universidade federal do cearÁ faculdade de medicina ...€¦ · resumo estudo do mecanismo de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

ALYNE MARA RODRIGUES DE CARVALHO

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DA

RIPARINA II DE Aniba Riparia EM CAMUNDONGOS

FORTALEZA

2016




Tese apresentada à Coordenação do programa

de Pós-graduação em Farmacologia do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

Faculdade de Medicina da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial para a

obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Orientadora: Profa. Dra. Francisca Cléa

Florenço de Sousa

FORTALEZA

2016




Tese apresentada a Coordenação do Programa

de Pós-Graduação em Farmacologia como

requisito parcial para a obtenção do título de

Doutor em Farmacologia.

Aprovada em: _____/_____/________

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________

Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará

___________________________________________

Prof. Dr. Emiliano Ricardo Vasconcelos Rios

Faculdade Metropolitana de Fortaleza

__________________________________________

Prof. Dra. Teresa Maria de Jesus Ponte Carvalho

Universidade Federal do Ceará

__________________________________________

Prof. Dra. Patrícia Freire de Vasconcelos

Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira

__________________________________________

Prof. Dr. Francisco Fleury Uchoa Santos Júnior

Centro Universitário Estácio do Ceará

AGRADECIMENTOS

A Deus em primeiro lugar

Aos meus pais e minha avó, por terem apoiado minhas decisões em todos os

momentos da minha vida. Amo muito vocês.

Ao meu irmão Henrique e a Samara (“Cun”) por todo incentivo que recebi e

também pelos momentos de lazer e descontração que me proporcionaram. Enfim, para toda a

minha família (incluindo a que ganhei após meu casamento) ...meu MUITO OBRIGADA!!

Ao meu marido, Leonardo, pela dedicação, companheirismo, generosidade,

humildade e seu grande amor. A pessoa com coração mais puro que conheço e que me faz feliz

todos os dias.

Aos meus amigos cuja pureza de coração e nobreza de caráter sempre me foram

revigorantes: Camila, Mariana, Nathalia, Thaís, Samanta, Roberta, JV, Camylla, Tatiana e

Thamires. Agradeço por terem sido sempre presentes quando necessitei.

Agradeço aos grandes amigos que fiz durante a pós-graduação Nayrton, Emiliano,

Aline e Marília. Agradeço por sempre ter encontrado incentivo, inúmeras idéias e pelo enorme

apoio em vários experimentos. Amigos que conquistei para a vida toda.

À minha orientadora, Profª. Drª. Francisca Cléa Florenço de Sousa, que tenho a há

10 anos me acolheu e me ensinou bastante, sendo minha inspiração e referência de

pesquisadora.

À todas outras professoras do Laboratório de Neurofarmacologia e do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia por ajudarem na minha formação

Aos professores doutores que participaram da banca, os quais tenho profunda

admiração científica, por estarem à disposição para participar desse dia tão especial.

À todos os amigos do laboratório de Neurofarmacologia Patrícia Xavier, Edith,

Giuliana, Camila, Belzinha, Thiciane, Fernanda, Gersilene, Mariana Fernandes, Cacá, Luciana,

Taciana, Vládia, Eduardo, Sarah e outros, pela companhia e cooperação.

Aos funcionários e amigos do laboratório Vilani (“prima”) e Lena, sempre presente

e dispostas a ajudar.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia pela dedicação ao

trabalho.

À CAPES e CNPq pelo apoio financeiro no desenvolvimento deste trabalho.

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para este trabalho

Muito obrigada!

RESUMO



Do fruto verde da espécie Aniba riparia (Nees) Mez, são encontradas algumas alcamidas, uma

em especial, a Riparina II (RipII) possuindo um interessante potencial terapêutico. Estudos

anteriores mostraram que a mesma apresentou efeitos ansiolítico e antidepressivo além de um

efeito antiinflamatório. Este trabalho foi desenvolvido após aprovação pela CEUA/UFC (nº

41/15). O objetivo do estudo foi avaliar o papel da RipII no processo de nocicepção, os possíveis

mediadores envolvidos e mecanismos farmacológicos. Foram utilizados camundongos Swiss

machos e inicialmente foi realizado o teste de toxicidade segundo a OECD 425, o teste de

toxicidade oral por 28 dias e a modelagem molecular para os os receptores TRPV1, TRPA1 e

bradicinina. Os modelos experimentais de nocicepção realizados foram: contorções induzidas

pelo ácido acético, hipernocicepção mecânica induzida por agentes algésicos (carragenina,

PGE2 e epinefrina), teste de nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina,

cinamaldeído, mentol, bradicinina, PMA e 8-Br-AMPc, além de investigar o envolvimento dos

canais de potássio e alguns sistemas de neurotransmissores. A modelagem molecular mostrou

que a RipII possui uma forte interação com os receptores TRPV1, TRPA1 e bradicinina. A

RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.) foi capaz de reduzir de forma significativa a nocicepção induzida

por ácido acético e a hipernocicepção induzida por carragenina, PGE2 e epinefrina. No teste das

contorções abdominais induzidas por ácido acético foi realizada curva de tempo com a RipII na

dose de 50mg/kg, onde observou-se que os efeitos da RipII-50mg/kg apareceram após 30

minutos e persistiu por 240 minutos. Na investigação do mecanismo antinociceptivo, a RipII

mostrou efeito relacionado com os canais K+ATP, TRPV1, TRPM8, ASIC, receptores de

bradicinina, PKA e PKC. Para estudar as possíveis vias de neurotransmissão foi realizado o

modelo de contorções induzidas por ácido acético e os animais foram pré-tratados com

diferentes substâncias. O efeito antinociceptivo da RipII (50 mg/kg, v.o.) foi revertido quando

os animais foram pré tratados com naloxona, glibenclamida e ioimbina, enquanto os animais

não apresentaram qualquer alteração comportamental, quando pré-tratadas com NAN-190,

ritanserina, ondansetrona, atropina ou haloperidol. Estes dados demonstram que RipII produz

um importante efeito antinociceptivo através de mecanismos moleculares dos canais K+ATP,

TRPV1, TRPA1, TRPM8, ASIC, PKC, PKA, receptores de bradicinina, receptores α2-

adrenérgico e receptores opioides.

Palavras chave: Nocicepção. Inflamação.modelagem de drogas. Produtos naturais.

ABSTRACT

STUDY OF THE MECHANISM OF ACTION OF THE ANTINOCICEPTIVE

ACTIVITY OF RIPARIN II BY Aniba riparia IN MICE

The unripe fruit of the species of Aniba riparia (Nees) Mez, found some alkamides, one in

particular, Riparin II (RipII) has an interesting therapeutic potential. Previous studies showed

that it had anxiolytic and antidepressant effects as well as an antiinflammatory effect. This study

was conducted after approval by the CEUA/UFC (n° 41/15). The aim of the study was to

evaluate the role of RipII in nociception process, possible mediators involved and the possible

pharmacological mechanisms involved. They used male Swiss mice and was initially

performed the toxicity test according to OECD 425, the oral toxicity test for 28 days and the

molecular modeling of the TRPV1, TRPA1 and bradikynin receptors. The models of

nociception were performed: writhes induced by acetic acid, hyperalgesia mechanical induced

nociceptive agents (carrageenan, PGE2 and epinephrine), nociception test induced by

intraplantar injection of capsaicin, cinnamaldehyde, menthol, bradykinin, PMA and 8-Br-

cAMP, and investigate the role of potassium channels and some neurotransmitter systems.

Molecular modeling has shown that RipII has a Strong interaction with TRPV1, TRPA1 and

bradykinin receptors. The RipII (25 and 50 mg/kg, p.o.) was able to significantly reduce

nociception induced by acetic acid and hyperalgesia induced by carrageenan, PGE2 and

epinephrine. In the test of writhing induced by acetic acid was carried out time curve at a dose

of 50 mg/kg and we observed that the effects of RipII-50mg/kg appeared within 30 minutes and

persisted for 240 minutes. In the investigation of the analgesic mechanism, RipII showed effect

related to the K+ ATP channels, TRPV1, TRPM8, ASIC, bradykinin receptors, PKA and PKC.

To study possible neurotransmission pathways was performed writhing model of acetic acid-

induced and the animals were pretreated different substances. The analgesic effect of RipII (50

mg/kg, p.o.) was reversed when the animals were pretreated with naloxone, glibenclamide and

yohimbine, while the animals showed no behavioral change when pretreated with NAN-190,

ritanserin, ondansetron, atropine or haloperidol. These data demonstrate that RipII produces a

significant antinociceptive effect via molecular mechanisms of K+ ATP channels, TRPV1,

TRPA1, TRPM8, ASIC, PKC, PKA, bradykinin receptors, α2 adrenergic receptors and opioid

receptors.

Keywords: Nociception. Inflammation. Drug design. Biological products

LISTA DE FIGURAS

1 Axônios aferentes primários............................................................................... 20

2 Principais nociceptores envolvidos na dor.......................................................... 21

3 Mecanismo de transdução periférica.................................................................. 22

4 Vias dos sistemas sensoriais............................................................................... 24

5 Secção transversal da medula espinal mostrando as lâminas de Rexed............. 25

6 Principais vias ascendentes antero-laterais de transmissão da dor..................... 27

7 Teoria do controle do portão (Teoria da Comporta) da dor................................ 28

8 Sistemas endógenos de analgesia........................................................................ 29

9 Aniba riparia (Nees) Mez................................................................................... 33

10 Esquema do teste de toxicidade aguda segundo OECD 425.............................. 41

11 Esquema do teste de toxicidade subcrônica no tratamento de doses repetidas

por 28 dias............................................................................................................ 42

12 Fotomicrografia de órgãos na toxicidade oral da RipII no protocolo de doses

repetidas por 28 dias (aumento x10).................................................................. 56

13 Locais de interação entre o ligante (RipII) e o receptor (TRPV1)..................... 57

14 Locais de interação entre o ligante (RipII) e o receptor (TRPA1)...................... 58

15 Ramachandran (MolProbity) para p modelo do receptor de bradicinina............ 60

16 Padrão de energia indicando a qualidade global do receptor de bradicinina..... 61

17 Locais de interação entre o ligante (RipII) e o receptor de bradicinina.............. 62

18 Análise histológica de patas de camundongos.................................................... 67

LISTA DE TABELAS

1 Receptores de transdução expressos por neurônios nociceptores................. 18

2 Usos das principais espécies da família Lauraceae...................................... 32

3 Atividades biológicas das alcamidas isoladas da Aniba riparia................... 34

4 Substâncias usadas no estudo........................................................................ 39

5 Pesos e observações quanto ao aparecimento dos sinais de toxicidade........ 52

6 Eritrograma, plaquetometria e leucograma dos camundongos no teste de

toxicidade oral por 28 dias............................................................................ 54

7 Níveis plasmáticos de uréia, creatinina, AST e ALT dos camundongos após

o tratamento diário consecutivo por 28 dias com Riparina II ou veículo

(Controle)...................................................................................................... 55

8 Avaliação do mecanismo de ação da RipII utilizando modelo de nocicepção

induzida por ácido acético............................................................................. 84

LISTA DE GRAFICOS

1 Média do ganho de peso dos animais no teste de toxicidade oral por 28 dias....... 53

2 Efeito da administração de RipII na nocicepção induzida por ácido acético em

camundongos......................................................................................................... 63

3 Efeito da RipII no teste da hipernocicepção inflamatória induzida por

carragenina............................................................................................................. 65

4 Análise histológica das patas de camundongos...................................................... 66

5 Níveis de MDA e Nitrito nas patas de camundongos inflamadas por

carragenina............................................................................................................. 68


PGE2...................................................................................................................... 69


Epinefrina............................................................................................................... 70

8 Papel dos receptores de potencial transiente do tipo V1 (TRPV1) no efeito

antinociceptivo da RipII......................................................................................... 71

9 Papel dos receptores de potencial transiente do tipo A1 (TRPA1) no efeito


10 Papel dos receptores de potencial transiente do tipo M8 (TRPM8) no efeito


11 Papel dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASIC) no efeito antinociceptivo da

RipII....................................................................................................................... 77

12 Envolvimento da RipII no comportamento nociceptivo causado pela injeção

intraplantar de bradicinina...................................................................................... 78

13 Efeito da RipII na nocicepção induzida pela injeção intraplantar de PMA........... 79

14 Efeito da RipII na nocicepção induzida pela injeção intraplantar de 8-Br-

AMPc..................................................................................................................... 80

15 Influência do pré-tratamento com glibenclamida (2 mg/kg) sobre o efeito


16 Influência do pré-tratamento com naloxona (1 mg/kg) sobre o efeito


17 Influência do pré-tratamento com ioimbina sobre o efeito antinociceptivo da

RipII...................................................................................................................... 83

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

µg Micrograma

5-HT 5-hidroxitriptamina (serotonina)

AMPc Adenosina 3´5´monofosfato cíclica

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

ASICs Canais iônicos sensíveis ao ácido

ASIC 1 Canais iônicos sensíveis ao ácido tipo 1

ASIC 4 Canais iônicos sensíveis ao ácido tipo 4

BK Bradicinina

Cg Carragenina

CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

COX Ciclooxigenase

DE50 Dose Efetiva 50

DL50 Dose Letal 50

DZP Diazepam

E.P.M. Erro Padrão da Média

GDNF Células gliais derivadas de fator neurotrófico

HE Hematoxilina Eosina

Il Interleucina

i.p. Intraperitonial

i.pl. Intraplantar

NGF Fator de crescimento neural

NK1 Neuroquinina 1

NMDA N-metil D-Aspartato

NMR Núcleo magno da rafe

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

P Nível de significância

P2X3 Receptor purinérgico 3

PAG Substância cinzenta periaquedutal

pCPA p-clorofenilalanina

PGs Prostaglandinas

PGE2 Prostaglandina tipo E2

PGF2 Prostaglandina tipo F2

PKA Proteína quinase A

PKC Proteína quinase C

PMA Formol 12 miristato 13-acetato

RPM Rotações por minuto

s.c. Subcutâneo

SP Substância P

SMT Trato espinomesencefálico

SNC Sistema nervoso central

SRT Trato espinoreticular

STT Trato espinotalâmico

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

TRKA Receptor de Tirosina Quinase tipo A

TRPA Receptor de Potencial Transitório do tipo Anquirina

TRPA 1 Receptor de Potencial Transitório do tipo Anquirina 1

TRPC Receptor de Potencial Transitório do tipo Canônico

TRPM Receptor de Potencial Transitório do tipo Melastatina

TRPM 8 Receptor de Potencial Transitório do tipo Melastatina 8

TRPV Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide

TRPV 1 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 1




VLF Funículo ventrolateral

v.o. Via oral

VR1 Receptor do tipo vanilóide 1

Vs. Versus

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 16

1.1 Nocicepção e Dor 16

1.1.1 Transdução 18

1.1.2 Transmissão 22

1.1.3 Modulação da dor 27

1.2 Plantas Medicinais 30

1.2.1 Família Lauraceae e a espécie Aniba riparia 31

1.3 Modelagem Molecular 35

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA 37

3 OBJETIVO 38

3.1 Geral 38

3.2 Específicos 38

4 MATERIAIS E MÉTODOS 39

4.1 Material Botânico 39

4.2 Drogas e substâncias utilizadas 39

4.3 Animais 40

4.4 Princípios éticos 40

4.5 Estimativa da DL50 da Riparina II através da OECD 425 (Acute Oral

Toxicity-Up-And-Down)

41

4.6 Avaliação da toxicidade oral de doses repetidas por 28 dias 42

4.6.1 Procedimentos analíticos 43

4.6.1.1 Análise dos parâmetros hematológicos 43

4.6.1.2 Análise dos parâmetros bioquímicos 43


4.8 Avaliação da Atividade antinociceptiva 44

4.8.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético 44

4.8.2 Hipernocicepção inflamatória induzida por carragenina 45

4.8.2.1 Análise da lesão causada pela carragenina 45

4.8.3 Hipernocicepção inflamatória induzida por PGE2 46

4.8.4 Hipernocicepção inflamatória induzida por Epinefrina 46

4.9 Avaliação do mecanismo antinociceptivo da RipII 46

4.9.1 Participação dos receptores potêncial transiente (TRP) 46

4.9.1.1 TRPV1 46

4.9.1.2 TRPA1 47

4.9.1.3 TRPM8 47

4.9.2 Participação dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASICs) 47

4.9.3 Participação dos receptores de bradicinina 48

4.9.4 Participação da Proteína Quinase C (PKC) 48

4.9.5 Participação da Proteína Quinase A (PKA) 48

4.9.6 Participação dos Canais de potássio dependentes de ATP 48

4.9.7 Participação do Sistema Opióide 49

4.9.8 Participação do sistema α2-adrenérgico 49

4.9.9 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-

HT3)

49

4.9.10 Participação do sistema colinérgico 49

4.9.11 Participação do sistema dopaminérgico 50

4.10 Análise estatística 50

5 RESULTADOS 51

5.1 Ensaios de Toxicidade 51

5.1.1 Estimativa da DL50 da RipII através da OECD 425 (Acute Oral Toxicity-

Up-And-Down)

51

5.2 Toxicidade oral da Riparina II no protocolo de doses repetidas por 28

dias

53

5.2.1 Sobrevivência, massa corpórea e observações comportamentais. 53

5.2.2 Análise dos parâmetros hematológicos 54

5.2.3 Análise dos parâmetros bioquímicos 55

5.2.4 Análise macro e microscópica dos órgãos 56


5.3.1 TRPV1 57

5.3.2 TRPA1 58

5.3.3 Bradicinina 59

5.4 Avaliação da Atividade Antinociceptiva 63

5.4.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético 63

5.4.2 Hipernocicepção inflamatória induzida por carragenina 65

5.4.2.1 Análise da lesão causada pela carragenina 66

5.4.3 Hipernocicepção inflamatória induzida por PGE2 69

5.4.4 Hipernocicepção inflamatória induzida por Epinefrina 70

5.5 Avaliação do mecanismo antinociceptivo da RipII 71

5.5.1 Participação dos receptores TRP 71

5.5.1.1 TRPV1 71

5.5.1.2 TRPA1 72

5.5.1.3 TRPM8 74

5.5.2 Participação dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASICs) 76

5.5.3 Participação dos receptores de Bradicinina 78

5.5.4 Participação da Proteína Quinase C (PKC) 79

5.5.5 Participação da Proteína Quinase A (PKA) 80

5.5.6 Participação dos Canais de potássio dependentes de ATP 81

5.5.7 Participação do Sistema Opióide 82

5.5.8 Participação do Sistema α2 adrenérgico 83

5.5.9 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-

HT3), colinérgicos e dopaminérgicos

84

6 DISCUSSÃO 85

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS 99

8 CONCLUSÃO 100

REFERÊNCIAS 101

ANEXO 1 119

ANEXO 2 120

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 Nocicepção e Dor

Desde os tempos mais remotos, conforme sugerem alguns registros gráficos da pré-

história e de documentos escritos, o homem sempre procurou esclarecer as razões que

justificassem a ocorrência de dor e os procedimentos destinados ao seu controle. A dor desde

os primórdios da humanidade está ligada ao homem e continua sendo uma grande preocupação

para a sociedade (SBED, 2016).

Atualmente, os dados adquiridos no último censo demográfico realizado pelo

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em 2010, foram observadas mudanças

na estrutura etária brasileira que apresenta 11,3 % da população brasileira acima de 60 anos,

evidenciando-se à transição epidemiológica. Frisa-se que à medida que a população envelhece,

maior é a prevalência de problemas crônicos de saúde (IBGE, 2010). Dentre as principais

consequências que essa mudança traz para a sociedade, a dor é uma das mais significativas,

sendo em muitos casos a dor crônica como principal queixa do indivíduo, interferindo

consideravelmente na qualidade de vida dos idosos (SBED, 2015).

A incidência da dor crônica no mundo oscila entre 7% a 40% na população. No

Brasil, estudos mostram altas taxas de prevalência, cerca de 41,4 até 61,4% na população (SÁ

et al., 2009), sendo que cerca de 50% a 60% dos pacientes ficam parcial ou totalmente

incapacitados, de maneira transitória ou permanente, comprometendo de modo significativo a

qualidade de vida, com impactos sociais e econômicos negativos. Consequentemente, muitos

dias de trabalho podem ser perdidos por indivíduos portadores de quadro álgico (BLYTH,

2008).

A Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) em uma reunião que

ocorreu em Kyoto no ano de 2007 definiu a dor como “uma experiência sensorial e emocional

desagradável, associada a uma lesão tecidual, real ou potencial, ou descrita em termos de tal

lesão”. No entanto, em 2011 a IASP alterou este conceito, que passou a ser “uma experiência

sensorial e emocional desagradável associada a uma lesão tissular, potencial ou real, ou mesmo

a nenhuma lesão, embora, ainda assim, descrita com termos sugestivos de que o dano tecidual

tivesse de fato ocorrido” (IASP, 2010).

A dor é sempre subjetiva onde cada indivíduo aprende a aplicação da palavra

através de experiências relacionadas com lesões no início da vida. Porém, a percepção corporal

17

da dor é denominada nocicepção, termo fisiológico usado para descrever o processo neural de

codificação e processamento de estímulos nocivos (LOESER; TREEDE, 2008).

O termo nocicepção, na comunidade científica, foi introduzido em 1906 para

diferenciar a percepção de estímulos nocivos da sensação da dor propriamente dita, é um

processo puramente fisiológico. Desta forma, a nocicepção consiste na recepção e

decodificação do estímulo nocivo por estruturas altamente especializadas do sistema nervoso

– os nociceptores. Tais nociceptores consistem em terminações nervosas livres associadas a

fibras aferentes primárias com características distintas (por exemplo, limiares de ativação e

sensibilidade) em relação a outras estruturas nervosas sensoriais (ALMEIDA;

ROIZENBLATT; TUFIK, 2004; LOESER; TREEDE, 2008).

O conhecimento sobre os mecanismos nociceptivos atingiu avanços significativos,

porém contrasta diretamente com a ausência de avanços nas estratégias terapêuticas. Sabemos

que os fármacos utilizados hoje para o controle da dor são os mesmos há décadas, basicamente

opióides e anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs). Embora eficazes em grande parte das

condições dolorosas, apresentam efeitos adversos que tornam o tratamento clínico limitado

(NEGUS et al., 2006; WOODCOCK et al., 2007). O aparecimento da tolerância analgésica e

a possibilidade de desenvolvimento de dependência química são alguns dos efeitos adversos

apresentados pelos analgésicos opióides. Entre os AINEs, o problema mais frequente está

relacionado às complicações gastrintestinais (HENRY et al., 1996; COLLETT, 1998;

WHITTLE, 2003).

A dor pode ser gerada pelo excesso de estímulos nociceptivos, pela diminuição do

limiar de disparo sensitivo ou pela hipoatividade do sistema supressor. Nas condições normais,

a divisão aferente do sistema nervoso periférico (SNP) capta estímulo sensorial e transmite

para o Sistema Nervoso Central (SNC), onde é decodificada e interpretada. Mecanismos

modulatórios sensibilizam ou suprimem a nocicepção em todas as etapas em que ela é

processada. (MILLAN, 1999; STANFIELD, 2013).

Existem três mecanismos interligados que explicam a ocorrência da sensação de

dor. O primeiro deles é a transdução, que consiste na ativação dos nociceptores por ocorrência

de um estímulo nocivo (podendo ser mecânico, térmico ou químico), gerando um potencial de

ação. A transmissão, efetuada pelo conjunto de vias que conduzem o impulso nervoso gerado

pelo nociceptor, leva a informação dolorosa para o SNC. Por fim, a modulação pode ativar vias

responsáveis pela supressão da dor gerada pelos próprios nociceptores e suas vias

(MESSLINGER, 1997; PORTO, 2004; TRANQUILLI, 2004).

18

1.1.1 Transdução

De todos os sistemas sensoriais, o sistema somestésico responde a uma variedade

de estímulos e pos isso, possui uma grande diversidade de tipos de receptores onde as

informações são captadas por receptores sensoriais, que respondem a tipos específicos de

estímulos. As sensações somestésicas de estímulos associados à superfície do corpo exigem

mecanoceptores, para detectar pressão, força e vibração; termorreceptores para detectar a

temperatura da pele; e nociceptores para detectar estímulos lesivos a tecidos (MUIR III, 2001)

(Tabela 1).

TABELA 1. Receptores de transdução expressos por neurônios nociceptores

Fonte: STANFIELD, 2013.

19

Os mecanoceptores podem ser encontrados em camadas superficiais da pele,

próximo à epiderme, como os discos de Merkel (responde melhor a pressão) e os Corpúsculos

de Meissner. Outros se localizam mais profundamente, na derme ou camada interna da pele,

como os receptores dos folículos pilosos (encontrado no tecido com pelo), os Corpúsculos de

Pacini, as terminações de Ruffini e os Corpúsculos de Meissner são encontrados apenas em

pele glaba (tecido sem pelo) (CRAIG, 2003).

Os termorreceptores respondem à temperatura das próprias terminações receptoras

e do tecido circulante, existindo dois tipos, de calor e de frio. Eles são terminações nervosas

livres, que contêm canais iônicos sensíveis à temperatura, denominados receptores de potencial

transitório (TRP), no entanto alguns desses canais também respondem a estímulos químicos e

estão envolvidos em transdução térmica, bem como na transdução de estimulos dolorosos (MA

et al., 2012).

Sete famílias de receptores TRP foram identificadas, com receptores da subfamília

TRPV (TRPV 1-4), ativados por calor, e os receptores das subfamílias TRPM (TRPM8) e

TRPA (TRPA1), ativados por frio. Os TRPV1 e TRPV2 são ativados a temperaturas superiores

a 42º C e são encontrados em nociceptores, no entanto o primeiro também é capaz de responder

a ácidos e a capsaicina, que é a substância química que confere sabor picante às pimentas. Os

TRPV3 e TRPV4 respondem a temperaturas na faixa de 27º C a 42º C e são encontrados em

receptores de calor. O receptor TRPM8 responde a temperaturas inferiores a 25º C e também

ao mentol e ao óleo de eucalipto, apresentando uma sensação de resfriamento. Os receptores

TRPA1 respondem a temperatura inferior a 17º C e também ao óleo de mostrada, ao alho e à

canela (JOSHI et al., 2010; GAVVA et al., 2008).

Os receptores de calor e frio são de adaptação rápida, nas quais, quando a

temperatura diminui, a frequência dos potenciais de ação dos axônios associados aos receptores

de frio aumenta abruptamente e, depois, gradualmente declina (à medida que o receptor se

adapta à alteração de temperatura) (JOSHI et al., 2010).

