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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
SARAI HESS
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO ÁCIDO MIRSINÓICO B
Itajaí - 2006
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
SARAI HESS
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO ÁCIDO MIRSINÓICO B
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Profª. Dra Márcia Maria de Souza
Itajaí, Setembro de 2006
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ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO ÁCIDO MIRSINÓICO B
Sarai Hess
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
Márcia Maria de Souza, Dra
Orientador
Tânia Mari Bellé Bresolin, Dra
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
Dra Márcia Mara de Souza (UNIVALI)
Presidente
Titulação Nome do Co-Orientador (se houver) (instituição)
Co-orientador
Titulação Nome do Membro da Banca (instituição)
Membro
Titulação Nome do Membro da Banca (instituição)
Membro
Titulação Nome do Membro da Banca (instituição)
Membro
Itajaí (SC), 24 de outubro de 2006
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Dedicatória Aos meus pais, Jaime e Adelina.
Vocês são o que de melhor existe em mim...
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AGRADECIMENTOS À Profª Márcia Maria de Souza, por me mostrar qual era o rumo certo
dividindo comigo sua sabedoria. Por ter me resgatado inúmeras vezes, pelos elogios
e pelas críticas. Você me ensinou muito mais do que fazer ciência.
Aos professores do PMCF da UNIVALI, pela transmissão do conhecimento e
pela amizade.
À professora Ângela Malheiros, pela paciência e amizade. Pelo composto
promissor que nos deu para estudar, por ter acreditado em bons resultados e por ter
me ensinado a empacotar colunas...
À UnC, pelo apoio financeiro e por acreditar na capacidade de seu corpo
docente.
À amiga Rosélia, sempre solícita e atenta a todos os detalhes.
Ao meu irmão Massay, pelas nossas intermináveis conversas sobre o etéreo,
por ter ouvido pacientemente minhas explicações farmacológicas e, principalmente,
por me fazer sentir como é amar alguém incondicionalmente.
À minha irmã Anahí, meu cunhado Lizandro, minha querida avó Thereza e
minha cunhada Ana Paula, porque compreenderam minha ausência e sempre
demonstraram carinho e certeza de que tudo iria dar certo.
Ao meu companheiro Carlos Jung, por ter acompanhado meu aprendizado,
sendo sempre prestativo e carinhoso.
À amiga Juliane Seleme Brehmer, por me mostrar que tudo é possível e que o
tempo é um mero detalhe. Sua amizade foi uma das minhas maiores conquistas.
À amiga Mariane Guttervil Leite, pela valiosa ajuda na finalização dos
experimentos.
Aos amigos Laiana, Cristina e Felipe. Aprendemos muito juntos. Sem a ajuda
de vocês, o que teria sido de mim?
Ao amigo Arnaldo, por ter me ensinado muito. Por estar sempre pronto para
ajudar, por ser guerreiro e sempre gentil.
Ao colega de mestrado Michel, pela amizade e pelo apoio.
À amiga Sheila, pelos valiosos ensinamentos e por ter me ajudado a
compreender a farmacognosia.
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Aos amigos Marcos e Dereti, pelas traduções, explicações, piadas, risadas,
almoços, mates...
Ao amigo Luiz Sakr, por me ajudar com o indecifrável mundo dos números.
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EPÍGRAFE
Só o desejo inquieto, que não passa faz o encanto da coisa desejada.
E terminamos desdenhando a caça pela doida aventura da caçada.
