UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Marko Pantić

Definisanje optimalnih uslova za izolaciju DNK iz tumora

glioblastoma

Master rad

Niš, 2018

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Definisanje optimalnih uslova za izolaciju DNK iz tumora

glioblastoma

Master rad

Kandidat: Mentor:

Marko Pantić 226 dr Tatjana Mitrović

Niš, 2018

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Defining optimal conditions for isolation of DNA from

glioblastoma

Master thesis

Candidate: Mentor:

Marko Pantić 226 dr Tatjana Mitrović

Niš, 2018

Zahvalnica

Put ka cilju često nije lak, ali uz jaku želju, predan rad, upornost, ali i podršku

drugih svaki cilj je ostvariv. Rad koji je pred Vama simbolično predstavlja ostvarenje

jednog od mojih ciljeva, kraj jednog puta, pa u njemu želim pomenuti one koji su na

tom putu bili uz mene, dali mi podršku i pomogli mi da stignem do njegovog kraja.

Svoju naiskreniju zahvlanost dugujem svom mentoru, dr Tatjani Mitrović, na

ukazanom poverenju, uloženom trudu, ažurnosti, dragocenim savetima, znanju i

iskustvu koje je podelila sa mnom kako u teorijskom, tako i u praktičnom radu.

Posebnu zahvalnost dugujem dr Vladimiru Cvetkoviću na izdvojenom

vremenu, spremnosti na saradnju, pravovremenim i vrednim sugestijama koje su

doprinele kvalitetu ovog rada ali i sticanju praktičnog znanja u eksperimentalnom

radu.

Iskrenu zahvalnost dugujem i studentu doktorskih studija Nikoli Jovanoviću

na strpljenju, savetima i pomoći oko izvođenja eksperimentalnog dela rada.

Neizmernu zahvalnost dugujem svojoj porodici! Hvala vam što ste bili tu, što

ste bili uz mene na ovom putu, što ste se radovali mojim uspesima i bili i ostali

ponosni na mene! I vi ste deo ovog rada!

Biografija

Marko Pantić rođen je u Nišu, 05. juna 1994. godine. Osnovnu školu ,,Kralj Petar Iʺ u Nišu,

završio je 2009. godine kao nosilac diplome ,,Vuk Karadžićʺ. Iste godine upisuje Gimnaziju

,,Svetozar Markovićʺ u Nišu, koju završava 2013. godine sa odličnim uspehom.

Osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu, na Departmanu

za biologiju i ekologiju upisuje 2013. godine i iste završava 2016. godine, pri tom stiče zvanje

,,Biologʺ. Iste godine upisuje Master akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u

Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju, smer Biologija, koje završava 2018. godine i stiče

zvanje ,,Master diplomirani biologʺ.

Tokom studija dva puta je bio korisnik stipendije Fonda za mlade talente i jednom

Stipendije za izuzetno nadarene studente i učenike.

Sažetak

Izolovana je genomska DNK iz tumora pacijenata obolelih od glioblastoma upotrebom

QIAGEN tehnologije bazirane na silika gel membranama. Varirani su različiti parametri (količina

tkiva, enzimski tretman, broj elucija) i praćen njihov uticaj na prinos i kvalitet izolovane DNK.

Količina i stepen čistoće izolovane genomske DNK određen je spektrofotometrijskom metodom

na Spectrophotometer UV-1650PC i BioSpec-nano aparatima. Definisani su maksimalni kapacitet

QIAGEN kolone i optimalni uslovi izolacije DNK na njoj. Intaktnost izolovane genomske DNK

proveravana je elektroforetskom metodom na agaroznom gelu.

Ključne reči: glioblastoma multiforme, izolacija DNK, tretman RNazom A

Abstract

Genomic DNA from tumor tissue of glioblastoma patient was isolated using QIAGEN

technology based on silica gel membrane. Different parameters (tissue quantity, enzyme

treatment, number of elutions) were varied and their effect on yield and quality of isolated DNA

was followed. Quantity of isolated genomic DNA and its purity was determined by

spectrophotometric method using Spectrophotometer UV-1650PC and BioSpec-nano devices.

The maximum capacity of the QIAGEN column and the optimal conditions of DNA isolation on it

were defined. Intactness of isolated genomic DNA was checked by agarose gel electrophoresis.

Key words: glioblastoma multiforme, isolation of DNA, RNase A treatment

Sadržaj

1. Uvod................................................................................................................................................................ - 1 -

1.1. Glioblastoma multiforme .................................................................................................................. - 1 -

1.1.1. Lokalizacija.................................................................................................................................... - 1 -

1.1.2. Histopatologija ............................................................................................................................. - 2 -

1.1.3. Incidenca i preživljavanje .............................................................................................................. - 2 -

1.1.4. Tipovi glioblastoma ....................................................................................................................... - 3 -

1.1.5. Molekularna karakterizacija glioblastoma .................................................................................... - 4 -

1.1.6. Lečenje.......................................................................................................................................... - 7 -

1.2. Hromatografija.................................................................................................................................. - 8 -

1.2.1. Adsorpciona hromatografija ......................................................................................................... - 9 -

1.2.2. Primena adsorpcione hromatografije ......................................................................................... - 10 -

2. Cilj rada ........................................................................................................................................................ - 11 -

3. Materijal i metode ................................................................................................................................... - 12 -

3.1. Materijal ......................................................................................................................................... - 12 -

3.2. Metode ........................................................................................................................................... - 13 -

3.2.1. Izolovanje genomske DNK upotrebom QIAamp® DNK Mini Kit ................................................... - 13 -

3.2.2. Prečišćavanje DNK metodom etanolne precipitacije ................................................................... - 15 -

3.2.3. Provera intaktnosti genomske DNK metodom elektroforeze na agaroznom gelu ....................... - 15 -

3.2.4. Određivanje koncentracije DNK spektrofotometrijskom metodom ............................................ - 16 -

3.2.5. Određivanje koncentracije DNK uz pomoć ImageJ softvera ........................................................ - 17 -

4. Rezultati i diskusija .................................................................................................................................. - 18 -

4.1. Provera intaktnosti izolovane genomske DNK na gelu .................................................................... - 18 -

4.2. Određivanje koncentracije izolovane DNK sa agaroznog gela upotrebom ImageJ softvera ............. - 20 -

4.3. Određivanje koncentracije izolovane DNK spektrofotometrijskom metodom ................................ - 21 -

4.4. Utvrđivanje prinosa DNK variranjem količine polaznog materijala ................................................. - 23 -

4.5. Utvrđivanje gubitka DNK na silika gel membrani ............................................................................ - 26 -

5. Zaključci ....................................................................................................................................................... - 29 -

6. Literatura .................................................................................................................................................... - 30 -

- 1 -

1. Uvod

1.1. Glioblastoma multiforme

Tumori nervnog tkiva, koji vode poreklo od glija ćelija ili njihovih prekursora, poznati su

kao gliomi. Svetska zdravstvena organizacija (eng. World Health Organisation, WHO), prema

klasifikaciji iz 2007. godine, klasifikuje gliome u četiri kategorije (stepena ili gradusa) na osnovu

stepena nediferenciranosti ćelija, anaplazije i agresivnosti [1][2]. U kategoriju I svrstavaju se

tumori koji se smatraju benignim i potpuno izlečivi kliničkom intervencijom. U kategoriju II

svrstani su tumori koji su označeni kao “low-grade” ili spororastući tumori, dok se maligni gliomi

ili “high-grade” gliomi ubrajaju u kategorije III i IV [3].

Glioblastoma multiforme (GBM) je astrocitom IV stepena, maligni gliom koji se razvija od

astrocita. Najčešći je od svih malignih glioma (60-70%) [4], a ujedno predstavlja i najagresivniju

formu, sa izvesno letalnim ishodom [2].

1.1.1. Lokalizacija

Glioblastom je obično lokalizovan u cerebralnim hemisferama gde polazi iz subkortikalne

bele mase [5]. Najčešće se javlja u frontalnom lobusu, zatim temporalnom i parijetalnom, a retko

u okcipitalnom [6][7]. Neretko obuhvata i više lobusa istovremeno (preklapajući tumor), a

posebno je česta frontotemporalna lokalizacija. Preko korpusa kalozuma može se proširiti u

drugu hemisferu mozga, retko se javlja intraventrikularno, a nije neuobičajena pojava tumora u

bazalnim ganglijama i talamusu [5]. Cerebelum i kičmena moždina su ekstremno retke lokacije

[8][9]. Priroda je tumora da difuzno infiltrira u okolno tkivo, poput prstiju, što umnogome otežava

hirušku intervenciju [10]. Metastaza je jako retka pojava kod GBM.