Muitos mediadores pró-inflamatórios interagem com seus receptores presentes em

nociceptores, causando tanto sensibilização, quanto ativação destes neurônios nociceptivos

(BESSON, 1999; MILLAN, 1999; JULIUS; BASBAUM, 2001; GRUNDY, 2002).

Mediadores químicos como o glutamato, serotonina, ATP, prótons, adenosina, dentre outros,

liberados frente a uma lesão tecidual, podem atuar diretamente em canais no interior da célula,

o que consequentemente deflagra o potencial de ação (JULIUS; BASBAUM, 2001; GRUNDY,

2002).

20

Entretanto, alguns mediadores inflamatórios como a bradicinina (BK), substância

P (SP) e as prostaglandinas (PGs), não atuam diretamente em canais iônicos, e sim em

receptores de sete domínios transmembranas acoplados a proteína G, podendo causar tanto

ativação, quanto sensibilização nos nociceptores (LEVITAN, 1994). Os principais mediadores

que participam da nocicepção inflamatória bem como algumas características que devem ser

ressaltadas sobre os mesmos estão relacionados na figura 1.

Figura 1. Principais nociceptores envolvidos na dor.

Fonte: OAKLANDER, 2011.

ATP = trifosfato de adenosina; fator de crecimento de nervo; NO = óxido nítrico; PRGC = peptídeo relacionado

ao gene da calcitonina.

21

Enquanto alguns desses receptores detectam estímulos do ambiente externo, outros

denominados receptores vicerais detectam estímulos originados no interior do corpo. Os

receptores viscerais transmitem informações ao SNC, por meio de uma clase de neurônios

aferentes conhecidos como aferentes viscerais (STANFIELD, 2013).

Os exemplos dos muitos tipos de receptores viscerais incluem quimiorreceptores

localizados nos principais vasos sanguíneos, monitorando os níveis de O2, CO2 e H+, além de

excitarem diretamente as terminações nervosas periféricas enquanto outros aumentam a

sensibilidade das terminações periféricas (agentes sensibilizadores). Os ligantes químicos

conhecidos que induzem respostas somatossensoriais estão associados, em sua maioria, a lesão

celular isquêmica ou inflamação. Esses ligantes químicos incluem prótons, íons potássio, ATP,

aminas, citocinas, fator de crescimento de nervos e bradicinina, assim como a ativação dos

nociceptores pode ser causada por um pH extracelular baixo, que produz influxo de cátions

despolarizantes através do TRPV1 e canais ionicos sensíveis ao ácido (ASICs) (GOLAN, 2014;

STANFIELD, 2013). (Figura 2)

Figura 2. Mecanismo de trasndução periférica

Fonte: GOLAN, 2014.

22

1.1.2 Transmissão

O impulso nervoso gerado pelo estímulo se propaga pela fibra nervosa ascendente

até a medula espinhal, desta para o córtex cerebral, onde serão comandadas e geradas as

respostas fisiológicas, emocionais e comportamentais (MUIR, 1998).

As fibras C e Aδ estão relacionadas à transdução e condução do estímulo nocivo;

enquanto as fibras C não são mielinizadas e de menor velocidade, as fibras Aδ são pouco

mielinizadas, possuindo maior velocidade de condução do impulso nervoso que as primeiras e

respondem a estímulos nocivos de origem térmica e mecânica. Já as fibras Aβ são mielinizadas

e de alto calibre, responsáveis por detectar estímulos inócuos aplicados na pele, músculos e

articulações, e em condições fisiológicas não são relacionadas à transmissão dolorosa

(COUTAUX et al., 2005; JULIUS; BASBAUM, 2001).

Na ausência de danos teciduais ou nervosos, as fibras Aβ somente transmitem

informação referente a estímulos inócuos, como tato, vibração e pressão. A ativação dos

nociceptores em resposta a estímulos nocivos leva à despolarização e geração de um potencial

de ação que se propaga ao longo de toda a fibra. Quando um dano inicial (lesão induzido por

inflamação) ativa os nociceptores locais, as fibras nervosas Aδ e C ficam sensibilizadas e

assumem limiares de ativação mais baixos. Estímulos nocivos que resultam em uma sensação

de dor rápida, fina e bem localizada em geral refletem a ativação de fibras Aδ (WOOLF;

SALTER, 2000), enquanto que as fibras C produzem uma segunda fase da dor mais difusa e

persistente e apresentam, na periferia, receptores de alto limiar para estímulos térmicos e/ou

mecânicos (KLAUMANN et al., 2008; PISERA, 2005; TRANQUILLI, 2004). (Figura 3)

Figura 3. Axônios aferentes primários

Fonte: SVENSSON, 2011 (adaptado).

23

A transmissão da dor ocorre principalmente através de duas vias: via da coluna

dorsal e do leminisco medial e trato espinotalâmico. Essas vias transmitem diferentes tipos de

informações sensoriais ao tálamo, e depois ao córtex somestésico primário. Em ambas as vias,

a informação adentra por um lado do corno posterior da medula espinhal e decursa para o lado

oposto antes de chegar no tálamo. Assim as informações somestésicas do lado direito do corpo

são percebidas no córtex somestésico do lado esquerdo (STANFIELD, 2013).

No entanto, antes de caracterizar cada via, é necessário elucidar de forma geral a

transmissão de informações sensoriais. O neurônio aferente, que transmite informações da

periferia para o SNC, como os nociceptores, é denominado neurônio de primeira ordem. Um

único neurônio de primeira ordem pode se ramificar no SNC e comunicar-se com vários

interneurônios. Além disso, também podem receber aferências convergentes de vários

neurônios de primeira ordem, que podem transmitir informações ao tálamo, o principal núcleo

de retransmissão de informações sensitivas; tais interneurônios são exemplos de neurônios de

segunda ordem. No tálamo, esses neurônios de segunda ordem estabelecem sinapses com

neurônios de terceira ordem, que transmitem informações ao córtex cerebral, onde ocorre a

percepção sensorial (PISERA, 2005).

Todos os neurônios nociceptivos de primeira ordem convergem e efetuam sinapses

excitatórias com neurônios de transmissão de segunda ordem e que estão situados no corno

dorsal da medula espinhal e no corno dorsal trigeminal bulbar. No interior da substância

cinzenta do corno dorsal da medula espinhal, a projeção aferente do neurônio primário faz

sinapse com os neurônios secundários (BESSON; CHAOUCH, 1987; DUBNER; BENNETT,

1983) (Figura 4)

24

Figura 4. Vias dos sistemas sensoriais


A substância cinzenta da medula espinhal foi dividida por Rexed em dez lâminas

ou camadas: as lâminas I a VI compõe o corno dorsal da medula espinhal (CDME). Os corpos

celulares dos neurônios secundários estão localizados na lâmina I (zona marginal), II

(substância gelatinosa) e V (camada profunda) (REXED, 1952; WILLIS; WESTLUND, 1997).

A substância gelatinosa (lâmina II) apresenta uma quantidade elevada de

interneurônios inibitórios e excitatórios que possuem funções moduladoras na transmissão da

informação nociceptiva (TRANQUILLI, 2004; DREWES, 2006; KLAUMANN et al., 2008).

Tanto a lâmina I quanto a II são ricamente inervadas por fibras Aδ e C. As lâminas III e IV

possuem neurônios que se conectam diretamente com as fibras Aβ e que respondem

predominantemente a estímulos inócuos, enquanto que os neurônios da lâmina VI estão

conectados de forma monossináptica com aferentes Aβ de músculos e articulações e

respondem aos mesmos estímulos das lâminas III e IV. Outras lâminas, VII, VIII e IX estão

situadas no corno ventral da medula espinhal e abrigam neurônios com funções motoras,

enquanto que a lâmina X, situada ao redor do canal central, possui neurônios envolvidos na

transmissão nociceptiva. (PISERA, 2005; KLAUMANN et al., 2008). (Figura 5)

25

Figura 5. Secção transversal da medula espinal mostrando as lâminas de Rexed

Fonte: KANDEL et al., 2003.

Essa informação se propaga pelos neurônios de segunda ordem, que podem ser

classificados em: neurônio nociceptivo específico (NS), que se encontra em elevada proporção

na lâmina I e responde apenas a impulsos provenientes de estimulação nociva somática e

visceral de alta intensidade - fibras Aδ e C; e/ou de neurônio de ampla faixa dinâmica (WDR),

que são encontrados principalmente na lâmina V. Eles se projetam no tronco encefálico e em

certas regiões do tálamo, podendo efetuar sinapses com os aferentes primários

mecanorreceptivos de baixo limiar (fibras do tipo Aβ, relacionadas com o tato) (MILLAN,

2002).

As informações sobre o dano tecidual são conduzidas por vias ascendentes ântero-

laterais de transmissão e que tem origem nos axônios dos neurônios de segunda ordem das

lâminas I e V principalmente, e ascendem pelo funículo ântero-lateral para estruturas supra-

espinhais. Este complexo sistema de vias diretas e indiretas conduz a transmissão das

informações nociceptivas para neurônios que se projetam através de várias vias ascendentes,

como: (LAMONT; TRANQUILLI; GRIMM, 2000; DREWES, 2006; KLAUMANN et al.,

2008).

- Via da coluna dorsal e do leminisco medial: transmite ao tálamo informações

provenientes de mecanorreceptores e proprioceptores. Nessa via, os neurônios de primeira

26

ordem se originam na periferia e adentram o corno dorsal da medula espinhal. Os colaterais do

axônio principal podem terminar na medula espinhal, comunicando-se com interneurônios

como aqueles envolvidos nos reflexos espinhais. Contudo, o ramo principal do axônio ascende

da medula espinhal para o tronco encefálico ipsilateral (do mesmo lado do estímulo) nas

colunas dorsais. Os neurônios de primeira ordem terminam nos núcleos da coluna dorsal da

medula oblonga, onde estabelecem sinapses com neurônios de segunda ordem. Então, os

neurônios de segunda ordem cruzam para o lado contralateral da medula oblonga, em um trato

denominado leminisco medial e, finalmente ascendem para o tálamo. No tálamo os neurónios

de segunda ordem estabelecem sinapse com neurônios de terceira ordem, que transmitem

informações do tálamo ao córtex somestésico (BRUSCATTO, 2006).

- Trato espinotalâmico: este trato transmite informações de termorreceptores e

nociceptores. Ele cruza para o outro lado do SNC no interior da medula espinal antes de atingir

o encéfalo. Composto por neurônios nociceptivos específicos e axônios de neurônios WDR,

tendo origem nos neurônios de segunda ordem das lâminas I e V que decussam dentro da

medula espinhal e ascendem pelo funículo ântero-lateral para terminar em um núcleo do

tálamo, isolado das terminações das projeções da coluna dorsal. Atualmente é dividido em

Trato Paleoespinotalâmico (medial), que transmitem a informação em baixa velocidade (dor

lenta), multissináptica para estruturas bulbares e mesencefálicas antes de alcançar estrutura do

complexo intralaminar e proterior medial do tálamo, daí projeta-se para o córtex e insula, e

Trato neoespinotalâmico (lateral), que conduz a informação nociceptiva em alta velocidade

(dor rápida) monossináptica para núcleos do complexo lateral do tálamo, envolvendo o

componente sensório-discriminativo da dor (Figura 6); (MUIR III et al., 2001)

- Trato espinorreticular: Compreende axônios de neurônios das lâminas VII e VIII

que terminam na formação reticular (bulbar e pontina), para logo ascender até o tálamo;

- Trato espinomesencefálico: É formado por axônios de neurônios de projeção das

lâminas I e IV que se projetam contralateralmente até a formação reticular mesencefálica e a

substância cinzenta periaquedutal até os núcleos parabraquiais da formação reticular. Os

neurônios parabraquiais projetam-se até a amigdala, um dos principais componentes do sistema

límbico, o que sugere que o trato espinomesencefálico contribui com os componentes afetivos

da dor;

- Trato espino-hipotalâmico: Compreende axônios principalmente provenientes

das lâminas I e V, que se projetam diretamente para núcleos do hipotálamo. Essas conexões

participam nas respostas neuroendócrinas e autonômicas induzidas pela dor (LAMONT;

TRANQUILLI; GRIMM, 2000; PISERA, 2005). (Figura 6)

27

Figura 6. Principais vias ascendentes antero-laterais de transmissão da dor.


Existem outras vias de transmissão da dor que trafegam contralateralmente pelo

funículo dorsolateral da medula espinhal. São elas, trato espinoparabranquio-amigdalóide e

trato espinoparabranquio-hipotalâmico. Ambos se originam nos neurônios nociceptivos

específicos da lâmina I, cujos axônios cruzam para o lado contralateral e ascendem pelo

funículo dorsolateral. Eles estão envolvidos nas respostas relativas ao componente afetivo-

motivacional da dor e na elaboração das respostas autonômicas e endócrinas que acompanham

o processo doloroso

1.1.3 Modulação da dor

Além de sistemas responsáveis pela transmissão e reconhecimento da dor

encontrados nas vias ascendentes, os organismos também são dotados de sistemas responsáveis

28

por sua modulação, no qual a facilitação ou a atenuação de sinais pode resultar em alterações

na percepção final daquelas informações (STANFIELD, 2013).

Em 1965, um mecanismo modulatório foi objetivamente proposto conhecido como

teoria do controle do portão (ou Teoria da Comporta). Tal teoria declara que os sinais somáticos

de fontes não dolorosas podem inibir sinais de dor no nível espinal. (Figura 7). Sugeriram a

existência de uma espécie de comporta no corno dorsal, que, quando aberta, permitiria a

transmissão dos impulsos dolorosos e, quando fechada, bloquearia a passagem dos mesmos

(RIEDEL; NEECK, 2001; STANFIELD, 2013).

Figura 7. Teoria do controle do portão (Teoria da Comporta) da dor


Desta forma, quando as informações de um estímulo doloroso estão sendo

transmitidas até a medula por fibras C, as fibras nervosas colaterais inibem a atividade de

interneurônios inibitórios localizados na lâmina II (gelatinosa), o que permite que a transmissão

prossiga para o neurônio de segunda ordem (PORRECA et al., 2002).

No entanto, se um estímulo mecânico não doloroso for aplicado simultaneamente

a um estímulo doloroso, as fibras nervosas colaterais mielinizadas de grande diâmetro (Aα e

29

Aβ), que são responsáveis por conduzir informações referentes a tato, pressão, propriocepção

e sensibilidade vibratória, são capazes de estimular o interneurônio inibitório, diminuindo,

assim, a transmissão dos sinais de dor (RANG; URBAN, 1995).

Assim, os interneurônios inibitórios localizados na substância gelatinosa atuam

como um portão, modulando a informação nociceptiva. Como consequência dessa proposta,

uma nova avenida para o tratamento das síndromes dolorosas foi aberta, como: a estimulação

elétrica de nervos periféricos (WALL; SWEET, 1967), do funículo posterior da medula

espinhal e do núcleo ventrocaudal (VC) do tálamo (IASP, 2010).

Além da Teoria das Comportas, existem outras formas importantes de modulação

da resposta nociceptivas, que são através de vias descendentes que fazem parte dos sistemas

endógenos de analgesia que bloqueiam a dor, no qual suas estruturas podem ser encontradas

no tronco encefálico. (Figura 8)

Figura 8. Sistemas endógenos de analgesia


30

Situações de estresse podem ativar uma área de mesencéfalo, denominada

substância cinzenta periaquedutal (SCP), e essa área se comunica com áreas da medula

oblonga, como o bulbo rostroventromedial (RVM), que inclui o núcleo magno da rafe (NMR)

e locus coeruleus (LC). Neurônios dessas áreas descem para medula espinhal, e quando

ativadas, enviam impulsos descendentes que bloqueiam a comunicação entre neurônios

nociceptivos aferentes e neurônios de segunda ordem encontrados no corno dorsal da medula

espinhal.

Assim, a SCP quando ativada, produz seu efeito por meio de projeções excitatórias

para o RVM ou o LC. Os axônios dos neurônios RVM têm projeção descendente, via funículo

dorsolateral, e terminam formando sinapses inibitórias com neurônios nociceptivos de segunda

ordem no corno dorsal da medula espinhal, causando uma inibição da informação nociceptiva

(MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).

O sitema opióide pode modular o sistema glutamatérgico através dos receptores μ

e δ, que podem inibir ou potencializar eventos mediados pelos receptores NMDA (N-Metil-D-

Aspartato), encontrados em todo o SNC, enquanto o receptor κ antagoniza a atividade mediada

por tais receptores (SIEBEL et al., 2004).

Além disso, a substâcia P, um neurotransmissor liberado por vias aferentes

nociceptivas, se comunica com neurônios de segunda ordem, que são capazes de sofrer ação

de interneurônios inibitórios da medula espinhal, e também com o terminal axônico do

neurônio aferente nociceptivo. Estes interneurônios inibitórios liberam neurotransmissores

opiáceos que induzem potenciais inibitórios póssinápticos.

A encefalina também se liga a receptores opiodes presentes nos terminais axônicos

do neurônio aferente nociceptivo, o que inibe a liberação de substância P, causando inibição

présináptica. Essas duas ações suprimem a transmissão de sinais do neurônio aferente para o

neurônio de segunda ordem, diminuindo, assim, a transmissão de sinais de dor ao encéfalo.

Esses interneurônios inibitórios são ativados por neurônios descendentes do núcleo mágno da

rafe e da formação reticular lateral.

1.2 Plantas Medicinais

As plantas medicinais constituem uma fonte renovável de onde podem ser obtidos

novos e eficazes medicamentos. A indicação de plantas medicinais aumenta a opção

31

terapêutica, ofertando medicamentos equivalentes, e talvez com indicações terapêuticas

complementares as medicações existentes sem substituir os medicamentos já comercializados

e registrados (SIMÕES et al, 1999; MAIOLI-AZEVEDO; FONSECA-KRUEL, 2007). As duas

principais vias de identificação de produtos naturais são (i) o conhecimento das práticas

tradicionais (ou etnofarmacologia), e (ii) a triagem aleatória de plantas, sendo a primeira mais

vantajosa por permitir o planejamento da pesquisa de novos fármacos a partir do conhecimento

empírico já existente (YUNES; CALIXTO, 2001).

A literatura mostra que medicamentos provenientes de substâncias naturais são

capazes de tratar cerca de 80% das enfermidades humanas, possuindo efeitos antibacterianos,

anticoagulantes, antiparasitárias, imunossupressores dentre outras (NEWMAN et al., 2003).

Isso torna-se possível graças a presença dos metabólitos secundários, que possuem diversas

funções nos vegetais, como defesa contra predadores, proteção contra raios ultravioleta, atração

de polinizadores, entre outros (PERES, 2003; SAKLANI; KUTTI, 2008). Essas substâncias

produzidas possuem estruturas com a facilidade de ligar-se a enzimas e receptores em outros

organismos e interferir direta ou indiretamente com mecanismos inflamatórios, sendo capaz de

gerar efeitos farmacológicos (LI; VEDERAS, 2009).

Desta forma, tem-se evidenciado um crescente aumento no estudo de plantas

preconizadas pela medicina popular para validar a sua utilização como fitoterápico seguro e

eficaz. O emprego de técnicas modernas de farmacologia, biologia molecular, modelagem

molecular, química farmacêutica e toxicologia renovaram o interesse na procura de novos

medicamentos ou de protótipos de novos fármacos a partir de produtos naturais (CALIXTO et

al, 2000). Dentre as técnicas utilizadas, destaca-se o método de Lipinski (ou regra dos cinco)

que pontua as principais propriedades físicos-quimicas e estruturais para um fármaco, avaliando

a probabilidade de uma substância ser um bom candidato a fármaco por via oral; onde o autor

correlaciona a baixa atividade farmacológica e a baixa absorção quando: (i) há mais de 5 centros

doadores de ligação de hidrogênio; (ii) há mais de 10 aceptores de hidrogênio, (iii) o peso

molecular é maior que 500 unidades e o (iv) o Log de P é maior que 5 (LIPINSKI et al., 2001).

1.2.1 Família Lauraceae e a espécie Aniba riparia

A família Lauraceae encontra-se amplamente distribuída nas regiões tropicais e

subtropicais do planeta e possui cerca de 3000 espécies, muitas de alto rendimento, produtoras

de óleos essenciais e também presentes na medicina tradicional e na culinária (ALCÂNTARA

et al., 2010; BROTTO et al., 2009) (Tabela 2). Os primeiros registros de sua utilização datam

32

de 2800 a.C. na Grécia antiga, fato que influenciou os nomes de muitos dos gêneros existentes

(LORENZI et al., 2008). É uma família rica em metabólitos secundários pertencentes às classes

das lignanas e neolignanas, alcaloides aporfínicos e benzilisoquínolínicos, flavonoides,

sesquiterpenos, alcamidas e pironas (KANG et al., 2009; NUNES et al., 2013).

Tabela 2. Usos das principais espécies da família Lauraceae

USO ESPÉCIES

Culinária

Persea americana Mill., P. gratissima L., Laurus nobilis L.,

Cinnamomum zeylanicum Breyne e C. cassia (Nees) Nees & Ebert ex

Blume.

Indústria

Química

Cinnamomum camphora (L.) Presl., Lindera benzoin (L.) Blume,

Licaria guianensis Aubl., A. parviflora, A. rosaeodora Ducke, A.

canellita (H.B.K) Mez, Sassafras albidum Nutt., Ocotea pretiosa

(Nees) Benthan & Hooke e O. costulata Mez.

Medicina

Popular

Sassafras albidum Nutt., Ocotea aciphylla, O. spectabilis, O. pulchella

Mart., O. teleiandra (Meissn.) Mez, O. indecora Schott., O.

guianensis, O. barcellensis Mez, O. pretiosa, O. cymbarum, Licaria

puchury-major Kosterm., Aniba riparia (Nees) Mez, A. canellita, A.

hastmanniana (Nees) Mez, A. rosaeodora, Laurus nobilis, Persea

americana, P. gratissima, P. cordata (Vell.) Mez, Cinnamomum

zeylanicum, C. cassia, Cryptocaria moschata Nees et Mart.,

Nectandra pichurim (H.B.K) Mez e N. rodiaei Schomb.

Fonte: AMAZONAS, 2012 (adaptado).

Das espécies que possuem efeito medicinal, uma que se destaca são as do gênero

Aniba, onde diversos efeitos farmacológicos têm sido encontrados na literatura, como: efeito

antiespasmódico da A. canelila (MAIA et al., 2003), efeitos cardiovasculares do óleo essencial

da A. canelilla (LAHLOU et al., 2005), atividade larvicida da A. duckei (SOUZA et al., 2007),

antifúngica e sedativa da A. roseodora (ALMEIDA et al., 2009; SIMIC et al., 2004).

A espécie Aniba riparia (Ness) Mez (que possui como sinônimo Aydendron

riparium Nees) é popularmente conhecida como louro e possui distribuição em diversos países

33

como Brasil (Região Amazônica), Colômbia, Peru, Equador, Bolívia e Venezuela. Seus frutos

contêm diversos constituintes químicos, como por exemplo, flavonóides, neolignanas,

stirilpironas e alcamidas (BARBOSA-FILHO et al., 1987). Esta última classe de substância tem

sido fonte de interesse de pesquisadores na busca de novas fontes vegetais com princípios

farmacologicamente ativos (CASTELO-BRANCO, 2000) (Figura 9).

Figura 9. Aniba riparia (Nees) Mez.

Fonte: http://fm2.fieldmuseum.org/vrrc/max/LAUR-anib-ripa-ecu-2188224.jpg (aceso em 06/16)

As alcamidas são metabólitos secundários que representam uma classe distinta de

produtos naturais e são constituídas pela união de um ácido graxo (de 8-18 carbonos) unido a

uma amina proveniente de algum aminoácido por descarboxilação no momento da

condensação. Em algumas espécies estão relacionados com a proteção contra o ataque de

patógenos (RAMIREZ-CHAVEZ et al., 2004; KANG et al., 2009).

34

Do fruto verde não maduro da Aniba riparia foram isoladas três alcamidas,

popularmente chamadas de riparinas I, II e III (CASTELO-BRANCO, 1992) que apresentam

diversas atividades biológicas, mostradas na tabela a seguir:

Tabela 3. Atividades biológicas das alcamidas isoladas da Aniba riparia

ALCAMIDA ATIVIDADE BIOLÓGICA

Riparina I

(O-metil-N-benzoil

tiramina)

Anticonvulsivante (MONTEIRO et al., 2005), Antimicrobiana

(MARQUES, 2001), Miorrelaxante (MARQUES et al., 2005),

Hipotensor (SEIXAS, 1996), Antidepressiva, Ansiolítica

(SOUSA et al., 2005), Antinociceptivo (ARAUJO et al., 2009)

Riparina II

(O-metil-N-2 hidroxi

benzoil tiramina)

Anticonvulsivante (LEITE et al., 2006), Antimicrobiana

(MARQUES, 2001), Relaxante de traqueia de cobaia

(CASTELO BRANCO et al., 2000), Hipotensor (SEIXAS,

1996), Antidepressivo (TEIXEIRA et al., 2013), Ansiolítico

(SOUSA et al., 2007), Anti-inflamatório (CARVALHO et al.,

2013)

Riparina III

(O-metil-N-2,6-

dihidroxi benzoil

tiramina)

Anticonvulsivante (MONTEIRO et al., 2005), Espasmódico

(THOMAS et al., 1994); Miorrelaxante (MARQUES et al.,

2005), Antimicrobiana (MARQUES, 2001), Hipotensor

(SEIXAS, 1996), Antinociceptivo e anti-inflamatório

(VASCONCELOS, 2015), Antidepressivo (SOUSA et al., 2004;

MELO et al., 2013; VASCONCELOS et al., 2015), Ansiolítico

(MELO et al., 2006; SOUSA et al., 2004)

35

1.3 Modelagem Molecular

A compreensão dos mecanismos fisiológicos de diversos processos no nosso corpo

só é possível com o entendimento da interação entre macromoléculas ou entre uma

macromolécula e um ligante que pode funcionar como agonista/antagonista ou

substrato/inibidor. Para isso, surge a modelagem molecular com o desenho racional de

fármacos, cujo o objetivo é direcionar as pesquisas para o desenvolvimento de moléculas com

maior potencial ou para prever uma possível interação entre uma molécula e um receptor

(MOBLEY; DILL, 2009; KITCHEN et al., 2004).

