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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

Estudo da Atividade Antinociceptiva e

Possíveis Mecanismos de Ação do Ácido

Oleanólico em Modelos de Nocicepção Induzida por

Capsaicina e Óleo de Mostarda em Camundongos

JULIANA LEMOS MAIA

FORTALEZA

2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

JULIANA LEMOS MAIA

Estudo da atividade antinociceptiva e possíveis

mecanismos de ação do ácido oleanólico em modelos de

nocicepção induzida por capsaicina e óleo de mostarda em

camundongos

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Orientador : Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao

Fortaleza

2006

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E POSSÍVEIS

MECANISMOS DE AÇÃO DO ÁCIDO OLEANÓLICO EM MODELOS

DE NOCICEPÇÃO INDUZIDA POR CAPSAICINA E ÓLEO DE

MOSTARDA EM CAMUNDONGOS

JULIANA LEMOS MAIA

Esta dissertação foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca setorial da referida Universidade. A citação de qualquer trecho desta dissertação é permitida, desde que realizada de acordo com as normas da ética científica.

Data da aprovação: 22 /12/ 2006

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao (orientador)

Universidade Federal do Ceará

_______________________________________

Profa. Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal

Universidade Federal do Ceará

_______________________________________

Profa. Dra. Fernanda Regina de Castro Almeida

Universidade Federal do Piauí

“É o conhecimento, e não outra coisa, que move o homem a realizar as

finalidades superiores de sua vida, e é também ele quem o leva pelos

caminhos do mundo, buscando-se sempre a si mesmo”.

(Raumsol)

Aos meus pais, Francisco Erivando Abraão

Maia e Telma Leda Gomes de Lemos, pelo amor

e incentivo que possibilitaram a conquista de

mais uma etapa na minha vida

Ao meu irmão David Lemos Maia por estar

presente nos momentos importantes da

minha vida

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Vietla Satyanarayana Rao pela sua competente orientação e pela

amizade demonstrada em cada ensinamento e conselho durante a realização deste

trabalho.

À Profa. Flávia Almeida Santos pelo incentivo e ajuda no desenvolvimento

deste trabalho.

À Profa. Adriana Rolim Campos pela amizade e grande colaboração para a

realização desse trabalho.

Ao Prof. Jorge David e à Profa. Juceni David pelo fornecimento do ácido

oleanólico, a base de realização deste trabalho.

Aos Doutorandos Roberto César Lima Júnior e Caroline Mourão Melo pelas

longas horas de contribuição nos meus experimentos e pelo inestimável

companheirismo.

Aos Doutorandos Karina Moreira de Alencar, Marjorie Moreira Guedes,

Silvéria Lira Regina, Cíntia e Dr. Sérgio pela amizade e momentos de

companheirismo.

Aos mestrandos do LPN, Alana, Ana Carla, Tiago, Danilo, Iana, Otacílio e

Deive pela amizade.

Aos bolsistas de iniciação científica do LPN, Ítalo, Jonnathann, Lívia Sales e

Lívia Lopes pela colaboração nos experimentos.

Às técnicas do Laboratório de Produtos Naturais, Daniella e Karina, pela

manutenção da organização do LPN e pela contribuição nos experimentos.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Aura,

Chiquinho, Edmílson, Fernando, Íris, Joana, Marta e Rose.

A todos os meus familiares e amigos por sempre estarem presentes na minha

vida.

Ao Cristiano pelo grande incentivo.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................17

1.1. Dor...................................................................................................................17

1.2. Mecanismos da dor.........................................................................................18

1.2.1. Ativação e sensibilização dos nociceptores.......................................19

1.2.2. Vias de transmissão da dor................................................................21

1.2.2.1. Vias ascendentes............................................................................21

1.2.2.2. Vias descendentes..........................................................................23

1.3. Classificação dos tipos de dor.........................................................................24

1.3.1. Classificação temporal da dor............................................................24

1.3.2. Classificação fisiopatológica da dor...................................................25

1.4. Dor nociceptiva................................................................................................26

1.5. Modelos de dor nociceptiva.............................................................................27

1.5.1. Capsaicina..........................................................................................28

1.5.2. Óleo de mostarda...............................................................................30

1.6. Uso de plantas no tratamento da dor..............................................................31

1.7. Terpenos.........................................................................................................33

1.8. Eriope blanchetii (Benth).................................................................................36

1.9. Ácido oleanólico..............................................................................................37

1.10. Relevância e justificativa...............................................................................40

2. OBJETIVOS...........................................................................................................41

3. MATERIAIS............................................................................................................42

3.1. Material botânico.............................................................................................42

3.2. Animais experimentais....................................................................................42

3.3. Drogas e reagentes.........................................................................................42

3.4. Equipamentos..................................................................................................43

4. MÉTODOS.............................................................................................................43

4.1. Obtenção do ácido oleanólico (extração e fracionamento)..............................43

4.2. Estudo da atividade antinociceptiva somática..................................................44

4.2.1. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina...............44

4.2.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide........................................ 44

4.2.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico................................. 45

4.2.4. Estudo do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico........................45

4.2.5. Estudo do envolvimento dos canais de potássio..................................45

4.3. Estudo da atividade antinociceptiva visceral....................................................46

4.3.1. Nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda.............................46

4.3.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide.........................................46

4.3.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico..................................47

4.3.4. Estudo do envolvimento do receptor da capsaicina (TRPV1)...............47

4.4. Avaliação do Sistema Nervoso Central............................................................48

4.4.1. Teste do campo aberto..........................................................................48

4.4.2. Teste do Rota Rod................................................................................48

4.5. Análise estatística............................................................................................49

5. RESULTADOS.......................................................................................................50

5.1. Estudo da atividade antinociceptiva somática..............................................50

5.1.1. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina em

camundongos.............................................................................................................50

5.1.2. Estudo do envolvimento opióide............................................................53

5.1.3. Estudo do sistema adrenérgico.............................................................53

5.1.4. Estudo do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico........................58

5.1.5. Estudo do envolvimento dos canais de potássio..................................58

5.2. Estudo da atividade antinociceptiva visceral..................................................63

5.2.1. Nocicepção induzida pela administração intracolônica de óleo de

mostarda.....................................................................................................................63

5.2.2. Estudo do envolvimento opióide............................................................63

5.2.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico..................................68

5.2.4. Estudo do envolvimento do receptor da capsaicina (TRPV1)...............68

5.3. Avaliação da atividade no Sistema Nervoso Central......................................73

5.3.1. Teste do campo aberto.........................................................................73

5.3.2. Teste do Rota Rod...............................................................................73

6. DISCUSSÃO..........................................................................................................76

7. CONCLUSÕES......................................................................................................87

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................89

LISTA DE SIGLAS

Mais ou menos

% Percentagem ® Marca registrada < Menor que

Alfa

Beta

Delta

Microlitro

Micrograma

Micromol

Micrômetro

Acetil CoA Acetil coenzima A AMPc 3‗,5‗-Adenosina monofosfato cíclico AO Ácido Oleanólico ANOVA Análise de variância C Átomo de carbono Ca2+ Íon cálcio cm Centrímetros E.P.M. Erro padrão da média et al. ...e colaboradores GABA Ácido gama aminobutirico GMPc Guanosina monofosfato cíclico g Grama h Hora H2O Água i.p. Intraperitoneal K+ Íon potássio Kg Kilograma mg Miligrama min Minuto mL Mililitro mm Milímetros No Número NMDA N-metil-D-aspartato NK1 Neurocinina 1 NO Óxido nítrico NOs Óxido nítrico sintase C° Grau centígrado p Nível de significância P.A. Para análise s Segundos s.c. Sub-cutâneo SNC Sistema Nervoso Central SUS Sistema Único de Saúde TRPV1 Transient Receptor Potential Vanilloide 1 v.o. Via oral VR1 Receptor Vanilóide 1 vs Versus

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Classificação dos terpenóides............................................................35

Tabela 2- Exemplos de plantas medicinais que contêm ácido oleanólico como

contituinte ativo...........................................................................................................39

Tabela 3- Efeito do ácido oleanólico sobre a nocicepção induzida pela

administração subplantar de capsaicina em camundongos.......................................52

Tabela 4- Efeito do naloxona sobre a atividade antinociceptiva do ácido

oleanólico e morfina na nocicepção induzida pela administração subplantar de

capsaicina em camundongos ....................................................................................55

Tabela 5- Efeito da ioimbina sobre a atividade antinociceptiva do ácido

oleanólico e clonidina na nocicepção induzida pela administração subplantar de

capsaicina em camundongos.....................................................................................57

Tabela 6- Efeito do L-NAME e L-arginina sobre a atividade antinociceptiva do

ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de


Tabela 7- Efeito da gibenclamida sobre a atividade antinociceptiva do ácido

oleanólico e diazóxido na nocicepção induzida pela administração subplantar de


Tabela 8- Efeito do ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzida

por óleo de mostarda em camundongos....................................................................65

Tabela 9- Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva do ácido

oleanólico e morfina na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em

camundongos ............................................................................................................67


oleanólico e clonidina na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em

camundongos ............................................................................................................70

Tabela 11- Efeito do vermelho de rutênio sobre a atividade antinociceptiva do

ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda

em camundongos ......................................................................................................72

Tabela 12- Efeito do ácido oleanólico no teste do campo aberto em

camundongos ............................................................................................................74

Tabela 13- Efeito do ácido oleanólico no teste do Rota Rod em

camundongos.............................................................................................................75

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Representação esquemática dos mecanismos da dor..............................24 Figura 2- Estrutura química da capsaicina ...............................................................29 Figura 3- Fotografia ilustrando a flor (A) e a planta (B) da espécie de Eriope

blanchetii ...................................................................................................................36

Figura 4- Estrutura química do ácido oleanólico.......................................................38 Figura 5- Efeito do ácido oleanólico sobre a nocicepção induzida pela administração

subplantar de capsaicina em camundongos .............................................................51

Figura 6- Estudo do envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação do



Figura 7- Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico no mecanismo de ação

do ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de


Figura 8- Estudo do envolvimento do óxido nítrico no mecanismo de ação do ácido

oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de capsaicina em

camundongos.............................................................................................................59

Figura 9- Estudo do envolvimento dos canais de potássio no mecanismo de ação do



Figura 10- Efeito antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de nocicepção

visceral induzida por óleo de mostarda em camundongos .......................................64

Figura 11- Estudo do envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação do

ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em

camundongos... ........................................................................................................66

Figura 12- Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico no mecanismo de ação

do ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em

camundongos........ ....................................................................................................69

Figura 13- Estudo do envolvimento do receptor vanilóide no mecanismo de ação do

ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em

camundongos.............................................................................................................71

RESUMO

Estudo da atividade antinociceptiva e possíveis mecanismos de ação do ácido oleanólico em modelos de nocicepção induzida por capsaicina e óleo de mostarda em camundongos. Juliana Lemos Maia. Orientador: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2006.

O ácido oleanólico é um triterpeno pentacíclico largamente encontrado em várias plantas medicinais. Essa substância demonstrou ter uma variedade de atividades farmacológicas, dentre as quais se destacam: antiinflamatória, hepatoprotetora, gastroprotetora e antinociceptiva. Este trabalho objetivou investigar a atividade antinociceptiva do ácido oleanólico em modelos de nocicepção aguda induzida por capsaicina (20µl/ 1,6 μg) e óleo de mostarda (0,75%, 50 µL/animal) em camundongos, além dos possíveis mecanismos de ação envolvidos. Camundongos foram pré-tratados com ácido oleanólico (3, 10, 30, 100 mg/kg, v.o.) ou veículo, e os comportamentos de dor foram analisados. As doses de 10, 30 e 100 mg/kg, v.o., foram capazes de reduzir os comportamentos dolorosos expressos pelos animais nos modelos de nocicepção induzida por capsaicina e óleo de mostarda, sendo o maior nível de inibição (p<0,001) encontrado na dose de 30 mg/kg. Na tentativa de desvendar os possíveis mecanismos de ação do ácido oleanólico no modelo de nocicepção induzido por capsaicina, avaliamos a participação dos receptores opióides, α2, óxido nítrico e canais de potássio. O efeito antinociceptivo do ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) foi significantemente revertido pelo pré-tratamento com antagonista opióide, naloxona (2 mg/kg, i.p.); pelo doador de óxido nítrico, L-arginina (600 mg/kg, i.p.) e pela glibenclamida (2 mg/kg, i.p.), um antagonista dos canais de potássio. Por outro lado, o pré-tratamento com um antagonista α2, ioimbina (2 mg/kg, i.p.), não ocasionou a reversão da antinocicepção. Na tentativa de desvendar os possíveis mecanismos de ação do ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda, avaliamos a participação dos receptores opióides, α2 e TRPV1. O efeito antinociceptivo do ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) foi significantemente revertido (p<0,05) pelo pré-tratamento com antagonista opióide, naloxona (2 mg/kg, i.p.), enquanto que o antagonista α2 , ioimbina (2 mg/kg, i.p.), não teve o mesmo efeito. O pré-tratamento com vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.), um antagonista não competitivo do receptor TRPV1 causou inibição significativa da nocicepção (p<0,01) induzida pelo óleo de mostarda, entretanto a administração conjunta com o ácido oleanólico não produziu antagonismo nem potenciação da antinocicepção causada pelo ácido oleanólico. Para avaliar a existência de um impedimento locomotor ou de uma incoordenação motora, foram utilizados os testes do campo aberto e o teste do rota rod, respectivamente. Os dados indicaram que o tratamento com o ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) não induziu (p>0,05) impedimento locomotor ou incoordenação motora nos animais, sendo ainda capaz de reverter (p<0,05) o impedimento locomotor induzido pelo óleo de mostarda no teste do campo aberto. Em conjunto os dados revelaram a efetividade do ácido oleanólico em modelos de nocicepção possivelmente envolvendo receptores opióides, TRPV1, óxido nítrico e canais de potássio. Palavras-chave: ácido oleanólico, triterpenos, atividade antinociceptiva, receptor

opióide, TRPV1, óxido nítrico.

ABSTRACT

Antinociceptive study and possible mechanisms of action of oleanolic acid in models of nociception induced by capsaicin and mustard oil in mice. Juliana Lemos Maia. Principal guide: Dr. Vietla Satyanarayana Rao. Department of Physiology and Pharmacology, UFC, 2006.

