universitÀ di roma “sapienza” - padis.uniroma1.itpadis.uniroma1.it/bitstream/10805/2109/1/tesi...

UNIVERSITÀ DI ROMA “SAPIENZA”

Scuola di Dottorato in Scienze Mediche Sperimentali e Cliniche

Dottorato di Ricerca in “Medicina Molecolare”

XXV ciclo

TESI

Regolazione trascrizionale del microRNA onco-soppressore

let-7c nella leucemia mieloide acuta

Silvia Careccia

Tutor: Prof. Massimo Levrero

Relatore esterno: Dott.ssa Maria Giulia Rizzo

Coordinatore: Prof. Alberto Gulino

3

INDICE

Aspetti generali…………………………………………………………………………..…….. 5

Introduzione…………………………………………………………………………………….…. 7

Capitolo 1. La Leucemia Mieloide Acuta……………………………………………. 7

1.1 Le leucemie………………………………………………………………………… 7

1.2 La leucemia mieloide acuta: caratteristiche generali………………… 8

1.3 La classificazione Franco-Americana-Britannica………………………. 9

1.4 Patogenesi molecolare della leucemia mieloide acuta……………….. 11

1.5 Anomalie citogenetiche nella leucemia mieloide acuta……………… 13

1.6 La leucemia promielocitica acuta……………………………………………. 14

1.7 Altre aberrazioni cromosomiche comuni nelle LAM………………….. 16

1.8 Mutazioni geniche nelle LAM…………………………………………………… 18

Capitolo 2. L’Epigenetica…………………………………………………………………… 22

2.1 L’organizzazione della cromatina nella cellula eucariota……………. 22

2.2 Epigenetica e trascrizione………………………………………………………. 23

2.2.1 La metilazione del DNA………………………………………………… 23

2.2.2 Le modificazioni post-traduzionali degli istoni…………………… 25

Capitolo 3. I microRNA………………………………………………………………….…… 31

3.1 I micro-RNA: biogenesi e meccanismi d’azione………………………….. 31

3.2 I miRNA intronici…………………………………………………………………… 34

3.3 miRNA e meccanismi epigenetici……………………………………………. 35

3.3.1 miRNA e metilazione del DNA…………………………………………….. 35

3.3.2 miRNA e modificazioni istoniche………………………………………… 36

3.4 MicroRNA e tumori………………………………………………………………… 37

3.4.1 MicroRNA e leucemie…………………….…………..…………………… 37

3.4.2 MicroRNA e tumori solidi………………………………………………… 39

3.5 La famiglia di microRNA let-7…………………………………………………. 41

3.5.1 Aspetti generali sulla famiglia let……………………………………… 41

4

3.5.2 Let-7 e tumori…………………………………………………………………. 44

Obiettivi della ricerca…………………………………………………………………….. 48

Materiali e Metodi…………………………………………………………………………. 49

• Linee cellulari e condizioni di coltura……………………………………………. 49

• Preparazione di RNA e cDNA………………………………………………………. 50

• Stem-loop RT-PCR………………………………………………………………………. 50

• Real Time PCR (qRT-PCR)…………………………………………………………… 51

• Analisi bioinformatica…………………………………………………………………. 52

• 5’ Rapid Amplification of cDNA Ends (5’ RACE)……………………………… 52

• Costrutti luc e saggi luciferasici……………………………………………………. 53

• Trasfezioni transienti…………………………………………………………………… 54

• Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)……………………………….. 55

• Analisi statistica…………………………………………………………………………… 59

Risultati…………………………………………………………………………………………….. 60

Identificazione di un nuovo TSS per il miRNA let-7c…………………………………... 60

Analisi dell’attività trascrizionale del promotore intronico del let-7c in cellule di leucemia promielocitica acuta…………………………………………………….. 61

Modificazioni epigenetiche del promotore del gene ospite del let-7c LINC00478 dopo trattamento con ATRA……………………………………………………. 62

Modificazioni epigenetiche del promotore intronico del let-7c dopo trattamento con ATRA……………………………………………………………………………… 64

Attività trascrizionale del promotore intronico del let-7c in tumori solidi………………………………………………………………………………………………………… 67

Correlazione dell’espressione del gene ospite LINC00478 e del let-7c in diversi tipi di tumore………………………………………………………………………………… 67

Discussione e conclusioni………………………………………...……………………… 70

Bibliografia…………………………………………………………………………………………… 75

5

ASPETTI GENERALI

La leucemia mieloide acuta (LAM) rappresenta un gruppo eterogeneo di disordini

ematopoietici, caratterizzati da distinte lesioni genetiche, in cui si ha un blocco del

processo differenziativo in uno stadio specifico della maturazione ematopoietica. Il

corretto differenziamento dipende da geni che codificano per fattori di trascrizione, la

cui mancata regolazione potrebbe, quindi, essere importante per lo sviluppo delle

neoplasie. E’ stato comunque dimostrato che i fattori di trascrizione non sono i soli

regolatori chiave dell’espressione genica. Meccanismi epigenetici come metilazione

del DNA, modificazioni post-traduzionali degli istoni, rimodellamento dei nucleosomi

ed espressione di piccoli RNA regolatori, contribuiscono alla regolazione

dell’espressione genica e alla determinazione della specificità cellulare e tissutale. La

de-regolazione di questi meccanismi coopera con le alterazioni genetiche

all’insorgenza e alla progressione tumorale. Recentemente, è stata identificata una

nuova rete di circuiti regolatori che operano a livello post-trascrizionale: i microRNA

(miRNA). I miRNA sono RNA non codificanti di dimensioni microscopiche (19-25

nucleotidi), regolatori e modulatori dell’espressione genica, coinvolti in importanti

processi cellulari come l’apoptosi, la proliferazione ed il differenziamento cellulare.

Alcuni miRNA mostrano espressione ubiquitaria, mentre altri sono limitati a certi

stadi dello sviluppo o a certi tessuti e tipi cellulari. In particolare, numerosi dati

dimostrano che i miRNA sono espressi differentemente in cellule ematopoietiche in

vivo e suggeriscono che possano giocare un ruolo importante nel differenziamento

ematopoietico. Il gruppo in cui ho svolto la mia attività di ricerca ha precedentemente

dimostrato che in blasti di leucemia acuta promielocitica (LAP), un sottotipo di LAM,

un ristretto gruppo di miRNA è differenzialmente espresso ed è modulato dal

trattamento differenziante con acido retinoico tutto-trans (ATRA). Inoltre, il confronto

dell’espressione di questi miRNA in promielociti normali e in blasti di LAP alla

diagnosi, ha rivelato in questi ultimi una ridotta espressione del miRNA let-7c. Il let-

7c appartiene alla famiglia di miRNA let-7, che svolge ruoli importanti in varie attività

cellulari, e diversi membri di questa famiglia sono specificamente repressi in vari tipi

di tumori. Il let-7c è un miRNA intronico localizzato all’interno di un introne del gene

non-codificante proteine LINC00478 e nostri precedenti dati indicano che la sua

trascrizione, in cellule di LAP, sembra essere sotto il controllo del promotore del gene

6

ospite. Sulla base di quanto sopradetto, lo scopo di questa tesi è stato quello di

individuare i possibili meccanismi molecolari alla base della regolazione

trascrizionale del miRNA let-7c in cellule mieloidi. I nostri dati mostrano che, in

cellule di LAP, l’incremento dell’espressione del let-7c indotta dall’ATRA potrebbe

essere mediata da meccanismi epigenetici. In maniera interessante, abbiamo anche

identificato, per il let-7c, oltre al promotore del gene ospite LINC00478, un nuovo sito

di inizio di trascrizione. Questo nuovo promotore ha una propria attività

trascrizionale. Tuttavia, trattamenti con ATRA, che inducono sul promotore del gene

ospite LINC00478/let-7c uno stato di maggiore attivazione trascrizionale, data da una

conformazione più aperta della cromatina, non portano a modulazioni significative

negli stessi marcatori epigenetici sul promotore intronico. Inoltre, abbiamo dati che

suggeriscono che il promotore intronico abbia un ruolo nel guidare la trascrizione del

let-7c in contesti tumorali diversi da quello leucemico in cui la trascrizione del let-7c

sembra essere principalmente a carico del promotore del gene ospite.

Questi risultati potrebbero contribuire ad una migliore comprensione del complesso

programma trascrizionale coinvolto nella transizione dal normale differenziamento

mieloide a quello patologico e potrebbero permettere l’identificazione di nuovi

bersagli molecolari, e quindi di nuove terapie, per le leucemie mieloidi acute.

7

INTRODUZIONE

Capitolo 1. La leucemia mieloide acuta

1.1 Le leucemie

Per leucemie si intende un gruppo eterogeneo di malattie neoplastiche, che

prevedono un qualsiasi processo di alterazione proliferativa a carattere progressivo

ed irreversibile, delle cellule emopoietiche del midollo osseo. Le leucemie hanno

origine dalla trasformazione maligna di una cellula progenitrice staminale

eamatopoietica, con alterazione della proliferazione e del differenziamento della

stessa e delle cellule derivanti mieloidi e linfoidi (globuli bianchi) e/o eritroidi

(globuli rossi) e/o megacariociti (piastrine).

Nelle leucemie, i blasti presentano un vantaggio proliferativo nei confronti del tessuto

normale; in questo modo vengono prodotte più cellule di quante ne muoiano e

queste, accumulandosi nel midollo osseo, determinano un’alterazione della

proliferazione e del differenziamento delle normali cellule ematopoietiche.

L’entità del difetto maturativo dei precursori leucemici e la rapidità di insorgenza

della malattia nei pazienti consente di separare nettamente le forme acute,

caratterizzate da elementi cellulari poco differenziati, dalle leucemie croniche che

presentano elementi ben definiti, e un decorso più lento e stabile nel tempo. Tale

distinzione è di notevole importanza non solo sul piano biologico, ma anche e

soprattutto sul piano clinico, per le implicazioni di ordine prognostico e terapeutico

che da essa derivano.

Dal punto di vista qualitativo la proliferazione neoplastica può interessare i

precursori della linea cellulare linfopoietica (leucemia linfoide), oppure quelli della

linea mielopoietica (leucemia non linfoide o mieloide). Le leucemie quindi, in base al

tipo cellulare coinvolto ed alle caratteristiche cliniche, possono essere suddivise in

leucemie mieloidi acute (LAM) e croniche (LCM), e linfoidi acute (LAL) e croniche

(LCL).

8

1.2 La leucemia mieloide acuta: caratteristiche generali

Per il presente lavoro, particolare importanza rivestono le leucemie mieloidi acute

(LAM), che rappresentano il 25% circa delle leucemie diagnosticate negli adulti. Le

LAM sono forme rapidamente progressive, che coinvolgono cellule immature le quali

proliferano in maniera afinalistica ed incontrollata, e sono incapaci di maturare in

maniera ordinata e di adempiere alle proprie funzioni. La LAM si può definire un

disordine ematopoietico clonale, causato da alterazioni genetiche a carico delle

cellule staminali ematopoietiche. A causa delle mutazioni genetiche accumulate, i

blasti leucemici possono anche inibire il differenziamento dei precursori mieloidi

normali del midollo, a causa di specifiche chemochine prodotte dai blasti tumorali

(Youn et al, 2000). Sul piano biologico questa proliferazione aberrante, originatasi a

livello del midollo osseo, si diffonde poi agli altri organi con potenzialità

emolinfopoietica (milza, linfonodi, fegato), invadendo successivamente tutti i tessuti

dell’organismo. In questo modo, in assenza di trattamenti la LAM determina

emorragie, infiltrazioni in altri organi e infezioni fatali entro un anno dalla diagnosi

(Estey e Döhner, 2006; Lowenberg et al, 1999).

Negli ultimi 30 anni, il trattamento delle LAM si è basato su combinazioni di

chemioterapici quali le antracicline, principalmente daunorubicina, idarubicina e

citarabina (Tallman et al, 2005; Ganetsky et al, 2012). Il trattamento si divide in due

fasi: una prima fase di induzione, che ha come obbiettivo la remissione della malattia

(con una possibile post-induzione), e una seconda fase di terapia post-remissione.

Generalmente, il trattamento delle LAM include almeno un ciclo di chemioterapia

intensiva di induzione, seguita da un addizionale ciclo di intensivo di terapia di

consolidamento, a cui fa seguito una terapia di mantenimento.

Il tasso di remissione e la sopravvivenza alle LAM varia grandemente in base all’età

del paziente e alla citogenetica dei blasti leucemici, ma rimane comunque il più basso

di tutte le leucemie (Estey e Döhner, 2006); alcuni studi mostrano infatti come il tasso

di sopravvivenza a 5 anni sia del 55% per pazienti con una citogenetica “favorevole”,

il 24% per pazienti a rischio intermedio, e solo il 5% per pazienti con citogenetica

“sfavorevole” (Byrd et al, 2002).

9

1.3 La classificazione Franco-Americana-Britannica

Nelle LAM, l’accumulo dei blasti leucemici si origina principalmente a causa

dell’incapacità dei precursori mieloidi di maturare completamente, perciò i sistemi di

classificazione tradizionali hanno utilizzato la morfologia cellulare per definire

diversi sottotipi di LAM. Questi sottotipi sono definiti sulla base dello stadio in cui si

verifica il blocco del differenziamento normale. Le notevoli divergenze nella

nomenclatura classificativa adoperata fino ad oggi, sono state superate dagli studi

effettuati da un gruppo cooperativo che ha elaborato un sistema di classificazione

ormai universalmente adottato: la classificazione Franco–Americana–Britannica

(FAB, Bennett et al, 1985).

In base a questa convenzione, i principali criteri su cui si deve basare una corretta

classificazione delle leucemie acute sono rappresentati da:

- morfologia delle cellule leucemiche del midollo osseo e del sangue periferico

dopo colorazione panottica (May–Grünwald, Wright, Romanovsky);

- comportamento di alcune reazioni citochimiche capaci di mettere in evidenza

attività enzimatiche e/o prodotti del metabolismo intracellulare con aspetti

peculiari per determinate linee cellulari.

Per quanto riguarda le LAM, il gruppo cooperatore FAB ha identificato almeno i

seguenti sottotipi:

M0 = (leucemia mieloblastica acuta altamente indifferenziata) Vi è predominanza di

blasti di aspetto completamente indifferenziato. L’identificazione può avvenire solo

per mezzo di anticorpi monoclonali specifici.

M1 = (leucemia mieloblastica acuta non differenziata) Vi è una prevalenza di blasti

indifferenziati; il nucleo è rotondeggiante od ovale con uno o più nucleoli evidenti e

cromatina finemente distribuita; citoplasma con scarsi granuli azzurrofili e rarissimi

corpi di Auer. La quota mieloide maturante è inferiore al 10% e quella monocitaria al

20%. Le indagini citochimiche dimostrano la positività della mieloperossidasi (MPO)

nel 3% dei blasti; anche la naftolo AS-D acetato esterasi (NASD-AE) risulta positiva,

ma in maniera debole e senza inibizione da parte del NaF.

M2 = (leucemia mieloblastica acuta differenziata) Vi è predominanza di blasti con

evidenti segni di differenziamento granulocitario; il nucleo è con più nucleoli e

cromatina finemente distribuita; il citoplasma è ricco di granulazioni azzurrofile e

10

corpi di Auer. La quota mieloide maturante è superiore al 10% e spesso presenta

anomalie morfologiche. Intensa risulta la positività alla MPO e alla NASD-AE non

inibita dal NaF.

M3 = (leucemia promielocitica acuta) E’ caratterizzata dalla predominanza di blasti di

tipo promielocitico con nucleo irregolare, talora reniforme o bilobato; il citoplasma è

ricchissimo di granulazioni azzurrofile associate a numerosi corpi di Auer. Le indagini

citochimiche dimostrano la massima positività alla MPO, mentre risulta positiva e non

inibita dal NaF la NASD-AE.

M4 = (leucemia mielomonocitica acuta) Vi è presenza nel sangue periferico e nel

midollo osseo di blasti ad orientamento mieloide e monocitario, questi ultimi in

proporzione variabile, ma sempre superiore al 20%. La positività alla MPO è intensa

negli elementi della linea mieloide, mentre risulta praticamente negativa nei

precursori monocitari. I blasti monocitici presentano, però, una spiccata positività per

l’alfa naftilacetato esterasi (ANAE) e per la NASD-AE con inibizione, nel caso di questa

ultima, da parte del NaF.

M5 = (leucemia monocitica acuta) Vi è prevalenza di elementi della linea monocitaria.

Si distinguono: una varietà A (M5A) con prevalenza di elementi più indifferenziati di

tipo monoblastico caratterizzati da grossa taglia, nucleo rotondo od ovale con nucleoli

evidenti, ampio citoplasma basofilo in cui si osservano fini granulazioni azzurrofile;

una varietà B (M5B) in cui le cellule presentano aspetti più differenziati, di tipo

promonocitico–monocitico. Per l’identificazione di tale varietà risultano

indispensabili le indagini citochimiche che dimostrano un’intensa positività della

NASD-AE, fortemente inibita dal NaF, e dell’ANAE.

M6 = (eritroleucemia) E’ una varietà molto rara, caratterizzata dalla proliferazione di

elementi leucemici appartenenti alle linee eritroblastiche e granuloblastiche. La

percentuale di cellule eritroidi midollari deve essere superiore al 50%; inoltre i blasti

mieloidi devono rappresentare almeno il 30% della popolazione non eritroblastica

midollare. Le indagini citochimiche possono mettere in evidenza in una percentuale

variabile di eritroblasti una spiccata positività alla colorazione Schiff-acido periodico

(PAS).

M7 = (leucemia megacarioblastica) E’ una varietà abbastanza rara, caratterizzata da

blasti che possono presentare un aspetto indifferenziato o talora di tipo linfoide. Le

indagini citochimiche possono evidenziare una PAS positività ed una positività focale

della ANAE senza tuttavia aspetti di specificità.

11

1.4 Patogenesi molecolare della leucemia mieloide acuta

Oltre alle differenze morfologiche e citochimiche manifestate dai blasti leucemici, la

LAM è una patologia estremamente eterogenea sotto il profilo genetico. E’ ormai

generalmente accettato che la patogenesi molecolare delle leucemie sia, almeno nella

maggior parte dei casi, un processo multi-stadio, nel quale l’accumulo di distinte

lesioni genetiche porta alla crescita clonale di precursori immaturi ed all’insorgenza

della malattia. L’attenzione della ricerca contro il cancro è stata tradizionalmente

rivolta allo studio di oncogeni e onco-soppressori che regolano la proliferazione e la

morte cellulare. Sebbene l’alterazione di questi processi può essere un evento-chiave

anche nella patogenesi della LAM, è la distruzione del normale differenziamento

cellulare ad avere rilevanza cruciale nell’insorgenza delle leucemie. I difetti dei blasti

leucemici possono includere anche un’evasione dalla morte cellulare programmata,

instabilità genomica e la disseminazione multi-organo delle cellule leucemiche.

Per quanto riguarda la distruzione dei normali processi di proliferazione e morte

cellulare, uno degli eventi patogenetici più importanti nelle LAM è l’alterazione dei

meccanismi di trasduzione del segnale. La crescita clonale di precursori ematopoietici

immaturi è dovuta ad una loro aumentata proliferazione e resistenza all’apoptosi, alla

quale certamente contribuisce l’attivazione costitutiva e/o aberrante delle vie del

segnale controllate dai recettori di fattori di crescita. Sebbene la proliferazione sia

regolata nei precursori ematopoietici normali dai fattori di crescita e dai segnali di

adesione, nelle cellule leucemiche può essere avviata in modo autonomo. In effetti,

l’attivazione aberrante di molecole implicate nella trasduzione del segnale è stata

riscontrata circa nel 50% delle LAM primarie (Steffen et al, 2005). Questa

proliferazione aberrante è spesso il risultato di mutazioni geniche che influenzano le

vie del segnale, e colpiscono i recettori tirosina-chinasici di membrana Flt3 e Kit,

oppure le proteine che ricevono il segnale a valle da questi recettori, come N-Ras e K-

Ras (Kottaridis et al, 2001; Döhner, 2007). Queste lesioni possono anche alterare la

sopravvivenza cellulare, principalmente stimolando la via del segnale della fosfatidil-

inositolo trifosfato chinasi, e comportando un’evasione dei blasti dai programmi

apoptotici. La caratterizzazione delle anomalie delle vie del segnale ha concentrato

l’attenzione sulla proliferazione cellulare come potenziale bersaglio terapeutico nelle

LAM. Tuttavia, l’ostacolo principale a questa strategia è rappresentato dai molti modi

attraverso i quali nelle LAM il segnale delle chinasi può essere attivato.

12

Il blocco del differenziamento è un’altra tipica anomalia dei blasti leucemici, e le LAM

rappresentano un eccellente modello per studiare il legame tra la regolazione del

differenziamento e la progressione tumorale. Per attivare i profili di espressione

genica necessari per il differenziamento dei vari stipiti ematopoietici, è necessario un

corretto bilancio di fattori di trascrizione generali e linea-specifici. Frequentemente,

nelle LAM le lesioni genetiche colpiscono, direttamente o indirettamente, questi

fattori di trascrizione, causando un difetto nel differenziamento ematopoietico.

Fondamentalmente, due tipi di lesioni genetiche contraddistinguono questa leucemia

e contribuiscono al fenotipo dei blasti leucemici: riarrangiamenti cromosomici e

mutazioni geniche. I riarrangiamenti cromosomici possono distruggere il normale

differenziamento a vari livelli. Fattori di trascrizione importanti possono essere

direttamente implicati nella traslocazione, oppure i riarrangiamenti coinvolgono un

coattivatore che risulta espresso in maniera aberrante. Le mutazioni puntiformi

possono colpire i fattori di trascrizione ematopoietici quali PU.1 e C/EBPα, e possono

condurre così al blocco del normale differenziamento mieloide (Martens 2011;

Mròzec et al, 2007). Può essere importante considerare che molti pazienti di LAM che

hanno mutazioni in PU.1 e C/EBPα non hanno traslocazioni cromosomiche. E’

possibile quindi che le proteine di fusione tipicamente associate a queste leucemie

distruggano le funzioni di PU.1 e C/EBPα. In effetti, è stato dimostrato che la proteina

di fusione AML1/ETO, prodotta dalla traslocazione t(8;21) (Vedi anche Capitolo 1.5

Anomalie citogenetiche nella leucemia mieloide acuta), distrugge la funzione di

C/EBPα (Westendorf et al, 1998).

Il contributo dei diversi eventi mutazionali che portano al cancro può variare nelle

LAM, e le caratteristiche dei blasti leucemici possono differire da un caso ad un altro

sulla base delle lesioni geniche che si sono prodotte. Perciò possono esistere casi in

cui l’accumulo dei blasti è principalmente determinato da un’inappropriata

proliferazione in assenza di normali fattori di crescita, e da un auto-rinnovamento

incontrollato delle cellule staminali, piuttosto che da un blocco del differenziamento,

e altri in cui il principale difetto dei blasti è l’incapacità di raggiungere un

differenziamento terminale.

In passato la LAM era considerata una neoplasia “monolitica”, che prevedeva un

trattamento chemioterapico pressoché unico per tutti i pazienti. Oggi, la grande

diversità genetica che lo studio delle LAM ha svelato lascia spazio alla prospettiva di

terapie personalizzate.

13

1.5 Anomalie citogenetiche nella leucemia mieloide acuta

L’eterogeneità genetica delle LAM richiama il problema di un’appropriata

classificazione sia per la comprensione dei meccanismi che intervengono nella

patogenesi della malattia, che per il valore prognostico che ne può derivare e la

definizione di strategie terapeutiche mirate. Sebbene il valore diagnostico del dato

morfologico e cito-chimico sia rimasto tuttora inalterato, appare sempre più

importante affiancare alla classificazione FAB anche una classificazione citogenetica,

basata sull’identificazione di riarrangiamenti non casuali del cariotipo. Le aberrazioni

cromosomiche sono una caratteristica frequentemente riscontrata nelle leucemie.

Tali riarrangiamenti possono essere evidenziati, oltre che con la citogenetica

tradizionale, anche con l’ibridazione in situ fluorescente (FISH), che impiega sonde

molecolari specifiche per i geni coinvolti nell’anomalia, o con la RT-PCR, che utilizza

sequenze nucleotidiche complementari a quelle localizzate alle estremità 3’ e 5’ del

gene di fusione. Un’altra possibilità consiste nella dimostrazione della proteina

chimerica, utilizzando un anticorpo monoclonale specifico. Le anomalie del cariotipo

presenti nella LAM comprendono traslocazioni reciproche e non, inversioni, trisomie,

monosomie e delezioni. Traslocazioni reciproche e inversioni peri-/paracentriche

sono presenti nel 40% circa dei pazienti affetti da LAM. Un ampio numero di studi ha

chiaramente dimostrato un ruolo centrale di questi riarrangiamenti genici nella

leuchemiogenesi. Tali studi hanno evidenziato che: geni di fusione specifici correlano

strettamente con specifici fenotipi tumorali; le terapie di successo sono associate ad

un decremento o alla eradicazione della chimera associata alla malattia; i costrutti dei

geni di fusione sono in grado di generare in modelli animali disordini simili a quelli

osservati nelle leucemie umane; il silenziamento dei trascritti di fusione in vitro

contrasta la leuchemiogenesi e la proliferazione cellulare, e può indurre il

differenziamento (Mitelman et al, 2007). L’importanza delle anomalie citogenetiche è

sottolineata dal fatto che, ad oggi, la principale stratificazione del rischio dei pazienti

di LAM è definita su criteri citogenetici, dividendo i pazienti in tre grandi gruppi

prognostici: pazienti con una prognosi favorevole, che portano specifiche aberrazioni

cromosomiche quali t(8;21), t(15;17) e inv16, a prognosi intermedia (cariotipo

normale), e a prognosi sfavorevole (anomalie del cariotipo complesse).