Inicialmente, deve-se criar a estrutura tridimensional do ligante e também da

macromolécula de interesse (receptor). A criação dessa macromolécula pode ser realizada

através de métodos experimentais como: ressonância nuclear magnética, raios X ou

cristalografia. Quando essa criação não for possível, pode-se realizar a modelagem por

homologia como uma ferramenta alternativa para as predições (RANGWALA; KARYPIS,

2011)

A modelagem por homologia é baseada na possibilidade de se determinar a

estrutura de uma proteína por meio de sua sequência de aminoácidos. Inicia-se pela busca em

banco de dados como o Protein Data Bank (PDB) por proteínas da mesma família que tenham

estruturas tridimensionais e coordenadas disponíveis. Um dos programas mais utilizados para

realizar a busca por alinhamentos é o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), pois ele

compara uma sequência desconhecida com aquelas depositadas em banco de dados, de maneira

rápida e confiável. Após este processo, realiza-se o alinhamento da sequência alvo com uma ou

mais sequências moldes a fim de verificar a correspondência entre os aminoácidos e a partir daí

gera-se a estrutura tridimensional inicial da macromolécula (MARTI REMON et al., 2009;

MOUNT, 2004).

Após a criação do modelo, é necessário realizar uma análise de qualidade. Tal

análise é realizada através da determinação de diversos fatores, como: comprimentos das

ligações, planaridade das ligações peptídicas, ângulos de torções, quiralidade e energia.

Programas como MolProbity e Procheck realizam estas análises e geram um gráfico de

Ramachandran, que identifica os resíduos que se encontram fora das regiões energeticamente

favoráveis, possibilitando uma melhora do modelo final. Caso após a análise da qualidade, o

resultado não tenha sido satisfatório, deve-se realizar algumas estratégias de refinamento para

a obtenção de um modelo mais próximo da realidade biológica (ALTMAN; DUGAN, 2005;

LIPINSKI et al., 2012)

36

Logo o modelo tendo sido criado e validado, garantindo a sua confiabilidade, deve-

se realizar a técnica de atracamento molecular (Docking Molecular) para prever o modo e

afinidade de ligação entre o ligante e um receptor (SCHWARZ; KAVRAKI, 2001).

A visão mais recente do atracamento proteína-ligante, descreve uma proteína como

um conjunto de estados conformacionais, com estruturas similares e energeticamente

equivalentes. O ligante ao interagir (através de ligações de hidrogênio, interações de van der

Waals, interações iônicas, hidrofóbicas e/ou interações envolvendo anéis aromáticos e íons

metálicos), seleciona uma conformação qualquer e desloca o equilíbrio para que essa

conformação tenha sua proporção aumentada na população total (GUEDES et al., 2013)

Atualmente existem diversos programas de atracamento molecular, que auxiliam

na identificação de sítios ativos e regiões farmacofóricas, diferenciado-se pelo método de

busca e pela função de afinidade empregada. Podemos destacar, os programas AutoDock,

AutoDock Vina e Dockthor (TALELE et al., 2010)

37

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

Em geral, a média da população brasileira que se queixa ou sofre de dor, é de cerca

de 30%, no entando não há estudos epidemiológicos que englobem todas as regiões do país

sobre a dor (SBED, 2015). O tratamento convencional para o controle da dor apresenta baixa

eficácia e muitos efeitos colaterais, o que acaba afetando negativamente a qualidade de vida

dos pacientes, resultando na interrupção do tratamento (ATTAL et al., 2010).

Dessa forma, novas substâncias que possam agir em novos alvos moleculares

relacionados ao processo nociceptivo, como a transdução, é extremamente importante para a

descoberta de tratamentos eficazes para os pacientes com dor.

Em estudos prévios realizados por nosso grupo de pesquisa, a atividade

antinociceptiva e anti-inflamatória das riparinas I, II e III foi testada. A Riparina I demonstrou

esta atividade em modelos químicos e térmicos de nocicepção em camundongos, sendo

sugeridos mecanismos de ação periféricos e centrais do composto (ARAÚJO et al., 2009). A

Riparina II apresentou uma atividade anti-inflamatória em modelos químicos da inflamação

aguda (CARVALHO et al., 2013). Já a Riparina III apresentou uma atividade antinociceptiva

periférica, interagindo com os receptores TRP e os sistemas serotonérgico, opióide e colinérgico

(VASCONCELOS, 2015).

Considerando os estudos anteriores do nosso grupo, aliado a uma semelhança

estrutural entre as riparinas, decidiu-se no presente trabalho investigar o efeito antinociceptivo

da riparina II dando enfoque aos mecanismos farmacológicos envolvidos nessa ação.

38

3 OBJETIVO

3.1 Geral

Caracterizar os efeitos da Riparina II em modelos de nocicepção e

consequentemente identificando os mecanismos farmacológicos envolvidos nessa ação.

3.2 Específicos

Avaliar a toxicidade pré-clínica aguda e subcrônica em camundongos da Riparina II

Realizar a modelagam molecular para os receptores TRPV1, TRPA1 e bradicinina

Determinar as doses efetivas e a duração do efeito antinociceptivo da Riparina II nos

testes de curva de dose e duração do efeito (“Time course”), respectivamente;

Estudar o efeito antinociceptivo da Riparina II nos modelos animais de hipernocicepção

mecânica induzido por carragenina, prostaglandina E2 ou epinefrina;

Analisar o grau da lesão induzida por carragenina na pata traseira de animais, bem como

o potencial antioxidante da Riparina II

Pesquisar o envolvimento de receptores de potencial transitório (TRP), receptor ASICs

e bradicinina no efeito antinociceptivo da riparina II no modelo de nocicepção induzida

pela injeção intraplantar de cinamaldeído (TRPA1), mentol (TRPM8), salina ácida

(ASICs) e bradicinina;

Avaliar o papel da proteína quinase C e A no efeito antinociceptivo da Riparina II;

Investigar o possível envolvimento dos canais de potássio dependentes de ATP no

mecanismo de ação antinociceptivo da Riparina II através do modelo de contorções

abdominais induzidas por suloção de ácido acético;

Investigar o envolvimento dos sistemas de neurotransmissores no efeito antinociceptivo

da Riparina II

39

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Material Botânico

A planta Aniba riparia (Nees) Mez foi identificada pelo botânico Klaus Kubitzki

da Universidade de Hamburgo/Alemanha. O fruto verde de Aniba riparia (material botânico)

foi coletado na região de Humaitá, estado do Amazonas, Brasil (BARBOSA FILHO et al.,

1987). O material foi cedido ao Prof. Dr. José Maria Barbosa-Filho do grupo de pesquisa do

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba, e a extração e

isolamento foram feitos pelo Prof. Dr. Stanley Juan Chávez Gutierrez da Universidade Federal

do Piauí, conforme descrito abaixo.

A riparina II foi isolada da Aniba riparia, purificada por cromatografia em camada

delgada preparativa e a sua estrutura foi confirmada por RMN e a pureza foi determinada por

cromatografia em camada delgada analítica e cromatografia liquida de alta eficiência,

determinado um grau de pureza de 99%.

4.2 Drogas e substâncias utilizadas

Tabela 4. Substâncias usadas no estudo.

Substância Origem Doses Via

Ácido acético Sigma-Aldrich® 0,6 % i.p.

8-Br-AMPc Sigma-Aldrich® 10nmol i.pl.

Atropina Sigma-Aldrich® 1 mg/kg i.p.

Bradicinina Sigma-Aldrich® 10 µg/pata i.pl.

Cânfora Sigma-Aldrich® 7,6 s.c.

Capsazepina Sigma-Aldrich® 5 mg/kg i.p.

Captopril Teuto® 5 mg/kg i.p.

Carboximetilcelulose Vetec® 0,5 % (veículo) v.o.

Cinamaldeído Sigma-Aldrich® 10 nmol/pata i.pl.

Diazóxido Sigma-Aldrich® 3 mg/kg i.p.

Formaldeído Vetec® 10% -

40

Substância Origem Doses Via

Epinefrina Sigma-Aldrich® 100ng/pata i.pl.

Glibenclamida Sigma-Aldrich® 2 mg/kg i.p.

Haloperidol Sigma-Aldrich® 0.2 mg/kg i.p.

Indometacina Sigma-Aldrich® 5 mg/kg v.o.

Ioimbina Sigma-Aldrich® 2,5 i.p.

Mentol Sigma-Aldrich® 1,2 μmol/pata i.pl.

Morfina Cristália® 7,5 e 5 i.p.

Naloxona Cristália® 1 mg/kg i.p.

NAN-190 Sigma-Aldrich® 0.5 mg/kg i.p.

Ondasentrona GlaxoSmithKline® 0,5 mg/kg i.p.

Ritanserina Sigma-Aldrich® 2 mg/kg i.p.

PMA Sigma-Aldrich® 500 pmol/pata i.pl.

Tween 80 Sigma-Aldrich® 3 % (Veículo) v.o.

Vermelho de Rutênio Sigma-Aldrich® 3 mg/kg i.p.

PGE2 Sigma-Aldrich® 3nmol/pata i.pl.

4.3 Animais

Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) variedade Swiss, machos

adultos, pesando entre 22-30 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do

Ceará, mantidos em caixas de propileno a 26 ± 2ºC, com ciclos claro/escuro de 12/12 horas,

recebendo ração padrão e água “ad libitum”. Os animais foram colocados em jejum de sólidos

por 3 horas antes da realização de cada experimento em que a via oral foi utilizada para a

absorção do fármaco.

4.4 Princípios éticos

Os experimentos foram realizados após a aprovação do projeto (Nº de protocolo:

41/2015) (Anexo 1) pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade

Federal do Ceará e foram realizadas em conformidade com as diretrizes atuais para o cuidado

41

de animais de laboratório e as normas éticas para investigações de dor experimental em animais

conscientes (ZIMMERMANN, 1983).

4.5 Estimativa da DL50 da Riparina II através da OECD 425 (Acute Oral Toxicity-Up-

And-Down)

A dose via oral inicial de RipII foi de 175 mg/Kg e a progressão ou regressão das

doses se dava de acordo com a sobrevivência ou não do animal, respeitando um intervalo de 48

horas entre as administrações de acordo com as recomendações da Organização para

Cooperação Econômica e Desenvolvimento (OECD 425) (OECD, 2001).

O peso do animal foi medido antes, no 7º e no 14º dia da administração. Cada animal

era observado por 14 dias quanto ao possível aparecimento de sinais de toxicidade (mudanças

na pele, pelo, olhos, mucosas e respiração, tremores, convulsão, salivação, diarreia, letargia e

coma) e sacrificados por deslocamento cervical após esse período. Órgãos como coração, rins,

cérebro, fígado e estômago foram retirados através de técnicas cirúrgicas adequadas para

análise macroscópica.

Figura 10. Esquema do teste de toxicidade aguda segundo OECD 425

42

4.6 Avaliação da toxicidade oral de doses repetidas por 28 dias

Para a avaliação da toxicidade subcrônica foram utilizados 20 camundongos Swiss

(20-30g), distribuídos em 2 grupos de 10 animais cada: controle (tratado com veículo) e RipII.

Os grupos receberam diariamente durante 28 dias por via oral, veículo e RipII (500 mg/kg;

v.o.).

Os pesos dos animais foram medidos semanalmente bem como observados quanto

ao aparecimento de sinais tóxicos e letais.

Ao final dos 28 dias de tratamento, os animais foram submetidos a uma coleta de

sangue pelo plexo orbital. Em seguida, foram sacrificados e alguns órgãos retirados (cérebro,

rim, coração e fígado) e fixados em formol a 10% para a realização da análise histológica.

Com a amostra de sangue retirada foram avaliados parâmetros hematológicos

como: número de eritrócitos, hemoglobina, hematócrito, volume corpuscular médio (VCM),

hemoglobina corpuscular médio (HCM), concentração de hemoglobina corpuscular média

(CHCM), número de plaquetas, número de leucócitos e número de linfócitos. Também foi

determinado alguns parâmetros bioquímicos como ureia, creatinina, aspartato aminotransferase

(AST) e alanina aminotransferase (ALT).

Figura 11. Esquema do teste de toxicidade subcrônica no tratamento de doses repetidas

por 28 dias

43

4.6.1 Procedimentos analíticos

Todas as análises hematológicas e bioquímicas foram realizadas no laboratório de

Análises Clínicas e Toxicológicas do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da

Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem da UFC, com a colaboração da Profa. Dra.

Maria Goretti Rodrigues de Queiroz.

4.6.1.1 Análise dos parâmetros hematológicos

Para a determinação dos parâmetros hematológicos número de eritrócitos,

hemoglobina, hematócrito, volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média

(HCM), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), número de plaquetas,

número de leucócitos e número de linfócitos utilizou-se sangue total coletado em tubos

contendo EDTA como anticoagulante.

Os valores absolutos das variáveis acima mencionadas foram obtidos através do

aparelho semi-automático Symex KX-21N Roche®, cuja metodologia baseia-se no princípio

da impedância e espectrofotometria. Previamente a inserção da amostra no analisador, o sangue

era cuidadosamente homogeneizado.

4.6.1.2 Análise dos parâmetros bioquímicos

Para a determinação da ureia, creatinina, AST e ALT, a coleta de sangue foi

realizada em tubos contendo heparina sódica. Após meia hora da coleta, as amostras foram

centrifugadas a 3500 rpm durante 15 minutos e o plasma retirado. As quantificações foram

realizadas através de kit´s colorimétricos da Labtest® e Bioclin®.

4.7 Modelagem Molecular

Para verificar a interação com alguns receptores envolvidos na dor, foram

utilizadas ferramentas de bioinformática disponíveis online gratuitamente. O ligante (RipII) foi

obtida através do programa Avogrado.

Para obtenção do modelo confiável dos receptores TRPV1 e TRPA1, foram

selecionados modelos encontrados no PDB (Protein Data Bank) com os códigos de ID: 2PNN

(pertencente à espécie Rattus norvegicus) e ID: 1N11 (pertencente a família Homo

44

sapiens) respectivamente, porém ambos escolhidos por fatores de similaridade com a espécie

Mus Musculus, empregando o servidor Run Blast.

O receptor de bradicinina pertencente à espécie Mus Musculus não possuía estrutura

cristalografada no banco de dados, então foi necessário realizar a criação do mesmo através de

homologia. Para isso, foi utilizado o molde da proteína PDB (ID: 4YAY- Receptor de

Angiotensina), e a modelagem espacial foi realizada empregando o software Robetta Server,

que é utilizado como um método de previsão da estrutura tridimensional da proteína e

proporciona uma orientação automatizada, além de fornecer dados para uma previsão da função

da proteína.

Em seguida, a estrutura foi otimizada com auxílio do software WinCoot versão

0.8.1 e, validada pelo servidor online do MolProbity usando o gráfico de Ramachandran e o

ProSA.

A análise da interação molecular (Docking Molecular) ocorreu através da utilização

da estrutura da RipII com os receptores, com auxílio do software Autodock Tool. A técnica

permite obter diferentes conformações espaciais do ligante, possibilitando identificar qual

dentre estas é a mais provável na interação ligante alvo.

4.8 Avaliação da Atividade antinociceptiva

4.8.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Grupos de 8 animais foram tratados com veículo (3% Tween 80 em água destilada),

RipII (3,125; 6,25; 12,5; 25, 50, 100 ou 200 mg/kg) ou Indometacina (5 mg/kg- usada como

droga de referência). Após 60 minutos do tratamento, os animais receberam uma injeção

intraperitonial (i.p.) de ácido acético 0,6% e foram colocados individualmente em funis de

vidro. Após 10 minutos da administração do ácido acético, o número de contorções abdominais

foi registrado durante 20 minutos. Uma contorção consiste na contração da musculatura

abdominal, juntamente com a extensão das patas traseiras. (KOSTER et al., 1959).

Em outra série de experimentos, foi avaliado a duração do efeito antinociceptivo da

RipII. Os animais receberam RipII-50 mg/kg (v.o.) e após 30, 60, 120, 240 e 360 minutos após

a administração, receberam ácido acético e o número de contorções foi avaliado conforme

descrito anteriormente.

45

A curva dose x resposta também foi realizada e a DE50 da RipII foi estimada com

os dados acima.

4.8.2 Hipernocicepção inflamatória induzida por carragenina

O uso de filamentos de Von Frey é bastante utilizado para avaliar através de

estímulo mecânico crescente (alodínia ou hiperalgesia) a sensibilidade tecidual da pata traseira

do animal (CUNHA et al., 2004).

Os animais foram divididos em grupos de 8 animais cada e pré-tratados com veículo

(3% Tween 80 em água destilada), RipII (25 ou 50 mg/kg) ou indometacina (5 mg/kg, v.o.).

Todos os animais receberam 20 µL de carragenina na pata e testados nos tempos 0, 30, 60 e

180 minutos. Os animais foram submetidos ao filamento de von Frey embaixo da superfície

plantar da pata direita traseira em escala crescente de estímulo de força até um valor máximo

de 50g (de modo a evitar lesão na pata). A indometacina foi utilizada como droga de referência.

Os resultados foram calculados pela diferença dos valores das leituras nos tempos (30, 60 e 180

minutos) pela leitura do tempo zero (antes da aplicação da carragenina) (CUNHA et al., 1992).

4.8.2.1 Análise da lesão causada pela carragenina

Os animais foram divididos em 5 grupos tratados com veículo (3% Tween 80 em

água destilada), RipII (25 ou 50 mg/kg) ou indometacina (5 mg/kg, v.o.). Todos os animais

receberam 20 µL de carragenina na pata direita traseira. Na 3ª h após a aplicação da carragenina,

as patas foram retiradas e parte delas fixadas em formol a 10% e incluídos em parafina. Os

cortes foram obtidos através de micrótomo (4 μm), coradas com hematoxilina-eosina e

examinados a microscopia óptica.

A análise histopatológica foi realizada em colaboração com a Prof. Dra. Gerly Anne

Castro de Brito do Departamento de Morfologia da UFC. Foi quantificado edema e infiltrado

em áreas representativas em aumento de 20x e 40x.

Uma outra parte da pata direita foi retirada e realizada a determinação das

substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico-TBARS (HUANG et al. 1998) e o conteúdo de

nitrito (GREEN et al., 1982).

46

4.8.3 Hipernocicepção inflamatória induzida por PGE2


(3% Tween 80 em água destilada) ou RipII (25 ou 50 mg/kg) Todos os animais receberam 20

µL de PGE2 (3nmol/pata) intraplantar e testados nos tempos 0, 30, 60 e 180 minutos. Os

animais foram submetidos ao filamento de von Frey embaixo da superfície plantar da pata

direita traseira em escala crescente de estímulo de força até um valor máximo de 50g (de modo

a evitar lesão na pata). Os resultados foram calculados pela diferença dos valores das leituras

nos tempos (30, 60 e 180 minutos) pela leitura do tempo zero (antes da aplicação da PGE2)

(CUNHA et al., 1992).

4.8.4 Hipernocicepção inflamatória induzida por Epinefrina


(3% Tween 80 em água destilada) ou RipII (25 ou 50 mg/kg). Todos os animais receberam 20

µL de Epinefrina (100ng/pata) intraplantar e testados nos tempos 0, 30, 60, 120 e 240 minutos.

Os animais foram submetidos ao filamento de von Frey embaixo da superfície plantar da pata

direita traseira em escala crescente de estímulo de força até um valor máximo de 50g (de modo

a evitar lesão na pata). Os resultados foram calculados pela diferença dos valores das leituras

nos tempos (30, 60, 120 e 2400 minutos) pela leitura do tempo zero (antes da aplicação da

epinefrina) (CUNHA et al., 1992).

4.9 Avaliação do mecanismo antinociceptivo da RipII

4.9.1. Participação dos receptores de potencial transiente (TRP)

4.9.1.1 TRPV1

Os animais foram divididos em 3 grupos e a RipII (25 e 50µg/pata, i.pl.) foi

coadministrada com capsaicina (2,2 µg/pata-ativador dos receptores TRPV1) na pata direita

traseira. O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, de 0-5 min, e considerado

como um índice de nocicepção. (SANTOS, CALIXTO, 1997a).

47

4.9.1.2 TRPA1

Os animais foram tratados com veículo (3% Tween 80 em água destilada), RipII

(25 e 50 mg/kg; v.o.) ou cânfora (7,6 mg/kg, s.c- antagonista TRPA1). Após 30 (s.c) ou 60

minutos (v.o.), os animais receberam uma injeção intraplantar de 20 µl da solução de

cinamaldeído (10 nmol/pata-ativador dos receptores TRPA1) na pata posterior direita. O tempo

em que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata foi registrado, de 0-5 min, e

considerado como um índice de nocicepção (BAUTISTA et al., 2006). Em outro experimento,

a RipII (25 e 50µg/pata, i.pl.) foi coadministrada com cinamaldeído (10 nmol/pata) na pata

direita traseira e a resposta determinada como descrita anteriormente.

4.9.1.3 TRPM8

Os animais foram tratados com veículo (3 % Tween 80 em água destilada; v.o.) ou

RipII (25 e 50 mg/kg; v.o.). Após 60 minutos, os animais receberam uma injeção intraplantar

de 20 µl da solução de mentol (1,2 μmol/pata-ativador dos receptores TRPM8) na pata direita

traseira. O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, de 0-20 min, e considerado

como um índice de nocicepção (RIOS et al., 2013). Em outro experimento, a RipII (25 e

50µg/pata, i.pl.) foi coadministrada com mentol (1,2 μmol/pata) na pata direita traseira e a

resposta determinada como descrita anteriormente.

4.9.2 Participação dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASICs)

Os animais foram tratados com RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.) ou veículo (3% de

Tween 80 em água destilada; v.o.). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar 20

μl de solução de salina ácida (ácido acético 2%, pH 1,98 – ativador de ASIC e receptor TRPV1)

na pata posterior direita. Para descartar o efeito sobre o TRPV1, um grupo foi pré-tratado com

capsazepina (5 mg/kg; i.p.) antes de receber a salina ácida. O tempo que o animal permaneceu

lambendo ou mordendo a pata injetada foi registrado durante um período de 20 min.

(BAUTISTA et al., 2006). Em outro experimento, a RipII (25 e 50µg/pata, i.pl.) foi

coadministrada com salina ácida (ácido acético 2%, pH 1,98) na pata direita traseira e a resposta

determinada como descrita anteriormente.

48

4.9.3 Participação dos receptores de bradicinina

Os animais foram pré-tratados com captopril (5 mg/kg, i.p.), para evitar a

degradação da bradicinina, e após 30 min receberam RipII-50 mg/kg ou veículo (3% de Tween

80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam 20 μl de Bradicinina (10 µg/pata)

na pata direita traseira. O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata

injetada, foi registrado por um período 15 minutos (FERREIRA et al., 2005).

4.9.4 Participação da Proteína Quinase C (PKC)

Os animais foram tratados por via oral com RipII na dose de 50 mg/kg (v.o.) ou

veículo (3% de Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via

intraplantar 20 μl de PMA (500 pmol/pata- ativador de PKC). O tempo que o animal

permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada, considerado como resposta nociceptiva,

foi mensurado no período de 15-45 minutos (FERREIRA et al., 2005).

4.9.5 Participação da Proteína Quinase A (PKA)

Para verificar a influência da RipII sobre a nocicepção induzida por PKA, os

animais foram tratados com veículo (3 % de Tween 80 em água destilada) ou RipII-50 mg/kg.

Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar 20 μl de 8-Bromo-AMPc (10

nmol/pata- ativador de PKA). O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata

injetada, considerado como resposta nociceptiva, foi cronometrado por um período de 30

minutos (FERREIRA et al., 2005).

4.9.6 Participação dos Canais de potássio dependentes de ATP

Para a verificação do envolvimento dos canais de potássio dependentes de ATP

sobre a propriedade antinociceptiva da RipII, grupos de animais foram pré-tratados com

glibenclamida (2 mg/kg, i.p.) ou veículo. Decorridos 15 minutos, os animais receberem RipII

(50 mg/kg, v.o.) ou diazóxido (3 mg/kg, i.p.). Após 30 min do tratamento, os animais foram

submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético como descrito

anteriormente (RIOS et al., 2013).

49

4.9.7 Participação do Sistema Opióide

Com o objetivo de avaliar a participação do sistema opióide sobre o efeito

antinociceptivo da RipII, grupos distintos de animais foram pré-tratados com naloxona (1

mg/kg, i.p., antagonista opióide não seletivo) e 15 minutos antes da adiministração da RipII (50

mg/kg) ou morfina (5 mg/kg, i.p., agonista opióide). Após um período de 30 minutos os animais

foram analisados no modelo de contorções induzidas por ácido acético como descrito

anteriormente (HESS, 2006).

4.9.8 Participação do sistema α2-adrenérgico

Camundongos foram pré-tratados com ioimbina (2,5 mg/kg; i.p.) ou veículo (3%

de Tween 80 em água destilada), depois de 15 minutos os animais receberem RipII-50 mg/kg

ou clonidina (0,15 mg/kg, i.p.). Após 30 minutos do último tratamento (RipII, ioimbina ou

clonidina), os animais foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas por

ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2010).

4.9.9 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3)

O envolvimento dos receptores serotoninérgicos sobre o efeito antinociceptivo da

RipII foi avaliado pela administração de NAN-190 (antagonista 5-HT1A-1 mg/kg, i.p.),

Ritanserina (antagonista 5-HT2A/C -1 mg/kg, i.p) e Ondansetrona (antagonista 5-HT3 -0,5

mg/kg, i.p.) 15 minutos antes dos animais receberem RipII- 50mg/kg (v.o.) ou veículo (3% de

Tween 80 em água destilada). Após 30 minutos, os animais foram submetidos ao teste das

contorções abdominais induzidas por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).

4.9.10 Participação do sistema colinérgico

Para demonstrar o envolvimento do sistema colinérgico sobre a atividade

antinociceptiva da RipII, os animais foram pré-tratados com atropina (1 mg/kg, i.p.- antagonista

colinérgico muscarínico não-seletivo) 15 minutos antes da administração RipII (50 mg/kg,

v.o.). Após 30 minutos do tratamento, os animais foram analisados no modelo de contorções

induzidas por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).

50

4.9.11 Participação do sistema dopaminérgico

A fim de avaliar a possível participação do sistema dopaminérgico no efeito

antinociceptivo da RipII, camundongos foram pré-tratados com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p.-

antagonista não-seletivo dos receptores dopaminérgicos), e após 30 minutos, receberam a RipII

(50 mg/kg) ou veículo. Decorridos 30 minutos, os animais foram analisados no modelo de

contorções induzidas por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2010).

4.10 Análise estatística

A análise estatística dos dados foi realizada pelo programa Graph Pad Prism 5.0

(USA). Para os testes com mais de três grupos foi feita a análise estatística empregando o teste

de análise de variância (ANOVA). Para verificar se houve diferença significativa entre os

grupos, foi realizado o teste de comparações múltiplas de Student-Newman-Keuls ou

Bonferroni. Para a análise dos testes com apenas dois grupos, foi utilizado o teste não

paramétrico de Mann-Whitney (t-test). Foi realizada a regressão não-linear para a determinação

da DE50 na curva dose x resposta. Os resultados foram expressos como média ± E.P.M

(variáveis com distribuição normal) ou mediana com máximo e mínimo, sendo as diferenças

consideradas estatisticamente significativas a partir de p<0,05.

