vjezbe biohemija

1. Proteini Praktikum iz Biohemije

1.1.5 Denaturacija proteins L ---------- --------------------------

Na tacno definiranoj trodimenzionalnoj strukturi, koju protein ima u uslovima koji vladaju unutar celije, zasniva se bioloska funkcija proteina. U uslovima koji se razlikuju od onih unutar celije moze doci do manjih ili vecih promjena strukture proteina. PenaturaciionoJiazivame-fiforoienLL, stmktujie nekog proteina.pri kojoj protein gubi.svoju bioloskuiunkciju (npr. enzimsko ili hormonsko djelovanje). Denaturirano. stanje ne podrazumjeva uvijek potpuno odvijanje polipeptidnogjanca proteina i prefazak u slucajnu konformaciju'("random coil”). U nekim uslovima, denaturirani proteini postoje u djelomicno svijenim stanjima koja jos uvijek nisu pojasnjena.

Vecina proteina denaturira na toploti, pri cemu se kidaju nekovalentne interakcije u proteinu (prvenstveno hidrogenske veze) i to na slozen nacin. Ako se temperatura povisuje polagano, konformacija proteina ostaje intaktnom sve do odredene temperature kada dolazi do naglog narusavanja nativne strukture proteina (i funkcije), sto se desava u uskom temperaturnom rasponu. To govori da je odvijanje polipeptidnog lanca proteina i njegov prelazak iz nativnog u denaturirano stanje kooperativan proces: gubitak strukture u jednom dijelu molekule proteina destabilizira druge dijelove ili narusavanje jednih nekovalentnih interakcija koje stabiliziraju nativnu konformaciju proteina pokrece narusavanje drugih. Proteini koji su stabilni na veoma visokim temperaturama, kao sto su proteini termofilnih bakterija, funkcionalni su na temperaturi vrelih izvora (~100°C). Strukture ovih proteina veoma malo se razlikuju od struktura njima homolognih proteina E.coli. Kako ove male razlike u strukturi doprinose temperaturnoj stabilnosti proteina jos nije pojasnjeno.

Proteine ne denaturira samo toplota nego i ekstremne pH vrijednosti, zatim organski rastvaraci kao alkoholi aceton, supstance kao sto su urea i gvanidin hlorid, deterdzenti. Svaki od ovih denatu- rirajucih agenasa djeluje tako da kida nekovalentne interakcije u molekuli proteina. Kovalentne veze u polipeptidnom lancu proteina pri tome se ne kidaju. Pre- ma tome, pri denaturaciji proteina narusavaju se sekundarna, tercijarna i kva- ternama struktura proteina, dok primarna struktura proteina ostaje ocuvana. Orga- nska otapala, urea i deterdzenti prvert- stveno narusavaju hidrofobne interakcije koje stabiliziraju hjdrofobnu unutrasnjost globularnih proteina; kod ekstremnih pH mijenja se rezultirajuci naboj proteina, a time i repulzije izmedu njegovih molekula, mogu se gubiti neke elektrostatske interakcije vazne za stabiliziranje nativne kon- formacije, kao i kidati neke od hidro- genskih veza.

S I.1 .14 - M e h a n iza m d e n a tu ra c ije p ro te in a s organskimo ta p a lim a . [Priprem ljeno prema Scopesu, 1994.]

pri visim j j " temperaturama

struktura labavi

unutarnje hidrofobne interakcije

u molekuli proteinamolekule organskog

otapala (M ) stupaju u interakciju sa hidrofobnim

aminokiselinama

sniije Praktikum iz Biohemije 1. Proteini

adajuinutarnjena_>nskolancaoteini

teinujano,jglog>onu.iranoIrugeacijuama,

Pri denaturaciji prostorna struktura molekule proteina prelazi iz visoko organiziranog u neorganizirano, slucajno stanje, koje se naziva “slucajno klupko” (“random coil"). Denaturacija je vrlo endergona reakcija, ali je ona iznad odredene kriticne temperature ipak egzergona. Time nalikuje na postupak taljenja, a ta analogija nije samo prividna. Kao sto se pri taljenju raspada kristalna resetka kristala, pri denaturaciji se kidaju nekovalentne veze koje stabiliziraju strukturu globularnih proteina u nativnoj konformaciji. Proteinski se lanac odmotava (denaturirani proteini daju rentgentski dijagram (3-keratina, dakle gotovo potpuno izduzenog polipeptidnog lanca), a izmedu lanaca stvaraju se sasvim slucajni sekundarni hemijski vezovi, pri cemu proteini postaju rretopivi. S druge strane, na povrsinu dolaze odredjehe grupe (na primjer SH-skupina ili tirozinski ostaci), koje su u nativnoj konformaciji bile skrivene u unutrasnjosti molekule. Proteaze lakse djeluju na denaturirane nego na nativne proteine.

