Tablici 1.3.

Trombofilija je najčešće nasljedna i rezultat urođenog nedostatka jednog ili više čimbenika

sustava zgrušavanja a u više od 50% slučajeva prisutni su i sekundarni čimbenici rizika

(operacijski zahvat s duljom imobilizacijom, debljina, trudnoća, uporaba oralnih

kontraceptiva, zloćudne bolesti, antifosfolipidni sindrom itd.).

Tablica 1.3. Uzročnici trombofilije

POREMEĆAJUČESTALOST RELATIVNI

RIZIK ZA VTE

opća populacija(%)

bolesnici s VTE (%)

Nedostatak antitrombina 0,18 1,1 5,0Nedostatak proteina C 0,2 3,2 6,5Nedostatak proteina S 1,3 3,1 2,4APC rezistencija (FV Leiden)

< 15 21 6,6

FII 20210A 2,3 6,2 2,8Hiperhomocisteinemija 5 10 2,5povišena aktivnost FVIII 11 25 4,8lupus antikoagulant i/ili antifosfolipidna protutijela 5 – 15

* VTE – venska tromboembolija

Ispitivanje na trombofiliju treba provesti u bolesnika koji imaju sljedeće karakteristike:

pozitivna obiteljska anamneza,

tromboza prije 45. godine života,

ponavljajuće tromboze,

tromboza u trudnoći i spontani pobačaj,

atipične venske tromboze,

boluju od autoimunih bolesti.

Pri postavljanju dijagnoze tromboze, uz ultrazvučnu dijagnostiku, osnovna

laboratorijska pretraga je određivanje koncentracije D-dimera – razgradnih produkata

fibrina koji imaju 100%-tnu negativnu prediktivnu vrijednost (negativan rezultat isključuje

postojanje tromboze).

Utvrđivanje uzroka trombofilije izvodi se na uzorcima krvi najmanje 3 mjeseca nakon

trombotičkog događaja. Ispitivanje se ne smije izvoditi:

- tijekom trombotičkog događaja,

- za vrijeme trajanja oralne antikoagulacijske terapije jer su snižene koncentracije

proteina C i proteina S,

- tijekom heparinske terapije koja snižava aktivnost antitrombina,

- tijekom i 3 mjeseca nakon trudnoće,

- tijekom uzimanja preparata estrogena,

- u bolestima jetre, upalnim stanjima i diseminiranoj intravaskularnoj koagulaciji.

1.4. PRAĆENJE ORALNE ANTIKOAGULACIJSKE TERAPIJE

Protrombinsko vrijeme je najčešće rabljena pretraga za praćenje promjena u

funkcionalnoj razini o vitaminu K ovisnih faktora zgrušavanja II, VII i X uzrokovanih

djelovanjem oralnih antikoagulanata koji se rabe u terapiji i sprječavanju nastanka venske

tromboze. Rezultati analize se izražavaju kao međunarodni normalizirani omjer (INR).

Preporučene terapijske širine u praćenju oralne antikoagulacijske terapije prikazane su u

Tablici 1.4.

Tablica 1.4. Preporučene vrijednosti protrombinskog vremena izraženog u INR-u u praćenju oralne antikoagulacijske terapije.

BOLEST / TERAPIJA PREPORUČENI INR

(raspon)profilaksa duboke venske tromboze 2.0-3.0terapija duboke venske tromboze iplućne embolije 2.0-3.0učestale duboke venske tromboze, plućna embolija, arterijske tromboze, sprečavanje sistemske embolije, fibrilacija atrija, akutni infarkt miokarda, umjetni srčani zalisci životinjskog podrijetla

2.0-3.0

umjetni srčani zalisci od sintetskog materijala, sprečavanje ponovnik infarkta miokarda, antifosfolipidni sindrom

2.5-3.5

Uz praćenje oralne antikoagulacijske terapije poremećaj sinteze protrombinskog

kompleksa nalazi se kod:

manjka vitamina K,

bolesti jetre.

Laboratorijski nalazi:

Pretraga RezultatPV produljeno

APTV produljenoFibrinogen normalanTrombociti normalni

F II, VII, IX, X sniženiProtein C snižen

PRAĆENJE ANTIKOAGULACIJSKE I FIBRINOLITIČKE TERAPIJE

Biserka Kos

Hemostazom nazivamo uravnotežen skup raznih reakcija u kojem sudjeluju krvne žile i trombociti te veliki broj čimbenika zgrušavanja i njihovih inhibitora, sa svrhom održavanja krvi u tekućem stanju te zaustavljanju krvarenja nakon eventualne ozljede.Poznata su dva puta zgrušavanja:

a) vanjski, koji započinje aktiviranjem čimbenika VII (F VII);b) unutarnji, koji započinje interakcijom čimbenika XII (F XII), prekalikreina te kinina

velike molekularne mase.Oba puta se sastaju kod aktiviranog čimbenika X (F Xa), a završavaju pretvaranjem fibrinogena u fibrin djelovanjem trombina.Bolest današnjice su česte tromboze, tj. stvaranje ugruška unutar krvnih žila, a one su posljedica raznih uzroka: oštećenje stijenke krvnih žila, kemijske promjene u krvi, usporena cirkulacija krvi kao posljedice tumora, urođeni nedostaci AT III i mnogi drugi.U liječenju i prevenciji intravaskularnih tromboza rabe se antikoagulacijski lijekovi. U tu skupinu spadaju:

1. Heparin2. Oralni antikoagulacijski lijekovi3. Fibrinolitici4. Inhibitori funkcije trombocita

U akutnoj fazi liječenje se provodi heparinom, a zatim se nastavlja oralnim antikoagulantima koji se koriste dulje vrijeme, dok kod jako rizičnih bolesnika i doživotno kao prevencija venskih tromboza. To su uglavnom pripravci dikumarola i indandiona. Oralni antikoagulanti djeluju na vanjski put koagulacije krvi. Za sintezu čimbenika protrombinskog kompleksa (II, VII i X) u hepatocitima potreban je vitamin K. Oralni antikoagulanti djeluju kompetitivno s vitaminom K, blokirajući karboksilaciju glutaminske kiseline. Čimbenici zgrušavanja bez karboksilne skupine nemaju mogućnost vezivanja kalcijevih iona, što znači da su funkcionalno neaktivni. Čimbenik V je neovisan o vitaminu K, ali o njemu su još ovisni čimbenik IX te prirodni inhibitori protein C i protein S.

Vitamin K k a r b o k s i l a z a Vitamin K - epoksid

Prekursori biološki neaktivnih Biološki aktivni čimbenicičimbenici zgrušavanja (II, VII, IX i X) zgrušavanja (II, VII, IX i te proteina C i proteina S X) te protein C i proteinS

COOH HOOC COOH

CH2 CH

CH2 CH2

NH - CH - CH - O NH - CH - CH - O

glutaminska kiselina -karboksi-glutaminska kiselina

Oralni antikoagulanti brzo snizuju razinu biološki aktivnih čimbenika zgrušavanja, tj. već za nekoliko dana. Najprije pada razina čimbenika VII čiji je poluživot pet sati, dok je poluživot F II, F IX i F X 24 do 48 sati. Zbog pada aktivnosti F IX, u kontroli učinkovitosti liječenja nije dovoljno koristiti samo određivanje protrombinskog vremena, već je potrebno kontrolirati i APTT (aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme). Oralni antikoagulanti daju se u početku liječenja u većim dozama, a učinak se postiže već nakon 24 do 48 sati. Nakon drugog dana nastavlja se održavanje s manjim dozama, a željeni hipokoagulacijski učinak postiže se nakon 3 do 5 dana. Veza između doze antikoagulanta i produljenja protrombinskog vremena vrlo su kompleksne i nepredvidive. Potrebno je voditi računa o ostalim lijekovima koje koristi bolesnik pošto neki potenciraju, a neki usporavaju antikoagulacijski učinak.

Lijekovi koji potenciraju djelovanje: Lijekovi koji usporavaju djelovanje:penicilin fenobarbitonsulfonamidi amitalsalicilati enitoinkinini antacidianestetici cimetidincimetidin vitamin Ktetraciklini transfuzija krvicefalosporini infuzija plazmealkohol

Laboratorijska kontrola se treba provoditi redovito i često. Protrombinsko vrijeme izvodi se s reagensom Ca-tromboplastinom koji aktivira vanjski put koagulacije. Brzina nastanka fibrina mjeri se u sekundama. Protrombinsko vrijeme izražava se u %, omjer bolesnika i normale (Ratio) ili kao vrijednost INR (International Normalized Ratio)

INR =

Vrijednost ISI odražava osjetljivost pojedinih tromboplastina koji je ispitan na velikom broju bolesnika pod oralnom antikoagulacijskom terapijom. Vrijednosti INR su usporedive bez obzira na upotrabu Ca-tromboplastina.

PV bol (s) ISI

PV nor (s)

Protrombinsko vrijeme izvodi se na koagulometrima raznim metodama, od kojih je danas u sve većoj uporabi određivanje preko kromogenih supstrata. Postoje i mali aparati koji koriste punu (kapilarnu) krv i pogodni su za kućnu uporabu. Terapijske doze INR određuje kliničar, a mogu se kretati od 1,5 do 2,5 kod dugotrajne profilakse, zatim od 3,0 do 4,5 kod dubokih venskih tromboza i plućne embolije.

Preporučene vrijednosti antikoagulacijske terapije izražene preko INR-a

BOLEST / LIJEČENJE PREPORUČENI INR

Profilaksa duboke venske tromboze 2,0 - 3,0

Liječenje duboke venske tromboze i plućne embolije 2,0 - 3,0

Učestale duboke venske tromboze, plućna embolija, arterijske tromboze, umjetni srčani zalisci životinjskog podrijetla

2,0 - 3,0

Umjetni srčani zalisci od sintetskog materijala 2,5 - 3,5

Nuspojave su rijetke, ali može doći do krvarenja po koži, sluznicama, zatim do pojave osipa, mučnine s povraćanjem i dijareje.Ako je vrijednost protrombinskog vremena jako produljena i dođe do krvarenja potrebno je bolesniku dati vitamin K (parenteralno ili intravenozno). Kod jačih krvarenja daje se svježe smrznuta plazma. Vrijednosti APTT koji prati unutarnji put koagulacije krvi (znači da obuhvaća vrijednost F IX koji je također o vitaminu K ovisan čimbenik) trebala bi se kretati u omjeru koji je do dva put viši od gornje referentne vrijednosti. Referentne vrijednosti su najčešće 30 do 40 sekundi.