Molti di questi riarrangiamenti coinvolgono loci genici codificanti attivatori

trascrizionali, i quali generano una proteina di fusione che mantiene la capacità di

14

legarsi al DNA, ma la cui attività trascrizionale è aberrante. L’alterata regolazione dei

geni bersaglio necessari per un normale sviluppo mieloide conduce infine alla

trasformazione leucemica.

1.6 La leucemia promielocitica acuta

Di particolare interesse per questo lavoro di tesi è la leucemia promielocitica acuta

(LAP). La traslocazione t(15;17) è tipicamente riscontrata in più del 95% dei casi di

leucemia promielocitica acuta ,che rappresenta circa il 10% di tutte le LAM ed ha

caratteristiche morfologiche corrispondenti ai sottotipi FAB M3 (80%) o vM3 (20%,

variante ipogranulare). La t(15;17) genera l’oncogene di fusione PML/RARα, che ha

un ruolo centrale nella leuchemiogenesi dei blasti LAP (Melnich e Lich, 1999).

Il gene PML codifica per una proteina che regola la senescenza e l’apoptosi: è ormai

dimostrato che PML sopprime la crescita cellulare se overespresso e, ad oggi, è

considerato un oncosoppressore sia nelle leucemie che nei tumori solidi (Gurrieri et

al, 2004). PML è caratterizzato da una particolare distribuzione all’interno di

determinate regioni nucleari chiamate PODs (PML Oncogenic Domains) o NB

(Nuclear Bodies, corpi nucleari), dove ha un ruolo centrale come “impalcatura” per

l’assemblaggio e il disassemblaggio delle proteine che compongono i NB. Nella

t(15;17) i NB risultano disgregati e PML assume una localizzazione micro-diffusa

(Melnich e Lich, 1999; Carracedo et al, 2011).

Il gene RARα, invece, codifica per un membro della famiglia dei recettori nucleari per

i retinoidi (RARs). In assenza di acido retinoico tutto-trans (ATRA), RARα si lega ai

siti RARE (Retinoic Acid Responsive Elements) dei geni bersaglio come etero-dimero

insieme ad un’altra proteina ad essa correlata, il recettore dei retinoidi X (RXR).

L’etero-dimero normale RARα/RXR recluta complessi di co-repressione e reprime

così la trascrizione dei geni bersaglio. Un cambiamento conformazionale, causato dal

legame con ATRA a concentrazioni fisiologiche, promuove la dissociazione dei co-

repressori e stimola il reclutamento di co-attivatori. L’onco-proteina PML/RARα

agisce invece come un repressore costitutivo che è insensibile alle concentrazioni

fisiologiche di ATRA (Licht, 2006). Numerosi studi hanno dimostrato che il solo

PML/RARα transgenico può indurre LAP in modelli murini (Brown et al, 1997;

Grisolano et al, 1997). PML/RARα compete con RARα, formando omodimeri e

sequestrando RXR. In questo modo PML/RARα lega gli elementi RARE sui geni

15

bersaglio e media la repressione trascrizionale tramite il reclutamento di DNA metil-

trasferasi (DNMT) e/o la de-acetilazione degli istoni per mezzo di complessi N-

CoR/Sin3A/HDACs (Di Croce et al, 2002; Insinga et al, 2005; Martens et al, 2010). Di

notevole importanza è che blasti di LAP PML/RARα-positivi sono indotti a

differenziare dal trattamento con dosi farmacologiche di ATRA (da 10-7 a 10-6 M): la

LAP è per questo un modello particolarmente interessante nello studio del cancro

umano, essendo la prima neoplasia maligna dell’uomo ad essere efficacemente

trattata con un induttore del differenziamento cellulare. Dosi farmacologiche di acido

retinoico sono necessarie per innescare la degradazione di PML/RARα e il

riassemblaggio dei corpi nucleari (Yoshida et al, 1996; Nervi et al, 1998). E’

generalmente accettato che questo trattamento sia anche in grado di indurre un

cambiamento conformazionale di PML/RARα; in entrambi i casi, l’ATRA induce la

dissociazione dei complessi co-repressori e il reclutamento di proteine con attività di

acetilasi istonica (HAT) sui geni bersaglio, aprendo così le strutture cromatiniche e

consentendo il ripristino della trascrizione genica (Grignani et al, 1998; Martens et al,

2010).

L’introduzione di ATRA come terapia principale di trattamento della LAP ha

trasformato questo tipo di leucemia dallo stato di neoplasia quasi sempre ad esito

fatale, a malattia altamente curabile, con un tasso di remissione clinica (CR) intorno al

90%. L’ATRA di per sé non è curativo, poiché le remissioni ATRA-indotte sono solo

transitorie, ma è utile come trattamento prima e in combinazione alle terapie

citotossiche intensive, principalmente a base di antracicline, necessarie ad ottenere

remissioni prolungate, con una sopravvivenza globale e libera da malattia intorno al

70-80% (Hu, 2011).

E’ interessante notare che il gene di fusione reciproco RARα/PML è anch’esso

espresso nei blasti di LAP e codifica per una proteina di fusione. Sebbene le sue

proprietà funzionali rimangano poco conosciute, sistemi animali transgenici

suggeriscono che possa avere un ruolo nel promuovere il fenotipo leucemico (He et

al, 2000; Zimonjic et al, 2000).

Esistono infine rari casi di LAP che non hanno la t(15;17), i quali sono sempre

caratterizzati da riarrangiamenti che coinvolgono la ricombinazione di RARα con

partner localizzati su altri siti cromosomici. La t(11;17)(q23;q12) genera una fusione

tra RARα e il gene PLZF (Promyelocytic Leukemia Zinc Finger), il quale codifica per un

membro della famiglia dei fattori di trascrizione POZ/zinc-finger (Chen et al, 1993).

16

La t(5;17) fonde il gene della nucleofosmina (NPM) a RARα (Redner et al, 1996). Altre

rare traslocazioni associate alle LAP sono la t(11;17)(q13;q12) che fonde la proteina

dell’apparato mitotico nucleare (NuMa) a RARα (Wells et al, 1997), e la t(17;17) nella

quale RARα è fuso al trasduttore di segnale e attivatore trascrizionale STAT5b

(Arnould et al, 1999). Alcune varianti di LAP, generalmente le LAP PLZF/RARα e

STAT5b positive, si sono dimostrate parzialmente o totalmente resistenti alla terapia

differenziante con ATRA (Licth et al, 1995; Cheng et al, 1999). Altre varianti, come le

LAP NPM1/RARα e NuMA/ RARα positive, sono invece responsive all’ATRA.

1.7 Altre aberrazioni cromosomiche comuni delle LAM

Il più frequente riarrangiamento cromosomico nelle LAM umane è la traslocazione

bilanciata tra i cromosomi 8 e 21, t(8;21), riscontrata in circa 10% di tutte le LAM.

Questa traslocazione produce il gene chimerico e la proteina di fusione costitutita da

una porzione del fattore di trascrizione AML1 fusa alla proteina co-repressoria ETO.

La risultante proteina di fusione AML1/ETO funziona come repressore trascrizionale

dei geni regolati da AML1, reclutando sui promotori bersaglio complessi di co-

repressione trascrizionali come SMRT, N-Cor e Sin3A e proteine con attività di istone

deacetilasi (HDACs) (Nervi et al, 2008).

Un altro riarrangiamento relativamente frequente è l’inversione cromosomica

inv(16), che viene riscontrata approssimativamente nell’8% dei casi di LAM, e causa

la fusione di una porzione ammino-terminale della proteina core binding factor β

(CBFβ) con un tratto carbossi-terminale della catena pesante della miosina del

muscolo liscio (MYH11). Normalmente, CBFβ interagisce col fattore ti trascrizione

AML1, modulandone l’attività regolatoria sui promotori dei geni bersaglio. In

contrasto, la proteina di fusione CBFβ-MYH11 continua a legarsi ad AML1,

conferendole però un’abberrante attività repressoria (Lutterbach et al, 1999).

Il gene MLL (Mixed Lineage Leukemia) è implicato almeno nel 10% delle leucemie

acute, sia LAL che LAM, e nei pazienti LAM le traslocazioni MLL sono generalmente

associate ad una prognosi sfavorevole (Eguchi et al, 2005). In condizioni normali,

MLL è un enzima con attività istone metil-trasferasi che funziona come un regolatore

positivo globale della trascrizione genica. Nelle leucemie acute, le traslocazioni

cromosomiche possono fondere MLL ad uno di oltre 50 geni partner, producendo una

proteina di fusione MLL che funziona come un potente oncogene (Krivtsov e

17

Armstrong, 2007). Sebbene i meccanismi d’azione molecolari e i bersagli genomici

specifici delle proteine di fusione MLL nelle LAM non siano stati ad oggi chiaramente

definiti, si ritiene che il dominio ammino-terminale MLL serva per reclutare

l’oncoproteina su loci genici specifici, mentre il partner di fusione funzioni come

un’unità effettrice, sostenendo una trans-attivazione aberrante del gene bersaglio

(Yokohama et al, 2010).

Esistono infine numerose altre traslocazioni bilanciate meno comuni, che

colletivamente costituiscono il 6% circa dei casi di LAM. Tra queste, sono importanti

le traslocazioni che coinvolgono i geni Hox, codificanti per fattori trascrizionali con un

ruolo importante nello sviluppo ematopoietico (Argiropoulos e Humphries, 2007). La

traslocazione meglio caratterizzata è la t(7;11), che genera il prodotto di fusione

NUP98/HOXA9. NUP98 è una nucleoporina facente parte del complesso del poro

nucleare, che può trovarsi fusa anche con altri membri dei geni Hox nelle leucemie,

come nella traslocazione NUP98/HOXD13 (Gough et al, 2011). HOXA9 è un membro

dei geni Hox espresso nei progenitori ematopoietici precoci, la cui espressione scende

durante il differenziamento ematopoietico, fino ad essere non rilevabile nelle cellule

terminalmente differenziate (Argiropoulos e Humphries, 2007). L’oncoproteina di

fusione NUP98/HOXA9 può promuovere la leuchemiogenesi conferendo un vantaggio

proliferativo e una inibizione del differenziamento nei blasti attraverso l’iper-

espressione dei geni bersaglio di HOXA9 (Yassin et al, 2009).

Le principali aberrazioni cromosomiche nelle LAM, e le onco-proteine che ne

risultano, sono riassunte in Tabella 1. In totale, approssimativamente il 35% delle

LAM è caratterizzato da traslocazioni cromosomiche ben definite. Circa la metà dei

pazienti LAM manifesta invece un cariotipo normale, mentre la rimanente parte ha

anomalie cariotipiche complesse. Tuttavia, negli ultimi anni numerose altre

anormalità genetiche sono state identificate nei blasti di LAM, che sfuggono

all’identificazione tramite analisi citogenetiche. Queste lesioni comprendono

mutazioni geniche oppure un’espressione aberrante di specifici geni, che hanno

svelato l’esistenza di un’enorme eterogeneità all’interno dei sotto-gruppi di LAM

definiti a livello citogenetico.

18

Tabella 1. Elenco di onco-proteine di fusione associate alle LAM (modificata da Martens e

Stunnenberg, 2010).

1.8 Mutazioni geniche nelle LAM

Con l’eccezione di AML1, i geni codificanti per fattori di trascrizione coinvolti nel

differenziamento mieloide non sono in genere siti comuni di traslocazioni

cromosomiche nelle LAM. Si può allora supporre che i geni codificanti per questi

fattori possano essere mutati in un certo numero di pazienti affetti da LAM. Inoltre,

considerando che le comuni traslocazioni cromosomiche possono alterare

drammaticamente l’espressione di fattori di trascrizione importanti per la

maturazione ematopoietica, si potrebbe ipotizzare che mutazioni di questi fattori

siano frequenti nei pazienti che non hanno traslocazioni.

Difatti, ciò è quello che è stato osservato in un certo numero di studi. Le mutazioni

geniche nelle LAM possono essere generalmente suddivise in due ampie categorie: le

mutazioni di classe I colpiscono geni coinvolti nelle vie di trasduzione del segnale e

conducono ad un’aumentata proliferazione e sopravvivenza dei progenitori cellulari

leucemici; le mutazioni di classe II riguardano fattori di trascrizione o componenti dei

complessi di co-attivazione trascrizionale e determinano difetti nel differenziamento.

19

Nell’ambito della classe I, di notevole rilevanza sono le mutazioni che colpiscono il

gene FLT3. Il recettore tirosina-chinasi FLT3 e il suo ligando sono importanti per la

proliferazione e il differenziamento dei progenitori ematopoietici più immaturi. Nei

blasti di pazienti LAM, FLT3 è iper-espresso nel 60-92% dei casi (Drexler, 1996;

Rosnet et al, 1996). Le mutazioni somatiche in FLT3 comportano un’attivazione

costitutiva del recettore, e sono state identificate all’interno di due domini funzionali

del recettore, il dominio giusta-membrana (Juxtamembrane; JM) e il dominio tirosina-

chinasico (TKD; Nakao et al, 1996; Yamamoto et al, 2001). Il dominio JM, che ha un

ruolo cruciale nell’auto-inibizione dell’attività chinasica del recettore, è

frequentemente distrutto da duplicazioni interne in tandem (Internal Tandem

Duplications; ITD), presenti nel 28-34% dei pazienti a cariotipo normale, mentre le

mutazioni puntiformi in questo dominio sono rare (Kottaridis et al, 2001). Nelle LAM,

il loop di attivazione nel lobo carbossi-terminale del TKD può subire mutazioni

puntiformi, piccole delezioni o inserzioni (Mead et al, 2007). Sotto il profilo clinico, le

mutazioni di FLT3 sono rilevanti sia per il loro impatto prognostico, sia perché FLT3

costitutivamente attivo rappresenta un interessante bersaglio per la terapia

molecolare delle LAM. Numerosi studi hanno infatti chiaramente evidenziato come

pazienti di LAM a cariotipo normale con mutazioni FLT3-ITD abbiano un decorso

significativamente peggiore rispetto a pazienti che mancano di FLT3-ITD (Kottaridis

et al, 2001). Anche nella LAP, dove queste mutazioni sono relativamente frequenti

rispetto agli altri sottotipi FAB, la presenza di FLT3-ITD è associata ad un rischio

maggiore di fallimento delle terapie (Kainz et al, 2002).

Nei pazienti di LAM, mutazioni geniche sono state riscontrate anche nei geni RAS, con

una incidenza maggiore per N-RAS, sporadicamente in K-RAS e solo molto raramente

in H-RAS (Döhner, 2007). Ad oggi, sebbene non sia stato attribuito un chiaro

significato prognostico alla presenza di queste mutazioni nelle LAM, mutazioni di RAS

possono rappresentare un altro obbiettivo di terapie molecolari.

Le mutazioni nel gene della nucleofosmina 1 (NPM1) sono relativamente frequenti

nei blasti di pazienti LAM, e rappresentano la più comune alterazione genetica

riscontrata nei pazienti a cariotipo normale (Falini et al, 2005). NPM1 è

un’abbondante fosfo-proteina che, in condizioni fisiologiche, è localizzata nei nucleoli

e fa la spola tra nucleo e citoplasma. NPM1 ha un ruolo in numerosi processi biologici,

quali la biogenesi dei ribosomi, la risposta allo stress, la stabilità genomica, la

trascrizione genica e la regolazione dell’attività di importanti onco-soppressori come

20

p53 e ARF (Grisendi et al, 2006). Queste attività sono legate sia al controllo della

proliferazione e sopravvivenza cellulare, che al differenziamento. Per questo motivo,

le mutazioni di NPM1 nelle LAM possono considerarsi al confine tra classe I e classe

II. Queste mutazioni generalmente cadono nell’esone 12 del gene, e comportano un

accumulo anomalo della proteina nel citoplasma (Falini et al, 2005). Il 40% dei

pazienti con mutazioni in NPM1 sono anche portatori di FLT3-ITD. Alcuni studi hanno

evidenziato come mutazioni in NPM1 possano rappresentare marcatori di prognosi

favorevole, ma solo in assenza di FLT3-ITD (Schnittger et al, 2005; Thiede et al,

2006).

Nell’ambito della classe II, di rilievo sono le mutazioni che colpiscono il fattore

trascrizionale C/EBPα, una proteina chiave nei processi di differenziamento mieloide.

Sono stati identificati due tipi di mutazioni nel gene di C/EBPα nelle LAM: 1)

mutazioni non-senso, che colpiscono la porzione N-terminale della proteina,

causando la formazione di una isoforma tronca a funzione di dominante negativo; 2)

mutazioni nel domino C-terminale a cerniera di leucina, che causano un’inefficace

capacità di legare il DNA o di formare omo-dimeri. Alcuni studi evidenziano che le

mutazioni in C/EBPα nelle LAM sono associate ad esito favorevole della malattia

(Estey e Doher, 2006; Mròzec et al, 2007).

Le mutazioni parziali in tandem del gene MLL (Partial tandem Duplications, PTD)

sono state le prime mutazioni riportate avere un ruolo prognostico nelle LAM a

cariotipo normale, e sono associate ad una durata più breve di remissione clinica. A

differenza delle proteine chimeriche di fusione MLL, MLL-PTD conserva tutti i domini

funzionali della proteina. La presenza di MLL-PTD è associata al silenziamento

dell’allele MLL normale, probabilmente attraverso meccanismi epigenetici (Estey e

Doher, 2006; Mròzec et al, 2007).

Le mutazioni del gene Wilms’ Tumor 1 (WT1) nelle LAM furono identificate per la

prima volta nel 1998 (King-Underwood e Pritchard-Jones, 1998). WT1 controlla sia la

quiescenza dei progenitori ematopoietici che il differenziamento delle cellule mielo-

monocitiche; perciò le mutazioni che distruggono le sue funzioni normali possono

alterare sia la capacità proliferativa che indurre un blocco del differenziamento nei

blasti leucemici.

Esistono infine altre mutazioni geniche, come le mutazioni dell’ubiquitina ligasi CBL,

la cui prevalenza e rilevanza clinica non sono state ancora chiaramente determinate

(Caligiuri et al, 2007). Inoltre, un certo numero di geni può avere un’espressione

21

deregolata nei blasti di LAM, senza necessariamente essere mutato o oggetto di

traslocazioni. I geni BAALC, ERG, MN1 e EVI1, risultano di frequente iper-espressi, e la

loro espressione deregolata può avere un significato prognostico (Mròzec et al, 2007).

22

Capitolo 2. L’epigenetica

2.1 L’organizzazione della cromatina nella cellula eucariota Nelle cellule eucariotiche il DNA si presenta come una complessa struttura

nucleoproteica che prende il nome di “cromatina”. L’unità fondamentale della

cromatina viene definita nucleosoma. Il livello organizzativo minimo della cromatina

è il “core” nucleosomale in cui 146 paia di basi di DNA si avvolgono intorno ad un

complesso di 8 proteine chiamate “istoni”. Questo ottamero è costituito dagli istoni

H2A, H2B, H3, H4 che presenti in duplice copia formano un tetramero (H3)2(H4)2 e

due eterodimeri H2A-H2B (Kelley, 1973; Kornberg et al, 1974; Roark et al, 1974;

Luger et al,1997). Gli istoni sono piccole proteine basiche, costituite da un dominio

globulare e da un segmento di 20-35 residui all’N-terminale ricco di aminoacidi

basici, la coda istonica, che protrude dal nucleosoma (Peterson and Laniel, 2004). Il

dominio globulare del “core” istonico è composto da 3 α-eliche coinvolte nei contatti

istone-istone ed istone-DNA (Arents et al, 1991). A livello molecolare le interazioni

del DNA con le proteine istoniche sono dovute a legami idrogeno che si instaurano tra

i gruppi fosfato del DNA e i residui amminici degli istoni, e ad interazioni

elettrostatiche con la catena basica laterale. Infatti, in tutti gli istoni sono presenti

molti residui aminoacidici carichi positivamente che interagiscono facilmente con

l’impalcatura fosfodiesterica del DNA che ha carica negativa. Gli istoni H3 ed H4 sono

sorprendentemente ben conservati attraverso l’evoluzione suggerendo quindi una

loro cruciale funzione. Gli altri istoni sono meno conservati e sono state trovate

varianti con diverse proprietà. Tra un nucleosoma e l’altro c’è un tratto di DNA

“linker” (DNA d’unione) che, negli eucarioti superiori, contiene un ulteriore istone,

H1, chiamato istone "linker", che non sembra importante per la formazione della

particella nucleosomale, ma pare coinvolto nella formazione di strutture di ordine

superiore. Si pensa che l'istone H1 stabilizzi le strutture cromatiniche mediante la

neutralizzazione delle cariche elettrostatiche del DNA di unione, attraverso il suo

dominio carbossi-terminale molto ricco di residui amminoacidici carichi

positivamente (Wolffe, 1997).

23

2.2 Epigenetica e trascrizione

L’epigenetica è la scienza che studia i cambiamenti ereditari nell’espressione genica

che avvengono senza apportare variazioni nella sequenza del DNA. I meccanismi

epigenetici sono essenziali per il normale sviluppo e per il mantenimento di un

modello di espressione genica tessuto-specifica nei mammiferi. Alterazioni dei

processi epigenetici possono portare ad alterate funzioni geniche e allo sviluppo di

malattie come il cancro, sindromi pediatriche, nonché fattori che contribuiscono a

malattie autoimmuni e all'invecchiamento (Rodenhiser and Mann, 2006).

L’organizzazione del DNA nelle fibre di cromatina costituisce un ostacolo al legame

con le proteine coinvolte nella trascrizione, per cui queste strutture devono essere

dinamiche ed in grado di compiere transizioni finemente regolate della loro

conformazione; tali cambiamenti della struttura cromatinica, facilitando o impedendo

l’accesso dei fattori trascrizionali al DNA nucleosomale, rappresentano quindi un

importante meccanismo di regolazione. La regolazione della trascrizione a livello

epigenetico coinvolge sia modificazioni post-traduzionali degli istoni, ad opera di

complessi che modificano covalentemente alcuni loro specifici residui aminoacidici,

che la metilazione del DNA. Questi meccanismi molecolari collaborano in modo

coordinato agli eventi di apertura e chiusura della cromatina stessa.

2.2.1 La metilazione del DNA

Nelle cellule eucariote la metilazione del DNA, che interessa la base citosina

nell’ambito del dinucleotide citosina – guanina (“CpG”), influenza la trascrizione del

gene interessato (Razin and Cedar, 1991). Dal punto di vista biochimico, questa

modificazione consiste nella sostituzione, operata dall’enzima DNA metiltrasferasi

(DNMT), dell’atomo di ossigeno legato al carbonio in posizione 5 della base citosina

con un gruppo metile, con formazione di 5-metilcitosina. Circa l’80% dei dinucleotidi

CpG presenti nel genoma dei mammiferi sono metilati (Cheung and Lau, 2005),

mentre il restante 20% risulta non metilato e prevalentemente situato, con elevata

densità (“CpG Island”), nelle regioni promotrici di geni costitutivi o inducibili.

Il fatto che ogni potenziale sito di metilazione nel genoma sia simmetrico implica

l’ereditabilità di tale modificazione: infatti, quando viene metilata la base citosina su

24

uno dei due filamenti di DNA, viene metilata anche la stessa base sul filamento

complementare. Dopo la duplicazione dell’acido nucleico, DNMT specifiche ricreano il

profilo di metilazione del filamento di DNA parentale in quello neo-sintetizzato.

Questa modificazione epigenetica è implicata in molti processi, quali la regolazione

trascrizionale e la modulazione della struttura della cromatina. Inoltre, essa esercita

un effetto stabilizzante che promuove e garantisce l'integrità del genoma, oltre ad una

corretta espressione temporale e spaziale dei geni durante lo sviluppo (Song et al,

2005).

La metilazione del DNA può reprimere la trascrizione (Figura 1) mediante

meccanismi diretti (tra cui l’inibizione di fattori della trascrizione che legano il DNA)

o indiretti, dovuti essenzialmente agli effetti di proteine che si legano alla base

citosina metilata nell’ambito del dinucleotide CG: ad esempio, le proteine MeCP2 e

MBDs si legano a CpG metilate e reprimono la trascrizione grazie all’interazione con

l’enzima istone deacetilasi (HDAC); a sua volta, quest’ultimo deacetila specifici residui

aminoacidici localizzati all’estremità amino-terminale delle proteine istoniche,

portando ad un rimodellamento della cromatina che risulta meno accessibile agli

enzimi della trascrizione, con conseguente repressione dell’espressione genica

(Jaenisch and Bird, 2003).