Oleanolic acid is a triterpene pentacyclic widely distributed in the plant kingdom. Different biologic activities have been reported including: antiinflammatory, hepatoprotective, gastroprotective and antinociceptive. This work was aimed to evaluate the antinociceptive s induced by capsaicin (20µl/ 1.6 μg) and mustard oil (0.75%, 50 µL/animal) in mice and to establish the likely mechanism(s) of action. Mice were pretreated orally with oleonolic acid (3, 10, 30 and 100 mg/kg) or vehicle, and the pain-related behavioral responses were analysed. The pain behavioral responses were significantly suppressed at doses 10, 30 and 100 mg/kg in acute nociception models induced by capsaicin and mustard oil. The maximal suppression (p<0.001) was observed at the dose of 30 mg/kg. In order to verify the possible mechanisms involved in the antinociceptive action of oleanolic acid in the capsaicin-induced nociception, the involvement of endogenous opioids, α2, nitric oxide and KATP channels were analyzed. The antinociception produced by OA (30 mg/kg, v.o.) was found to be significantly blocked in animals pre-treated with the opioid antagonist, naloxone (2 mg/kg, i.p.); the substrate for oxide nitric synthase, L-arginine (600 mg/kg, i.p.); or a KATP-channel blocker, glibenclamide (2 mg/kg, i.p.) but was unaffected by yohimbine (2 mg/kg, i.p.), an α2 -adrenoceptor antagonist. In order to verify the possible mechanisms involved in the antinociceptive action of oleanolic acid in the mustard oil-induced visceral pain model, opioid, α2 adreno and TRPV1 receptors were analyzed. The antinociceptive effect of oleanolic acid (30 mg/kg, v.o.) was significantly blocked (p<0.05) by pretreatment with the opioid antagonist, naloxone (2 mg/kg, i.p.), but the α2-adrenoceptor antagonist, yohimbine (2 mg/kg, s.c.), had no effect. Pretreatment with ruthenium red (3 mg/kg, s.c.), a non-competitive TRPV1 antagonist alone caused significant inhibition (p<0.01) of mustard oil-induced nociception but its co-administration with oleanolic acid produced neither antagonism nor potentiation of oleonolic acid antinociception. Further, to evaluate a possible motor impairment and motor incoordination effects related to oleanolic acid, open-field and rota-rod tests were performed. The data indicated that the treatment of animals with the oleanolic acid (30 mg/kg, v.o.) was unable to cause motor impairment or motor incoordination effects (p>0.05), being even able to reverse (p<0.05) a mustard oil-induced motor impairment in the open field test. The results taken together strongly suggest the therapeutic potential of oleanolic acid in oblitering nociception through the mechanisms that possibly involve the opioids, TRPV1 receptors, nitric oxide and KATP channels. Key words: oleanolic acid, triterpenes, antinociceptive activity, opioid-receptor, TRPV1 receptor, oxide nitric.

Introdução

17

1. INTRODUÇÃO

1.1. Dor

A dor continua sendo uma das grandes preocupações da humanidade. Desde

os primórdios do ser humano, conforme sugerem alguns registros gráficos da pré-

história e os vários documentos escritos anteriormente, o homem sempre procurou

esclarecer as razões que justificassem a ocorrência de dor e os procedimentos

destinados ao seu controle. A expressão da dor varia não somente de um indivíduo

para outro, mas também de acordo com as diferentes culturas (COLLINS, 1978).

A capacidade de sentir dor tem papel protetor para os seres vivos, pois alerta-

os para iminente ou real dano aos tecidos e induz reflexos coordenados e respostas

comportamentais para que tal lesão seja mínima (LEE et al., 2005; CAILLIET, 1999).

Se o dano tecidual for inevitável, uma gama de alterações da excitabilidade no

sistema nervoso central e periférico se estabelece como um profundo, mas

reversível estado de dor e hipersensibilidade no tecido inflamado e nas suas

adjacências. Esse processo facilita a reparação das partes lesadas, evitando o

contato local até que a cura aconteça. Entretanto, quando as lesões afetam as vias

nervosas centrais e periféricas, podem se desenvolver síndromes dolorosas

persistentes que não oferecem nenhuma vantagem biológica, causando sofrimento e

estresse para os portadores (USUNOFF et al., 2006).

De acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) deve-

se distinguir dor de nocicepção. A dor foi conceituada em 1986, como uma

experiência sensorial e emocional desagradável que é associada a lesões reais ou

potenciais ou descrita em termos de tais lesões (IASP, 1979). Nocicepção, por outro

lado, é um termo neurofisiológico que denota a atividade específica do nervo e o

mecanismo de transmissão fisiológica, não descrevendo a dor psicológica (NASSER

et al., 2004).

A dor é uma sensação de complexa percepção (JULIOS; BASBAUM, 2001).

De todas as sensações é a mais influenciada pelo estado emocional, pelas

18

contingências ambientais e pela própria experiência da pessoa sendo por isto difícil

de tratar clinicamente (CALVINO, 2006).

A dor é uma das razões mais freqüentes das consultas médicas, sendo o

motivo pelo qual cerca de 10 a 40% dos indivíduos procuram clínicos gerais (SBED,

2005). No Brasil, a dor manifesta-se em mais de 70% dos doentes que procuram

consultórios médicos e é a razão das consultas para um terço dos doentes. Devido à

dor, cerca de 50 a 60% dos doentes se tornam parcial ou totalmente incapacitados,

transitória ou permanentemente (TEIXEIRA et al., 1995).

Mesmo tendo uma função tão importante, o conhecimento científico sobre a

dor ainda está no seu início. Apesar de a dor ser um sentimento que sempre

acompanhou o ser humano e os seus ancestrais, foi só no último século que o

Mundo Ocidental conseguiu ter algum tipo de conhecimento sobre o seu mecanismo

de funcionamento, e só nas últimas três décadas a pesquisa sobre a dor foi

conduzida de maneira mais intensa. O principal motivo desta preocupação está no

aumento do número de pessoas que sofrem de dores devido às mudanças ocorridas

na área da saúde e na mudança do estilo de vida do mundo moderno (YENG;

TEIXEIRA, 2005).

Graças aos avanços da medicina, as pessoas estão tendo uma sobrevivência

muito maior do que há apenas 20 ou 30 anos atrás. Além da maior sobrevivência à

doença, houve também nesta época um envelhecimento da população,

especialmente nos países mais ricos, que aumentou em muito a demanda por novas

pesquisas e tratamentos para a dor (YENG; TEIXEIRA, 2005).

1.2. Mecanismos da dor

O fenômeno sensitivo doloroso é um processo extensivo e complexo, que

envolve eventos biológicos em vários níveis do sistema nervoso (PORTH, 2004). A

sensação da dor é iniciada com a transformação dos estímulos ambientais em

potenciais de ação, que das fibras periféricas, são transferidos para o Sistema

Nervoso Central (SNC) através de neurônios de primeira, segunda e terceira ordem.

(SBED, 2005).

19

Os neurônios de primeira ordem e suas terminações receptivas detectam

estímulos que ameaçam a integridade dos tecidos inervados. Os neurônios de

segunda ordem localizam-se na medula espinhal e processam a informação

nociceptiva. Os neurônios de terceira ordem projetam a informação dolorosa para o

cérebro. A partir dessa percepção da dor pelo SNC, são obtidas as respostas

motoras, autonômicas e comportamentais diante do estímulo doloroso (PORTH,

2004).

Durante esse trajeto, esse mecanismo tem sua atividade regulada por um

conjunto de substâncias produzidas no sistema nervoso, que agem sobre o sistema

de transmissão da dor, aumentando ou diminuindo a sensação dolorosa (SBED,

2005).

1.2.1. Ativação e sensibilização dos nociceptores

O estímulo doloroso é transcodificado por um mecanismo de transdução,

onde estímulos nocivos são transformados em potenciais de ação do nervo

sensitivo, captado perifericamente pelos receptores do tipo nociceptores (receptores

para dor) (STUCKY et al., 2001).

Os nociceptores são terminações nervosas livres, que consistem nos

prolongamentos periféricos de axônios de neurônios aferentes primários distribuídos

na periferia, cujos corpos celulares situam-se no glânglio da raiz dorsal ou gânglio

trigeminal (PORTH, 2004). Esses neurônios, denominados neurônios aferentes

primários, possuem além do ramo periférico, um ramo central, que adentra o corno

dorsal da medula espinhal pela raiz dorsal (NUMAZAKI; TOMINAGA, 2004).

Os nociceptores estão localizados na pele, nos músculos, articulações, tecido

conjuntivo e vísceras. Podem ser ativados por basicamente 4 tipos de estímulos:

mecânico, elétrico, térmico ou químico (NASSER et al., 2004). Alguns tecidos

possuem nociceptores que podem ser térmicos (ativados por temperaturas

extremas), mecânicos (ativados por intensa pressão) ou polimodais (ativados por

estímulos químicos, térmicos ou mecânicos de elevada intensidade). As vísceras

possuem nociceptores ―silenciosos‖ que respondem a estímulos químicos e

20

inflamações. A ativação dos nociceptores é, em geral, associada a uma série de

reflexos, tais como o aumento do fluxo sanguíneo local, a contração de músculos da

vizinhança, mudanças na pressão sanguínea e dilatação da pupila (DE LA TORRE,

2001).

A atividade dos receptores nociceptivos é modulada pela ação de substâncias

químicas, que amplificam os eventos pela liberação local de substâncias

denominadas genericamente de algogênicas. Essas substâncias podem surgir em

elevadas concentrações no ambiente tecidual em decorrência de processos

inflamatórios, traumáticos ou isquêmicos (MARQUES, 2004; PORTH, 2004).

Em resposta ao dano tecidual, células liberam mediadores inflamatórios no

local da agressão, tais como, prostaglandinas, leucotrienos, histamina, serotonina,

bradicinina, acetilcolina, citocinas, íons potássio e produtos derivados do ácido

araquidônico (GUYTON; HALL, 2002; CAILLIET, 1999). Outros são produzidos no

sentido inverso da transmissão dos nervos sensitivos, isto é, do corpo neural para a

periferia, sendo a mais importante a substância P (MARQUES, 2004).

Esses mediadores químicos produzem seus efeitos pela estimulação direta

dos nociceptores ou sensibilizando-os aos efeitos dos estímulos nociceptivos; pela

perpetuação das respostas inflamatórias que levam à liberação dos agentes

químicos que atuam como estímulos nociceptivos; ou pela incitação dos reflexos

neurogênicos que aumentam a resposta aos estímulos nociceptivos (PORTH, 2004).

Esses neurotransmissores ligam-se a receptores específicos induzindo alterações

na permeabilidade iônica da membrana pós-sináptica, produzindo desta forma

diferenças de potencial que determinam o nível de atividade do neurônio e a sua

capacidade de transmitir informação a outros neurônios (NASSER et al., 2004). Os

sinais originados dos nociceptores são propagados até a medula espinhal através de

fibras aferentes primárias, que podem ser classificadas com base em seu diâmetro,

estrutura e velocidade de condução (MARQUES, 2004).

O primeiro tipo de neurônio a ser excitado possui fibras do tipo A delta. Esse

tipo de neurônio é responsável pela sensação de dor aguda. Esta é a primeira forma

de impulso de dor que recebemos devido à velocidade em que é transmitida, já que

21

esse tipo de neurônio possui um recobrimento de mielina mais espesso e um

diâmetro do axônio maior (2-6 μm de diâmetro) (JULIUS; BASBAUM, 2001; LEE et

al., 2005). O outro tipo de neurónio possui fibras do tipo C, que leva ao cérebro um

impulso de dor do tipo "pulsante", semelhante as que ocorrem nas inflamações. Este

impulso é mais demorado, pois o neurônio do tipo C tem um diâmetro menor (0,4-1,2

μm de diâmetro) e são amielínicos (LE BARS et al., 2001; DAVIS et al., 2000). Ainda

existem fibras do tipo A beta que são mielinizadas e de rápida condução. Estão

relacionadas à sensação do tato e envolvidas na modulação do sinal doloroso, e em

algumas situações participando de forma absolutamente anormal no processo

doloroso (MARQUES, 2004; PORTH, 2004).

1.2.2. Vias de transmissão da dor

A dor não é uma sensação uniforme, a qualidade da dor e o início das

respostas de proteção são determinados por muitos fatores dentro da medula

espinhal e estruturas do cérebro, envolvidas na integração e modificação da

sinalização nociceptiva (DICKENSON; BESSON, 1997). Existem duas vias que

processam o estímulo doloroso: a via ascendente e a via descendente.

1.2.2.1. Vias ascendentes

Após uma estimulação periférica de natureza e intensidade suficientes para

ativarem os nociceptores, a informação é conduzida em potenciais de ação que

percorrem o neurônio aferente primário, o qual estabelece sinapses com neurônios

do corno dorsal da medula espinhal, denominados neurônios de segunda ordem

(LEE et al., 2005) (Figura 1).

O corno dorsal da medula espinhal apresenta uma organização laminar,

numerada de I à X, cada lâmina com características morfofuncionais e de recepção

das fibras advindas da periferia, distintas. As lâminas mais superficiais (I e II),

juntamente com a lâmina V constituem as regiões predominantemente implicadas na

recepção, processamento e transmissão da informação nociceptiva. As fibras C

terminam na lâmina II, as fibras A delta nas lâminas I e V e, as fibras A beta nas

lâminas II, IV e V (MARQUES, 2004).

22

Os neurônios aferentes primários transmitem o impulso nervoso para a

medula espinhal através da liberação de aminoácidos excitatórios (glutamato e

aspartato) e neuropeptídeos (substância P), os quais ocupam receptores específicos

tipo NMDA e NK1 entre outros, na região pós-sináptica do segundo neurônio

sensitivo (TERMAN; BONICA, 2001). A ativação destes receptores promove a

produção de segundos mensageiros (AMP, fosfatidilinositol, fosfolipase C) para

abertura de canais de cálcio e, consequentemente, influxo de Ca2+ nas células

neuronais. Ocorre então produção de outros mediadores (óxido nítrico e metabólitos

do ácido araquidônico), que alteram a transmissão do potencial de ação e a ultra-

estrutura dos neurônios, suas sinapses, sensibilização medular e aumento da

duração da resposta de certos neurônios (KRAYCHETE; GUIMARÃES, 2003).

Os neurônios de segunda ordem cruzam a medula espinhal, transmitindo o

impulso para o cérebro, incluindo formação reticular, tálamo e córtex cerebral,

através de tratos ascendentes, que formam dois sistemas filogenéticos distintos. O

primeiro, passa através da região medial da medula espinhal, sendo formado pelos

tratos: paleoespinotalâmico, espinoreticular, espinomesencefáfico,

espinoparabrachio-amigdalóide, espinobrachio-hipotalâmico e espinotalâmico. O

outro sistema ocupa a região lateral da medula espinhal e consiste no trato

neoespinotalâmico, espinocervical e pós-sináptico no corno dorsal (ALMEIDA et al.,

2004).

No tálamo, neurônios de terceira ordem emitem axônios através da cápsula

interna ao córtex somatosensor, onde a somatização do estímulo nocivo ocorre, ou

emitem axônios ao giro cingulado anterior, onde existe o componente emocional da

dor (RUSSO; BROSE, 1998).

Contudo, nem todos os eventos que ocorrem no corno dorsal da medula

espinhal facilitam a nocicepção. Em 1965, Melzack e Wall propuseram a teoria do

controle do portão, onde um sistema modulador específico da dor regula a

passagem dos impulsos das fibras aferentes periféricas ao tálamo através dos

neurônios de transmissão no corno dorsal. Os neurônios na substância gelatinosa

(SG) do corno dorsal agem para inibir a via de transmissão. Os interneurônios

inibitórios são ativados pelos neurônios inibitórios descendentes ou pela aferência

23

nociceptiva das fibras A. Eles são inibidos pela aferência nociceptiva da fibra C, de

modo que a atividade persistente da fibra C facilita a excitação das células de

transmissão pelas aferências nociceptivas e não nociceptivas (SCHNEIDER et al.,

1998; MELO, 2006).

1.2.2.2. Vias descendentes

As vias descendentes originadas de estruturas cerebrais têm um importante

papel na modulação e integração das mensagens nociceptivas no corno dorsal da

medula. A via descendente dirige-se em sentido diametralmente oposto ao da via

sensitiva ascendente, exercendo um efeito inibitório e modulador sobre estruturas

distais, muito particularmente sobre a parte posterior da medula espinhal (MILLAN,

1999).