Pri primjeni oralne antikoagulacijske terapije treba voditi računa i o razini proteina C u plazmi koji je prirodni inhibitor, ovisan o vitaminu K i s kratkim poluživotom pa se stoga njegova koncentracija vrlo brzo može spustiti od 50% na manje od 5%. S obzirom da protein C (uz protein S kao ko-čimbenik koji je ovisan o vitaminu K) inhibira čimbenike Va i VIIIa, njegov nagli pad može dovesti do učinka koji je suprotan očekivanom uspjehu liječenja oralnim antikoagulantima.

Heparin je heterogena mješavina sulfatnih estera mukopolisaharida molekularne mase 4 000 do 40 000, a dobiva se iz pluća i crijeva goveda i ovaca. Antikoagulacijski djeluje samo parenteralnim putom. Inaktivira ga trombocitni čimbenik 4 (TF4) kojeg luče aktivirani trombociti te enzim heparinaza koji se sintetizira u jetri, a odstranjuju ga stanice retikuloendotelnog sustava (RES-a). Zbog toga je djelovanje heparina izraženije kod trombocitopeničnih osoba. Za svoje djelovanje heparin treba prirodni inhibitor antitrombin III (AT III). Heparin se veže na aminokiselinu lizin u AT III te tako mijenja njegovu strukturu. On višestruko ubrzava reakciju AT III i aktivnih čimbenika zgrušavanja (F XIIa, F XIa, F Xa, F IIa) te plazmina. Nakon kovalentnog vezivanja AT III i serinskih proteaza heparin se lako otpušta iz kompleksa te se ista molekula može vezati za drugu molekulu AT III. Samo djelovanje na reakciju AT III i serinskih proteaza ovisi i o molekularnoj težini heparina.Niskomolekularni heparin jače ubrzava reakciju AT III i F Xa, dok oni s višom molekularnom masom jače djeluju antitrombinski (IIa). Pri dugotrajnoj heparinskoj terapiji koncentracija AT III u plazmi može biti snižena. Sve češće se danas u profilaksi tromboembolijskih oboljenja koristi niskomolekularni heparin. Dobiva se iz standardnog heparina enzimskom ili kemijskom hidrolizom. Kod većine kirurških zahvata daje se 2 do 4 sata predoperativno. Jednokratne doze provode se još 7 do 10 dana iza operacije. Dnevne doze moraju biti prilagođene tjelesnoj težini bolesnika. Daje se subkutano. Zbog toga što je njegovo djelovanje usmjereno uglavnom na F Xa, kontrola se provodi određivanjem

koncentracije F Xa te kontrole broja trombocita zbog moguće trombocitopenije inducirane heparinom.Standardni heparin se koristi u malim, srednjim ili velikim dozama, ovisno o stanju bolesnika i željenom učinku.Male doze (5 000 i.j.) koriste se u prevenciji tromboembolijske bolesti kod kirurških bolesnika s visokim rizikom komplikacija (visoka dob, pretilost, pušenje, dijabetes, dugotrajno ležanje, maligni tumori). Srednje doze (20 000 do 60 000 i.j.) koriste se u kontinuiranoj infuziji kroz 24 sata ili intravenski svakih 6 sati u liječenju:

tromboze površinskih i dubokih vena, tromboflebitisa i plućne embolije, pri dijalizi i ekstrakorpuskularnoj cirkulaciji pri operacijama na srcu.

Visoke doze (60 000 do 120 000 i.j.) u kontinuiranoj infuziji koriste se kod masivne plućne embolije.

Kontrola heparinske terapijeProvodi se dnevnim mjerenjem APTT-a te mjerenjem koncentracije heparina preko kromogenih supstrata.APTT treba biti 1,5 do 2 put veći od normalnog.Komplikacije su rijetke, a kreću se od krvarenja osipa, povišene temperature pa sve do osteoporoze kod dugotrajne terapije.Kod manjih komplikacija prekida se davanje ili se smanjuje doza, dok se kod većih komplikacija daje protamin-sulfat kao antidot heparina.

Fibrinolitici se koriste kao temeljna terapija u liječenju dubokih venskih tromboza i plućne embolije. Veoma je važno takvu terapiju provesti na vrijeme. Najčešće se koriste:

1. Streptokinaza (SK),2. Urokinaza (UK),3. Tkivni aktivator plazminogena (t-PA).

Zajedničko im je da pretvaraju plazminogen vezan na fibrinske niti tromba u plazmin koji tada otapa fibrin, pri čemu nastaju razgradni produkti fibrina (FDP) koje odstranjuju stanice bubrega i stanice retikuloendotelnog sustava (RES-a). Cilj uporabe fibrinolitika je što prije opstruiranu krvnu žilu učiniti ponovno prohodnom.S obzirom da fibrinolitici ne mogu razlikovati ugrušak nastao na oštećenoj krvnoj žili od ugruška koji vrši opstrukciju koronarne arterije, oni mogu dovesti do poremećaja hemostaze i krvarenja. Aktivatori plazminogena ne djeluju samo na plazminogen u trombu, već i na cirkulirajući plazminogen. Osim fibrinogena, stvoreni plazmin razgrađuje i F V i F VIII. Nadalje, fibrinolitici inhibiraju adheziju i agregaciju trombocita.Primjenjuje se intravenski ili intraarterijski. Vrijeme poluživota kreće se od 5 minuta za t-PA do 20 do 30 minuta kod streptokinaze.U laboratorijskoj kontroli od testova se rabe:

vrijeme krvarenja zbog oštećenja trombocita trombinsko vrijeme protrombinsko vrijeme aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTT)

Fibrinogen je snižen,fibrinoliza skraćena,trombinsko vrijeme produženo,FDP-povišeni.

Iako mnogi lijekovi djeluju kao inhibitori funkcije trombocita, samo neki se koriste u prevenciji i liječenju arterijskih i venskih tromboza. Oni najčešće djeluju na adheziju, agregaciju i produljenje života trombocita. Najčešće je u uporabi acetil-salicilna kiselina (Aspirin, Acisal) čije djelovanje na trombocite traje 7 do 10 dana.

Djelovanjem acetil-salicilne kiseline smanjuje se agregacija trombocita s ADP-om i kolagenom. Ne djeluje na adheziju (Tr) niti normalizira skraćeni poluživot (T1/2) trombocita.Pod djelovanjem acetil-salicilne kiseline u trombocitima je blokirano stvaranje tromboksana A2 (trajno), a u endotelnim stanicama stvaranje prostaciklina obnavlja se nakon 24 do 48 sati.

Shema prikazuje djelovanje acetil-salicilne kiseline te Sulfinpyrazona i Dipyrazolona.

AspirinSufinpyrazonDipyrazon

Ciklooksigenaza Fosfolipidi (Trombociti + membrana + Arahidonska kiselina

TxA - vazokonstriktori i Vazodilatatori agreg. tvar antiagreg. tvar

Uzimanje aspirina, persantina (dipridamol) ili kojeg drugog sredstva mora biti pod laboratorijskom kontrolom kako bi se mjerila adhezija i agregacija trombocita. Kod većine bolesnika produljeno je vrijeme krvarenja. Kao komplikacije mogu nastati krvarenja po koži, u gastrointestinalnom sustavu i poslijeoperativna krvarenja. Kod incidentnih stanja treba prekinuti uzimanje aspirina, a kod jačih krvarenja potrebna je i eventualna supstitucija.

VAŽNOST ISI I PROVJERA VRIJEDNOSTI U VLASTITOM LABORATORIJURenata Zadro

U praćenju oralne antikoagulacijske terapije (OAT) važna laboratorijska analiza je protrombinsko vrijeme (PV) ili modifikacije te pretrage. Protrombinsko vrijeme je vrijeme zgrušavanja plazme ili pune krvi (u sekundama) u prisutnosti pripravka tromboplastina i određene količine kalcijevih iona.Tromboplastin je reagens koji sadrži tkivni faktor i fosfolipide. Većina komercijalnih tromboplastina su ekstrakti tkiva sisavaca (zečjeg mozga, ljudske placente i pluća) te produkti dobiveni rekombinantnom tehnologijom. Pripravak tromboplastina koji sadrži

Prostaciklin(PGI 2)

Prostaglandini(Tromboksan A2u trombocitu)

Endoperoksid(trombociti)

Endoperoksid(membrana)

tkivni ekstrakt sa ili bez kalcijevih iona naziva se “jednostavan”. Ako sadrži goveđi FV i fibrinogen, naziva se “složeni”. Tkivni faktor ljudskog rekombinantnog tromboplastina proizvodi se u bakteriji Escherichia coli rekombinantnom DNA tehnologijom, a zatim se dodaju fosfolipidi in vitro.Da bi se rezultati analize protrombinskog vremena mogli tumačiti, potrebno je tromboplastine pravilno baždariti. To omogućuje usporedbu rezultata PV s različitim reagensima i različitim proizvodnim pripravcima istog reagensa. Način baždarenja tromboplastina objavljen je i opisan u 33. izvješću Stručnog odbora za standardizaciju Svjetske zdravstvene organizacije (1). Time je definiran i jedan od parametara za baždarenje nazvan internacionalni indeks osjetljivosti (International Sensitivity Index - ISI) koji određuje osjetljivost reagensa prema određenom Internacionalnom referentnom pripravku. S pomoću ISI-ja rezultat analize protrombinskog vremena može se izraziti kao internacionalni normalizirani omjer (International Normalized Ratio - INR):

