Ústav lekárskej biológie, LF UPJŠ v Košiciach

CYTOGENETIKACYTOGENETIKACHROMOZÓMYCHROMOZÓMY

KARYOTYPKARYOTYP

Takmer celý obsah DNA eukaryotickej bunky sa nachádza v jadre, kde spolu s bielkovinami vytvára štruktúry – chromozómy – viditeľne v deliacej fáze – mitóze.

V nedeliacom sa jadre sa chromozómy javia ako granulárna masa – CHROMATÍN (chromozómy sú hydratované, dekondenzované a rozvinuté)

Heterochromatín a euchromatínHeterochromatín

• predstavuje časti chromozómov obsahujúce málo alebo žiadne gény,ako napr.

• centroméry a teloméry• je kondenzovaný • môže obsahovať transpozóny a "junk"

DNA; • je replikovaný v neskorej S-fáze b.

cyklu; • crossing over v meióze je zriedkavý • gény lokalizované v heterochromatíne

sú vo všeobecnosti inaktívne, t.j. nie sú transkribované

Euchromatín • predstavuje časti chromozómov obsahujúce množstvo génov • Je kondenzovaný do voľných slučiek 30-nm vláken. • Je oddelený od priľahlých oblastí heterochromatínu inzulátormi. Slučky heterochromatínu sú zväčša lokalizované v blízkosti komplexov jadrových pórov.

a)

b)

c)

d)

DNA

Nukleozómovévlákno (11 nm)

Chromatínovévlákno (30 nm)

Chromatínové slučky

(300 nm)

Heterochromatín(700 nm)

Chromozóm

Eukaryotické chromozómyEukaryotické chromozómy- genetické jednotky bunky zložené z DNA a bielkovín

Chemické zloženie chromozómovChemické zloženie chromozómov

• DNA: jedna lineárna dvojvláknová molekula (napr. ľudský chromozóm č.1 – 2,5x108bp – cca. 15cm, najmenší chromozóm č.21 – 0,5x108bp – cca. 3 cm)

• RNA: molekuly rRNA, tRNA a mRNA transkribované z DNA

• Bielkoviny: významná zložka chromozómov euk. buniek. Podľa charakteru delíme na:

• históny – bázické bielkoviny (Lys, Arg, His)

• nehistónové bielkoviny

Pomer NK a bielkovín je 60% ku 40%

HistónyHistóny

Malé molekuly bázických bielkovín (100-200 AMK).

Bola zistená evolučná stálosť sekvencií AMK v reťazci histónov, takmer 100% zhoda (rast., živoč., človek).

Históny sú syntetizované v plazme.

Typy histónov: H1, H2A, H2B, H3, H4

Jednotlivé históny sa líšia svojou štruktúrou a chem. zložením.

V spermiách cicavcov sú históny viac bázické.Funkcia histónov:

- priestorové usporiadanie DNA do nadmolekulovej štruktúry pri tvorbe chromozómu. Regulácia transkripcie.

Nehistónové bielkoviny: kyslý charakter, viac ako 100 druhov bielkovín – enzýmy – replikácia – transkripcia – génové regulácie

• Históny majú pozitívny elektrický náboj, preto môžu vytvárať iónové väzby s negatívne nabitými fosfátovými skupinami v DNA

• Chromatínové vlákno je usporiadané do veľkého počtu slučiek, ktoré vyčnievajú z centrálneho skeletu tvoreného nehistónovými chrom. proteínmi

• Pri kondenzácii dochádza ku kontrakcii NHC (non-histone chrom. proteins)

Submikroskopická štruktúra chromozómu Submikroskopická štruktúra chromozómu

- zložitá nadmolekulárna organizácia DNA a histónových bielkovín

- celková dĺžka DNA v ľudskej diploidnej bunke (1,5 – 2 m) – 3x109 bp, veľkosť jadra (5-10 mikrónov)

- základná submikroskopická jednotka chromozómu je nukleozóm

Nukleozóm: sa skladá z jadra a DNA (200bp)

Nukleozómové jadro: oktamér 2xH2A, H2B, H3 a H4 (kladne nabitý).

DNA vytvára 2 otáčky okolo nukleozómu. H1 slúži ako viazač DNA medzi dvoma nukleozómami.

Nukleozómové vlákno

Mikroskopická štruktúra chromozómu Mikroskopická štruktúra chromozómu

Chromozómy svetelným mikroskopom môžeme pozorovať a hodnotiť v metafáze bunkového delenia.

Morfológia chromozómov sa hodnotí podľa umiestnenia centroméry, kt. spája dve dcérske chromatidy a rozdeľuje chromozóm na p a q rameno.