A via descendente é controlada por vários sistemas que modulam a

transmissão nociceptiva, podendo ser tanto inibitórios quanto estimulatórios. A

estimulação de algumas áreas cerebrais (periaquedutal e periventricular) provoca a

liberação de substâncias neuromoduladoras, como por exemplo, os peptídeos

opióides endógenos que tem ação analgésica (MILLAN, 2002). Três famílias

distintas desses peptídeos opióides foram identificados: encefalinas, endorfinas e

dinorfinas (PORTH, 2004).

O sistema serotoninérgico e o sistema catecolinérgico são importantes

exemplos desses sistemas inibitórios. A ativação destes sistemas produz analgesia,

mas a sua falência é obviamente causa de dor, ou seja, quando esta via está

patologicamente interrompida, as endorfinas já não desempenham o seu papel

analgésico (MILLAN, 2002).

Existe um grande número de mediadores químicos implicados no processo de

transmissão da dor tanto em nível periférico quanto em nível de SNC. A sensação

final de dor dependerá, portanto, da interação entre essas substâncias. A

transmissão da dor não é somente um simples processo de transmissão nervosa, e

sim um resultado de numerosos sistemas transmissores tanto excitatórios quanto

24

inibitórios, agindo tanto em nível periférico quanto central (McCURDY; SCULLY,

2005).

FIF

1.3. Classificação dos tipos de dor

1.3.1. Classificação temporal da dor

A dor pode ser classificada de várias maneiras. Quanto a classificação temporal, a

sensação dolorosa pode ser classificada em: dor aguda, dor crônica ou transitória.

Na dor transitória, a ativação dos receptores da dor acontece na ausência de

qualquer dano tecidual (LOESER; MELZACK, 1999).

A dor aguda é um sintoma biológico de um estímulo nociceptivo aparente, como



1.3.1. Classificação temporal da dor

A dor pode ser classificada de várias maneiras. Quanto à classificação

temporal, a sensação dolorosa pode ser classificada em: dor aguda, dor crônica ou

Trauma

Capilar

Liberação de:

Substância P

Histamina

Serotonina

Bradicinina

Prostaglandinas

Vias descendentes inibitórias

Neurotransmissor:

noradrenalina

serotonina

encefalinas

Trato

espinotalâmico

Liberação de

noradrenalina

Neurotransmissores

nervo aferente primário:

Sustância P

Glutamato

GABA

Figura 1- Representação esquemática dos mecanismos da dor

25

transitória. Na dor transitória, a ativação dos receptores da dor acontece na

ausência de qualquer dano tecidual (LOESER; MELZACK, 1999).

A dor aguda é um sintoma biológico de um estímulo nociceptivo aparente,

com um dano tecidual devido à doença ou trauma. Essa dor pode ser altamente

localizada e pode irradiar. Pode ser descrita em caráter de pontadas e persiste

enquanto houver patologia tecidual. A dor aguda tem função de alerta, é auto-

limitada e geralmente desaparece com a resolução do processo patológico. Nos

casos em que o controle do processo patológico não é satisfatório, pode tornar-se

crônica (SMITH et al., 1986; VILELA FILHO; CORRÊA, 1999).

A dor crônica difere significativamente da dor aguda por ter duração maior

que o curso usual de uma doença aguda ou lesão. Essa dor pode estar associada

com a continuação da patologia ou pode persistir após a recuperação da doença ou

lesão. Como ocorre na dor aguda, se a dor crônica for devido à doença orgânica, ela

é efetivamente curada ao se tratar a desordem de base. Geralmente não é bem

localizada e tende a ser maciça, dolorida, contínua ou recorrente (SMITH et al.,

1986; VILELA FILHO; CORRÊA, 1999).

1.3.2. Classificação fisiopatológica da dor

Na classificação fisiopatológica, a dor pode ser dividida em nociceptiva,

neuropática e psicogênica (MILLAN, 1999).

A dor pode ser considerada nociceptiva quando é originada pela estimulação

excessiva dos nociceptores localizados na pele, vísceras e outros órgãos (MILLAN,

1999).

A dor neuropática é fruto da lesão ou disfunção do SNC ou Sistema Nervoso

Periférico. Em geral, persistem por longo tempo após o evento precipitante. A dor

neuropática pode ser episódica, temporária ou crônica, persistente, podendo

inclusive não estar associada a qualquer lesão detectável. Pode manifestar-se de

várias formas como sensação de queimação, peso, agulhadas, ferroadas ou

26

choques, podendo ou não ser acompanhada de "formigamento" ou "adormecimento"

de uma determinada parte do corpo (MILLAN, 1999; TEIXEIRA, 2003).

Considera-se a existência da dor psicogência quando nenhum mecanismo

nociceptivo ou neuropático pode ser identificado e que pode refletir fatores

psicológicos (MILLAN, 1999). Na prática, a dor psicogênica é diagnóstico de

exclusão, tendo ocorrência muito rara. Muitos autores consideram-na virtual, uma

vez que mesmo patologias puramente psiquiátricas são manifestações de alterações

orgânicas e identificáveis, mesmo que somente bioquimicamente.

1.4. Dor Nociceptiva

A dor nociceptiva é a forma de dor que surge em todos os indivíduos normais,

como conseqüência da aplicação de estímulos que produzem danos ou lesões nos

órgãos somáticos ou viscerais. Ocorre como resultado da ativação de nociceptores

em tecidos cutâneos e profundos, os quais poderão encontrar-se em um estado

normal ou sensibilizados. Quando encontram-se normais, nenhuma disfunção

sensorial é observada. Caso estejam sensibilizados, na ocorrência de lesão tissular

periférica e posterior liberação de agentes inflamatórios, alterações sensoriais

(alodínia e hiperalgesia) estarão presentes (FILHO; BRAUN, 2004). A dor

nociceptiva começa simultaneamente ao início da atividade do fator causal, o qual

pode ser usualmente identificado (PORTO, 2004).

A dor nociceptiva somática é frequentemente descrita como uma sensação

dolorosa rude, aguda e localizada. Muitas vezes está associada a uma contratura

muscular e pode ser exarcebada ao movimento. É aliviada pelo repouso, e variável

conforme a lesão básica. Exemplos desse tipo de dor são: dores ósseas, pós-

operatórias, dores músculo-esqueléticas, dores artríticas, entre outras (PERRON;

SCHONWETTER, 2001).

A dor nociceptiva visceral ocorre quando os estímulos que vão produzir a

sensação de dor provêm das vísceras. É causada por alterações internas dos

órgãos ocos e cápsulas de vísceras sólidas, tais como, estômago, rins, bexiga,

vesícula biliar e intestinos. Os principais fatores que estimulam as fibras nociceptivas

27

viscerais são: estiramento ou tensão na parede muscular das vísceras, processo

inflamatório de origem infecciosa ou química, isquemia e neoplasias (CERVERO;

LAIRD, 1999; NESS, 1999; GIAMBERARDINO, 1999).

A dor visceral é usualmente descrita por alguns sintomas característicos:

1) Não é evocada por todas as vísceras. Algumas vísceras apresentam deficiência

de receptores sensoriais. As propriedades funcionais de seus receptores periféricos

não evocam a percepção consciente ou não são receptores sensoriais verdadeiros;

2) Não está sempre relacionada à lesão visceral;

3) É difusa e pobremente localizada devido à organização das vias nociceptivas

viscerais no SNC, que ascendem com as de origem somática;

4) É referida em outros locais, provavelmente relacionada à convergência das fibras

nervosas viscerais e somáticas ao conectarem no corno dorsal da medula espinhal.

A dor é relacionada à pele porque áreas encefálicas interpretam o impulso de

maneira errada, ou porque algumas fibras aferentes inervam estruturas somáticas e

viscerais;

5) É acompanhada de reflexos autonômicos e motores, que servem como

mantenedor e facilitador da transmissão dolorosa (CHAER; TRAUB, 2002;

CERVERO, 2002; GIAMBERARDINO, 1999).

É uma das formas de dor mais comuns, bem como uma das mais freqüentes

razões pelas quais o paciente necessita de cuidados médicos. Apesar disso, a dor

visceral tradicionalmente foi muito pouco estudada, quando comparada à dor

somática, provavelmente devido à dificuldade de acesso aos órgãos internos

(CERVERO, 2002; LAIRD, et al., 2001). Atualmente, com o aumento da sofisticação

tecnológica para detecção e mensuração da dor, a dor visceral passou a ser melhor

estudada.

1.5. Modelos de dor nociceptiva

Diversos modelos animais são empregados no estudo de novas drogas

analgésicas derivadas de produtos naturais. Nesses modelos experimentais, a

nocicepção pode ser induzida por agentes químicos, mecânicos, térmicos e

inflamatórios. A capsaicina e o óleo de mostarda são produtos naturais derivados de

28

plantas, que levam à nocicepção e à inflamação quando aplicados na pele. Essas

substâncias são facilmente encontradas na alimentação diária, o que torna mais fácil

sua utilização. No nosso estudo, a capsaicina foi utilizada como modelo de

nocicepção somática, enquanto que o óleo de mostarda foi utilizado como modelo

de nocicepção visceral (JORDT et al., 2004).

1.5.1. Capsaicina

Capsaicina, um ingrediente pungente da pimenta vermelha (Capsicum spp) é

extensamente utilizada como ferramenta farmacológica no estudo tanto em

humanos quanto em animais (SZALLASI; BLUMBERG, 1999) (Figura 2).

A capsaicina tem um efeito nociceptivo, que se deve à ligação dessa

substância com um receptor específico chamado TRPV1 (receptor vanilóide 1,

inicialmente chamado VR1) presente na membrana de muitos nociceptores,

especialmente nas fibras aferentes primárias A e C que transmitem a sensação de

dor. É um canal iônico polimodal, pois reage não só à capsaicina, mas também ao

calor intenso, prótons (íons de hidrogênio, que acidificam o meio) e derivados

lipídicos (LEE et al., 2005; GEPPETTI et al., 2006). A ativação dos receptores

TRPV1 inicia uma complexa cascata de eventos, incluindo um aumento no influxo de

Ca2+ nos neurônios sensoriais nociceptivos, resultando na despolarização e

liberação de neuropeptídeos pró-inflamatórios dos terminais de neurônios aferentes

(PELISSIER et al., 2002; MELO et al., 2006).

Além dos efeitos associados com a nocicepção, a administração sistêmica da

capsaicina produz vários efeitos farmacológicos, tais como termorregulação,

bradicardia, redução na pressão sanguínea e redução da motilidade intestinal, ações

estas que devem ser reguladas por outros neurônios que não sejam os primários

(SASAMURA; KURAISHI, 1999).

O papel dos receptores TRPV1 na nocicepção aguda e crônica tem sido

estabelecido pelo uso de antagonistas do receptor TRPV1 e camundongos TRPV1

knockout (WALKER et al., 2003). A dessensibilização induzida por agonistas do

receptor TRPV1 apontam para sua utilização na supressão da dor neuropática,

29

enquanto que antagonistas TRPV1 são agentes poderosos no tratamento da dor

inflamatória, pós-operatória e da artrite (LOPEZ-RODRIGUEZ et al., 2003; EL

KOUHEN et al., 2005).

A injeção de capsaicina na pata traseira de camundongos, produz padrão de

comportamento de nocicepção característico, tais como lamber e morder a pata

afetada, produzindo alterações significativas nos limiares de nocicepção térmica e

mecânica. Tais fatos acontecem pela indução da estimulação direta de receptores

específicos localizados nos neurônios nociceptivos, causando a liberação de vários

neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa, dentre estes a substância P.

Os comportamentos dolorosos produzidos têm sido usados como um modelo de

nocicepção em camundongos e mais recentemente em ratos (NAH et al., 2000;

SAWYNOK et al., 2006).

Após repetidas aplicações de capsaicina, ocorre um período de redução na

sensibilidade, e em seguida uma dessensibilização, possivelmente decorrente da

depleção de substância P. Tem sido demonstrado também que dependendo da dose

sistêmica utilizada, a capsaicina pode produzir uma pronunciada nocicepção, bem

como uma antinocicepção. Após aplicações de altas doses de capsaicina em

animais, ocorre dessensibilização e degeneração das fibras aferentes (NOLANO et

al., 1999; SANTOS; CALIXTO, 1997).

Esse modelo é muito atrativo porque os eventos moleculares envolvidos

(ativação dos receptores TRPV1, entrada de cátions e despolarização das fibras C)

são muito melhor entendidos do que aqueles envolvidos em outros modelos de

nocicepção química, como por exemplo no modelo da formalina, onde muitos

mediadores teciduais e celulares estão envolvidos (SAWYNOK et al., 2006).

Figura 2- Estrutura química da capsaicina

30

1.5.2. Óleo de mostarda

O uso de modelos animais é um passo necessário para elucidar o mecanismo

neurofisiológico e neurofarmacológico da nocicepção visceral. Até recentemente,

muito do que se sabia sobre o mecanismo da dor derivava de estudos experimentais

da nocicepção somática. Entretanto, com o passar dos anos, uma variedade de

modelos animais têm sido desenvolvidos para mimetizar a nocicepção originada das

vísceras (LAIRD et al., 2001).

A dificuldade de realizar experimentos envolvendo nocicepção visceral se

deve à maior dificuldade de acesso aos tecidos viscerais quando comparados com

estruturas mais superficiais como a pele. A maioria dos modelos animais de

nocicepção visceral envolve algum tipo de procedimento mais complexo para sua

realização. Mais recentemente, alguns modelos animais utilizando substâncias

algogênicas, como por exemplo, capsaicina, ácido acético e salina hipertônica, têm

sido utilizadas para produzir contrações nos músculos viscerais (GIAMBERADINO,

1999; LAIRD et al., 2001).

Esses modelos ajudaram no melhor entendimento da resposta aguda

fisiológica associada com a nocicepção visceral mecânica ou inflamatória, e tem-se

tornado evidente que dor visceral e somática são diferentes, apesar de algumas

similaridades existirem (CHAER; TRAUB, 2002).

A aplicação tópica de óleo de mostarda na pele ativa as terminações

nervosas produzindo dor, inflamação, hipersensibilidade a estímulos térmicos e

mecânicos (JORDT et al., 2004). O óleo de mostarda é um potente ativador neuronal

que promove alodínia e hiperalgesia em poucos minutos após aplicação. Induz uma

estimulação direta de fibras aferentes sensoriais, uma colite rápida, aguda e

transitória, além de mudanças na motilidade intestinal e inflamação, o que permite

seu estudo como modelo de desordens intestinais (KIMBALL et al., 2005).

A administração intra-colônica do óleo de mostarda, bem como da capsaicina,

pode ser usado como um modelo válido de nocicepção aguda visceral em

camundongos, levando à comportamentos dolorosos espontâneos, simulando a

31

sensação de hiperalgesia visceral geralmente expressada por pacientes com

desordens funcionais viscerais (MAIA et al., 2006).

1.6. O uso de plantas no tratamento da dor

Nos primórdios da humanidade, os homens procuravam vencer as doenças

com exorcismos. A magia foi a primeira fase da luta do homem contra as doenças.