Figura 1: La metilazione come meccanismo epigenetico. La metilazione del DNA può portare al

silenziamento trascrizionale; ciò è dovuto al cambiamento di conformazione della cromatina, che passa

da uno stato più “aperto”, attivo dal punto di vista trascrizionale

2.2.2 Le modificazioni post

Le modificazioni post-traduzionali degli istoni includono l’acetilazione di lisine (K), la

metilazione di lisine ed arginine (R), la fosforilazione di serine (S) e treonine (T),

l’ubiquitinazione e la sumolazione di

queste modificazioni sono state riscontrate nelle code istoniche N

l’eccezione dell’ubiquitinazione che si verifica nelle code C

e H2B (Peterson and Laniel, 2004). Una

modificazioni post-traduzionali degli istoni è riportata in

La metilazione come meccanismo epigenetico. La metilazione del DNA può portare al


da uno stato più “aperto”, attivo dal punto di vista trascrizionale, ad uno più “chiuso”.

cazioni post-traduzionali degli istoni

traduzionali degli istoni includono l’acetilazione di lisine (K), la


l’ubiquitinazione e la sumolazione di K, e l’ADP-ribosilazione. La maggior parte di

queste modificazioni sono state riscontrate nelle code istoniche N

l’eccezione dell’ubiquitinazione che si verifica nelle code C-terminali degli istoni H2A

e H2B (Peterson and Laniel, 2004). Una rappresentazione schematica delle principali

traduzionali degli istoni è riportata in Figura 2.

25

La metilazione come meccanismo epigenetico. La metilazione del DNA può portare al


, ad uno più “chiuso”.

traduzionali degli istoni includono l’acetilazione di lisine (K), la


ribosilazione. La maggior parte di

queste modificazioni sono state riscontrate nelle code istoniche N-terminali, con

terminali degli istoni H2A

rappresentazione schematica delle principali

Figura 2.

Figura 2: Rappresentazione delle principali modificazioni post

istoniche ( da Spivakov and Fisher, 2007)

Acetilazione: L’acetilazione dell’istone H2A in lisina 5 (K5), dell’istone H2B in lisina

12, 15 e 20 (K12, K15, K20), dell’istone

dell’istone H4 in lisina 5 e 8 (K5, K8) sono modificazioni che promuovono

l’attivazione trascrizionale. L’acetilazione delle code amino

consiste nel trasferimento della porzione acetile

residui conservati di lisina. Questo tipo di modificazione neutralizza le cariche

positive delle code istoniche indebolendo la loro interazione con i gruppi fosfato del

DNA carichi negativamente. Ciò determina un rilas

nucleosomale che permette l’accesso dei fattori trascrizionali promuovendo alti livelli

di trascrizione genica. Così, un’aumentata acetilazione istonica è associata

all’attivazione della trascrizione genica, mentre una sua diminuzio

una generale inibizione della trascrizione.

L’acetilazione è promossa da enzimi ad attività istone acetiltransferasica (HAT), a

localizzazione nucleare o citoplasmatica. Le HAT che catalizzano reazioni a livello

nucleare sono principalme

acetiltransferasi localizzate nel citoplasma invece regolano l’acetilazione degli istoni

Rappresentazione delle principali modificazioni post-traduzionali a carico delle code

istoniche ( da Spivakov and Fisher, 2007)

: L’acetilazione dell’istone H2A in lisina 5 (K5), dell’istone H2B in lisina

12, 15 e 20 (K12, K15, K20), dell’istone H3 in lisina 4, 9,14 e 27 (K4, K9, K14, K27) e


l’attivazione trascrizionale. L’acetilazione delle code amino-terminali degli istoni

consiste nel trasferimento della porzione acetile dell’acetil-CoA sul gruppo ε



DNA carichi negativamente. Ciò determina un rilassamento della struttura



all’attivazione della trascrizione genica, mentre una sua diminuzio

una generale inibizione della trascrizione.



nucleare sono principalmente coinvolte nella regolazione trascrizionale. Le


26

traduzionali a carico delle code

: L’acetilazione dell’istone H2A in lisina 5 (K5), dell’istone H2B in lisina

H3 in lisina 4, 9,14 e 27 (K4, K9, K14, K27) e


terminali degli istoni

CoA sul gruppo ε-NH3+ dei



samento della struttura



all’attivazione della trascrizione genica, mentre una sua diminuzione è associata con



nte coinvolte nella regolazione trascrizionale. Le


27

neo-sintetizzati, controllando la loro traslocazione nucleare. Oggi si contano sei

famiglie di proteine che presentano attività istone acetiltransferasica (Roth et al,

2001; Ehrenhofer-Murray, 2004). Fra queste, la famiglia di GCN5 e quella di p300

sono quelle meglio caratterizzate. I membri della famiglia GCN5 sono tutti co-

attivatori trascrizionali. Fra di essi troviamo la p300/Cbp Associated Protein (PCAF),

del quale saggi in vitro e in vivo hanno dimostrato la sua interazione con i membri

della famiglia di p300 (Schiltz et al, 1999). La famiglia di p300 include p300 e la

proteina di legame CREB (Creb Binding Protein, CBP), due proteine nucleari che

coordinano e regolano l’apparato trascrizionale della cellula. Fin dalle prime ricerche

è stato chiaro il ruolo di entrambe queste proteine quali co-attivatori della

trascrizione, a cui è seguita l’identificazione della loro attività acetiltransferasica

(Giordano and Avantaggiati, 1999). p300 e CBP sono due proteine altamente

omologhe, che contengono molti motivi strutturali comuni e che si sovrappongono da

un punto di vista funzionale.

L’acetilazione degli istoni è un processo reversibile, infatti sono stati isolati enzimi ad

attività istone deacetilasica (HDAC) (Figura 3). Le HDAC rimuovono i gruppi acetili

dai residui N-terminali di lisina compattando la cromatina con conseguente inibizione

trascrizionale; le HDAC sono suddivise in quattro diverse classi, in base all’omologia

di sequenza e all’organizzazione del dominio (Dokmanovic, 2007).

Gli enzimi appartenenti alla classe I sono le HDAC1, 2, 3, e 8; quelli di classe II sono le

HDAC 4, 5, 6, 7, 9 e 10 (de Ruijter et al, 2003). Un terzo gruppo di HDAC, la famiglia

Sirtuin, il cui membro principale è la proteina Sir1 strutturalmente non correlata alle

altre due famiglie, richiede il NAD+ come cofattore nella reazione di deacetilazione. Le

Sirtuin sono conservate dal punto di vista evoluzionistico negli eucarioti, nei

procarioti e negli archea, dove svolgono diverse funzioni nello sviluppo, nella

formazione dell’eterocromatina e nell’apoptosi (Buck et al, 2004). L’unica HDAC

appartenente alla classe IV ad oggi è l’HDAC11, di cui si conosce ben poco oltre alla

sua capacità di interagire con l’HDAC6 (Verdin et al, 2003).

28

Figura 3: L’acetilazione delle code istoniche è correlata all’attivazione trascrizionale; è un processo

reversibile catalizzato dalle istone acetitasi (HAT) e dalle istone deacetilasi (HDAC). In seguito

all’azione delle HAT la cromatina assume una conformazione prona alla trascrizione; viceversa,

l’azione delle HDAC rende la cromatina non accessibile al macchinario di trascrizione.

Metilazione: mentre l’acetilazione è generalmente associata con l’attivazione

trascrizionale, la metilazione degli istoni è legata sia ad attivazione che ad inibizione

trascrizionale. La diversa regolazione sulla trascrizione a carico di questo tipo di

modificazione dipende dal residuo aminoacidico istonico coinvolto e dal numero di

gruppi metilici associati a ciasuna lisina (mono-, di-, trimetilazione). In particolare, la

metilazione delle lisine è sia pro-attivatoria che inibitoria. Per esempio, la

trimetilazione dell’istone H3 in lisina 9 (K9), lisina 27 (K27) e lisina 79 (K79), e la

trimetilazione dell’istone H4 in lisina 20 (K20) è associata alla formazione

dell’eterocromatina e quindi a repressione genica, mentre la di- e trimetilazione

dell’istone H3 nelle lisine 4 e 36 (K4, K36) è legata all’attivazione trascrizionale

(Martin and Zhang, 2005; Barski et al, 2007). La metilazione delle arginine, come

quella dell’istone H3 in arginina 17 (R17) e dell’istone H4 in arginina 3 (R3), è invece

associata solo all’attivazione trascrizionale (Zhang and Reinberg, 2001; Peterson and

Laniel, 2004). Inoltre, come già descritto in precedenza, alcune di queste lisine

possono anche essere acetilate (ad esempio la K4, K9 e K27 dell’istone H3). Questa

alternanza tra acetilazione e metilazione ha spesso come risultato un cambiamento

29

nello stato di attivazione genica. La metilazione è promossa dagli enzimi istone

metiltransferasi (HMT) (Ehrenhofer-Murray, 2004). Un gruppo lisinico ε-NH3+ può

essere mono-, di- o trimetilato. Grazie alla struttura cristallografica delle HMT e allo

studio del loro sito catalitico è stato possibile capire come un enzima possa essere in

grado di catalizzare una mono-, ma non una di- o trimetilazione. Nelle monometilasi

come Set7/9, il gruppo ε-NH3+ è legato così fortemente nel sito attivo che non c’è

ulteriore spazio per un gruppo metilico ingombrante (Xiao et al, 2003; Ehrenhofer-

Murray, 2004). Perciò l’enzima può catalizzare solo la mono-metilazione. Invece le di-

e trimetilasi mostrano una maggiore flessibilità nel loro sito attivo. A differenza

dell’acetilazione, che risulta nella neutralizzazione delle cariche positive nel gruppo ε-

NH3, la metilazione lascia le cariche intatte. Mentre l’acetilazione degli istoni viene

regolata in maniera dinamica dall’azione delle HAT ed HDAC, la metilazione degli

istoni sembra essere chimicamente più stabile. Attualmente, comunque, sono stati

isolati diversi enzimi istone demetilasi (HDM), che sono in grado di demetilare l’H3 in

K4, in K27 e in K36.

Fosforilazione: è associata ad attivazione trascrizionale, alla condensazione dei

cromosomi durante la mitosi, e al riparo da danno al DNA (Sauve et al, 1999). E’ stato

dimostrato che la fosforilazione dell’istone H3 sulla serina 10 (S10) in collaborazione

con altre modificazioni (per esempio, l’acetilazione in K14) induce l’inizio della

trascrizione (Lo et al, 2001), mentre da sola o in combinazione con altre

fosforilazioni, recluta fattori responsabili della condensazione e della segregazione

cromosomica (Wei et al, 1999). Una delle risposte cellulari precoci dopo l’induzione

della rottura di entrambi i filamenti della doppia elica di DNA (Double Strand Break) è

la fosforilazione della Serina 139 (S139) dell’estremo C-terminale dell’istone H2AX,

una variante minore dell’istone H2A, in corrispondenza del sito di danno (Rogakou et

al, 1998). Studi di colocalizzazione proteica hanno mostrato che la fosforilazione

dell’istone H2AX è necessaria per il reclutamento di proteine coinvolte nella

riparazione del danno e nel blocco del ciclo cellulare (Karlsson and Stenerlow, 2004).

poli-ADP-ribosilazione: è una reazione catalizzata dall’enzima nucleare

poli(ADPribosio) polimerasi (PARP). E’ stato visto che l’ADP-ribosilazione dell’istone

H1 promuove la decondensazione della fibra cromatinica, mentre la modificazione

dell’istone H2B porta ad una parziale dissociazione del DNA dal core istonico. La sua

azione, quindi, determina un riarrangiamento nucleosomale e trasforma la cromatina

30

in una struttura trascrizionalmente attiva (de Murcia et al, 1988; Kraus and Lis,

2003).

Ubiquitinazione: è una modificazione post-traduzionale grazie alla quale una catena

(poliubiquitinazione), una singola molecola (monoubiquitinazione) o piu’ di una

singola molecola (multiubiquitinazione) di ubiquitina viene legata a proteine

bersaglio. L’ubiquitinazione delle proteine ha una funzione precisa: indica che queste

molecole possono essere degradate dal proteosoma. Gli istoni H2A, H2B, H3, H1 e la

variante H2A.Z possono essere monoubiquitinati (Osley et al, 2006). Il ruolo della

monoubiquitinazione è ancora poco noto, dal momento che l’aggiunta di una singola

molecola di ubiquitina non è sufficiente ad indirizzare le proteine verso la

degradazione proteosomale. Alcune evidenze sperimentali suggeriscono che

l’ubiquitinazione degli istoni possa avere un ruolo nel controllo della trascrizione

attraverso la regolazione della metilazione di alcuni residui specifici.

Sumolazione: consiste nel legame covalente della proteina SUMO (Small Ubiquitin-

related MOdifier) a residui di lisina delle proteine bersaglio. Questa modificazione

coinvolge diverse proteine, regolandone in generale la localizzazione e l’attività. Nel

caso degli istoni, il legame della proteina SUMO si oppone all’acetilazione, attribuendo

alla sumolazione un ruolo di inibizione della trascrizione (Iniguez-Lluhi, 2006). Per

esempio, la sumolazione dell’istone H4 media il silenziamento genico attraverso il

reclutamento di istone deacetilasi e della proteina eterocromatinica 1 (HP1) (Shiio

and Eisenman, 2003).

31

Capitolo 3. I microRNA

3.1 I microRNA: biogenesi e meccanismi d’azione

L'identificazione negli anni '90 dei microRNA (miRNA) ha aperto una nuova era nella

comprensione dei processi regolatori post-trascrizionali dell’espressione genica. I

miRNA sono una ampia classe di piccoli RNA non codificanti formati da 19-25

nucleotidi che regolano negativamente l’espressione genica a livello post-

trascrizionale, inducendo la degradazione di specifici RNA messaggeri (mRNA), o

impedendone la traduzione in proteina. E’ stato inoltre dimostrato che in lievito, nelle

piante, e negli animali i miRNA sono in grado di indurre silenziamento trascrizionale

mediante modificazioni del DNA e/o della cromatina (Noma et al, 2004). I miRNA

riconoscono specificamente gli mRNA bersaglio mediante un appaiamento

complementare delle basi. Tali RNA non sono perfettamente complementari tra loro

(vi sono uno o più disappaiamenti) e, nella maggior parte dei casi, i miRNA provocano

un blocco nella traduzione, senza causare la degradazione del mRNA bersaglio

(Bartel, 2009).

Le prime evidenze dell’esistenza e del ruolo dei miRNA nella regolazione traduzionale

furono osservate nei nematodi. In Caenorhabditis elegans (C.elegans) furono

identificati piccoli RNA in grado di ridurre la sintesi proteica senza modificare i livelli

di accumulo di specifici mRNA. Il primo gene codificante per uno di questi piccoli RNA

ad essere descritto, lin-4, è un regolatore essenziale della divisione cellulare allo

stadio larvale. Esso da origine ad un corto RNA di 22 nucleotidi di lunghezza,

perfettamente complementare ad un tratto della regione 3’ non tradotta (3’UTR)

dell’mRNA codificante per la proteina LIN-14, precedentemente dimostrata, tramite

approccio genetico, essere controllata da lin-4 (Lee et al., 1993). Attualmente sono

stati individuati, mediante tecniche di clonazione tradizionale in associazione ad

ausili bioinformatici, 2042 miRNA maturi (1600 precursori) nell’uomo ed è stato

stimato che circa il 30% dei geni umani sono regolati da miRNA (Bartel, 2004).

Pertanto, attualmente i miRNA costituiscono la più grande classe di geni regolatori. I

miRNA attivi nella regolazione dei loro mRNA bersaglio sono definiti miRNA “maturi”.

I geni di miRNA sono dispersi in tutti i cromosomi umani eccetto che nel cromosoma

Y.

32

La biogenesi dei miRNA ha inizio con la trascrizione di una breve sequenza genomica

che dà origine ad un “microRNA primario” (pri-miRNA). Esso viene trascritto nel

nucleo della cellula dalla RNA polimerasi II (RNAPol II) oppure, meno

frequentemente, dalla RNA polimerasi III (RNAPol III; Borchert et al, 2006). I pri-

miRNA, così come avviene per gli altri mRNA di classe II, subiscono modificazioni

post-trascrizionali quali l’aggiunta del cappuccio di 7-metil-guanosina all’estremità 5’

e della coda di poli(A) all’estremità 3’ (Lee et al, 2002). La loro lunghezza può variare

da qualche centinaia fino ad alcune migliaia di basi e possono contenere uno o più

precursori dei miRNA (pre-miRNA) in forma policistronica. I pri-miRNA si ripiegano

fino ad assumere una tipica struttura secondaria caratterizzata da uno o più diversi

ripiegamenti a forcina (“stem-loop”), ognuno dei quali darà in seguito origine ad un

miRNA diverso. L’evento di maturazione successivo avviene ad opera di un complesso

multi-proteico (Microprocessor) di cui fanno parte l’RNasi di tipo III Drosha e la

proteina di legame all’RNA a doppio filamento DiGeorge syndrome critical region 8

gene DGCR8 (Landthaler et al, 2004). I pri-miRNA vengono riconosciuti da Drosha a

livello dei ripiegamenti a forcina e tagliati alla base di tali strutture. Come risultato

del taglio si ha la formazione dell’intermedio successivo, il pre-miRNA, della

lunghezza di 60-70 nucleotidi e caratterizzato da una peculiare estremità di 2

nucleotidi a singolo filamento alle terminazioni 3’ (Lee et al, 2003). Questa estremità

asimmetrica al 3’ è legata dalla proteina Esportina-5, che permette la traslocazione

nel citoplasma del pre-miRNA (Lund et al, 2004; Zeng, 2006). In Drosophila e nei

mammiferi esistono anche vie non canoniche di processamento dei miRNA, che

portano alla formazione di un pre-miRNA attraverso meccanismi indipendenti da

Drosha. In genere, questi meccanismi riguardano miRNA localizzati in brevi introni

(miRtrons), trasportati nel citoplasma direttamente dopo lo splicing (Berezikov et al,

2007). Il pre-miRNA, traslocato nel citoplasma, viene riconosciuto a livello della

protrusione al 3’ da un complesso multienzimatico con attività endonucleasica,

chiamato Dicer, che completa la maturazione dei miRNA tagliandolo nella forma

finale a doppio filamento di 22 nucleotidi con 2 nucleotidi sporgenti all’estremità 3’

(Meister e Tuschl, 2004). A questo punto i miRNA vengono incorporati nel complesso

ribonucleoproteico dei miRNA (miRNP), noto anche come complesso silenziatore

indotto da RNA (RISC). Quando il miRNA viene caricato sul RISC uno dei due filamenti

viene allontanato e degradato. Il filamento che viene a far parte del RISC è in genere

quello con l’estremità 5’ con energia libera minore (Schwarz et al, 2003). La

33

regolazione della produzione dei miRNA può avvenire durante tutte le fasi della loro

biogenesi.

Fin dalla loro scoperta, l’interesse per il ruolo rappresentato dai miRNA nella

regolazione genica è cresciuto esponenzialmente. Numerosi dati sperimentali hanno

dimostrato che i miRNA agiscono in numerosi processi cellulari, quali proliferazione,

apoptosi, differenziamento, trasduzione del segnale ed in processi fisiologici come il

metabolismo, la embriogenesi e l’organogenesi (Kloosterman and Plasterk, 2006;

Alvarez-Garcia and Miska, 2005).

I miRNA possono avere profili di espressione specifici per stadi di sviluppo, tessuti e

patologie; ciascun tessuto può così essere caratterizzato e da uno specifico e distinto

profilo di espressione di un gruppo di miRNA (Rana, 2007).

Il controllo dell’espressione genica avviene a livello post-trascrizionale, inducendo la

degradazione di specifici mRNA oppure impedendo la traduzione della proteina. Il

meccanismo d’azione che porta al silenziamento genico dipende dal grado di

complementarità tra il miRNA e il suo mRNA bersaglio. Il grado di complementarietà,

che si limita ad una regione di 6-8 nucleotidi all’estremità 5’ del miRNA detta “seed”, è

una caratteristica fondamentale per il destino dell’mRNA dopo il reclutamento del

RISC. Una ridotta omologia di sequenza porta generalmente alla repressione

traduzionale senza la degradazione dell’mRNA bersaglio, mentre se l’appaiamento

alla regione 3’UTR degli mRNA bersaglio è perfetto, come nei miRNA delle piante o in

alcuni miRNA animali, si verifica il taglio del messaggero, catalizzato dal complesso

RISC reclutato dal miRNA stesso, che porta infine alla degradazione dell’mRNA

bersaglio (Ambros, 2004).

Il meccanismo tramite cui RISC regola la traduzione è tutt’ora oggetto di attivo

dibattito; a tal riguardo sono stati proposti tre modelli:

• la repressione dell’inizio della traduzione (Pillai et al, 2005);

• la repressione della fase di allungamento della traduzione (Maroney et al,

2006; Nottrott et al, 2006);

• la destabilizzazione del trascritto attraverso un accorciamento della coda di

poli(A) (Wu et al, 2006).

Comunque il processo, qualora le informazioni di sequenza non siano sufficienti ad

indirizzare il meccanismo regolatorio, può essere influenzato anche da altri fattori,

quali la composizione proteica del RISC a cui è associato il miRNA, il pattern proteico

34

a cui il miRNA è correlato o il promotore che guida la trascrizione del gene bersaglio

(Filipowicz et al, 2008).

3.2 I miRNA intronici

I geni dei miRNA sono presenti nel genoma come unità independenti (miRNA

intergenici) o localizzati all’interno di introni di altri geni, definiti “ospite”, nello

stesso orientamento o nell’orientamento opposto (miRNA intronici; Rodriguez et al,

2004). Dati recenti riportano che circa il 50% dei geni per i miRNA si trova in regioni

intergeniche, mentre il restante 50% risiede in sequenze introniche di specifici geni

(Griffiths-Jones, 2007; Saini et al, 2008).

Mentre i miRNA che risiedono nell’introne di un gene nell’ orientamento antisenso

(opposto a quello della trascrizione) sono, per definizione, trascritti

indipendentemente dal gene ospite, fino a poco tempo fa si credeva che i miRNA

intronici orientati nello stesso senso del gene che li conteneva, fossero prodotti da un

trascritto comune a quello del gene ospite, ovvero dipendessero dal promotore del

gene ospite per la loro trascrizione (Bartel, 2004).

Se ciò fosse vero, l’espressione di questi miRNA potrebbe essere semplicemente

dedotta dal profilo di espressione del loro gene ospite. In effetti, in esperimenti di

microarray nell’uomo, è stata trovata una buona correlazione tra i livelli

d’espressione dei miRNA intronici e dei loro geni ospite (Baskerville and Bartel,

2005).

Sebbene diversi dati sperimentali esistano a supporto di questo modello di biogenesi

di “trascrizione comune” dei miRNA intronici con i loro geni ospite, un crescente

numero di evidenze mostra che molti miRNA intronici, con orientamento “senso”,

sono trascritti come unità trascrizionali indipendenti. Aboobaker e colleghi hanno

trovato che il pattern di ibridazione in situ di miR-7 in Drosophila è diverso da quello

del suo gene ospite bancal: mentre bancal è espresso ubiquitariamente, miR-7 ha un

modello molto particolare di espressione spazio-temporale, suggerendo differenze

nella regolazione in cis di questo miRNA e del suo gene ospite (Aboobaker et al,

2005). Nell’uomo, le nuove strategie “high throughput” per la caratterizzazione di

promotori, come la ChIP-seq per valutare le modificazioni istoniche e la presenza di

RNA polimerasi II, in combinazione o meno con l’analisi del posizionamento dei

nucleo somi, suggeriscono che circa un terzo dei miRNA intronici possiede un

35

promotore proprio indipendente da quello del gene ospite (Ozsolak et al, 2008;

Corcoran et al, 2009; Wang et al, 2009).

Tuttavia, non è ancora chiaro se la trascrizione dei miRNA intronici indipendente da

quella dei geni ospite sia un eccezione o piùttosto la regola.

3.3 miRNA e meccanismi epigenetici

Cambiamenti epigenetici, come la metilazione del DNA e la modificazione degli istoni,

giocano un ruolo molto importante nel rimodellamento della cromatina e nella

regolazione dell’espressione di geni codificanti per proteine nelle neoplasie umane

(Esteller, 2007). Tali meccanismi interessano anche la regolazione trascrizionale dei

miRNA e sono considerati meccanismi chiave nella modulazione della loro

espressione (Lujambio et al., 2008. Weber et al, 2007).

3.3. 1 miRNA e metilazione del DNA

Così come avviene per i geni codificanti proteine, anomali profili di metilazione di

isole CpG, situate all’interno o nelle vicinanze di un gene codificante per un miRNA,

possono determinare un’alterata espressione di alcuni miRNA, generando alterazioni

patogeniche, inclusa la tumorigenesi (Jones and Baylin, 2002).

Circa il 50% dei geni dei miRNA sono associati a isole CpG. Alcuni di questi miRNA

sono stati trovati essere metilati in alcuni tipi di tumore come il promotore del miR-

124a, ipermetilato in linee cellulari di cancro al colon ma non nel tessuto sano

(Lujambio et al, 2007). Nei tumori mammari è stato dimostrato che l’ipermetilazione

del promotore del miR-31 e del suo gene ospite, il lncRNA LOC554202, è uno dei

principali meccanismi che ne determinano il suo silenziamento (Augoff et al, 2012).