Medzi morfologické charakteristiky patrí aj veľkosť chromozómu a morfologická štruktúra.

p-ramienko

q-ramienko

teloméra

teloméra

Počet chromozómov Počet chromozómov

Pre každý biologický druh je charakteristický počet chromozómov (diploidný počet (2n) – telové bunky, haploidný počet (n) - gaméty)

Príklady počtu chromozómov u rôznych druhov:

Druh Diploidný počet (2n)Plazmódium malárie 2Drozofila melanogaster 8Rak 116Kapor 104Pes 78Hov. Dobytok 60Kôň 66Myš 40Šimpanz, orangutan, gorila 48Človek 46

Teloméry - Telomeráza Teloméry - Telomeráza

Teloméry: koncové časti chromozómov so špeciálnou sekvenciou dusíkatých báz, kt. ohraničujú koncové časti pred zlomami, kt. uľahčujú fúziu chromozómov a prestavby chromozómov – chromozómové mutácie

Telomeráza: enzým, nukleoproteín – okrem proteínovej zložky má zabudovanú v molekule aj sekvenciu ribonukleotidov – CCCAAU (človek).

Význam telomerázy je v kompletizácii zaostávajúceho vlákna DNA v dôsledku zostrihu primerov RNA, kt. zahajujú replikáciu DNA v Okazakiho fragmentoch.

Každý biologický druh má svoj charakteristický karyotyp – genetická charakteristika.

metacentrický

submetacentrický

akrocentrický

telocentrický

Chromozómy v diploidnej bunke sa vyskytujú v pároch. Pár chromozómov zhodných v tvare a štruktúre sa označuje ako

homologický pár.

Podľa určenia pohlavia chromozómy delíme:

-telové, somatické, autozómy

-pohlavné, gonozómy, sex-chromozómy, heterochromozómy

Podľa intenzity farbenia chromozómu rozoznávame:

-heterochromatínové časti (centroméry, teloméry), geneticky neaktívne časti, kt. sa replikujú v neskorej S-fáze – výraznejšie farbiteľné časti

-euchromatínové časti – menej výrazne farbiteľné časti, genetický aktívne, dokonale dekondenzované a odvinuté

Ku správnemu určeniu počtu chromozómov prispela modifikácia metódy, aplikácia fytohemaglutinínu (PHA) – stimulácia delenia leu, hlavne aplikácia kolchicínu – zastavenie mitózy v metafáze a použitie hypotonického roztoku, kt. spôsobil disperziu chromozómov v priestore.

Klasifikácia chromozómov u človeka – Denverská (1961), Parížska (1972)

Skupina Charakteristika Autozómy Gonozómy Muž Žena

A najväčšie metacentrické 1-3 - 6 6

B veľké submetacentrické 4-5 - 4 4

C stredne veľké submetacentrické 6-12 X 15 16

D väčšie akrocentrické 13-15 - 6 6

E malé metacentrické 16-18 - 6 6

F najmenšie metacentrické 19-20 - 4 4

G najmenšie akrocentrické 21-22 Y 5 4

46 46

počet

Súbor chromozómov diploidnej bunky s charakteristickým tvarom a počtom chromozómov sa volá KARYOTYP.

Presný počet chromozómov v diploidnej bunke u človeka stanovili Tjio a Levan v roku 1956, keď dokázali, že človek má 46 chromozómov. Do uvedeného obdobia sa za pravdivý považoval fakt, že ľudské bunky majú 48 chromozómov.

Štruktúra ľudských chromozómov Štruktúra ľudských chromozómov

DNA eukar. bunky je rozdelená do jednotlivých chromozómov, kt. predstavujú samostatné molekuly DNA.

Poznanie štruktúry chromozómov prispelo k rozvoju nového odvetvia genetiky – CYTOGENETIKY, čo našlo uplatnenie aj klinickej genetike. Potvrdzuje to aj fakt, že už v 60. rokoch bol cytogenetický diagnostikovaný Downov sy., Edwardsov sy., Patauov sy. a iné

Uplatnenie cytogenetickej analýzy:-diagnostická metóda – určenie syndrómov-diagnostika VVCH-diagnostika nádorov (leukémia)-prenatálna diagnostika (bunky plodu)-hodnotenie buniek za spontánnych potratov a iných reprod. problémov-hodnotenie chromozómov u rizikových profesií (mutagény)-in vitro experimenty na mutagenézu nových chemikálií, liekov, prísad do potravín

• Diabetes mellitus and deafness (DAD) – this combination at an early age can be due to mitochondrial disease – Diabetes mellitus and deafness can be found together for other reasons as

well • Leber hereditary optic neuropathy (LHON)