- 2 -

1.1.2. Histopatologija

GBM je neoplazma sačinjena od mnogobrojnih, slabo diferenciranih, često pleomorfnih

astrocitnih tumorskih ćelija koje karakteriše izražena nuklearna atipija, kao i pojačana mitotska

aktivnost. Ključni histopatološki parametri su mikrovaskularna proliferacija i/ili nekroza, a takođe

se javlja i vaskularna tromboza [5].

Histopatološka slika ovog tumora je varijabilna, na šta i ukazuje termin ,,multiforme”. Neki

tumori pokazuju visok stepen nuklearnog i ćelijskog polimorfizma sa brojnim multinuklearnim

gigantskim ćelijama, dok su drugi visokocelularni, ali uniformni. Regionalna heterogenost je,

takođe, izražena što predstavlja problem kod analize malih uzoraka tkiva uzetih biopsijom.

Neophodno je prisustvo anaplastičnih glijalnih ćelija, mitotske aktivnosti i vaskularne proliferacije

i/ili nekroze, a distribucija ovih ključnih elemenata u tumoru je varijabilna. Vaskularna

proliferacija zapaža se u celom tumoru, najčešće oko regije nekroze i u perifernoj zoni infiltracije

[5]. Novoformirani krvni sudovi su morfološki slični renalnom glomerulu, ali su njihove

endotelijalne ćelije drugačije od običnih – preklapaju se, razlikuju se po veličini i obliku i dolazi do

njihove hiperplazije. Sudovi su obavijeni diskontinuiranim slojem pericita, ali oni nemaju kontakt

sa nastavcima astrocita [11]. Još jedna karakteristika GBM je vaskularna tromboza, koja može

dovesti do oštećenja i proliferacije endotelijalnih ćelija. Oštećenja koja nastastaju uzrokuju

ekstravazaciju crvenih krvnih zrnaca [12]. Vaskularna tromboza može imati ulogu i u ishemijskoj

tumorskoj nekrozi [5].

Velike nekrotične zone obično se nalaze u centru tumora, dok su vijabilne tumorske ćelije

locirane na periferiji [5]. Obično se se sreću dva tipa nekroze, u zavisnosti od lokalizacije i veličine

nekrotične zone. Prvi tip predstavljaju velike nekrotične zone u centralnom delu tumora koje

nastaju kao posledica nedostatka dotoka krvi. Drugi tip karakterišu male zone, nepravilnog oblika,

okružene pseudopalisadnim zonama [13].

1.1.3. Incidenca i preživljavanje

Učestalost pojave GBM na globalnom nivou varira od 0,59 do 3,69 obolelih na 100.000

osoba na godišnjem nivou (najniža stopa je u Koreji, a najviša u Grčkoj) [14][15]. Najviše stope

karakteristične su za Evropu i Severnu Ameriku a kreću se između 3 i 5 obolelih na 100.000 osoba

- 3 -

godišnje (3,2 SAD; 3,55 u Švajcarskoj), dok se najniže javljaju na području Azije. GBM se obično

dijagnostifikuje u starijem dobu pri čemu je prosečan broj godina 64. Učestalost javljanja se

povećava sa godinama starosti, a svoj pik dostiže između 75. i 84. godine (15,28/100.000). Pojava

ove bolesti kod dece je prilično retka. Muškarci oboljevaju mnogo češće nego žene (1,58 puta

više, u SAD), a takođe, bolest je češća kod ljudi bele nego crne boje kože (1,93 puta, u SAD)

[14][15][16][17].

GBM zbog svojih osobenosti, kao na primer karakteristika rasta, a pre svega agresivnosti,

ima jednu od najlošijih prognoza preživljavanja od svih humanih tumora uopšte. Prosečna dužina

života od trenutka uspostavljanja dijagnoze je 3 meseca za nelečene pacijente, dok je za pacijente

koji su podvrgnuti multidisciplinarnom lečenju (hiruška intervencija, hemoterapija, radioterapija)

taj period produžen na 14,6 meseci [15]. Dužina života, generalno, zavisi od metode lečenja kao

i od kombinacije različitih metoda. Prema podacima iz Sjedinjenih Američkih država 42,2%

obolelih preživi 6 meseci, 39,7% godinu dana, 10,1% 3 godine, dok samo 5,5% njih preživi 5 godina

i više, što je jedna od najlošijih petogodišnjih prognoza medju humanim tumorima [16][17].

Prema podacima ,,Registra za rak u Centralnoj Srbiji“ br. 17, 2015. godine, ukupan broj

novoobolelih od raka iznosio je 27.867, od čega 14.582 muškaraca i 13.285 žena. Od raka mozga,

iste godine, obolelo je 348 muškaraca i 291 žena, što je u oba slučaja 2,4% od ukupnog broja

obolelih od nekog malignog oboljenja, za dati pol. U tom periodu, u Nišavskom okrugu oboleo je

21 muškarac i 19 žena, dok je broj umrlih 14, odnosno 16 [18].

Standardizovana stopa incidencije raka mozga na 100.000 stanovnika u Centralnoj Srbiji

iznosi 8,0 za muškarce i 6,6 za žene. Vrednost ove stope u Nišavskom okrugu iznosi 6,2 za

muškarce i 5,1 za žene [18].

1.1.4. Tipovi glioblastoma

Generalno razlikujemo sledeće tipove glioblastoma: primarni i sekundarni.

Primarni GBM nastaje de novo, kao jako invazivna i agresivna tumorska forma bez

kliničkih ili histoloških tragova prethodnih oboljenja (po nekim podacima smatra se da vodi

poreklo od neuralnih stem ćelija [19]), dok se sekundarni GBM razvija putem progresije ili

transformacije iz glioma nižeg WHO gradusa (astrocitoma ili oligodendroglioma). Sekundarni

- 4 -

GBM, takođe, ima i niži stepen nekroze, i značajno bolju prognozu [20]. Čak 90%

dijagnostifikovanih GBM su primarni tumori, a preostalih 10% čine sekundarni [13]. Još jedna

razlika između dva pomenuta tipa je srednji broj godina u kojima se dijagnostifikuje oboljenje: 62

za primarni, nasuprot 45 za sekundarni, pa se može zaključiti da se primarni glioblastom javlja

kod starijih osoba [20]. Primarni se češće javlja kod muškaraca, za razliku od sekundarnog gde je

situacija obrnuta [21]. Iako se primarni i sekundarni glioblastom histološki u velikoj meri ne mogu

razlikovati, njihovi se, pak, genetički putevi nastanka jasno razlikuju [20].

1.1.5. Molekularna karakterizacija glioblastoma

U cilju što bolje karakterizacije glioblastoma, neophodno je bilo utvrditi biomarkere

svojstvene ovom tumoru. Ćelije glioblastoma razlikuju se od ostalih ćelija po biomarkerima koji

se kod njih mogu identifikovati. Biomarker predstavlja karakteristiku koja se objektivno može

meriti i biti procenjena kao indikator normalnog biološkog procesa, patološkog procesa ili

farmakološkog odgovora na primenu terapije [22]. Biomarkeri se determinišu iz uzorka

cerebrospinalne tečnosti, seruma ili tkiva tumora (hitopataloške analize, merenje proteina,

RNK/DNK, receptora, antitela).

Biomarkeri mogu podeliti na osnovu primene na dijagnostičke, prognostičke, prediktivne

i farmakodinamične. Dijagnostički biomarkeri se koriste za dokazivanje prisustva tumora i

određivanje njegovog tipa. Prognostički biomarkeri služe za procenu ishoda bolesti sa ili bez

terapije istovremeno dajući informaciju o verovatnoći preživljavanja pacijenta. Prediktivni

biomarkeri daju procenu kako će pacijent reagovati na određenu terapiju i koja je terapija

najbolja za datog pacijenta. Farmakodinamični biomarkeri predstavljaju molekularne markere

koji pokazuju kratkoročni efekat određenog leka na tumor (ili organizam) [23]. Napredak u

genomici i proteomici omogućio je istraživačima da utvrde značajan broj biomarkera

glioblastoma, od kojih će samo najznačajniji biti pomenuti u ovom radu.

Postoje dve glavne kategorije biomarkera: epigenetički i genetički. Pod epigenetičkim

biomarkerima podrazumevamo sve epigenetičke promene koje dovode do nepravilne ekspresije

gena, kao što su: metilacija DNK, modifikacija histona, remodelovanje hromatina ili promena

ekspresije malih nekodirajućih RNK (eng. micro RNA, miRNA - miRNK). Najznačajniji epigenetički

- 5 -

biomarker glioblastoma je hipermetilacija promotora MGMT gena (eng. O6-methylguanine-DNK-

methyltransferase). Genetički biomarkeri su mutirani geni povezani sa nastankom određenih

bolesti, pri čemu mutacije nastaju u okviru sekvence gena ili njegovog promotora. Najznačajniji

geni kao biomarkeri glioblastoma su: EGFR, PTEN, TP53, IDH1, IDH2, TERT.