51

5 RESULTADOS

5.1 Ensaios de Toxicidade

5.1.1 Estimativa da DL50 da RipII através da OECD 425 (Acute Oral Toxicity-Up-And-Down)

O primeiro camundongo recebeu a dose inicial de RipII 175 mg/Kg por via oral e

após tal administração, foram realizadas observações no comportamento do animal por 48 horas

a procura de algum sinal tóxico. Após esse período foi administrada a próxima dose de 550

mg/Kg ao segundo animal. Semelhante ao animal anterior, o segundo não apresentou sinais de

toxicidade e sobreviveu após as 48 horas. Então, o terceiro animal recebeu a dose de 2000

mg/Kg. Durante a primeira meia hora após a administração da RipII, o animal apresentou

piloereção e letargia que desapareceu e o mesmo permaneceu sem sinais de toxicidade até o

final do experimento.

Seguindo a OECD 425, administrou-se a dose de 2000 mg/kg ao quarto animal que

também apresentou letargia na primeira meia hora após o tratamento. Após esse intervalo, o

animal retornou ao estado normal e sobreviveu. Em seguida, a dose de 2000 mg/Kg foi

administrada ao quinto animal e encerrou-se o ensaio de toxicidade oral aguda, já que três

animais consecutivos receberam a mesma dose (2000 mg/kg) e permaneceram vivos, como

demonstrado na tabela 5.

Observamos também que os animais tiveram uma evolução normal de peso ao

longo dos 14 dias de observação (ganho em média de 4,8 g), não ocorrendo redução de massa

corpórea nos animais tratados com a RipII. Esse é um dado relevante pois a perda de peso é um

forte indicativo de toxicidade.

52

Tabela 5. Pesos e observações quanto ao aparecimento dos sinais de toxicidade

Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5

Dose (mg/Kg) 175 550 2000 2000 2000

Peso inicial (g) 32 35 37 39 25

Peso final (g) 39 39 39 42 33

Observações 30 min SST SST Piloereção Letargia Letargia

Observações 1 h SST SST SST SST SST

Observações 4 h SST SST SST SST SST

Mortalidade - - - - -

Nos cinco camundongos foram administrados RipII nas doses de 175 mg/Kg, 550 mg/Kg, 2000 mg/Kg, 2000

mg/kg e 2000 mg/Kg de acordo com a OECD 425. As observações foram 30 minutos, 1 hora e 4 horas após a

administração. SST: sem sinais de toxicidade.

Tal metodologia possui a finalidade de estimar a DL50 utilizando o menor número

de animais possível. Com esses resultados, podemos inferir que a DL50 da RipII é superior a

2000 mg/kg (faixa de 2000-5000 mg/kg), o que a enquadra na categoria 5 (substâncias com

baixa toxicidade) segundo a Globally Harmonized System of Classification and Labelling of

Chemicals (GSH).

Não foram verificadas alterações macroscópicas dos órgãos retirados (cérebro,

coração, fígado, estômago e rins) após tratamento com RipII.

53

5.2 Toxicidade oral da Riparina II no protocolo de doses repetidas por 28 dias

5.2.1 Sobrevivência, massa corpórea e observações comportamentais

O tratamento durante 28 dias com veículo e RipII-500 mg/kg não ocasionou

nenhuma morte nos animais bem como alterações comportamentais. Os mesmos também não

apresentaram sinais de toxicidade como perda de peso, mudanças no aspecto dos pelos,

tremores, convulsão, aumento da salivação, letargia e coma.

Podemos observar um ganho de peso natural em todos os grupos experimentais

(Gráfico 1).

Gráfico 1. Média do ganho de peso dos animais no teste de toxicidade oral por 28 dias

0 1 2 3 420

25

30

35

40 Controle Riparina II

Semanas

Pe

so

do

s a

nim

ais

(g

)

Animais tratados com veículo (controle) e RipII-500 mg/Kg durante 28 dias. Os resultados dos grupos

experimentais (n=10) foram expressos como média.

54

5.2.2 Análise dos parâmetros hematológicos

Os resultados mostraram que o eritrograma, a plaquetometria e o leucograma dos

animais tratados com RipII-500 mg/kg por 28 dias não apresentou nenhuma diferença

significativa em relação aos animais do grupo controle (Tabela 6).

Tabela 6. Eritrograma, plaquetometria e leucograma dos camundongos no teste de

toxicidade oral por 28 dias.

PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS

GRUPOS EXPERIMENTAIS

Controle Riparina II

Média ± E.P.M Média ± E.P.M

Hemácias (106/µL) 8,627±0,1202 8,718±0,1091

Hemoglobina (g/dL) 13,93±0,2761 14,03±0,2533

Hematócrito (%) 46,62±0,85715 45,84±0,6754

VCM (fL) 54,03±0,6518 52,62±0,6601

HCM (pg) 16,15±0,2045 16,12±0,3040

CHCM (g/dL) 29,89±0,1991 30,60±0,2321

Plaquetas (103/µL) 1404±48,740 1500±56,480

Leucócitos (103/µL) 4,163±0,2847 3,311±0,2746

Linfócitos (103/µL) 3,600±0,2322 2,971±0,2101

VCM: volume corpuscular médio; HCM: hemoglobina corpuscular média; CHCM: concentração de hemoglobina

corpuscular média. Os resultados dos grupos experimentais (n=10) foram expressos como média ± erro padrão da

média (EPM) (t-test com Mann-Whitney post test).

55

5.2.3 Análise dos parâmetros bioquímicos

As determinações bioquímicas de marcadores de função renal e hepática não

apresentaram diferença significativa entre os grupos experimentais (Tabela 7).

Tabela 7. Níveis plasmáticos de uréia, creatinina, AST e ALT dos camundongos após o

tratamento diário consecutivo por 28 dias com Riparina II ou veículo (Controle).

PARÂMETROS BIOQUÍMICOS

GRUPOS EXPERIMENTAIS

Controle Riparina II

Média ± E.P.M Média ± E.P.M

Ureia (mg/dL) 58,67±2,5120 57,75±2,864

Creatinina (mg/dL) 0,4440±0,0918 0,4275±0,0280

AST (U/L) 88,00±7,3580 83,00±12,210

ALT (U/L) 43,33±3,1270 38,00±2,5910

Os resultados dos grupos experimentais (n=10) foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) (t-

test com Mann-Whitney post test).

56

5.2.4 Análise macro e microscópica dos órgãos

Na observação dos órgãos retirados (cérebro, coração, fígado, estômago e rins) não

foram observadas alterações macroscópicas após tratamento durante 28 dias com RipII-

500mg/kg.

Também não foram encontradas alterações histopatológicas nos órgãos

estudados. A análise do coração não apresentou alteração arquitetural e não houve indício de

citotoxicidade. Os cérebros dos animais tratados com a RipII estavam semelhantes aos animais

controle, entretanto 1 animal apresentou foco de calcificação no parênquima cerebral. Não

houve alteração arquitetural no fígado e não houve indício de citotoxicidade, entretanto foram

observados focos inflamatórios agudo no parênquima hepático. Entretanto, tal alteração não

deve estar relacionada ao teste de toxicidade, pois foram observadas também no grupo controle.

Já os rins não apresentaram citotoxicidade epitelial e 1 animal apresentou foco de pielonefrite

crônica discreta, que pode estar relacionado a uma alteração no próprio animal, uma vez que

tais processos geralmente têm causas ascendentes a partir da bexiga. (Figura 12)

Figura 12. Fotomicrografia de órgãos na toxicidade oral da RipII no protocolo de doses

repetidas por 28 dias (aumento x10)

Legenda: A: Cérebro (esquerda-controle; direita: RipII); B: Rim (esquerda-controle; direita: RipII); C: Fígado

(esquerda-controle; direita: RipII); D: Coração (esquerda-controle; direita: RipII)

57

5.3. Modelagem Molecular

5.3.1 TRPV1

A interação entre o receptor TRPV1 e o ligante RipII apresentou um valor de

energia no sistema com o valor de E-value = – 239,39 Kcal.mol-1, mostrando que essa ligação

pode favorecer uma interação muito forte entre o receptor e o ligante. (Figura 13)

Desse modo, é muito provável que a RipII possa apresentar algum efeito

farmacológico quando ligada a proteína TRPV1 nos aminoácidos GLU293, VAL283, TYR246,

LYS238, LYS237, PHE245, SER282, LYS345.

Figura 13. Locais de interação entre o ligante (RipII) e o receptor TRPV1

58

5.3.2 TRPA1

A interação entre a proteína TRPA1 e o ligante RipII apresentou um valor de E-

value = – 232,27 Kcal.mol-1, no qual esse dado representa o favorecimento entre a energia do

complexo, demostrando que ocorreu interação muito forte entre o receptor e o ligante. (Figura

14)

Desse modo, é muito provável que a substância RipII possa apresentar uma

atividade antinociceptiva quando se comunicar com a proteína TRPA1 (N-terminal), pois

apresentou uma ligação entre os aminoácidos ASN629, GLY602, TRP600, GLU631, VAL633,

PRO598, ALA630, ALA599 e o ligante.

Figura 14. Locais de interação entre o ligante (RipII) e o receptor TRPA1

59

5.3.3 Bradicinina

Após a pesquisa, foi realizado o download do arquivo no formato .fasta da

sequência da proteína, referente ao modelo 4YAY, pertencente ao Receptor de Angiotensina,

no qual foi selecionado a partir de resultados encontrados na busca realizada pelo servidor

pBLAST, baseado no menor valor de E-value, identidade de sequência e parâmetros de

resolução estrutural.

O modelo de homologia foi construído a partir da utilização da ferramenta Robetta,

onde a comparação por sobreposição estrutural com o complexo cristalografado original,

apresentou um valor obtido de RMSD = 7,8 ± 4,4 Å, revelando alta similaridade com o modelo

PDB ID: 4YAY (Receptor de Angiotensina). O valor de C-score = 0,46 alcançado indica que o

modelo tem alto nível de confiança, portanto um modelo estrutural adequado.

Após obtenção, o mesmo foi refinado pela ferramenta WinCoot. A qualidade do

modelo foi avaliada a partir do servidor MolProbity, no qual proporciona parâmetros para a

escolha do modelo ideal criado por semelhança estrutural, a partir da criação do gráfico

Ramachandran, que é capaz de indicar as combinações mais estáveis (de baixa energia) através

das regiões favoráveis.

As figuras indicadas em A1 e A2 mostram a conformação estereoquímica antes do

refinamento, onde podemos observar que: 92,6% de todos os resídos (361/390) estão

localizados em regiões favoráveis (azul claro); 99,2% de todos os resíduos (387/390) estão

localizados em áreas adicionalmente permitidas (azul escuro); e 3 aminoácidos (LEU111,

PRO112 e VAL334) estão localizados em regiões não permitidas (branca). Após o refinamento

(figuras B1 e B2) 92,8% dos resíduos (362/390) estão localizados em regiões favoráveis (azul

claro) e 100% (390/390) dos resíduos estão agora em regiões adicionalmente permitidas (azul

escuro). (Figura 15).

60

Figura 15. Ramachandran (MolProbity) para o modelo do Receptor de Bradicinina,

gerado por modelagem por homologia

O eixo Psi e Phi variam de -180 a +180, onde as regiões das áreas demarcadas do gráfico são consideradas regiões

permitidas. A1 e A2: antes do refinamento. B1 e B2: após o refinamento. Legenda: Área branca: regiões não

favoráveis/permitidas; Região azul escuro: regiões adicionalmente permitidas; Região azul clara: regiões

favoráveis/permitidas

Outro modelo para validar a estrutura foi realizado utilizando o programa ProSA,

que analisa a qualidade global e local do modelo, tendo como referência outras estruturas de

proteínas do mesmo tamanho já depositadas no PDB (regiões azuis do gráfico), pela avaliação

das coordenadas e das energias em função das distâncias entre os resíduos.

A figura 16 indica um gráfico de energia que mostra a qualidade global do modelo

em função da posição do aminoácido na sequência proteica, no qual obteve o resultado de -

4,81. Em geral, valores positivos correspondem a regiões do modelo que estão erradas ou com

61

problemas. A avaliação mostra que a maioria dos resíduos está na região negativa, indicando

qualidade local satisfatória.

Figura 16: Padrão de energia indicando a qualidade global do receptor de bradicinina

Legenda: Região azul (clara e eescura) indicam outros modelos de proteínas do mesmo tamanho que já foram

depositadas no PDB. Receptor de bradicinina (ponto preto)

A interação entre o receptor de bradicinina e o ligante RipII apresentou um valor

de energia no sistema com o valor de E-value = – 232,27 Kcal.mol-1, valor que pode favorecer

a interação muito forte entre o receptor e o ligante. Desse modo, é muito provável que a

substância RipII possa apresentar um possível efeito farmacológico quando ligada ao Receptor

de Bradicinina, através da comunicação dos resíduos LEU194, LEU105, VAL133, CYS109,

LEU187, MET140, ILE106, THR136, MET137 e o ligante (Figura 17).

62

Figura 17. Locais de interação entre o ligante (RipII) e o receptor de Bradicinina.

63

5.4 Avaliação da Atividade Antinociceptiva

5.4.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Os resultados mostram que a RipII exibiu uma redução significativa do número de

contorções abdominais em todas as doses testadas [RipII-3,125: 21,40 ± 2,2205; RipII-6,25:

28,86 ± 2,198; RipII-12,5: 26,00 ± 2,463; RipII-25: 18,75 ± 0,725; RipII-50: 18,29 ± 1,672;

RipII-100: 20,00 ± 3,120; RipII-200: 16,60 ± 1,720], quando comparado com os animais

tratados apenas com o veículo [36,54 ± 2,657] (Gráfico 2A).

A curva dose x resposta mostrada no Gráfico 2B indica que a RipII possui uma DE

estimada de 24,72 mg/kg (16,12- 37,91 mg/kg).

Os resultados apresentados no Gráfico 2C mostram que a RipII 50 mg/kg (v.o.)

produziu um efeito antinociceptivo que se inicia aos 30 minutos, sendo mantido por até 4h após

a administração [Veículo: 43,00 ± 3,651; 0,5h: 26,29 ± 2,749; 1h: 16,71 ± 2,135; 2h: 21,88 ±

2,806; 4h: 21,83 ± 2,926].

Gráfico 2. Efeito da administração de RipII na nocicepção induzida por ácido acético em

camundongos.

Veículo 3,125 6,25 12,5 25 50 100 200 INDO0

10

20

30

40

50

*

RipII (mg/kg; v.o.)

*

A

Núm

ero

de c

onto

rções (

n)

64

0.0 0.5 1.0 1.5 2.020

30

40

50

60

70

DE50=24,72 mg/kg (16,12 - 37,91)

B

log[Dose]

Resposta

antin

ocic

eptiv

a (

%)

0

10

20

30

40

50

60

30 60 120 240 360

*

*

**

480

Linha Controle

C

Tempo (min)

Núm

ero

de c

onto

rções (

n)

O gráfico A mostra o efeito antinociceptivo da RipII em diversas doses (3,125-200 mg/kg). Indometacina (INDO-

5 mg/kg; v.o.) foi utilizada como droga de referência. O gráfico B mostra uma curva Log [dose] x resposta da

RipII. O gráfico C mostra o tempo de ação antinociceptiva da RipII-50 mg/kg (v.o). Os valores representam a

média ± E.P.M. com máximo e mínimo do número de contorções. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-

Newman-Keuls ou Bonferroni, post hoc). Regressão não-linear foi utilizada para estimar a DE50 com intervalo de

confiança de 95%.

65

5.4.2 Hipernocicepção inflamatória induzida por carragenina

O Gráfico 3 mostra que a carragenina quando injetada na pata direita traseira do

animal produz uma intensa nocicepção causando um aumento da sensibilidade. O grupo que

recebeu indometacina (5 mg/kg; v.o.) foi capaz de reduzir a hipernocicepção mecânica em todos

os tempos avaliados.

A RipII nas dose de 25 e 50 mg/kg foram capazes de gerar um efeito antinociceptivo

significativo em todos os tempos analisados.

Gráfico 3. Efeito da RipII no teste da hipernocicepção inflamatória induzida por

carragenina.

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

Veículo

50

25

Indo

30 60 180

Tempo (min)

* ***

*

*

**

Inte

nsid

ade d

a h

ipern

ocic

epção

( lim

iar

de r

etira

da, g)

*

RipII 25 e 50 mg/kg, veículo e indometacina (Indo) foram administrados antes da carragenina a 0,1%. Cada ponto

representa a média ± EPM do limiar de retirada da pata (em gramas) da estimulação tátil da pata direita traseira.

*p<0,05 vs Veículo (Two way ANOVA Bonferroni post hoc).

66

5.4.2.1 Análise da lesão causada pela carragenina

A administração intraplantar de carragenina 1% promoveu uma reação inflamatória

aguda, com intensa infiltração celular. O pré-tratamento, por via oral, de RipII (25 ou 50 mg/kg)

ou indometacina (5 mg/kg) foram capazes de diminuir de forma significativa o edema [Veículo:

2,000 ± 0,0; RipII-25: 1,000 ± 0,0; RipII-50: 1,200 ± 0,3742] e o infiltrado de células

inflamatórias [Veículo: 2,750 ± 0,2500; RipII-25: 1,400 ± 0,2449; RipII-50: 1,800 ± 0,3742].

Nenhuma alteração foi observada no grupo tratado apenas com salina [Edema: 0,0 ± 0,0;

Infiltrado: 0,0 ± 0,0] (Gráfico 4A).

A fotomicrografia mostra uma ausência de células inflamatórias e de edema

tecidual nos animais tratados apenas com salina. Já nos animais tratados com carragenina houve

um aumento do número de células inflamatórias e um espaçamento tecidual caracterizando o

edema (Figura 17). Por fim, no tratamento com RipII nas doses de 25 e 50 mg/kg (v.o.) foi

observado uma redução de tais parâmetros (Gáfico 4B)

Gráfico 4. Análise histológica das patas de camundongos.

Sadio Veículo RipII-25 RipII-50 Indometacina0

1

2

3

4

*

A

Esc

ore

s

Sadio Veículo RipII-25 RipII-50 Indometacina0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

B

*

Esc

ore

s

Animais foram tratados com RipII (25 e 50 mg/kg), veículo, salina (sadio) e indometacina (5 mg/kg). A: Infiltrado;

B: Edema. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

67

Figura 18. Fotomicrografia histológica de patas de camundongos.

Animais foram tratados com RipII (25 e 50 mg/kg), veículo, salina (sadio) e indometacina (5mg/kg).

*: infiltrado; seta: edema

CTRL (x20)

*

CTRL (x40)

*

RipII-25 (x20) RipII-25 (x40)

SADIO (x20) SADIO (x40)

*

*

*

* *

RipII-50 (x20) RipII-50 (x40)

Indometacina (x20)

Indometacina (x40)

*

*

*

*

68

O pré-tratamento com RipII (25 ou 50 mg/kg; v.o.) foi capaz de reduzir de forma

significativa os níveis de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico [Veículo: 19,52 ± 3,049;

RipII-25: 8,000 ± 1,204; RipII-50: 7,820 ± 0,5739], bem como os níveis de nitrito [Veículo:

539,7 ± 75,76; RipII-25: 291,6 ± 49,46; RipII-50: 283,7 ± 50,24].

Nenhuma alteração foi observada no grupo não tratado com carragenina, apenas

salina [TBARS: 8,000 ± 1,528; Nitrito: 125,5 ± 27,75]. (Gráfico 5)

Gráfico 5. Níveis de MDA e Nitrito nas patas de camundongos inflamadas por

carragenina.


5

10

15

20

25

*

*

A

nm

ols

de

MD

A/

g t

ecid

o


200

400

600

800

*

*

B

nM

Nitri

to/g

te

cid

o

Animais foram tratados com RipII (25 e 50 mg/kg), veículo, salina (sadio) e indometacina (5 mg/kg). A:

Determinação de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico; B: Determinação do conteúdo de nitrito *p<0,05 vs

Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

69

5.4.3 Hipernocicepção inflamatória induzida por PGE2

O Gráfico 6 mostra que a prostaglandina E2 quando injetada na pata direita traseira

do animal produz uma intensa nocicepção causando um aumento da sensibilidade.

A RipII nas doses de 25 e 50 mg/kg gerou um efeito antihipernociceptivo

significativo apenas no tempo de 180 minutos.

Gráfico 6. Efeito da RipII no teste da hipernocicepção inflamatória induzida por PGE2.

-7-6-5-4-3-2-1012345678

Veículo

25

50

30 60 180

Tempo (min)

*

*Inte

nsid

ad

e d

a h

ipe

rno

cic

ep

çã

o

( lim

iar

de

re

tira

da

, g

)

RipII 25 e 50 mg/kg (v.o.) e veículo foram administrados antes da PGE2 (3nmol/pata). Cada ponto representa a

média ± EPM do limiar de retirada da pata (em gramas) da estimulação tátil da pata direita traseira. *p<0,05 vs

Veículo (Two way ANOVA Bonferroni post hoc).

70

5.4.4 Hipernocicepção inflamatória induzida por Epinefrina

O Gráfico 7 mostra que a epinefrina quando injetada na pata direita traseira do

animal produz uma intensa nocicepção causando um aumento da sensibilidade. A RipII na dose

de 25 mg/kg foi capaz de reverter de maneira significativa o processo hiperlagésico nos tempos

30 e 240 minutos e a dose de 50 mg/kg foi capaz de reduzir apenas no tempo 240 minutos

Gráfico 7. Efeito da RipII no teste da hipernocicepção inflamatória induzida por

epinefrina.

-7-6-5-4-3-2-1012345678

Veículo

25

50

30 60 120

Tempo (min)

240

*

*

*

Inte

nsid

ad

e d

a h

ipe

rno

cic

ep

çã

o

( lim

iar

de

re

tira

da

, g

)

RipII 25 e 50 mg/kg e veículo foram administrados antes da epinefrina (100 ng/pata). Cada ponto representa a

média ± EPM do limiar de retirada da pata (em gramas) da estimulação tátil da pata direita traseira. *p<0,05 vs

Veículo (Two way ANOVA Bonferroni post hoc).

71

5.5. Avaliação do mecanismo antinociceptivo da RipII

5.5.1 Participação dos receptores TRP

5.5.1.1 TRPV1

A coadministração intraplantar de RipII (25 e 50 µg/kg) e capsaicina (2,2 µg/pata)

foi capaz de reduzir significativamente o tempo de lambedura (RipII 25µg: 14,25 ± 1,750; RipII

50µg: 18,75 ± 1,612) em relação ao controle (32,46 ± 4,153) (Gráfico 8).

Gráfico 8. Papel dos receptores de potencial transiente do tipo V1 (TRPV1) no efeito

antinociceptivo da RipII.

Veículo 25 500

10

20

30

40

*

RipII (g/kg; i.pl.)

Capsaicina 2,2 g/pata

Te

mp

o d

e L

am

be

du

ra (

s)

RipII (25 e 50 µg/kg, i.pl.) foi coadministrada com capsaicina (2,2 µg/pata). Os valores representam a média ±

E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo; ap<0,05 vs RipII-50 (ANOVA e Student-Newman-Keuls,

post hoc).

72

5.5.1.2 TRPA1

O Gráfico 9A mostra que a administração cinamaldeído causa nocicepção (39,43 ±

5,340). Já a RipII em ambas as doses (25 e 50 mg/kg, v.o.) foi capaz de reduzir

significativamente o tempo de lambedura induzido por cinamaldeído quando comparado com

o veículo (RipII-25: 11,00 ± 1,165; RipII-50: 11,00 ± 0,9258).

A cânfora (7,6 mg/kg, s.c), utilizada como droga de referência, também foi capaz

de reduzir de forma significativa o tempo de lambedura (13,75 ± 1,306) quando comparado ao

veículo.

A coadministração de RipII (25 e 50 µg/kg, i.pl.) e cinamaldeído (10nmol/pata) foi

capaz de reduzir significativamente o tempo de lambedura (RipII 25µg: 34,38 ± 3,184; RipII

50µg: 26,13 ± 3,652) em relação ao veículo (59,00 ± 11,21) (Gráfico 9B)

73

Gráfico 9. Papel dos receptores de potencial transiente do tipo A1 (TRPA1) no efeito


Veículo 25 50 Cânfora0

10

20

30

40

50

*

Cinamaldeído 10 nmol/pata

RipII (mg/kg; v.o.)

AT

em

po

de

La

mb

ed

ura

(s

)

Veículo 25 500

20

40

60

80

Cinamaldeído 10 nmol/pata

RipII (g/pata; i.pl.)

*

B

Te

mp

o d

e L

am

be

du

ra (

s)

A: Os animais foram tratados com veículo, RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.) e cânfora (7,6 mg/kg, s.c). B: RipII (25 e

50 µg/kg, i.pl.) foi coadministrada com cinamaldeído (10nmol/pata). Os valores representam a média ± E.P.M. do

tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

74

5.5.1.3 TRPM8

O mentol quando administrado sozinho foi capaz de causar nocicepção

caracterizado pelo aumento no tempo de lambedura da pata do aninal (35,67 ± 4,944). A

administração de RipII nas doses de 25 e 50 mg/kg (v.o.) foram capazes de produzir uma

redução significativa (RipII-25: 10,50 ± 1,765; RipII-50: 4,000 ± 0,8563) no tempo de

lambedura induzido por mentol quando comparado com o veículo (Gráfico 10A).

A coadministração de RipII e mentol também apresentou comportamento

semelhante, ou seja, foi capaz de reduzir significativamente a resposta nociceptiva (RipII 25µg:

21,89 ± 2,058; RipII 50µg: 18,00 ± 2,867) quando comparado ao controle (31,60 ± 3,471)

(Gráfico 10B).

75

Gráfico 10. Papel dos receptores de potencial transiente do tipo M8 (TRPM8) no efeito


Veículo 25 500

10

20

30

40

50

*

RipII (mg/kg; v.o.)

Mentol 1,2 mol/pata

A

Te

mp

o d

e L

am

be

du

ra (

s)

Veículo 25 500

10

20

30

40

RipII (g/kg; i.pl.)

Mentol 1,2 mol/pata

B

*

Te

mp

o d

e L

am

be

du

ra (

s)

A: Os animais foram tratados com veículo e RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.). B: RipII (25 e 50 µg/kg, i.pl.) foi

coadministrada com o mentol (1,2 µmol/pata). Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

76

5.5.2 Participação dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASICs)

A administração de RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.) foi capaz de diminuir o tempo de

lambedura após a injeção intraplantar de salina ácida quando comparado ao controle (RipII-25:

53,40 ± 8,189; RipII-50: 41,00 ± 5,779; Veículo: 106,1 ± 5,495).