Ranije se opcenito smatralo da je denaturacija proteina uvijek ireverzibilna. Anfinsen je 1961.godine uspio renaturirati enzim ribonukleazu. Enzim je dena- turiran u 8 M urei i u prisustvu merkaptoetanola kao reducensa. Pri tome enzim je izgubio svoju kataliticku sposobnost. Kada je polaganom dijalizom uz istovre- meno dovodenje kisika iz zraka (za reoksidaciju SH- skupina, pri cimu se obrazuju disulfidni vezovi) iz otopine ribonukleaza uklonjen denaturirajuci agens (urea) enzim je ponovno postao kataliticki aktivan. To znaci da se uklanjanjem uree polipeptidni lanac ribonukleze ponovno svio u nativnu konformaciju. Time se dokazalo da am inokiselinska sekvenca prote ina sadrzi sve informacije potrebne za svijanje polipeptdnog lanca proteina u nativnu konformaciju i da “pravilno svijanje”nastaje samo po sebi, na osnovu fizikalno-hemijskih sila si.1 .15 - Denaturacija proteina. [Pripremijeno

vezivanja. Eoj^cUumeHDmteinLse^Jwagu-xeveEibilno Prema Lehningeru, 1975.]

denaturirati i sa gvanidin-Jiidrohloridom-Qba dena- turirajuca agensa- siroko se koriste^u istraz+vanjima svijanja (“foldinga”) proteina.

1. Proteini Praktikum iz Biohemij

Vjezba 1.1. Reakcije talozenja proteina

Opste osobine proteina ispitujemo sa dvije grupe reakcija: reakcijama talozenja proteina i obojeni reakcijama na proteine. Reakcijama talozenja ispitujemo fizicko-hemijska svojstva proteina, obojenim njihovu hemijsku prirodu.

treverzibilne reakcije talozenja proteina

Reakcije talozenja proteina dijele se na ireverzibilne i reverzibilne. Ireverzibilne reakcije talozer prati ireverzibilna denaturacija proteina. Proteini se ireverzibilno taloze zagrijavanjem na temperatu iznad 60°C, mineralnim kiselinama, organskim kiselinama, solima teskih metala, alkaloidim Ireverzibilnim reakcijama talozenja uklanjaju se iz otopina proteini koji bi mogli smetati neki ispitivanjima. U tu svrhu najcesce se koriste trihloracetatna kiselina i uranil-acetat.

• Talozenje proteina toplotom

Na povisenim temperaturama proteini se ireverzibilno denaturiraju. Denaturacija proteina je olaksai ako se protein nalazi u izoelektricnoj tacki , koja se za vecinu proteina nalazi u slabo kiselc podrucju (pH oko 5). Protamini i histoni imaju izoelektricnu tacku u slabo alkalnoj sredini (pH ol 8.0). Koncentracija vodikovih iona vazan je faktor za ovaj nacin talozenja proteina. Sto je razli! izmedu izoelektricne tacke proteina (pi) i pH sredine veca, molekule proteina imaju veci naboj, s ih na povisenim temperaturama cini stabilnijim.

Postupak: U 4 epruvete sipaju se po 2 mL pripremljene vodene otopine bjelanceta. Prva epruve se zagrijava do kljucanja. Zapaza se zamucenje tecnosti koja postaje opalescentna. U dru< epruvetu se na otopinu bjelanceta dodaje 8 kapi rastvora acetatne kiseline i epruveta se zagrija do kljucanja. Zapaza se obrazovanje taloga. Dodatkom acetatne kiseline, sredina postaje slal kisela. Molekule proteina nalaze se u izoelektricnoj tacki, nemaju rezultirajuci naboj i izdvajaju se talog. U trecoj epruveti na rastvor bjelanceta se dodaju 2 mL otopine acetatne kiseline (veca kiselc sredine) i epruveta se zagrijava. Zapazamo da se talog proteina ne obrazuje. U kiseloj sred dolazi do povecane protonizacije molekula proteina, one se pune pozitivnim nabojem, sto poveca njihovu stabilnost. U cetvrtu epruvetu se, na otopinu bjelanceta, dodaje 10 kapi rastvora natrijui hidroksida, pa sredina postaje bazna. Zagrijavanjem ove epruvete do kljucanja ne dolazi i izdvajanja taloga. U baznoj sredini povecava se negativni naboj na molekulama proteina i ras njihova stabilnost na visim temperaturama.

Reagensi: vodena otopina bjelanceta, rastvor acetatne kiseline masene koncentracije 10g/L, rastv NaOH masene koncentracije 100 g/L, zasiceni rastvor natrijum-hlorida (NaCI).

Pribor: epruvete, pipete.

• Talozenje proteina solima teskih metala

Soli teskih metala sa proteinima daju u vodi netopive spojeve - metal-proteine. Neke od soli tesl metala, dodane u suvisku, rastvaraju talog metal-proteina, uz nastajanje u vodi topivih kompleksr spojeva.

[email protected]

Text Box

VJEŽBA BROJ 1.

Praktikum iz Biohemije 1. Proteini

Postupak: U epruvetu se sipa 5 kapi vodene otopine bjelanceta i pazljivo se dodaju 1-2 kapi otopine kupri-sulfata. Nastaje biijedoplavi talog. U drugu epruvetu se sipa isti sadrzaj, a po obrazovanju taloga, dodaju se 2-3 kapi kupri-sulfata u suvisku. Zapazamo otapanje taloga.

Reagensi: vodena otopina bjelanceta, rastvor kupri-sulfata masene koncentracije 50 g/L.


* Talozenje proteina koncentrovanim mineralnim kiselinama

Koncentrovane mineralne kiseline ireverzibilno denaturiraju proteine, uz nastajanje kompleksnih soli proteina i kiselina.