Mais tarde, verificando que nem sempre essas práticas levavam à cura, o homem

acrescentou uma nova arma: a planta (BRESOLIN; FILHO, 2003). Plantas, orações,

magias e crenças se difundiam na esperança de se conseguir minimizar o

sofrimento humano causado pela dor. Com o uso de infusões, chás, beberagens e

emplastros de origem vegetal, a humanidade deu o seu primeiro passo na direção

da futura Medicina (AZAIZEH et al., 2006; RATES, 2001).

No início do século XIX, o francês Armand Seguin, isolou pela primeira vez a

principal substância ativa do ópio: a morfina (nome grego derivado de Morfeus, deus

do sono). O ópio compreende o látex obtido de incisões no fruto da papoula,

Papaver somniferum L. Contêm além da morfina, outros alcalóides importantes,

como a codeína, papaverina e aporfinas (BRESOLIN; FILHO, 2003; PORTH, 2004).

Posteriormente, a morfina foi estudada pelo farmacêutico alemão Friedrich

Sertürner, tornando-se o primeiro composto ativo extraído de um vegetal com

propriedades analgésicas e iniciando-se daí os estudos e pesquisas para isolar os

componentes ativos das plantas.

Em 1828, o farmacêutico francês Henri Leroux e o químico italiano Raffaele

Piria, isolaram uma substância amarela em forma de cristais, com sabor muito

amargo ao qual denominou de salicina ou ácido salicílico (MASON; PASERO, 2006).

Essa substância foi encontrada em plantas, como a Spiraea ulmaria que mais tarde

inspirou o nome aspirina, droga com potencial analgésico e antipirético utilizada até

os dias de hoje.

A partir dessas descobertas, inúmeras outras plantas foram estudadas e seus

potenciais analgésicos descobertos (McCURDY; SCULLY, 2005). Atualmente,

32

aproximadamente 60% da população mundial utiliza plantas medicinais como

medicação. Estima-se a existência de aproximadamente 350.000 espécies de

plantas no mundo e provavelmente apenas 10% foram testadas em ensaios

biológicos (HARVEY, 2000; RATES, 2001).

As plantas medicinais têm ingredientes bioativos que podem ser usados como

atenção primária ou suplementar quando utilizados adequadamente. Até

recentemente, a maioria dos medicamentos era derivada diretamente de plantas ou

de animais. Apesar do grande aumento no uso das drogas sintéticas, os produtos

naturais continuaram a ser o tratamento de escolha em diferentes tipos de doenças

(HALBERSTEIN, 2005).

A descoberta de novos fármacos, ou fármacos acessíveis, pode determinar a

melhoria da qualidade de vida em doenças crônicas ou a própria sobrevivência do

paciente afetado. Socialmente, a descoberta de fontes naturais de compostos

químicos usualmente importados e/ou o desenvolvimento de fitoterápicos de

fabricação nacional, podem ter conseqüências econômicas significativas, além de

possibilitar a autonomia de cada país no gerenciamento de suas políticas de saúde

(ELIZABETZKY, 2001).

A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a

sua complexidade, estimando-se a existência de mais de 2 milhões de espécies

distintas de plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com maior

diversidade genética vegetal do mundo (BRESOLIN; FILHO, 2003), contando com

mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000

espécies (GUERRA; NODARI, 1998).

No Brasil, aproximadamente 84% das drogas atualmente no mercado são

importadas e 60% de todas as drogas processadas são consumidas por 23% da

população, o que faz com que os remédios caseiros à base de plantas medicinais

sejam ainda a principal fonte de medicamentos para a maioria do povo brasileiro.

Assim, é inegável que a maioria da população de baixa renda recorre às plantas

medicinais para o tratamento dos seus males (ELISABETZKY; WANNMACHER,

1993; ELISABETZKY, 2001).

33

Nos últimos anos, tem-se evidenciado um crescente aumento no estudo de

plantas preconizadas pela medicina popular para validar sua utilização como

fitoterápico seguro e eficaz, tendo em vista que o uso popular de uma determinada

planta não é suficiente para validá-la como fitoterápico. Desta forma, o emprego de

técnicas modernas renovou o interesse na procura de novos medicamentos ou de

protótipos de novos fármacos a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2000).

Atualmente, o Ministério da Saúde do Brasil, por meio do Departamento de

Assistência Farmacêutica, vem desenvolvendo de forma participativa com todos os

níveis e instâncias do governo e da sociedade, diversas ações voltadas ao

desenvolvimento das cadeias produtivas de plantas medicinais e fitoterápicos, com

vista à ampliação do acesso a esses produtos e serviços aos usuários do SUS, na

perspectiva da integralidade da atenção à saúde (BRASIL, 2006). Nesse sentido, foi

aprovada no dia 22 de junho de 2006, foi aprovada a Política Nacional de Plantas

Medicinais pelo governo federal, assegurando o acesso às plantas medicinais,

fitoterápicos, com segurança e eficácia, para melhoria da atenção à saúde e

inclusão social (BRASIL, 2006).

1.7. Terpenos

Os princípios ativos são moléculas quimicamente definidas, responsáveis total

ou parcialmente pelas ações farmacológicas das plantas medicinais. A origem

biossintética das principais classes de substâncias vegetais dá-se através do

metabolismo primário ou secundário. Os metabólitos primários são encontrados em

todos os seres vivos, essenciais ao crescimento e à vida, como os aminoácidos e

lipídios. Os metabólitos secundários são produtos de metabolismo específico,

relacionados aos processos adaptativos. São biossintetizados a partir de metabólitos

primários, com distribuição restrita a certas plantas e microorganismos; e

caracterizados por uma enorme diversidade química, como por exemplo os

alcalóides, esteróides e terpenóides (BRESOLIN; FILHO, 2003; KAUFMAN et al.,

1999).

Muitos compostos vegetais biologicamente importantes pertencem à classe

dos terpenos ou derivados de terpenos em partes de sua molécula. Os terpenos

34

constituem o maior grupo de produtos naturais secundários. São metabólitos

secundários derivados do acetato, cuja estrutura básica é o isopreno, e que quando

possuem elementos adicionais, como o oxigênio, são denominados terpenóides. As

diversas substâncias dessa classe, são em geral, insolúveis em água e sintetizadas

a partir de acetil CoA ou de intermediários glicolíticos (NES; ZHOU, 2001).

Os terpenóides representam a maior classe química de constituintes ativos de

plantas, havendo mais de 30.000 substâncias descritas. A classificação básica dos

vários terpenos decorre do número de unidades isoprênicas que contêm

(VERPOORTE; MARASCHIN, 2001). Através de ligações sucessivas de esqueletos

de carbono, obtêm-se assim as classes principais de terpenos, como os

hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20),

sesterterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40) (DEWICK, 2002) (Tabela

1).

Várias atividades farmacológicas dos compostos terpênicos foram

descobertas, tais como sedativa (DO VALE et al., 2002), gastroprotetora (GUEDES,

2002), hepatoprotetora (OLIVEIRA et al., 2005), antiinflamatória (IWAMOTO et al.,

2001; AHMAD et al., 2005; KÜPELI et al., 2003), cardioprotetora (LIEBGOTT et al.,

2000), antitumoral (CARNESECCHI et al., 2004), anti-hipertensiva, relaxante da

musculatura lisa vascular (TORRES et al., 2000), antimicrobiana (MADUREIRA et

al., 2003), antiulcerogênica (HIRUMA-LIMA et al., 2002) e antinociceptiva (GUEDES,

2002; LIMA-JÚNIOR et al., 2006).

Os triterpenos constituem talvez o grupo mais importante dos terpenóides.

São moléculas constituídas por trinta átomos de carbono, seis unidades

isoprenóides (com cinco átomos de carbono). Apresentam estrutura do tipo C30,

policíclica, normalmente tetra ou pentacíclica, quase sempre hidroxilados na posição

C3. Os triterpenos estão divididos em várias classes, com diferentes estruturas

básicas. Já foram isolados e reportados mais de quatro mil triterpenóides naturais e

identificados mais de quarenta tipos de esqueletos (PATOCKA, 2003).

35

Tabela 1 - Classificação dos terpenóides

UNIDADES DE ISOPRENO

NÚMERO DE CARBONOS

CLASSIFICAÇÃO

1

5 Hemiterpeno

2

10 Monoterpeno

3

15 Sesquiterpeno

4

20 Diterpeno

5

25 Sesterterpeno

6

30 Triterpeno

8

40 Tetraterpeno

>8

>40 Politerpeno

Fonte: Santos (2005)

A seleção apropriada da dose para a utilização desses triterpenos é

essencial. Embora alguns triterpenos sejam relativamente seguros, a toxicidade

pode ocorrer em algumas circunstâncias. Por exemplo, em baixas doses um

triterpeno pode ser hepatoprotetor enquanto que em doses altas pode produzir

hepatotoxicidade (LIU, 2005).

Há um crescente interesse nessas substâncias devido ao seu variado

espectro de atividades farmacológicas (PATOCKA, 2003). Apresentam propriedades

medicinais, com grandes potencialidades em atividades biológicas, entre estas:

antiinflamatória (AHMED et al., 2006), antimicrobiana (EL- SEEDI, 2005), antiviral

(NIEDERMEYER et al., 2005), antinociceptiva (LIMA- JÚNIOR et al., 2006),

cardiovascular (DU; KO, 2006), antitumoral e imunomoduladora (PLOHMANN et al.,

1997). Devido à sua grande diversidade o seu estudo científico tem sido de grande

interesse na tentativa de novas e reais aplicabilidades.

36

1.8. Eriope blanchetii (Benth.)

A família Lamiaceae pertencente à Ordem Tubiflorae (Lamiales), abrange

cerca de 200 gêneros e aproximadamente 3.500 a 4.000 espécies, distribuídas em

todo o mundo. Possui ampla distribuição, principalmente na região mediterrânea.

Seu crescimento ocorre em diferentes habitats e altitudes: desde a região Ártica até

o Himalaia, Austrália, África dentre outros (ALMEIDA; ALBUQUERQUE, 2002).

Dentre os gêneros, podemos encontrar o gênero Eriope, nativo das regiões

tropical e subtropical da América do Sul e possui cerca de 20 espécies, sendo que

18 destas estão restritas ao território brasileiro. No Brasil, estas espécies distribuem-

se principalmente em áreas de campo rupestre em Minas Gerais, Bahia, Goiás e

estados vizinhos (DAVID et al., 2001).

Figura 3 – Fotografia ilustrando a flor (A) e a planta (B) da espécie Eriope blanchetii

Na literatura, poucos trabalhos são encontrados utilizando Eriope blanchetii

(Figura 3). Segundo David et al. (2001), de Eriope blanchetii foram isolados quatro

triterpenos pentacíclicos, sitosterol glicosilado, bem como β-peltatina e α-peltatina,

lignanas responsáveis pela atividade citotóxica observada em testes in vitro. Cerca

de 30% do extrato CHCl3 é formado pelo ácido oleanólico, portanto a pequena

expressão desta atividade citotóxica no extrato bruto, provavelmente, é decorrente

da alta concentração dos ácidos triterpênicos, especialmente do ácido oleanólico.

A B

37

1.9. Ácido Oleanólico

O ácido oleanólico (AO) é um triterpeno pentacíclico largamente encontrado

em várias plantas medicinais e em vários outros tipos de plantas, podendo ser

encontrado na forma livre ou ligado com unidades de açúcares denominados

glicosídeos. É um triterpeno pentacíclico pertencente ao grupo dos oleanos e seu

nome oficial é ácido (3β)-3-Hidroxioleano-12-en-28-oico. É um isômero do ácido

ursólico, sendo os dois quase sempre encontrados simultaneamente em diversas

plantas (SOMOVA et al., 2003) (Figura 4).

Nas últimas décadas, vários artigos sobre AO foram publicados, o que reflete

o grande interesse e progresso no entendimento dessa substância, incluindo o

isolamento e purificação de triterpenos de várias plantas, modificações químicas,

estudos farmacológicos, estudos toxicológicos e o uso clínico do AO no tratamento

de várias doenças, tasi como a hepatite (CHEN et al., 2006; LIU, 2005) (Tabela 2).

Muitos experimentos demonstraram uma variedade de atividades

farmacológicas para o AO, dentre as quais se destacam: atividade antiinflamatória

(OVESNA et al., 2004), antioxidante (OVESNA et al., 2006) hepatoprotetora (LIU,

1995), gastroprotetora (SANCHÉZ et al., 2006), antialérgica (BANNO et al., 2004),

anti-úlcera (OVESNA et al., 2004) e antimicrobiana (NGOUELA et al., 2005), bem

como efeito antiparasitário contra Trypanosoma sp. (CUNHA et al., 2003) e

Leishmania species (TORRES-SANTOS et al., 2004). Também mostrou ter efeito

contra patógenos periodontais, contra o vírus do HIV (OVESNA et al., 2004) e contra

Mycobacteruim tuberculosis, o agente causador da tuberculose (GUA et al., 2004).

O AO foi testado para avaliar sua ação antihipertensiva em animais

(SOMOVA et al., 2004) e como imunomodulador (OVESNA et al., 2004). Em virtude

de inúmeras atividades apresentadas por AO, surgiu interesse por parte dos

pesquisadores em estudar os efeitos deste triterpeno na inibição de tumores. Os

resultados mostraram que o AO pode atuar nas diversas fases do desenvolvimento

do tumor (OVESNA et al., 2004; APARECIDA et al., 2006), além de possuir uma

atividade antiproliferativa (CIPAK et al., 2006).

38

Mais recentemente alguns pesquisadores descobriram uma possível ação do

AO sobre o metabolismo do glicogênio. Este parece inibir a enzima que metaboliza o

glicogênio. Testes in vivo comprovaram um potencial efeito hipoglicemiante em ratos

diabéticos (CHEN et al., 2006).

Extratos de plantas ricas em AO têm demonstrado propriedades

antinociceptivas nos testes da placa quente e tailflick (CHOI et al., 2005) e um efeito

benéfico na dor em pessoas com artrites (LUKACZER et al., 2005). Foram

demonstrados também, estudos mostrando a eficácia dessa substância no combate

a infertilidade (CHATTOPADHYAY et al., 2005).

H3C

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C CH3

COOH

HO

Figura 4- Estrutura química do ácido oleanólico

39

Tabela 2- Exemplos de plantas medicinais que contêm ácido oleanólico como constituinte ativo

Nome das plantas medicinais Atividade biológica

Aralia chinesis L. var nuda Nakai Atividade hepatoprotetora

(Araliaceae)

Calendula officinalis L. Atividade antifúngica

(Compositae)

Ganoderma lucidum karst Atividade anticariogênica

Ligustrum lucidum

(Oleaceae) Atividade hipoglicemiante

Oleandra neriifolia L. Atividade antiinflamatória

Panax ginseng C. A. Meyer Atividade hepatoprotetora

(Araliaceae)

Sapindus mukorossi Gaertn Atividade antiinflamatória

(Sapindaceae)

Swertia mileensis He et Shi. Atividade hepatoprotetora

(Gentianaceae)

Tetrapanax papyriferum L. Atividade hepatoprotetora

(Araliaceae)

Tinospora sagittata G. Atividade hipoglicemiante

(Menispermaceae)

(LIU, 1995)

40

1.10. Relevância e Justificativa

A dor é uma das mais frequentes razões das consultas médicas. Possui uma

incidência alta, muitas vezes tornando os doentes parcial ou totalmente

incapacitados (SBED, 2005). Grandes progressos na elucidação dos mecanismos

da transmissão da dor têm permitido a descoberta de novas substâncias usadas no

seu tratamento. Entretanto, a morfina, uma substância que apesar de efetiva

promove uma variedade de efeitos colaterais, continua a ser uma das drogas mais

ultilizadas na prática clínica para desordens dolorosas (BRESOLIN; FILHO, 2003).