Efeito semelhante foi observado quando ocorreu o bloqueio dos receptores TRPV1

pela capsazepina (CZP+RipII-50: 31,00 ± 9,406) (Gráfico 11A). A capsazepina foi utilizada

para eliminar a influência do receptor TRPV1 no efeito, já que a salina ácida é capaz de ativar

tanto TRPV1 quanto ASICs.

Quando a RipII foi coadministrada com a salina ácida também houve uma redução

significativa no tempo de lambedura nas duas doses testadas (RipII 25µg: 51,44 ± 7,433; RipII

50µg: 58,50 ± 18,72) quando comparadas com o controle (136,1 ± 18,79) (Gráfico 11B).

77

Gráfico 11. Papel dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASIC) no efeito antinociceptivo da

RipII.

Veículo RipII-25 RipII-50 CZP CZP+RipII-500

50

100

150

*

a

Salina Ácida (2% aa em 0.9% salina, pH 1.98/pata)

AT

em

po

de

La

mb

ed

ura

(s)

Veículo 25 500

50

100

150

200

*

B

Salina Ácida (2% aa em salina 0.9%, pH 1,98/pata)

RipII (g/kg; i.pl.)

Te

mp

o d

e L

am

be

du

ra (

s)

A: Os animais foram tratados com veículo, RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.), capsazepina (CZP- 5mg/kg; i.p.) e

CZP+RipII-50. B: RipII (25 e 50 µg/kg, i.pl.) foi coadministrada com a salina ácida. Os valores representam a

média ± E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo; ap<0,05 vs RipII-50 (ANOVA e Student-Newman-

Keuls, post hoc).

78

5.5.3 Participação dos receptores de Bradicinina

O grupo tratado com RipII (50 mg/kg; v.o.) foi capaz de reduzir de forma

significativa a resposta nociceptiva induzida pela injeção intraplantar de bradicinina (20,67 ±

1,783), comparada com o veículo (50,20 ± 8,639). (Gráfico 12)

Gráfico 12. Envolvimento da RipII no comportamento nociceptivo causado pela injeção

intraplantar de bradicinina.

Veículo RipII-500

20

40

60

80

*

Bradicinina 10g/pata

Te

mp

o d

e L

am

be

du

ra (

s)

Os animais foram tratados com veículo e RipII-50 mg/kg (v.o.). Os valores representam a média ± E.P.M. do

tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (t-test; Mann-Whitney).

79

5.5.4 Participação da Proteína Quinase C (PKC)

RipII na dose de 50 mg/kg (85,60 ± 4,956) reduziu significativamente o tempo de

lambedura induzida por PMA (ativador de PKC) quando comparados com o veículo (168,2 ±

15,43) (Gráfico 13).

Gráfico 13. Efeito da RipII na nocicepção induzida pela injeção intraplantar de PMA.

Veículo RipII-500

50

100

150

200

PMA 500 pmol/pata

*

Te

mp

o d

e L

am

be

du

ra (

s)

Os animais foram tratados com veículo e RipII 50 mg/kg (v.o.) 60 minutos antes da administração de PMA na pata

direita traseira. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (t-test; Mann

Whitney).

80

5.5.5 Participação da Proteína Quinase A (PKA)

A administração de RipII-50 mg/kg (9,750 ± 1,702) foi capaz de reduzir

significativamente o tempo de lambedura induzida por 8-Br-AMPc (ativador de PKA) quando

comparado com o veículo (20,83 ± 2,960) (Gráfico 14).

Gráfico 14. Efeito da RipII na nocicepção induzida pela injeção intraplantar de 8-Br-

AMPc.

Veículo RipII-500

5

10

15

20

25

*

8-Br-cAMP 500 nmol/pata

Te

mp

o d

e L

am

be

du

ra (

s)

Os animais foram tratados com veículo e RipII 50 mg/kg (v.o.) 60 minutos antes da administração de 8-Br-AMPc.

Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (T-test; Mann Whitney).

81

5.5.6 Participação dos Canais de potássio dependentes de ATP

O pré-tratamento com glibenclamida (2 mg/kg, i.p.) foi capaz de reverter o efeito

antinociceptivo da RipII (Glib+RipII: 25,00 ± 1,633), quando comparado ao grupo que recebeu

somente RipII (15,57 ± 1,110). Já o grupo tratado com glibenclamida sozinha (26,57 ± 1,925)

não interferiu no padrão das contorções quando comparado com o veículo (30,65 ± 1,809)

(Gráfico 15). Podemos observar também no gráfico que a glibenclamida foi capaz de reverter

(Diaz: 7,375 ±1,569) o efeito do diazóxido (Glib+Diaz: 18,75 ±2,704).

Gráfico 15. Influência do pré-tratamento com glibenclamida (2 mg/kg) sobre o efeito


Veículo Glib RipII-50 Glib+RipII-50 Diaz Glib+Diaz0

10

20

30

40

*

*

a

b

Nú

me

ro d

e c

on

torç

õe

s (

n)

Grupos receberam veículo, RipII (50 mg/kg; v.o.), glibeclamida (Glib- 2 mg/kg; i.p.), Glib+RipII, Diazóxido

(Diaz- 3 mg/kg; i.p.) 3 Glib+Diaz. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. *p<0,05 vs

Veículo; ap<0,05 vs RipII-50; bp<0,05 vs Diaz (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

82

5.5.7 Participação do Sistema Opióide

O pré-tratamento com a naloxona foi capaz de reverter o efeito antinociceptivo da

RipII (Nal+RipII: 22,83 ± 3,664), quando comparado ao grupo que recebeu somente RipII

(13,00 ± 1,453).

Já o grupo tratado com naloxona sozinha (26,91 ± 1,900) não interferiu no padrão

das contorções quando comparado com o veículo (31,53 ± 1,740) (Gráfico 16).

Gráfico 16. Influência do pré-tratamento com naloxona (1 mg/kg) sobre o efeito


Veículo Nal RipII-50 Nal+RipII Morf0

10

20

30

40

*

*

a

Nú

me

ro d

e c

on

torç

õe

s (

n)

Grupos receberam veículo, RipII (50 mg/kg; v.o.), naloxona (Nal- 1mg/kg; i.p.), Nal+RipII, morfina (5 mg/kg;

i.p.). Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. *p<0,05 vs Veículo e ap<0,05 vs RipII-

50 (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

83

5.5.8 Participação do sistema α2 adrenérgico

A ioimbina quando administrada sozinha apresentou uma semelhança no número

de contorções em relação ao controle (Ioimb.: 36,00 ± 3,941; Veículo: 40,09 ± 3,801).

Já a RipII-50 mg/kg foi capaz de reduzir o número de contorções (RipII-50: 8,500

± 1,701). O pré-tratamento com a ioimbina foi capaz de reverter o efeito antinociceptivo da

RipII (Ioimb.+RipII: 21,20 ± 2,267), quando comparado ao grupo que recebeu somente RipII

(Gráfico 17).

Gráfico 17. Influência do pré-tratamento com ioimbina sobre o efeito antinociceptivo da

RipII.

Veí

culo

Ioim

b.

RipII-

50

Ioim

b.+R

ipII-

50

Clon.

Ioim

b.+C

lon.

0

10

20

30

40

50

*

*

a

b

Nú

me

ro d

e c

on

torç

õe

s (

n)

Grupos receberam veículo, RipII (50 mg/kg; v.o.), ioimbina (Ioimb.-2,5 mg/kg; i.p.), Ioimb.+RipII, clonidina

(Clon.-0,15 mg/kg; i.p.). Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. *p<0,05 vs Veículo; ap<0,05 vs RipII-50; bp<0,05 vs Clon. (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

84

5.5.9 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3), colinérgicos

e dopaminérgicos

Tabela 8. Avaliação do mecanismo de ação da RipII utilizando modelo de nocicepção

induzida por ácido acético

Tratamento Dose (mg/kg) Número de Contorções

Veículo 0 36,88 ± 2,745

NAN 190 0,5 28,43 ± 3,077ns

RipII 50 17,82 ± 1,432*

NAN 190+RipII 0,5 + 50 18,38 ± 4,000ns

Veículo 0 25,42 ± 0,9806

RIT 1 20,63 ± 2,314ns

RipII 50 16,13 ± 1,109*

RIT+RipII-50 1 + 50 12,83 ± 2,845ns

Veículo 0 35,82 ± 2,621

OND 0,5 29,50 ± 2,630ns

RipII 50 16,13 ± 1,109*

OND + RipII 0,5 + 50 19,00 ± 2,982ns

Veículo 0 35,43 ± 3,303

RipII 50 19,00 ± 0,8944*

Atropina 1 30,25 ± 2,411ns

Atropina + RipII 1 + 50 15,67 ± 2,813ns

Veículo 0 30,79 ± 1,891

RipII 50 16,13 ± 1,109*

Haloperidol 0,2 26,82 ± 2,004ns

Haloperidol + RipII 0,2 + 50 14,33 ± 2,386ns

O número de contorções foi contado durante 20 min após a administração de ácido acético. NAN (NAN-190), RIT

(Ritanserina), OND (ondansetrona). *p<0,001 vs veículo; ns não houve significância em relação ao veículo.

ANOVA e Student-Newman-Keuls, post ho.

85

6 DISCUSSÃO

A busca por novos agentes tem levado a descoberta de muitas drogas clinicamente

úteis no tratamento de diversas patologias e nesse contexto, extratos vegetais de plantas

possuem uma grande diversidade de moléculas que podem atuar sinergicamente em múltiplos

alvos, e podem ser uma alternativa mais econômica (PATWARDHAN; VAIDYA, 2010;

MAROON et al., 2010).

Na grande maioria das vezes, o processo para a obtenção de compostos isolados de

espécies vegetais é trabalhoso com um baixo rendimento ao final do processo extrativo. Isso

leva a um desinteresse das indústrias no que se refere a exploração dessas substâncias,

dificultando ainda mais a descoberta de novos medicamentos a partir de espécies vegetais.

Então, atualmente se está investindo na síntese dessas substâncias de maneira planejada, pois

se mantém a atividade biológica sem a demora e os custos na obtenção do produto natural

(COSTA, 2009).

Os estudos mostram que mesmo as substâncias provenientes de plantas não são

desprovidas de toxicidade ou efeitos adversos, o que mostra a importância de se conhecer bem

as condições do seu uso seguro. Realizar uma avaliação de segurança torna-se importante, pois,

se pode caracterizar os efeitos tóxicos considerando o órgão alvo, tempo de exposição,

reversibilidade dos efeitos e tempo em que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem. É

um parâmetro necessário para qualquer estudo in vivo e in vitro (FDA, 2002).

Os estudos de toxicidade são utilizados para classificar as substâncias quanto a sua

capacidade de causar agravos ao organismo vivo. Existem dois ensaios que são mais utilizados,

pois diferenciam-se de acordo com a manifestação dos efeitos em relação ao tempo de

exposição, que são os testes agudos e crônicos. Tais estudos são obtidos por meio da realização

de testes, que envolvem a aplicação de protocolos pré-estabelecidos, principalmente por órgãos

regulatórios conhecidos mundialmente, como a Organização para Cooperação Econômica e

Desenvolvimento (Organization for Economic Cooperation and Development – OECD).

(SPINDLER; SJOBERG; KNUDSEN, 2000; MONTEIRO, 2010). Os protocolos preconizados

pela OECD são de grande aceitação pela comunidade científica na avaliação da toxicidade

aguda para qualquer tipo de substância.

O guia da OECD 425 (Método Up-and-Down) é um teste de toxicidade aguda que

apresenta boa reprodutibilidade, utiliza poucos animais e também reduz o sofrimento dos

mesmos. Consiste em uma administração sequenciada em animais individuais, onde a dose de

para cada animal é ajustada dependendo do resultado do animal anterior. Esse método objetiva

86

estimar a dose letal 50 (DL 50%- corresponde à dose que mata 50% dos animais) e permite

classificar a substância de acordo com sistemas internacionalmente aceitos (Globally

Harmonised System-GHS) (OECD, 2001).

De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, nenhum animal morreu

após o tratamento com doses crescentes de RipII até 2000 mg/kg. Pode-se inferir, portanto, que

a sua DL50 é superior a 2000 mg/kg (na faixa de 2000-5000 mg/kg), o que a enquadra na

categoria 5 (substâncias com baixa toxicidade) de acordo com o sistema de Classificação

Globalmente Harmonizado (GSH).

Dando sequência a avaliação da toxicidade da RipII, foi realizado o tratamento oral

de doses repetidas durante 28 dias (toxicidade subcrônica). Nesse teste, os efeitos tóxicos são

avaliados através da análise do peso corporal, exames bioquímicos, exames hematológicos e

análise macro e microscópica dos principais órgãos. Esse ensaio fornece resultados acerca da

exposição contínua de um composto, bem como os níveis de exposição com segurança.

No presente estudo, a administração por 28 dias de RipII 500mg/kg apresentou um

padrão semelhante quanto ao ganho de peso. Tal parâmetro é utilizado para indicar o

aparecimento dos efeitos tóxicos de uma substância no animal (PITA, 2011). Sinais de

toxicidade, como alterações na pele, olhos, mucosas, diarreia, letargia e aumento na salivação

também não foram observados nos animais tratados.

A toxicidade de uma substância pode comprometer alguns órgãos, e dentre eles, o

fígado e os rins são os mais susceptíveis. Por isso, torna-se importante a análise de parâmetros

que avaliem as funções hepáticas e renais (MOTTA, 2003).

As substâncias quando aplicadas por via oral, são absorvidas no trato

gastrointestinal e em seguida transportadas para o fígado para ser metabolizada ou não, para

então serem distribuídas pela corrente sanguínea. Então, a avaliação de parâmetros de função

hepática torna-se essencial para a análise toxicológica (BRUNTON et al., 2012).

A atividade das aminotransferases (alanina aminotransferase-ALT e aspartato

aminotransferas-AST) são utilizadas como indicativo de dano hepático. A ALT é uma enzima

encontrada no citosol dos hepatócitos que catalisa a transferência do grupo amino da alanina,

permanecendo o ácido pirúvico e é considerado um marcador sensível de dano hepatocelular,

podendo inclusive fornecer uma avaliação do grau de dano sofrido pelo fígado. Já a AST

catalisa a transaminação de L-aspartato e alfa-cetoglutarato em oxalacetato e glutamato e é

localizada nas mitocôndrias e aparece em altas concentrações em vários tecidos (fígado, rins,

coração e pâncreas) (MABEKU et al., 2007). Ambas aparecem elevadas mediante um dano

87

irreversível a membrana celular com o consequente extravasamento das enzimas. (HENRY,

2008).

No presente estudo, não foi observado alteração dessas duas enzimas nos grupos

tratados com RipII por 28 dias, bem como não houve alteração macro ou microscópica no

fígado dos animais, sugerindo uma ausência de toxicidade nesse órgão.

Os rins possuem como uma de suas funções a excreção de metabólitos, sendo

também necessário à sua análise em protocolos de toxicidade. Ureia e creatinina são parâmetros

úteis na avaliação da função renal (LI et al., 2011).

A creatinina é um composto nitrogenado formado pela hidrólise não enzimática da

creatina liberada durante a defosforilação da creatina fosfato. Uma vez gerada, ela entra na

circulação por difusão e é filtrada pelos rins, sendo excretada somente pela urina. Então, a

creatinina indica o ritmo da filtração glomerular onde níveis elevados indicam uma deficiência

na funcionalidade renal (HEYMSFIELD et al., 2005).

Já a ureia consiste no maior produto final do catabolismo de aminoácidos e

proteínas e é gerada no fígado pelo ciclo da ureia, onde é distribuída e excretada pelos rins. O

seu aumento pode ser devido a uma elevação do metabolismo dos aminoácidos e incremento

da reabsorção tubular, sendo um índice preditivo da insuficiência renal sintomática e de

desordens hepáticas (OSTERMANN et al., 2012).

No presente estudo, não foi observado alteração nos níveis de ureia e creatinina nos

grupos tratados com RipII por 28 dias, bem como não houve alteração macro ou microscópica

nos rins dos animais, indicativo de ausência de toxicidade renal.

O tecido hematológico é um dos alvos mais sensíveis dos efeitos adversos de

compostos tóxicos, pois possui um alto índice mitótico. É considerado um importante indicador

do estado fisiológico ou patológico onde sinais de toxicidade da medula óssea são avaliadas

através da análise de alterações do sangue periférico (EVAN, 2008). Quanto aos parâmetros

hematológicos não houve nenhuma diferença significativa em relação ao grupo controle

indicando que a RipII parece não interferir na produção de glóbulos vermelhos, bem como a

inexistência de processo inflamatório.

Após a classificação da RipII como uma substância que possui uma baixa

toxicidade, foram realizados os testes de modelagem molecular para verificar a possível

interação entre a RipII e alguns receptores envolvidos no processo nociceptivo.

88

A modelagem molecular consiste em diversas ferramentas de construção, edição,

análise e planejamento que envolve o entendimento das interações de uma molécula com o seu

receptor, permitindo uma análise profunda da estrutura molecular e prever uma possível

atividade farmacológica. Permite analisar o tamanho e o formato do grupo farmacofórico,

observar os aspectos estereoquímicos das moléculas e a sua relação com a atividade

farmacológica e predizer os mecanismos moleculares envolvidos no efeito (CHENG et al.,

2003). É uma opção extremamente válida de direcionamento para os testes in vivo,

racionalizando o uso de animais.

Uma das técnicas mais utilizadas é a do Docking, que estuda a interação energética

entre o ligante e o receptor utilizando um campo de força (McCONKEY, 2002). Essa interação

é específica e determinada por meio do ajuste do ligante no sítio do receptor via conformação

de menor energia (BURSULAYA et al., 2003). Nossos resultados de modelagem molecular

mostraram que a RipII possui fortes interações com os receptores TRPV1, TRPA1 e

bradicinina, o que nos levou a estudar também em modelos animais.

Estudos anteriores já mostraram a atividade anti-inflamatória da RipII em modelos

animais padronizados (CARVALHO et al., 2013), mas no presente trabalho tentou-se obter

avanços importantes quanto a sua ação antinociceptiva bem como o mecanismo de tal ação. O

trabalho foi inicialmente conduzido utilizando um modelo extensamente utilizado para avaliar

a atividade antinociceptiva de diversas substâncias que foi o modelo de contorções abdominais

induzidas por ácido acético.

O modelo permite avaliar a nocicepção visceral de origem inflamatória, pois a

injeção de ácido acético é capaz de provocar uma irritação local e desencadear a liberação de

diversos mediadores inflamatórios, como as prostaglandinas, histamina, bradicinina, substância

P, citocinas dentre outros (RIBEIRO et al., 2000). A injeção peritoneal também é capaz de

induzir um aumento de glutamato e aspartato no líquido cerebroespinhal, levando a um aumento

do processo doloroso (FENG et al., 2003). A nocicepção causada pelo ácido acético é mediada

também pela dissociação de prótons que ativam os canais TRPV1 e ASICs nos neurônios

aferentes primários (JULIUS; BASBAUM, 2001).

O resultado mostrou que RipII possui um efeito antinociceptivo que parece estar

relacionado a inibição da produção de mediadores pró inflamatórios ou dos canais TRPV1 e

ASIC. Foi observado que a DE50 (Dose efetiva 50) da RipII foi de 24,72 mg/kg e que a ação

antinociceptiva teve início após 30 minutos de sua administração e permaneceu significativo

por até 4 horas.

89

Estudos anteriores (CARVALHO, 2011) mostraram que a RipII possui efeito em

outros modelos animais, como na segunda fase da formalina (dados não publicados), o que

sugere uma possível atuação na sensibilização de nociceptores. Dessa forma, prosseguiu-se com

base nos resultados realizados, o modelo da hipernocicepção inflamatória induzida por diversos

agentes (carragenina, prostaglandina e epinefrina) utilizando o filamento de Von Frey.

O uso de filamentos de Von Frey é bastante utilizado para avaliar através de

estímulo mecânico crescente (alodínia ou hiperalgesia) a sensibilidade tecidual da pata traseira

do animal (CUNHA et al., 2004). O teste é realizado utilizando um transdutor de pressão

adaptado a um contador digital de força expressa em gramas, onde as alterações nos limiares

nociceptivos são avaliadas exercendo-se uma pressão crescente na pata do animal até a

produção de uma resposta na pata estimulada (JENSEN et al., 1986). Com essa técnica, o

processo doloroso deixa de ser subjetivo.

O primeiro teste realizado foi a hipernocicepção induzida por carragenina. A

administração intraplantar de carragenina é capaz de promover uma reação inflamatória local,

com vasodilatação, extravasamento plasmático e liberação de mediadores inflamatórios.

Também é capaz de induzir a sensibilização dos nociceptores para estímulos mecânicos e

térmicos, que inicia a liberação de uma cascata de diversas citocinas pró-inflamatórias.

(PINHEIRO; CALIXTO, 2002; SMITH et al.; 1998; CAMPOS et al., 1999; CUNHA et al.,

2005).

Outras pesquisas mostram que a nocicepção induzida por carragenina leva a

produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) que induz a produção de interleucinas, que

por sua vez estimulam a formação de COX-2 (bem como prostaglandina E2) além da produção

e liberação de aminas simpáticas e de bradicinina. (FERREIRA et al., 1993; LORENZETTI et

al., 2002).

O teste executado mostrou que a RipII foi capaz de reduzir a hipernocicepção

induzida pela carragenina, indicando um mecanismo amplo, sendo necessário realizar, dessa

forma, outros testes na tentativa de elucidar a via de ação desse composto.

A reação inflamatória causada pela carragenina leva ao aparecimento de espécies

reativas do oxigênio (EROS) e diversos mediadores inflamatórios, gerando um estresse

oxidativo, que contribui no aumento dos danos ao tecido e no processo doloroso (VANE et al.,

1998). As células ativadas liberam EROS que interagem com diversas moléculas levando a

lesão de proteínas, DNA e lipídios no local do processo inflamatório, podendo induzir também

a peroxidação lipídica (CIENCEWICKI et al., 2008). O estresse oxidativo está envolvido em

processos inflamatórios como pneumonias, asma, diabetes, aterosclerose e doenças

90

neurodegenerativas, sendo de extrema importância o seu controle para que ocorra uma redução

da severidade de tais patologias (LIMON-PACHECO; GONSEBATT, 2009).

Uma das consequências da manutenção do estresse oxidativo é a peroxidação

lipídica ou lipoperoxidação. Ela resulta da ação dos radicais livres sobre os lipídios insaturados

das membranas celulares, levando a diversas alterações que podem culminar na sua destruição.

Essas alterações podem levar a uma perda da seletividade com mudança no fluxo de íons e

outras substâncias e comprometendo os componentes da matriz (CARTA et al., 2009).

Um teste bastante utilizado para avaliar o nível de lesão e o grau de lipoperoxidação

de um tecido é a determinação dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS). Essa quantificação é uma análise válida para uma possível ação protetora de uma

substância.

Nossos resultados mostraram que a carragenina aumentou significativamente os

níveis de malonildialdeído (MDA) proveniente do processo inflamatório, entretanto, o

tratamento com RipII em ambas as doses foi capaz de reduzir os níveis de MDA. Outro

mediador importante envolvido no processo gerado pela carragenina é produção de óxido

nítrico (NO). A enzima iNOS é ativada em resposta a estímulos inflamatórios e libera grandes

quantidades de NO, que interage com EROS, formando outras espécies reativas, denominadas

espécies reativas do nitrogênio (ERNS). O NO é um potente vasodilatador capaz de aumentar

a permeabilidade vascular, quimiotaxia de leucócitos e o edema através de mudanças no fluxo

sanguíneo local, além de aumentar a produção de prostaglandinas pró inflamatórias

(MONCADA et al., 1991; DAVIDGE et al., 1995, SALVEMINI et al., 1994).

O tratamento com RipII foi capaz de reduzir os níveis de nitrito nas amostras de

patas inflamadas com carragenina. Esse resultado analisado em conjunto com o TBARS sugere

um papel antioxidante que pode estar auxiliando diretamente na redução do processo

inflamatório e nociceptivo.

Os mediadores inflamatórios são os principais responsáveis pela diversidade de

eventos que ocorre durante a transmissão da dor tanto no SNC como na periferia. Como existe

uma infinidade de mediadores, pode-se inferir que uma substância pode atuar por diferentes

vias, como por exemplo, alterando a excitabilidade neuronal ou até mesmo bloqueando a síntese

de mediadores ao interagir diretamente com uma enzima (PARADA et al., 2003; VERGOLE,

2008).

As prostaglandinas, geradas a partir do ácido araquidônico, são mediadores

inflamatórios responsáveis pela dor inflamatória e também pela sensibilização dos

nociceptores. Estudos mostram que a dor é precedida pela inflamação através de interações

91

entre citocinas, que levam a liberação de prostaglandinas e aminas simpáticas (VERRI et al.,

2005).

A PGE2 é uma das principais prostaglandinas pró nociceptivas liberadas na

periferia em grande quantidade no local da injúria, sendo capaz de atingir seu pico em 3 horas

após a administração (NAGATA et al., 2005). A ação da sensibilização da PGE2 depende

principalmente da ativação de seus receptores EP e a modulação entre canais iônicos, adenilil

ciclase/AMPc e ativação de PKA (NARUMIYA, FITZGERALD, 2001; BREYER et al., 2001).

A ativação dessas vias leva a uma fosforilação dos canais de sódio, inibição das correntes de

potássio dependente de voltagem e influxo de cálcio em fibras nociceptivas. Essa alteração de

íons leva a uma redução no limiar, causando um aumento na excitabilidade e aumento da

liberação de neurotransmissores, como o glutamato. (VANEGAS; SCHAILBE, 2001;

AHMADI et al., 2002).

Devido a essa diversidade de efeitos, a PGE2 é extensamente utilizada em modelos

animais de nocicepção, como um indutor de hiperalgesia (DEROW et al., 2007). Estudos

mostram também que metabólitos da PGE2 podem excitar diretamente alguns neurônios

nociceptivos através da ativação direta do receptor TRPA1 (TAYLOR-CLARK et al., 2008).

No modelo utilizado, a RipII foi capaz de reverter a hipernocicepção induzida pela PGE2 na 3°

hora após a administração.

Outros mediadores importantes no processo de nocicepção são as catecolaminas,

como a noradrenalina, adrenalina e dopamina.

A epinefrina liga-se aos receptores chamados adrenérgicos, que se dividem em duas

classes principais denominadas α e β. Todas as classes são membros da família de receptores

acoplados a proteína G, que por sua vez, estão acopladas a cascatas de sinalização distais. Os

receptores α1 efetuam sua sinalização através de vias mediadas por Gq, que geram IP3, que

mobiliza as reservas de cálcio e DAG que ativa a PKC; já os receptores β ativam a proteína Gs

e adenilil ciclase com aumento de AMPc (GOLAN et al., 2014).