MGMT je enzim koji učestvuje u reparaciji DNK. Abnormalna metilacija promotora

njegovog gena uzrokuje izostanak ekspresije ovog gena što dovodi do smanjenje sposobnosti

reparacije ćelije i na kraju do ćelijske smrti. Lek Temozolomid (TMZ) koji uzrokuje oštećenja DNK,

koja se u ćelijama sa normalnom funkcijom MGMT uspešno popravljaju, dovodi do smrti

tumorskih ćelija sa ovim poremećajem. Tako, metilovani promotor MGMT služi kao prognostički

i prediktivni biomarker koji ukazuje na ishod hemoterapije i radioterapije [23].

U poslednje vreme često se koristi i nova kategorija epigenetičkih biomarkera, miRNK.

Njihova uloga u nastanku ili progresiji tumora ogleda se u modifikaciji molekularnih puteva

onkogena i tumor supresorskih gena. Promena u koncentraciji miRNK može biti indikator

kancerogeneze [24].

EGFR (eng. epidermal growth factor receptor – receptor epidermalnog faktora rasta) je

tirozin-kinazni receptor lociran na površini ćelije, specifičan za određeni ligand (epidermalni

faktor rasta, EGF), sa ulogom u kontroli puteva koji regulišu ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju i

preživljavanje. U tumorskim ćelijama najčešće dolazi do amplifikacije gena za EGFR, samim tim i

do prekomerne ekspresije. Osim toga, može doći i do mutacije u genu EGFR tipa delecije ili

tačkaste mutacije. Najpoznatija mutacija je delecija egzona 2-7, pri čemu nastaje EGFR vIII,

varijanta ovog receptora koja nema ekstracelularni domen za vezivanje liganda, i koja je stalno

,,uključena”, odnosno konstantno šalje stimulišući signal nizvodno [25]. Najčešće se mutacije i

amplifikacije EGFR zajedno nalaze u genomu tumorskih ćelija [26].

PTEN (eng. phosphatase and tensin homolog – homolog fosfataze i tenzina) je protein

kodiran od strane tumor supresornog PTEN gena, i predstavlja negativni regulator PI3K (eng.

phosphoinositide 3-kinase – fosfoinositid 3-kinaza) puta, jednog od najvažnijih signalnih puteva

koji stimuliše ćelijsku proliferaciju kao odgovor na stimulaciju faktorom rasta [24][26]. Gubitak

funkcije ovog gena nastaje kao rezultat dve promene: delecije dela hromozoma 10, na kome je i

lociran ovaj gen (eng. loss of heterozygosity, LOH 10q) ili mutacije PTEN gena.

- 6 -

TP53 (eng. tumor protein p53 – tumor protein 53) je tumor supresorni gen koji kodira

protein TP53 (poznat i kao p53), često nazivan čuvarom genoma. Ovaj protein učestvuje u

regulaciji ćelijskog ciklusa, ćelijskog odgovora na oštećenja DNK, ćelijskoj smrti i diferencijaciji.

Osim toga, TP53 deluje i kao transkripcioni faktor, regulišući transkripciju ciljanih gena, ili

direktnim uticajem na ciljane proteine, modifikacijom njihove funkcije. Ekspresija TP53 se aktivira

kao odgovor na oštećenje DNK, i dalje aktivira gene čiji produkti učestvuju u reparaciji, ili vodi u

apoptozu ako reparacija nije moguća. Kod tumorskih ćelija glioblastoma ovaj gen je mutiran.

IDH1 i IDH2 (eng. isocitrate dehydrogenase 1/2 – izocitrat dehidrogenaza 1/2) su enzimi

koji katališu reakciju dekarboksilacije izocitrata do α-ketoglutarata (αKG). IDH1 je lokalizovan u

citoplazmi i peroksizomima sa ulogom u zaštiti ćelija od oksidativnog stresa, dok se IDH2 nalazi u

mitohondrijama gde ima ulogu u Krebsovom ciklusu [27]. Mutacija u genima ovih enzima dovodi

do promene funkcije enzima u smislu da oni redukuju α-ketoglutarat u 2-hidroksiglutarat (2-HG)

koji je onkometabolit [24][28]. Produkovani 2-HG kompetitira sa αKG za aktivaciona mesta na

enzimima koji katališu metilaciju DNK, što vodi u hipermetilaciju DNK i finalno u tumorogenezu

[24].

TERT (eng. telomerase reverse trascriptase – reverzna transkriptaza telomeraze) je

katalitička subjedinica enzima telomeraze. Mutacija u regionu promotora istoimenog gena

primećena je kod ćelija glioblastoma, a takođe se povezuje sa povećanom ekspresijom i

aktivnošću telomeraze [29].

Kako su određeni biomarkeri svojstveni primarnom, odnosno sekundarnom glioblastomu,

njihovom analizom moguće je utvrditi o kom tipu glioblastoma je reč. Najznačajniji biomarkeri

primarnih glioblastoma su:

1. hipermetilacija promotora gena za MGMT

2. amplifikacija i mutacija gena za EGFR

3. mutacija gena za PTEN i LOH 10q,

dok sekundarne glioblastome karakterišu:

1. mutacija tumor supresornog gena za protein p53 (TP53)

2. mutacija gena za IDH1

- 7 -

U Tabeli 1. dat je prikaz glavnih genetičkih markera primarnih i sekundarnih glioblastoma

(GBM).

Tabela 1. Genetičke abnormalnosti i glavni signalni putevi uključeni u patogenezu GBM [26].

Genetičke abnormalnosti Učestalost (%) Glavni izmenjeni signalni putevi

Sekundarni GBM

IDH mutacija 60-80 Metabolizam

TP53 mutacija 65 Put p53

PTEN gubitak 4 PI3K signalni put

Primarni GBM

TERT mutacija promotora 60-80 Održavanje telomera

PTEN gubitak 36-41 PI3K signalni put

TP53 mutacija 28-35 Put p53

EGFR vIII 25-50 RTK* signalni put

EGFR amplifikacija 36-60 RTK signalni put

*RTK: (eng. receptor tyrosine kinase) receptor tirozin-kinaza

1.1.6. Lečenje

Lečenje GBM podrazumeva primenu hiruških metoda, radioterapije i hemoterapije, kao i

njihovu kombinaciju. Standardna terapija za GBM podrazumeva maksimalno moguću hirušku

resekciju praćenu kombinacijom radioterapije i hemoterapije TMZ-om, nakon čega se primenjuje

samo hemoterapija TMZ-om [30]. Komparativne studije uticaja različitih terapeutskih agenasa

pokazale su da je temozolomid lek koji omogućava najduže prosečno vreme preživljavanja

pacijenata [13].

GBM je poznata po heterogenosti svojih ćelija kao i njihovoj jakoj rezistenciji na lekove.

Ako se na to doda ograničavajući efekat lekova zbog postojanja krvno-moždane barijere, veoma

opasna lokalizacija tumora, kao i to da sve navedeno dovodi do recidiva nakon lečenja, lako je

zaključiti da je GBM jedan od najsmrtonosnijih kancera.

- 8 -

1.2. Hromatografija

Pod hromatografijom podrazumevamo skup analitičkih tehnika za detektovanje,

separaciju i kvantitativno determinisanje uzoraka na osnovu razlika u fizičkim karakteristikama

njegovih konstituenata, odnosno razlika u njihovoj molekularnoj masi, obliku, naelektrisanju,

isparljivosti, rastvorljivosti i/ili adsorptivnosti. Hromatografski se mogu analizirati: gasovi,

neorganski joni, makromolekuli (polisaharidi, proteini, nukleinske kiseline, lipidi), odnosno

njihove gradivne komponente (monosaharidi, aminokiseline, nukleotidi, masne kiseline),

vitamini, lekovi, droge, steroidi, etarska ulja biljaka, bakterije, virusi, itd [31].

Primenu hromatografskih tehnika omogućava sistem za hromatografiju koji se sastoji iz:

mobilne faze, stacionarne faze, hromatografskog ležišta, sistema za isporuku mobilne faze i

detekcionog sistema. Suština ovih tehnika ogleda se u tome da se uzorak (smeša molekula koje

treba razdvojiti) rastvara u tečnosti ili gasu, koji predstavljaju mobilnu ili pokretnu fazu, i koji nose

uzorak do i kroz odabranu podlogu (matriks) tj. stacionarnu ili nepokretnu fazu (solidni matriks,

gel ili imobiliziranu tečnosti). Razdvajanje zavisi od različitog stepena fizičke interakcije izmedju

pojedinačnih komponenti uzorka i stacionarne faze sistema. Komponenta uzorka koja ima veći

afinitet prema stacionarnoj nego prema mobilnoj fazi sporije napreduje kroz hromatografski

sistem nego komponenta suprotnog afiniteta. Ova pojava dovodi do toga da komponenta sa

većim afinitetom prema mobilnoj fazi zajedno sa njom brzo prodje kroz sistem, dok komponenta

koja interaguje sa stacionarnom fazom ostaje u sistemu, iz koga se kasnije, po potrebi, ekstrahuje.