INR = (PV/MNPT)ISI

MNPT (Mean Normal Prothrombin Time) je geometrijska sredina protrombinskih vremena najmanje 20 uzoraka plazme zdravih odraslih ispitanika oba spola. Preporuka je da svaki laboratorij odredi MNPT na sustavu kojeg rabi (tromboplastin/koagulometar).ISI je mjera za osjetljivost tromboplastina na poremećaj kojeg izazivaju oralni antikoagulanti. Vrijednost ISI-ja ovisna je o određenom tromboplastinu, različita je kod različitih pripravaka istog tromboplastina i ovisna je o sustavu (instrumentu) na kojem se izvodi analiza protrombinskog vremena. Zbog toga proizvođači prilažu vrijednost ISI-ja za određenu kombinaciju tromboplastin/koagulometar. No i taj način ima ograničenja jer su pokazane razlike s istim reagensom i instrumentom u različitim centrima. Baždarenje tromboplastina izvodi se prema internacionalnom referentnom pripravku sličnog sastava i izvora. Tri su internacionalna referentna pripravka dostupna iz Internacionalnog laboratorija za biološke standarde Svjetske zdravstvene organizacije: OBT/79 (goveđi), RBT/90 (zečji), rTF/95 (rekombinantni) koja su uspoređena s prvim Internacionalnim referentnim pripravkom tromboplastina, 67/40 (ljudski). Sustav ISI/INR bi morao osigurati da je izračunata vrijednost ISI-ja reagensa neovisna o podrijetlu internacionalnog referentnog pripravka jer su svi oni baždareni prema prvom Internacionalnom referentnom pripravku 67/40. To se pokazalo netočnim u nekoliko studija gdje su dobivene razlike u vrijednostima INR-a, najviše zbog postupka baždarenja. Dogovoren je zbog toga novi postupak u kojem se bilo koji internacionalni referentni pripravak tromboplastina baždari prema svim dostupnim internacionalnim referentnim pripravcima kako bi se osigurala dosljednost rezultata zbog različitih načina baždarenja. Preporučeno je također da se za baždarenje sekundarnih standarda (radnih standarda) rabi internacionalni referentni pripravak istog podrijetla, npr. tromboplastin ljudskog podrijetla baždari se prema ljudskom rekombinantnom pripravku rTF/95.Zbog složenosti postupka baždarenja protrombinskog vremena i razlika u rezultatima između laboratorija, koje su dokazane multicentričnim studijama (Kv za ISI od 1.7% do 8.1%), Svjetska zdravstvena organizacija (2) dala je smjernice kojima su obuhvaćeni svi dosad navedeni problemi i podrobno opisane metode u uporabi. U postupku baždarenja grafički se na logaritamskom papiru prikaže ovisnost PV ispitivanog tromboplastina i Internacionalnog referentnog pripravka uporabom 20 uzoraka plazme zdravih ispitanika i 60 uzoraka plazme bolesnika na stabilnoj OAT (Slika 1). PV se određuje ručno. Nagib pravca (b) koji se izračuna ortogonalnom regresijom pomnoži se ISI-jem Internacionalnog referentnog pripravka (ISIIRP) kako bi se dobila vrijednost za ISI ispitivanog tromboplastina (ISI).

ISI = ISIIRP x b

Slika 1. Baždarenje tromboplastina

Baždarenje sustava tromboplastin/koagulometarRazlikujemo četiri vrste baždarenja:1. baždarenje internacionalnih referentnih pripravaka

2. baždarenje sekundarnih standarda (npr. nacionalnih referentnih pripravaka i radnih standarda proizvođača tromboplastina)

3. baždarenje komercijalnih pripravaka prema odgovarajućem radnom standardu

4. baždarenje sustava unutar laboratorija

Baždarenja pod 1. i 2. izvode se s velikim brojem svježih plazmi ili pune krvi. Za baždarenje pod 3. moguće je rabiti smrznutu smjesu plazmi ili plazme kojima nedostaju faktori zgrušavanja ovisni o vitaminu K. Baždarenje pod 4. uključuje uporabu liofiliziranih plazmi s točno naznačenim vrijednostima INR-a i protrombinskog vremena u postotcima i preporučeno je kako bi se umanjile razlike u INR-u između laboratorija. Može se izvesti uporabom određenog broja plazmi s točno naznačenom vrijednošću INR-a za dobivanje lokalnog ISI-ja (Slika 2) ili konstrukcijom standardne krivulje iz koje se očitavaju vrijednosti INR-a (Slika 3).

x(s)

Slika 2. Grafičko izračunavanje ISI-ja za sustav tromboplastin/koagulometar

Karakteristike plazmi za baždarenje:- pogodnije su plazme dobivene od bolesnika na OAT nego umjetno priređene zbog

utjecaja proteina induciranih nedostatkom vitamina K (PIVKA) na tromboplastin

- rabe se svježe, smrznute ili liofilizirane plazme

- razlike u koncentraciji citrata u plazmi mogu prouzročiti značajnu nepreciznost prilikom određivanja ISI-ja i INR-a. Preporučena koncentracija natrijevog citrata je 105-109 mM

Slika 3. Uspostava standardne krivulje za izravno očitavanje INR-a

Koji način baždarenja upotrijebiti? Plazme koje imaju naznačenu vrijednost INR-a mogu se upotrijebiti za određivanje lokalnog ISI-ja ortogonalnom regresijom. Ili se može prirediti baždarna krivulja iz koje se izravno može očitati vrijednost INR-a ispitivane plazme.

sek

baždarni pravac

standardni pravac

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA TROMBOFILIJA

Désirée Coen Herak

Trombofilija se može definirati kao povećana sklonost trombozi zbog urođenih ili stečenih poremećaja prirodnog antikoagulacijskog ili fibrinolitičkog sustava (Slika 1.).