La ridotta espressione del mir-34b/c, componente cruciale nella via del segnale

dell’oncosoppressore p53 (Corney et al, 2007), correla con l’ipermetilazione dell’

isola CpG presente sul suo promotore nella maggior parte delle neoplasie al colon-

retto (Toyota et al, 2008; Lujambio et al, 2008). L’ipermetilazione delle isole CpG del

miR-34b/c, del miR-148 e del miR-9 risultano inoltre essere associate allo sviluppo di

metastasi in numerose neoplasie umane (Lujambio et al, 2008). Grady e colleghi

hanno trovato che il trattamento combinato di 5-AzaC, sostanza che demetila il DNA,

con l’inibitore delle HDAC tricostatina A (TSA) poteva ripristinare i livelli

36

d’espressione del miR-342 e del suo gene ospite EVL, (Grady et al, 2008). Per quanto

riguarda le leucemie, un esempio eccellente è il miR-223, un miRNA espresso

esclusivamente nelle cellule mieloidi. Fazi e colleghi hanno dimostrato che in blasti

AML con traslocazione t(8;21) che genera l’oncoproteina di fusione AML1/ETO, il

miR-223 è ipo-espresso. Ciò è dovuto al legame di AML1/ETO che, reclutando sul suo

promotore un complesso epigenetico che comprende le DNMT e le HDAC, ne causa il

silenziamento (Fazi et al, 2007).

3.3.2 miRNA e modificazioni istoniche

Le deacetilasi istoniche (HDAC) e le proteine del gruppo polycomb (PcG) sono gli

enzimi regolatori delle modificazioni istoniche più studiati. La perdita di acetilazione

nelle code istoniche, mediata dalle HDAC, risulta nella repressione genica. Le HDAC

sono state spesso trovate over-espresse in vari tipi di cancro (Halkidou et al, 2004;

Song et al, 2005), così sono diventate uno dei maggiori bersagli per le terapie

epigenetiche.

In un lavoro di Scott e colleghi, è stato dimostrato che trattando una linea di tumore al

seno con un inibitore delle HDAC, i livelli d’espressione di 27 miRNA venivano

rapidamente alterati (Scott et al, 2006). La metilazione del DNA e le modificazioni

istoniche lavorano spesso insieme nel regolare l’espressione dei miRNA. Ad esempio,

l’espressione del miRNA onco-soppressore miR-127 può essere altamente

incrementata dalla demetilazione del promotore e dall’ inibizione delle HDAC in

cellule tumorali umane (Saito et al, 2006).

E’ interessante notare che potrebbe esistere una regolazione a feedback; infatti,

alcuni studi hanno mostrato che un ristretto gruppo di miRNA può a sua volta

regolare l’espressione di enzimi chiave del macchinario epigenetico. Per esempio,

HDAC1 è stato dimostrato essere direttamente down-regolato dal miR-449a (Noonan

et al, 2009). I membri della famiglia del miR-29 (a/b/c) sono stati riportati reprimere

l’espressione degli enzimi DNMT3a e 3b appaiandosi al 3’UTR del loro trascritto

(Fabbri et al, 2007).

Questo ruolo nella regolazione a “feedback” indica una complessa rete tra microRNA

e macchinario epigenetico che aumenta la complessità delle conseguenze dell’alterata

regolazione epigenetica dei miRNA, attribuendogli un ruolo anche come controllori

della struttura cromatinica.

37

3.4 MicroRNA e tumori

3.4.1 MicroRNA e leucemie

I miRNA sono espressi in modo dinamico durante tutta l’ematopoiesi, ed è ormai

chiaro che questa classe di regolatori genici controlla il differenziamento e l’attività

delle cellule emopoietiche (Havelange e Garzon, 2010; Figura 4).

Chen e collaboratori per primi identificarono un ridotto gruppo di miRNA (miR-181,

miR-223 e miR-142) differenzialmente espresso nei tessuti ematopoietici murini

(Chen et al, 2004). Da allora, numerosi altri studi hanno chiaramente evidenziato che

i miRNA giocano ruoli importanti nel differenziamento ematopoietico. Considerata la

profonda implicazione dei miRNA nell’ematopoiesi, non è soprendente che un

crescente numero di studi abbia descritto un loro ruolo nei disordini ematopoietici.

Figura 4. Livello di espressione e meccanismi regolatori dei miRNA nell’ematopoiesi. CLP, Progenitore

linfoide comune; CMP, progenitore mieloide comune; DN, precursori di cellule T doppi negativi; DP,

doppi positivi (cellule T CD4+, CD8+); EMP, precursore eritrocita-megacariocitario; EP, precursore

eritrocitario; GMP, precursore granulocito-monocitario; GP, precursore granulocitario; HSC, cellula

staminale ematopoietica; MP, precursore megacariocitario. Le frecce verdi indicano una regolazione

positiva, le frecce rosse una regolazione negativa. I bersagli dei miRNA o i fattori coinvolti nella

regolazione dei miRNA sono in blu (da Havelange e Garzon, 2010).

38

Nelle leucemie, e nei tumori in generale, i miRNA possono funzionare da oncogeni

(onco-miR) attraverso vari meccanismi, e principalmente tramite la repressione di

proteine oncosoppressorie, oppure avere un ruolo di oncosoppressori, bersagliando

mRNA oncogenici. Le cause della deregolazione dell’espressione di specifici miRNA

nello sviluppo tumorale non sono ancora del tutto note. La maggior parte dei geni che

trascrivono per i miRNA risiede in particolari regioni genomiche conosciute come siti

fragili, che nelle cellule cancerose sono spesso soggette ad alterazioni (Calin et al,

2004). Il ruolo dei miRNA nelle leucemie fu per la prima volta evidenziato dal gruppo

di Calin nel 2002, il quale mostrò che pazienti affetti da una comune forma di

leucemia, la leucemia linfocitica cronica delle cellule B (LCL), presentavano

frequentemente delezioni o silenziamenti del cluster intronico di miRNA che

includeva miR-15a e miR-16-1 (Calin et al, 2002).

Il locus (13q14) dove mappano questi due miRNA risulta essere deleto in più del 65%

dei casi di LCL, come nel 16-40% dei mielomi multipli e nel 60% dei carcinomi

prostatici. In un altro studio, è stato dimostrato che il miR-15a e il miR-16-1 regolano

in maniera negativa il gene anti-apoptotico Bcl2, la cui iper-espressione è stata

riscontrata in molti tipi di tumori, inclusi le leucemie ed i linfomi (Cimmino et al,

2005). Il miR-223 potrebbe avere funzioni oncosoppressorie, almeno in alcuni

sottotipi di LAM: è stato dimostrato che AML1/ETO reprime l’espressione del miR-

223 tramite silenziamento epigenetico, e l’espressione ectopica di questo miR in

cellule di LAM è in grado di promuovere il differenziamento granulocitario (Fazi et al,

2007). Al contrario, il miR-155 rappresenta un classico esempio di onco-miR nelle

leucemie: l’espressione aberrante di questo miRNA è stata riscontrata in specifici

sottogruppi di LAM (Garzon et al, 2008a; Garzon et al, 2008b), e l’espressione forzata

del miR-155 in cellule staminali ematopoietiche (HSC) murine causa mielo-

proliferazione, splenomegalia e cambiamenti displastici (O’Connel et al, 2008). La

grande variabilità nel decorso ed esito della malattia nei pazienti di LAM, anche

all’interno di sottogruppi definiti a livello morfologico o citogenetico, ha suggerito la

possibilità che l’espressione di gruppi specifici di miRNA possa essere associata a

particolari sotto-tipi di leucemia e avere un significato prognostico. Ad esempio, Isken

e collaboratori hanno analizzato 50 casi di pazienti LAM e 12 campioni di controllo

per l’espressione di 154 miRNA umani. Questo studio mostra una iper-espressione

dei miR-34a, miR-221 e miR-222 nelle cellule di LAM rispetto a precursori

CD34+(Isken et al, 2008). Specifici profili di espressione di miRNA possono

39

consentire di discriminare le LAM dalle LAL, come è stato mostrato da uno studio nel

quale sono stati identificati 27 miRNA espressi differenzialmente tra LAL e LAM (Mi

et al, 2007). Tra questi miRNA, i miR-128a, -128b, - 223, e let-7b potevano distinguere

le LAL dalle LAM con un’accuratezza diagnostica del 97-99%. Garzon e collaboratori

hanno analizzato l’espressione di miRNA in cellule di LAP nel differenziamento

granulocitario indotto da ATRA (Garzon et al, 2007). In questo studio, il trattamento

con ATRA nella linea cellulare di LAP NB4 induceva una diminuita espressione del

miR-181b e un aumento di espressione dei miR-15a, -15b, -16, -107, -223, -342, let-

7a, let-7c e let-7d, suggerendo per questi ultimi una possibile funzione di

oncosoppressori (Garzon et al, 2007). Il nostro gruppo di ricerca ha recentemente

confermato ed esteso questi risultati in vivo in blasti primari di LAP (Careccia et al,

2009). In questo lavoro, campioni derivati da pazienti LAP, trattati con successo con

terapie a base di chemioterapici e ATRA, mostravano una diminuita espressione del

miR-181b, e un’aumentata espressione dei miR-15b, -16, -107, -223, -342 e let-7c.

Inoltre, è stato identificato uno specifico profilo di espressione di un ristretto gruppo

di miRNA che distingueva i blasti LAP dai promielociti normali. In particolare,

l’espressione del miR-342 e del let-7c risultavano significativamente ridotte nei blasti

leucemici rispetto a promielociti normali differenziati in vitro da progenitori CD34+.

Abbiamo dimostrato che, in cellule di LAP, i promotori di questi due miRNA erano

bersaglio dell’oncoproteina PML/RARα e, in risposta al trattamento con ATRA,

l’aumentata espressione del miR-342 e del let-7c era associata al distacco di

PML/RARα dai loro promotori (Careccia et al, 2009). Questi risultati suggerivano che

specifici profili di espressione di miRNA potevano distinguere le cellule di LAP dai

promielociti normali, e che la repressione trascrizionale dei miR-342 e let-7c ad

opera dell’oncoproteina PML/RARα poteva rappresentare un evento importante nella

leuchemiogenesi delle LAP.

3.4.2 MicroRNA e tumori solidi

E’ stato stimato che circa il 30% dei geni umani è regolato dai miRNA (Bartel, 2004).

Analisi di espressione hanno dimostrato che molti miRNA sono finemente regolati

durante lo sviluppo ed in modo tessuto-specifico (He and Hannon, 2004; Miska,

2005). Al contrario, un crescente numero di lavori mostra che un profilo di

espressione aberrante dei miRNA è associato con molte malattie umane,

40

specialmente con il cancro (Anindo and Yaqinuddin, 2012). Infatti, i miRNA possono

funzionare sia come oncogeni che come oncosoppressori e il ruolo ad essi associato

dipende dalla funzione di inibire l’espressione di geni soppressori tumorali o di

oncogeni. Esistono tuttavia anche dei casi in cui uno stesso miRNA funzioni sia come

oncogene che come oncosoppressore, ruolo che dipende dal contesto cellulare

specifico in cui si trova il miRNA: un esempio è il miR-29a. Il suo ruolo di soppressore

tumorale è stato dimostrato in tumori solidi come neuroblastoma, sarcoma, tumore

gastrico e tumore al cervello (Xu et al, 2009; Cui et al., 2011). In contrasto, il miR-29a

risulta avere un ruolo da promotore dell’oncogenesi nelle leucemie mieloidi acute

(AML) (Han et al, 2010) e nelle leucemie linfocitiche croniche del tipo B-cellule (B-

CLL) (Santanam et al, 2010).

Alcuni esempi di miRNA promotori dell’oncogenesi sono:

• il cluster miRNA 17-92, che regola la proliferazione, l’apoptosi e lo sviluppo

cellulare (Pospisil et al, 2011) e che risulta sovraespresso in diversi tipi di

tumori (Dixon-McIver et al, 2008; Volinia et al, 2006).

• Il miRNA-21 che risulta over-espresso in differenti tipi di tumore solido con la

funzione di inibire l’espressione di differenti geni soppressori tumorali con

conseguente aumento della proliferazione e/o diminuzione dall’apoptosi

(Huang et al, 2013).

• Il miRNA-155 che risulta altamente espresso in differenti tipi di tumori. Viene

processato a partire da un esone di un RNA non codificante, BIC (B Cell

Integration Cluster), che originariamente è stato descritto come il sito di

integrazione di DNA virale nei linfomi indotti da virus (Clurman and Hayward,

1989). Nel cancro alla mammella, la sua elevata espressione è associata ad un

aumento della sopravvivenza cellulare e della resistenza ai chemioterapici

(Kong et al, 2010). Nel tumore al colon, il miR-155 targhetta molti componenti

del sistema di riparo del DNA causando un elevato tasso di mutazioni al DNA e

l’instabilità di micro satelliti (Valeri et al, 2010).

• Il miRNA-30d regola la proliferazione, l’apoptosi, la senescenza, e la

migrazione nelle cellule tumorali. Il locus cromosomico che ospita il miR-30d è

stato trovato amplificato in più del 30% di molti tipi di tumore solido umano

ed è stato dimostrato che la sua inibizione blocca la crescita tumorale in vivo

(Li et al, 2012).

41

Esempi di miRNA che al contrario svolgono un ruolo di soppressori tumorali sono:

• I miRNA della famiglia let-7, la cui espressione risulta ridotta in differenti tipi

di tumori e di cui si conosce ampiamente in letteratura l’importante ruolo di

soppressori tumorali, ad esempio nel cancro al polmone. È stato visto infatti

che l’espressione endogena di questo miRNA riduce in vivo la crescita del

tumore in modelli di tumore al polmone (Kumar et al, 2008; Roush and Slack,

2008).

• Il miRNA-34, regolato trascrizionalmente da p53, è frequentemente represso

nel carcinoma al pancreas ed è implicato nella regolazione del ciclo cellulare,

dell’apoptosi e del riparo del DNA (Chang et al, 2007).

• I miR-143 e miR-145, i cui livelli di espressione risultano ridotti in differenti

tipi di tumori e il cui ripristino, nel tumore alla prostata e nel tumore colon-

rettale, riduce significativamente la crescita del tumore sia in vitro che in vivo

(Clape et al, 2009; Chen et al, 2009).

3.5 La famiglia di micro-RNA let-7

3.5.1 Aspetti generali sulla famiglia let-7

Particolarmente rilevante per l’argomento di questo lavoro di tesi, è il microRNA let-

7c, appartenente alla famiglia di miRNA let-7. Il gene lethal (let-7) fu inizialmente

scoperto come un gene essenziale per lo sviluppo in C.elegans, e fu uno dei primi

miRNA identificati (Reinhart et al, 2000). La famiglia di miRNA let-7, spesso presente

in copie multiple nel genoma, è molto conservata nelle specie animali (Tabella 2).

Per distinguere tra le diverse isoforme, una lettera posta dopo let-7 distingue i diversi

componenti della famiglia, che differiscono leggermente nella sequenza del miRNA

maturo. Un numero posto alla fine del nome può indicare che la stessa sequenza è

presente in copie multiple nel genoma. Ad esempio, nell’uomo esistono 10 sequenze

mature di let-7, e 13 loci genici. Tre precursori diversi codificano per lo stesso let-7a

maturo (let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3), e precursori di due loci genici diversi producono

il let-7f (let-7f-1 e let-7f-2).

42

Tabella 2. Organizzazione schematica dei membri di let-7 nelle diverse specie. I numeri nella tabella

rappresentano il numero di copie annotate in mirBase (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/). Il

Cluster 1 è costituito dal miR-100, 99, let-7, e miR-125; il Cluster 2 è rappresentato dal let-7a, d e let-7f.

Il Cluster 3 è composto dal let-7a-3 e let-7b, mentre il Cluster 4 è composto dal let-7f e miR-98 (da

Roush e Slack, 2008).

In C.elegans, il let-7 è un gene con funzioni eterocroniche (geni le cui mutazioni

causano trasformazioni fatali allo sviluppo temporale della cellula). Durante gli stadi

larvali dello sviluppo di C.elegans, le cellule dell’ipodermide, conosciute come cellule

di giunzione (“seam cells”), si dividono in modo analogo alle cellule staminali, con una

cellula figlia che differenzia e l’altra che mantiene le proprietà auto-rinnovanti e

continua il programma proliferativo. Alla transizione tra stadio larvale L4 e adulto, la

cellule figlia auto-rinnovante cessa di proliferare e differenzia. Cellule di giunzione

mutanti con perdita di funzione per let-7, falliscono nell’uscire dal ciclo cellulare a

questo stadio, e subiscono divisioni cellulari extra (Reinhart et al, 2000). La

maggioranza degli animali con perdita di funzione per let-7 muore a causa di questi

difetti nello sviluppo, e il mutante nullo è stato perciò definito lethal (let). Il ruolo

cruciale ricoperto da let-7 nello sviluppo di C.elegans è suggerito anche dalla sua

espressione strettamente regolata nel tempo, che comincia ad essere rilevata allo

stadio L3, e raggiunge il suo picco massimo durante lo stadio L4, in accordo con il suo

ruolo nel promuovere l’uscita dal ciclo cellulare e il differenziamento terminale delle

cellule di giunzione alla fine dello stadio larvale L4 (Esquela-Kersher et al, 2005).

Sebbene molte caratteristiche dei miRNA let-7 sembrino altamente conservate nelle

specie, esistono anche differenze cospicue passando da C.elegans agli organismi più

43

complessi. Ad esempio, il numero dei membri della famiglia è maggiore nei vertebrati,

e la sola sequenza matura del let-7a è identica tra tutte le specie animali, dal C.elegans

all’uomo. Gli altri membri hanno identica “seed”, ma differiscono in varia misura nei

nucleotidi rimanenti (Roush e Slack, 2008). Anche i meccanismi regolatori

dell’espressione temporale di let-7 possono differire tra invertebrati e organismi

superiori. Alcuni studi hanno mostrato che negli eucarioti inferiori, come in C.elegans

e Drosophila, la regolazione avviene a livello della trascrizione del pri-let-7 (Sempere

et al, 2002; Johnson et al, 2003), mentre nei mammiferi intervengono meccanismi più

complessi, e la regolazione può avvenire sia livello trascrizionale che post-

trascrizionale (Newman et al, 2008; Viswanathan et al, 2008).

Ad ogni modo, la comparsa di let-7 maturo negli stadi avanzati dell’embriogenesi è

una caratteristica conservata in molti organismi, come nel tessuto cerebrale di topo e

Danio rerio (Lagos-Quintana et al, 2002; Wulczyn et al, 2007). In contrasto con la loro

espressione nei tessuti differenziati, forme mature di let-7 sono assenti in cellule

staminali embrionali umane e murine, e un tema comune sembra un loro aumento di

espressione in seguito al differenziamento (Lagos-Quintana et al, 2002; Sempere et al,

2004; Mineno et al, 2006; Wulczyn et al, 2007), rispecchiando l’espressione di let-7

nelle cellule di giunzione differenzianti di C.elegans. In effetti, una delle funzioni

principali del let-7 sembra quella di promuovere il differenziamento cellulare:

l’espressione del let-7a, let-7c e let-7e maturi è aumentata durante lo sviluppo

cerebrale di topo (Wulczyn et al, 2007), e in un altro studio il let-7 è stato trovato

espresso in progenitori cellulari di tessuto mammario indotti a differenziare (Ibarra

et al, 2007). Un’altra funzione della famiglia let-7 è il controllo del ciclo cellulare: la

perdita di let-7 in C.elegans e Drosophila conduce ad una iper-proliferazione cellulare

(Reinhart et al, 2000; Caygill e Johnston, 2008) e, allo stesso modo, il blocco

d’espressione di let-7 nella linea di carcinoma polmonare umana A549 induce

un’aumentata proliferazione, mentre la sua iper-espressione blocca la progressione

del ciclo cellulare (Johnson et al, 2007). Alcuni studi suggeriscono che bassi livelli di

let-7 potrebbero essere usati come una caratteristica diagnostica di certe popolazioni

di cellule staminali: ad esempio, una bassa espressione di let-7c è stata usata per

arrichire le cellule staminali in una linea di epitelio mammario murino Comma-Dβ,

mentre un’iper-espressione di let-7c riduceva la sotto-popolazione delle cellule auto-

rinnovanti (Ibarra et al, 2007).

44

Questi dati suggeriscono che la regolazione del differenziamento e della

proliferazione cellulare sono funzioni conservate della famiglia let-7 durante

l’evoluzione delle specie. Tuttavia, sebbene i miRNA della famiglia let-7 abbiano

caratteristici “pattern” di espressione temporali durante lo sviluppo, un ruolo diretto

del let-7 nello sviluppo dei vertebrati non è stato ad oggi chiaramente dimostrato. Il

ritardo nell’identificazione di queste funzioni è probabilmente dovuto alle difficoltà

associate al silenziamento dei molteplici membri della famiglia nello stesso animale, e

alla possibile ridondanza dei membri di una famiglia così numerosa (Roush e Slack,

2008).

3.5.2 Let-7 e tumori

Le proprietà di de-differenziamento e di aumento della proliferazione appena

descritte, sono anche caratteristiche tipiche delle cellule tumorali. In effetti, la ridotta

espressione di vari membri della famiglia let-7 è stata associata a molti tumori umani

(Büssing et al, 2008) ed alle cellule staminali tumorali (Yu et al, 2007), suggerendo un

ruolo di questi miRNA come oncosoppressori nei tumori umani. In particolare,

l’espressione dei miRNA let-7 è stata trovata ridotta in linee cellulari e tessuti primari

di carcinoma polmonare (Takamizawa et al, 2004; Johnson et al, 2007) e, in pazienti

affetti da carcinoma polmonare a cellule non piccole, associata a cattiva prognosi

(Takamizawa et al, 2004). Questi dati sono in accordo con l’osservazione che diversi

membri della famiglia let-7 mappano su siti cromosomici frequentemente deleti nei

tumori polmonari (Calin et al, 2004). Potenziali meccanismi molecolari di una

funzione oncosoppressoria dei miRNA let-7 emergono da diversi studi, nei quali è

stato riportato che let-7 regola numerosi oncogeni. E’ stato dimostrato che K-RAS e N-

RAS sono bersagli molecolari di let-7, suggerendo che questi miRNA possano

funzionare da oncosoppressori nei carcinomi polmonari in vivo riducendo

l’espressione di RAS (Johnson et al, 2005). Un altro bersaglio molecolare di let-7 è

l’oncogene MYC, sebbene la rilevanza in vivo di questa interazione debba essere

ancora completamente chiarita (Leucci et al, 2008). Il cluster altamente conservato

del let-7a, let-7d e let-7f può essere coinvolto nei linfomi a cellule B, poiché sembra

esser regolato direttamente dall’oncogene v-myc (v-myc myelocytomatosis viral

oncogene homolog). E’ stato dimostrato che let-7a reprime l’espressione di MYC nel

linfoma di Burkitt, suggerendo l’esistenza di un circuito a “feedback” negativo

45

(Sampson et al, 2007; Chang et al, 2008). Numerosi gruppi hanno riportato che un

altro importante oncogene, HMGA2, è regolato negativamente da membri della

famiglia let-7 (Lee e Dutta, 2007; Mayr et al, 2007). Nei tumori le mutazioni di HMGA2

frequentemente causano delezioni del 3’ UTR, portando all’eliminazione dei siti di

legame per let-7, e alla iper-espressione della proteina HMGA2 che promuove il

cancro (Mayr et al, 2007). Numerosi lavori hanno identificato altri bersagli dei miRNA

let-7 che supportano la potenziale rilevanza di questa famiglia di miRNA nel controllo

del ciclo cellulare in cellule tumorali: CDC25a e CDK6, due regolatori fondamentali

nella progressione del ciclo cellulare, si sono rivelati bersagli diretti di let-7 (Johnson

et al, 2007), così come la ciclina D1 (Schultz et al, 2008).

Studi recenti riportano che due proteine in grado di legare l’RNA, Lin28 e Lin28B,

sono in grado di bloccare il corretto processamento e maturazione dei precursori

della famiglia let-7, suggerendo che l’aberrante aumento di espressione di Lin28 e

Lin28B, frequentemente riscontrata nei tumori umani, possa promuovere la

tumorigenesi tramite la repressione di let-7 (Viswanathan et al, 2009). La proteina

Lin28 lega il trascritto primario e il precursore a forcina del microRNA (pri-let-7 e

pre-let-7) inibendo il taglio da parte di Drosha. Lin28 è in grado anche di promuovere

l’uridilazione terminale del pre-let-7, mediante una uridil-transferasi 3’terminale,

determinando la degradazione del trascritto. Questo indica che Lin28 inibisce la

processazione attuata da Dicer (Viswanathan et al, 2008; Viswanathan and Daley,

2010). Inoltre, il ripristino dell’espressione di let-7 in cellule di leucemia mieloide

cronica K-562 mediante inibizione dell’espressione di Lin28, diminuisce la capacità

proliferativa e quella di formare colonie in soft agar, e stimola modificazioni

morfologiche indicative di un’induzione del differenziamento (Newman et al, 2008;

Viswanathan et al, 2008; Viswanathan et al, 2009).