Portanto, torna-se necessário a descoberta de novas drogas analgésicas mais

seguras e eficazes (CALIXTO et al., 2001).

Os produtos naturais são uma fonte rica em substâncias com potenciais

efeitos terapêuticos, onde se busca novas fontes de medicamentos. A indicação de

plantas medicinais aumenta a opção terapêutica, ofertando medicamentos

equivalentes, também registrados, com espectros de ação mais adequados e, talvez

com indicações terapêuticas complementares às medicações existentes, sem

substituir os medicamentos já comercializados e registrados (DI STASI, 1996).

Observando-se a necessidade de se descobrir novos medicamentos no

combate à dor, selecionamos o ácido oleanólico, uma substância largamente

encontrada em várias plantas, com uma ampla e reconhecida variedade de

propriedades farmacológicas. Entretanto, poucos são os relatos científicos sobre o

potencial antinociceptivo dessa substância (LIU, 1995).

Nesse sentido, o presente estudo se justifica, tendo em vista que estudos

prévios mostram o potencial terapêutico dessa substância. Contudo, estudos

adicionais são necessários para confirmar a importante atividade antinociceptiva do

ácido oleanólico, bem como analisar os possíveis mecanismos de ação

responsáveis por esse efeito.

41

2. OBJETIVOS

Objetivos gerais:

Determinar a atividade antinociceptiva do ácido oleanólico em modelos de

nocicepção visceral e somática em camundongos

Avaliar os possíveis mecanismos de ação envolvidos

Objetivos específicos:

Investigar a atividade antinociceptiva do ácido oleanólico no modelo de

nocicepção na pata induzida por capsaicina

Avaliar a participação do sistema opióide, do receptor α2-adrenérgico, do óxido

nítrico e dos canais de potássio ATP dependentes no mecanismo antinociceptivo do

ácido oleanólico no modelo de nocicepção na pata induzida por capsaicina

Analisar a atividade antinociceptiva do ácido oleanólico no modelo de nocicepção

visceral induzida por óleo de mostarda

Avaliar a participação do sistema opióide, do receptor α2-adrenérgico e do

receptor da capsaicina (TRPV1) no mecanismo antinociceptivo do ácido oleanólico

no modelo de nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda

Determinar os efeitos do ácido oleanólico nos modelos de campo aberto e rota-

rod

42

3. MATERIAIS

3.1. Material botânico

Partes aéreas de Eriope blanchetii (Benth), foram coletadas na região

metropolitana de Salvador-Bahia, nas proximidades da lagoa do Abaeté. A

identificação botânica foi feita por especialistas e uma excicata com o No (# 045599)

encontra-se depositada no Herbário Alexandre Leal Costa no Departamento de

Biologia da Universidade Federal da Bahia. O material de estudo, o ácido oleanólico,

foi obtido a partir desse material.

3.2. Animais experimentais

Camundongos albinos (Mus musculus) variedade Swiss Webster, adultos,

machos, pesando entre 25-30 g, provenientes do Biotério setorial do Departamento

de Fisiologia e Farmacologia e do Biotério Central da Universidade Federal do

Ceará, mantidos em caixas de propileno, a temperatura média de 26 2º C em

ciclos de claro-escuro de 12/12 horas, recebendo ração padrão (Purina Chow) e

água ―ad libitum‖. Os animais foram colocados em jejum de sólidos 18 h antes da

realização dos experimentos.

Os protocolos utilizados neste trabalho possuem aprovação pelo Comitê de

Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará.

3.3. Drogas e Reagentes

PRODUTOS ORIGEM

Capsaicina Calbiochem, USA

Clonidina Sigma, USA

Diazóxido Sigma, USA

Glibenclamida Sigma, USA

43

Ioimbina Sigma, USA

L- arginina Sigma, USA

L-NAME Sigma, USA

Morfina Cristália, Brasil

Naloxona Sigma, Brasil

Óleo de mostarda Ridel-de Haën, Alemanha

Tween 80 Sigma, USA

Vaselina AVD, Brasil

Vermelho de rutênio Aldrich, USA

3.4. Equipamentos

Equipamento Origem

Balança para animais (mod. MF-6) Filizola, Brasil

Balança analítica (mod. AX-200) Shimadzu, Japão

Campo aberto LPN – CE

Rota-Rod Insight, Brasil

4. MÉTODOS

4.1. Obtenção do ácido oleanólico (extração e fracionamento)

Partes aéreas de Eriope blanchetii (Benth) foram secas à temperatura

ambiente, trituradas e submetidas ao processo de extração a frio com metanol,

seguido de concentração de solvente orgânico. O extrato metanólico obtido foi

submetido a processo de partição com mistura de solventes nas seguintes

proporções: hexano:MeoH/H2O (9:1); CHCl3 : MeOH/H2O (6:4) e AcOEt :H2O (6:4).

A fração clorofórmica obtida de partição foi então cromotografada em sílica gel

usando a mistura de solvente CHCl3;MeOH/H2O com aumento gradativo de

polaridade . As frações obtidas foram purificadas por sucessivas cromatografias em

sílica gel, seguido de reação de metilação com obtenção de éster metílico de ácido

oleanólico na forma pura (2,5 g). O ácido oleanólico foi identificado por dados

44

espectroscópicos como: RMN (1H e 13C), infra-vermelho e espectrometria de massa

além de comparação com dados da literatura.

4.2. Estudo da atividade antinociceptiva somática

4.2.1. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina

Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e colocados para

ambientação no local de observação por 30 min. Após esse período, os animais

foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.),

ácido oleanólico (3, 10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) ou vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.)

1 h antes da administração subplantar (20 µl) da capsaicina. Cada animal foi usado

somente uma vez por experimento. O prurido (tempo de lambedura) na pata que

recebeu capsaicina foi observado durante 5 min (SANTOS; CALIXTO, 1997). A dose

de escolha para a capsaicina foi de (1,6 µg), já a dose de escolha das drogas

agonistas e antagonistas foram baseadas em testes pilotos realizados ou citações

de trabalhos anteriores. Um grupo controle normal que recebeu apenas salina por

via intraplantar foi incluído no estudo.

4.2.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide




ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) 1 h ou morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min antes da

administração subplantar (20 µl) da capsaicina (1,6 μg).

O papel do sistema opióide foi avaliado pela administração de naloxona (2

mg/kg, i.p.) 30 min antes da morfina (5 mg/kg, s.c.) ou 15 min antes do ácido

oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após 30 min da administração da morfina e 1 h após a

administração de ácido oleanólico os animais receberam administração subplantar

(20 µl) da capsaicina (1,6 μg).

45

4.2.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico

Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e colocados

para ambientação no local de observação por 30 min. Após esse período, os

animais foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg;

v.o.), ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) 1 h ou clonidina (0,1 mg/kg, i.p.) 30 min antes

da administração subplantar (20 µl) da capsaicina (1,6 μg).

O papel do sistema adrenérgico foi avaliado pela administração de ioimbina (2

mg/kg, i.p.) 30 min antes de clonidina (0,1 mg/kg, s.c.) ou 15 min ant

oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após 30 min da administração da clonidina e 1 h após a

administração de ácido oleanólico, os animais receberam administração subplantar

(20 µl) da capsaicina (1,6 μg).

4.2.4. Estudo do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico




ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) 1 h, L-NAME (20 mg/kg, i.p.) 20 min ou L-arginina

(600 mg/kg, i.p.) 30 min antes de receberem administração subplantar (20 µl) da

capsaicina (1,6 μg).

O papel da via L-arginina-óxido nítrico foi avaliado pela administração de um

inibidor da enzima óxido nítrico sintase, o L-NAME (20 mg/kg, i.p.), e após 20 min

receberam o AO (30 mg/kg, v.o.) ou L-arginina (600 mg/kg, i.p.), um substrato

precursor da síntese do óxido nítrico. Após 1 h da administração do ácido oleanólico

ou 30 min após o tratamento com L-arginina, os animais receberam a administração

subplantar (20 µl) da capsaicina (1,6 μg).

4.2.5. Estudo do envolvimento dos canais de potássio

Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais e colocados para


46


ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) 1 h, glibenclamida (2 mg/kg, i.p.) 30 min ou

diazóxido (10 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração subplantar (20 µl) da

capsaicina (1,6 μg).

A participação dos canais de potássio na atividade antinociceptiva foi avaliada

pela administração de glibenclamida (2 mg/kg, i.p.) 30 min antes do tratamento com

diazóxido (10 mg/kg, i.p.) ou 15 min antes da administração do ácido oleanólico (30

mg/kg, v.o.). Após 1 h da administração do ácido oleanólico ou 30 min após o

tratamento com diazóxido, os animais receberam a administração subplantar (20 µl)

da capsaicina (1,6 μg).

4.3. Estudo da atividade antinociceptiva visceral

4.3.1. Nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda

Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e tratados com

veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.), ácido oleanólico (3, 10 ,

30 ou 100 mg/kg, v.o.) 1 h ou Morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min antes de receberem

óleo de mostarda intracolônico (0,75% em salina 0,9%; 50 μL/animal) através de

uma fina cânula com ponta arredondada, 1 mm de diâmetro externo. Foram

introduzidos 4 cm de comprimento da cânula pela via intracolônica para injeção do

óleo de mostarda. Foi utilizada vaselina sólida na região perianal para evitar

estimulação local pela administração. O número total de comportamentos

relacionados à dor (lamber abdômen, arrastar-se contra o solo, contorção e retração

abdominais) foram contados por 20 min imediatamente após a instilação de óleo de

mostarda (LAIRD et al., 2001). Um grupo controle normal, que recebeu apenas

salina por via intracolônica foi incluído no estudo.



veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.), ácido oleanólico (30

47

mg/kg, v.o.) 1 h ou morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min antes de receberem óleo de

mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 µL/animal) por via intracolônica.

O papel do sistema opióide foi avaliado pela administração de naloxona (2

mg/kg, i.p.) 30 min antes de morfina (5 mg/kg, s.c.) ou 15 min antes do ácido

oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após 30 min da administração da morfina e 1 h após a

administração de ácido oleanólico os animais receberam óleo de mostarda (0,75%

em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via intracolônica.




mg/kg, v.o.) 1 h ou clonidina (0,1 mg/kg, i.p.) 30 min antes de receberem óleo de


O papel do sistema adrenérgico foi avaliado pela administração de ioimbina (2

mg/kg, i.p.) 30 min antes de clonidina (0,1 mg/kg, s.c.) ou 15 min ant

oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após 30 min da administração da clonidina e 1 h após a

administração de ácido oleanólico, os animais receberam óleo de mostarda (0,75%

em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via intracolônica.

4.3.4. Estudo do envolvimento do receptor da capsaicina (TRPV1)



mg/kg, v.o.) ou vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.) 1 h antes de receberem óleo de


O envolvimento do receptor TRPV1 foi avaliado pela administração de

vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.) 15 min ante g,

v.o.). Após 1h da administração de ácido oleanólico os animais receberam óleo de

mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via intracolônica.

48

4.4. Avaliação da atividade no Sistema Nervoso Central

4.4.1. Teste do Campo Aberto

A atividade motora espontânea dos animais foi verificada de acordo com o

método de Capaz et al (1981) com pequenas modificações, na tentativa de verificar

uma atividade sedativa/depressora no Sistema Nervoso Central, utilizando um

campo aberto, quadrangular, com 30 cm de lado, tendo em demarcados sua base 9

quadrados iguais de 10 cm de lado.

Camundongos foram divididos em 4 grupos de 8 animais: os grupos I e II

foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg de peso;

v.o.) e os grupos III e IV foram tratados com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após

1 h os grupos I e III receberam salina 0,9% por via intracolônica e os grupos II e IV

receberam óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via

intracolônica. Após 5 min os animais foram levados individualmente ao campo

aberto, ambientados por 1 min e, em seguida, observados por 4 min quanto ao

número de campos explorados.

4.4.2. Teste do Rota Rod

Camundongos foram pré-selecionados, 24 h antes da realização do

experimento, ao serem individualmente posicionados no aparelho de rota-rod (4

rotações por minuto). O animal que permanecia 2 min na barra era selecionado para

inclusão no estudo.

Camundongos foram divididos em 4 grupos de 8 animais: os grupos I e II

foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg de peso;

v.o.) e os grupos III e IV foram tratados com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após

1 h os grupos I e III receberam salina 0,9% por via intracolônica, os grupos II e IV

receberam óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via

intracolônica. Após 5 min os animais foram levados individualmente ao rota rod e

registrado o tempo de permanência no aparelho durante 2 min (DUNHAM; MIYA,

1957).

49

4.5. Análise estatística

Os resultados foram expressos como média E.P.M. (erro padrão da média).

Para comparação múltipla dos dados paramétricos, foi utilizada a Análise de

Variância (ANOVA), e o nível de significância entre os grupos foi determinado pelo

teste de múltipla comparação de Dunnet.

Em todas as análises estatísticas, considerou-se o nível crítico para rejeição

da hipótese de nulidade menos que 5% (p<0,05).

.

50

c

c

5. RESULTADOS

5.1. Estudo da atividade antinociceptiva somática

5.1.1. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina em

camundongos.

A Figura 5 e Tabela 3 mostram o efeito da administração oral do ácido

oleanólico sobre a nocicepção induzida por injeção intraplantar de capsaicina (1,6

g, 20 L/pata direita) em camundongos. O ácido oleanólico nas doses de 10, 30 e

100 mg/kg, v.o., reduziu de maneira significativa a nocicepção de 56,0 5,4 s

(veículo) para 26,36 5,4; 17,63 3,2 e 35,50 3,0 s respectivamente. A injeção de

salina induziu somente uma mínima lambedura da pata (1,00 0,38 s).

Vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.), antagonista não competitivo dos

receptores vanilóides utilizado como controle positivo, reduziu significativamente

(p<0,05) a nocicepção induzida pela capsaicina de 56,0 5,4 s (veículo) para 34,4

5,53 s.

51

Figura 5– Efeito do ácido oleanólico sobre a nocicepção induzida pela

administração subplantar de capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a

3% em água destilada, v.o.), ácido oleanólico (3-100 mg/kg, v.o.) e Vermelho de

rutênio (VR, 3 mg/kg, s.c.) foram administrados 1 h antes da administração

subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). Os valores representam a média E.P.M.

do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a administração da capsaicina.

Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs. salina; bp<0,01; cp<0,001;

dp<0,05 vs. controle capsaicina (ANOVA e Teste de Dunnet).