– visual loss beginning in young adulthood – Wolff-Parkinson-White syndrome – multiple sclerosis-type disease

• Leigh syndrome, subacute sclerosing encephalopathy – after normal development the disease usually begins late in the first year

of life, but the onset may occur in adulthood – a rapid decline in function occurs and is marked by seizures, altered states

of consciousness, dementia, ventilatory failure • Neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis (NARP)

– progressive symptoms as described in the acronym – dementia

• Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy (MNGIE) – gastrointestinal pseudo-obstruction – neuropathy

DELENIE DELENIE BUNIEKBUNIEK

• základná charakteristika života

• vznik nových buniek delením existujúcich

Delenie buniek Delenie buniek

Význam delenia buniek:

a) U jednobunkových organizmov delenie – rozmnožovanie

b) U mnohobunkových organizmov – delenie zygoty a následné bunkové delenia – embryonálny vývoj, delenia v postembyonálnom vývoji – rast organizmu

c) Náhrada strát buniek v dôsledku fyziologického opotrebovania (erytrocyty, bunky epidermis 1010/deň), patologických procesov a mechanického poškodenia buniek

Typy bunkového delenia Typy bunkového delenia • priame delenie – amitóza

• nepriame delenie – mitóza

• redukčné delenie - meióza

Priame delenie: - prokaryotické bunky

Replikácia kruhovej DNA je nasledovaná priečnym rozdelením bunky (30-60 min.).

Materská bunka

Dcérske bunky

Mitotické delenie: -nepriame delenie – prebieha v jednotlivých fázach, kt. reprezentujú bunkový cyklus (cyklické striedanie dejov v období od vzniku dcéskej bunky po jej opätovné rozdelenie).

Medzi hlavné fázy bunkového cyklu patria:

-interfáza – 3 štádia : G1 – S – G2

- mitotická fáza – 5 štádií : profáza, metafáza, anafáza, telofáza, cytokinéza

cytokinesis

G1 štádium:

-postmitotické štádium – od vzniku dcérskej bunky po S – štádium

-35% trvania bunkového cyklu (výrazná variabilita – 10-180 hodín)

Prejavuje sa tu adaptačná schopnosť na vonkajšie podmienky, zrýchľovanie a spomaľovanie bunk. cyklu.

Ak bunka nepokračuje v bunk. cykle zostáva v G1 štádiu resp. v G0, bunka vykonáva metabolické procesy (proteosyntéza), ale na bunkové delenie sa aktívne nepripravuje.

G0 štádium je charakteristické pre kmeňové, pluripotentné bunky napr.: bunky krvotvorby, epidermis.

- hlavný kontrolný uzol – regulácia bunk. cyklu – rozhoduje o pokračovaní bunky do S-štádia ak sú splnené podmienky: kritický objem, syntéza enzýmov a iných biopolymérov, syntéza RNA a DNA polymeráz

S štádium:

-syntetické štádium DNA, naväzuje na G1 v prípade, že boli uskutočnené nutné deje a bunka má priaznivé podmienky pre syntézu DNA.

-trvanie S-štádia konštantné pre daný typ buniek (8-20 hod. = cca.45% bunk. cyklu)

-výsledok: vznik tetraploidnej bunky vznik dvoch chromatíd (reduplikácia chromozómov)

Okrem replikácie DNA v štádiu prebieha syntéza histónových bielkovín, riadená asi 40 génmi (syntéza mtDNA je nezávislá na syntéze jadrovej DNA).

G2 štádium:

-postsyntetické, relatívne krátke trvanie (10% bunk. cyklu)

-pokračuje syntéza bielkovín

-rast bunkových organel

-syntéza mitotického aparátu (tubulín, kinetochórové vlákna)

-V tomto štádiu sa nachádza kontrolný uzol rozhodnutie o vstupe bunky do mitózy

MITOTICKÁ FÁZA (mitóza)-trvá asi 10% bunkového cyklu (1-1,5 hod.), dĺžka trvania je konštantná

PROFÁZA-rozsiahle prestavby v cytoplazme a jadre bunky. V cytoplazme sa centriol rozdelí na dve časti, kt. putujú k pólom bunky. Tvorí sa mitotický aparát a ku koncu profázy sa vlákna deliaceho vretienka pripájajú ku kinetochóru.

V jadre sa stráca jadierko, chromozómy sa dehydratujú a špiralizujú – stávajú sa viditeľnými. Neskôr na konci profázy sa stráca jadrová membrána, kt. sa stáva súčasťou ER.