Može se konstatovati da stepen finalnog razdvajanja individualnih komponenti uzoraka zavisi od

karakteristika mobilne i stacionarne faze, karakteristika analiziranih molekula u mobilnoj fazi,

karakteristika porozne podloge i dinamike protoka [31].

Hromatografsko ležište može biti: staklena ili metalna kolona u kojoj je stacionarna faza

napakovana, staklena ili plastična folija na koju je stacionarna faza naslonjena ili celulozna vlakna

koja adsorbuju stacionarnu fazu. Sistem za isporuku sprovodi mobilnu fazu ka i kroz

hromatografsko ležište, dok detekcioni sistem služi za vizuelizaciju razdvojenih komponenti po

završetku hromatografije [31].

Podela hromatografskih tehnika izvršena je na osnovu fizičko-hemijskih procesa koji

dovode do razdvajanja komponenti uzorka (površinske adsorpcije, molekularnog afiniteta,

- 9 -

podele tečnosti, jonske izmene, gel filtracije ili hidrofobnih interakcija) i to na: adsorpcionu

hromatografiju, afinitetnu hromatografiju, particionu hromatografiju, jonoizmenjivačku

hromatografiju, gel filtraciju i hidrofobno-interakcionu hromatografiju [31]. U daljem tekstu biće

reči samo o adsorpcionoj hromatografiji koja je primenjena u našem eksperimentalnom radu.

1.2.1. Adsorpciona hromatografija

Adsorpciona hromatografija predstavlja vid tečno-čvrste hromatografije (Slika 1).

Stacionarna faza je porozna čvrsta supstanca u koloni ili tankoslojnoj formi koja apsorbuje

molekule uzorka na osnovu dipol-dipol interakcija, vodoničnih veza i/ili van der Valsovih sila.

Većina adsorbenata se pre upotrebe aktivira zagrevanjem na 110 - 120°C, čime se uklanjaju

eventualni molekuli vode koji bi značajno smanjili adsorpcioni kapacitet [31].

Izbor adsorbenta zavisi od prirode komponenti uzorka koji se analizira. Za nepolarne

molekule koriste se nepolarni adsorbenti kao što su drveni ugalj i polistiren-divinilbenzin, dok se

za polarne molekule upotrebljavaju polarni adsorbenti. Najpoznatiji primer polarnog adsorbenta

je hidroksiapatit koji vezuje biomolekule kao što su proteini i nukleinske kiseline. Bazni molekuli

zadržavaju se na kiselo-polarnim adsorbentima poput silika gela, a kiseli molekuli na bazno-

polarnim adsorbentima kao što je alumina (Al2O3), mada se u prisustvu pufera visoke jonske

jačine kiseli molekuli, kao što je DNK, mogu adsorbovati na silika gelu. Silika gel i alumina takođe

se koriste za izdvajanje fosfolipida, sterola i karotenoida iz smeša.

Uzorak, rastvoren u mobilnu fazu, nanosi na adsorpcionu kolonu, gde se molekuli odvajaju

na osnovu njihovog afiniteta za mobilnu, odnosno stacionarnu fazu. Adsorbovani molekuli se

spiraju (eluiraju, desorbuju) sa adsorbenta ispiranjem kolone odgovarajućim rastvaračima. Na

primer, molekuli proteina i nukleinskih kiselina vezani različitim afinitetom za kolonu

hidroksiapatita se sekvencijalno eluiraju primenom serije fosfatnih pufera sa sve većom jonskom

jačinom, tako da se prvo oslobađaju molekuli koji su slabije adsorbovani, a zatim oni koji su jače

vezani za kolonu. Fosfolipidi, steroli i karotenoidi razdvojeni na silika gelu ili alumini se spiraju

nepolarnim rastvaračima, kao što su hloroform, heksan ili etil etar ili smešom naedenih

rastvarača u zavisnosti od toga koja se supstanca želi izolovati [31].

- 10 -

Slika 1. Šema adsorpcione hromatografije [32]

1.2.2. Primena adsorpcione hromatografije

Različiti kitovi za izolaciju DNK (ili RNK) baziraju se upravo na primeni adsorpcione

hromatografije za izdvajanje nukleinske kiseline iz različitih uzoraka. Jedan od takvih jeste

QIAamp® DNK Mini Kit koji, pored pufera različitog sastava i jonske jačine i proteinaze K, sadrži i

kolone za hromatografiju (kao i kolekcione tube) nalik onim prikazanim na slici 2. U okviru kolone

nalazi se filter baziran na principu silika gel membrane. Ceo proces podrazumeva tri koraka:

vezivanje-ispiranje-elucija. Kako su i DNK i membrana negativno naelektrisani, neophodni su

odgovarajući puferi kako bi se DNK vezala za membranu. U puferu za vezivanje prisutne su

haotropne soli koje uklanjaju hidratisani omotač oko molekula DNK, što omogućava velikom

broju naelektrisanih jona da posreduje u vezivanju formirajući most između negativno

naelektrisane membrane i nukleinske kiseline. Ispiranje se takodje može vršiti puferima velike

jonske jačine, dok se elucija vrši puferima male jonske jačine ili puferima bez prisustva soli [33].

Slika 2. Kolona za hromatografiju (desno) i kolekciona tuba (levo) [34]

- 11 -

2. Cilj rada

Prvi korak u determinaciji i kvantifikaciji biomarkera glioblastoma je njegova izolacija. Cilj

ovog rada je određivanje optimalnih parametara za što efikasniju ekstrakciju, adsorpciju i eluciju

DNK iz uzoraka tumora glioblastoma.

- 12 -

3. Materijal i metode

3.1. Materijal

U ovom radu korišćeni su uzorci tumora mozga pacijenta (Tabela 2.) uzeti tokom operacije

i odmah zamrznuti u tečnom azotu. Uzorci su čuvani na -80°C.

Tabela 2. Podaci o eksperimentalnom materijalu

Pacijent Starost Dijagnoza Dužina života nakon operacije

21A 58 godina GBM, recidiv 4 meseca

Napomena: Istraživanje je obavljeno u okviru internog projekta Medicinskog fakulteta

pod nazivom ,,Molekularna dijagnostika glioblastoma“ (ev. br. 36; rukovodilac doc. dr. Vesna

Nikolov). Ovaj projekat se realizuje u saradnji sa Laboratorijom za molekularnu laboratoriju

(Prirodno-matematički fakultet u Nišu), Klinikom za neurohirurgiju (Klinički centar Niš), Centrom

za patologiju i patološku anatomiju (Klinički centar Niš) i Laboratorijom za funkcionalnu genomiku

i proteomiku (Medicinsku fakultet u Nišu). Projekat je odobren od strane Etičkog komiteta

Medicinskog fakulteta (odluka br. 01-2113-10, od 01.04.2013. godine). Pacijenti koji su

učestvovali u istraživanju su bili upoznati sa njegovom namenom i potpisali saglasnost da se

uzorak njihovog tumorskog tkiva koristi u ovom projektu.

- 13 -

3.2. Metode

3.2.1. Izolovanje genomske DNK upotrebom QIAamp® DNK Mini Kit

Polazni materijal uziman je iz Banke tumora mozga na Medicinskom fakultetu u Nišu i

transportovan IsoThermSystem®-om (Eppendorf, Nemačka) do Laboratorije za molekularnu

biologiju PMF-a u Nišu.

Najpre su pripremljene mikroepruvete (Eppendorf® Safe-Lock microcentrifuge tubes, 1,5

ml) sa po 80 µl hladnog 1xPBS-a (eng. phosphate-buffered saline – fosfatni pufer)(170 mM NaCl,

3,3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,0) i stavljene u led. Uzorak tkiva je brzo

prebacivan iz IsoThermSystem® bloka u Petri šolju na ledu i u njoj skalpelom sečen na komade

željene veličine koji su odmeravani na analitičkoj vagi (KERN ALS 120-4N, Nemačka). U ovom

istraživanju korišćeni su uzorci tumora težine približno 12,5 mg i 25 mg u duplikatu.

Iz odmerenih uzoraka tkiva izolovana je genomska DNK upotrebom QIAamp® DNK Mini

Kit-a (QIAGEN Inc., Nemačka) po protokolu koji je objašnjen u priručniku koji dolazi uz kit [35].