Slika 1. Mogući uzroci trombofilije

U pravilu trombofilija nastaje zbog hiperaktivnosti sustava zgrušavanja uslijed hipoaktivnosti antikoagulacijskih mehanizama ili smanjenog fibrinolitičkog potencijala. Trombozu karakterizira pojačano intravaskularno stvaranje ugrušaka u arterijama, venama, kapilarama ili u šupljinama srca. Trombofilija je najčešće nasljedna i povezana je s urođenim nedostatkom jednog ili više čimbenika. U bolesnika s nasljednom trombofilijom postoji predispozicija za opetovane tromboze u ranoj životnoj dobi. Kod većine bolesnika tromboza se pojavljuje sporadično i izmjenuje se često s dugim asimptomatskim periodima. Samo kod nekih bolesnika dolazi do učestalih trombotičkih incidencija u slučaju da nisu pod nikakvom terapijom.Više od polovice trombotičkih epizoda događa se u kombinaciji sa sekundarnim čimbenicima rizika.

Sekundarni čimbenici povišenog rizika od intravaskularne tromboze i plućne embolije su:trauma, nedavni kirurški zahvat s produljenom imobilizacijom, pretilost sa sklonošću venskoj stazi, uporaba oralnih kontraceptiva, trudnoća, postpartalni period, maligne bolesti (solidni tumori), talasemija, sistemski lupus eritematodes i antifosfolipidni sindrom.

Pojam nasljedne trombofilije označava genski određenu sklonost za nastajanje venske tromboembolijske bolesti. Genski čimbenici rizika imaju važnu ulogu u patogenezi venske tromboze. Možemo ih podijeliti na učestale ili dobro ustanovljene i rijetke ili nedovoljno ustanovljene (Tablica 1.).

Prokoagulacijski čimbenici

Fibrinolitički sustav

Inhibitori

Inhibitori

Fibrinogen

Fibrin

D-dimeri

Tablica 1. Uzroci nasljedne trombofilije

Učestali ili dobro ustanovljeni: nedostatak antitrombina nedostatak proteina C nedostatak proteina S APC rezistencija (FV Leiden) FII20210A hiperhomocisteinemija

Rijetki ili nedovoljno ustanovljeni: disfibrinogenemija hipo-displazminogenemija nedostatak ko-čimbenika II heparina nedostatak ili vrijednosti glikoproteina s visokim sadržajem histidina vrijednosti inhibitora aktivatora plazminogena abnormalni trombomodulin nedostatak FXII

Utvrđeno je da poremećaj na molekularnoj razini može dovesti do : nedostatka jednog ili više inhibitora zgrušavanja: antitrombina, proteina C, proteina S rezistencije na aktivirani protein C (APC rezistencija)

Klinički se ovi poremećaji najčešće očituju kao duboke venske tromboze donjih ekstremiteta s ili bez plućne embolije u više od 90 % trombotičkih epizoda, dok se u manje od 5 % javljaju kao tromboze mezenterijskih ili moždanih vena. Nije dokazano da u heterozigota za ove poremećaje postoji povećan rizik od nastajanja arterijskih tromboza.

Tablica 2. Učestalost (%) nasljednog trombofilijskog sindroma u općoj populaciji i u bolesnika s utvrđenom venskom trombozom

SindromOpćapopulacija

Bolesnici s utvrđenomvenskom trombozom

Broj različitih mutacija

nedostatak AT 0.020.17 0.54.9 79

nedostatak proteina C 0.140.50 1.48.6 160

nedostatak proteina S 1.47.5 13

APC rezistencija

FII20210A

515

2-4

1064

6-18

1

1

Još jedan korak naprijed učinjen je nedavnim otkrićem prema kojem je i hiperhomocisteinemija jedan od mogućih uzroka nasljedne trombofilije. Blaga i umjerena hiperhomocisteinemija je jedini nasljedni poremećaj koji može podjednako uzrokovati juvenilnu arterijsku i vensku okluzivnu bolest. Učestalost u bolesnika s utvrđenom venskom trombozom se kreće od 10-19%.

NEDOSTATAK ANTITROMBINA

Antitrombin (AT) je protein plazme s višestrukim inhibicijskim djelovanjem unutar sustava zgrušavanja. Inhibicijsko djelovanje antitrombina se odnosi prvenstveno na inaktiviranje trombina i FXa te aktiviranih čimbenika zgrušavanja XIIa, XIa, IXa i VIIa, kao i kalikreina, tripsina i plazmina. Antitrombin predstavlja ujedno i najvažniji fiziološki regulator stvaranja fibrina.Nedostatak antitrombina je bio prvi opisani nasljedni poremećaj povezan sa sklonošću nastajanja tromboze. Nasljeđuje se autosomno dominantno. Većina bolesnika su heterozigoti s vrijednostima 4070% od normalne vrijednosti. Na osnovu rezultata određivanja antigenske i funkcijske aktivnosti razlikujemo dva fenotipa:

TIP I snižena funkcijska aktivnost i koncentracija antigenaTIP II snižena funkcijska aktivnost uz normalnu koncentraciju antigena

Učestalost nastajanja tromboze je podjednaka i kod muškaraca i kod žena i najčešće se očituje kao duboka venska tromboza donjih ekstremiteta ili plućna embolija, dok su začepljenja arterija rijetka.