Salina Veículo 3 10 30 100 3 mg/kg

Ácido oleanólico VR

Capsaicina

b

c

d d

a

0

10

20

30

40

50

60

70

Te

mp

o la

mb

ed

ura

pa

ta (

s/5

min

)

52

Tabela 3- Efeito do ácido oleanólico sobre a nocicepção induzida pela

administração subplantar de capsaicina em camundongos

Grupo Dose

(mg/kg) Tempo lambedura pata (s/5min)

Salina - 1,00 0,38 Controle capsaicina - 56,0 5,4 a Ácido oleanólico 3, v.o. 52,44 6,4 10, v.o. 26,36 5,4 b 30, v.o. 17,63 3,2 c 100, v.o. 35,50 3,0 d Vermelho de rutênio 3, s.c. 34,4 5,53 d

Os valores representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata

durante 5 min após a administração da capsaicina. Veículo (controle), ácido

oleanólico e Vermelho de rutênio foram administrados 1 h antes da administração

subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). O grupo salina recebeu apenas salina por

via subplantar. Foram utilizados grupos de 8 animais cada. ap<0,001 vs. salina;

bp<0,01; cp<0,001; dp<0,05 vs. controle capsaicina (ANOVA e Teste de Dunnet).

53


O tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) ou com

morfina (5 mg/kg, s.c.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) no tempo de

lambedura da pata (15,33 3,2; 0,2 0,8 s, respectivamente), quando comparado

ao grupo controle veículo (52,03 2,4 s). O pré-tratamento com naloxona (2 mg/kg,

i.p.) reverteu significativamente (p<0,001) a inibição dos comportamentos

nociceptivos do ácido oleanólico (47,29 4,4 s) e da morfina (39,86 4,2 s) (Figura

6 eTabela 4).



clonidina (0,1 mg/kg, i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do tempo de

lambedura da pata (14,43 3,3; 3,4 1,26 s, respectivamente), quando comparado

ao grupo controle veículo (51,60 2,2 s). O pré-tratamento com ioimbina (2 mg/kg,

i.p.) reverteu significativamente (p<0,001) a inibição dos comportamentos

nociceptivos da clonidina (38,60 3,3 s), porém foi ineficaz na reversão da

antinocicepção produzida pelo ácido oleanólico (21,14 4,56 s) (Figura 7 e Tabela

5).

54

Figura 6– Estudo do envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação

do ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de

capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, v.o.) e

ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e a morfina (5

mg/kg, s.c.) 30 min antes da administração subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL).

A naloxona (Nalox, 2 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 min antes da morfina (5 mg/kg,

s.c.) ou 15 min antes do ácido oleanólico. Os valores representam a média E.P.M.

do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a administração da capsaicina.

Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,001

vs. ácido oleanólico e cp<0,001 vs. morfina (ANOVA e Teste de Dunnet).

Veículo AO 30 Morf 5

Nalox Nalox

mg/kg

a

b

a

c

Capsaicina

0

10

20

30

40

50

60

Te

mp

o la

mb

ed

ura

pa

ta (

s/ 5

min

)

55


oleanólico e morfina na nocicepção induzida pela administração

subplantar de capsaicina em camundongos

Grupo Dose


Controle capsaicina

- 52,03 2,4

Ácido oleanólico

30, v.o. 15,33 3,2 a

Morfina

5, s.c. 0,2 0,8 a

Naloxona + Morfina

2, i.p. +

5, s.c.

39,86 4,2 c

Naloxona + Ácido oleanólico

2, i.p. +

30, v.o.

47,29 4,4 b


durante 5 min após a administração da capsaicina. Veículo (controle) e ácido

oleanólico foram administrados 1 h antes e morfina 30 min antes da administração

subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). A naloxona foi administrada 30 min antes

da morfina ou 15 min antes do ácido oleanólico. Foram utilizados 8 animais por

grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,001 vs. ácido oleanólico e cp<0,001

vs. morfina (ANOVA e Teste de Dunnet).

56

Figura 7– Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico no mecanismo de

ação do ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração

subplantar de capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água

destilada, v.o.) e ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes

e clonidina (Clon, 0,1 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração subplantar de

capsaicina (1,6 μg/20 μL). A ioimbina (Ioimb, 2 mg/Kg, i.p.) foi administrada 30 min

antes de clonidina (0,1 mg/Kg, s.c.) ou 15 min antes do ácido oleanólico. Os valores

representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a

administração da capsaicina. Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs.

controle capsaicina; bp<0,001 vs. clonidina (ANOVA e Teste de Dunnet).

AO 30 Clon 0,1 mg/kg

Ioimb Ioimb

a

a

b

Veículo

Capsaicina

0

10

20

30

40

50

60

Te

mp

o la

mb

ed

ura

pa

ta (

s/5

min

)

57


oleanólico e clonidina na nocicepção induzida pela administração


Grupo Dose


Controle capsaicina

- 51,60 2,2

Ácido oleanólico

30, v.o. 14,43 3,3 a

Clonidina

0,1, i.p. 3,4 1,26 a

Ioimbina + Clonidina

2, s.c. +

0,1, i.p.

38,60 3,3 b

Ioimbina + Ácido oleanólico

2, s.c. +

30, v.o.

21,14 4,56



oleanólico foram administrados 1 h antes e clonidina 30 min antes da administração

subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). A ioimbina foi administrada 30 min antes da

clonidina ou 15 min antes do ácido oleanólico. Foram utilizados 8 animais por grupo.

ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,001 vs. clonidina (ANOVA e Teste de

Dunnet).

58

5.1.4. Estudo do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico

O tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/Kg, v.o.) ou com L-

NAME (20 mg/Kg, i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do tempo de

lambedura da pata (20,87 2,88; 12,83 3,99, respectivamente), quando

comparado ao grupo controle veículo (51,03 4,2). O pré-tratamento com L-arginina

(2 mg/Kg, i.p.) reverteu significativamente a antinocicepção induzido pelo ácido

oleanólico (p<0,05), enquanto que o pré-tratamento com L-NAME (20 mg/kg, i.p.)

potencializou a antinocicepção induzida pelo AO (p<0,05), respectivamente (41,67

4,0; 4,33 1,90) quando comparado ao grupo AO (20,87 2,88) (Figura 8 e Tabela

6).

5.1.5. Estudo do envolvimento dos canais de potássio


diazóxido (10 mg/kg, i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do tempo de

lambedura da pata (21,29 6,54; 8,8 2,21, respectivamente), quando comparado

ao grupo controle veículo (61,50 6,5). O pré-tratamento com glibenclamida (2

mg/kg, i.p.) reverteu significativamente a inibição dos comportamentos nociceptivos

do ácido oleanólico (p<0,05) e do diazóxido (p<0,01), respectivamente (42,50

6,54; 34,63 6,27) (Figura 9 e Tabela 7).

59

Figura 8– Estudo do envolvimento do óxido nítrico no mecanismo de ação do


capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, v.o.) e

ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e a L-arginina (L-arg,

600 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração subplantar (20µl) da capsaicina

(1,6μg). O L-NAME (20 mg/kg, i.p.) foi administrado 20 min antes da L-arginina (600

mg/kg, i.p.) ou 15 min antes do ácido oleanólico. Os valores representam a média

E.P.M. do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a administração da

capsaicina. Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina;

bp<0,001 vs. L-NAME e c,dp<0,05 vs. ácido oleanólico (ANOVA e Teste de Dunnet).

Veículo 30 600 20 L-NAME +

L-arg

AO +

L-arg

AO +

L-NAME

mg/kg

AO L-arg L-NAME

a

a

b

c

a,d

0

10

20

30

40

50

60

Tem

po

lam

bed

ura

pata

(s/5

min

)

60

Tabela 6- Efeito do L-NAME e L-arginina sobre a atividade antinociceptiva do

ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração


Grupo Dose

(mg/kg) Tempo lambedura pata

(s/5min)

Controle capsaicina

- 51,03 4,2

Ácido oleanólico

30, v.o. 20,87 2,88 a

L-arginina

600, i.p. 43,83 4,42

L-NAME

20, i.p. 12,83 3,99 a

L-NAME + L-arginina

20, i.p. +

600, i.p.

36,17 4,04 b

L-arginina + Ácido oleanólico

600, i.p. +

30, v.o.

41,67 4,0 c

L-NAME + Ácido oleanólico

20, i.p. +

30, v.o

4,33 1,9 a,d



oleanólico foram administrados 1 h antes e a L-arginina 30 min antes da

administração subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). O L-NAME foi administrado

20 min antes da L-arginina ou 15 min antes do ácido oleanólico. Foram utilizados 8

animais por grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,001 vs. L-NAME e

c,dp<0,05 vs. ácido oleanólico (ANOVA e Teste de Dunnet).

61

Figura 9– Estudo do envolvimento dos canais de potássio no mecanismo de

ação do ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração

subplantar de capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água

destilada, v.o.) e ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes

e o diazóxido (Diaz, 10 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração subplantar de

capsaicina (1,6 μg/20 μL). A glibenclamida (Glib, 2 mg/kg, i.p.) foi administrada 30

min antes do diazóxido ou 15 min antes do ácido oleanólico. Os valores

representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a

administração da capsaicina. Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs.

controle capsaicina; bp<0,05 vs. Ácido oleanólico e cp<0,01 vs. diazóxido (ANOVA e

Teste de Dunnet).

Veículo AO 30 Diaz 2

Glib Glib

mg/kg

a

a

b

c

Capsaicina

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Tem

po

lam

bed

ura

pata

(s/5

min

)

62

Tabela 7- Efeito da glibenclamida sobre a atividade antinociceptiva do ácido

oleanólico e diazóxido na nocicepção induzida pela administração


Grupo Dose


Controle capsaicina

- 61,50 6,5

Ácido oleanólico

30, v.o. 21,29 6,54 a

Diazóxido

10, i.p. 8,8 2,21 a

Glibenclamida + Diazóxido

2, i.p. +

10, i.p.

34,63 6,27 c

Glibenclamida + Ácido oleanólico

2, i.p. +

30, v.o.

42,50 6,54 b



oleanólico foram administrados 1 h antes e diazóxido 30 min antes da administração

subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). A glibenclamida foi administrada 30 min

antes do diazóxido ou 15 min antes do ácido oleanólico. Foram utilizados 8 animais

por grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,05 vs. ácido oleanólico e cp<0,01

vs. diazóxido (ANOVA e Teste de Dunnet).

63

5.2. Estudo da atividade antinociceptiva visceral

5.2.1. Nocicepção induzida pela adminstração intracolônica de óleo de

mostarda em camundongos

O triterpeno ácido oleanólico nas doses de 10, 30 e 100 e a morfina (5

mg/kg), atuaram reduzindo o número total de comportamentos de dor visceral

expressos pelos animais (28,80 4,76; 19 3,27; 34,17 3,13; 2,14 0,86,

respectivamente) de forma significativa, comparados ao grupo controle óleo de

mostarda (54,4 1,03). Este induziu dor visceral caracterizada pela diferença

estatística observada (p<0,001) entre este e o grupo salina (5,42 2,37), que

recebeu somente salina por via intracolônica (Figura 10 eTabela 8).



morfina (5 mg/kg, s.c.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do número de

comportamentos de dor expressos (19,0 3,27; 8,86 1,6, respectivamente),

quando comparado ao grupo controle veículo (54,4 1,03). O pré-tratamento com

naloxona (2 mg/kg, i.p.) reverteu (p<0,05) a inibição dos comportamentos

nociceptivos do ácido oleanólico (34,0 5,1) e da morfina (21,0 3,35) (Figura 11 e

Tabela 9).

64

Figura 10- Efeito antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de nocicepção

visceral induzida por óleo de mostarda em camundongos. Veículo (Tween 80 a

3% em água destilada, v.o.) e ácido oleanólico (3-100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 1 h antes e morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min antes da administração

intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 L/animal). Os valores

representam a média E.P.M. do número de comportamentos de dor durante 20 min

após a administração do óleo de mostarda. Foram utilizados 8 animais por grupo.

ap<0,001 vs. grupo salina; bp<0,001 e cp<0,01 vs. controle óleo de mostarda

(ANOVA e Teste de Dunnet).

Ácido oleanólico

Salina Veículo 3 10 30 100 5 mg/kg

Morfina

Óleo de Mostarda

a

b

b

c

b

0

10

20

30

40

50

60

Nú

mero

de C

om

po

rtam

en

tos

de d

or/

20m

in

65

Tabela 8- Efeito do ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral

induzida por óleo de mostarda em camundongos

Grupo Dose

(mg/kg) Número de comportamentos

de dor/20min.

Salina - 5,42 2,37 Controle óleo de mostarda - 54,4 1,03 a ácido oleanólico 3, v.o. 51,17 4,17 10, v.o. 28,80 4,76 b 30, v.o. 19,0 3,27 b 100, v.o. 34,17 3,13c Morfina 5, s.c. 2,14 0,86 b

Os valores representam a média E.P.M. do número dos comportamentos de

dor durante 20 min após a administração do óleo de mostarda. Veículo (controle) e

ácido oleanólico foram administrados 1 h antes e morfina 30 min antes da

administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina, 50 L/animal). O

grupo salina recebeu apenas salina por via intracolônica. Foram utilizados grupos de

8 animais cada. ap<0,001 vs. grupo salina; bp<0,001 e cp<0,01 vs. controle óleo de

mostarda (ANOVA e Teste de Dunnet).

66

Figura 11- Estudo do envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação

do ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em

camundongos. Veículo (Tween 80 a 2% em água destilada, v.o.) e ácido oleanólico

(AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min

antes da administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%,

50 μL/animal). A naloxona (Nalox, 2 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 min antes da

morfina ou 15 min antes da administração do ácido oleanólico. Os valores



ap<0,001 vs. grupo controle mostarda; bp<0,05 vs ácido oleanólico e cp<0,05 vs.

morfina (ANOVA e Teste de Dunnet).

Veículo AO 30 Morfina 5 mg/kg

Nalox Nalox

a

b

a

c

Óleo de mostarda

0

10

20

30

40

50

60

Nú

mero

de C

om

po

rtam

en

tos

de d

or/

20 m

in

67


oleanólico e morfina na nocicepção visceral induzida por óleo de


Grupo Dose


de dor/20min.

Controle óleo de mostarda

- 54,4 1,03

Ácido oleanólico

30, v.o. 19,0 3,27 a

Morfina

5, s.c. 8,66 1,6 a

Naloxona + Morfina

2, i.p. +

5, s.c.

21,0 3,35 c

Naloxona + Ácido oleanólico

2 , i.p. +

30, v.o.

34,0 5,1 b



ácido oleanólico foram administrados 1 h antes e morfina 30 min antes da

administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina, 50 L/animal). A

naloxona foi administrada 30 min antes da morfina ou 15 min antes da administração

do ácido oleanólico. Foram utilizados grupos de 8 animais cada. ap<0,001 vs. grupo

controle mostarda; bp<0,05 vs ácido oleanólico e cp<0,05 vs. morfina (ANOVA e

Teste de Dunnet).

68


O pré-tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) ou com

clonidina (0,1 mg/kg, i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do número

de comportamentos de dor (23,60 3,4; 3,6 1,16, respectivamente), quando

comparado ao grupo controle óleo de mostarda (55,0 2,2). O tratamento com

ioimbina (2 mg/kg, i.p.) reverteu (p<0,001) a inibição dos comportamentos

nociceptivos da clonidina (39,67 2,33), porém não reverteu a atividade

antinociceptiva do ácido oleanólico (15,75 2,62) (Figura 12 e Tabela 10).

5.2.4. Estudo do envolvimento do receptor da capsaicina (TRPV1)

Os grupos tratados com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.), vermelho de rutênio

(3 mg/kg, i.p.) e ácido oleanólico + vermelho de rutênio apresentaram uma redução

significativa (p<0,001) na expressão do número de comportamentos de dor visceral

(28,83 1,4; 32,50 3,06; 26,67 1,5 respectivamente) quando comparados ao

grupo controle óleo de mostarda (54,60 2,31) (Figura 13 e Tabela 11).