Postupak: U epruvetu se sipa 1 mL koncentrovane nitratne kiseline, na koju se pazljivo, niz zid ukosene epruvete, dodaje ista kolicina otopine bjelanceta. Zapazamo da se na dodirnom sloju obrazuje talog u vidu prstena, koji se u suvisku nitratne kiseline ne otapa.

Slicna proba moze se izvesti i sa koncentrovanom sulfatnom kiselinom po istom postupku. Za razliku od probe sa nitratnom kiselinom, nastali talog se u suvisku sulfatne kiseline rastvara.

Reagensi: Vodena otopina bjelanceta, koncentrovana nitratna kiselina.


• Talozenje proteina organskim kiselinama

Postupak: U epruvetu se sipaju 2 mL otopine bjelanceta i doda se 10 kapi otopine trihloracetatne kiseline. Zapazamo nastajanje taloga.

Reagensi: Vodena otopina bjelanceta,otopina trihloracetatne kiseline masene koncentracije 100g/L.


* Talozenje proteina alkaloidima \jC/Alkaloidi, kao i proteini, sadrze heterociklicne nitrogenske strukture, koje reaguju sa odgovarajucim skupinama proteina i obrazuju netopive soli.

Postupak: U epruvetu se sipaju 2 mL vodene otopine bjelanceta i dodaju 0,5 mL zasicene otopine tanina i 0,5 mL otopine acetatne kiseline. Zapazamo nastajanje taloga proteina, zuto-sive boje.

Reagensi: Vodena otopina bjelanceta, zasicena otopina tanina, otopina acetatne kiseline masene koncentracije 10 g/L.

Pribor:: epruvete, pipete.

Reverzibilne reakcije talozenja proteina

ijr ©rzibilne reakcije talozenja proteina moguce je izvesti postupkom isoljavanja solima lakih a- U sredini koja ima visoku ionsku jakost, kakva se stvara u prisustvu visokih Roncentracija

---------------------------------------------------------------------------------------------------- T £ >

1. Proteini Praktikum iz B iohemije

neutrainih soli, molekule proteina gube hidratacioni plast. Uklanjanjem hidratacionog sloja, interakcije izmedu molekula proteina postaju jace od onih izmedu molekula proteina i rastvaraca. Posljedica je nastajanje netopivih agregata i talozenje proteina. Za nastanak agregata bitne su interakcije izmedu hidrofobnih podrucja na povrsini molekyla proteina. Proteini istalozeni kod odredene ionske jakosti odvajaju se centrifugiranjem ili filtriranjem. U otopini iznad izdvojenog taloga proteina ostaju otopljeni proteini koji se taloze kod visih ionskih jakosti. U nasim primjerima globulini se izdvajaju u talog, a albumini ostaju u supernatantu. U daljem postupku talozimo aibumine kod potpunog zasicenja s (NH4)2S 0 4, koje postizemo dodavanjem kristalnog (NH4)2S 0 4. Istalozene aibumine izdvajamo ili centrifugiranjem ili filtriranjem. Precipitirani proteini zadrzavaju nativnu konformaciju, a time i svoju biolosku aktivnost. Istaloze'ni proteini ponovno se mogu otopiti u destiliranoj vodi, a da pri tome ne denaturiraju. Za isoljavanje proteina osobito je pogodan (NH4)2S 0 4 koji zbog dobre rastvorljivosti daje otopine visoke ionske jakosti. Isoljavanje se moze izvesti i sa natrijum-hloridom, ali ova so ima slabije dehidrataciono dejstvo od amonijum-sulfata.

• Talozenje proteina amonijum-sulfatom

Postupak: U epruvetu sipati 5 mL otopine bjelanceta i tome dodati istu kolicinu zasicene otopine (NH4)2 S 0 4. Promijesati. Poslije nekoliko minuta opazamo nastanak taloga globulina. Talog globulins uklanjamo filtriranjem. Filtratu dodajemo kristalni (NH4)2S 0 4 do potpunog zasicenja otopine Zapazamo obrazovanje taloga albumina koji se taloze u zasicenoj otopini (NH4)2S 0 4. Ponovnirr filtriranjem uklanjamo talog albumina. Filtrat vise ne sadrzi proteine, sto dokazujemo biuretskon reakcijom.

Reagensi: Otopina bjelanceta u otopini NaCI*, zasicena otopina (NH4)2S 0 4, kristalni (NH4)2S 0 4

‘ Otopina bjelanceta - tri bjelanceta se pomijesaju sa 700 mL destilirane vode i 300 mL zasicene otopine NaCI, p se profiltriraju kroz gazu


• Frakcioniranje albumina i globulina govedeg seruma postupkom isoljavanja

Postupkom isoljavanja razdvojicemo aibumine i globuline prisutne u govedem serumu.