NEDOSTATAK PROTEINA C

Protein C (PC) je glikoprotein ovisan o vitaminu K koji se sintetizira u jetri kao inaktivni zimogen. Fiziološki aktivator proteina C je trombin koji se veže na trombomodulin koji se nalazi na površini endotelnih stanica, pri čemu nastaje kompleks trombin/trombomodulin. Aktivirani protein C (APC) izražava antikoagulacijski i profibrinolitički učinak inaktiviranjem aktiviranih čimbenika V(FVa) i VIII(FVIIIa) te neutraliziranjem inhibitora aktivatora plazminogena -1 (PAI-1).Nasljedni nedostatak proteina C se nasljeđuje autosomno dominantno. U heterozigota se vrijednosti kreću od 3060%, a u homozigota 25% i rijetko 10%. Fenotipski kao i kod nedostatka antitrombina možemo razlikovati dva tipa:

TIP I snižena funkcijska aktivnost i koncentracija antigenaTIP II snižena funkcijska aktivnost uz normalnu koncentraciju antigena

Neonatalna purpura fulminans je najteži klinički oblik koji nastaje zbog nedostatka proteina C nakon rođenja i najčešće ima fatalni ishod.

NEDOSTATAK PROTEINA S

Protein S (PS) je glavni ko-čimbenik aktiviranog proteina C i također je ovisan o vitaminu K. Sintetizira se u jetri, u stanicama endotela, megakariocitima i Leydenovim stanicama u testisima. Protein S pojačava afinitet aktiviranog proteina C za negativno nabijene fosfolipide, stvarajući kompleks APC-PS koji se nalazi vezan na membrani, što olakšava inaktiviranje FVa. U plazmi se protein S nalazi u dva oblika: slobodni (40%) i vezan (60%) na C4b-vezni protein (C4b-BP). Samo slobodni oblik ima antikoagulacijsko djelovanje.Vrijednosti proteina S su više kod muškaraca nego kod žena. Nedostatak proteina S je uglavnom povezan s venskom trombozom, ali se može povezati i s arterijskom trombozom.

Fenotipski razlikujemo tri tipa:

TIP I snižena funkcijska aktivnost i koncentracija ukupnog i slobodnog antigenaTIP II snižena funkcijska aktivnost uz normalnu koncentraciju ukupnog i

slobodnog antigenaTIP III snižena funkcijska aktivnost i koncentracija slobodnog antigena uz normalnu koncentraciju ukupnog antigena

Precizna dijagnostika proteina S se zasniva na kombinaciji testova kojima se mjeri ukupna koncentracija PS Ag, koncentracija slobodnog Ag i aktivnost slobodnog PS. Sliku upotpunjuje saznanje o koncentraciji C4b-BP.

REZISTENCIJA NA AKTIVIRANI PROTEIN C (APC REZISTENCIJA)

U najvećem broju slučajeva APC rezistencija nastaje kao posljedica točkaste mutacije gena za čimbenik zgrušavanja V (FV Leiden). Ova mutacija uzrokuje hiperkoagulabilno stanje zbog usporenog inaktiviranja FVa pomoću aktiviranog proteina C te predstavlja najčešći uzrok nasljedne trombofilije.Sinteza defektne molekule FV (FV Leiden) nastaje zbog točkaste mutacije u egzonu 10. Zamjena baza GA na položaju 1691 uzrokuje zamjenu arginina na položaju 506 glutaminom.Ova mutacija je pronađena u 80-100% APC rezistentnih ispitanika.

HIPERHOMOCISTEINEMIJA

Nasljedna hiperhomocisteinemija nastaje kao posljedica poremećaja gena koji kodiraju dva enzima, cistationin--sintazu i metilentetrahidrofolat reduktazu, koji su uključeni u metabolizam homocisteina. Točan mehanizam doprinosa hiperhomocisteinemije aterogenezi i trombogenezi nije u potpunosti razjašnjen, ali se na temelju dosadašnjih istraživanja in vitro smatra da potiče oksidaciju LDL-a i povećava ugradnju Lp(a) u fibrin. Toksično djelovanje homocisteina na endotelne stanice može pojačati adheziju trombocita, potiče tkivni čimbenik i aktiviranje FV inhibicijom antikoagulacijskog učinka proteina C.

Postoji određen broj drugih genskih poremećaja ili izoliranih nedostataka koji doprinose riziku od nastajanja tromboza.

Nasljedna disfibrinogenemijaNasljednu disfibrinogenemiju karakterizira prisutnost disfunkcionalnog fibrinogena koji nastaje zbog zamjene jedne ili više aminokiselina u polipeptidnim lancima fibrinogena. Klinički se može očitovati kao umjereno krvarenje i venska ili arterijska tromboza. Učestalost ovog poremećaja je 0,8-1,0% u bolesnika s utvrđenom trombozom.