Já os receptores α2 ativam a proteína Gi levando a uma inibição da adenilil ciclase,

ativação dos canais de K+ e inibição dos canais de cálcio neurais, o que resulta na inibição da

liberação de neurotransmissores no neurônio-alvo. A literatura mostra que esse receptor está

relacionado com a resposta inibitória no corno dorsal da medula, reduzindo a excitabilidade e

possuindo assim uma capacidade analgésica (GOLAN et al., 2014).

O produto final da síntese das catecolaminas, a epinefrina é capaz de produzir uma

redução do limiar de nociceptores e um aumento da excitabilidade neural, através da ativação

92

do receptor beta-adrenérgico e consequente envolvimento do AMPc e PKA. (MANJAVACHI

et al., 2010).

Os nossos resultados mostraram que a RipII foi capaz de reduzir a hipernocicepção

induzida pela Epinefrina, o que nos leva a inferir que haja uma relação entre a substância do

nosso estudo e o receptor α2, já que ele está diretamente relacionado com a capacidade

analgésica dessa via.

Objetivando avaliar o envolvimento da RipII na fase inicial da nocicepção, foi

investigado no presente trabalho, seu efeito frente aos canais e receptores que regulam estímulos

térmicos e químicos presentes na periferia. Desta forma, a RipII foi testada em modelos de

nocicepção induzida pela administração intraplantar de capsaicina, cinamaldeído, mentol,

salina ácida e bradicinina.

A sensibilidade a dor térmica é detectada através de neurônios sensoriais primários,

entre os quais podemos destacar a família dos receptores de potencial transitório (TRP)

(GOLAN et al., 2014). Essa família codifica proteínas de membrana que funcionam como

canais iônicos não seletivos que podem ser ativados por uma variedade de estímulos e quando

ativados levam a um influxo de íons e depolarização e o início de um potencial de ação

(CLAPHAM, 2003).

Os receptores de potencial transitório da subfamília vanilóide 1 (TRPV1) são

expressos principalmente em neurônios sensoriais periféricos (fibras C e Aδ) e podem ser

ativados por temperaturas acima de 42°C, por compostos vanilóides como a capsaicina e pH

abaixo de 6,5. O TRPV1 está diretamente envolvido no processo nociceptivo, pois participa na

detecção de estímulos térmicos e químicos, bem como na integração de tais estímulos. Estudos

mostraram que a ativação de TRPV1 provoca a liberação de neuropeptídios, mediadores

inflamatórios, glutamato, óxido nítrico, substância P e que essa liberação tem relação com a

proteína quinase C (PKC) (SANTOS et al., 1997b; SAKURADA et al., 2003; SWEITZER et

al., 2004). Bem como vários mediadores como a bradicinina, glutamato, PGE2 são capazes de

sensibilizar o TRPV1 indiretamente através da ativação da fosfolipace C, com consequente

ativação da PKC ou PKA (CHUANG et al., 2001). Há também uma relação importante entre o

TRPV1 e o glutamato, onde a ativação do TRPV1 induz a liberação de glutamato, então o seu

bloqueio reduz a nocicepção causada pelo glutamato (MEDVEDEVA; KIM; USACHEV,

2008).

Resultados anteriores (CARVALHO, 2011) mostraram que a RipII foi capaz de

reduzir a nocicepção induzida pela capsaicina quando administrada por via oral (dados já

pulbicados) e no presente estudo, o efeito foi observado quando foi co-administrada por via

93

intraplantar, sugerindo também uma ação diretamente nos receptores localizados nas fibras

aferentes primárias. Esse resultado sugere também que a RipII ao atuar no bloqueio do TRPV1

pode causar a redução da liberação de glutamato.

Os canais de cátions do receptor de potencial transiente da subfamília anquirina

(TRPA1) são expressos primariamente em neurônios nociceptivos de pequeno diâmetro e

ativados por compostos como: canela, alicina, sementes de mostarda, irritantes ambientais,

bradicinina (B2) e temperaturas < 17°C (KATSURA et al., 2006). O TRPA1 atua

despolarizando os nociceptores frente aos estímulos nocivos que ativam vias envolvendo a

fosfolipase C, PKA e receptor ativado por protease 2 (JORDT et al., 2004; WANG et al., 2008).

Além disso, os receptores TRPA1 são coexpressos com os canais TRPV1, e essa coexpressão

reforça o envolvimento mútuo e/ou sinergia de diferentes mecanismos envolvendo os dois

receptores (STORY et al., 2003; KOBAYASHI et al., 2005).

A literatura já demonstra em vários estudos o envolvimento do TRPA1 no processo

nociceptivo, o qual pode estar envolvido na hiperalgesia mecânica induzida no processo

inflamatório (PETRUS et al., 2007). Camundongos com delação gênica para TRPA1

mostraram uma redução no comportamento nociceptivo induzido pela formalina

(MACPHERSON et al., 2007) e o bloqueio do TRPA1 reduz a hiperalgesia mecânica induzida

por CFA (EID et al., 2008). Foi demostrado que o TRPA1 participa da hiperalgesia induzida

pela carragenina, PGs, PKA e epinefrina (FERREIRA; LORENZETTI; POOLE, 1993b).

Outro receptor envolvido no processo nociceptivo é o receptor TRPM8, que é

considerado um dos principais receptores de frio nos neurônios aferentes primários e que pode

ser ativado por substâncias como o mentol, eucaliptol e temperaturas próximas a 22°C

(ANDERSSON et al., 2007; ROSSI et al., 2006). O mentol é capaz de induzir sensações

nociceptivas de ardor ou formigamento (WASNER et al., 2004; GREEN, 2005) e quando

aplicado topicamente pode induzir hiperalgesia ao frio (NAMER et al., 2005).

Os resultados do presente trabalho mostraram que a RipII é capaz de inibir a

nocicepção causada pelo cinamaldeído e pelo mentol, sugerindo uma ação sobre os receptores

TRPA1 e TRPM8.

Uma análise conjunta dos resultados, mostra que a RipII parece se tratar de uma

substância não seletiva para os canais TRP, pois possui afinidade semelhante para as diversas

subfamílias. Dados anteriores ainda não publicados mostram que a RipII também é capaz de

reduzir a nocicepção causada pelo glutamato, o que nos leva a sugerir que ela seja uma molécula

capaz de atuar em diferentes sítios com uma forte interação entre o sistema glutamatérgico e os

TRP´s.

94

Além dos TRP, outros canais que participam da transdução do sinal nociceptivo são

os canais iônicos sensíveis ao ácido (ASICs). Pertencem a superfamília de canais de Na+

epiteliais degenerina e são ativados por prótons extracelulares e modulado por diversos cátions

e proteínas quinases (PKC e PKA), tendo sua expressão aumentada mediante alguns

mediadores inflamatórios (bradicinina, serotonina e IL-1) (MAMET et al., 2002). Existem 7

subtipos de ASICs, sendo que o subtipo 3 é expresso nos neurônios sensoriais e o mais sensível

para detectar as alterações de pH (SMITH et al., 2007). Estudos mostram que esses canais

possuem a capacidade de detectar variações de pH na faixa fisiológica e patofisiológica e estão,

portanto, envolvidos no processo de dor inflamatória crônica e reações isquêmicas (WANG et

al., 2006; DUBÉ; ELAGOZ; MANGAT, 2009).

O presente estudo mostrou que a RipII foi capaz de reduzir a nocicepção causada

pela salina ácida, já que foi realizado o bloqueio dos receptores TRPV1 (que também podem

ser ativados por prótons) pela capsazepina. Pode-se sugerir então que a RipII possa agir através

de algum efeito de neutralização dos prótons extracelulares.

A bradicinina (BK), considerada essencial para o processo inicial da dor, bem como

para a produção de hiperalgesia, atua através da estimulação dos receptores de bradicinina B1

e B2 (ambos acoplados a proteína G). O receptor B2 é constitutivo em todo o sistema nervoso

e responsável pela fase inicial da dor inflamatória, enquanto a expressão de B1 é induzida em

resposta a alguns estímulos nocivos e relacionada com processos patológicos persistentes

(RAHID et al., 2004; SANTOS et al., 1997a). Os efeitos da BK são provenientes da ativação

da fosfolipase C e/ou fosfolipase A2, com a consequente liberação de Ca2+ e PKC para fosforilar

receptores de membranas e canais iônicos (CALIXTO et al., 2001).

A ativação do receptor B2 provoca hiperalgesia térmica e que camundongos

nocaute para TRPV1 apresentam pouca sensibilidade térmica no local da inflamação tecidual,

sugerindo que a ativação de B2 ativa uma isoforma específica da PKC (PKCε), que fosforila o

TRPV1 facilita a sua abertura (WANG et al., 2008).

Na periferia, a BK exerce ações pró inflamatórias, como a liberação de

prostaglandinas, citocinas, óxido nítrico, histamina, radicais livres, estimulam e sensibilizam os

neurônios sensoriais e é capaz de induzir dor pela estimulação direta e sensibilização de

nociceptores (DRAY; PERKINS, 1997; RANG, URBAN, 1995; SHUGRUE et al., 2003). O

SNC também apresenta todos os componentes das cininas em regiões como córtex, tronco

encefálico, hipotálamo, onde sugere-se o envolvimento da BK na modulação central da dor

(PARPURA et al., 1994; NODA et al., 2003). A literatura mostra que astrócitos são ativados

95

por BK que aumentam a concentração de cálcio intracelular e também a liberação de glutamato

e ácido araquidônico (ONGALI et al., 2003).

Há uma forte relação entre a BK e as prostaglandinas, onde a ativação de B2

estimula a produção de PGs através da fosfolipase A2. Trabalhos mostram que a hiperalgesia

induzida pela administração intraplantar de BK é mediada por prostanóides, (PETHO et al.,

2012; OLIVA et al., 2006). Tal relação foi observada no presente achado, pois a RipII foi capaz

de reduzir a nocicepção pela BK sugerindo um efeito direto sobre o receptor B2, bem como um

efeito indireto por atuar na redução do efeito de PGE2.

Em outra série de experimentos, foi analisado a relação entre o efeito

antinociceptivo da RipII e as proteínas quinases C e A. Essas proteínas possuem mecanismos

regulatórios importantes na transmissão do sinal nociceptivo, pois a maioria dos mediadores

químicos sensibilizadores atuam sobre receptores acoplados a proteína G ou tirosinoquinase de

receptores expressos nos neurônios nociceptivos. Isso leva a uma ativação da fosfolipase C e

A2 intensificando assim, a resposta periférica (DRAY; PERKINS, 1993; GOLAN et al., 2014).

A proteína quinase C (PKC) também está relacionada com a transdução do estímulo

nocivo e a hiperalgesia, está envolvida em diversas vias de sinalização glutamatérgica, TRPs,

BK e PG. (VELAZQUEZ et al., 2007). É uma enzima que pertence a uma família de

serina/treonina quinases que possui diversas isoformas (α, βI, βII, γ, δ, ε, η, θ) que podem ser

dependentes de Ca2+ e ativadas pelo DAG, independentes de Ca2+ e ativadas pelo DAG ou

ativadas por outros componentes lipídicos (MOCHLY-ROSEN; KAUVAR, 1998; WAY et al.,

2000; SOUSA et al., 2002). É amplamente distribuída nos tecidos e, sua ativação está associada

à sua translocação do citoplasma para a membrana ou para diferentes compartimentos celulares,

onde exerce importante papel na regulação de proteínas de membrana como canais iônicos e

receptores (FERREIRA et al., 2005; POOLE et al., 2007).

A ativação da PKC induz a produção de mediadores inflamatórios que contribuem

para a ativação ou sensibilização a estímulos térmicos e mecânicos dos nociceptores. Pode ser

ativada nas fibras aferentes periféricas pela BK, PGs e citocinas, enquanto nos neurônios da

medula, influencia na liberação de glutamato e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

(CGRP) (BHAVE et al., 2003; VELAZQUEZ; MOHAMMAD; SWEITZER, 2007). Outros

estudos mostram que a sua ativação estimula a produção de algumas citocinas inflamatórias,

aumenta a expressão do gene da COX-2, fosforila as subunidades dos receptores NMDA para

o glutamato e aumenta o fluxo de cátions através do TRPV1 e ASICs. A PKC fosforila o

receptor TRPV1, fazendo com que ele se abra promovendo assim, o influxo de cátions em

96

temperaturas mais baixas que o normal, sensibilizando o receptor (MILLER et al., 1997;

WANG et al., 2001; VELAZQUEZ et al., 2007).

Os presentes achados mostram que a administração intraplantar de miristato acetato

de forbol (PMA) causou nocicepção em animais por ligar-se a PKC e estimular a atividade

catalítica da quinase e que a RipII foi capaz de reduzir tal parâmetro, sugerindo a participação

da PKC no seu mecanismo antinociceptivo o qual pode ser através da inibição da translocação

do citosol para a membrana ou pela sensibilização dos receptores TRPV1.

A PKA altera as atividades de proteínas alvo, fosforilando grupos específicos de

serina e treonina e pode ser ativada por concentrações de AMPc e óxido nítrico

(MOHAPATRA; NAU, 2003; MALMBERG et al., 1997). É capaz de fosforilar o canal de

sódio Nav1.8, resultando em diminuição do seu limiar de ativação e aumento da corrente; os

receptores AMPA de glutamato através da ativação dos receptores para o CGRP e o receptor

TRPV 1que leva a uma potencialização da sua resposta por redução da dessensibilização

(PREMKUMAR et al., 2005; KAUER; GIBSON, 2009). A ativação de PKA também está

diretamente relacionada com a hiperalgesia inflamatória induzida por PGE2 e BK (ENGAND

et al., 1996; FERREIRA et al., 2005).

Os resultados deste trabalho mostraram que a aplicação de 8-Br-AMPc (ativador

de PKA) causou uma intensa nocicepção e que a RipII foi capaz de reduzir esse parâmetro,

indicando o envolvimento da PKC no seu efeito antinociceptivo.

Em resposta aos estímulos nociceptivos, nosso corpo possui mecanismos de

controle que modulam o estímulo doloroso, permitindo que tais estímulos sejam seletivamente

inibidos alterando assim, a transmissão para os centros superiores (YOSHIMURA, FURUE,

2006; MILLAN, 1999). Os principais neurotransmissores inibitórios no corno dorsal da medula

são os peptídeos opioides, a norepinefrina e a serotonina, que parecem inibir a excitação dos

neurônios de segunda ordem frente a um estínulo nocivo (MILLAN, 2002).

Visando ampliar o conhecimento do mecanismo antinociceptivo da RipII, foi

analisado o seu efeito frente a pontos chave da via inibitória da dor como os canais de potássio,

sistema opioide e α2 adrenérgico.

Os canais de potássio são de extrema importância no controle da excitabilidade

neuronal. Eles controlam o potencial de repouso das células neuronais e também a recuperação

da voltagem após um potencial de ação. A ativação desses canais causa um aumento do efluxo

de potássio, o que leva a uma hiperpolarização e redução da geração do potencial de ação,

reduzindo assim as respostas neuronais o que resulta em uma antinocicepção (SACHS et al.,

2002; VERRI et al., 2006). Ações pós-sinápticas dos receptores α2-adrenérgicos, μ e δ opióides

97

são mediados primariamente pela abertura dos canais de potássio (GALEOTTI et al., 1999;

RODRIGUES, DUARTE, 2000; GOLAN et al., 2014).

Os resultados deste trabalho mostraram que o pré tratamento dos animais com a

glibenclamida (um bloqueador de K+ATP) foi capaz de reverter parcialmente o efeito

antinociceptivo da RipII, sugerindo o possível envolvimento desses canais no mecanismo


Os opioides inibem a transmissão sináptica e são liberados em vários locais do SNC

em resposta ao estímulo nocivo. Produzem analgesia através de sua ação no cérebro, no tronco

encefálico, na medula espinhal e nas terminações periféricas dos neurônios aferentes primários

(BAILEY et al., 2004). Os receptores opioides são divididos em 3 subtipos (µ, δ e κ) e

pertencem a família dos receptores acoplados a proteína G. Os efeitos da sua sinalização

consiste na redução da condução pré-sináptica do cálcio, inibindo a liberação de

neurotransmissores como o glutamato e aumento da condutância pós-sináptica de potássio

reduzindo a geração de um potencial de ação (KING et al., 1999; GOLAN et al., 2014). Assim,

o efeito final é inibitório a nível celular.

Nesta pesquisa, tanto a morfina quanto a RipII apresentaram um efeito

antinociceptivo no modelo de contorções induzidas por ácido acético. Entretanto, o pré-

tratamento com a naloxona (antagonista opioide), conseguiu reverter de forma significativa o

efeito antinociceptivo promovido pela RipII e pela morfina, sugerindo a relação do efeito

antinociceptivo da substância com o sistema opioide.

A literatura mostra que a ativação dos receptores α2 adrenérgicos exerce um poder

antinociceptivo associado a inibição descendente. As principais fontes de projeções

noradrenérgicas diretas para a medula espinhal são os núcleos A5, A6 e A7, e são nessas regiões

onde podem ocorrer as respostas pré e pós-sinápticas. A literatura mostra que a clonidina

(agonista seletivo do reeptor α2) é capaz de causar antinocicepção que é revertida por

antagonistas seletivos dos mesmos receptores. As ativações de tais receptores produzem não

somente um efeito antinociceptivo, como também um efeito sinérgico com agonistas dos

receptores µ. Os opioides espinhais inibem a liberação das vesículas sinápticas dos aferentes

primários e hiperpolarizam os neurônios pós-sinápticos. (FIELDS; BASBAUM;

HEINRICHER, 2005; PERTOVAARA, 2006).

O presente trabalho demonstrou que a ioimbina reverteu significativamente o efeito

antinociceptivo da RipII e a clonidina causou significativa redução da nocicepção no modelo

estudado e tal efeito bloqueado pela ioimbina (antagonista α2). Podemos então sugerir o

98

envolvimento de pelo menos em parte dos receptores adrenérgicos. Tal resultado corrobora

também com os resultados anteriores da hipernocicepção mecânica.

O efeito antinociceptivo da RipII foi investigado em animais tratados com

antagonistas dos receptores 5-HT1 (NAN-190), 5HT-2A/C (ritanserina) e 5-HT3 (ondansetrona)

para a verificação da participação do sistema serotonérgico. Visto que estudos mostram que a

inibição descendente da nocicepção é mediada por neurônios serotonérgicos que se projetam

no tronco espinhal e liberam serotonina na medula (RAHMAN et al., 2009). Os resultados

mostraram que não há a participação do sistema serotonérgico na atividade analgésica da RipII.

Outra parte do presente estudo foi avaliar o possível envolvimento de outras vias

de neurotransmissão que podem modular o processo nociceptivo no mecanismo antinociceptivo

da RipII, como as vias colinérgica e dopaminérgica.

Sabe-se que o sistema colinérgico modula parcialmente a analgesia mediada pelos

sistemas adrenérgico e serotonérgico (JONES et al., 2007). Já em relação ao sistema

dopaminérgico, os receptores D2, D3 e D4 ativam os canais de potássio, conferindo

características analgésicas (MANSIKKA et al., 2005). No entanto, esses sistemas parecem não

estar envolvidos na ação antinociceptiva da RipII, visto que o pré-tratamento com atropina e

haloperidol não foram capazes de reverter o efeito antinociceptivo da substância.

99

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

De acordo com o presente estudo constata-se que:

A RipII mostrou ser segura em camundongos, pois não apresentou efeitos nocivos nos

testes de toxicidade aguda e crônica, onde a sua DL50 é superior a 2000 mg/kg

Na modelagem molecular, a RipII apresentou uma forte interação entre os receptores

TRPV1, TRPA1 a bradicinina

O tratamento oral com RipII foi capaz de causar uma antinocicepção no modelo de

contorções induzida por ácido acético, com DE50 de 24,72 mg/kg e efeito que se inicia

30 minutos após a sua administração e dura por até 4h

A RipII apresenta propriedades antihiperalgésica frente a estímulos como a carragenina,

PGE2, epinefrina e bradicinina bem como uma ação antioxidante parcial por reduzir os

níveis de nitrito e espécies reativas do ácido tiobarbitúrico.

RipII administrada por gavagem ou por via intraplantar apresentou um efeito

antinociceptivo que parece envolver os receptores TRPV1, TRPA1, TRPM8 e ASICs.

O efeito antinociceptivo da RipII parece envolver também PKC e PKA.

Na via descendente inibitória, a RipII parece atuar sobre os sistemas opióide e α2

adrenérgico.

Seu efeito parece não estar relacionado com o sistema serotonérgico, colinérgico e

dopaminérgico.

100

8 CONCLUSÃO

O conjunto de resultados obtidos no presente estudo demonstra que a RipII exerce

um efeito antinociceptivo significativo. Tal efeito a nível periférico parece ser mediado em

parte, pelo bloqueio da ativação dos receptores TRP, ASICs e BK, ou seja, os principais

estímulos térmicos e químicos responsáveis pelo processo de transdução do processo

nociceptivo. Já a nível de modulação do controle da dor, a ação analgésica da RipII parece

envolver os canais de potássio e os sistemas opioides e α2-adrenérgico.

Diante do exposto, podemos sugerir que a RipII constitui uma molécula interessante

para o desenvolvimento de fármaco terapeuticamente útil no controle da dor aguda e crônica.

101

REFERÊNCIAS

AHMADI, S.; LIPPROSS, S.; NEUHUBER, W. L.; ZEILHOFER, H. U. PGE(2) selectively

blocks inhibitory glycinergic neurotransmission onto rat superficial dorsal horn neurons.

Nature Neuroscience, v. 5, n. 1, p. 34-40, 2002.

ALCÂNTARA, J. M.; YAMAGUCHI, K. K. L.; SILVA, J. R. A.; VEIGA JÚNIOR, V. F.

Composição química e atividade biológica dos óleos essenciais das folhas e caules de

Rhodostemonodaphne parvifolia Madriñán (Lauraceae). Acta Amazônica, v. 40, n. 3, p. 567-

572, 2010.

ALMEIDA, T. F.; ROIZENBLATT, S.; TUFIK, S. Afferent pain pathways: a neuroanatomical

review. Brain Research, v. 1000, p. 40-56, 2004.

ALMEIDA, R. N.; ARAÚJO, D. A. M.; GONÇALVES, J. C. R.; MONTENEGRO, F. C.;

SOUSA, D. P.; LEITE, J. R.; MATEEI, R.; BENEDITO, M. A. C.; CARVALHO, J. G. B.;

CRUZ, J. S.; MAIA, J. G. S. Rosewood Oil Induces Sedation and Inhibits Compound Action

Potential in Rodents. Journal of Ethnopharmacology, v. 124, n. 3, p. 440-443, 2009.

ALTMAN, R. B.; DUGAN, J. M. Defining Bioinformatics and Structural Bioinformatics.

2nd ed., Wiley-Blackwell, 2005.

AMAZONAS, D. R.. Variabilidade química e atividade antimicrobiana de espécimes

indicados como pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) do oeste do Pará. 2012. 70f.

Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais da Amazônia) - Programa de Pós-Graduação em

Recursos Naturais da Amazônia, Universidade Federal do Oeste do Pará, Santarém, 2012.

ANDERSSON, D.A.; NASH, M.; BEVAN, S. Modulation of the cold-activated channel

TRPM8 by lysophospholipids and polyunsaturated fatty acids. J Neurosci. v.27, p. 3347–3355,

2007

ARAÚJO, F. L. O.; MELO, C.T. V.; ROCHA, N. F. M.; MOURA, B. A.; LEITE, C. P.;

AMARAL, J. F.; BARBOSA-FILHO, J. M.; GUTIERREZ, S. J. C.; VASCONCELOS, S. M.

M.; VIANA, G. S. B.; SOUSA, F. C. F. Antinociceptive effects of (O-methyl)-N-benzoyl

tyramine (riparin I) from Anibariparia (Nees) Mez (Lauraceae) in mice. Naunyn-

Schmiedeberg’s Archives Pharmacology, v. 380, p. 337-344, 2009.

ATTALA, N.; CRUCCU, G; BARON, R.; HAANPÄÄ, M.; HANSSON, P.; JENSEN, T. S.;

NURMIKKO, T. EFNS guidelines on the pharmacological treatment of neuropathic pain: 2009

revision. European Journal Neurology, v. 17, n. 9, p. 1113-e88, 2010.

BAILEY, C. P.; KELLY, E.; HENDERSON, G. Protein kinase C activation enhances

morphine-induced rapid desensitization of µ-opioid receptors in mature rat locus coeruleus

neurons. Molecular Pharmacology, New York, v. 66, n. 6, p.1592- 1598, dec. 2004.

BARBOSA-FILHO, J. M.; YOSHIDA, M.; GOTTLIEB, O. R.; BARBOSA, R. C. S. B. C.;

GIESBRECHT, A. M.; YONG, M. C. M. Benzoyl esters and amides, stryrylpyrones and

neolignans from the fruits of Aniba riparia. Phytochemistry, v. 26, p. 2615-2617, 1987.

102

BAUTISTA, D. M.; JORDT, S. E.; NIKAI, T.; TSURUDA, P. R.; READ, A. J.; POBLETE,

J.; YAMOAH, E. N.; BASBAUM, A. I.; JULIUS, D. TRPA1 mediates the inflammatory

actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell, v. 124, n. 6, p. 1269-1282, 2006.

BESSON, J. M. The neurobiology of pain. The Lancet, v. 353, n. 9164, p. 1610-1615, 1999.

BESSON, J. M.; CHAOUCH, A. Peripheral and spinal marchanism of nociception.

Physiological Reviews, v. 67, n. 1, p. 67-186, 1987.

BHAVE, G.; HU, H. J.; GLAUNER, K. S.; ZHU, W.; WANG, H.; BRASIER, D. J.; OXFORD,

GERRY S.; GEREAU, R. W. Protein kinase C phosphorylation sensitizes but does not activate

the capsaicin receptor transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1). Proceeding of the

National Academy of Sciences of the United States of America, v. 100, n. 21, p. 12480-5,

2003.

BLYTH, F. M. Chronic pain--is it a public health problem? Pain, v. 137, n. 3, p. 465-6, 2008.

BREYER, R. M.; BAGDASSARIAN, C. K.; MYERS, S. A.; BREYER, M. D. Prostanoid

receptors: subtypes and signaling. Annual Reviews Pharmacology and Toxicology, v. 41, p.

661-690, 2001.

BROTTO, M. L.; SANTOS, E. P.; BAITELLO, J. B. Lauraceae no morro dos perdidos

(Floresta Atlântica), Paraná, Brasil. Rodriguésia, v. 60, n. 2 p. 445-459, 2009.