Nonostante la ridotta espressione dei membri della famiglia let-7 sia stata

generalmente associata ad un aumento della capacità trasformante in vitro in vari tipi

tumorali, alcuni dati contrastanti in vari tipi di cancro suggeriscono che la funzione

della famiglia let-7 non sia ancora completamente chiarita, e che singoli membri della

famiglia let-7 possano avere ruoli distinti. E’ possibile infatti che i 13 loci genici di let-

7 nell’uomo non esistano semplicemente per avere diverse funzioni nei vari tessuti,

ma potrebbero avere differenti funzioni nella stessa cellula. Alcuni lavori riportano

che in certi tumori alcune isoforme di let-7 sono iper-espresse mentre altre sono

perse. Ad esempio, in uno studio sul mesotelioma maligno, è stato trovato iper-

46

espresso il let-7b, mentre l’espressione del let-7g era fortemente ridotta (Guled et al,

2009).

Per quanto riguarda il let-7c, particolarmente importante per il lavoro di questa tesi,

è un miRNA intronico localizzato sul cromosoma 21 in un introne del gene non-

codificante proteine LINC00478, all’interno del quale si trovano anche il miR-99a and

miR-125b-2, ed è espresso ubiquitariamente in tessuti murini ed umani (Ro et al,

2007). Let-7c presenta funzioni oncosoppressive che correlano con il suo

coinvolgimento nella carcinogenesi (Shell et al, 2007). E’ stato individuato un gruppo

di LOG (let-7–regulated oncofetal genes) sovra-espressi in molti carcinomi umani la

cui sovra-espressione correlava con la perdita di espressione di let-7. L’RNA di questi

geni era ipo-regolato da una sovra-espressione esogena del let-7(Boyerinas et al,

2008). Questa attività di oncosoppressore è stata riportata anche in modelli di

tumore della prostata e del polmone. In particolare, nei carcinomi polmonari la

modulazione dell’espressione del let-7c è strettamente correlata a quella

dell’oncogene RAS, la cui attivazione è un evento cruciale per l’insorgenza della

neoplasia (Johnson et al, 2005; Ozen et al, 2008). Il let-7c è stato mostrato essere

anche direttamente implicato nell’epatocarcinoma, essendo la sua espressione

diminuita durante la progressione tumorale (Pineau et al, 2010).

Nei tumori ematopoietici, il let-7c è regolato negativamente in pazienti di LAM con

t(8;21), inv(16) e con Linfoma di Burkitt (Jongen-Lavrencic et al, 2008; Leucci et al,

2008). Jongen-Lavrencic e colleghi, hanno valutato l’espressione di 260 miRNA in 215

casi LAM di nuova diagnosi, appartenenti a diversi gruppi citogenetici. In questo

studio hanno mostrato che una ridotta espressione di let-7b e let-7c consentiva di

discriminare le LAM con t(8;21) e inv(16) dagli altri gruppi definiti a livello

molecolare, suggerendo un potenziale ruolo onco-soppressivo di let-7b e let-7c in

questi sottotipi di leucemia (Jongen-Lavrencic et al, 2008). Inoltre, nostri dati recenti

mostrano che l’espressione ectopica del let-7c è sufficiente a indurre il

differenziamento mieloide in linee cellulari e blasti primari derivati da pazienti di

AML di nuova diagnosi (Pelosi et al, 2012).

In conclusione, la funzione della famiglia di miRNA let-7 come oncosoppressore in

molti tipi di cancro, incluse le leucemie, rende estremamente importante sia la

comprensione di come i vari membri let-7 vengano regolati, che l’ulteriore

definizione di quali siano i loro bersagli nella tumorigenesi e i meccanismi molecolari

47

nei quali sono implicati. E’ possibile infatti che la dettagliata comprensione di questi

meccanismi possa condurre allo sviluppo di nuove terapie contro il cancro.

48

Obiettivi della ricerca

Dati recenti suggeriscono che una significativa porzione del genoma umano è regolata

da miRNA. Numerosi studi hanno, inoltre, dimostrato che l’espressione dei miRNA è

spesso deregolata nelle malattie umane, incluse quelle che riguardano il tessuto

ematopoietico. Comunque, sebbene l’importanza biologica dei miRNA sta diventando

sempre più chiara, la regolazione della loro espressione non è ancora pienamente

conosciuta. Nel laboratorio in cui è stata svolta questa tesi, è stata osservata un’espressione

coordinata del let-7c con il suo gene ospite LINC00478, che è un bersaglio del

repressore trascrizionale PML/RARα . Inoltre, in seguito a trattamento con ATRA, che

porta alla rimozione di PML/RARα, il let-7c mostrava una coordinata espressione con

il suo gene ospite suggerendo, quindi, che l’espressione del miRNA fosse regolata

esclusivamente dal promotore del suo gene ospite (Careccia et al., 2009). Il let-7c è un

miRNA intronico, e fino a poco tempo fa era opinione diffusa che tali miRNA, a

differenza di quelli intergenici che presentano elementi regolatori propri, fossero

semplicemente trascritti dal promotore del gene ospite con un meccanismo mediato

dalla RNApol II, e maturati in seguito, tramite il canonico macchinario di “splicing”

dell’RNA. Tuttavia, recentemente è stato dimostrato come la regolazione dei miRNA

intronici sia molto più complessa (vedi Discussione), ammettendo l’esistenza anche di

una loro regolazione indipendente dal gene ospite.

Per quanto sopradetto, lo scopo di questa ricerca è quello di valutare l’esistenza di un

promotore per il let-7c in grado di regolarlo indipendentemente dal suo gene ospite e

di identificare i possibili meccanismi di regolazione trascrizionale coinvolti nella

ridotta espressione del let-7c in blasti di LAP rispetto a promielociti normali.

49

Materiali e metodi Linee cellulari e condizioni di coltura Le linee cellulari leucemiche NB4, HEL, HL-60, KG-1, K-562, SKNO-1, THP-1, U937 e

UF-1 sono state cresciute in terreno di coltura RPMI + Glutamax (Gibco, Life

Technologies) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) o 20% per le BV-173,

GDM-1, KG-1a, KASUMI-1 e PL-21 inattivato per 1 ora a 56 °C (Hyclone, Perbio, Logan,

Utah), e 1% di penicillina-streptomicina (Cambrex Bio-Science, Verviers, Belgio). Le

OCI-AML3 sono state coltivate in alpha-MEM (Life Technologies Invitrogen, Carlsbad,

CA, USA) con l’aggiunta del 20% di siero bovino fetale (FBS, Hyclone, Perbio, Logan,

Utah) e 1% di penicillina-streptomicina (Cambrex Bio-Science, Verviers, Belgio). Le

cellule, che crescono in sospensione, sono state piastrate ad una concentrazione

compresa tra 0,1-1 x 106 cellule/mL.

Le linee cellulari di adenocarcinoma polmonare H1299 e A549, di adenocarcinoma di

mammella MCF-7 e di carcinoma ovarico A2780 sono state cresciute in RPMI (Life

Technologies Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) con il 10% di FBS (Cambrex Bio-Science,

Verviers, Belgium) e 1% di penicillina-streptomicina (Cambrex Bio-Science, Verviers,

Belgio). Le linee di adenocarcinoma di mammella SKBR3 e MDA-231, di

neuroblastoma SH-SY5Y, di epatocarcinoma Hep-G2 e di carcinoma colorettale HCT-

116 sono state cresciute in Dulbecco’s modified Eagles medium (DMEM; Life

Technologies Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) contenente il 10% di FBS o 15% FBS per

le SH-SY5Y, (Cambrex Bio-Science, Verviers, Belgium) e 1% di penicillina-

streptomicina (Cambrex Bio-Science, Verviers, Belgio). La linea di adenocarcinoma di

prostata LNCaP è stata cresciuta in RPMI con 10% FBS (Cambrex Bio-Science,

Verviers, Belgium), 1% di penicillina-streptomicina (Cambrex Bio-Science, Verviers,

Belgio), e con l’aggiunta di glucosio allo 0,35%. Tutte le linee sono state coltivate alla

temperatura di 37 °C, in atmosfera con 5% di CO2 e umidità al 90%.

I trattamenti con acido retinoico tutto-trans (ATRA; Sigma, St Louis, MO) sono stati

fatti alla concentrazione di 1 µM per 24h nei saggi luciferasici e 72h per l’analisi di

ChIP.

50

Preparazione di RNA e cDNA

L’estrazione dell’RNA totale dalle cellule analizzate è stata effettuata con il metodo

che impiega il reagente Trizol®, seguendo il protocollo fornito dalla ditta (Reagent,

GibcoBRL).

Per la preparazione di cDNA, è stato usato 1 μg di RNA totale per campione, in una

miscela di reazione contenente i seguenti componenti:

• RT-buffer 1X [Tris-SO4 pH 9,1; (NH4)2SO4 90 mM];

• 200 nM dNTP;

• 150 ng di esameri casuali (sequenze casuali di nucleotidi in grado di appaiarsi a

qualsiasi sequenza di RNA);

• 2,5 μM ditiotreitolo (DTT);

• 2 unità RNasi Out;

• 10 unità retrotrascrittasi del virus della leucemia murina (M-MLV, 10 u/μl, Roche

Diagnostics).

La miscela di reazione è stata portata ad un volume finale di 30 μl con acqua RNasi

free ed i campioni incubati per 1 h a 37°C.

Stem-loop RT-PCR

L’espressione del let-c maturo è stata misurata tramite un metodo che prevede una

retrotrascrizione che fa uso di primers “stem-loop”, seguita dall’analisi mediante

Real-Time PCR (stem loop RT-PCR; Chen et al, 2005). Per ogni campione, sono stati

retro-trascritti 50 ng di RNA totale in una mix di reazione così composta:

• dNTP mix (100 mM) 0,15 µl

• Multiscribe™ RT (50U/µl) 1,00 µl

• 10 X RT Buffer 1,5 µl

• Rnase inhibitor (20 U/µl) 0,19 µl

alla quale sono stati aggiunti 3 µL di primer microRNA-specifico per hsa-let-7c,

oppure per lo “small-non coding” RNA U19 (RNU19), usato come normalizzatore

51

interno (0,25 mM; Applied Biosystems), e acqua RNasi-free fino al volume finale di 15

µL. La mix di reazione è stata incubata 5 minuti in ghiaccio, poi 30’ a 16°C, 30’ a 42°C,

e 5’ a 85°C.

Real Time PCR

Le reazioni di Real-Time PCR (qRT-PCR), sono state effettuate utilizzando un

termociclatore della ditta Applied Biosystem modello 7500 Real Time PCR System

SDS v1,2.

L’espressione del let-7c è stata misurata mediante primers e sonda specifici,

sintetizzati dalla ditta Applied Biosystem. Le reazioni di amplificazione per ciascun

campione sono state effettuate in triplicato in un volume finale di 20 μl contenente: 1

μl del prodotto di retro-trascrizione specifico per il miRNA, 10μl di TaqMan®

Universal PCR Master Mix 2X (Applied Biosystem), 1 μl di una mix di sonda

TaqMan® 200 nM, primer senso e primer antisenso 20x (Applied Biosystem) e acqua

DNasi ed RNasi-free. Il ciclo di amplificazione usato è quello standard, che prevede

una prima fase di 2 minuti a 50°C, una seconda fase di 10 minuti a 95°C seguita da

una successione di 40 cicli a 95°C per 15 secondi e 60°C per 1 minuto ognuno. I dati

ottenuti sono stati analizzati con il metodo comparativo dei ΔΔCt o delle fold change.

Per l’espressione di let-7c, la normalizzazione è stata fatta con sonde e primers

specifici per lo “small-non coding” RNU19 (Applied Biosystem).

L’espressione di LINC00478 è stata misurata con il metodo Sybr Green®; le reazioni

di amplificazione, per ciascun campione, sono state effettuate in triplicato in un

volume finale di 20 μl contenente: 1 μl del prodotto di retro-trascrizione, 10 μl di Sybr

Green® Master Mix 2x, primers specifici 300 nM (FW -

CCATGGTGATGTGAAGATGAGAA; RV - CCTGAAGATCTGGTTTGCAGAA) e acqua fino al

volume di 20 μl. Il ciclo di amplificazione usato è quello standard, incluso lo stadio

finale di dissociazione. I dati ottenuti sono stati analizzati con il metodo comparativo

dei ΔΔCt. La normalizzazione è stata fatta con primers specifici per il gene GAPDH

(FW - TCCCTGAGCTGAACGGGAAG; RV - GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT).

52

Analisi bioinformatica

Al fine di identificare un putativo nuovo inizio della trascrizione, una regione di 10kb

a monte del pre-let-7c è stata sottomessa a vari motori di ricerca in grado di

riconoscere elementi regolatori caratteristici dei promotori. In particolare sono stati

usati:

Promoter Scan v.1.7 (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/);

BDGP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html);

FPROM(http://www.softberry.ru/berry.phtmlgroup=programs&subgroup=promoter

&topic=fprom).

È stata inoltre eseguita, con il software MatInspector Professional di Genomatix

(http://www.genomatix.de), una ricerca di siti di legame per specifici fattori di

trascrizione nella regione al 5’ del putativo TSS identificato in silico.

Per identificare la presenza di isole CpG è stato usato il software CpG Island

searcher(http://cpgislands.usc.edu/).

5‘ rapid amplification of cDNA ends (5‘ RACE)

Questa procedura, il cui protocollo è fornito dal kit commerciale della Invitrogen,

permette la sintesi e l’amplificazione della regione 5’ terminale del cDNA mediante

PCR.

La sintesi del primo filamento di cDNA è stata effettuata partendo da 5μg di RNA

estratto dalla linea cellulare LNCaP con Trizol (Invitrogen) trattato con DNasi I,

utilizzando primers specifici (GSP1) [GSP1: 5’-ACGTAAAATGTCTTCTGAC-3’]. La

reazione è catalizzata da una trascrittasi inversa fornita dal kit (SuperScript TM II RT)

in presenza di PCR buffer, MgCl2, dNTPs e DTT. Dopo la sintesi è stato ottenuto un

doppio filamento ibrido formato da mRNA-cDNA. L’emifilamento di mRNA è stato

degradato attraverso l’utilizzo di una RNAsi mix. A questo punto il cDNA a singolo

filamento è stato purificato mediante l’utilizzo di una colonna S.N.A.P., fornita dal kit. I

componenti del buffer, i dNTPs non utilizzati, gli enzimi ed i primer rimasti in

soluzione sono stati così rimossi.

53

E’ stata quindi aggiunta all’estremità 3’ del cDNA, attraverso l’utilizzo della TdT

(Terminal deoxynucleotidil Transferase) e in presenza di dCTP, una coda

omopolimerica di poli(C) che permette di creare un sito di attacco per un primer di

ancoraggio (anchor primer) che sarà utilizzato nella successiva reazione di

amplificazione.

Il cDNA poliC è stato successivamente amplificato tramite una reazione di PCR

usando un primer senso GSP-2 [GSP2: 5’-AGGGTTTGGACCAGGATCT-3’] che appaia a

monte del primer GSP-1 ed un primer antisenso AAP (Abridged Anchor Primer),

fornito nel kit, complementare alla coda di poliC.

Il prodotto di PCR è stato controllato mediante elettroforesi su gel d’agarosio e la

dimensione della banda amplificata è stata valutata dal confronto con il marker 1Kb

DNA ladder plus (Invitrogen). Successivamente, è stata eseguita una nested PCR con

un primer senso GSP3 che appaia a monte del primer GSP2 [GSP3: 5’

CAAAATGCTATACACAGTGCCG-3’] ed un primer antisenso AUAP (Abridged Universal

Amplification Primer) che appaia con l’AAP.

Il prodotto di PCR è stato quindi clonato nel TA cloning vector pCR2.1 (Invitrogen) e

sequenziato.

Costrutti luc e saggi luciferasici

Il frammento di 1.7 Kb del promotore intronico del let-7c, contenente i siti RARE non

canonici, la TATA box e la sequenza CAAT, è stato amplificato tramite PCR

convenzionale utilizzando DNA genomico umano usando i seguenti primers:

FW: 5’-AAAAGAGCTCGCAGTTTGTGTCCCATTGAA-3’

RV: 5’-AAAACTCGAGGAGAATTGAAGCCTGCCTTG-3’.

Il frammento di 2 Kb del promotore del gene ospite è stato amplificato allo stesso

modo con i seguenti primers:

FW: 5’-AAAAAGCTAGCGACAGCCACAGT-3’

RV: 5’-AAAACTCGAGAACCAGCCAGTG-3’.

I prodotti amplificati sono stati separati mediante elettroforesi su gel d’agarosio “low

melting” (SeaPlaque GTG). Le banda corrispondenti ai frammenti d’interesse sono

54

state isolate e purificate utilizzando il QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) e clonate

nel vettore pGL3 Basic (Promega) a monte del gene della luciferasi.

Per i saggi di attività luciferasica, la linea cellulare NB4 è stata trasfettata mediante

elettroporazione con Nucleofector 4D system (Lonza, Walkersville, MD,USA) con 0,4

µg dei costrutti luc contenenti il frammento di promotore intronico del let-7c (pGL3-

let-7c-intronic prom), il frammento di promotore del gene ospite (pGL3-LINC00478

prom), il vettore pGL3-Basic vuoto (Ctrl) e 10 ng di Renilla luciferasi pRL-TK. Il

vettore pRL-TK, che fornisce un’espressione costitutiva della luciferasi Renilla, è stato

co-trasfettato come controllo interno per correggere le differenze sia nell’efficienza di

trasfezione che di raccolta delle cellule. Dopo 16 ore dall’elettroporazione è stato fatto

un cambio di terreno e le cellule sono state trattate con ATRA 1µM. 24 ore dopo il

trattamento sono state raccolte.

Le linee cellulari H1299 e LNCaP sono state trasfettate transientemente con

Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) in dish da 60 mm, usando 2 µg dei vettori pGL3-

let-7c-intronic prom, pGL3-LINC00478 prom, il vettore pGL3 Basic vuoto e 10 ng di

Renilla luciferasi pRL-TK. Le cellule sono state raccolte 24 ore dalla trasfezione.

L’attività luciferasica è stata misurata e normalizzata con l’attività della Renilla,

usando il kit Dual Luciferase assay (Promega). L’attività luciferasica normalizzata del

controllo (pGL3 Basic) è stata posta uguale a 1. Per ogni esperimento, i punti sono

stati fatti in triplicato.

Trasfezioni transienti

La linea cellulare NB4 è stata trasfettata mediante elettroporazione con Nucleofector

4D system (Lonza, Walkersville, MD,USA). Per ogni campione, 2-4 x 106

cellule/cuvetta sono state centrifugate a 200 g a temperatura ambiente (RT) per 10’. I

pellet sono stati risospesi in 100 µL di buffer di elettroporazione SF + Supplement 1

(Lonza) cui sono stati aggiunti 0,4 µg dei costrutti luc, 10 ng di Renilla luciferasi pRL-

TK, usata come normalizzatore interno, e trasferiti in cuvetta. Il programma di

elettroporazione usato è stato il EH-100. Dopo l’elettroporazione, le cellule sono state

incubate per 10’ a RT, poi piastrate alla densità di 1 milione cellule/mL in terreno

senza antibiotici. Dopo 16 ore è stato fatto un cambio di terreno e le cellule sono state

piastrate in terreno completo alla densità di 0,1-0,2 milioni/mL. L’efficienza di

55

trasfezione è stata verificata elettroporando le cellule in cuvetta alle medesime

condizioni con 0,4 µg di plasmide pmaxGFP® (Lonza), e misurando la percentuale di

cellule GFP-positive a 24 ore dalla trasfezione tramite conta al microscopio. Nei vari

esperimenti, l’efficienza di trasfezione è stata del 59% ±5%.

Le linee cellulari H1299 e LNCaP sono state trasfettate transientemente con

Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) in dish da 60 mm secondo il protocollo fornito

dalla ditta.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) L’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica che permette

l’individuazione, in sistemi cellulari, dei legami esistenti tra le proteine e specifiche

regioni del DNA. La tecnica si basa sul fatto che è possibile convertire in legami

covalenti le deboli interazioni tra i fattori trascrizionali ed il DNA. L'utilizzo della ChIP

prevede che le cellule siano inizialmente fissate con formaldeide all’1% che permette

di convertire in legami covalenti le deboli interazioni tra i fattori trascrizionali ed il

DNA genomico (crosslink del DNA). Il DNA legato covalentemente alle proteine viene

sottoposto a “sonicatura” e cioè ridotto, con l’utilizzo di ultrasuoni, a frammenti di

dimensioni comprese fra 500 e 2000 paia di basi. Dopo “sonicatura” il materiale

ottenuto è utilizzato in esperimenti di immunoprecipitazione con anticorpi specifici

per la proteina di interesse. La cromatina immunoprecipitata è poi sottoposta ad una

reazione di “reverse crosslinking” per scindere il legame tra il fattore proteico

selezionato nell’immunoprecipitazione e la sua sequenza bersaglio. Una successiva

reazione di PCR con sequenze di innesco specifiche sul DNA immunoprecipitato

consente poi di identificare le sequenze di DNA connesse con le proteine di interesse

(Gurtner et al, 2003).

a) “Crosslinking” con formaldeide

La formaldeide è stata aggiunta direttamente al terreno di coltura delle cellule ad una

concentrazione finale dell’1% per 10 minuti alla temperatura di 22°C. Per evitare che

la formazione di troppi legami mascheri i siti antigenici delle proteine stesse, la

reazione è stata bloccata aggiungendo glicina 0,125 M per 5 minuti a 22°C. Quindi le

cellule sono state raccolte, lavate con PBS 1X freddo, e centrifugate per ottenere i

pellet cellulari.

b) Preparazione dei nuclei

56

Il pellet cellulare è stato risospeso in 5 volumi di tampone di lisi (PIPES 5 mM pH 8;

KCl 85 mM; NP40 0,5%), e lasciato in ghiaccio per 30 minuti. I nuclei sono stati quindi

separati meccanicamente con l’apposito pestello “Dounce” (Wheaton Instruments) e

recuperati centrifugando per 10 minuti a 2000 rpm a 4°C. Il pellet nucleare è stato

risospeso in 500-1000 μl di tampone di “sonicatura” (SDS 0,1%; EDTA 10 mM; Tris-

HCl 50 mM pH 8).

c) Frammentazione della cromatina

La cromatina contenuta nei nuclei isolati è stata frammentata con il sonicatore

(Bandelin Sonopuls HD 2070) in ghiaccio per 1 minuto alla massima potenza. I

parametri di “sonicatura” (tempo e potenza) variano da campione a campione. Le

dimensioni dei frammenti di DNA ottenuti sono stati controllati caricando 5 μl della

soluzione di cromatina su un gel d’agarosio allo 0,8%. Quindi i detriti cellulari sono

stati rimossi centrifugando a 14000 rpm per 10 minuti a 4°C. Il supernatante è stato

successivamnte diluito 10 volte nel tampone di diluizione (SDS 0,01%; TritonX-100

1,1%; EDTA 1,2 mM; Tris-HCl 16,7 mM pH 8,1; NaCl 16,7 mM).

d)“Pre-clearing” della cromatina

La cromatina “sonicata” è stata incubata per 1 ora in agitazione continua a 4 °C con 20

μl di proteina G coniugata alle biglie di agarosio (Pierce) per eliminare la frazione di

DNA con sequenze altamente ripetute che possono legarsi aspecificamente alle resine

usate nell’immunoprecipitazione. Successivamente i campioni sono stati sottoposti a

breve centrifugazione a 14000 rpm e il sovranatante recuperato.

e) Immunoprecipitazione della cromatina

Per la successiva immunoprecipitazione il sovranatante è stato diviso in aliquote

uguali da 60 μg di DNA ed immunoprecipitato, a 4 °C in agitazione per una notte, con i

seguenti anticorpi specifici: anti-PML (PG-M3 and H-238), anti-RXR (∆N 197), anti-

p300 (N-15) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-HDAC1 (3284)

(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) anti-H3K9me3 (ab8898) (Abcam, Cambridge, UK);

anti-H3K4me2 (07-030), anti-H3K4me3 (07-473), anti-H3K9ac (07-352), anti-

H3K14ac (07-353), anti-H3K27ac (07-360) (Millipore, Billerica, MA, USA). In un

campione (il No Ab) non è stato aggiunto nessun anticorpo.

f) Raccolta degli immunocomplessi

Per la raccolta degli immunocomplessi sono stati aggiunti 30 μl di proteina G saturata

(vedi avanti Saturazione della proteina G) agli immunocomplessi e incubati per 2 ore

a 4°C. In questo modo gli immunocomplessi che si sono formati tra gli anticorpi e le

57

loro proteine bersaglio, eventualmente legate al DNA, si legano attraverso il loro

frammento cristallizzabile (FC) alla proteina G e possono in tal modo essere raccolti

centrifugando a 14000 rpm. Dopo centrifugazione, il supernatante che conterrà la

cromatina non immunoprecipitata è stato rimosso, e gli immunocomplessi legati alle

biglie sono stati sottoposti a 10 lavaggi. E’ stato recuperato solamente il supernatante

dei campioni No Ab, che viene utilizzato come “input”, che sarà trattato dal “reverse

crosslinking” in poi. L’“input”, amplificato attraverso la PCR, fornisce infatti sia una

misura della quantità di cromatina che era contenuta nei diversi campioni al

momento dell’immunoprecipitazione, sia informazioni sulla specificità

dell’amplificazione di una sequenza bersaglio ottenuta dalla PCR.