Postupak: Isoljavanje se radi na temperaturi 4°C. U casu od 100 mL, koja je postavljena na usitnjei led sipa se 20 mL govede plazme. Potom odvagati 6.75 g kristalnog (NH4)2S 0 4 i dodati u plazrru Sadrzaj u casi lagano mijesati staklenim stapicem dok se sav amonijum-sulfat ne otopi. Opazam pojavu bijelog zamucenja. To je talog globulina koji se stvorio u poluzasicenoj otopini (NH4)2SO Sadrzaj iz case sipati u epruvete za centrifugiranje i centrifugirati 10 minuta na 3 000 obr/min. N dnu epruveta za centifugiranje izdvojio se talog globulina. Albumini, koji se kod poluzasicenja s (NH4)2S 0 4 ne taloze, ostaju u supernatantu iznad izdvojenog taloga globulina. Supernatante pazljiv odlijemo u drugu casu i ponovno dodamo 6.75 g kristalnog (NH4)2S 0 4. Pri tome se casa s supernatantima drzi na usitnjenom ledu, a sadrzaj u casi pazljivo mijesa staklenim stapicem da I se otopio sav dodani (NH4)2S 0 4. Opazamo pojavu bijelog zamucenja koje potice od albumina kc su se istalozili u zasicenoj otopini (NH4)2S 0 4 (zasicena otopina (NH4)2S 0 4 sadrzi 6.75 (NH4)2S 0 4/L na 4°C). Talog albumina izdvojiti cemo ili centrifugiranjem na 4 000 obr/min u trajan od 10 min ili filtriranjem preko filter papira. Talog albunima izdvojen centrifugiranjem ili filtriranjer uz pazljivo mijesanje, otopiti u nekoliko mililitara destilirane vode. Reverzibilno istalozeni protei se ponovno otapaju.

Reagensi: govedi serum, kristalni (NH4)2S 0 4.

Pribor: case od 100 mL, epruvete za centrifugiranje, stakleni stapici, centrifuga.


Vjezba 1.2. Obojene reakcije proteina iX>"

Obetef=tttTrreat<cij'a dokazuje se proteinska priroda supstanci i prisustvo odredenih aminokiselina u proteinima. Pojedine obojene reakcije predstavljaju osnovu nekih kvantitativnih metoda za odredivanje proteina i aminokiselina.

• Bi u re iska r ea kei j.a

Biuretska reakcijaje obojgna reakcija na peptidnu vez u molekulama proteina. Ova reakcija ie pozitivna ukoljko supstanca koju ispitujemo sadrzi najmanje dvije peptidne.vezp. Protcinskom uzorku dodajemo alkalnu Otopinu kupri-sulfata i kaliju-natrijum-tartarata. K,Na- tartarat sa kupri-ionima gradi koordinacijski spoj i tako sprjecava njihovo talozenje u alkalnoj sredini. Peptidne veze istisnu tartaratne Jigande iz koordinacijskog spoja sa Cu2+. Pri tome cetiri NH-skupine iz peptidnih veza izgrade koordinacujski spoj sa kupri-ionima^ Nastale kompleksne soli su karakteristicne ljubicaste boje.

Postupak: U epruvetu sipati 2 mL otopine bjelanceta i tome dodati 1 mL otopine NaOH i 3 kapi otopine CuS04. Promijesati. Zapazamo pojavu ljubicaste boje.

h200=c

R -H C '

o=c

R-HC

.NH

Cu

,NH.

'N H '

C = 0

CH-R

- C = 0

CH-R

h2o

Reagensi: Vodena otopina bjelanceta, otopina NaOH masene koncentracije 100 g/L, otopina CuS04 masene koncentracije 10 g/L.


* Ninhidrinska reakcija

Ninhidrinska reakcijaje obojena reakcija koju daje a-amino skupina aminokiselina, peptida i proteina. Nije specificna i daju je i neki amini i amidi. U ninhidrinskoj reakciji aminokiselina na kojoj se nalazi a-amino skupina razgraduje se do pripadnog aldehida koji ima jedan ugljikov atom manje i C 0 2, a PiQdra boja potice od spoja koji nastaje reakcijom jedne molekule reduciranog ninhidrina, jedne molekule ninhidrina i molekule oslobodenog amonijaka.

Postupak: U epruvetu sipati 2 mL vodene otopine bjelanceta i dodati se 2 mL otopine ninhidrina. Sadrzaj epruvete se, uz kljucanje, zagrijava 2 minuta. Zapazamo pojavu ljubicaste boje.

Reagensi:Vodena otopina bjelanceta, otopina ninhidrina masene koncentracije 1 g/L.

Pnbor: epruvete, pipete.

[email protected]

Text Box

VJEŽBA BROJ 2.

1. Proteini Praktikum iz B iohemije

ninhidrin

O H0O

reduciranininhidrin

O plavi spoj

Ksantoproteinska reakcija J j

KsanJoproteinska-feakcija je tipicna za prisustvo aromatskih aminokiselina u molekuli protei (triptofana, tirozina, fenilalanina). Anaraatske arriinokiseline u prisustvu nitratne kiseline gra nitro-spojeve zuteJboje (npr. tirozin prelazi u dinitrotirozin). Ovi se spojevi dodatkom baze pretvar; u hinoidnie soli koje su oranz boje. .. — ~

OHD2N X . ,n °2

NH2

tirozin

-2H20

O OH

o 2n ^ - ^ \ ^ n = o

h2c - c h - c o o h - * - ^ h2c - c h - c o o h

n h 2 nh2

O ONa

O0 2N J . N =

VK2NaOH h 2q _ q h —COO-H20

dinitrotirozin hinoidni oblik dinitrotirozina

NH2

natrijeva sol dinitrotirozina

Postupak: U epruvetu sipati 2 mL otopine bjelanceta, dodati 3 kapi koncentrirane HN03, pa paz zagrijavati. Zapazamo pojavu taloga koji se naknadno oboji zuto. Sadrzaj u epruveti ohladimo mlazom vode i u kapljicama dodajemo NaOH do pojave oranz boje.