Trvanie: 30 min.

METAFÁZA

-chromozómy sa ešte viacej kondenzujú a stávajú sa viditeľnejšími

V dôsledku pripojenie mikrotubúl deliaceho vretienka sú chromozómy stabilizované v tzv. rovníkovej rovine. Chromatidy sú stále spojené v mieste centroméry.

Trvanie: 3 min.

ANAFÁZA

-pozdĺžne rozdelenie chromozómu na chromatídy, kt. reprezentujú chromozómy budúcich dcérskych buniek. Rýchlosť pohybu chromozómov 1 mikrón/s.

Trvanie: 5 min.

TELOFÁZA

Strata – degradácia – mitotického aparátu, proces depolymerizácie proteínov

-dekondenzácia a hydratácia chromozómov – premena na chromatín

-tvorba jadrovej membrány z ER

-vydiferencovanie jadierka Trvanie: 20 min.

CYTOKINÉZA

Cytokinéza je proces, pri ktorom sa materská bunka rozdelí na dve bunky schopné samostatnej existencie. Cytokinézu považujeme za samostatnú fázu bunkového cyklu, pretože nemusí stále prebiehať na konci M-fázy, ale môže byť, z hľadiska časového rozvrhu cyklu, „preradená“ do priebehu už nasledujúceho cyklu alebo sa nemusí vôbec uskutočniť (vznikajú tak viacjadrové bunky).

DĹŽKA TRVANIA BUNKOVÉHO CYKLU U EUKARYOTOV

Organizmus G1 S G2 M celková dĺžka

Ľudský 8 10 5 1 24 hod.

Rastlinný 8 12 8 1 29 hod.

Kvasinky 24 40 35 20 120 min.

Kontrola bunkového cykluKontrola bunkového cykluNormálny vývoj a rast organizmu počas jeho ontogenézy je zabezpečený prostredníctvom mechanizmov, kt. kontrolujú bunkové delenie.

-embryonálny vývoj intenzívne bunkové delenie

-postembryonálny vývoj rýchlosť delenia buniek sa mení (v bunkách niektorých tkanív a orgánov sa môže dočasne zastaviť). Niektoré bunky strácaju schopnosť delenia úplne (ery, leu, neuróny). Niektoré bunky zostávajú v G0 štádiu, t.j. nepripravujú sa na bunkový cyklus a le schopnosť delenia si ponechávajú.

Mechanizmy bunkového delenia:

• genetické

• negenetické

Genetická kontrola

- uskutočňuje sa pomocou génov a ich produktov (polypeptidy, enzýmy a hormóny). Procesy bunkového delenia môžu byť stimulované (pozitívna kontrola) alebo inhibované (negatívna kontrola).

Pozitívna kontrola bunkového delenia

-v zmysle stimulácie bun. delenia prostredníctvom produktov iných buniek (signály), kt. sú spracované receptormi:

-mitogény – rastové proteíny (fytohemaglutinín)

-rastové hormóny – somatotropín – hypofýza

tyroxín – štítna žľaza

testosterón, estrogény

erytropoetín – obličky

rastové faktory (EGF, IL-6…)

Reakcia signál – receptor aktivuje gény pre produkciu proteínov, kt. pozitívne alebo negatívne kontrolujú procesy delenia. Okrem horeuvedených stimulátorov gény riadia produkciu cytokínov a cyklín závislých kináz.

-PROTOONKOGÉNY

gény, ktoré produkujú proteíny s pozitívnou riadiacou činnosťou. Mutácie týchto génov vedú k vzniku onkogénov nádorové bujnenie

Negatívna kontrola bunkového delenia

-charakteristická inhibíciou bunkového delenia. Génové produkty inhibujú bunkové delenie, ak toto nie je žiadúce pre organizmus.

TUMOR SUPRESOROVÉ GÉNY (p53, retinoblastóm)

-tieto kontrolujú bunkové delenie tak, že ho zastavujú v G1-štádiu a bunka nevstupuje do S-štádia.

Pri mutácii génu pre p53, gén produkuje neaktívny proteín, kt. nie je schopný udržiavať inhibíciu bunkového delenia. Bunka napriek tomu, že organizmus to nepožaduje, vstupuje do S-fázy proces karcinogenézy, iný príklad kožné ochorenie psoriáza – nadmerná produkcia epidermálnych buniek

Schéma kontroly bunkového cyklu:

Negenetická kontrola

-Chemické faktory: pH, koncentrácia iónov, metabolity, pO2 (hypoxia v nadmorskej výške)

-Fyzikálne faktory: teplota, žiarenie, kontaktná inhibícia