Prema preporuci proizvođača, maksimalna količina tkiva je 25 mg. Za tkivo mozga, količine 25

mg, optimalan prinos je 35-60 µg nukleinske kiseline, bez tretmana RNazom A, odnosno 15-30 µg

DNK, uz tretman RNazom A.

Tkivo odmereno u epruvetama je homogenizovano upotrebom mehaničkog

homogenizera, nakon čega je dodato 100 µl ATL pufera i 20 µl proteinaze K. Tako pripremljen

uzorak je lagano izmešan na vorteksu (Heidolph™ Reax Top Vortex Mixer, Nemačka) a potom

inkubiran je u termomikseru (Thermomixer comfort, Eppendorf, Nemačka) na 56 °C u trajanju od

3 h. Dva uzorka, jedan sa većom i jedan sa manjom količinom tkiva, tretirana su RNazom A, dok

druga dva nisu. Tretman je podrazumevao dodavanje 4 µl RNaze A, lagano mešanje, a potom

inkubiranje na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 min. Po isteku datog perioda, u sve četiri

epruvete dodato je 200 µl AL pufera, smeša je lagano promešana, a potom inkubirana u

termomikseru na 70 °C u trajanju od 10 min, bez mešanja. Nakon inkubacije dodato je 200 µl

etanola i lagano promešano na vorteksu. Ova smeša je prebačena na kolonu (Slika 2), prethodno

smeštenu u kolekcionoj tubi (2ml). Kolekcione tube sa kolonama su centrifugirane u

mikrocentrofugi (MiniSpin, Eppendorf, Nemačka) 1 min na 8000 rpm. Kolona je prebačena u novu

- 14 -

kolekcionu tubu, a filtrat odbačen. Potom je u kolonu dodato 500 µl AW1 pufera za ispiranje, pa

se ponovo pristupilo centrifugiranju na 8000 rpm u trajanju od 1 min. Kolona je prebačena u novu

kolekcionu tubu, a fitrat odbačen. Isti postupak ponovljen je sa puferom AW2 (500 µl), uz

centrifugiranje u trajanju od 3 min na 14000 rpm. Filtrat je odbačen, a kolona prebačena u novu

mikroperuvetu (1,5 ml). Elucija je izvedena dodavanjem 200 µl AE pufera u kolonu, inkubiranjem

1 min na sobnoj temperaturi, i nakon toga i centrifugiranjem na 8000 rpm, 1min. Elucija je

ponovljena još dva puta, pa su ukupno dobijena 3 eluata.

- 15 -

3.2.2. Prečišćavanje DNK metodom etanolne precipitacije

U eluate DNK su dodati 0,1V 3M Na acetata pH 5,2 i 2V 100% ledenog etanola (-20 °C).

Smeša je inkubirana preko noći u zamrzivaču na -20 °C. Nakon toga smeša je centrifugirana 15

min na 13000 rpm na 4 °C (Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Nemačka). Odliven je supernatant, a

dobijeni talog DNK rastvoren u 2V 70% etanola. Proces centrifugiranja je ponovljen pod istim

uslovima, supernatant odliven a talog DNK osušen u termomikseru [36]. DNK je rastvorena u 40

µl ddH2O i čuvana u zamrzivaču na -20 °.

3.2.3. Provera intaktnosti genomske DNK metodom elektroforeze na agaroznom gelu

Kvalitet i kvantitet izolovane genomske DNK određivan je elektroforezom na 1%

agaroznom gelu [37]. Za pripremu gela korišćen je pufer 1xTAE (Tris, acetat, EDTA)(40 mM TRIS-

acetat, 1 mM EDTA, pH 8,0), koji je takođe korišćen i tokom elektroforeze. Etidijum bromid je

korišćen za obeležavanje DNK i njenu kasniju vizualizaciju, a dodavan puferu u koncentraciji od

0,5 µg/ml. Po 5 µl svakog eluata, najpre je mešano sa 1 µl 10x puferom za uzorak (0,5 M TRIS pH

7,5, 0,05 M EDTA pH 8,0, 70% saharoza, 1% bromfenol plavo), a potom nanošeno na gel.

Elektroforeza je tekla pri konstantnom naponu od 1-10 V/cm gela, tokom 2h. Za određivanje

veličine DNK na gelu korišćen je sledeći standard:

,,SERVA DNK Standard λ x BstE II“ (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany):

DNK λ faga obrađena BstEII enzimom, pri čemu su dobijeni sledeći fragmenti: 8.543,

7.242, 6.369, 5.687, 4.822, 4.324, 3.675, 2.323, 1.929, 1.371, 1.264, 702, 224 i 117 bp.

Nakon elektroforeze, gel je posmatran na UV transiluminatoru sa sistemom za

fotodokumentaciju (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, Francuska).

- 16 -

3.2.4. Određivanje koncentracije DNK spektrofotometrijskom metodom

Koncentracija DNK određivana je spektrofotometrijski na dva načina: standardnim UV/VIS

spektrofotometrom (Spectrophotometer UV-1650PC, Shimadzu, Japan) i aparatom nanodropom

(BioSpec-nano, Shimadzu, Japan).

U standardnoj UV/VIS spektrofotometrijskoj metodi uzorak je meren u kvarcnim

kivetama. Kao slepa proba (blank) korišćena je dejonizovana voda, a uzorak je razblaživan 30

puta. Optička gustina (OD), odnosno apsorbancija (A), merene su na talasnim dužinama od 260

nm i 280 nm. Koncetracija DNK u uzorku određivana je po formuli:

𝑂𝐷260𝑢𝑧𝑜𝑟𝑘𝑎 × 50 × 30 = [𝐷𝑁𝐾](𝑛𝑔/µ𝑙)

pri čemu 50 potiče od poznate vrednosti: 1 OD260 = 50 ng/µl za DNK, dok 30 predstavlja faktor

razblaženja DNK u vodi [31].

Odnos između vrednosti optičkih gustina na 260 nm i 280nm uzorka daje informaciju o

čistoći uzorka, a računao se po formuli:

𝑂𝐷260

𝑂𝐷280= n

Ako je vrednost stepena čistoće uzorka (n) veća od 1,8, uzorak se smatra čistim i kvalitetnim.

Izolati DNK koji imaju u sebi nečistoće (proteine, soli, itd.) imaju vrednost n ≈ 1,5 i moraju se

dodatno prečistiti.

Merenje optičke gustine na nanodropu podrazumevalo je upotrebu minimalne količine

nerazblaženog uzorka DNK (2 µl). Uzorak je nanošen u vidu kapi direktno na ležište u aparatu.

Nanodrop je automatski očitavao optičku gustinu uzorka na 260 nm i 280 nm i uz pomoć softvera

određivao njegovu koncentraciju i stepen čistoće.

- 17 -

3.2.5. Određivanje koncentracije DNK uz pomoć ImageJ softvera

ImageJ je softver razvijen u američkom Nacionalnom institutu za zdravlje (eng. National

Institute of Health, NIH), i služi za obradu fotografija u načne svrhe [38]. Fotografije koje su

obrađivane u ovom programu su dobijene slikanjem gela nakon elektroforeze. Upoređivanjem

intenziteta traka standarda i izolovane DNK, uz pomoć pomenutog softvera, definisana je veličina

i količina izolovane DNK.

- 18 -

4. Rezultati i diskusija

4.1. Provera intaktnosti izolovane genomske DNK na gelu

Genomska DNK izolovana je iz ćelija tumora pacijenta obolelog od glioblastoma, a njena

intaktnost, a kasnije i koncentracija, proverena je elektroforezom na 1% agaroznom gelu.

+

Na osnovu analize gela može se zaključiti da je izolovana DNK u velikoj meri ostala

očuvana, odnosno da je kvalitet zadovoljavajući. O tome svedoči činjenica da je DNK na gelu

raspoređena u vidu jasno uočljivih traka u nivou najdužih fragmenata markera. Pojava ,,smiraʼʹ

(eng. smear – bris, mrlja, premaz) na gelu može se objasniti na više načina. Ako je u uzorku, pored

DNK, prisutna i RNK, to će se manifestovati u vidu ,,smirovaʺ (ili traka ukoliko je reč o većoj

količini) u donjem delu gela. Oni se, na Slici 3, jasno mogu uočiti kod uzoraka koji nisu tretirani

M Ia1 Ia2 Ia3 Ib1 Ib2 Ib3 IIa1 IIa2 IIa3 IIb1 IIb2 IIb3

Slika 3. Provera kvaliteta izolovane genomske DNK na 1% agaroznom gelu.

(M – DNK marker λ/BstE II; I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b – uzorak mase ≈ 12,5 mg; 1,2,3 – broj eluata. Napomena: tokom procesa izolacije došlo je do prosipanja dela eluata Ia1, tj. smanjenja njegove količine, što objašnjava slabiji signal na gelu.)