20



Reagensi: Vodena otopina bjelanceta, koncentrirana HN 03, otopina NaOH masene koncentracije 100 g/L.

• Cisteinska reakcija

Cisteinska reakcija je tipicna za prisustvo sulfhidridne skupine u molekuli proteina. Djelovanjem natrijum-hidrokslda'oistein prelazi u serin uz izdvajanje natrijum-sulfida (Na2S). Natrijum-sulfid reagira sa olovo-acetatom, dajuci mrki talog olovo-sulfida (PbS).

COOH COOH

H2N— C -H + 2NaOH-------- ► H2N— C -H + Na2S + H20

CH2—SH CH2—OHcistein serin natrijum-sulfid

(CH3COO)2Pb + 2NaOH--------►Na2Pb02 + 2CH3COOH

natrijum-plumbit

Na2Pb02 + Na2S + 2H20 -------- PbSj + 4NaOH

olovo-sulfid

Postupak: Prethodno napraviti reagens (u epruvetu sipati 1 mL otopine olovo-acetata i dodavati NaOH dok se ne izgubi talog). Na 2 mL pripremljenog reagensa dodati 2 ml vodene otopine bjelanceta i zagrijavati uz kljucanje do pojave mrkog taloga olobo-sulfida.

Reagensi: Vodena otopina bjelanceta,otopina olovo-acetata masene koncentracije 5 g/L, otopina NaOH masene koncentracije 100 g/L.


* Hopkins-Coleova reakcija (Adamkijeviceva reakcija) ^

Hopkins-Coleova reakcija tipicna je za prisustvo indolne skupine u molekuli proteina. Pozitivne reakcije da|u_svi proteini koji sadrze aminokiselinu triptofan. U ovoj reakciji triptofan reaguje sa 9 loksilnom kiselinom koja je, u niskim koncentracijama, uvijek prisutna u koncentriranoj acetatnoj 'selini. Uz izdvajanje molekule vode djelovanjem koncentrovane sulfatne kiseline, dvije molekule

r pt0'aria povezuju se preko glioksilne kiseline, dajuci spoj ljubicaste boje; ovaj spoj predstavlja ondenzacioni proizvod triptofana i glioksilne kiseline.

postupak: Uzeti dvije epruvete, u jednu epruvetu sipati 3 mL koncentrirane H2S 0 4, a u drugu 2 mLpine bjelanceta i 3 mL glacijalne acetatne kiseline. Potom, u drugu epruvetu (pazljivo niz zidsene epruvete) dodavati sadrzaj iz prve epruvete. Zapazamo nastanak ljubicastog prstena na

.^airnom sloju.

21


triptofan

COOH

,0 h2n - c —c

nhc h 2L

0 \cvOH H

glioksilna kiselina triptofan

COOH COOH

OHcrveno ljubicasti

kondenzacioni proizvod

Reagensi: Vodena otopina bjelanceta, koncentrirana H2S 0 4, glacijaina acetatna kiselina.


• Millonova reakcija

Reakcijaje karakteristicna za prisustvo tirozina u molekuli proteina. U reakciji tirozin sa Millonovim reagansom gradi zivinu so njtrotirozina, koja je ervene boje.

OH O ? Hg

A s ° 2\ > ^ N = 0

+HN03+HgN03 ■ ,CH2 -C H — COOH ----- _2HJ -----CH2 -C H -C O O H

n h 2 2 n h 2

tirozin zivina so nitrotirozna(ervene b o je)

Postupak: U epruvetu sipati 2 mL vodene otopine bjelanceta i dodati 3-4 kapi Millonovog reagensa Zapazamo obrazovanje bijeloga taloga, koji zagrijavanjem dobiva crvenu boju.

Reagensi: vodena otopina bjelanceta, Millonov reagens*.


COOH

* Millonov reagens - otopiti 250g zive u 500 mL konc. HCI, dopuniti vodom do 1000 mL i ostaviti da stoji 24h.

Praktikum iz B iohem ije

« Sakagucijeva reakcija

1. Proteini

£flkamicijeMajeakciia tipicna ie za prisustvo gvanidino-skupine u molekuli proteina, pa je pozitivna i i_g\/ih.proteina koji sadrze arginin. U.ovoj reakciji arainin (i druga jedinjenja koja imaju gvanidino- skupinu) reaguje sa a-naftolom u prisustvu KOBr (kalijum-hipobromita), obrazujuci spoj crvene boje koji je proizyod kondenzacije oksidiranog QbJi ka argi n ina sa a-naftolom. Hipobromit, koji je prisutan, oksidira arginin i pomaze obrazovanje ovog spoja.

COO'+ I

H3N -C -H

c h 2

c h 2!

H2CX

H

NH2

,C.NH

3NaOBr

COO"

H3N - C - H

CH2

CH2

h2c

H

O -C i0H6Br

No f O—C10H7

NH

+ 2NaBr

+ 2NaOH

+ 2H20

arginin a-naftol (C10HtOH) spoj crvene boje

Postupak: U epruvetu sipati 3-4 kapi otopine albumina, dodati 5-6 kapi NaOH, 2 kapi a-naftola i 2 kapi KOBr. Pojava crvenog obojenja znakje prisustva gvanidino grupe. Crvena boja se stabilizira dodatkom 3-4 kapi otopine uree.