Nasljedna hipo-displazminogenemija Hipoplazminogenemija i displazminogenemija nisu uobičajeni rizični čimbenici za nastajanje tromboze. Hipoplazminogenemija nastaje zbog smanjene sinteze ili izlučivanja normalne molekule plazminogena dok displazminogenemija, koja je najčešća u japanskoj populaciji, nastaje zbog sinteze kvalitativno promijenjenog plazminogena.

Nedostatak ko-čimbenika II heparina

Ko-čimbenik II heparina (HCII) je inhibitor trombina čiju aktivnost stimuliraju različiti glikozaminoglikani, posebice dermatan sulfat i heparin. Nedostatak ko-čimbenika II heparina nije uobičajeni uzrok trombozi.

Snižene i povišene vrijednosti glikoproteina s visokim sadržajem histidinaSnižene i povišene vrijednosti glikoproteina s visokim sadržajem histidina (HRG) u plazmi zbog nasljednog poremećaja su također povezane s trombofilijom. HRG se natječe s AT i HCII za heparin. Smatra se da stvara kompleks s plazminogenom i na taj način interferira s vezanjem plazminogena na fibrin.

Abnormalni trombomodulinTrombomodulin (TM) je transmembranski protein koji se sintetizira u endotelnim stanicama i predstavlja receptor za trombin te ima ulogu ko-čimbenika trombina u aktiviranju proteina C. Smatra se da je nedostatak ili abnormalni trombomodulin također povezan s trombofilijom, iako još nema dovoljno podataka.

Nedostatak FXIIU posljednje vrijeme se dosta govori o mogućoj povezanosti djelomičnog nedostatka FXII s trombofilijom. Nedostatak FXII se nasljeđuje autosomno recesivno i smatra se da uvjetuje nastajanje tromboze, posebice u bolesnika sa smanjenom fibrinolitičkom aktivnošću.

Opisani su i drugi rijetki nasljedni poremećaji povezani s nastajanjem venske tromboze. U njih spadaju: povišene vrijednosti inhibitora aktivatora plazminogena (PAI), povišene vrijednosti FVIII, nedostatak FVII, FXI te prekalikreina i visokomolekularnog kininogena.

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

Cilj laboratorijske dijagnostike je ustanoviti uzroke poremećaja u bolesnika s utvrđenom trombozom, kao i u asimptomatskim bolesnicima.Do danas na tržištu ne postoji niti jedan globalni test za probiranje trombofiličnih bolesnika, tako da je potrebno načiniti nekoliko testova koji nisu ni jednostavni ni jeftini i moraju se izvesti u samo odabranim ispitanicima.

Prvenstveno je potrebno isključiti stečene uzroke tromboze kao što su maligne bolesti, mijeloproliferativne bolesti, sistemski lupus eritematodes i antifosfolipidni sindrom. U tu svrhu laboratorijska dijagnostika obično započinje ispitivanje plazme ispitanika na prisutnost lupus antikoagulanta.

Laboratorijska dijagnostika trombofilija potrebna je u bolesnika: s venskom trombozom prije 40-45 godina života s atipičnim okluzijama arterija, osobito prije 40-45 godine života žena s opetovanim spontanim pobačajima s atipičnim venskim trombozama s autoimunim bolestima

Laboratorijski testovi koji se koriste za potvrđivanje dijagnoze nasljednih trombofilija moraju biti specifični. Obično se ispitivanje provodi u dvije faze (Tablica 3.).

Tablica 3. Laboratorijska dijagnostika nasljednih trombofilija

Prva faza Druga fazaodređivanje aktivnosti AT : PC uporabom kromogenih supstrata

imunoanaliza slobodnog i ukupnog PS

APC rezistencija (na osnovi APTV-a)analiza DNA FII20210Aodređivanje koncentracije homocisteina

imunoanaliza, križna imunoelektroforeza, te DNA analiza AT i PC

križna imunoelektroforeza te DNA analiza PS

analiza DNA / FV Leiden

U prvoj fazi se koriste testovi za isključivanje ili potvrđivanje najčešćih uzroka nasljednih trombofilija. U ovoj fazi se preporučuje uporaba funkcijskih testova zbog toga što omogućuju istodobno utvrđivanje kvantitativnih i kvalitativnih poremećaja.Dijagnoza nedostatka PC, PS i APC rezistencije je otežana u bolesnika na oralnoj antikoagulacijskoj terapiji jer rezultati interferiraju s uporabom antagonista vitamina K, pa se u slučaju potrebe ispitivanja ovih poremećaja oralni antikoagulansi moraju zamijeniti 7-10 dana niskomolekularnim heparinom. Abnormalni rezultati dobiveni nakon prve faze ispitivanja se dalje ispituju specifičnim testovima druge faze.

U slučaju da su ovi testovi normalni, a utvrđeno je postojanje osobne ili obiteljske tromboze pristupa se daljnjem ispitivanju i to prvenstveno disfibrinogenemije. Trombinsko vrijeme je jednostavan test za otkrivanje nasljedne disfibrinogenemije koju je moguće potvrditi istodobnim mjerenjem koncentracije fibrinogena koagulacijskom metodom i imunološkim testovima.

U sljedećoj fazi preporuča se određivanje: aktivnosti FXII aktivnosti plazminogena aktivnosti PAI koncentracije tPA