Mario Quintana
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ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO ÁCIDO MIRSINÓICO B
Sarai Hess Setembro/2006
Orientador: Márcia Maria de Souza, Dra. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 107 O Ácido Mirsinóico B (AMB) é um ácido benzóico prenilado isolado da Rapanea sp. Vários estudos demonstram que compostos desta natureza apresentam atividade antifúngica, moluscicida e antiparasitária. O objetivo deste estudo foi a avaliação da ação modulatória do AMB no processo doloroso bem como o possível mecanismo envolvido em sua ação antinociceptiva através de estudos farmacológicos in vivo utilizando diferentes modelos de nocicepção. Para isto foram utilizados camundongos “Swiss” machos pesando entre 25 e 35g e ratos “Wistar” pesando entre 250 e 300g. Os modelos farmacológicos utilizados foram os modelos do ácido acético, formalina, capsaicina, glutamato, placa quente, hiperalgesia (Randall-Selitto), Open field, toxicidade aguda e o teste da Artemia salina. O mecanismo de ação foi estudado através do modelo do ácido acético. O AMB administrado via i.p. (3 – 60 mg/kg) causou redução na nocicepção induzida pelo ácido acético, formalina, capsaicina, glutamato e também quando analisado no modelo da placa quente. Quando administrado v.o. (150 – 500 mg/kg) foi efetivo em reduzir a nocicepção no modelo do ácido acético. O efeito antinociceptico do AMB (60 mg/kg) foi completamente revertido pelo pré-tratamento dos animais com ioimbina (0,15 mg/kg i.p.), prazosina (0,15 mg/kg i.p.), atropina (1,0 mg/kg i.p.), L-arginina (600 mg/kg i.p.), PCPA (100 mg/kg i.p.) e após adrenalectomia bilateral, mas não foi afetado pelo pré-tratamento com haloperidol (0,2 mg/kg i.p.), bicuculina (0,7 mg/kg i.p.), faclofeno (3 mg/kg i.p.), naloxona (1 mg/kg i.p.), ondasetron (0,5 mg/kg i.p.) e cetanserina (1 mg/kg i.p.). Foram analisados os efeitos de toxicidade aguda do AMB através da administração de 2000mg/kg v.o. Neste teste não foram detectados efeitos tóxicos significativos nos animais tratados quando comparado com o grupo controle, porém o composto demonstrou citotoxicidade quando testado em organismos unicelulares. Também foi analisado o efeito do AMB sobre a atividade locomotora dos animais através do modelo do Open field. O pré-tratamento com o composto não apresentou alterações significativas em relação ao rearing, porém o crossing demonstrou diminuição significativa quando comparado com o grupo controle. Estes resultados demonstram que o AMB apresenta um importante efeito antinociceptivo interagindo com os sistemas α-adrenérgico, colinérgico, oxidonitrérgico, com o eixo HPA e parcialmente com sistema serotoninérgico, mas não com os sistemas dopaminérgico, GABAérgico e opióide. Assim, o presente estudo sugere que o AMB possui potente ação antinociceptiva podendo tornar-se útil no estudo e desenvolvimento de um novo fármaco com atividade analgésica. Palavras-chave: Ácido Mirsinóico, Antinocicepção, Mecanismo de Ação.
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ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY OF MIRSINOIC B ACID
Sarai Hess September, 2006
Supervisor: Márcia Maria de Souza, Dr. Subject: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances Page:107 Mirsinoic B Acid (MBA) is a prenilate benzoic acid isolated from Rapanea sp. Various studies have shown that compounds of this type have antifungal, molluscicidal and antiparasitic activity. The objective of this study was to evaluate the role of MBA in the pain process, and the possible antinociceptive mechanisms involved, using some in vivo pharmacological nociceptive models. Male Swiss mice (Mus musculus) weighing 25 - 30 g, and male Wistar rats (Rattus norwegicus) weighing 250 – 300g were used in the assays. The pharmacological models used were the acetic acid, formalin, capsaicin, glutamate, hot plate, hyperalgesia (Randall-Sellitto), open field, and acute toxicity models, and the Artemia salina assay. The action mechanism was studied using the acetic acid model. MBA, administered intraperitonially (3 - 60mg/kg) caused a reduction in nocioconception induced by acetic acid, formalin, capsaicin and glutamate, and also when analyzed in the hot plate model. When administered orally (p.o. 150 – 500 mg/kg), MBA effectively reduced nociception in the acetic acid model . The antinociceptive effect of MBA (60mg/kg) was completely reverted when the animals was pre-treated with yoimbine (0.15 mg/kg, ip), prazosine (0.15 mg/kg, ip), atropine (1.0 mg/kg ip), L-arginine (600 mg/kg ip), PCPA (100mg/kg ip) and after bilateral adrenalectomy, but there was no change after pre-treatment with haloperidol (0.2 mg/kg ip), bicuculine ( 0.7 mg/kg ip), phaclofen (3 mg/kg ip), naloxone (1mg/kg ip), ondansetrone (0.5 mg/kg ip) and ketanserine (1 mg/kg ip). The acute toxicity effect of MBA was tested by injection of 2000 mg/kg v.o. In this test, no significant toxic effects were detected on the treated animals, compared with the control group, but the compound showed toxicity when tested in unicellular organisms. The effect of MBA on the animal’s locomotion was also studied, by the open field model. Pre-treatment with the compound did not show any significant alterations in relation to rearing, but significantly reduced crossing, compared with the control. These data demonstrate that MBA has an important antinociceptive effect, interacting with the α-adrenergic, cholinergic, and nitric oxide systems, the hypotalamus-pituitary-adrenal axis and, in part, the serotoninergic system. There was no evidence of the antinociceptive effects of MBA on the dopaminergic, gabaergic and opioid systems. This study suggests, therefore, that MBA has powerful antinociceptive action and could be useful for the investigation and development of a new analgesic drug. Keywords: Mirsinoic B Acid, Antinociception, Mechanism of Action
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LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Via sensorial primária (condução do processo doloroso) ......................22 Figura 02. Rotas alternativas para a condução do estímulo doloroso. A) Trato