Reagensi: Albumin masene koncentracije 20 g/L, otopina NaOH masene koncentracije 100 g/L, otopina KOBr masene koncentracije 20 g/L, alkoholna otopina a-naftola, otopina uree 400 g/L.


r/iolischova reakcija tipicna jeza prisustvo ugljikohidratnih skupina u molekuli proteina. Ugljikohidratne skupine u molekuli proteina (najcesee^glukozamini) djelovanjem koncentrirane sulfatne kiseline pretvaraju se u derivate fu'rfurala, koji sa a-naftolom daje spoj ljubicaste boje. Mehanizam reakcije je prikazan u reakcijama na monosaharide.

Postupak: U epruvetu sipati 2 mL otopine bjelanceta i dodati nekoliko kapi a-naftola, pa niz zid epruvete, pazljivo kapaljkom dodavati koncentriranuJH § 0 4. Na dodirnom sloju obrazuje se ljubicasti Prsten. ^ 'xyAl t

Reagensi: vodena otopina bjelanceta, alkoholna otopina a-naftola, koncentrirana H2S 0 4.


1. Proteini Praktikum iz Biohemt

1.2. Slozeni proteini

Slozeni proteini, nazivaju se i proteidima, su oni koji pored proteinskog dijela moleki sadrze i neproteinsku komponentu. Ova neproteinska komponenta, koja je sastavni dio protei u njegovom nativnom stanju, naziva se prostetskom grupom. Proteinski dio molekule slozei proteina naziva se apoprotein. Kompletan protein sa prostetskom grupom naziva se holoprote Prema vrsti prostetske grupe razlikujemo: glikoproteine, lipoproteine, fosfoproteine, metaloprote i hromoproteine.

Nacin vezivanja proteinskog dijela i prostetske grupe vrlo je razlicit: od labavo poveza varijabilnih agregata kao sto su npr. lipoproteini, preko kompleksa povezanih nekovalentnim veza (neki metaloproteini) do kovalentno vezane neproteinske na proteinsku komponentu (glikoprote fosfoproteini)

1.2.1. Fosfoproteini

Fosfoproteini (fosfoproteidi) su slozeni proteini koji kao prostetsku grupu sadrze oste fosfatne kiseline koja je esterski vezana na aminokiselinske ostatke proteinskog dijela molek koji u bocnom lancu sadrze hidroksilnu grupu (npr. serin, treonin). U fosfoproteine spadaju: pro mlijeka kazein, ovoalbumini zumanceta jajeta, ihtulin izjaja riba i fosfoproteini tkiva. Fosfoprot su nerastvorljivi u vodi, rastvaraju se u razblazenim rastvorima baza, a taloze pri zakiseljavanj poluzasicenjem sa amonijum-sulfatom.

Kazein se u mlijeku nalazi u obliku rastvorljive soli kalcijuma (kalcijum-kazeinat trifosl Prostetsku grupu kazeina cini fosfoseril-glutaminska kiselina. Postoje tri vrste kazeina a ,(3 i se, se medusobno razlikuju po molekulskoj masi, sadrzaju fosfatne kiseline, izoelektricnoj tat elektroforetskoj pokretljivosti.

1.2.2. Hromoproteini

Hromoproteini (hromoproteidi) su slozeni proteini koji kao prostetske skupine sadrze n obojene spojeve neproteinske prirode (hem, karotenoidi, flavini). Siroko su rasprostranje zivotinjskim i biljnim celijama i imaju vaznu ulogu u oksido-redukcijskim procesima.

1.2.2.1. Hem proteini

U hromoproteine spada niz proteina s vaznom bioloskom funkcijom, koji kao proste skupinu imaju tetrapirolne pigmente sa ugradenim zeljezom. Nazivamo ih zeljezo-porfirinski pro ili hem proteini. Tu spadaju hemoglobin koji se nalazi u eritrocitima i vrsi vaznu funkciju prer kisika u krvi, te mioglobin protein misica koji sluzi kao spremnik kisika i olaksava njegovo kret u misicu. Sposobnost hemoglobina i mioglobina da vezu kisik ovisi o prisustvu neproteir korriponente hema (fero-protoporfirin IX), koji predstavlja prostetsku skupinu ovih proteina i im daje boju. U hem proteine spadaju i citohromi b i c, enzimi putem kojih se odvija trans elektrona u respiratornom lancu mitohondrija, zatim enzimi katalaza i peroksidaze. .K a ta la :

siroko rasprostranjen enzim lociran u peroksisomima. Katalizira dizmutaciju hidrogen perok: nastalog djelovanjem superoksid dizmutaze kao i onog koji je nastao neenzimskim reakcij hidroperoksi radikala, u vodu i molekulski kisik:

24

Praktikum iz Biohem ije 1. Proteini

H2O2 + H2O2 ----- >- H2O + O2

Zajedno sa superoksid dizmutazom cini sistem enzima koji stite celiju od oksidativnog ostecenja koje mogu uzrokovati reaktivne vrste kisika, kao sto su superoksid radikali, hidroksi radikali i hidrogen peroksid. Ovi reaktivni i toksicni derivati kisika nastaju kao sporedni produkti aerobnog metabolizma i djelovanjem zracenja. Hem kao prostetsku skupinu sadrze i peroksidaze, enzimi koji kataliziraju reakcije u kojima se alkil peroksid djelovanjem nekog reducensa (AH2) reducira u alkohol i vodu:

ROOH + AH 2 ------ ► ROH + H20 + A

Monooksigenaze tipa citohrom P450 koje kataliziraju reakacije hidroksilacije, su zeljezo-porfirinski proteini koji kao prostetsku skupinu sadrze hemin (feri-protoporfirin).