69

Figura 12- Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico no mecanismo de

ação do ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de

mostarda em camundongos. Veículo (Tween 80 a 2% em água destilada, v.o.) e

ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e clonidina

(Clon, 0,1 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração intracolônica de óleo de

mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 μL/animal). A ioimbina (Ioimb, 2 mg/kg, i.p.) foi

administrada 30 min antes de clonidina (0,1 mg/kg, s.c.) ou 15 min antes do

oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Os valores representam a média E.P.M. do número de

comportamentos de dor durante 20 min após a administração do óleo de mostarda.

Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs. grupo controle mostarda;

bp<0,001 vs clonidina (ANOVA e Teste de Dunnet).

Veículo AO 30 Clon 0,1 mg/kg

Ioimb Ioimb

a

a

b

Óleo de mostarda

0

10

20

30

40

50

60

Nú

mero

de C

om

po

rtam

en

tos

de d

or/

20 m

in

70


oleanólico e clonidina na nocicepção visceral induzida por óleo de


Grupo Dose


de dor/20min.


- 55,0 2,2

Ácido oleanólico

30, v.o. 23,6 3,4 a

Clonidina

0,1, i.p. 3,6 1,16 a

Ioimbina + Clonidina

2, s.c. +

0,1, i.p.

39,67 2,33 b

Ioimbina + Ácido oleanólico

2, s.c. +

30, v.o.

15,75 2,62



ácido oleanólico foram administrados 1 h antes e clonidina 30 min antes da

administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina, 50 L/animal). A

ioimbina foi administrada 30 min antes da clonidina ou 15 min antes da

administração do ácido oleanólico. Foram utilizados grupos de 8 animais cada.

ap<0,01 vs. grupo controle mostarda; bp<0,001 vs clonidina (ANOVA e Teste de

Dunnet).

71

Figura 13- Estudo do envolvimento do receptor vanilóide no mecanismo de

ação do ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de

mostarda em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, v.o.) e o

ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e vermelho de

rutênio (3 mg/kg, s.c.) 30 min antes da administração intracolônica de óleo de

mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 μL/animal). O vermelho de rutênio (3 mg/kg,

s.c.) foi administrada 15 min antes da administração do ácido oleanólico. Os valores



ap<0,001 vs. grupo controle mostarda (ANOVA e Teste de Dunnet).

Veículo AO 30 AO 30 +

Vermelho de

Rutênio

mg/kg Vermelho de

Rutênio

a

a

a

0

10

20

30

40

50

60

Nú

mero

de C

om

po

rtam

en

tos

de d

or/

20 m

in

72

Tabela 11- Efeito do vermelho de rutênio sobre a atividade antinociceptiva do

ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzida por

óleo de mostarda em camundongos

Grupo Dose


de dor/20min.


- 54,60 2,31

Ácido oleanólico

30, v.o. 28,83 1,4 a

Vermelho de Rutênio

3, i.p. 32,50 3,06 a

Vermelho de Rutênio + Ácido oleanólico

3, i.p. +

30, v.o.

26,67 1,5 a



ácido oleanólcio foram administrados 1 h antes e vermelho de rutênio 30 min antes

da administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina, 50

L/animal). O vermelho de rutênio foi administrado 15 min antes da administração do

ácido oleanólico. Foram utilizados grupos de 8 animais cada. ap<0,001 vs. controle

óleo de mostarda (ANOVA e Teste de Dunnet).

73

5.3. Avaliação da atividade no Sistema Nervoso Central

5.3.1. Teste do Campo Aberto

Os dados indicam que o ácido oleanólico, na dose de 30 mg/kg, não interfere

com o número de invasões dos animais, quando comparada ao grupo controle

veículo (44,67 2,11; 47,00 4,53, respectivamente). Porém, o óleo de mostarda

inibiu significativamente (p<0,05) a atividade locomotora normal dos animais (28,00

2,59) comparado ao grupo veículo. Os animais tratados com o triterpeno e que

receberam o óleo de mostarda por via intracolônica apresentaram uma reversão

(50,50 7,44) significativa (p<0,05) da inibição da atividade locomotora induzida

pelo óleo (Tabela 12).

5.3.2. Teste do Rota Rod

Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, v.o.) e ácido oleanólico (30

mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes da administração intracolônica de salina

ou de óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 L/animal). Os dados indicam

que não houve diferença estatisticamente significante (p>0,05) entre os grupos

veículo, ácido oleanólico, veículo + óleo de mostarda e ácido oleanólico + óleo de

mostarda quanto ao tempo de permanência na barra (Tabela 13).

74

Tabela 12- Efeito do ácido oleanólico no teste do campo aberto em camundongos

Grupo Número de invasões

Veículo AO (30 mg/kg, v.o.) Veículo + óleo de mostarda AO (30 mg/kg, v.o.) + óleo de mostarda

47,00 4,53

44,67 2,11

28,00 2,59 a

50,50 7,44 b

Camundongos foram pré-tratados com veículo (3% tween 80 em água

destilada, v.o.) ou ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.), antes da administração

intracolônica de salina ou óleo de mostarda (0,75%, 50 μl). Os valores representam

a média E.P.M. do número de invasões dos animais após administração do óleo

de mostarda. ap<0,05 vs. grupo veículo; bp<0,05 vs. veículo + óleo de mostarda

(ANOVA e Teste de Dunnet).

75

Tabela 13- Efeito do ácido oleanólico no teste do rota rod em camundongos

Grupo Dose

(mg/kg) Tempo de permanência

na barra (s.)/2min.

- Controle (veículo)

120,00 0,00

Ácido oleanólico

30, v.o. 120,00 0,00

Óleo de Mostarda

- 114,30 4,54

Ácido oleanólico + Óleo de Mostarda

30, v.o. 116,78 3,14

Os valores representam a média E.P.M. do tempo (s) de permanência dos

animais no aparelho de rota rod durante 2 min. Veículo (controle), ácido oleanólico

foram administrados 1 h antes da administração intracolônica de salina ou de óleo

de mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 L/animal). Foram utilizados grupos de 8

animais cada (ANOVA e Teste de Dunnet).

76

6. DISCUSSÃO

A pesquisa com produtos naturais continua a nos dar uma enorme variedade

de substâncias que são usadas para o desenvolvimento de novas drogas pelas

indústrias farmacêuticas (BORRIS, 1996). Atualmente, o interesse para o uso clínico

de novas substâncias com atividades analgésicas utilizadas principalmente para o

tratamento de vários tipos de dor, vem aumentando significativamente. Vários

modelos de nocicepção em animais de laboratório podem ser utilizados para

verificar a atividade analgésica de extratos e compostos. No entanto, de uma

maneira geral, esses modelos possuem características próprias que devem ser

consideradas, tais como simplicidade, reprodutibilidade e validade dos resultados

obtidos e principalmente, a possibilidade de serem correlacionados com estudos

clínicos (DICKENSON; BESSON, 1997).

Uma classe de substâncias bastante estudada hoje em dia é a dos

triterpenos. Os triterpenos são substâncias naturais e biologicamente ativas

extraídas de muitas plantas, que têm produzido resultados promissores em estudos

experimentais e clínicos (SPESSOTO et al., 2003). O ácido oleanólico é um

triterpeno natural encontrado em algumas plantas e é um componente de muitas

ervas medicinais. Estudos anteriores demonstraram que essa substância possui

uma variedade de ações amplamente conhecidas, tais como: hepatoproteção,

gastroproteção, antiinflamatória, anti-câncer, antioxidante e também antinociceptiva

(CIPAK et al., 2006). Várias dessas atividades farmacológicas do AO são bem

estabelecidas na literatura, principalmente a atividade hepatoprotetora (TANG et al.,

2005; LIU, 2005). Entretanto, poucos trabalhos visaram o estudo da atividade

antinociceptiva.

Estudo realizado por Choi et al. (2005), demonstrou a atividade

antinociceptiva de um extrato de Akebia quinata nos modelos de placa quente e tail

flick, onde parte dessa atividade foi atribuída ao AO. A avaliação da atividade

antinociceptiva do AO isolado de um extrato de Kochia scoparia L., foi avaliada

também em um estudo realizado por Matsuda et al. (1997), nos testes de contorções

abdominais induzidas por ácido acético assim como no teste da formalina.

77

No presente estudo, procuramos avaliar a atividade antinociceptiva do AO

usando dois modelos de nocicepção, um somático e outro visceral, assim como

buscamos desvendar os possíveis mecanismos de ação envolvidos. O primeiro foi

um modelo de nocicepção neurogênica induzida pela injeção intraplantar de

capsaicina em camundongos.

Sakurada et al. (1992), foram os primeiros a demonstrar que a injeção

intraplantar de capsaicina na pata posterior de camundongos causava vigorosa

nocicepção, caracterizadas por lambidas e mordidas, sendo esse efeito relacionado

com a nocicepção de origem neurogênica. A capsaicina é um ingrediente pungente

extraído da pimenta vermelha, que estimula um receptor específico denominado

TRPV1, localizado nas fibras C. Quando aplicada na pele ou em animais, produz

irritação caracterizada por reação dolorosa e subseqüente dessensibilização para a

dor induzida quimicamente (MELO et al., 2006).

Sabe-se que a injeção intraplantar de capsaicina leva ao aumento na ativação

de nociceptores presentes nas fibras aferentes primária do tipo C e A , na ativação

de receptores TRPV1 e causa acúmulo de Ca2+, o que é necessário para a liberação

de neurotransmissores e para a inflamação neurogênica (SZOLCSÁNYI, 1999;

SAKURADA et al., 2003).

Os resultados obtidos com o AO, mostram que a substância administrada via

oral (10; 30 e 100 mg/kg) e o vermelho de rutênio, foram capazes de inibir a

nocicepção aguda induzida pela administração de capsaicina em camundongos. AO

produziu uma antinocicepção dose dependente nas dose de 10 e 30 mg/kg,

enquanto que em uma dose maior (100 mg/kg) a resposta foi bem mais reduzida

apesar de estatisticamente diferente. Essa é uma característica da resposta da

droga e consideramos que o AO em baixas doses produz efeitos benéficos

(CALABRESE et al., 2006).

Alguns trabalhos mostram que o AO em baixas doses, pode oferecer

gastroproteção, hepatoproteção, enquanto que em altas doses pode produzir

hepatotoxicidade. Portanto, apesar de ser relativamente segura e não tóxica a

78

seleção da dose apropriada da substância é essencial (LIU, 2005; LIU, 1995;

OVESNÁ et al., 2004).

Na dose de 100 mg/kg, o efeito inibitório do AO na nocicepção se assemelha

aquele do vermelho de rutênio, um antagonista não-competitivo TRPV1.

Capsazepina, embora pareça ser um antagonista seletivo dos receptores TRPV1,

não foi utilizada para comparação com o AO porque parece ser menos efetivo em

roedores e recentemente sua seletividade tem sido questionada (CORRELL et al.,

2004; WALKER et al., 2003).

De acordo com Stanfa et al. 1992, o sistema opióde exerce um importante

papel na modulação da dor tanto em condições fisiológicas, quanto em condições

inflamatórias. Estudos anteriores mostraram que opióides endógenos agem na

antinocicepção por abrir os canais de potássio ATP dependentes (LOHMANN;

WELCH, 1999).

Desde a descoberta do ópio da papola, é sabido que os opiáceos como a

morfina e a codeína têm efeitos analgésicos. A ligação dos opióides aos neurônios

pode provocar analgesia de duas maneiras: provocando a hiperpolarização das

membranas, devido ao aumento da condutância ao K+; ou pela diminuição da

liberação de neurotransmissores excitatórios, devido à inibição de canais de Ca2+

ativados por voltagem.

O efeito antinociceptivo de triterpenos envolvendo o sistema opióide já foi

descrito na literatura. Oliveira et al. (2005) demonstraram que o efeito antinociceptivo

da mistura de triterpenos, α- e -β amirinas, deve-se em parte a participação do

sistema opióide. Outro estudo feito por Ferreira et al. (2000), também mostrou o

efeito antinociceptivo do extrato de Epidendrum Mosenii, provavelmente devido à

presença de triterpenos, e em parte devido à participação do sistema opióide.

No nosso estudo, o papel do sistema opióide foi determinado pela

administração de morfina (5 mg/kg s.c.) e naloxona (2 mg/kg i.p.). Nossos resultados

sugerem a participação do sistema opióide no efeito antinociceptivo do AO frente à

79

capsaicina, devido a reversão do efeito antinociceptivo em animais pré-tratados com

naloxona, um antagonista opióide não seletivo.

Os canais KATP dependentes também mostraram ter um envolvimento nos

processos de dor. A ativação desses canais, leva a uma hiperpolarização celular,

diminuindo os níveis de Ca2+ intracelular e reduzindo a liberação de

neurotransmissores, desse modo levando à antinocicepção (ASSANO et al., 2000;

OCANA et al., 2004; LOHMANN; WELCH, 1999). Dependendo da localização, esses

canais podem agir direta ou indiretamente nos sinais de transmissão da dor.

Atualmente, vários anestésicos usados clinicamente agem por interagir com canais

de potássio. Alguns produtos naturais também possuem essa mesma ação

(McCURDY; SCULLY, 2005).

Para verificar o possível envolvimento dos canais KATP dependentes no

mecanismo de ação do AO, utilizamos a glibenclamida, um conhecido bloqueador

desses canais. Os resultados obtidos mostraram que a antinocicepção produzida

pelo AO não é somente revertida pelo naloxona, como também é revertida pela

glibenclamida, sugerindo o envolvimento dos canais KATP dependentes nesse

mecanismo de ação.

Outro mecanismo que procuramos avaliar foi o envolvimento do sistema

adrenérgico. O envolvimento dos receptores adrenérgicos do tipo 2 na modulação

da transmissão dolorosa encontra-se bastante estabelecido. Os receptores

adrenérgicos 2 encontram-se envolvidos na analgesia produzida após estimulação

de diversos componentes do sistema endógeno, como por exemplo a substância

cinzenta periaqueductal e diversas áreas do tronco cerebral que alojam grupos de

neurônios noradrenérgicos (JONES, 1992).

O funcionamento dos receptores quando ativados por um agonista é o de

inibir a enzima adenilato ciclase, que causa conseqüentemente diminuição do AMP

cíclico (AMPc) intracelular. Uma diminuição no AMPc causa atenuação da ativação

das proteínas alvo reguladoras, impedindo sua fosforilação, que, por sua vez, altera

a resposta biológica celular. Outro mecanismo é através da saída de potássio do

meio intracelular através de um canal ativado (BAGATINI et al., 2002).

80

Efetivamente, a analgesia produzida por estimulação dessas áreas pode ser

inibida por aplicação de antagonistas dos receptores adrenérgicos 2. Dessa

maneira, examinamos o possível envolvimento dos receptores 2 no efeito

antinociceptivo do AO, usando animais pré-tratados com clonidina, agonista ou

ioimbina, um antagonista desse receptor.

A ação analgésica da clonidina é exercida através de diferentes mecanismos,

ou seja, pelo bloqueio da condução nervosa das fibras C e A-δ, pelo aumento da

concentração de acetilcolina medular e pela elevação dos níveis de noradrenalina no

SNC (ROCHA et al., 2002).