- 19 -

RNazom (sa oznakom II), što ukazuje na značaj ovog tretmana za dobijanje DNK visoke čistoće

prilikom izolacije.

Pojava ,,smiraʼʹ neposredno ispod jasno izdvojene trake genomske DNK govori o njenoj

delimičnoj degradaciji (Slika 3). Jedan od mogućih razloga degradacije je čuvanje uzorka tkiva na

-20 °C, kao i više puta ponovljeni procesi njegovog odmrzavanja i zamrzavanja. Uzorak koji je

korišćen u ovom eksperimentu odmrzavan je ukupno tri puta, a između poslednja dva

odmrzavanja čuvan je u RNAlater-u godinu dana. Osim toga i sam protokol za izolaciju može biti

uzrok degradacije usled koraka kao što su centrifugiranje, vorteksiranje i sličnih mehaničkih

delovanja. Izolaciju treba završiti u što kraćem vremenskom periodu jer sa dužinom manipulacije

DNK molekulom raste i verovatnoća njegovog oštećenja. Pojava ,,smiraʼʹ iznad trake uobičajena

je kada je prevelika količina DNK naneta na gel (eng. overloading – pretovarenje). Intaktna

visokomolekularna DNK ostaje u bunarčićima.

- 20 -

4.2. Određivanje koncentracije izolovane DNK sa agaroznog gela

upotrebom ImageJ softvera

Fotografija gela, snimljena nakon elektroforeze, analizirana je u programu ImageJ i

dobijene su vrednosti koncetracije eluata prikazane u Tabeli 3. Količina DNK u eluatima

determinisana je na osnovu poznatih vrednosti količine DNK u standardu.

Tabela 3. Koncetracija DNK izračunata sa agaroznog gela uz pomoć programa ImageJ

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg;

b – uzorak mase ≈ 12,5 mg; 1,2,3 – broj eluata)

Eluat Koncentracija DNK (ng/µl)

Ia1 24,19*

Ia2 99,33

Ia3 24,72

Ib1 97,31

Ib2 88,80

Ib3 88,47

IIa1 154,36

IIa2 99,71

IIa3 35,67

IIb1 103,26

IIb2 105,37

IIb3 44,02

* prilikom izolacije veći deo eluata je greškom izgubljen

- 21 -

4.3. Određivanje koncentracije izolovane DNK spektrofotometrijskom

metodom

Koncentracija DNK nakon izolacije merena je i spektrofotometrijskom metodom, i to

upotrebom dva aparata: standardnog UV/VIS spektrofotometra i nanodropa. Rezultati tih

merenja su prikazani u Tabelama 4 i 5 i upoređeni sa rezultatima dobijenim obradom signala na

gelu ImageJ softverom.

Tabela 4. Uporedni prikaz koncentracija izračunatih standardnim UV/VIS spektrofotometrom,

nanodropom i ImageJ-om i njihovih međusobnih odnosa za uzorke tretirane RNazom A.

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b – uzorak mase ≈ 12,5 mg

1,2,3 – broj eluata)

Eluat Spektrofotometar

(ng/µl)

Nanodrop

(ng/µl)

ImageJ

(ng/µl)

Spektrofot./

ImageJ

Nanodrop/

Spektrofot.

Nanodrop/

ImageJ

Ia1 112,50* 123,87* 24,19* 4,65 1,10 5,12

Ia2 166,50 401,81 99,33 1,68 2,40 4,05

Ia3 34,50 269,87 24,72 1,40 7,80 10,92

Ib1 250,50 450,76 97,31 2,57 1,80 4,63

Ib2 187,50 546,08 88,80 2,11 2,90 6,15

Ib3 57,00 154,48 88,47 0,64 2,70 1,75

Prosek odstupanja vrednosti:

2,18

3,10

5,43

* prilikom izolacije veći deo eluata je greškom izgubljen

Najviše vrednosti koncentracije izolovane DNK izmerene su na nanodropu, sa značajnim

odstupanjima u odnosu na vrednosti dobijenim drugim dvema metodama. Najveće odstupanje u

vrednostima zabeleženo je između nanodropa i analize gela uz pomoć ImageJ softvera (prosečno

se dobija 5,43 puta veća vrednost na nanodropu). Primećeno je i da se odnosi između

koncentracija različitih eluata mogu razlikovati u zavisnosti od primenjene metode.

- 22 -

Tabela 5. Uporedni prikaz koncentracija izračunatih standardnim UV/VIS spektrofotometrom,

nanodropom i ImageJ-om i njihovih međusobnih odnosa za uzorke koji nisu tretirani RNazom A.

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b – uzorak mase ≈ 12,5 mg;

1,2,3 – broj eluata)

Eluat Spektrofotometar

(ng/µl)

Nanodrop

(ng/µl)

ImageJ

(ng/µl)

Spektrofot./

ImageJ

Nanodrop/

Spektrofot.

Nanodrop/

ImageJ

IIa1 717,00 2186,70 154,36 4,65 3,00 14,17

IIa2 375,00 1157,50 99,71 3,76 3,10 11,61

IIa3 168,00 246,93 35,67 4,71 1,50 6,92

IIb1 439,50 1073,36 103,26 4,26 2,40 10,40

IIb2 453,00 1285,20 105,37 4,30 2,80 12,20

IIb3 244,50 550,73 44,02 5,55 2,30 12,51

Prosek odstupanja vrednosti:

4,54

2,50

11,30

Rezultati prikazani u Tabeli 5 pokazuju istu pravilnost kao i rezultati prikazani u prethodnoj

tabeli. Najviše vrednosti koncentracije izolovane DNK, i u ovom slučaju, izmerene su na

nanodropu. Odstupanje u dobijenim vrednostima koncentracije između nanodropa i ImageJ-a je,

kod uzoraka koji nisu tretirani RNazom, još izraženije jer se primenom prve metode dobijaju

prosečno 11,30 puta veće vrednosti.

Razlog ovako velikih odstupanja u podacima između metoda može se objasniti time da

nanodrop u uzorku meri pored DNK i RNK, oligonukleotide i slobodne nukleotide, dok se uz

pomoć ImageJ softvera mere samo jasno definisane trake DNK, a pomenute nečistoće se tokom

elektroforeze na gelu razdvoje od ovih traka. Činjenica je i da intaktna, visokomolekularna DNK

ostaje u bunarićima gela, pa tako ne ulazi u proračun prinosa i koncentracije izolovane DNK uz

pomoć ImageJ softvera. Time se dobija nešto manja vrednost pomenutih parametara primenom

ove metode.

Osim toga, može se primetiti da uzorci koji nisu tretirani RNazom pokazuju značajno veće

vrednosti kod obe spektrofotometrijske metode. Ovo činjenica se može proveriti upoređivanjem

vrednosti koncentracije bilo koja dva uzorka iste mase i istog rednog broja eluata, pri čemu je

- 23 -

jedan tretiran RNazom A, drugi ne (npr. Ib1 i IIb1). Razlog je RNK prisutna u uzorku koja apsorbuje

svetlost na istoj talasnoj dužini kao i DNK.

4.4. Utvrđivanje prinosa DNK variranjem količine polaznog materijala

U eksperimentalnom radu, kao polazni materijal, korišćeni su uzorci tumora težine

približno 12,5 mg i 25 mg, u duplikatu, pri čemu je po jedan od uzoraka iste težine tretiran

RNazom A. Ukupan prinos DNK po uzorku tumora dat je u Tabeli 6.

Tabela 6. Ukupan prinos DNK po uzorku tkiva tumora

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b – uzorak mase ≈ 12,5 mg)

Uzorak Spektrofotometar (µg) Nanodrop (µg) ImageJ (µg)

Ia 29,37 50,35 9,55

Ib 19,80 46,05 10,98

IIa 50,40 143,65 11,59

IIb 45,48 116,37 10,11

U priručniku koji dolazi uz korišćeni kit za izolaciju definisan je očekivani prinos DNK u

zavisnosti od tipa tkiva iz kog je izolovana. Za tkivo mozga mase 25 mg, bez tretmana RNazom A

očekuje se prinos 35-60 µg, dok je očekivani prinos sa tretmanom RNazom A manji i kreće se od

15-30 µg [35]. Ove vrednosti se u potpunosti poklapaju vrednostima prinosa dobijenih pod

ekvivalentnim kriterijumima na standardnom UV/VIS spektrofotometru (naznačeni u Tabeli 6).