1.2.2.2. Hemoglobin i mioglobin

Hemoglobin i mioglobin su molekule prenosioci kisika. Hemoglobin je protein koji se nalazi u eritrocitima i sluzi kao prenosilac kisika u krvi. Pored toga, ima kljucnu ulogu u prenosu C 0 2 i H+ ionaV Mioglobin, koji se nalazi u misicima, sluzi kao spremiste kisika i obezbjeduje rezervno snabdijevanje misica kisikom. Molekula mioglobina se sastoji iz jednog polipeptidnog lanca. U hidrofobnom dzepu polipeptidnog lanca mioglobina smjesten je hem, prostetska grupa ovog proteina. Hemoglobin je protein koji ima kvaternamu strukturu. Hemoglobini kicmenjaka sastoje se iz cetiri polipeptidna lanca, dva lanca jedne vrste i dva lanca druge vrste. Ova cetiri lanca nalaze se u tetraedarskom rasporedu i drze se na okupu nekovalentnim interakcijama. Svaki lanac u

2000.]

Mioglobin 3 podjedinica hemoglobina

Poredenj e s truktura m iog lob ina i P p od jed in ice hem oglobina.[Priprem ljeno prema Nelsonu i Coxu,

Praktikum iz B iohemije 1. Protein i

v-Vjeitaa 1.3. Dokazivanje fosfoproteinske prirode kazeina

• Izdvajanje kazeina iz m iijeka

Kazein ima izoelektricnu tacku 4,7 i ta lozi se razbiazenim rastvorima acetatne, mlijecne i hloridne kiseline. Dodatkom kiseline mlijeku, kazein se talozi. Ako se kiselina doda u suvisku tako da se postigne pH nizi od izoelektricne tacke kazeina, talog kazeina iscezava. Kod pH nizih od izoelektricne tacke na molekulama kazeina se ponovo uspostavlja rezultirajuci n&boj i one prelaze u rastvor.

Postupak: U epruvetu sipati 2 mL miijeka i razblaziti ga istom kolicinom destilirane vode. Dodati 3-5 kapi 10% acetatne kiseline da bi se kazein istalozio. Sadrzaj profiltrirati, a talog na filter papiru isprati destiliranom vodom. Dobijeni talog skinuti sa filter papira staklenim stapicem i prenijeti ga u epruvetu.

Reagensi: svjeze mlijeko, 10% acetatna kiselina

Pribor: stakleni stapic, lijevak, filter-papir, epruvete, pipete.

• Hidroliza kazeina i kvalitativno dokazivanje prisustva fosfata u hidroiizatu

Postupak: U epruvetu sa slifovanim zapusacem (kroz koji prolazi staklena cijev) staviti kazein izdvojen u prethodnoj vjezbi (100 mg) i otopiti ga u 3 mL 10% otopine natrijum- hidroksida (NaOH). Epruvetu fiksirati pomocu stalka, takoda bude prislonjena na azbestnu resetku koja se zagrijava S|.1.32.-Priborza hidrolizu [Pripremijeno na spiritnoj lampi. Sadrzaj epruvete se zagrijava 1 5 - 2 0 prema wiihoijcicu, 1985 .] minuta, na temperaturi kljucanja. Po zavrsetku hidrolize,sadrzaj epruvete se ohladi meutralizira sa 10 % otopinom nitratne kiseline (neutralizaciju kontrolirati Plavi'm lakmus papirom).|Po neutralizaciji dobija se talog visokomolekulskih jedinjenja, nastalih nepotpunom hidrolizom kazeina. Sadrzaj profiltriramo i sa filtratom izvedemo molibdensku probu za dokazivanje prisustva fosfata. Na 1 mL filtrata dodamo 4 mL molibdenskog reagensa i nekoliko minuta lagano zagrijavamo na plameniku, do pojave kao limun zute boje. Hladenjem nastanu zuti kristali amonijum-fosfomolibdata:

12(NH4)2M o04 + H3PO4 + 2 IHNO3 ----- ► (NH4)3P0 4 x12Mo03 + 21NH4N 03 + 12 H20

Reagensi: Kazein izdvojen prethodno opisanim postupkom ili kazein u prahu, molibdenski reagens t .5 g amonijum molibdata otopiti u 100 mL destilirane vode i toj otopini dodati 100 mL 32% otopine jMmk6 ̂ iseline): otoP'na acetatne kiseline, 10% otopina nitratne kiseline, 10% otopina natrijum-

r'b°r: pribor za hidrolizu kazeina, epruvete, pipete, lijevak za fiitriranje, lakmus papir, filter papir.

[email protected]

Text Box

VJEZBA 3.