paleoespinotalâmico, B) Trato neoespinotalâmico. ...............................23 Figura 03. Estruturas de derivados do ácido benzóico encontrado na natureza ....33 Figura 04. Estrutura do ácido mirsinóico B isolado da Rapanea sp........................35 Figura 05. Fluxograma do protocolo utilizado no estudo para determinação do
mecanismo de ação do AMB.................................................................46 Figura 06. Efeito antinociceptivo do AMB no teste das contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético pela administração i.p. (A) e v.o. (B). ......51 Figura 07. Duração do efeito antinociceptivo do AMB no teste do acido
acético, administrado na dose de 60mg/kg, i.p......................................54 Figura 08. Efeito antinociceptivo do AMB no teste da formalina pela
administração i.p. (painel A – dor neurogênica, painel B – dor inflamatória e painel C – atividade antiedematogênica). .......................55
Figura 09. Efeito antinociceptivo do AMB no teste da injeção intraplantar da capsaicina em camundongos. ...............................................................58
Figura 10. Efeito da atividade antinociceptiva do AMB i.p. no teste da injeção intraplantar do glutamato em camundongos.........................................60
Figura 11. Efeito antinociceptivo causado pelo AMB administrado pela via i.p. e pela morfina administrada via s.c. no teste da placa quente em camundongos. .......................................................................................62
Figura 12. Efeito do AMB administrado por via intraperitoneal em relação a hiperalgesia induzida pela injeção intraplantar de capsaicina, carragenina, adrenalina, bradicinina e substância P. ............................64
Figura 13. Efeito do AMB (60mg/kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais “crossing” (cruzamentos) – Painel A e atividade exploratória “rearing” – Painel B, no modelo do Open Field. .................71
Figura 14. Influência do pré-tratamento de camundongos com ioimbina (0,15mg/kg i.p.) e prazosina ( 0,15 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.) ou clonidina (0,1 mg/kg i.p.) ou fenilefrina (7 mg/kg i.p.), respectivamente, no modelo de dor induzida pelo ácido acético.. ......................................................72
Figura 15. Influência do pré-tratamento de camundongos com atropina (1 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.) na nocicepção induzida pelo ácido acético.. ........................73
Figura 16. Influência do pré-tratamento de camundongos com haloperidol (0,2 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p) ou apomorfina (1 mg/kg i.p.) no modelo de nocicepção induzida pelo ácido acético....................................................................75
Figura 17. Influência do pré-tratamento de camundongos com bicuculina (0,7 mg/kg i.p.) ou faclofeno (3 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.), muscimol (1 mg/kg i.p.) ou baclofeno (1 mg/kg i.p.) na nocicepção induzida pelo ácido acético.. ...77
Figura 18. Influência da adrenalectomia bilateral em camundongos sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.) na nocicepção induzida pelo ácido acético.................................................79
Figura 19. Influência do pré-tratamento de camundongos com L-arginina (600 mg/kg i.p.) ou D-arginina (600 mg/kg i..p) sobre o efeito
10
antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.) ou L-NOARG (75 mg/kg i.p.) na nocicepção induzida pelo ácido acético.. ........................80
Figura 20. Influência do pré-tratamento de camundongos com naloxona (1 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p) ou morfina (5 mg/kg s.c) no modelo de nocicepção induzida pelo ácido acético....................................................................82
Figura 21. Influência do pré-tratamento de camundongos com PCPA (100 mg/kg i.p.) – Painel A , e do pré-tratamento com ondasetron (0,5 mg/kg i.p.) e cetanserina (1 mg/kg i.p.) – Painel B, sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.), na nocicepção induzida pelo ácido acético....................................................................85
Figura 22. Possíveis vias envolvidas no efeito do AMB sobre o processo doloroso.................................................................................................88
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES – TABELAS E QUADROS
Tabela 01. Comparação dos valores das DIs50 e inibição máxima para a
atividade antinociceptiva do AMB, da aspirina, do diclofenaco potássico e do meloxicam na nocicepção induzida pelo ácido acético. ................................................................................................ 53
Tabela 02. Comparação dos valores das DIs50 e inibição máxima para a atividade antinociceptiva do AMB, da aspirina, do diclofenaco potássico e do meloxicam na nocicepção induzida pela formalina ...... 57
Tabela 03. Valores das DIs50 e inibição para o AMB na nocicepção induzida pela capsaicina .................................................................................... 59
Quadro 01. Comparação do efeito do AMB sobre a hiperalgesia induzida pela capsaicina (A), carragenina (B), adrenalina (C), bradicinina (D) e substância P (E)................................................................................... 65
Quadro 02. Efeito do AMB sobre a toxicidade aguda. Adaptado de OECD Guidelines for the testing of chemicals (2001) ..................................... 68
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LISTA DE ABREVIATURAS 5-HT Serotonina
AAS Ácido Acetil Salicílico
ACh Acetilcolina
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
AINE Antiinflamatório não-esteroidal
AMB Ácido Mirsinóico B
AMPA Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiônico
AMPc Adenosina 3,5-monofosfato cíclico
ANOVA Análise de variância
ASIC Canal iônico ativado pelo estiramento
ATC Antidepressivo tricíclico
ATP Adenosina 1,4,5-trifosfato
BDNF Fator neurotrófico cerebral
CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