- 24 -

Tabela 7. Prinos izolovane DNK izražen po mg tkiva

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b – uzorak mase ≈ 12,5 mg)

Uzorak Spektrofotometar (µg) Nanodrop (µg) ImageJ (µg)

Ia 1,18 2,03 0,39

Ib 1,65 3,84 0,92

IIa 1,99 5,68 0,46

IIb 3,55 9,09 0,79

Što se tiče efekta variranja količine početnog materijala, primećena je pravilnost u vidu

većeg prinosa po jedinici tkiva kod uzoraka manje polazne količine (≈ 12,5 mg) (Tabela 7). To se

može objasniti boljom homogenizacijom uzorka, efikasnijom lizom ćelija i ograničenim

kapacitetom kolone. Ćelijski detritus iz uzoraka sa većom količinom tkiva može dovesti do

delimičnog ,,začepljenjaʺ kolone.

Tabela 8. Odnos prinosa uzorka tumora 25 mg prema prinosu uzorka od 12,5 mg.

Uzorak tretiran RNazom A Spektrofotometar Nanodrop ImageJ

DA 1.48 1.09 0.87

NE 1.11 1.23 1.15

Povećanje početne količine uzorka dva puta nije ni u jednom slučaju rezultovalo

proporcionalno većim prinosom. Najveća razlika između prinosa uzorka od 25 mg i 12,5 mg

izmerena je na spektrofotometru za uzorke koji su tretirani RNazom A i iznosi 1,48 puta.

- 25 -

Tabela 8. Stepen čistoće izolata genomske DNK iz glioblastoma determinisan nanodrop

spektrofotometrijskom metodom.

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b – uzorak mase ≈ 12,5 mg)

Eluat Čistoća DNK (OD 260 nm/280 nm)

Ia1 1.94

Ia2 1.90

Ia3 2.33

Ib1 1.97

Ib2 1.95

Ib3 1.98

IIa1 2.07

IIa2 1.98

IIa3 2.00

IIb1 2.02

IIb2 2.01

IIb3 1.95

Finalno, nakon određivanja koncentracije i prinosa DNK u izolatima iz uzorka tumora,

determinisan je i stepen njihove čistoće (Vidi: Materijal i metode). Utvrđeno je da je bez obzira

na tretman RNazom stepen čistoće zadovoljavajući, odnosno veći od 1,8 (Tabela 8).

- 26 -

4.5. Utvrđivanje gubitka DNK na silika gel membrani

Završni korak u izolaciji DNK uz pomoć hromatografske kolone jeste ispiranje (elucija)

nukleinske kiseline vezane za silika gel membranu. Neophodno je bilo ustanoviti da li posle prve

elucije na membrani ostane značajna količina DNK koja se gubi ukoliko se postupak elucije ne

ponovi. Iz tog razloga elucija je ponovljena po tri puta za svaki uzorak a rezultati su prikazani na

Graficima 1, 2 i 3.

Grafik 1. Prinos izolovane genomske DNK po eluciji, meren na spektrofotometru.

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b –

uzorak mase ≈ 12,5 mg; 1,2,3 – broj eluata)

Na Grafiku 1 uočava se pravilnost da je prinos uvek najmanji u trećem eluatu, dok po

istom kriterijumu dominira prvi eluat. U jednom slučaju, u drugom eluatu je bilo čak više DNK

nego u prvom.

0

5

10

15

20

25

30

Ia1 Ia2 Ia3 Ib1 Ib2 Ib3 IIa1 IIa2 IIa3 IIb1 IIb2 IIb3

Pri

no

s (µ

g)

Eluat

- 27 -

Grafik 2. Prinos izolovane genomske DNK po eluciji, meren na nanodropu.

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b – uzorak

mase ≈ 12,5 mg; 1,2,3 – broj eluata)

Na Grafiku 2 uočava se slična pravilnost u dobijenim rezultatima kao na prethodnom

grafiku, s tim da su značajno veće vrednosti izmerene kod uzoraka koji nisu tretirani RNazom A.

Grafik 3. Prinos izolovane genomske DNK po eluciji, meren uz pomoć ImageJ sofvtera.

(I – uzorak tretiran RNazom A; II – uzorak koji nije tretiran RNazom A; a – uzorak mase ≈ 25 mg; b – uzorak

mase ≈ 12,5 mg;1,2,3 – broj eluata)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Ia1 Ia2 Ia3 Ib1 Ib2 Ib3 IIa1 IIa2 IIa3 IIb1 IIb2 IIb3

Pri

no

s(µ

g)

Eluat

0

1

2

3

4

5

6

7

Ia1 Ia2 Ia3 Ib1 Ib2 Ib3 IIa1 IIa2 IIa3 IIb1 IIb2 IIb3

Pri

no

s (µ

g)

Eluat

- 28 -

I pored malog odstupanja u merenjima u odnosu na prethodne dve metode, koje se

ogleda u većem izmerenom prinosu u trećem eluatu uzorka Ib, i na osnovu Grafika 3 može se

potvrditi visok prinos u prvom i drugom eluatu.

U već pomenutom priručniku za izolaciju DNK uz pomoć QIAamp® DNK Mini Kit-a

navedene su vrednosti prinosa DNK iz određenog tkiva nakon svake od tri elucije. Za tkivo mozga

mase 25 mg nakon prve elucije očekuje se 20-30 µg DNK, nakon druge 10-20 µg DNK a nakon

treće elucije 5-10 µg DNK (ukupno 35-60 µg DNK). Ove vrednosti važe za postupak izolacije

izveden bez tretmana RNazom A, i u potpunosti se poklapaju sa adekvatnim vrednostima za

uzorke koji su na Grafiku 1 označeni sa IIa, a mereni su na spektrofotometru.

Na osnovu podataka iz Grafika 1, 2 i 3 može se zaključiti da se značajna kolilčina DNK

zadržava na membrani nakon prve elucije, pa se nakon druge sa membrane spira količina DNK

koja nije zanemarljiva, čak u nekim slučajevima i veća nego nakon prve elucije. U trećem eluatu

uvek ostaje najmanja količina DNK, što je i očekivano. Ukoliko je cilj izolacije visok prinos DNK,

preporučljivo je raditi minimum tri elucije.

- 29 -

5. Zaključci

Rezultati dobijeni tokom ovog istraživanja navode na sledeće zaključke:

1. Genomska DNK izolovana upotrebom QIAamp® DNK Mini Kit-a za izolaciju je dobrog kvaliteta

i može se koristiti u daljim manipulacijama.

2. Postoji značajna razlika u vrednostima koncentracije izolovane DNK između tri metode

merenja korišćene u ovom radu. Najveće vrednosti koncentracije DNK su zabeležene na

nanodropu (čak do 11,3 puta više u odnosu na koncentracije dobijene primenom ImageJ

softvera), a najmanje na agaroznom gelu.

3. Tretman RNazom A prilikom izolacije DNK iz tkiva glioblastoma značajno utiče na smanjenje

RNK u izolatu.

4. Korišćenje dva puta veće polazne količine uzorka tumora nije rezultiralo proporcionalnim

povećanjem prinosa DNK u izolatu, već nešto manjim od očekivanog.

5. Prinos izolovane DNK, izražen po mg tkiva, veći je kod uzoraka tumora količine 12,5 mg u

odnosu na duplo veću količinu tumora.

6. Kombinacija QIAamp® DNK Mini Kit-a za izolaciju i etanolne precipitacije daje izolat DNK

visoke čistoće.

7. Značajna količina DNK ostaje vezana za silika gel membranu nakon prve elucije. Ukoliko je cilj

izolacije visok prinos DNK, preporučljivo je ponoviti postupak elucije minimum dva puta, a

treća elucija bi bila poželjna.

- 30 -

6. Literatura

[1] D. A. Forst, B. V. Nahed, J. S. Loeffler, and T. T. Batchelor, “Low-Grade Gliomas,” Oncologist, vol. 19, no. 4, pp. 403–413, Apr. 2014.

[2] D. N. Louis et al., “The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system.,” Acta Neuropathol., vol. 114, no. 2, pp. 97–109, Aug. 2007.

[3] A. Sarkar and E. A. Chiocca, “Glioblastoma and Malignant Astrocytoma,” in Brain Tumors, 2012, pp. 384–407.

[4] H. Ohgaki and P. Kleihues, “Epidemiology and etiology of gliomas,” Acta Neuropathol., vol. 109, no. 1, pp. 93–108, Jan. 2005.

[5] R. V Ilić, “PROGNOSTIČKI FAKTORI I SAVREMENI TERAPIJSKI PRISTUP LEČENJU PACIJENATA OBOLELIH OD MULTIFORMNOG GLIOBLASTOMA” (Doktorska disertacija). Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet, 2017.

[6] D. Krex et al., “Long-term survival with glioblastoma multiforme,” Brain, vol. 130, no. 10, pp. 2596–2606, Oct. 2007.