1 Proteini Praktikum iz B iohemije

Vjezba 1.4. Kvalitativne reakcije dokazivanja hemoglobins

• Benzidinska proba na hemoglobin

Benzidinska proba zasniva se na katalitickom djelovanju hemoglobina na oksidaciju benzidina sa vodikovim-peroksidom. Nastaje p-hinondiimid, plave boje koja stajanjem prelazi u crvenu.

^ H N = < >=N H + H20

benzidin p-hinondiim id(plava boja)

$ &Postupak: U epruvetu sipati 0,5 mL razblazene hemolizirane krvi pa dodati pet kapi otopine benzidina i pet kapi otopine H20 2. Zapazamo pojavu plave boje koja stajanjem prelazi u crvenu.

<1Reagensi: razblazena hemolizirana krv, 0,2% alkoholna otopina benzidina, 3,2% vodikov-peroksid (H2Oz).


Teichmannova proba

Djeiovanjem kiseline i uzzagrijavanje, hemoglobin se hidrolizira na hem i globin. Hem se dalje, pod uticajem kisika, oksidira u hematin (hemin), koji sa NaCI gradi nerastvorljive kristale hlorhematina (hlorhemin).

Postupak: Kap svjeze krvi staviti na mikroskopsku plocicu, razvuci je u tanak sloj i ovlas posuti kristalima NaCI. Kada se razmaz osusi na zraku, pokriti ga ljuspicom i pomocu sta- klenog stapica sa strane podliti acetatnom kiselinom. Nakon sto acetatna kiselina, djeiovanjem kapilarnih sila, inbibira cijelu povrsinu ispod ljuspice, plocicu pazljivo zagrijavamo prevla- cenjem nad plamenom. Poslije kraceg vremena preparat ostaviti da se ohladi, a zatim ga posmatrati pod mikroskopom. Z apaz iti i posm atra ti tip icne k ris ta le h lo rhem atina (Teichmmanove kristale) koji su mrke boje i romboidnog oblika, grupisani ili cesce razbacani u obliku stapica. Ukoliko se plocica previse ili nedovoljno zagrijava, proba ne uspijeva i treba je ponoviti.

Reagensi: krv, NaCI u kristalima, acetatna kiselina.

Pribor: mikroskop, mikroskopske plocice, ljuspice, plamenik.

40

S I .1 .3 3 . - K r is ta li h lo rh e m a tin a . [Priprem ljeno prema Wliholjcicu, 1985]

[email protected]

Text Box

VJEŽBA BROJ 3.


O o a U -ta ;r iv M C 1

« Dokazivanje hem oglobina po Castle-Mayeru

/ M. (1

Dokazivanje hemoglobina ovim postupkom zasniva se na sposobnosti hemoglobina da, kao i enzim peroksidaza, razlaze vodikov peroksid na vodu i nascentni kisik (H20 2̂ H 20+0). Djelovanjem nascentnog kisika, bezbojni fenolftalin prelazi u crveni fenolftalein. Na ovaj nacin se dokazuju tragovi krvi u sudsko-medicinskoj praksi.

fenolftalein(bezbojan)

fenolftalein(erven)

Postupak: Na 2 mL razblazene krvi (na kap krvi dodati destiliranu vodu do gubitka crvene boje), dodaju se 1 mL 3% otopine vodikovog peroksida i 1 mL Castle-Mayerovog reagensa. Pojava intenzivne crvene boje fenolftaleina dokaz je prisustva hemoglobina.

Reagensi: krv, 3% otopina vodikovog peroksida, Castle-Mayerov reagens (Na 2g fenolftalina, 10 g metalnog cinka i 20 g natrijum-hidroksida doda se 100 mL destilirane vode. Pri zagrijavanju ove smjese, natrijum-hidroksid reagira sa cinkom, pri cemu nastaje natrijum-cinkat, uz oslobadanje vodika koji reducira fenolftalein).



Vjezba 1.5. Dokazivanje ugfjikohidratne grupe u molekuli mucina

• Izdvajanje mucina iz pljuvacke

Glikoproteini se taloze u kiseloj sredini.

Postupak: Na 2 mL pljuvacke sakupljene u epruveti dodati 4-5 kapi koncentrirane acetatne kiselin Zapaziti izdvajanje taloga mucina, koji se tesko otapa u visku acetatne kiseline. Grudvice mucir izdvojiti staklenim stapicem, prenijeti u cistu epruvetu i sa njima izvesti Molischovu probu.

Reagensi: pljuvacka, acetatna kiselina.


Molischova reakcija je tipicna za prisustvo secernih grupa u molekuli proteina. Ugljikohidral (secerne) grupe u molekuli proteina, djeiovanjem koncentrirane sulfatne kiseline prelaze u deriv furfurala (mehanizam reakcije prikazan je u reakcijama na monosaharide) koji sa a-naftolom d spoj ljubicaste boje.

Postupak: U epruvetu u kojoj se nalaze mucini izdvojeni iz pljuvacke, dodati nekoliko kapi a-nafti pa nizzid epruvete pazljivo, pipetom dodavati koncentriranu sulfatnu kiselinu. Zapazamo nastajc ljubicastog prstena na dodirnom sloju.

Reagensi: mucini izdvojeni iz pljuvacke, konc. sulfatna kiselina, a-naftol.

Pribor: epruvete, kapaljke, pipete.

vjezbe biohemija

Documents