g) Saturazione della proteina G

Contemporaneamente all’immunoprecipitazione della cromatina (punto e), alle

stesse condizioni di tempo e temperatura, la quantità di proteina G necessaria per la

raccolta degli immunocomplessi (30 μl per campione) è stata saturata, incubandola

con 1 mg/ml di DNA di salmon-sperma “sonicato” e 1 mg/ml di albumina sierica

bovina (BSA), in un volume finale di 60 μl a campione raggiunto aggiungendo

tampone di immunoprecipitazione (SDS 0,1 %, EDTA 10mM, Tris HCl 50 mM pH 8,

desossicolato 0,5%, LiCl 150 mM). Lo scopo di questo passaggio è quello di

neutralizzare i siti della proteina G e dell’agarosio coniugato cui si può legare in

maniera aspecifica il DNA da immunoprecipitare o la proteina anticorpale dando

risultati falsamente positivi.

h) Lavaggi degli immunocomplessi ed eluizione

Gli immunocomplessi sono stati lavati 4 volte con un apposito tampone di lavaggio a

bassa salinità (SDS 0,1 %,Triton X-100 1%, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8.1, NaCl

150mM), 4 volte con un tampone di lavaggio ad alta salinità (SDS 0,1%, Triton X-100

1%, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8.1, NaCl 500 mM) e 2 volte con TE 1X (Tris-HCl

10 mM, EDTA 1 mM pH 8.0). Ciascun lavaggio è stato fatto in agitazione continua a

4°C per 5 minuti seguito da centrifugazione alla velocità di 3000 rpm per 3 minuti a

4°C. Gli immunocomplessi sono stati poi eluiti dalla resina con 200 μl di tampone di

eluizione (SDS 1%; NaHCO3 0,1 M) per 2 volte a temperatura ambiente in agitazione

continua per 10 minuti e centrifugati brevemente a 14000 rpm per recuperare il

supernatante.

i)“Reverse crosslinking”

58

Infine, aggiungendo NaCl 200 mM per 5 ore a 65°C all’eluato, abbiamo ottenuto il

distacco dell’anticorpo e della proteina bersaglio dal DNA (“reverse crosslinking”). I

residui proteici sono stati successivamente eliminati con un trattamento con

proteinasi K (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania), aggiungendo 10 μl di EDTA

0,5 M, 20 μl di Tris-HCl 1 M pH 6.8, 2 μl di proteinasi K 10 mg/ml, per 2 ore a 45°C.

l) Estrazione del DNA

La purificazione del DNA è stata ottenuta aggiungendo ad ogni campione 1 volume di

fenolo:cloroformio:alcol isoamilico 25:24:1, centrifugando a temperatura ambiente

per 10 minuti a 14000 rpm e recuperando la fase superiore contenente gli acidi

nucleici. Il DNA è stato quindi precipitato a -20°C per tutta la notte aggiungendo

nell’ordine: 1/10 di NaAc 3 M pH 7, 1 μl di glicogeno (che permetterà di visualizzare

più facilmente il pellet di DNA) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Dopo centrifugazione,

il DNA è stato lavato in etanolo al 70% e risospeso in 30 μl di acqua bidistillata

autoclavata (gli input in 100 μl, poiché molto concentrati).

m) Quantificazione dell’immunoprecipitato mediante PCR

Il risultato della ChIP è stato analizzato eseguendo una Real Time-PCR con il metodo

Sybr Green® sul DNA ottenuto in ogni immunoprecipitazione specifica con primers

complementari ai promotori dei geni esaminati. L’amplificazione del DNA avviene

solo se la proteina, bersaglio dell’anticorpo utilizzato, era legata alla sequenza di DNA

amplificata al momento dell’immunoprecipitazione.

Le sequenze dei primers utilizzati sono le seguenti:

C21 RARE FW: 5’ –CAGCTTCGCGGTAATT– 3’

C21 RARE RV: 5’ –TCCTCCTAGACCCTGACAGCAG– 3’

ER4 FW: 5’ –CCAATTCCTTGAAACCAGTAACTAAAC– 3’

ER4 RV: 5’ –GCCATGAATGTAGTATTACGAGCCTAT– 3’

DR3 FW: 5’ –CCTGATAAGACAATGAAACCAAAACA– 3’

DR3 RV: 5’ –CAAATGTGAAATAAGAGGCAGCAT– 3’

#1 FW: 5’ –GGTTCTTTTTAGTGCCGCTCAGT– 3’

#1 RV: 5’ –CACAATTTCCTTAAGCAGAATTTAAAGC– 3’

#2 FW: 5’ – CTTGTACCTCCATGCTGCCTC– 3’

#2 RV: 5’– AAGCCAGTGAAAGTTGGTGTACC– 3’

#3 FW: 5’– CGCTCAGTATGTTTGGTTTCTGTAC– 3’

#3 RV: 5’- AGCCAAACAGGAAAGCAAGC– 3’

59

Analisi statistica

Per ogni esperimento, i risultati sono espressi come media aritmetica di 3

esperimenti indipendenti, ± l’errore standard della media (Standard Error of the

Mean, S.E.M.). Le analisi statistiche sono state condotte usando il test t di Student.

L’analisi di correlazione è stat eseguita usando il coefficiente di correlazione di

Pearson.

60

RISULTATI

Identificazione di un nuovo TSS per il miRNA let-7c

Allo scopo di verificare l’esistenza di un nuovo promotore in grado di regolare il let-7c

indipendentemente dal suo gene ospite, abbiamo eseguito un’analisi in silico della

regione genomica che si estende per 10 kb a monte della sequenza del pre-miRNA

usando gli algoritmi: ProScan v.1.7, BDGP and F/PROM. Questi strumenti

bioinformatici hanno predetto un singolo putativo TSS, non ancora descritto,

localizzato circa 700 bp a monte del pre-let-7c, all’interno del sesto introne del gene

ospite del let-7c, LINC00478 (Figura 5a). L’analisi bioinformatica ha inoltre rivelato

che questa regione presenta elementi regolatori tipici di promotori associati alla RNA

Polimerasi II e siti di legame per fattori di trascrizione altamente conservati, come

TATA box e CAAT box. Per validare sperimentalmente questo putativo TSS, abbiamo

utilizzato la tecnica della “5’ Rapid Amplification of cDNA Ends” (RACE).

A causa della natura labile dei pri-miRNA dovuta al loro rapido processamento, non

siamo stati in grado di ottenere un prodotto di 5’ RACE dalla linea cellulare di LAP

NB4, nella quale l’espressione del let-7c è molto bassa. Per questo motivo, abbiamo

analizzato i livelli di espressione del let-7c in una serie di linee cellulari sia di tumore

solido che leucemiche. I nostri dati mostrano che fra le lineee cellulari analizzate le

LNCaP, un carcinoma della prostata, presentano i maggiori livelli di espressione di let-

7c (Figura 5b). Mediante analisi di 5’ RACE eseguita in questa linea cellulare,

abbiamo ottenuto un singolo prodotto di amplificazione il cui sequenziamento ha

permesso di localizzare esattamente il TSS: 668bp a monte del pre-let-7c, molto

vicino al TSS identificato in silico (Figura 5c).

Figura 5. Identificazione di un nuovo TSS intronico del let

a) Rappresentazione schematica del

putativo TSS (freccia azzurra)

Le distanze indicate sono relative

primers GSP-1 e GSP-2 usati nella 5’ RACE

indicate. Le barre di errore indicano la S.E.M. (n=3);

amplificazione del cDNA ottenuto

prodotto di amplificazione del c

dei primers, linea 3: controllo

Analisi dell’attività trascrizionale del promotore intronico del let

in cellule di leucemia promielo

Per valutare se il nuovo promotore del let

intrinseca, abbiamo clonato, da DNA genomico umano di placenta, un frammento di

1700bp a monte del nuovo TSS intronico del let

vettore “reporter” con attività

abbiamo clonato in un vettore luciferasico anche un frammento di 2000bp a monte

del 5’UTR del gene ospite

Abbiamo quindi eseguito saggi di tr

trasfettate transientemente con il costrutto

pGL3-LINC00478 prom

6a, l’attività trascrizionale

Identificazione di un nuovo TSS intronico del let-7c.

Rappresentazione schematica della regione a monte del pre-let-7c. In figura sono mostrati il

(freccia azzurra) identificato, la TATA box (bottone verde) e la CAAT box

Le distanze indicate sono relative al pre-let-7c. Le frecce (nera e gialla) indicano le posizioni dei

2 usati nella 5’ RACE; b) Livello di espressione (2^-ΔCt)

Le barre di errore indicano la S.E.M. (n=3); c) 5’-RACE su LNCaP

ottenuto usando i primer GSP-2 e Abridged Anchor Primer

prodotto di amplificazione del cDNA senza la coda di poli- (-dC) usato come controllo per la specificità

controllo negativo senza templato, linea M: marker 1kb.

Analisi dell’attività trascrizionale del promotore intronico del let

in cellule di leucemia promielocitica acuta

Per valutare se il nuovo promotore del let-7c possedesse un’attività trascrizionale


1700bp a monte del nuovo TSS intronico del let-7c (vedi Materiali e Metodi

vettore “reporter” con attività luciferasica (pGL3-let-7c-intronic prom


del 5’UTR del gene ospite (pGL3-LINC00478 prom).

Abbiamo quindi eseguito saggi di transattivazione in cellule umane di LAP NB4

trasfettate transientemente con il costrutto pGL3-let-7c-intronic prom

LINC00478 prom e con il vettore reporter vuoto (Ctrl). Come mostrato in Figura

trascrizionale basale del vettore pGL3-let-7c-intronic prom

61

. In figura sono mostrati il

e la CAAT box (ottagono blu).

gialla) indicano le posizioni dei

ΔCt) del let-7c nelle linee

LNCaP. Linea 1: prodotto di

Abridged Anchor Primer (AAP), linea 2:

dC) usato come controllo per la specificità

Analisi dell’attività trascrizionale del promotore intronico del let-7c

7c possedesse un’attività trascrizionale


Materiali e Metodi) in un

intronic prom). Analogamente,


ansattivazione in cellule umane di LAP NB4

intronic prom, il costrutto

Come mostrato in Figura

intronic prom è maggiore

rispetto al controllo rappresentato dal vettore vuoto.

LINC00478 prom ha un’attività luciferasica

intronico (Figura 6a). Dopo trattamento con ATR

del gene ospite è incrementata. Questi dati suggeriscono che l’aumento dei livelli

d’espressione del pri-

principalmente dovuto all’attività del promotore del gene

Figura 6. Attività trascrizionale del promotore intronico del let

ospite LINC00478 in linee cellulari leucemiche.

a) Saggi di attività luciferasica sulla

luciferasici contenenti il promotore intronico del let

gene ospite LINC00478 (pGL3

trattate e dopo 24 ore di trattamento con ATR

trasfezione con l’attività del vettore

(n=3); b) Analisi dell’espressione

in cellule NB4 non trattate e dopo

per l’espressione di GAPDH ed espressi come

errore indicano la S.E.M. (n=3)

Modificazioni epigenetiche del promotore del gene ospite del let

LINC00478 dopo trattamento con ATRA

Per studiare il contributo trascrizionale dei due promotori del let

gene ospite, in cellule di LAP, abbiamo studiato le modificazi

regioni in cellule NB4 prima e dopo trattamento con ATRA.

rispetto al controllo rappresentato dal vettore vuoto. Tuttavia, il

un’attività luciferasica ~2 volte più elevata rispetto al promotore

). Dopo trattamento con ATRA soltanto l’attività del promotore


-let-7c osservati in cellule NB4 dopo ATRA (

principalmente dovuto all’attività del promotore del gene ospite.

Attività trascrizionale del promotore intronico del let-7c e del promotore del gene

in linee cellulari leucemiche.

Saggi di attività luciferasica sulla linea cellulare NB4 trasfettata transientemente con

luciferasici contenenti il promotore intronico del let-7c (pGL3-let-7c intronic prom

pGL3-LINC00478 prom). L’attività luciferasica è stata

trattate e dopo 24 ore di trattamento con ATRA 1µM. I valori sono stati normalizzati per l’efficienza di

trasfezione con l’attività del vettore co-trasfettato renilla pRLTK. Le barre di errore indicano la S.E.M.

Analisi dell’espressione, misurata tramite qRT-PCR, di pri-let-7c e del gene os

non trattate e dopo 24 ore di trattamento con ATRA 1µM. I valori sono stati normalizzati

per l’espressione di GAPDH ed espressi come fold change rispetto al campione non trattato

errore indicano la S.E.M. (n=3).

Modificazioni epigenetiche del promotore del gene ospite del let

LINC00478 dopo trattamento con ATRA

Per studiare il contributo trascrizionale dei due promotori del let

gene ospite, in cellule di LAP, abbiamo studiato le modificazioni epigenetiche su tali

regioni in cellule NB4 prima e dopo trattamento con ATRA. L’analisi con il software

62

Tuttavia, il vettore pGL3-

~2 volte più elevata rispetto al promotore

A soltanto l’attività del promotore


7c osservati in cellule NB4 dopo ATRA (Figura 6b) sia

e del promotore del gene

transientemente con i costrutti

7c intronic prom) ed il promotore del

sica è stata misurata in cellule non

I valori sono stati normalizzati per l’efficienza di

Le barre di errore indicano la S.E.M.

e del gene ospite LINC00478

I valori sono stati normalizzati

campione non trattato. Le barre di

Modificazioni epigenetiche del promotore del gene ospite del let-7c

Per studiare il contributo trascrizionale dei due promotori del let-7c, intronico e del

oni epigenetiche su tali

L’analisi con il software

63

CpG Island Searcher (vedi Materiali e Metodi) ha rivelato che sia sul promotore del

gene ospite che sul promotore intronico del let-7c non sono presenti isole CpG. Data

l’assenza di isole CpG su entrambi i promotori abbiamo escluso un coinvolgimento

delle DNMT, quindi della metilazione del DNA, per la regolazione trascrizionale del

let-7c.

Precedentemente, avevamo dimostrato che PML/RARα legava il sito RARE presente

sul promotore del gene ospite del let-7c in maniera ATRA-sensibile, e che il suo

rilascio era accompagnato da un incremento dell’acetilazione dell’istone H3 (Careccia

et al, 2009). In questo lavoro di tesi noi confermiamo questi dati e mostriamo una co-

localizzazione di RXR con PML, il cui legame, così come per PML, è ridotto dopo

trattamento con ATRA (Figura 7b). Inoltre, osserviamo la rimozione del legame

dell’istone deacetilasi 1 (HDAC1) dal promotore del gene ospite LINC00478, ed un

incremento dell’istone acetil trasferasi p300. In accordo con questi risultati, l’analisi

di altri marcatori epigenetici della conformazione della cromatina mostra un notevole

incremento dell’istone H3 acetilato in lisina 9, lisina 14 e lisina 27 (H3K9ac, H3K14ac

e H3K27ac), ed una diminuzione del tri-metilato in lisina 9 (H3K9me3). In cellule non

trattate, inoltre, ridotti livelli di marcatori di promotori attivi, come il di- e tri-

metilato in lisina 4 (H3K4me2, H3K4me3), confermano, a livello basale, uno stato di

repressione trascrizionale di questo promotore. Al contrario trattamenti con ATRA

determinano un aumento di H3K4me2, ed una riduzione di H3K4me3 (Figura 7b).

Questi dati indicano, quindi, che dopo trattamento con ATRA il promotore del gene ospite

LINC00478 presenta uno stato della cromatina trascrizionalmente più permissivo.

Figura 7. Modificazioni epigenetiche

prima e dopo trattamenti con ATRA

monte del 5’UTR del gene LINC00478

del TSS del gene (freccia rossa)

specifica regione di promotore

anticorpi indicati, sul promoto

con ATRA. I valori di qRT-PCR

(No Ab) sono stati sottratti

Modificazioni epigenetiche del promotore intronico del let

trattamento con ATRA

Mediante analisi bioinformatica svolta con il software Genomatix

abbiamo identificato a ~1300 bp e ~450 bp a monte del TSS intronico due siti RARE

non canonici (DR3 ed ER4;

Attraverso saggi di ChIP in cellule di LAP prima e dopo trattamento con ATRA

mostriamo che i siti RARE identificati sul prom

PML/RARα solo debolmente ed il trattamento con ATRA

reclutamento (Figura 8b

Modificazioni epigenetiche del promotore del gene opite LINC00478 in cellule NB4

prima e dopo trattamenti con ATRA. a) Rappresentazione schematica di una

LINC00478 in cui è indicato un sito RARE canonico

(freccia rossa). Le frecce azzurre indicano i primers utilizzati per amplificare

regione di promotore nei campioni di cromatina immunoprecipitata;

promotore del gene ospite LINC00478 in cellule NB4 prima e dopo trattamento

PCR sono espressi come percentuale dell’input. I valori del

ad ogni campione. Le barre di errore indicano la S.E.M. (n=3)

Modificazioni epigenetiche del promotore intronico del let

trattamento con ATRA

analisi bioinformatica svolta con il software Genomatix


non canonici (DR3 ed ER4; Figura 8a).


mostriamo che i siti RARE identificati sul promotore intronico sono legati da

solo debolmente ed il trattamento con ATRA non interferisce con

Figura 8b).

64

l promotore del gene opite LINC00478 in cellule NB4

di una regione di 2000 bp a

in cui è indicato un sito RARE canonico (DR5) ~ 200bp a monte

ers utilizzati per amplificare la

romatina immunoprecipitata; b) Analisi di ChIP, con gli

prima e dopo trattamento

valori del controllo negativo

Le barre di errore indicano la S.E.M. (n=3).

Modificazioni epigenetiche del promotore intronico del let-7c dopo

analisi bioinformatica svolta con il software Genomatix MatInspector,



otore intronico sono legati da

non interferisce con il suo

Inoltre, dopo ATRA non si hanno modulazioni di H3K9ac, H3K14ac, H3K9me3,

H3K4me2 e H3K4me3

Figura 8. Modificazioni epigenetiche del promotore intronico del let

dopo trattamenti con ATRA. a)

cui sono indicati il nuovo TSS identificato attraverso

canonici (DR3 and ER4) presenti a monte del TSS

amplificate mediante qRT-PCR

promotore intronico del let

cromatina è stata immunoprecipitata con gli anticorpi indicati

percentuale dell’input. I valori del

barre di errore indicano la S.E.M. (n=3)

Per verificare se altre putative sequenze regolatorie di let

(Oszolak et al, 2008; Corcoran et al, 2009) potessero rispondere epigeneticamente

all’ATRA, abbiamo analizzato queste regioni per il legame di PML/RAR

significative modificazioni istoniche.

I nostri dati mostrano uno scenario epigenetico molto simile a quello del nostro

promotore intronico. Infatti, PML/RAR

trattamenti con ATRA non determinano modulazioni di H3K14ac e H3K4me3

9b-d).


(Figura 8b).

Modificazioni epigenetiche del promotore intronico del let-7c

dopo trattamenti con ATRA. a) Rappresentazione schematica della regione a monte del

cui sono indicati il nuovo TSS identificato attraverso 5’RACE (freccia nera)

presenti a monte del TSS. Le frecce azzurre indicano la posizione delle regioni

PCR nei campioni di cromatina immunoprecipitata

let-7c in cellule NB4 prima e dopo trattamento con ATRA 1 µM per 72h. La

cromatina è stata immunoprecipitata con gli anticorpi indicati. I valori di qRT

valori del controllo negativo (No Ab) sono stati sottratt

barre di errore indicano la S.E.M. (n=3).

Per verificare se altre putative sequenze regolatorie di let-7c, indicate da altri gruppi


alizzato queste regioni per il legame di PML/RAR

significative modificazioni istoniche.


promotore intronico. Infatti, PML/RARα e HDAC1 non legano queste regioni, e

trattamenti con ATRA non determinano modulazioni di H3K14ac e H3K4me3

65


7c in cellule NB4 prima e

a della regione a monte del pre-let-7c in

era)e i due siti RARE non

e indicano la posizione delle regioni

nei campioni di cromatina immunoprecipitata; b) Analisi di ChIP sul

in cellule NB4 prima e dopo trattamento con ATRA 1 µM per 72h. La

I valori di qRT-PCR sono espressi come

sottratti ad ogni campione. Le

7c, indicate da altri gruppi


alizzato queste regioni per il legame di PML/RARα ed alcune


e HDAC1 non legano queste regioni, e

trattamenti con ATRA non determinano modulazioni di H3K14ac e H3K4me3 (Figura

Questi risultati ci fanno ipotizzare che in cellule di LAP l’espressione del let

principalmente a carico del promotore del gene ospite LINC00478 durante il

trattamento differenziante con ATRA.

Figura 9. Modificazioni epigenetiche di altri putativ

NB4 prima e dopo trattamenti con ATRA

del let-7c predetti da Ozsol

contrapposte indicano le coppie di primers usate per

campioni di cromatina immunoprecipitata

regione. Le distanze indicate sono relative alla sequenza del pre

anticorpi indicati, in cellule NB4 prima e dopo trattamento con ATRA

del TSS intronico putativo

anticorpi indicati, del promotore intronico

Analisi di ChIP, per gli anticorpi indicati,

Corcoran et al, (oligo #3). I risultati sono espressi come

negativo (No Ab) sono stati

Questi risultati ci fanno ipotizzare che in cellule di LAP l’espressione del let


ento differenziante con ATRA.

Modificazioni epigenetiche di altri putativi promotori intronic

NB4 prima e dopo trattamenti con ATRA. a) Rappresentazione schematica dei putativi TSS

Ozsolak et al (freccia verde) e da Corcoran et al (freccia gialla

contrapposte indicano le coppie di primers usate per amplificare le diverse

campioni di cromatina immunoprecipitata, il rombo rosso indica il sito RARE

regione. Le distanze indicate sono relative alla sequenza del pre-let-7c; b)

in cellule NB4 prima e dopo trattamento con ATRA sul sito RARE presente a monte

del let-7c descritto in Oszolak et al, (oligo #1); c)

del promotore intronico putativo del let-7c descritto in Oszolak et al,

per gli anticorpi indicati, del promotore intronico putativ

). I risultati sono espressi come percentuale dell’input.

sottratti ad ogni campione. Le barre di errore indicano la S.E.M. (n=3)

66

Questi risultati ci fanno ipotizzare che in cellule di LAP l’espressione del let-7c sia


intronici del let-7c in cellule

Rappresentazione schematica dei putativi TSS intronici

freccia gialla). Le frecce azzurre

diverse regioni di promotore nei

(DR5) presente in questa

b) Analisi di ChIP, con gli

sul sito RARE presente a monte

c) Analisi di ChIP, per gli

in Oszolak et al, (oligo #2); d)

utativo del let-7c descritto in

percentuale dell’input. I valori del controllo


Attività trascrizionale del promotore intronico del let

solidi

Per valutare il potenziale coinvolgimento del promotore del gene ospite e/o di quello

intronico nel guidare

abbiamo trasfettato i costrutti luciferasici con la regione del promotore intronico o

del gene ospite in una linea cellulare di adenocarcinoma di prostata (LNCaP) o in una

di adenocarcinoma polmonare (H1299). I saggi di trans attivazione mostrano che

nelle linee cellulari di t

(Figura 10). Inoltre, è da notare che, differentemente dalle cellule leucemiche,

l’attività del promotore intronico è più elevata di quella del gene ospite. Ciò

suggerisce un potenziale ruolo della r

trascrizione del let-7c preferenzialmente in questi contesti cellulari.

Figura 10. Attività trascrizionale dei promotori intronico e d el gene ospite in linee cellulari

solido. Saggi di attività luci

di prostata LNCaP trasfettate transientemente con

intronico del let-7c ed il promotore del gene ospite LINC00478

24h dopo la trasfezione. I valori sono stati normalizzati per l’efficienza di trasfezione

vettore co-trasfettato renilla

Correlazione dell’espressione del gene osp

in diversi tipi di tumore

Per approfondire il contributo relativo dei due promotori in diversi istotipi tumorali,

abbiamo valutato la correlazione tra l’espressione del gene ospite LINC00478 e del

ascrizionale del promotore intronico del let


l’espressione del let-7c in contesti tumorali non leucemici,

costrutti luciferasici con la regione del promotore intronico o



nelle linee cellulari di tumore solido analizzate entrambi i promotori sono attivi

). Inoltre, è da notare che, differentemente dalle cellule leucemiche,


suggerisce un potenziale ruolo della regione regolatoria intronica nel guidare la

7c preferenzialmente in questi contesti cellulari.

Attività trascrizionale dei promotori intronico e d el gene ospite in linee cellulari

Saggi di attività luciferasica sulle linee di adenocarcinoma polmonare H1299

trasfettate transientemente con i costrutti luciferasici contenenti il promotore

7c ed il promotore del gene ospite LINC00478. L’attività lucifera

I valori sono stati normalizzati per l’efficienza di trasfezione

renilla pRLTK. Le barre di errore indicano la S.E.M. (n=3)

Correlazione dell’espressione del gene ospite LINC00478 e del let

in diversi tipi di tumore

er approfondire il contributo relativo dei due promotori in diversi istotipi tumorali,


67

ascrizionale del promotore intronico del let-7c in tumori


7c in contesti tumorali non leucemici,

costrutti luciferasici con la regione del promotore intronico o



umore solido analizzate entrambi i promotori sono attivi

). Inoltre, è da notare che, differentemente dalle cellule leucemiche,


egione regolatoria intronica nel guidare la

7c preferenzialmente in questi contesti cellulari.