[7] I. Chakrabarti, M. Cockburn, W. Cozen, Y.-P. Wang, and S. Preston-Martin, “A population-based description of glioblastoma multiforme in Los Angeles County, 1974-1999,” Cancer, vol. 104, no. 12, pp. 2798–2806, Dec. 2005.

[8] H. Adams, K. L. Chaichana, J. Avendaño, B. Liu, S. M. Raza, and A. Quiñones-Hinojosa, “Adult cerebellar glioblastoma: understanding survival and prognostic factors using a population-based database from 1973 to 2009.,” World Neurosurg., vol. 80, no. 6, pp. e237-43, Dec. 2013.

[9] H. H. Engelhard et al., “Clinical presentation, histology, and treatment in 430 patients with primary tumors of the spinal cord, spinal meninges, or cauda equina,” J. Neurosurg. Spine, vol. 13, no. 1, pp. 67–77, Jul. 2010.

[10] E. T. Wong, E. Lok, and K. D. Swanson, “An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas,” Curr. Treat. Options Oncol., vol. 16, no. 8, p. 40, Aug. 2015.

[11] A. M. Rojiani and K. Dorovini-Zis, “Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study,” J. Neurosurg., vol. 85, no. 6, pp. 1078–1084, Dec. 1996.

[12] S. Aamir and A. Ul-Haque, “Morphological Spectrum of Vascular Changes in Glioblastoma Multiforme,” Int. J. Pathol., vol. 4, no. 1, pp. 1–5, 2006.

- 31 -

[13] K. Urbańska, J. Sokołowska, M. Szmidt, and P. Sysa, “Glioblastoma multiforme - an overview.,” Contemp. Oncol. (Poznan, Poland), vol. 18, no. 5, pp. 307–12, 2014.

[14] Q. T. Ostrom et al., “The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review.,” Neuro. Oncol., vol. 16, no. 7, pp. 896–913, Jul. 2014.

[15] A. F. Tamimi and M. Juweid, Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Codon Publications, 2017.

[16] Q. T. Ostrom et al., “CBTRUS Statistical Report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2010–2014,” Neuro. Oncol., vol. 19, no. suppl_5, pp. v1–v88, Nov. 2017.

[17] H. Ohgaki and P. Kleihues, “Population-Based Studies on Incidence, Survival Rates, and Genetic Alterations in Astrocytic and Oligodendroglial Gliomas,” J. Neuropathol. Exp. Neurol., vol. 64, no. 6, pp. 479–489, Jun. 2005.

[18] D. Miljuš, S. Živković, and Z. Božić, “Incidencija i mortalitet od raka u centralnoj Srbiji 2015,” 2017.

[19] F. Alić, H. Bečulić, R. Skomorac, and A. Jusić, “Prikaz dva slučaja AGRESIVNOST VISOKOGRADNUSIH GLIJALNIH TUMORA Visokogradusni tumori mozga.”

[20] H. Ohgaki and P. Kleihues, “The Definition of Primary and Secondary Glioblastoma,” Clin. Cancer Res., vol. 19, no. 4, pp. 764–772, Feb. 2013.

[21] C. Adamson et al., “Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going,” Expert Opin. Investig. Drugs, vol. 18, no. 8, pp. 1061–1083, Aug. 2009.

[22] A. J. Atkinson et al., “Biomarkers and surrogate endpoints: Preferred definitions and conceptual framework,” Clinical Pharmacology and Therapeutics, vol. 69, no. 3. pp. 89–95, Mar-2001.

[23] C. L. Sawyers, “The cancer biomarker problem,” Nature, vol. 452, no. 7187. pp. 548–552, 03-Apr-2008.

[24] A. O. Sasmita, Y. P. Wong, and A. P. K. Ling, “Biomarkers and therapeutic advances in glioblastoma multiforme,” Asia. Pac. J. Clin. Oncol., vol. 14, no. 1, pp. 40–51, Feb. 2018.

[25] Z. An, O. Aksoy, T. Zheng, Q.-W. Fan, and W. A. Weiss, “Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies.,” Oncogene, vol. 37, no. 12, pp. 1561–1575, Mar. 2018.

[26] Q.-J. Li, J.-Q. Cai, and C.-Y. Liu, “Evolving Molecular Genetics of Glioblastoma,” Chin. Med. J. (Engl)., vol. 129, no. 4, p. 464, 2016.

[27] I. Crespo et al., “Molecular and Genomic Alterations in Glioblastoma Multiforme,” Am. J. Pathol., vol. 185, no. 7, pp. 1820–1833, Jul. 2015.

- 32 -

[28] R. A. Cairns, I. S. Harris, and T. W. Mak, “Regulation of cancer cell metabolism,” Nat. Rev. Cancer, vol. 11, no. 2, pp. 85–95, Feb. 2011.

[29] J. Vinagre et al., “Frequency of TERT promoter mutations in human cancers,” Nat. Commun., vol. 4, no. 1, p. 2185, Dec. 2013.

[30] S. V. Ellor, T. A. Pagano-Young, and N. G. Avgeropoulos, “Glioblastoma: Background, Standard Treatment Paradigms, and Supportive Care Considerations,” J. Law, Med. Ethics, vol. 42, no. 2, pp. 171–182, Jul. 2014.

[31] T. Mitrović, OSNOVNI PRINCIPI EKSPERIMENTALNE BIOHEMIJE II -Metode izolacije, separacije i kvantifikacije nukleinskih kiselina i proteina, Prvo izdan. Prirodno-matematički fakultet u Nišu, 2012.

[32] “https://biocyclopedia.com/index/chem-lab-methods/chromatography-introduction.php.” .

[33] E. Iannone, Labs on Chip: Principles, Design and Technology. CRC Press. Taylor & Francis Group, 2015.

[34] “https://www.vitascientific.com/dbm-82ge50-dbio-spin-column-for-gel-extraction-or-pcr-product-cleanup-50-columns.html.” .

[35] QIAamp® DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook. 2003.

[36] J. Zeugin and J. Hartley, “Ethanol Precipitation of DNA,” Focus (Madison)., 1985.

[37] J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, “Gel electrophoresis of DNA,” in Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, USA: New York: Cold Spring Harbor Laboratory PressNew York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[38] “https://imagej.nih.gov/ij/.” .

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Марко Пантић

Ментор, МН: Татјана Митровић

Наслов рада, НР: Дефинисање оптималних услова за изолацију ДНК из тумора

глиобластома

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

6 поглавља, 31 стр., 3 слике, 9 табела, 3 grafika

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: Молекуларна биологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: глиобластома мултиформе, изолација ДНА, третман РНазом А

УДК 577.215:616-006

Чува се, ЧУ: библиотека

Извод, ИЗ: Изолована је геномска ДНК из тумора пацијената оболелих од глиобластома употребом QIAGEN технологије базиране на силика гел мембранама. Варирани су различити параметри (количина ткива, ензимски третман, број елуција) и праћен њихов утицај на принос и квалитет изоловане ДНК. Количина и степен чистоће изоловане геномске ДНК одређен је спектрофотометријском методом на Spectrophotometer UV-1650PC и BioSpec-nano апаратима. Дефинисани су максимални капацитет QIAGEN колоне и оптимални услови изолације ДНК на њој. Интактност изоловане геномске ДНК проверавана је електрофоретском методом на агарозном гелу.

Датум прихватања теме, ДП: 13.06.2018.

Датум одбране, ДО: 15.10.2018. Чланови комисије, КО: Председник: Владимир Цветковић

Члан: Јелена Виторовић

Члан, ментор: Татјана Митровић

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Marko Pantić

Mentor, MN: Tatjana Mitrović

Title, TI: Defining optimal conditions for isolation of DNA from

glioblastoma

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

6 chapters, 31 p., 3 pictures, 9 tables, 3 charts

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: molecular biology

Subject/Key words, S/KW: glioblastoma multiforme, isolation of DNA, RNase A treatment

UC 577.215:616-006

Holding data, HD: library

Abstract, AB: Genomic DNA from tumor tissue of glioblastoma patient was isolated using QIAGEN technology based on silica gel membrane. Different parameters (tissue quantity, enzyme treatment, number of elutions) were varied and their effect on yield and quality of isolated DNA was followed. Quantity of isolated genomic DNA and its purity was determined by spectrophotometric method using Spectrophotometer UV-1650PC and BioSpec-nano devices. The maximum capacity of the QIAGEN column and the optimal conditions of DNA isolation on it were defined. Intactness of isolated genomic DNA was checked by agarose gel electrophoresis.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 13.06.2018.

Defended on, DE: 15.10.2018

Defended Board, DB: President: Vladimir Cvetković

Member: Jelena Vitorović

Member, Mentor: Tatjana Mitrović

Образац Q4.09.13 - Издање 1