BRUNTON, L. L.; CHABNER, B. A.; KNOLLMANN, B. C. As Bases Farmacológicas da

Terapêutica de Goodman & Gilman. 12 ed. Rio de Janeiro: Mcgraw Hill, 2012.

BRUSCATTO, C. A. Tratamento das dores musculares crônicas: comparação de dois

métodos fisioterapêuticos. 2006. 172 f. Dissertação (Mestrado em Neurociências) – Programa

de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Neurociências, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, 2006.

BURSULAYA, B. D., TOTROV, M., ABAGYAN, R., BROOKS, C. L. Comparative study of

several algorithms for flexible ligand docking. Journal of computer-aided molecular design,

v. 17, p. 755-763, 2003

CALIXTO, J. B. Efficacy, safety, quality, control, marketing and regulatoy guidelines for

herbal medicines (phytotherapeutic agents). Brazilian Journal of Medical and Biological

Research, v. 33, p. 179-189, 2000.

CALIXTO, J. B.; CABRINI, D. A.; FERREIRA, J.; CAMPOS, M. M. Inflammatory pain:

kinins and antagonists. Current Opinion in Anaesthesiology, v. 14, n. 5, p. 519-526, 2001.

CAMPOS, R. O. P.; ALVES, R. V.; FERREIRA, J.; KYLE, D. J.; CHAKRAVARTY, S.;

MAVUNKEL, B. J.; CALIXTO, J. B. Oral antinociception and oedema inhibition produced by

NPC 18884, a non-peptidic bradykinin B2 receptor antagonist. Naunyn Schmiedeberg’s

Archives of Pharmacology, Berlin, v. 360, n. 3, p. 278-286, sep. 1999.

103

CARTA, S.; CASTELLANI, P.; DELFINO, L.; TASSI, S.; VENÈ, R.; RUBARTELLI, A.

DAMPs and inflammatory processes: the role of redox in the different outcomes. Journal of

Leukocyte Biology, v.86, n.3, p.549-555, 2009.

CARVALHO, A. M. R. Estudo da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória da

Riparina II (O-metil-N-2-hidroxibenzoil tiramina).2011. 101f. Dissertação (Mestrado em

Farmacologia)- Universidade Federal do Ceará, Ceará, 2011

CARVALHO, A. M. R.; ROCHA, N. F. M.; VASCONCELOS, L. F.; RIOS, E. R. V.; DIAS,

M. L.; SILVA, GOMES, M. I.; FONTELES, M. M. F.; BARBOSA FILHO, J. M.;

GUTIERREZ, S. J. C.; SOUSA, F. C. F. Evaluation of the anti-inflammatory activity of riparin

II (O-methil-N-2-hidroxi-benzoyl tyramine) in animal models. Chemico-Biological

Interactions, v. 205, n. 3, p. 165-172, 2013.

CASTELO-BRANCO, U. V.; THOMAS, G.; ARAÚJO, C. C.; BARBOSA-FILHO, J. M.

Preliminary pharmacological studies on three benzoyl amides constituents of Aniba riparia

(Ness) Mez (Lauraceae). Acta Farmacéutica Bonaerense, v. 19, p. 197-202, 2000.

CASTELO-BRANCO, U. V.. Preparação e estudos farmacológicos do éter metílico de N-

benzoiltiramina e do éter metílico de N-(2-hidroxibenzoil)-tiramina. 1992. Dissertação

(Mestrado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos) – Universidade Federal da Paraíba,

Paraíba 1992.

CHENG, Z.; REN, J.; YAN, G.; LI, Y.; CHANG, W.; CHEN, Z. Quantitative elucidation of

the molecular mechanisms of hydroxyl radical quenching reactivity of phenolic compounds.

Bioorg. Chem., v.31, n.2, p.149-162, 2003

CHUANG, H. H.; PRESCOTT, E. D.; KONG, H.; SHIELDS, S.; JORDT, S. E.; BASBAUM,

A. I.; CHAO, M. V.; JULIUS, D. Bradykinin and nerve growth fator released the capsaicina

receptor PtdIns (4,5) P2-mediated inhibition. Nature, v. 411, n. 6840, p. 957-62, 2001.

CIENCEWICKI, J.; TRIVEDI, S.; KLEEBERGER, S. R. Oxidants and the pathogeneses of

lung diseases. Journal of Allergy and Clinicla Immunology, v. 122, p. 456-68, 2008

CLAPHAM, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature, v. 426, p. 517-524, 2003.

COLLETT, B. J. Opioid tolerance: the clinical perspective. British Journal of Anaesthesia,

v. 81, n. 1, p. 58-68, 1998.

COSTA, P. R. R. Produtos naturais como ponto de partida para a descoberta de novas

substâncias bioativas: Candidatos a fármacos com ação antiofídica, anticâncer e antiparasitária.

Revista Virtual de Química, v. 1, n. 1, 2009.

CRAIG, A. D. Pain mechanisms: labeled lines versus convergence in central processing.

Annual Reviews of Neuroscience, v. 26, p.1-30, 2003.

COUTAUX, A.; ADAM, F.; WILLER, J. C.; LE BARS, D. Hyperalgesia and allodynia:

peripheral mechanisms. Joint Bone Spine, v.72, p.359-371, 2005.

104

CUNHA, T. M.; VERRI JÚNIOR, W. A.; SILVA, J. S.; POOLE, S.; CUNHA, F. Q.;

FERREIRA, S. H. A cascade of cytokines mediates mechanical inflammatory hypernociception

in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

Aamerica, v. 102, n. 5, p. 1755-60, 2005.

CUNHA, T. M.; VERRI, W. A.; VIVAMOS, G. G.; MOREIRA, I. F.; REIS, S.; PARADA, C.

A.; CUNHA, F. Q.; FERREIRA, S. H. An electronic pressure-meter nociception paw test for

mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 37, n. 3, p. 401-407, 2004.

CUNHA, F. Q.; POOLE, S.; LORENZETTI, B. B.; FERREIRA, S. H. The pivotal role of tumor

necrosis factor a in the development of inflammatory hyperalgesia. British Journal of

Pharmacology, v. 107, p. 660-664. 1992.

DAVIDGE, S. T.; BAKER, P. N.; MCLAUGHLIN, M. K; ROBERTS, J. M. Nitric oxide

produced by endothelial cells increases production of eicosanoids through activation of

prostaglandin H synthase. Circulation Research, v. 77, n. 2, p. 274-283, 1995.

DEROW, A.; IZYDORCZYK, I.; KUHN, A.; REEH, P. W.; PETHÕ, G. Prostaglandin E2 and

I2 facilitate noxious heat-induced spike discharge but not iCGRP release from rat cutaneous

nociceptors. Life Sciences, v. 81, n. 25-26, p. 1685-1693, 2007.

DRAY, A.; PERKINS, M. Bradykinin and inflammatory pain. Trends in Neurosciences, v.

16, n. 3, p. 99-104, 1993.

DRAY, A.; PERKINS, M. Kinins and pain. In: FARMER, Stephen G. The Kinin System.

Londres: Academic Press, 1997. 157-172p.

DREWES, A. M. The physiology of pain. Ugeskr Laeger, v. 168, n. 20, p.1941-1943, 2006.

DUBÉ, G. R.; ELAGOZ, A.; MANGAT, H. Acid sensing ion channels and acid nociception.

Curr Pharm Des. v. 15, n. 15, p. 1750-66, 2009

DUBNER, R., BENNETT, G. J. Spinal and trigeminal mechanisms of nociception. Annual

Reviews og Neuroscience, v. 6, p. 381-418, 1983.

EID, S. R.; CROWN, E. D.; MOORE, E. L.; LIANG, H. A.; CHOONG, K. C.; DIMA, S.;

HENZE, D. A.; KANE, S. A.; URBAN, M. O. HC-030031, a TRPA1 selective antagonist,

attenuates inflammatory- and neuropathy-induced mechanical hypersensitivity. Molecular

Pain, v. 4, p. 48, 2008.

ENGAND, S.; BEVAN, S.; DOCHERTY, R. J. Docherty. PGE2 modulates the tetrodotoxin-

resistant sodium current in neonatal rat dorsal root ganglion neurones via the cyclic AMPprotein

kinase A cascade. The Journal of Physiology, v. 495, n. 2, p. 429-40, 1996.

EVAN, G. O. Animal hematotoxicology: a practical guide for toxicologists and biomedical

researchers. Boca Raton: CRC Press/Taylon & Francis Group, 2008.

FENG, Y.; CUI, M.; WILLIS, W. Gabapentin markedly reduces acetic acid–induced visceral

nociception. Anesthesiology, v. 98, p. 729–733, 2003.

105

FERREIRA, J.; TRICHÊS, K.M.; MEDEIROS, R.; CALIXTO, J. B. Mechanisms involved in

the nociception produced by peripheral protein kinase C activation in mice. Pain, v. 117, n. 1-

2, p. 171-181, 2005.

FERREIRA, S. H.; LORENZETTI, B.; POOLE, S. Bradykinin initiates cytokine mediated

inflammatory hyperalgesia. British Journal of Phamarcology, v.110. p.1227-1227, 1993.

FIELDS, H. L.; BASBAUM, A. I.; HEINRICHER, M. M. Central nervous system mechanisms

of pain modulation. In: MCMAHON, Stephen; KOLTZENBURG, Martin. Wal and

Malzack’s Textbook of Pain. 5. ed. Burlington, Massachusetts: Elsevier Health Sciences,

2005. 125-142p.

FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. Guindance for indutry: Imunotoxicology

evaluation of investigational new drugs. Center for Drug Evaluation and Research, 2002.

Disponível em:

http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/uc

m079239.pdf. Acesso em: 16 jan. 2016.

GALEOTTI, N.; GHELARDINI, C.; VINCI, M. C.; BARTOLINI, A.. Role of potassium

channels in the antinociception induced by agonists of a2-adrenoceptors. British Journal of

Pharmacology, v. 126, n. 5, p. 1214-1220, 1999.

GAVVA, N. R.; TREANOR, J. J. S.; GARAMI, A.; FANG, L.; SURAPANENI, S.; AKRAMI,

A.; ALVAREZ, F.; BAK, A.; DARLING, M.; GORE, A.; JANG, G. R.; KESSLAK, J. P.; NI,

L.; NORMAN, M. H.; PALLUCONI, G.; ROSE, M.; SALFI, M.; TAN, E.; ROMANOVSKY,

A. A.; CHRISTOPHER, B.; DAVAR, G. Pharmacological blockade of the vanilloid receptor

TRPV1 elicits marked hyperthermia in humans. Pain, v. 136, n. 1-2, p. 202-210, 2008.

GUEDES, I. A.; MAGALHAES, C. S.; DARDENNE, L. E. Receptor–ligand molecular

docking. Biophysical Reviews, v. 6, p. 75–87, 2013

GOLAN, D. E.; TASHJIAN JR, A. H.; ARMSTRONG, E. J.; ARMSTRONG, A. W.

Princípios de Farmacologia a Base Fisiopatológica da Farmacoterapia.3 ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2014.

GREEN, B. G. Lingual heat and cold sensitivity following exposure to capsaicin or menthol.

Chemical Senses, v. 30, p. 201-202, 2005. Suppl. 1.

GREEN, L. C.; WAGNER, D. A.; GLOGOWSKI, J.; SKIPPER, P. L.; WISHNOK, J. S.;

TANNENBAUM, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Anal

Biochemistry, v. 126, n. 1, p. 131-138, 1982.

GRUNDY, D. Neuroanatomy of visceral nociception: vagal and splanchnic afferent. Gut, v.

51, p. 2-5, 2002.

HENRY, J. B. Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais. 20 ed. São

Paulo: Manole, 2008.

HENRY, D.; LIM, L. L.Y; GARCIA RODRIGUEZ, L. A.; PEREZ GUTTHANN, S.;

CARSON, J. L.; GRIFFIN, M.; SAVAGE, R.; LOGAN, R.; MORIDE, Y.; HAWKEY, C.;

106

HILL, S.; FRIES, J. T. Variability in risk of gastrointestinal complications with individual non-

steroidal anti-inflammatory drugs: results of a collaborative meta-analysis. BMJ, v. 312, n.

7046, p.1563-6, 1996.

HESS, S. Atividade antinociceptiva do Ácido Mirsinóico B. 2006. 108 f. Dissertação

(Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências

Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2006.

HESS, S.; PADOANI, C.; SCORTEGANHA, L. C.; SOUZA, M. M. Assessment of

mechanisms involved in antinociception caused by myrsinoic acid B. Biological &

Pharmaceutical Bulletin, v. 33, n. 2, p. 209-15, 2010.

HEYMSFIELD, S. B.; LOHMAN, T. G.; WANG, Z.; GOING, S. B. Human Body

Composition. 2 ed: Human Kinetics, 2005. 206-208p.

KRELING, M. C. G. D.; CRUZ, D. A. L. M.; PIMENTA, C. A. M. Prevalência de dor crônica

em adultos. Revista Brasileira de Enfermagem, v. 59, n. 4, p. 509-13. 2006.

HUANG, S. H.; LEONARD, S.; SHI, X.; GOINS, M. R.; VALLYATHAN, V. Antioxidant

activity of lazaroid (U-75412E) and its protective effects against crystalline silica-induced

cytotoxicity. Free Radical Biology and Medicine, v. 24, n. 4, p. 529-36, 1998.

INTERNACIONAL ASSOCIATION FOR THE STUDY OF PAIN. Guia para o tratamento

da dor em contextos de poucos recursos. 2010. Disponível em:

http://www.iasppain.org/files/Content/ContentFolders/Publications2/FreeBooks/GuidetoPain

Management_Portuguese.pdf. Acesso em: 11 mar. 2016.

INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Projeção da População do

Brasil por Sexo e Idade 1980-2050. Revisão. 2008. Rio de Janeiro, 2010.

JOSHI, S. K.; HONORE, P. The role of TRPV1 receptors in osteoarthritic pain. In:

GOMTSYAN, A.; FALTYNEK, C. R. Vanilloid Receptor TRPV1 in Drug Discovery:

Targeting Pain and Other Pathological Disorders. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 2010. 175-

190p.

JENSEN, K.; ANDERSEN, H. O.; OLESEN, J.; LINDBLOM, U. Pressurepain threshold in

human temporal region. Evaluation of a new pressure algometer. Pain, v. 25, n. 3, p. 313-323,

1986.

JONES, P. G.; DUNLOP, J. Targeting the cholinergic system as a therapeutic strategy for the

treatment of pain. Neuropharmacology, v. 53, n. 2, p.197-206, 2007.

JORDT, S. E.; BAUTISTA, D. M.; CHUANG, H. H.; MCKEMY, D. D.; ZYGMUNT, P. M.;

HÖGESTÄTT, E. D.; MENG, I. D.; JULIUS, D. Mustard oils and cannabinoids excite sensory

nerve fibers through the TRP channel ANKTM1. Nature, v. 427, p. 260-265, 2004.

JULIUS, D.; BASBAUM, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature, v. 413, p. 203-

210, 2001.

107

KANDEL, E. R.; SCHWARTZ, J. H.; JESSEL, T. M. Princípios de neurociência. 4 ed. São

Paulo: Manole, 2003.

KATSURA, H.; OBATA, K.; MIZUSHIMA, T.; YAMANAKA, H.; KOBAYASHI, K.; DAI,

Y.; FUKUOKA, T.; TOKUNAGA, A.; SAKAGAMI, M.; NOGUCHI, K. Antisense knock

down of TRPA1, but not TRPM8, alleviates cold hyperalgesia after spinal nerve ligation in

rats. Exp Neurol. , v. 200, n. 1, p. 112-23, 2006

KAUER, J. A.; GIBSON, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in

Neurosciences, v. 32, n. 4, p. 215-223, 2009.

KING, A. P.; HALL, K. E.; MACDONALD, R. L. κ-and μ-opioid inhibition of N-type calcium

currents is attenuated by 4β-phorbol 12-myristate 13-acetate and protein kinase C in rat dorsal

root ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,

Baltimore, v. 289, n. 1, p. 312-320, apr. 1999.

KITCHEN, D.B.; et al. Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods

and applications. Nat Rev Drug Discov, v. 3, p. 935–949, 2004.

KLAUMANN, P. R.; WOUK, A. F. P. F.; SILLAS, T. Patofisiologia da dor. Archives of

Veterinary Science, v. 13, n. 1, p. 1-12, 2008.

KANG, K.; PARK, M.; PARK, S.; KIM, Y. S.; LEE, S.; LEE, S.; BACK, K. Production of

plant-specific tyramine derivatives by dual expression of tyramine N-hydroxy

cinnamoyltransferase and 4- coumarate: coenzyme A ligase Escherichia coli. Biotechnology

Letters, v. 31, n. 9, p. 1469-1475, 2009.

KOBAYASHI, K.; FUKUOKA, T.; OBATA, K.; YAMANAKA, H.; DAI, Yi; TOKUNAGA,

A.; NOGUCHI, K. Distinct expression of TRPM8, TRPA1, and TRPV1 mRNAs in rat primary

afferent neurons with adelta/c-fibers and colocalization with trk receptors. The Journal of

Comparative Neurology, v. 493, n. 4, p. 596-606, 2005.

KOSTER, R.; ANDERSON, M.; BEER, E. J. Acetic acid for analgesic screening. Federation

Proceedings, v.18, p. 412-417, 1959.

LAHLOU, S. MAGALHÃES, P. J. C.; SIQUEIRA, R. J. B.; FIGUEIREDO, A. F.;

INTERAMINENSE, L. F. L.; MAIA, J. G. S., SOUSA, P. J. C. Cardiovascular effects of the

essential oil of Aniba canelilla bark in normotensives rats. Journal of Cardiovascular

Pharmacology, v. 46, n. 4, p. 412-421, 2005.

LAMONT, L. A.; TRANQUILLI, W.J.; GRIMM, K. A. Physiology of Pain. Veterinary

Clinics of North America: Small Animal Practice, v. 30, n. 4, p. 703-728, 2000.

LEITE, C. P.; MELO, C. T. V.; ARAÚJO, F. L. O.; FONSECA, F. N.; PEREIRA, F. A.;

VASCONCELOS, S. M. M.; BARBOSA-FILHO, J. M.; GUTIERREZ, S. J. C.; SOUSA, F. C.

F. Efeitos de N-(2-hidroxibenzoil)-tiramina (riparina II) de Aniba riparia (Nees) Mez

(lauraceae) nos modelos comportamentais de convulsão induzida por pentilenotetrazol e

estricnina em camundongos. In: XXI Reunião da Federação de Sociedades de Biologia

Experimental, 2006, Águas de Lindóia. Anais. Águas de Lindóia, 2006.

108

LEVITAN, I. B. Modulation of ion channels by protein phosphorylation and

dephosphorylation. Annual Reviews of Physiology, v. 56, p. 193-212, 1994.

LI, J. W.H; VEDERAS, J. C. Drug Discovery and natural products: end of an era or an endless

frontier?. Science, v. 325, p. 161-165, 2009.

LI, X.; WANG, L.; LI, Y.; BAI, L.; XUE, M.. Acute and subacute toxicological evaluation of

scutellarin in rodents. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v. 60, p.106-111, 2011.

LIMÓN-PACHECO, J.; GONSEBATT, M. E. The role of antioxidants and antioxidant-related

enzymes in protective responses to environmentally induced oxidative stress. Mutation

Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, v. 674, n.1-2, p.137-147,

2009.

LIPINSKI, C. A.; LOMBARDO, F.; DOMINY, B. W; FEENEY, P. J. Experimental and

computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and

development settings. Advanced Drug Delivery Reviews, v.46, p.3-26, 2001.

LIPINSKI, C. A.; LOMBARDO, F.; DOMINY, B. W.; FEENEY, P. J. Experimental and

computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and

development settings. Adv. Drug Deliv. Rev. v. 64, p 4-17, 2012.

LOESER, J. D.; TREEDE, R. D. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain,

v. 137, n. 3, p. 473-477, 2008.

LORENZI, H.; SOUZA, V. C. Botânica Sistemática: guia ilustrado para identificação das

famílias de Fanerógamas nativas e exóticas no Brasil, baseado em APG II. 2 ed. Nova Odessa,

São Paulo: Instituto Plantarum, 2008. 85-89p.

LORENZETTI, B. B.; VEIGA, F. H.; CANRTTI, C. A.; POOLE, S.; CUNHA, F. Q.;

FERREIRA, S. H. Citokyne induced neutrophil chemoattractant mediates the sympathetic

componente of inflammatory mechanical hypernsitivity int. European Cytokine Network, v.

13. p. 456-461, 2002.

MA, X.; HE, D.; RU, X.; CHEN, Y.; CAI, Y.; BRUCE, I.C.; XIA, Q.; YAO, X.; JIN, J.

Apigenin, a plant-derived flavone, activates transient receptor potential vanilloid 4 cation

channel. British Journal of Pharmacology, v. 166, n. 1, p. 349-358, 2012.

MABEKU, L. B. K.; BENG, V. P.; KOUAM, J.; ESSAME, O.; ETOA, F. X. Toxicological

evaluation of ethyl acetate extract of Cylicodiscus gabunensis stem bark (Mimosaceae).

Journal of Ethnopharmacology, v. 111, n. 3, p. 598-606, 2007.

MAIA, J. G. S.; SOUSA, P. J. C.; FONTES JÚNIOR, E. A.; SANTOS, A. M. S. Volatile

Compounds and Antispasmodic Activity of the Stem Bark Oil of Aniba canelilla. In: XII

Congresso Ítalo-Latino-Americano de Etnomedicina. Rio de Janeiro, RJ. Anais. Rio de Janeiro,

2003.

MAIOLI-AZEVEDO, V.; FONSECA-KRUEL V. S. Plantas medicinais e ritualísticas vendidas

em feiras livres no município do Rio de Janeiro, RJ, Brasil: estudo de caso nas zonas Norte e

Sul. Acta Botânica Brasilica, v. 21, n. 2, p. 263-275, 2007.

109

MACPHERSON, L. J.; DUBIN, A. E.; EVANS, M. J.; MARR, F.; SCHULTZ, P. G.;

CRAVATT, B. F.; PATAPOUTIAN, A. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels

through covalent modification of cysteines. Nature, v. 445, n. 7127, p. 541-5, 2007.

MALMBERG, A. B.; BRANDON, E. P.; IDZERDA, R. L.; LIU, H.; MCKNIGHT, G. S.;

BASBAUM. A. Diminished inflammation and nociceptive pain with preservation of

neuropathic pain in mice with a targeted mutation of the type I regulatory subunit of cAMP-

dependent protein kinase. The Journal of Neuroscience, v. 17, p. 7462-7470,1997.

MAMET, J.; BARON, A.; LAZDUNSKI, M.; VOILLEY, N. Proinflammatory mediators,

stimulators of sensory neuron excitability via the expression of acidsensing ion channels. The

Journal of Neuroscience, v. 22, n. 24, p. 10662-70, 2002.

MANJAVACHI, M.N. et al., Mechanisms involved in IL-6 induced muscular mechanical

hyperalgesia in mice. Pain. v. 151, n. 2, p. 345-355, 2010

MANSIKKA, H.; ERBS, E.; BORRELLI, E.; PERTOVAARA, A. Influence of dopamine D2

receptor knockout on pain-related behavior in the maouse. Brain Research, v.1052, n. 1, p. 82-

7, 2005.

MARTI-RENOM, M. A.; et al. Structure comparison and alignment. In: GU, Jenny; BOURNE,

Philip E. (Org.). Structural Bioinformatics. 2.ed. Hoboken: John Wiley & Sons, 2009.

MARQUES, A. D. S.; ZHENG, C.; BARBOSA-FILHO, J. M.; LIN, C. T.; GUTIERREZ, S. J.

C. Electronic and structural effects in muscular relaxants: Riparin I and riparin III. Journal of

Molecular Structure, v. 753, p. 13-21, 2005.

MARQUES, C. A. Importância econômica da família lauraceae lindl. Floresta e Ambiente, v.

8, n. 1, p.195 - 206, 2001.

MAROON, J. C.; BOST, J. W.; MAROON, A. Natural anti-inflammatory agents for pain relief.

Surgical Neurology International, v. 1, 2010.

McCONKEY, B. J., SOBOLEV, V., EDELMAN, M. The performance of current methods in

ligand-protein docking. Current Science, v. 83, p. 845-856, 2002

MEDVEDEVA, Y.V., KIM, M.S, USACHEV, Y.M. Mechanisms of prolonged presynaptic

Ca2+ signaling and glutamate released induced by TRPV1 activation in rat sensoty neurons. J

Neurosci. v. 28, n. 20, p. 5295-311, 2008

MELO, C. T. V.; CARVALHO, A. M. R.; MOURA, B. A.; TEIXEIRA, C. P. L.;

VASCONCELOS, L. F.; FEITOSA, M. L.; OLIVEIRA, G. V.; BARBOSA-FILHO, J. M.; GUTIERREZ, C. S. J.; FONTELES, M. M. F.; VASCONCELOS, S. M. M.; SOUSA, F. C. F.

Evidence for the involviment of the serotonergic, noradrenergic, and dopaminergic systems in

the antidepressant-like action of riparin III obteined from Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae)

in mice. Fundamental & Clinical Pharmacology, v. 27, n. 1, p. 104-12, 2013.

MELO, C. T. V.; MONTEIRO, A. P.; LEITE, C. P.; ARAÙJO, F. L. O.; LIMA, V. T. M.;

BARBOSA-FILHO, J. M.; FONTELES, M. M. F.; VASCONVELOS, S. M. M.; VIANA, G.

110

S. B.; SOUSA, F. C. F. Anxiolytic-like effects of (O-methyl)-N-2,6-dihydroxybenzoyl-

tyramine (riparin III) from Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae) in mice. Biological and

Pharmaceutical Bulletin, v. 29, n. 3, p. 451-454, 2006.

MENESCAL-DE-OLIVEIRA, L. D. In: ROBERTO, Lent. Neurociência da Mente e

Comportamento. Rio de janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 183-201p.

MESSLINGER, K. [What is a nociceptor]. Der Anaesthesist, v. 46, n. 2, p.142-53, 1997.

MILLAN, M. J. The induction of pain: an integrative review. Progress in Neurobiology, v.

57, n. 1, p. 161-164, 1999.

MILLAN, M. J. Descending control of pain. Progress in Neurobiology. v. 66, n. 6, p. 355-

474, 2002.

MILLER, B.W.; BAIER, L.D.; MORRISON, A.R. Overexpression of protein kinase C-ζ

isoform increases cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase. American Journal of

Physiology, Washington, v. 273, n. 1, p. C130-C136, jul. 1997.