Attività trascrizionale dei promotori intronico e d el gene ospite in linee cellulari di tumore

H1299 e adenocarcinoma

i costrutti luciferasici contenenti il promotore

luciferasica è stata misurata

I valori sono stati normalizzati per l’efficienza di trasfezione con l’attività del


ite LINC00478 e del let-7c

er approfondire il contributo relativo dei due promotori in diversi istotipi tumorali,


68

let-7c in linee cellulari di LAM di vari sottotipi FAB (Tabella 3 )ed in linee cellulari di

diversi tipi di tumore solido (Tabella 4).

Linea cellulare Sottotipo FAB KG1a M0

KG1 M1

HL60 M2

Kasumi-1 M2

SKNO-1 M2

NB4 M3

UF-1 M3

PL-21 M3

GDM-1 M4

OCI-AML3 M4

THP-1 M5

U937 pseudo M5

HEL M6

K562 CML

BV173 CML

Tabella 3. Linee cellulari AML usate e relativo sottotipo FAB

Linea cellulare Istotipo tumorale LNCaP Adenocarcinoma di prostata

DU-145 Carcinoma di prostata

PC-3 Carcinoma di prostata

SK-BR-3 Carcinoma mammario

MCF-7 Adenocarcinoma mammario

MDA-MB-231 Carcinoma mammario

A-549 Carcinoma polmonare

H1299 Carcinoma polmonare a cellule non piccole SH-SY5Y Neuroblastoma

A2780 Carcinoma ovarico

Hep-G2 Epatocarcinoma

HCT-116 Carcinoma colorettale

Tabella 4. Linee cellulari di tumore solido usate e relativo istotipo tumorale.

I nostri dati mostrano una significativa correlazione tra espressione del let-7c maturo

e quella del suo gene ospite in un contesto cellulare leucemico (Figura 11a). Al

contrario, nelle varie linee derivanti da tumori solidi non si osserva tale correlazione

(Figura 11b).

Figura 11. Correlazione dell’espressione del gene ospite LINC00478 e del let

di LAM ed in linee cellulari di diversi tumori solidi.

LINC00478 in 15 linee cellulari di

e del gene ospite LINC00478

rappresenta il valore d’espressione del let

linee cellulari analizzate. I valori

GAPDH per let-7c e LINC00478

coefficiente di correlazione di Pearson.

Tutti questi risultati, suggeriscono che il promotore del gene ospite giochi un ruolo

principale nel guidare la trascrizione del let

promotore intronico potrebbe regolare trascrizionalmente il miR let

cellulari diversi, come ad esempio in alcune linee di tumore solido.

Correlazione dell’espressione del gene ospite LINC00478 e del let

di LAM ed in linee cellulari di diversi tumori solidi. a) Espressione del

linee cellulari di sottotipi diversi di LAM (elencate in Tab. 3).

LINC00478 in 12 linee cellulari di tumori solidi con diverso istotipo

d’espressione del let-7c (in ordinata) e del gene ospite (in ascissa)

I valori sono espressi in 2 –ΔCt. La normalizzazione è stata fatta con

LINC00478 rispettivamente. Per l’analisi della correlazione è stato usato il

coefficiente di correlazione di Pearson.


principale nel guidare la trascrizione del let-7c in un contesto leucemico, mentre il

ore intronico potrebbe regolare trascrizionalmente il miR let


69

Correlazione dell’espressione del gene ospite LINC00478 e del let-7c in linee cellulari

l let-7c e del gene ospite

LAM (elencate in Tab. 3). b) Espressione del let-7c

diverso istotipo. Il pallino

gene ospite (in ascissa) in ognuna delle

La normalizzazione è stata fatta con RNU19 e

lla correlazione è stato usato il


7c in un contesto leucemico, mentre il

ore intronico potrebbe regolare trascrizionalmente il miR let-7c in contesti


70

Discussione e Conclusioni

Recenti evidenze suggeriscono che una significativa porzione del genoma umano è

regolata dai miRNA. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che l’espressione dei

miRNA è spesso deregolata nelle malattie umane, incluse quelle che riguardano il

sistema ematopoietico (Ambros, 2004; Bartel, 2004; Alvarez-Garcia and Miska, 2005).

Comunque, sebbene l’importanza biologica dei miRNA ormai sia chiara, i meccanismi

della loro regolazione necessitano di ulteriori studi. Quindi, l’identificazione di

elementi genetici e meccanismi epigenetici responsabili della regolazione

trascrizionale dei miRNA potrebbe aiutarci a capire le vie del segnale alla base della

biologia dei miRNA.

Nel laboratorio in cui si è svolto questo lavoro di tesi, è stato dimostrato che il miRNA

let-7c è ipoespresso in pazienti di LAP di nuova diagnosi rispetto a promielociti

normali derivanti da un sistema di differenziamento granulocitario in vitro (Careccia

et al, 2009), e che l’espressione ectopica dilet-7c è sufficiente a indurre il

differenziamento mieloide di linee cellulari e blasti primari derivati da pazienti di

LAM di nuova diagnosi (Pelosi et al, 2012). Questi dati sottolineano, quindi,

l’importanza di studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione

dell’espressione di let-7c in cellule leucemiche.

Il let-7c, membro della famiglia let-7, è un miRNA intronico localizzato sul cromosoma

21 in un introne del gene LINC00478, all’interno del quale si trovano anche il miR-99a

and miR-125b-2. La famiglia di miRNA let-7 presenta una conservazione elevata in

tutta la filogenesi animale, da C. Elegans all’uomo. Ciò suggerisce che i membri di

questa famiglia di miRNA siano essenziali regolatori dell’espressione genica in vari

organismi (Hertel et al, 2012).

Fino a poco tempo fa, era generalmente accettato che i miRNA intronici fossero

trascritti come conseguenza della trascrizione del loro gene-ospite (Rodriguez et al,

2004; Kim and Kim, 2007; Liang et al, 2007; Saini et al, 2007; Gromak, 2012). In

accordo con questo modello, recentemente abbiamo osservato in cellule leucemiche

una coordinata regolazione dell’espressione di let-7c con il suo gene ospite,

suggerendo che la sua trascrizione potesse essere controllata dallo stesso promotore.

In maniera interessante, inoltre, abbiamo osservato un reclutamento di PML/RARα su

siti RARE nel promotore del gene ospite, ed un suo rilascio dopo trattamento con

71

ATRA, in parallelo ad un aumentata espressione di let-7c (Careccia et al, 2009). Ad

oggi, tuttavia, sta emergendo il concetto che il processamento dal trascritto primario

del gene ospite del miRNA non è l’unica via per la generazione di miRNA intronici

(Baskerville and Bartel, 2005).

Un’ipotesi interessante suggerisce che quando un miRNA intronico “nasce” utilizzi

inizialmente il TSS del suo gene ospite e che possa acquisire un promotore proprio,

indipendente, più tardi durante l’evoluzione (Ozsolak et al, 2008). Secondo tale

ipotesi, i miRNA intronici evolutivamente più “vecchi” (come, ad esempio, il let-7c)

avrebbero perciò una maggiore probabilità di avere promotori propri indipendenti

rispetto a miRNA relativamente più recenti.

Infatti, con lo sviluppo di sempre più nuove strategie “high throughput” per la

caratterizzazione di promotori, come la ChIP-seq per valutare le modificazioni

istoniche, in combinazione o meno con l’analisi del posizionamento dei nucleosomi

(Ozsolak et al, 2008; Wang et al, 2009, Monteys et al, 2010), sono stati identificati

numerosi miRNA intronici che potrebbero essere espressi da promotori indipendenti

dal gene ospite. Per quanto riguarda il let-7c, alcuni studi indicano diversi putativi siti

intronici di inizio di trascrizione (Oszolak et al, 2008; Corcoran et al, 2009; Wang et al,

2009; Monteys et al, 2010). In particolare, Ozsolak e collaboratori hanno identificato

un putativo nuovo promotore prossimale del let-7c, combinando la mappatura dei

nucleosomi con i rimodellamenti della cromatina in alcune linee cellulari tumorali. In

questo lavoro, è stato identificato un putativo TSS intronico per il let-7c, situato nel

quinto introne del gene ospite LINC00478. Altri autori, invece, suggeriscono che il let-

7c potrebbe essere regolato, mediante un meccanismo RNA polimerasi III-mediato, da

un proprio promotore intronico il cui TSS è localizzato nel sesto introne del gene

ospite LINC00478 (Monteys et al, 2010).

Da quanto sopra riportato, si evince che il reale promotore del let-7c deve essere

ancora ben identificato e caratterizzato. Per cercare, quindi, un possibile nuovo

promotore intronico per il let-7c, abbiamo effettuato un’analisi in silico su una regione

genomica immediatamente “a monte” del let-7c, identificando un nuovo putativo TSS

localizzato a circa 700 bp dal pre-let-7c. Questa regione è stata quindi validata

sperimentalmente mediante 5’ RACE e, clonata a monte del gene della luciferasi, ha

mostrato avere un’attività trascrizionale. Questi dati suggeriscono quindi che per la

trascrizione del let-7c bisogna considerare almeno due promotori distinti: il

72

promotore distale del gene ospite LINC00478, ed il promotore prossimale intronico

specifico del miRNA.

In questo studio di tesi abbiamo anche confermato il legame di PML/RARα sul

promotore del gene ospite del let-7c e mostrato una co-localizzazione di RXR con

PML. Questi risultati sono in accordo con recenti ritrovamenti indicanti che RXR è

presente associato a PML/RARα in complessi funzionali (Martens et al, 2010).

Abbiamo quindi verificato se PML/RARα fosse in grado di legare il promotore

intronico del let-7c dove, mediante analisi bioinformatica, abbiamo trovato due siti

RARE non canonici (DR3 ed ER4). Sebbene i siti DR5, DR2 e DR1 siano i più comuni

siti di legame per RXR/RARα in condizioni fisiologiche, ci sono evidenze che

suggeriscono che PML-RARα-RXR abbia una più estesa capacità di legare il DNA e che

sia in grado di legare anche ripetizioni dirette o evertite con spaziatura variabile

(Martens et al, 2010). I nostri dati tuttavia mostrano che sul promotore intronico da

noi identificato PML-RARα è reclutato solo debolmente, ed il trattamento con ATRA

non interferisce con il suo reclutamento.

Abbiamo inoltre analizzato alcuni dei principali enzimi implicati nelle modificazioni

epigenetiche e l’acetilazione e metilazione degli istoni su entrambi i promotori del let-

7c in cellule di LAP NB4. I nostri dati mostrano che dopo trattamenti con ATRA, solo il

promotore del gene ospite presenta una conformazione più aperta della cromatina ed

un aumento dei marcatori epigenetici che correlano con uno stato di maggiore

attivazione trascrizionale. Sorprendentemente, dopo trattamento con ATRA

osserviamo sul promotore del gene ospite una diminuzione di H3K4me3, noto

marcatore di promotori trascrizionalmente attivi. Ciò sembrerebbe in conflitto con le

altre modificazioni epigenetiche analizzate. Comunque, deve essere considerato che il

promotore del gene ospite del let-7c non ha isole CpG, e che il profilo delle

modificazioni epigenetiche di tali promotori non è esattamente uguale a quello dei

promotori con isole CpG. Ad esempio, segnali di H3K4me3 più deboli sono stati

descritti essere associati a promotori senza isole CpG (Wang et al, 2009). In ogni caso,

nel nostro sistema sperimentale questo tipo di modificazione istonica non sembra

avere un ruolo rilevante nei cambiamenti di conformazione della cromatina sul

promotore del LINC00478.

Al contrario, il promotore intronico dopo trattamenti con ATRA non mostra

modulazione alcuna negli stessi marcatori epigenetici. Questi dati sono in linea con i

73

dati di luciferasi sui promotori di let-7c (vedi Analisi dell’attività trascrizionale del

promotore intronico del let-7c in cellule di leucemia promielocitica acuta), in cui solo

l’attività del promotore del gene ospite è incrementata da trattamenti con ATRA.

Questi risultati indicano che il promotore del gene ospite abbia un ruolo

predominante nella regolazione del let-7c durante il differenziamento indotto da

ATRA in cellule di LAP, mentre il promotore intronico potrebbe avere un ruolo nel

guidare la trascrizione del let-7c in contesti tumorali diversi da quello leucemico.

Infatti, i saggi di luciferasi effettuati indicano che l’attività del promotore intronico è

più elevata di quella del gene ospite nelle linee cellulari di tumore solido LNCaP e

H1299, suggerendo che questo promotore possa avere un ruolo importante nel

guidare la trascrizione del let-7c in contesti cellulari diversi dalle leucemie.A

rafforzare questa ipotesi, abbiamo dati preliminari che mostrano una significativa

correlazione tra l’espressione del gene ospite LINC00478 e del let-7c in linee cellulari

di LAM di vari sottotipi FAB. Al contrario, nelle varie linee derivanti da tumori solidi

non si osserva tale correlazione. Poiché l’espressione dei microRNA può essere

regolata a livello post-trascrizionale, ed in particolare per la famiglia let-7 sono ben

noti i meccanismi di regolazione post-trascrizionale (vedi anche Capitolo 3.5.2 Let-7 e

tumori), per validare questi nostri risultati preliminari, sarà nostro interesse

analizzare l’espressione del pri-miR nelle varie linee leucemiche e di tumore solido

mettendola in relazione con l’espressione del miRNA maturo e del gene ospite.

La nozione secondo cui promotori intronici siano in grado di guidare l’espressione di

specifici miRNA è una scoperta relativamente recente, che si propone di ampliare le

nostre (poche) conoscenze sulla regolazione trascrizionale dei miRNA intronici. Per i

miRNA caratterizzati da un doppio promotore, quello del gene ospite e quello

intronico, sorge un numero sempre maggiore di domande a proposito dei contributi

forniti da ogni promotore ai livelli di espressione dei miRNA, ed è ancora ben lontano

dall’essere determinato quale o quali siano i meccanismi responsabili del potenziale

uso alternativo di questi promotori nella regolazione dei miRNA.

Questi dati sottolineano quindi una complessa regolazione dell’espressione di let-7c

che potrebbe avere un ruolo importante nella deregolazione e patogenesi dei tumori.

Inoltre, l’uso alternativo di questi due promotori potrebbe rappresentare un nuovo

meccanismo regolatorio dell’espressione del let-7c in differenti tessuti o nei vari

sottotipi di AML.

74

Infine, il contributo fornito dalle due tipologie di promotori (gene ospite ed intronico)

nel controllo dell’espressione del let-7c potrebbe essere dipendente dal contesto

cellulare ,e ulteriori e dettagliati studi andranno svolti per verificare questa ipotesi.

L’analisi dei meccanismi di regolazione epigenetica del promotore del gene ospite,

che sembra essere responsabile della trascrizione del let-7c in cellule leucemiche,

apre nuove possibilità nell’ambito di una terapia basata sull’impiego di farmaci in

grado di modificare la cromatina. Questi dati potrebbero, quindi, contribuire ad una

migliore comprensione dei complessi meccanismi molecolari coinvolti nella

transizione dal normale differenziamento mieloide a quello patologico e potrebbero

permettere l’identificazione di nuovi bersagli e quindi di nuove terapie per le

leucemie mieloidi acute. Infine, se sarà verificata l’ipotesi del ruolo del promotore

intronico nel guidare la trascrizione del let-7c in relazione al contesto cellulare, sarà

interessante analizzare i possibili meccanismi che sono alla base della sua regolazione

in tali contesti e studiare così le cause della sua de-regolazione nei vari tipi di tumore.

75

BIBLIOGRAFIA

Aboobaker AA, Tomancak P, Patel N, Rubin GM, Lai EC: Drosophila microRNAs exhibit diverse spatial expression patterns during embryonic development. Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102:18017-18022.

Alvarez-Garcia I, Miska EA (2005). MicroRNA functions in animal development and human disease. Development 132: 4653-4662.

Ambros V (2004). The functions of animal microRNAs. Nature 431: 350-355.

Anindo MI, Yaqinuddin A (2012). Insights into the potential use of microRNAs as biomarker in cancer Int J Surg. 10(9):443-9.

Arents G, Burlingame RW, Wang BC, Love WE, Moudrianakis EN (1991). The nucleosomal core histone octamer at 3.1 A resolution: a tripartite protein assembly and a left-handed superhelix. Proc Natl Acad Sci U S A 88(22):10148-52

Argiropoulos B, Humphries RK (2007) Hox genes in hematopoiesis and leukemogenesis. Oncogene 26: 6766-6776.

Arnould C, Philippe C, Bourdon V, Gr goire MJ, Berger R, Jonveaux P (1999). The signal transducer and activator of transcription STAT5b gene is a new partner of retinoic acid receptor alpha in acute promyelocytic-like leukaemia. Hum Mol Genet 8: 1741-1749.

Augoff K, McCue B, Plow EF, Sossey-Alaoui K (2012). miR-31 and its host gene lncRNA LOC554202 are regulated by promoter hypermethylation in triplenegative breast cancer. Mol.

Cancer 11: 5

Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z et al (2007). High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129(4):823-37

Bartel DP (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 281-297.

76

Bartel DP (2009). MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136: 215-233.

Baskerville S, Bartel DP (2005). Microarray profiling of microRNAs reveals frequent coexpression with neighboring miRNAs and host genes. RNA 11: 241-247.

Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR et al (1985). Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. A report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Intern Med 103: 620-625.

Berezikov E, Chung WJ, Willis J, Cuppen E, Lai EC (2007). Mammalian mirtron genes. Mol Cell 28: 328-336.

Borchert GM, Lanier W, Davidson BL (2006). RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol 13: 1097-1101.

Boyerinas B, Park SM, Shomron N, Hedegaard MM, Vinther J, Andersen JS et al (2008). Identification of let-7-regulated oncofetal genes. Cancer Res 68: 2587-2591.

Brown D, Kogan S, Lagasse E, Weissman I, Alcalay M, Pelicci PG et al (1997). A PMLRARalpha transgene initiates murine acute promyelocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 2551-2556.

Buck SW, Gallo CM, Smith JS (2004). Diversity in the Sir2 family of protein deacetylases. J

Leukoc Biol. 75(6):939-50.

Bussing I, Slack FJ, Grosshans H (2008). let-7 microRNAs in development, stem cells and cancer. Trends Mol Med 14: 400-409.

Byrd JC, Mrozek K, Dodge RK, Carroll AJ, Edwards CG, Arthur DC et al (2002). Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461). Blood 100: 4325-4336.

Caligiuri MA, Briesewitz R, Yu J, Wang L, Wei M, Arnoczky KJ et al (2007). Novel c-CBL and CBL-b ubiquitin ligase mutations in human acute myeloid leukemia. Blood 110: 1022-1024.

77

Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, Bichi R, Zupo S, Noch E et al (2002). Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15524-15529.

Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, Hyslop T, Noch E, Yendamuri S et al (2004). Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2999-3004.

Careccia S, Mainardi S, Pelosi A, Gurtner A, Diverio D, Riccioni R et al (2009). A restricted signature of miRNAs distinguishes APL blasts from normal promyelocytes. Oncogene 28: 4034-4040.

Carracedo A, Ito K, Pandolfi PP (2011). The nuclear bodies inside out: PML conquers the cytoplasm. Curr Opin Cell Biol 23: 360-366.

Caygill EE, Johnston LA (2008). Temporal regulation of metamorphic processes in Drosophila by the let-7 and miR-125 heterochronic microRNAs. Curr Biol 18: 943-950.

Chang TC, Yu D, Lee YS, Wentzel EA, Arking DE, West KM et al (2008). Widespread microRNA repression by Myc contributes to tumorigenesis. Nat Genet 40: 43-50.

Chang TC, Wentzel EA, Kent OA, Ramachandran K, Mullendore M, Lee KH, et al. (2007) Transactivation of miR-34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis. Mol Cell 26(5):745-52

Clape C, Fritz V, Henriquet C, Apparailly F, Fernandez PL, Iborra F et al (2009). miR-143 interferes with ERK5 signaling, and abrogates prostate cancer progression in mice. PLoS ONE 26;4(10):e7542.

Chen X, Guo X, Zhang H, Xiang Y, Chen J, Yin Y et al (2009). Role of miR-143 targeting KRAS in colorectal tumorigenesis. Oncogene 28(10):1385-92

Chen Z, Brand NJ, Chen A, Chen SJ, Tong JH, Wang ZY et al (1993). Fusion between a novel Kruppel-like zinc finger gene and the retinoic acid receptor-alpha locus due to a variant t(11;17) translocation associated with acute promyelocytic leukaemia. EMBO J 12: 1161-1167.

78

Chen CZ, Li L, Lodish HF, Bartel DP (2004). MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science 303: 83-86.

Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT et al (2005). Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33: e179.

Cheng GX, Zhu XH, Men XQ, Wang L, Huang QH, Jin XL et al (1999). Distinct leukemia phenotypes in transgenic mice and different corepressor interactions generated by promyelocytic leukemia variant fusion genes PLZF-RARalpha and NPM-RARalpha. Proc Natl

Acad Sci U S A 96: 6318-6323.

Cheung P and Lau P (2005). Epigenetic regulation by histone methylation and histone variants. Mol. Endocrinol. 19: 563-573

Corcoran DL, Pandit KV, Gordon B, Bhattacharjee A, Kaminski N, Benos PV (2009). Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One 4: e5279

Corney DC, Flesken-Nikitin A, Godwin AK, Wang W, Nikitin AY (2007). MicroRNA-34b and MicroRNA-34c are targets of p53 and cooperate in control of cell proliferation and adhesion-independent growth. Cancer Res. 67: 8433–8438.

Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, Iorio MV, Ferracin M, Shimizu M et al (2005). miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 13944-13949.

Clurman BE, Hayward WS (1989). Multiple protooncogene activations in avian leukosis virus induced lymphomas: evidence for stage-specific events. Mol Cell Biol 9(6): 2657–2664

Cui Y, Su WY, Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al (2011).. MiR-29a Inhibits Cell Proliferation and Induces Cell Cycle Arrest through the Downregulation of p42.3 in Human Gastric Cancer. PLoS One 6(10): e25872

de Murcia G, Huletsky A, Poirier GG (1988). Modulation of chromatin structure by poly(ADP-ribosylation). Biochem Cell Biol 66(6):626-35.

79

de Ruijter AJ, van Gennip AH, Caron HN, Kemp S, van Kuilenburg AB (2003). Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family. Biochem J. 370 (Pt 3):737-49.

Di Croce L, Raker VA, Corsaro M, Fazi F, Fanelli M, Faretta M et al (2002). Methyltransferase recruitment and DNA hypermethylation of target promoters by an oncogenic transcription factor. Science 295: 1079-1082.

Dixon-McIver A, East P, Mein CA, Cazier JB, Molloy G, Chaplin T et al (2008). Distinctive patterns of microRNA expression associated with karyotype in acute myeloid leukaemia. PLoS

One 3(5): e2141

Dokmanovic M, Clarke C, Marks PA (2007). Histone deacetylase inhibitors: overview and perspectives. Mol Cancer Res. 5(10):981-9

Döhner H (2007). Implication of the molecular characterization of acute myeloid leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 412-419.

Drexler HG (1996). Expression of FLT3 receptor and response to FLT3 ligand by leukemic cells. Leukemia 10: 588-599.

Eguchi M, Eguchi-Ishimae M, Greaves M (2005). Molecular pathogenesis of MLL-associated leukemias. Int J Hematol 82: 9-20.

Ehrenhofer-Murray AE (2004). Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. Eur J Biochem. 271(12):2335-2349. Review

Esquela-Kerscher A, Johnson SM, Bai L, Saito K, Partridge J, Reinert KL et al (2005). Post-embryonic expression of C. elegans microRNAs belonging to the lin-4 and let-7 families in the hypodermis and the reproductive system. Dev Dyn 234: 868-877.

Esteller M (2007). Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nat

Rev Genet. 8(4):286-98.

Estey E, Dohner H (2006). Acute myeloid leukaemia. Lancet 368: 1894-1907.

80

Fabbri M, Garzon R, Cimmino A, Liu Z, Zanesi N, Callegari E, et al (2007). MicroRNA-29 family reverts aberrant methylation in lung cancer by targeting DNA methyltransferases 3A and 3B. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(40):15805-10

Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L et al (2005). Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. N Engl J Med 352: 254-266.

Fazi F, Racanicchi S, Zardo G, Starnes LM, Mancini M, Travaglini L et al (2007). Epigenetic silencing of the myelopoiesis regulator microRNA-223 by the AML1/ETO oncoprotein. Cancer

Cell 12: 457-466.

Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N (2008). Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genet 9: 102-114.

Ganetsky A (2012). The role of decitabine for the treatment of acute myeloid leukemia. Ann

Pharmacother 46: 1511-1517.