Os resultados obtidos indicam que tanto a clonidina quanto o AO são capazes

de diminuir a dor aguda causada pela capsaicina, Entretanto, a ioimbina conseguiu

antagonizar somente o efeito antinociceptivo da clonidina, não revertendo o efeito

produzido pelo AO. Podemos sugerir que os receptores 2 não devem estar agindo

no mecanismo de ação do AO.

Investigou-se também a participação da via L-arginina- óxido nítrico na

antinocicepção induzida pelo AO, tendo em vista que essa via exerce um papel

importante na modulação da nocicepção. Uma série de estudos morfológicos,

fisiológicos e farmacológicos sugerem que o óxido nítrico (NO) participa do processo

de nocicepção (HALEY et al., 1992).

O NO é responsável pela ativação da guanilato ciclase solúvel e aumento do

GMPc intraceclular, podendo então modular uma série de funções fisiológicas.

Também está envolvido na nocicepção central e periférica, agindo como agente pró-

nociceptivo, bem como um agente antinociceptivo. Diversos estudos têm

evidenciado alguma participação do NO durante a transmissão nociceptiva

prolongada, notadamente medular, sugerindo importante papel do NO na dor

(DICKENSON, 1995). Entretanto, o mecanismo exato pelo qual o óxido nítrico

exerce esse duplo efeito ainda é incerto (MACHELSKA et al., 1997; ZAKARIA et al.,

2005).

81

Kawabata et al. (1994), sugere que o NO induz um efeito pró-nociceptivo em

baixas concentrações e antinociceptivo em altas concentrações. Em nível supra-

espinhal o NO parece ter um efeito duplo dependendo da via que é ativada. A

ativação da via NO-cGMPC resulta em hiperalgesia (KAWABATA et al., 1993).

A L-arginina administrada topicamente exibe atividade antinociceptiva em

ratos com hiperalgesia induzida por carragenina, sendo esse efeito bloqueado por

inibidores de NOS e de guanilato ciclase. Contrariamente a esses achados, a L-

arginina, produziu uma resposta nociceptiva em respostas inflamatórias causadas

por substância P, carragenina e bradicinina, sendo o efeito suprimido pelo L-NAME.

Esses achados confirmam o efeito nociceptivo e antinociceptivo da via NO- GMPc

nos tecidos periféricos (ZAKARIA et al., 2005).

No nosso estudo, camundongos foram pré-tratados com o substrato do óxido

nítrico sintase, a L-arginina, em uma dose que não teve nenhum efeito significativo

frente à injeção intraplantar de capsaicina, e este reverteu significativamente a

antinocicepção produzida tanto pelo AO quanto pelo L-NAME, esse último sendo um

conhecido inibidor de NO. Os achados desse estudo sugerem um possível

envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico na antinocicepção causada pelo AO.

É interessante notar que o L-NAME sozinho reduziu a nocicepção induzida

pela capsaicina, indicando o papel do NO na nocicepção induzida por esse agente.

Entretanto, a combinação deste com AO, mostrou uma potenciação na resposta.

Não é bem claro dizer se a formação de NO tem papel na abertura dos canais

KATP dependentes, mas um estudo realizado em porcos, mostrou que a formação de

NO leva á ativação dos canais KATP dependentes sensíveis a glibenclamida, através

da via cGMP-kinase. Através dessas observações e baseado em nossos resultados,

sugerimos o envolvimento da via oxido nítrico – cGMP – canais KATP no efeito

antinociceptivo do AO.

Em animais, muitas substâncias algogênicas, como a capsaicina, óleo de

mostarda e ciclofosfamida, quando aplicadas a estruturas viscerais induzem a

expressão de comportamentos relacionados à nocicepção envolvendo fibras

82

aferentes sensíveis à capsaicina (JORDT et al., 2004; KOBAYASHI, 2003; MAGGI et

al., 1992). Essas substâncias algogênicas são capazes de induzir nocicepção, bem

como uma reação inflamatória, quando fibras aferentes viscerais são sensibilizadas

ou neurônios centrais sofrem uma mudança em sua excitabilidade (sensibilização

central) após persistente ativação visceral (GEBHART, 1995).

O óleo de mostarda é um potente ativador neuronal que, quando aplicado

topicamente na pele, ativa as terminações nervosas, produzindo dor, inflamação e

hipersensibilidade a estímulos térmicos e mecânicos (JORDT et al., 2004). O maior

constituinte do óleo de mostarda é o Alil-isotiocianato, sendo postulada uma ação

sobre receptores da capsaicina TRPV1 como mecanismo de ação, também podendo

desenvolver lesão tecidual direta com produção de mediadores inflamatórios, como

a bradicinina e prostaglandinas. Muito se questiona quanto ao real mecanismo pró-

nociceptivo desta substância uma vez que camundongos ‗knock-out‘ para o receptor

TRPV1 possuem sensibilidade para o óleo de mostarda, sugerindo que a capsaicina,

um reconhecido agonista destes receptores, e os isotiocianatos possuem

mecanismos moleculares diferentes (CATERINA et al., 2000).

Mais recentemente, um estudo realizado por Bautista et al. (2006), sugeriu a

ligação do óleo de mostarda com um receptor específico, denominado TRPA1.

Utilizando camundongos ―knockout‖ para esse tipo de receptor, mostrou-se que o

TRPA1 é um importante receptor, no qual irritantes e agentes algésicos endógenos

se ligam despolarizando nociceptores para causar a dor inflamatória.

No modelo de nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda o

tratamento via oral dos animais com ácido oleanólico, em doses que variaram de 3-

100 mg/kg, também promoveu uma redução na nocicepção nas doses de 10, 30 e

100 mg/kg, sendo o maior percentual de inibição dos comportamentos obtido com a

dose de 30 mg/kg. Esta por ser mais efetiva foi, portanto, a dose selecionada para o

estudo do mecanismo de ação do AO nesse modelo.

Como já visto anteriormente, o AO demonstrou ter eficácia melhor em baixas

doses (10, 30 mg/kg, v.o.), ao passo que com uma dose mais elevada (100 mg/kg,

v.o.) ocorreu uma redução na atividade antinociceptiva da droga. Isso promoveu a

83

formação de um gráfico dose-resposta na forma de ―U‖, implicando que AO pode ter

uma dupla ação sobre a resposta do agente danoso, provavelmente devido ao

aumento da toxicidade da droga em altas doses. Esses resultados estão de acordo

com o trabalho realizado por Lima-Júnior et al. (2006). Nesse estudo, avaliou-se a

atividade antinociceptiva de uma mistura de triterpenos α- e -β amirinas no modelo

de nocicepção visceral induzido por óleo de mostarda. O aumento da dose testada

levava a uma redução da atividade antinociceptiva, semelhante ao ocorrido no nosso

estudo.

O triterpeno AO reduziu significantemente os comportamentos dolorosos

viscerais induzidos por óleo de mostarda, possivelmente regulando o funcionamento

das fibras aferentes primárias. As vísceras expressam uma vasta gama de

receptores de membrana (incluindo receptores vanilóides, TRPV1) para estímulos

químicos, que estão envolvidos na sinalização sensorial desde a periferia até o

sistema nervoso central (WOOD, 2004). O receptor TRPV1 realiza importante papel

na regulação funcional dos nervos sensoriais. Evidências apontam para o potencial

terapêutico dos moduladores destes receptores, particularmente no controle da dor

(DOHERTY et al., 2005; BONACHE et al., 2006). Antagonistas do receptor TRPV1

produzem efeitos anti-hiperalgésicos em modelos de dor neuropática e inflamatória

(OGNYANOV et al., 2006).

Camundongos ‗knock-out‘ para o receptor TRPV1, mostram analgesia em

alguns estados de dor inflamatória, sugerindo que antagonistas do receptor TRPV1

podem ser efetivos nesses tipos de dor associada com injúria tecidual e exposição a

substâncias irritantes (LIMA-JÚNIOR et al., 2006).

Jones et al. (2005), também demonstraram que receptores TRPV1 presentes

nas fibras neuronais aferentes de cólons de ratos, medeiam os comportamentos

nociceptivos viscerais durante uma injúria tecidual mecânica. Por essas razões,

buscamos avaliar a participação desse receptor em um modelo de nocicepção

visceral induzido quimicamente.

Com o objetivo de verificar a participação dos receptores TRPV1 no

mecanismo de ação do AO, utilizamos o vermelho de rutênio, um antagonista não-

84

competitivo do receptor TRPV1. Essa substância atua mediante bloqueio do influxo

de Ca2+ através do canal associado ao receptor, inibe a atividade excitatória

mediada pela capsaicina, além de inibir a liberação dos estoques intracelulares de

Ca2+ (SZALLASI; BLUMBERG, 1999).

O vermelho de rutênio e o ácido oleanólico foram capazes de inibir a

nocicepção induzida por óleo de mostarda. Entretanto, isso não implica que o ácido

oleanólico é um antagonista não competitivo do TRPV1, como o vermelho de

rutênio. Quando os animais foram pré-tratados com ácido oleanólico e vermelho de

rutênio em combinação, não existiu antagonismo ou aumento na antinocicepção no

teste do óleo de mostarda. Além disso, diferentemente da capsaicina, o AO falhou

em induzir per se nocicepção depois da injeção subplantar em pata de

camundongos. Essas observações sugerem que o AO não age como um agonista

do TRPV1, mas possivelmente induz uma influência modulatória nos receptores

vanilóides, o que necessita de estudos mais aprofundados.

Na tentativa de desvendar melhor o mecanismo de ação, verificou-se a

participação dos receptores α2. Estudos anteriores mostraram que a administração

de um agonista do receptor α2, demonstrou ter efeito antinociceptivo em modelos

experimentais de colite induzida por formalina em ratos e demonstrou reduzir a

hipersensibilidade visceral em testes clínicos (MIAMPAMBA et al., 1996;

BLACKSHAW; GEBHART, 2002).

A clonidina, agonista dos receptores α2, e o AO foram capazes de reduzir os

comportamentos dolorosos induzidos pelo óleo de mostarda. Entretanto, a ioimbina,

antagonista dos receptores α2, foi capaz de reverter a antinocicepção produzida pela

clonidina, mas não a produzida pelo AO, sugerindo que os receptores α2 não têm

participação nesse mecanismo.

Nesse modelo, procuramos avaliar também a participação do sistema opióide.

Nossos resultados mostraram que a morfina e o AO reduziram significantemente a

nocicepção visceral induzida pelo óleo de mostarda, sendo esse efeito revertido pelo

pré-tratamento com naloxona, o que indica um possível envolvimento do sistema

opióide. É interresante notar, que a inibição da morfina foi mais eficaz quando

85

comparado com o AO. Provavelmente, a morfina exerça um efeito maior sobre o

subtipo de receptor k-opióide. Como sugerem dados da literatura, dentre os subtipos

de receptores opióides, o receptor k-opóide exerce um papel bastante expressivo na

nocicepção visceral (BLACK; TREVETHICK, 1998).

A dor relacionada aos testes comportamentais usados para selecionar

agentes potencialmente antinociceptivos pode ter alguma limitação. Não está claro

qual extensão da sedação ou alterações nas funções motoras podem influenciar o

resultado destes testes. Estudos sugerem que a sedação do sistema nervoso central

e o efeito músculo-relaxante não-específico podem reduzir a resposta de

coordenação motora como, por exemplo, a lambedura de pata no teste da

capsaicina (SOJA et al., 2002). Desta maneira, procuramos avaliar a ação do AO

nos modelos do campo aberto e rota-rod.

No teste do campo aberto, houve uma redução significativa da freqüência de

locomoção dos animais associada à administração do óleo de mostarda. Porém, o

tratamento dos animais com AO antes da injeção intracolônica do óleo reverteu

significativamente este impedimento locomotor ‗freezing‘ induzido pelo óleo de

mostarda, permitindo afirmar a efetividade desta mistura como droga antinociceptiva.

Em adição, o teste do rota rod foi realizado para avaliar uma possível

interferência sobre a coordenação motora dos animais causada pela administração

do óleo de mostarda ou pelo tratamento com AO. Os dados indicam que tanto o AO

(30 mg/kg, v.o.), como o óleo de mostarda, não induzem incoordenação motora nos

animais no teste do rota rod, permitindo afirmar que o ‗freezing‘ expresso pelos

animais que receberam o algógeno não se relaciona a alterações motoras e que o

triterpeno é realmente efetivo na reversão desta condição.

Avaliando nossos achados, os resultados obtidos no presente estudo

confirmam e estendem os dados da literatura, mostrando que o triterpeno AO inibe a

nocicepção visceral e somática nos modelos de nocicepção induzido por capsaicina

e óleo de mostarda. Sugere-se que esse efeito sobre a nocicepção no modelo

induzido pela capsaicina é em parte devido a uma ação sobre os receptores

opióides, inibição da produção de NO e ativação dos canais de K+. Já no modelo de

86

nocicepção induzida por óleo de mostarda, sugere-se a participação do sistema

opióide, bem como uma ação modulatória sobre os receptores vanilóides,

necessitando de estudos mais aprofundados.

87

7. CONCLUSÕES

O ácido oleanólico nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg revelou uma atividade

antinociceptiva no modelo de nocicepção induzida pela injeção intraplantar de

capsaicina;

O estudo do mecanismo antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de

nocicepção induzido pela capsaicina, indica um envolvimento do sistema opióide, da

inibição da produção do óxido nítrico e dos canais de potássio, como evidenciado

pela reversão da atividade do AO, proporcionada pela naloxona, L-arginina e

glibenclamida respectivamente;

O uso do antagonista dos receptores α2-adrenérgicos, ioimbina, não reverteu a

atividade antinociceptiva do ácido oleanólico, excluindo-se a participação deste

receptor como mecanismo de ação do AO no modelo de nocicepção induzido por

capsaicina;

O ácido oleanólico nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg revelou uma atividade

antinociceptiva no modelo de nocicepção visceral induzida pelo óleo de mostarda;

O estudo do mecanismo antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de

nocicepção visceral induzido por óleo de mostarda, indica um envolvimento, do

sistema opióide, como evidenciado pela reversão da atividade do AO, proporcionada

pela naloxona;

O estudo do envolvimento do receptor TRPV1 como parte do mecanismo

antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzido por

óleo de mostarda, revela uma possível modulação ao nível deste receptor,

evidenciado pela não potencialização da resposta antinociceptiva do vermelho de

rutênio, um antagonista não competitivo do receptor TRPV1;

O uso do antagonista dos receptores α2-adrenérgicos, ioimbina, não reverteu a

atividade antinociceptiva do ácido oleanólico, excluindo-se a participação deste

88

receptor como mecanismo de ação do AO no modelo de nocicepção visceral

induzido por óleo de mostarda;

O ácido oleanólico não alterou a atividade locomotora espontânea dos animais,

como demonstrado pelo teste do campo aberto; porém na vigência de um estímulo

algogênico (injeção intracolônica de óleo de mostarda), que reduz a deambulação

normal dos animais, a substância (30 mg/kg) foi capaz de reverter esse estado de

imobilidade, indicando uma atividade antinociceptiva;

Tanto o ácido oleanólico, como o algógeno óleo de mostarda, não causam

alterações motoras nos animais, como evidenciado no teste do rota rod, indicando

que a atividade antinociceptiva da susbtância independe de um comprometimento

motor.

89

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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