MOBLEY, D.L.; DILL, K.A. Binding of Small-Molecule Ligands to Proteins: ‘What

You See’ Is Not Always ‘What You Get’. Structure, v. 17, p. 489–498, 2009.

MOCHLY-ROSEN, D.; KAUVAR, L. M. Modulating protein kinase C signal transduction.

Advances in Pharmacology, New York, v. 44, p. 91-145, 1998.

MOHAPATRA, D.; NAU, C.. Desensitization of Capsaicin-activated Currents in the Vanilloid

Receptor TRPV1 is Decreased by the Cyclic AMP-dependent Protein Kinase Pathway. The

Journal of Biological Chemistry, v. 278, n. 50, p. 50080-50090, 2003.

MONCADA, S.; PALMER, R. M. J.; HIGGS, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology

and pharmacology. Pharmacological Reviews, v. 43, n. 2, p. 109-141, 1991.

MONTEIRO, E. A. S. Avaliação toxicológica da Ipomoea asarifolia (salsa) em ratos. 2010.

102f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Ciências Agrárias e

Veterinárias Campus de Jaboticabal, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,

Jaboticabal, 2010.

MONTEIRO, A. P.; MELO, C. T. V.; LEITE; C. P.; FILHO; F. E. R.; GUTIERREZ, S. J. C.;

BARBOSA-FILHO, J. M.; SOUSA, F. C. F. Anticonvulsant properties of riparin I (rip I) and

riparin III (rip III) from Aniba Riparia (Nees) Mez (Lauraceae) in mice. Brazilian Journal of

Pharmaceutical Sciences, v. 41, p. 241, 2005. Supl. 1.

MOTTA, V. T. Bioquímica Clínica: Princípios e Interpretações. 4 ed. Porto Alegre: Médica

Missau, 2003.

MOUNT, D. W. Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. 2.ed. Cold Spring Harbor:

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004.

MUIR, W. W. Anaesthesia and pain magnement in horses. Equine Veterinary Education, v.

10, p. 335-340, 1998.

111

MUIR III, W. W.; HUBBELL, J. A. E.; SKARDA, R. T.; BEDNARSKI, R. M. Manual de

Anestesia Veterinária. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2001. 242-249p.

NAGATA, K.; DUGGAN, A.; KUMAR, G.; GARCÍA-AÑOVEROS, J. Nociceptor and hair

cell transducer properties of TRPA1, a channel for pain and hearing. The Journal of

Neuroscience, v. 25, p. 4052-4061, 2005.

NAMER, B.; FRANK, S.; HERMANN OTTO, H.; CHRISTIAN, M.. TRPA1 and TRPM8

activation in humans: effects of cinnamaldehyde and menthol. NeuroReport, v. 16, n. 9, p.

955-959, 2005.

NARUMIYA, S.; FITZGERALD, G. A. Genetic and pharmacological analysis of prostanoid

receptor function. The Journal of Clinical Investigation, v. 108, n. 1, p. 25-30, 2001.

NEGUS, S. S.; VANDERAH, T. W.; BRANDT, M. R.; BILSKY, E. J.; BECERRA, L.;

BORSOOK, D. Preclinical assessment of candidate analgesic drugs: recent advances and future

challenges. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 319, n. 2, p.

507-14. 2006.

NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M.; SNADER, K. M. Natural products as sources of new drugs

over the period 1981-2002. Journal of Natural Products, v. 66, n. 7, p.1022-1037, 2003.

NODA, M.; KARIURA, Y.; AMANO, T.; MANAGO, Y.; NISHIKAWA, K.; AOKI, S.;

WADA, K.. Expression and function of bradykinin receptors in micróglia. Life Sciences, v. 72,

n. 14, p. 1573-1581, 2003.

NUNES, G. B. L.; COSTA, L. M.; GUTIERREZ, S. J. C.; NUNES, L. C. C.; FREITAS, R. M.

Prospecção científica e tecnológica da Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae). Cadernos de

Prospecção, v. 6, n. 4, p. 447-458, 2013.

OAKLANDER, A. L. Cronic Pain. ACP Medicine. p. 1-19, 2011.

ORGANISATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT. OECD 425

Guideline for Testing of Chemicals. Acute Oral Toxicity – Up- and-Down Procedure.

Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, 2001. Disponível em:

http://www.oecd.org/chemicalsafety/risk-assessment/1948378.pdf. Acesso em: 03 fev. 2016.

OLIVA, P.; BERRINO, L.; NOVELLIS, V.; PALAZZO, E.; MARABESE, I.; SINISCALCO,

D.; SCAFURO, M.; MARIANI, L.; ROSSI, F.; MAIONE, S. Role of periaqueductal grey

prostaglandina receptors in formalina induced hyperalgesia. European Journal of

Pharmacology, v. 530, n. 1-2, p. 40-47, 2006.

ONGALI, B.; CAMPOS, M. M.; BREGOLA, G.; RODI, D.; REGOLI, D.; THIBAULT, G.;

SIMONATO, M.; COUTURE, R. Autoradiographic analysis of rat brain kinin B1 and B2

receptors: normal distribuition and alterations induced by epilepsy. The Journal of

Comparative Neurology, v. 41, n. 4, p. 506-519, 2003.

112

OSTERMANN, M.; DICKIE, H.; BARRETT, N. A. Renal replacement therapy in critically ill

patients with acute kidney injury—when to start. Nephrology Dialysis Transplantation, v. 27,

p. 2242-2248, 2012.

PARPURA, V.; BASARSKY, T. A.; LIU, F.; JEFTNIJA, K.; JEFTNIJA, S.; HAYDON, P. G.

Glutamate mediated astrocyte neuron signalling. Nature, v. 369, p. 744-747, 1994.

PARADA, C. A.; YEH, J. J.; REICHLING, D. B.; LEVINE, J. D. Transiente attenuation of

protein kinase Ce can terminate a chronic hyperalgesia state in the rat. Neuroscience, v .120,

n. 1, p.219-226, 2003.

PATWARDHAN, B. K.; VAIDYA, A. D. Natural products drug discovery: accelerating the

clinical candidate development using reverse pharmacology approaches. Indian Journal of

Experimental Biology, v. 48, n. 3, p. 220-7, 2010.

PERES, L. E. P. Metabolismo secundário. 2003. Disponível em: www.danepatrie.com.

Acesso em 15 de dezembro de 2015.

PERTOVAARA, A. Noradrenergic pain modulation. Progress in Neurobiology, v. 80, n. 2, p.

53-83, 2006.

PETHO, G.; REEH, P.W., Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids,

platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews v.

92, p. 1699-1775, 2012.

PETRUS, M.; PEIER, A. M.; BANDELL, M.; HWANG, S. W.; HUYNH, T.; OLNEY, N.;

JEGLA, T.; PATAPOUTIAN, A. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by

pharmacological inhibition. Molecular Pain, v. 3, n. 40, 2007.

PINHEIRO, R. M.; CALIXTO, J. B. Effect of the selective COX-2 inhibitors, celecoxib and

rofecoxib in rat acute models of inflammation. Inflammation Research, Basel, v. 51, n. 12, p.

603-610, dec. 2002.

PISERA, D. Fisiologia da dor. In: OTERO, Pablo E. Dor: Avaliação e Tratamento em pequenos

animais. São Paulo: Interbook, 2005. 30-74p.

POOLE, D.P.; AMADESI, S.; ROZENGURT, E.; THACKER, M.; BUNNETT, N.W.;

FURNESS, J.B. Stimulation of neurokinin 3 reeptor activates protein kinase C (épsilon) and

protein kinase D in enteric neurons. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, v. 294, n. 5, p.

1245-56, 2008.

PORRECA, F.; OSSIPOV, M. H.; GEBHART, G. F. Chronic pain and medullary descending

facilitation. Trends in Neurosciences, v. 25, n. 6, p. 319-325, 2002.

PORTO, C. C. Exame clinico: Bases para a Prática Médica. 5 ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2004. 37-40p.

113

PREMKUMAR, L. S.; RAISINGHANI, M.; PINGLE, S. C.; LONG, C.; PIMENTEL, F.

Downregulation of transient receptor potential melastatin 8 by protein kinase C-mediated

dephosphorylation. The Journal of Neuroscience, v. 25, p. 11322-11329, 2005.

RANG, H. P.; URBAN, L. New molecules in analgesia. British Journal of Anaesthesia, v.

75, p. 145-156, 1995.

RANGWALA, H.; KARYPIS, G. Introduction to Protein Structure Prediction: Methods

and Algorithms. Hoboken: John Wiley & Sons, 2011

RAHMAN, W.; BAUER, C. S.; BANNISTER, K.; VONSY, J. L.; DOLPHIN, A. C.;

DICKENSON, A. H. Descending serotonergic facilitation and the antinociceptive effects of

pregabalin in a rat model of osteoarthritic pain. Molecular Pain, v. 5, n. 1, p. 45-62, 2009.

RAHID, H.; INOUE, M.; MATSUMOTO, M.; UEDA, H. Switching of bradykinin mediated

nociception following partial sciatic nerve injury in mice. Journal of Pharmacology and

Experimental Therapeutics, v. 308, n. 3, p.1158-1164, 2004.

RAMÍREZ-CHÁVEZ, E.; LÓPEZ-BUCIO, J.; HERRERA-ESTRELLA, L.; MONILA-

TORRES, J. Alkamides isolated from plants promote growth and alter root development in

Arabidopsis. Plant Physiology, v. 134, n. 3, p. 1058-1068, 2004.

REXED, B. The cytoarchitectonic organuzation of the spinal cord in the rat. The Journal of

Comparative Neurology, v. 96, p. 415-466, 1952.

RIBEIRO, R.A.; VALE, M.V.; THOMAZZI, S.M.; PASCHOALATO, A.B.P.; POOLE, S.

FERREIRA, S.H.; CUNHA, F.Q. Involvement of resident macrophages and mast cells in the

writhing nociceptive response induced by zymosan and acetic acid in mice. Eur. J. Pharmacol.

v. 387, p. 111-118, 2000.

RIEDEL, W.; NEECK, G. Nociception, pain, and antinociception: current concepts. Zeitschrift

für Rheumatologie, v. 60, p. 404-415, 2001.

RIOS, E. R. V.; ROCHA, N. F. M.; CARVALHO, A. M. R.; VASCONCELOS, L. F.; DIAS,

M. L.; SOUSA, D. P.; SOUSA, F. C. F.; FONTELES, M. M. F. TRP and ASIC channels

mediante the antinociceptive effect of citronellyl acetate. Chemico-Biological Interactions, v.

203. p. 573-9, 2013.

RODRIGUES, A. R. A.; DUARTE, I. D. G. The peripheral antinociceptive effect induced by

morphine is associated with ATP-sensitive K+ channels. British Journal of Pharmacology,

v. 129, p. 110-114, 2000.

ROSSI, H. L.; VIERCK, JR, C. J.; CAUDLE, R. M.; NEUBERT, J. K. Characterization of

cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain,

London, v. 2, p. 37, 2006.

SÁ, K.; BAPTISTA, A. F.; MATOS, M. A.; LESSA, I. Prevalência de dor crônica e fatores

associados na população de Salvador, Bahia. Revista de Saúde Pública, v. 43, n. 4, p. 622-30,

2009.

114

SACHS, D.; CUNHA, F. Q.; POOLE, S.; FERREIRA, S. H. Tumor necrosis fator-α,

interleukin-1β and interleukin-8 induce persistente mechanical nociceptor hypersensitivity.

Pain, v. 96, n. 1-2, p. 89-97, 2002.

SAKLANI, A.; KUTTY, S. K. Plant-derived compounds in clinical trials. Drug Discovery

Today, v. 13, p. 161-171. 2008.

SAKURADA, T.; MATSUMURA, T.; MORIYAMA, T.; SAKURADA, C.; UENO, S.;

SAKURADA, S. Differential effects of intraplantar capsazepine and ruthenium red on

capsaicininduced desensitization in mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior, v.75,

n.1, p.115-21, 2003.

SALVEMINI, D.; SEIBERT, K.; MASFERRER, J. L.; MISKO, T. P.; CURRIE, M. G.;

NEEDLEMAN, P. Endogenous nitric oxide enhances prostaglandin production in a model of

renal inflammation. The Journal of Clinical Investigation, v. 93, n. 5, p. 1940-1947, 1994.

SANTOS, A. R. S.; CALIXTO, J. B. Further evidence for the involvement of tachykinin

receptor subtypes in formalin and capsaicin models of pain in mice. Neuropeptides, v. 31, n.

4, p. 381-389. 1997a.

SANTOS, A. R. S.; CALIXTO, J. B. Ruthenium red and capsazepine antinociceptive effect in

formalin and capsaicin models of pain in mice. Neuroscience Letters, v. 235, n.1-2, p.73-6.

1997b.

SCHWARZ, D.; KAVRAKI, L. E. Protein–ligand interactions: Computational docking, eLS,

2006

SEIXAS, S. R. S. Preparação de derivados benzoiltiramínicos e sua atividade

cardiopressora. 1996. 103f. Dissertação (Mestrado em Produtos Naturais) -Universidade

Federal da Paraíba, Paraíba, 1996.

SHUGHRUE, P. J.; KY, B.; AUSTIN, C. P. Localization of B1 bradykinin receptor mRNA in

the primate brains and spinal cord: na in situ hybridization stdy. The Journal of Comparative

Neurology, v. 465, n. 3, p. 372-384, 2003.

SIEBEL, J. S.; BEIRITH, A.; CALIXTO, J. B. Evidence for the involvement of metabotropic

glutamatergic, neurokinin 1 receptor pathways and protein kinase C in the antinociceptive effect

of dipyrone in mice. Brain Research, v. 1003, n. 1-2, p. 61-67, 2004.

SIMIC, A.; SOKOVIC, M. D.; RISTIC, M.; GRUJIC-JOVANOVIC, S.; VUKOJEVIC, J.;

MARIN, P. D. The chemical composition of some Lauraceae essential oils and their antifungal

activities. Phytotherapy Research, v. 18, p. 713-717, 2004.

SMITH, C. J.; ZHANG, Y.; KOBOLDT, C. M.; MUHAMMAD, J.; ZWEIFEL, B. S.;

SHAFFER, A.; TALLEY, J. J.; MASFERRER, J. L.; SEIBERT, K.; ISAKSON, P. C.

Pharmacological analysis of cyclooxygenase-1 in inflammation. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of Aamerica, v. 95, n. 22, p. 13313-13318, oct.

1998.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9308027

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9308027

115

SMITH, E. S.; CADIOU, H., MCNAUGHTON, P. A. Arachidonic acid potentiates acid sensing

ion channels in rat sensory neurons by a direct action. Neuroscience, v. 145, n. 2, p. 686-98,

2007.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.;

PETROVICK, P. R. (org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre:

Universidade Federal de Santa Catarina, 1999. 821p.

SOCIEDADE BRASILEIRA DE ESTUDO SOBRE A DOR. A dor crônica no Brasil - o que

nos dizem os estudos. 2015

SOCIEDADE BRASILEIRA PARA O ESTUDO DA DOR. O que é Dor?. 2012. Disponível

em: http://www.dor.org.br. Acesso em: 21 mar. 2016.

SOUSA, F. C. F.; MELO, C. T. V.; MONTEIRO, A. P.; LIMA, V. T.; GUTIERREZ, S. J. C.;

PEREIRA, B. A.; BARBOSA-FILHO, J. M.; VASCONCELOS, S. M. M.; FONTELES, M.

M. F.; VIANA, G. S. B. Antianxiety and antidepressant effects of riparin III from Aniba riparia

(Nees) Mez (Lauraceae) in mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior, v. 78, p. 22-33,

2004.

SOUSA, F. C. F.; MONTEIRO, A. P.; MELO, C. T. V.; OLIVEIRA, G. R.; VASCONCELOS,

S. M. M.; FONTELES, M. M. F.; GUTIERREZ, S. J. C.; BARBOSA-FILHO, J. M.; VIANA,

G. S. B. Antianxiety effects of Riparin I from Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae) in mice.

Phytotherapy Reseach, v. 19, n. 12, p. 1005-1008, 2005.

SOUSA, F. C. F.; LEITE, C. P.; MELO, C. T. V.; ARAÚJO, F. L. O.; GUTIERREZ, S. J. C.;

BARBOSA-FILHO, J. M.; FONTELES, M. M. F.; VASCONCELOS, S. M. M.; VIANA, G.

S. B. Evaluation of effects of N-(2-hydroxybenzoyl) tyramine (riparin II) from Aniba riparia

(NEES) MEZ (Lauracea) in anxiety models in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin,

v. 30, p. 1212-1216, 2007.

SOUZA, K. S.; CHAAR, J. S.; OLIVEIRA, K. M. T.; GOMES, E. O.; PORTELA, C. N.;

POHLIT, A. M.; QUIHNARD, E. L. J.; NUNOMURA, S. M.; TADEI, W. P.; MOUCHREK

FILHO, V. E.; SILVA, D. D.; GALHIANE, M. S.; CHIERICE, G. O. Atividade Biológica de

Extratos, Hidrolatos e Óleos Voláteis de Pau-rosa (Aniba duckei Kostermans) e Quantificação

do Linalol no Hidrolato de Folhas. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 9, p. 1-7,

2007.

SOUZA, A. L. S.; MOREIRA, F. A.; ALMEIDA, K. R.; BERTOLLO, C. M.; COSTA, K. A.;

COELHO, M. M. In vivo evidence for a role of protein kinase C in peripheral nociceptive

processing. British Journal of Pharmacology, v. 135, n. 1, p. 239-47, 2002.

SPINDLER, P.; SJOBERG, P.; KNUDSEN L. E. First exposure in man: toxicological

considerations. Pharmacology and Toxicology, v. 86, n. S1, p. 8-12, 2000.

STANFIELD, C. L. Principles of human physiology. 5 ed. São Paulo: Pearson, 2013.

STORY, G. M.; PEIER, A. M.; REEVE, A. J.; EID, S. R.; MOSBACHER, J.; HRICIK, T. R.;

EARLEY, T. J.; HERGARDEN, A. C.; ANDERSSON, D. A.; HWANG, S. W.; MCLNTYRE,

116

P.; JEGLA, T.; BEVAN, S.; PATAPOUTIAN, A. ANKTM1, a TRP-like channel expressed in

nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell, v. 112, n. 6, p. 819-29, 2003.

SVENSSON, P., BAAD-HANSESN, L., PIGG, M., LIST, T., ELIAV, E., ETTLIN, D.,

MICHELOTTI, A., TSUKIYAMA, Y., MATSUKA, Y., JAASKELAINEN, S.K., ESSICK,

G., GREENSPAN, J.D., DRANGSHOLT, M. Guidelines and recommendations for assessment

of somatosensory function in oro-facial pain conditions- a taskforce report. J Oral Rehabil., v.

38, n. 5, p. 366-94, 2011

SWEITZER, S. M.; ALLEN, C.; ZISSEN, M. H.; KENDIG, J. J. Mechanical allodynia and

thermal hyperalgesia upon acute opioid withdrawal in the neonatal rat. Pain, v. 110, n. 1-2, p.

269-80, 2004.

TALELE, T. T.; KHEDKAR, S. A.; RIGBY, A. C. Successful applications of computer aided

drug discovery: moving drugs from concept to the clinic. Curr Top Med Chem v. 10, p. 127–

141, 2010.

TAYLOR-CLARK, T. E.; UNDEM, B. J.; MACGLASHAN, D. W.; GHATTA, S.; CARR, M.

J.; MCALEXANDER, M. A. Prostaglandin-induced activation of nociceptive neurons via

direct interaction with transient receptor potential A1 (TRPA1). Molecular Pharmacology, v.

73, n. 2, p. 274-281, 2008.

TAYLOR, R. D.; JEWSBURY, P. J.; ESSEX, J. W. A review of protein-small molecule

docking methods. J. Comput. Aided Mol. Des., v. 16, p. 151–166, 2002.

TEIXEIRA, C. P. L.; MELO, C. T. V.; ARAÚJO, F. L. O.; CARVALHO, A. M. R.; SILVA,

M. I. G.; BARBOSA-FILHO, J. M.; MACÊDO, D. S.; VIANA, G. S. B.; SOUSA, F. C. F.

Antidepressant-like effect of riparin II from Aniba riparia in mice: evidence for the involvement

of the monoaminergic system. Fundamental & Clinical Pharmacology, v. 11, n. 2, p. 129-

137, 2013.

THOMAS, G.; CASTELO-BRANCO, J. V.; BARBOSA-FILHO, J. M.; BACHELET, M.;

VARGAFTIG, B. B. Studies on the mechanism of spasmolytic activity of (O-methyl)-N-(,26-

dihydroxybenzoyl) tyramine, a constituent of Aniba riparia (Ness) Mez. (Lauraceae), in rat

uterus, rabbit aorta and guinea-pig alveolar leucocytes. Journal of Pharmacy and

Pharmacology, v. 46, p. 103-107, 1994.

TRANQUILLI, W. J. Fisiologia da dor aguda. In: GREENE, Stephen A. Segredos em

anestesia veterinária e manejo da dor. Porto Alegre: Artmed, 2004. 399-402p.

VANE, J. R.; BAKHLE, Y. S.; BOTTING, R. M. Ciclooxygenases 1 and 2. Annual Reviews

Of Pharmacology and Toxicology, v. 38, p. 97-120, 1998.

VANEGAS, Horacio; SCHAIBLE, Hans-Georg. Prostaglandins and cyclooxygenases in the

spinal cord. Progress in Neurobiology, v. 64, n. 4, p. 327-363, 2001.

VASCONCELOS, L. F. Efeito antinociceptivo da Riparina III (n-2,6-dihidroxibenzoil o-

metil-tiramina) em camundongos: possíveis mecanismos farmacológicos. 2015. 97f. Tese

(Doutorado em Biotecnologia) -Universidade Federal do Ceará, Ceará, 2015.

117

VASCONCELOS, A. S.; OLIVEIRA, I. C.; VIDAL, L. T.; RODRIGUES, G. C.;

GUTIERREZ, S. J.; BARBOSA-FILHO, J. M.; VASCONCELOS, S. M. M.; FONTELES, M.a

M. F.; GASPAR, D. M.; SOUSA, F. C. F. Subchronic administration of riparin III induces

antidepressive-like effects and increases BDNF levels in the mouse hippocampus.

Fundamental & Clinical Pharmacology, v. 29, n. 4, p. 394-403, 2015.

VERGOLE, N. Postinflammatory visceral sensitivity and pain mechanisms.

Neurogastroenterology & Motility, v. 20, p. 73-80, 2008.

VELÁZQUEZ, K. T.; MOHAMMAD, H.; SWEITZER, S. M. Protein kinase C in pain:

involvement of multiple isoforms. Pharmacological Research, v. 55, n. 6, p. 578-89, 2007.

VERRI, W. A.; SCHIVO, I. R. S.; CUNHA, T. M.; LIEW, F. Y.; FERREIRA, S. H.; CUNHA,

F. Q. Interleukin-18 induces mechanical hypernociception in rats via endothelin acting on ETB

receptors in a morphine-sensitive manner. The Journal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics, v. 310. p. 710-717, 2005.

VERRI JR., W. A.; CUNHA, T. M.; PARADA, C. A.; POOLE, S.; CUNHA, F. Q.;

FERREIRA, S. H. Hypernociception role of cytokines and chemokines: targets for analgesic

drug development? Pharmacology & Therapeutics, v. 112, n. 1, p. 116-138, 2006.

WANG, S.; DAI, Y.; FUKUOKA, T.; YAMANAKA, H.; KOBAYASHI, K.; OBATA, K.;

CUI, X.; TOMINAGA, M.; NOGUCHI, K. Phospholipase C and protein kinase A mediate

bradykinin sensitization of TRPA1: a molecular mechanism of inflammatory pain. Brain, v.

131, p. 1241-51, 2008.

WANG, W. Z.; CHU, X. P; LI, M. H.; SEEDS, J.; SIMON, R. P.; XIONG, Z. G. Modulation

of acid sensing ion channel currents, acid-induced increase of intracellular Ca2+, and acidosis-

mediated neuronal injury by intracellular pH. The Journal of Biological Chemistry, v. 281, p.

29369-378, 2006.

WANG, H. Q.; KIM, M. P.; TIANO, H. F.; LANGENBACH, R.; SMART, R. C. Protein kinase

C-α coordinately regulates cytosolic phospholipase A2 activity and the expression of

cyclooxygenase-2 through different mechanisms in mouse keratinocytes. Molecular

Pharmacology, New York, v. 59, n. 4, p. 860-866, apr. 2001.

WALL, P. D.; SWEET, W. H. Temporary abolition of pain in man. Science, v. 155, p. 108-9.

1967.

WAY, K. J.; CHOU, E.; KING, G. L. Identification of PKC-isoform-specific biological actions

using pharmacological approaches. Trends in Pharmacological Sciences, Amsterdam, v. 21,

n. 5, p. 181-187, may. 2000.

WASNER, G.; SCHATTSCHNEIDER, J.; BINDER, A.; BARON, R. Topical menthol – a

human model for cold pain by activation and sensitization of C nociceptors. Brain, v. 127, p.

1159-1161, 2004.

WHITTLE, B. J. Gastrointestinal effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs.

Fundamental Clininial Pharmacology, v.17, n. 3, p. 301-13. 2003.

118

WILLIS, W. D., WESTLUND, Karin N. Neuroanatomy of the pain system and of the pathways

that modulate pain. Journal of Clinical Neurophysiology, v. 14, n. 1, p. 2-31, 1997.

WOODCOCK, J.; WITTER, J.; DIONNE, R. A. Stimulating the development of mechanism-

based, individualized pain therapies. Nature Reviews Drug Discovery, v. 6, n. 9, p.703-10.

2007.

WOOLF, C. J.; SALTER, M. W. Neuronal plasticity: increasing the gain in pain. Science, v.

288, p. 1765-1768, 2000.

YOSHIMURA, M.; FURUE, H. Mechanisms for the anti-nociceptive actions of the descending

noradrenergic and serotonergic systems in the spinal cord. Journal of Pharmacological

Science, v. 101, n. 2, p. 107-117. 2006.

YUNES, R. A.; CALIXTO, João Batista. Plantas Medicinais sob a ótica da Química

Medicinal Moderna. Chapecó-SC, Argos: Editora Universitária, 2001. 297-315p.

ZIMMERMANN, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious

animals. Pain, v. 16, n. 2, p. 109-110, 1983.

119

ANEXOS

Anexo 1- DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DO PROJETO DE PESQUISA PELA CEUA

120

Anexo 2- ARTIGO PUBLICADO DURANTE O DOUTORADO

universidade federal do cearÁ faculdade de medicina ...€¦ · resumo estudo do mecanismo de...

Documents