Garzon R, Pichiorri F, Palumbo T, Visentini M, Aqeilan R, Cimmino A et al (2007). MicroRNA gene expression during retinoic acid-induced differentiation of human acute promyelocytic leukemia. Oncogene 26: 4148-4157.

Garzon R, Garofalo M, Martelli MP, Briesewitz R, Wang L, Fernandez-Cymering C et al (2008a). Distinctive microRNA signature of acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic mutated nucleophosmin. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 3945-3950.

Garzon R, Volinia S, Liu CG, Fernandez-Cymering C, Palumbo T, Pichiorri F et al (2008b). MicroRNA signatures associated with cytogenetics and prognosis in acute myeloid leukemia. Blood 111: 3183-3189.

Giordano A, Avantaggiati ML (1999). p300 and CBP: partners for life and death. J Cell Physiol. 181(2):218-30.

Gough SM, Slape CI, Aplan PD (2011). NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood 118: 6247-6257.

81

Grady WM, Parkin RK, Mitchell PS, Lee JH, Kim YH, Tsuchiya KD et al (2008). Epigenetic silencing of the intronic microRNA hsamiR-342 and its host gene EVL in colorectal cancer. Oncogene 27: 3880–3888.

Grignani F, De Matteis S, Nervi C, Tomassoni L, Gelmetti V, Cioce M et al (1998). Fusion proteins of the retinoic acid receptor-alpha recruit histone deacetylase in promyelocytic leukaemia. Nature 391: 815-818.

Griffiths-Jones S (2007). Annotating noncoding RNA genes. Annu Rev Genomics Hum Genet 8: 279-298.

Grisendi S, Mecucci C, Falini B, Pandolfi PP (2006). Nucleophosmin and cancer. Nat Rev Cancer 6: 493-505.

Grisolano JL, Wesselschmidt RL, Pelicci PG, Ley TJ (1997). Altered myeloid development and acute leukemia in transgenic mice expressing PML-RAR alpha under control of cathepsin G regulatory sequences. Blood 89: 376-387.

Gromak N (2012). Intronic microRNAs: a crossroad in gene regulation. Biochem Soc Trans 40: 759-761.

Guled M, Lahti L, Lindholm PM, Salmenkivi K, Bagwan I, Nicholson AG et al (2009). CDKN2A, NF2, and JUN are dysregulated among other genes by miRNAs in malignant mesothelioma -A miRNA microarray analysis. Genes Chromosomes Cancer 48: 615-623.

Gurrieri C, Capodieci P, Bernardi R, Scaglioni PP, Nafa K, Rush LJ et al (2004). Loss of the tumor suppressor PML in human cancers of multiple histologic origins. J Natl Cancer Inst 96: 269-279.

Halkidou,K. Gaughan L, Cook S, Leung HY, Neal DE, Robson CN (2004). Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer. Prostate 59: 177–189.

Han YC, Park CY, Bhagat G, Zhang J, Wang Y, Fan JB et al. (2010). microRNA-29a induces aberrant self-renewal capacity in hematopoietic progenitors, biased myeloid development, and acute myeloid leukemia. J Exp Med 207(3): 475–489

82

Havelange V, Garzon R (2010). MicroRNAs: emerging key regulators of hematopoiesis. Am J

Hematol 85: 935-942.

He LZ, Bhaumik M, Tribioli C, Rego EM, Ivins S, Zelent A et al (2000). Two critical hits for promyelocytic leukemia. Mol Cell 6: 1131-1141.

He L, Hannon GJ (2004). MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev

Genet. 5(7):522-31.

Hertel J, Bartschat S, Wintsche A, Otto C (2012). Evolution of the let-7 microRNA family. RNA

Biol. 9(3):231-41.

Hu J (2011). Arsenic in the treatment of newly diagnosed acute promyelocytic leukemia: current status and future research direction. Front Med 5: 45-52.

Huang Y, Yang YB, Zhang XH, Yu XL, Wang ZB, Cheng XC (2013). MicroRNA-21 gene and cancer. Med Oncol 30(1):376.

Ibarra I, Erlich Y, Muthuswamy SK, Sachidanandam R, Hannon GJ (2007). A role for microRNAs in maintenance of mouse mammary epithelial progenitor cells. Genes Dev 21: 3238-3243.

Iniguez-Lluhi JA (2006). For a healthy histone code, a little SUMO in the tail keeps the acetyl away. ACS Chem Biol. 1(4):204-6

Insinga A, Pelicci PG, Inucci S (2005). Leukemia-associated fusion proteins. Multiple mechanisms of action to drive cell transformation. Cell Cycle 4: 67-69.

Isken F, Steffen B, Merk S, Dugas M, Markus B, Tidow N et al (2008). Identification of acute myeloid leukaemia associated microRNA expression patterns. Br J Haematol 140: 153-161.

Jaenisch R and Bird A (2003). Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33 Suppl.: 245-254

Johnson SM, Lin SY, Slack FJ (2003). The time of appearance of the C. elegans let-7 microRNA

83

is transcriptionally controlled utilizing a temporal regulatory element in its promoter. Dev

Biol 259: 364-379.

Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, Byrom M, Jarvis R, Cheng A et al (2005). RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 120: 635-647.

Johnson CD, Esquela-Kerscher A, Stefani G, Byrom M, Kelnar K, Ovcharenko D et al (2007). The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells. Cancer Res 67: 7713-7722.

Jones PA and Baylin SB (2002). The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev

Genet. 3(6):415-28.

Jongen-Lavrencic M, Sun SM, Dijkstra MK, Valk PJ, Lowenberg B (2008). MicroRNA expression profiling in relation to the genetic heterogeneity of acute myeloid leukemia. Blood 111: 5078-5085.

Kainz B, Heintel D, Marculescu R, Schwarzinger I, Sperr W, Le T et al (2002). Variable prognostic value of FLT3 internal tandem duplications in patients with de novo AML and a normal karyotype, t(15;17), t(8;21) or inv(16). Hematol J 3: 283-289.

Karlsson KH, Stenerlow B (2004). Focus formation of DNA repair proteins in normal and repair-deficient cells irradiated with high-LET ions. Radiat Res. 161(5):517-27.

Kelley RI (1973). Isolation of a histone IIb1-IIb2 complex. Biochem Biophys Res Commun., 54(4):1588-94.

Kim YK, Kim VN (2007). Processing of intronic microRNAs. Embo J 26: 775-783.

King-Underwood L, Pritchard-Jones K (1998). Wilms' tumor (WT1) gene mutations occur mainly in acute myeloid leukemia and may confer drug resistance. Blood 91: 2961-2968.

Kloosterman WP, Plasterk RH (2006). The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Dev Cell 11: 441-450.

Kong W, He L, Coppola M, et al. MicroRNA-155regulates cell survival, growth and

84

chemosensitivity by targeting FOXO3a in breast cancer. JBiol Chem, 2010

Kornberg RD, Thomas JO (1974). Chromatin structure; oligomers of the histones. Science 84(139):865-8

Kottaridis PD, Gale RE, Frew ME, Harrison G, Langabeer SE, Belton AA et al (2001). The presence of a FLT3 internal tandem duplication in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic information to cytogenetic risk group and response to the first cycle of chemotherapy: analysis of 854 patients from the United Kingdom Medical Research Council AML 10 and 12 trials. Blood 98: 1752-1759.

Kraus WL, Lis JT (2003). PARP goes transcription. Cell 113(6):677-83.

Krivtsov AV, Armstrong SA (2007). MLL translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer 7: 823-833.

Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, Meyer J, Lendeckel W, Tuschl T (2002). Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Curr Biol 12: 735-739.

Landthaler M, Yalcin A, Tuschl T (2004). The human DiGeorge syndrome critical region gene 8 and Its D. melanogaster homolog are required for miRNA biogenesis. Curr Biol 14: 2162-2167.

Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S, Kim VN (2002). MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBO J 21: 4663-4670.

Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J et al (2003). The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature 425: 415-419.

Lee YS, Dutta A (2007). The tumor suppressor microRNA let-7 represses the HMGA2 oncogene. Genes Dev 21: 1025-1030.

Leucci E, Cocco M, Onnis A, De Falco G, van Cleef P, Bellan C et al (2008). MYC translocation-negative classical Burkitt lymphoma cases: an alternative pathogenetic mechanism involving miRNA deregulation. J Pathol 216: 440-450.

85

Liang Y, Ridzon D, Wong L, Chen C (2007). Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics 8: 166.

Li N, Kaur S, Greshock J, Lassus H, Zhong X, Wang Y et al (2012). A combined array-based comparative genomic hybridization and functional library screening approach identifies mir-30d as an oncomir in cancer. Cancer Res 72(1):154-64.

Licht JD, Chomienne C, Goy A, Chen A, Scott AA, Head DR et al (1995). Clinical and molecular characterization of a rare syndrome of acute promyelocytic leukemia associated with translocation (11;17). Blood 85: 1083-1094.

Licht JD (2006). Reconstructing a disease: What essential features of the retinoic acid receptor fusion oncoproteins generate acute promyelocytic leukemia? Cancer Cell 9: 73-74.

Lo WS, Duggan L, Emre NC, Belotserkovskya R, Lane WS, Shiekhattar R, Berger SL (2001). Snf1--a histone kinase that works in concert with the histone acetyltransferase Gcn5 to regulate transcription. Science 293(5532):1142-6.

Lowenberg B, Downing JR, Burnett A (1999). Acute myeloid leukemia. N Engl J Med 341: 1051-1062.

Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ (1997). Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389(6648):251-60.

Lujambio A, Ropero S, Ballestar E, Fraga MF, Cerrato C, Setien F et al (2007). Genetic unmasking of an epigenetically silenced microRNA in human cancer cells. Cancer Res. 67: 1424–1429.

Lujambio A, Calin GA, Villanueva A, Ropero S, Sánchez-Céspedes M, Blanco D et al (2008). A microRNA DNA methylation signature for human cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci USA 105: 13556-13561.

Lund E, Guttinger S, Calado A, Dahlberg JE, Kutay U (2004). Nuclear export of microRNA precursors. Science 303: 95-98.

86

Lutterbach B, Hou Y, Durst KL, Hiebert SW (1999). The inv(16) encodes an acute myeloid leukemia 1 transcriptional corepressor. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 12822-12827.

Maroney PA, Yu Y, Fisher J, Nilsen TW (2006). Evidence that microRNAs are associated with translating messenger RNAs in human cells. Nat Struct Mol Biol 13: 1102-1107.

Martens JH, Brinkman AB, Simmer F, Francoijs KJ, Nebbioso A, Ferrara F et al (2010). PML-RARalpha/RXR Alters the Epigenetic Landscape in Acute Promyelocytic Leukemia. Cancer Cell 17: 173-185.

Martens JH (2011). Acute myeloid leukemia: a central role for the ETS factor ERG. Int J

Biochem Cell Biol 43: 1413-1416.

Martin C, Zhang Y (2005). The diverse functions of histone lysine methylation. Nat Rev Mol

Cell Biol 6(11):838-49.

Mayr C, Hemann MT, Bartel DP (2007). Disrupting the pairing between let-7 and Hmga2 enhances oncogenic transformation. Science 315: 1576-1579.

Mead AJ, Linch DC, Hills RK, Wheatley K, Burnett AK, Gale RE (2007). FLT3 tyrosine kinase domain mutations are biologically distinct from and have a significantly more favorable prognosis than FLT3 internal tandem duplications in patients with acute myeloid leukemia. Blood 110: 1262-1270.

Meister G, Tuschl T (2004). Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 431: 343-349.

Melnick A, Licht JD (1999). Deconstructing a disease: RARalpha, its fusion partners, and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia. Blood 93: 3167-3215.

Mi S, Lu J, Sun M, Li Z, Zhang H, Neilly MB et al (2007). MicroRNA expression signatures accurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloid leukemia. Proc Natl

Acad Sci U S A 104: 19971-19976.

Mineno J, Okamoto S, Ando T, Sato M, Chono H, Izu H et al (2006). The expression profile of microRNAs in mouse embryos. Nucleic Acids Res 34: 1765-1771.

87

Mitelman F, Johansson B, Mertens F (2007). The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer 7: 233-245.

Monteys AM, Spengler RM, Wan J, Tecedor L, Lennox KA, Xing Y et al (2010). Structure and activity of putative intronic miRNA promoters. RNA 16: 495-505

Mrozek K, Dohner H, Bloomfield CD (2007). Influence of new molecular prognostic markers in patients with karyotypically normal acute myeloid leukemia: recent advances. Curr Opin

Hematol 14: 106-114.

Nakao M, Yokota S, Iwai T, Kaneko H, Horiike S, Kashima K et al (1996). Internal tandem duplication of the flt3 gene found in acute myeloid leukemia. Leukemia 10: 1911-1918.

Nervi C, Ferrara FF, Fanelli M, Rippo MR, Tomassini B, Ferrucci PF et al (1998). Caspases mediate retinoic acid-induced degradation of the acute promyelocytic leukemia PML/RARalpha fusion protein. Blood 92: 2244-2251.

Nervi C, Fazi F, Grignani F (2008). Oncoproteins, heterochromatin silencing and microRNAs: a new link for leukemogenesis. Epigenetics 3: 1-4.

Newman MA, Thomson JM, Hammond SM (2008). Lin-28 interaction with the Let-7 precursor loop mediates regulated microRNA processing. RNA 14: 1539-1549.

Noma K, Sugiyama T, Cam H, Verdel A, Zofall M, Jia S et al (2004). RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat Genet 36: 1174-1180.

Noonan EJ, Place RF, Pookot D, Basak S, Whitson JM, Hirata H, et al (2009). miR-449a targets HDAC-1 and induces growth arrest in prostate cancer. Oncogene 28(14):1714-24.

Nottrott S, Simard MJ, Richter JD (2006). Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nat Struct Mol Biol 13: 1108-1114.

O'Connell RM, Rao DS, Chaudhuri AA, Boldin MP, Taganov KD, Nicoll J et al (2008). Sustained expression of microRNA-155 in hematopoietic stem cells causes a myeloproliferative disorder. J Exp Med 205: 585-594.

88

Osley MA, Fleming AB, Kao CF (2006). Histone ubiquitylation and the regulation of transcription. Results Probl Cell Differ 41:47-75.

Ozen M, Creighton CJ, Ozdemir M, Ittmann M (2008). Widespread deregulation of microRNA expression in human prostate cancer. Oncogene 27: 1788-1793.

Ozsolak F, Poling LL, Wang Z, Liu H, Liu XS, Roeder RG et al (2008). Chromatin structure analyses identify miRNA promoters. Genes Dev 22: 3172-3183.

Pelosi A, Careccia S, Lulli V, Romania P, Marziali G, Testa U et al (2012). miRNA let-7c promotes granulocytic differentiation in acute myeloid leukemia. Oncogene, Sep 10. doi: 10.1038/onc.2012.398. [Epub ahead of print]

Peterson CL and Laniel MA (2004). Histones and histone modifications. Curr. Biol. 14(14): R546-51.

Pillai RS, Bhattacharyya SN, Artus CG, Zoller T, Cougot N, Basyuk E et al (2005). Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells. Science 309: 1573-1576.

Pineau P, Volinia S, McJunkin K, Marchio A, Battiston C, Terris B et al (2010). miR-221 overexpression contributes to liver tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 264-269.

Pospisil V, Vargova K, Kokavec J, Rybarova J, Savvulidi F, Jonasova A et al (2011). Epigenetic silencing of the oncogenic miR-17-92 cluster during PU.1-directed macrophage differentiation. Embo J 30(21): 4450–4464

Rana TM (2007). Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 23-36.

Razin, A. and Cedar, H. (1991). DNA methylation and gene expression. Microbiol. Rev. 55: 451-58.

Redner RL, Rush EA, Faas S, Rudert WA, Corey SJ (1996). The t(5;17) variant of acute promyelocytic leukemia expresses a nucleophosmin-retinoic acid receptor fusion. Blood 87: 882-886.

89

Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE et al (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403: 901-906.

Ro S, Park C, Young D, Sanders KM, Yan W (2007). Tissue-dependent paired expression of miRNAs. Nucleic Acids Res 35: 5944-5953.

Roark DE, Geoghegan TE, Keller GH (1974). A two-subunit histone complex from calf thymus. Biochem Biophys Res Commun. 59(2):542-7.

Rodenhiser D, Mann M (2006). Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications CMAJ 174(3):341-8.

Rodriguez A, Griffiths-Jones S, Ashurst JL, Bradley A (2004): Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res 14:1902-1910.

Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM (1998). DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem 273(10):5858-68.

Rosnet O, Buhring HJ, Marchetto S, Rappold I, Lavagna C, Sainty D et al (1996). Human FLT3/FLK2 receptor tyrosine kinase is expressed at the surface of normal and malignant hematopoietic cells. Leukemia 10: 238-248.

Roth SY, Denu JM, Allis CD (2001). Histone acetyltransferases. Annu. Rev. Biochem. 70: 81–120

Roush S, Slack FJ (2008). The let-7 family of microRNAs. Trends Cell Biol 18: 505-516.

Saini HK, Griffiths-Jones S, Enright AJ (2007). Genomic analysis of human microRNA transcripts. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 104: 17719-17724.

Saini HK, Enright AJ, Griffiths-Jones S (2008). Annotation of mammalian primary microRNAs. BMC Genomics 9: 564.

90

Sampson VB, Rong NH, Han J, Yang Q, Aris V, Soteropoulos P et al (2007). MicroRNA let-7a down-regulates MYC and reverts MYC-induced growth in Burkitt lymphoma cells. Cancer Res 67: 9762-9770.

Santanam U, Zanesi N, Efanov A, Costinean S, Palamarchuk A, Hagan JP et al (2010). Chronic lymphocytic leukemia modeled in mouse by targeted miR-29 expression. Proc Natl Acad Sci U

S A 107(27): 12210–12215.

Sauve DM, Anderson HJ, Ray JM, James WM, Roberge M (1999). Phosphorylation-induced rearrangement of the histone H3 NH2-terminal domain during mitotic chromosome condensation. J Cell Biol 145(2):225-35.

Schiltz RL, Mizzen CA, Vassilev A, Cook RG, Allis CD, Nakatani Y (1999). Overlapping but distinct patterns of histone acetylation by the human coactivators p300 and PCAF within nucleosomal substrates. J Biol Chem. 274(3):1189-92.

Schnittger S, Schoch C, Kern W, Mecucci C, Tschulik C, Martelli MF et al (2005). Nucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. Blood 106: 3733-3739.

Schultz J, Lorenz P, Gross G, Ibrahim S, Kunz M (2008). MicroRNA let-7b targets important cell cycle molecules in malignant melanoma cells and interferes with anchorage-independent growth. Cell Res 18: 549-557.

Schwarz DS, Hutvagner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD (2003). Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115: 199-208.

Scott GK, Mattie MD, Berger CE, Benz SC, Benz CC (2006).Rapid alteration of microRNA levels by histone deacetylase inhibition. Cancer Res. 66(3):1277-81.

Sempere LF, Dubrovsky EB, Dubrovskaya VA, Berger EM, Ambros V (2002). The expression of the let-7 small regulatory RNA is controlled by ecdysone during metamorphosis in Drosophila melanogaster. Dev Biol 244: 170-179.

Sempere LF, Freemantle S, Pitha-Rowe I, Moss E, Dmitrovsky E, Ambros V (2004). Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronal differentiation. Genome Biol 5: R13.

91

Shell S, Park SM, Radjabi AR, Schickel R, Kistner EO, Jewell DA et al (2007). Let-7 expression defines two differentiation stages of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 11400-11405.

Shiio Y, Eisenman RN (2003), Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. Proc Natl Acad Sci USA 100(23):13225-30.

Song J, Noh JH, Lee JH, Eun JW, Ahn YM, Kim SY, et al (2005). Increased expression of histone deacetylase 2 is found in human gastric cancer. APMIS 113: 264–268.

Song F, Smith JF, Kimura MT, Morrow AD, Matsuyama T, Nagase H et al (2005). Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 102: 3336-3341

Steffen B, Muller-Tidow C, Schwable J, Berdel WE, Serve H (2005). The molecular pathogenesis of acute myeloid leukemia. Crit Rev Oncol Hematol 56: 195-221.

Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, Tomida S, Osada H, Endoh H et al (2004). Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 64: 3753-3756.

Tallman MS, Gilliland DG, Rowe JM (2005). Drug therapy for acute myeloid leukemia. Blood 106: 1154-1163.

Thiede C, Koch S, Creutzig E, Steudel C, Illmer T, Schaich M et al (2006). Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutations in 1485 adult patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood 107: 4011-4020.

Toyota M, Suzuki H, Sasaki Y, Maruyama R, Imai K, Shinomura Y et al (2008). Epigenetic silencing of microRNA-34b/c and B-cell translocation gene 4 is associated with CpG island methylation in colorectal cancer. Cancer Res. 68: 4123–4132.

Valeri N, Gasparini P, Fabbri M, Braconi C, Veronese A, Lovat F et al (2010). Modulation of mismatch repair and genomic stability by miR-155. Proc Natl Acad Sci U S A 107(15): 6982–6987

92

Verdin E, Dequiedt F, Kasler HG (2003). Class II histone deacetylases: versatile regulators.

Trends Genet. 19(5):286-93

Viswanathan SR, Daley GQ, Gregory RI (2008). Selective blockade of microRNA processing by Lin28. Science 320: 97-100.

Viswanathan SR, Powers JT, Einhorn W, Hoshida Y, Ng TL, Toffanin S et al (2009). Lin28 promotes transformation and is associated with advanced human malignancies. Nat Genet 41: 843-848.

Viswanathan SR, Daley GQ (2010). Lin28: A microRNA regulator with a macro role. Cell 140: 445-449.

Volinia S, Calin GA, Liu CG, Ambs S, Cimmino A, Petrocca F et al (2006). A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci U

S A 103(7): 2257–2261

Wang X, Xuan Z, Zhao X, Li Y, Zhang MQ (2009). High-resolution human core-promoter prediction with CoreBoost_HM. Genome Res 19: 266-275.

Weber B, Stresemann C, Brueckner B, Lyko F (2007). Methylation of human microRNA genes in normal and neoplastic cells. Cell Cycle 6(9):1001-5.

Wei Y, Yu L, Bowen J, Gorovsky MA, Allis C, (1999). Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97(1):99-109.

Wells RA, Catzavelos C, Kamel-Reid S (1997). Fusion of retinoic acid receptor alpha to NuMA, the nuclear mitotic apparatus protein, by a variant translocation in acute promyelocytic leukaemia. Nat Genet 17: 109-113.

Westendorf JJ, Yamamoto CM, Lenny N, Downing JR, Selsted ME, Hiebert SW (1998). The t(8;21) fusion product, AML-1-ETO, associates with C/EBP-alpha, inhibits C/EBP-alpha-dependent transcription, and blocks granulocytic differentiation. Mol Cell Biol 18: 322-333.

Wolffe AP (1997). Histone H1. Int J Biochem Cell Biol. 29(12):1463-6.

93

Wu L, Fan J, Belasco JG (2006). MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA. Proc Natl

Acad Sci U S A 103: 4034-4039.

Wulczyn FG, Smirnova L, Rybak A, Brandt C, Kwidzinski E, Ninnemann O et al (2007). Post-transcriptional regulation of the let-7 microRNA during neural cell specification. FASEB J 21: 415-426.

Xiao B, Jing C, Wilson JR, Walker PA, Vasisht N, Kelly G, et al (2003) Structure and catalytic mechanism of the human histone methyltransferase. Nature 421(6923):652-6.

Xu H, Cheung IY, Guo HF, Cheung NK (2009). miR-29 modulates expression of immunoinhibitory molecule B7-H3: potential implications for immune based therapy of human solid tumors. Cancer Res 69(15): 6275–6281

Yamamoto Y, Kiyoi H, Nakano Y, Suzuki R, Kodera Y, Miyawaki S et al (2001). Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies. Blood 97: 2434-2439.

Yassin ER, Sarma NJ, Abdul-Nabi AM, Dombrowski J, Han Y, Takeda A et al (2009). Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One 4: e6719.

Yokoyama A, Lin M, Naresh A, Kitabayashi I, Cleary ML (2010). A higher-order complex containing AF4 and ENL family proteins with P-TEFb facilitates oncogenic and physiologic MLL-dependent transcription. Cancer Cell 17: 198-212.

Yoshida H, Kitamura K, Tanaka K, Omura S, Miyazaki T, Hachiya T et al (1996). Accelerated degradation of PML-retinoic acid receptor alpha (PML-RARA) oncoprotein by all-trans-retinoic acid in acute promyelocytic leukemia: possible role of the proteasome pathway. Cancer Res 56: 2945-2948.

Youn BS, Mantel C, Broxmeyer HE (2000). Chemokines, chemokine receptors and hematopoiesis. Immunol Rev 177: 150-174.

Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S et al (2007). Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318: 1917-1920.

94

Zeng Y (2006). Principles of micro-RNA production and maturation. Oncogene 25: 6156-6162.

Zhang Y, Reinberg D (2001). Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15(18):2343-60. Review

Zimonjic DB, Pollock JL, Westervelt P, Popescu NC, Ley TJ (2000). Acquired, nonrandom chromosomal abnormalities associated with the development of acute promyelocytic leukemia in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 13306-13311.

universitÀ di roma “sapienza” - padis.uniroma1.itpadis.uniroma1.it/bitstream/10805/2109/1/tesi...

Documents