COX Ciclooxigenase
DI50 Dose inibitória 50%
DL Dose letal
DLF Funículo dorsolateral
DMSO Dimetilsulfóxido
EPM Erro padrão da média
GABA Ácido γ-aminobutírico
GMPc Guanosina 3,5-monofosfato cíclico
HPA Hipófise-pituitária-adrenal
IASP Associação Internacional para o Estudo da Dor
IL Interleucina
IM Inibição máxima
INF Interferon
L-NOARG NG-nitro-L-arginina
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
NGF Fator de crescimento do nervo
NKA Neurocinina A
13
NKB Neurocinina B
NMDA N-metil-D-aspartato
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico-sintetase
NPY Neuropeptídeo Y
NRM Núcleo magno da rafe
OECD Guideline for testing of chemicals
PAG Substância cinzenta periaquedutal
PCPA Ρaraclorofenilalanina
PG Prostaglandina
PLA2 Fosfolipase A2
PLC Fosfolipase C
RVLM Medula rostral ventrolateral
RVM Medula ventro-medial rostral
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Periférico
SP Substância P
SSRI Inibidores seletivos da recaptação de serotonina
TNF Fator de necrose tumoral
TRPV Receptor vanilóide
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS........................................................................................................... 18
2.1 Objetivo Geral ....................................................................................................18
2.2 Objetivos Específicos .........................................................................................18
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 19
3.1 Aspectos gerais do processo doloroso................................................................19
3.1.1 Conceito ...........................................................................................................19
3.1.2 Classificação ....................................................................................................19
3.1.3 Mecanismos envolvidos na transmissão e modulação do processo
doloroso ............................................................................................................21
3.1.4 Farmacologia do controle da dor ......................................................................26
3.2 Importância das plantas como fonte de medicamentos ......................................29
3.3 Compostos obtidos de plantas com comprovado efeito analgésico ....................31
3.4 Ácido Mirsinóico B...............................................................................................32
4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 36
4.1 Obtenção do Ácido Mirsinóico B .........................................................................36
4.2 Animais................................................................................................................36
4.3 Drogas e reagentes.............................................................................................37
4.4 Vias de administração .........................................................................................37
4.5 Ensaios farmacológicos utilizados.......................................................................38
4.5.1 Analgesia..........................................................................................................38
4.5.1.1 Teste das Contorções Abdominais induzidas pelo Ácido Acético .................38
4.5.1.2 Avaliação do Tempo de Reação (Time Course)............................................38
4.5.1.3 Modelo de dor induzida pela Formalina......................................................... 39
4.5.1.4 Modelo de dor induzida pela Capsaicina.......................................................39
4.5.1.5 Modelo de dor induzida pelo Glutamato ........................................................ 40
4.5.1.6. Modelo de dor induzida pelo Calor (Hot Plate) .............................................40
4.5.1.7 Modelo de hiperalgesia .................................................................................41
4.5.2 Modelos complementares ................................................................................42
4.5.2.1 Modelo de toxicidade aguda..........................................................................42
4.5.2.2 Modelo de citotoxicidade induzida pela Artemia salina .................................43
4.5.2.3 Modelo do campo aberto (Open Field) ..........................................................44
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4.5.3 Determinação do mecanismo de ação da propriedade antinociceptiva do
ácido mirsinóico B.............................................................................................45
4.5.3.1. Participação do sistema α- adrenérgico .......................................................46
4.5.3.2. Participação do sistema colinérgico .............................................................47
4.5.3.3. Participação do sistema dopaminérgico .......................................................47
4.5.3.4 Participação do sistema GABAérgico............................................................47
4.5.3.5 Participação do sistema glicocorticóide.........................................................48
4.5.3.6 Participação da via L-arginina-óxido nítrico ...................................................48
4.5.3.7 Participação do sistema opióide ....................................................................49
4.5.3.8 Participação do sistema serotoninérgico .......................................................49
4.6 Análise estatística ...............................................................................................49
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 51
5.1 Analgesia.............................................................................................................51
5.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético .....................51
5.1.2 Avaliação do tempo de reação (Time Course) .................................................53
5.1.3 Modelo de dor induzida pela Formalina ...........................................................54
5.1.4 Modelo de dor induzida pela Capsaicina..........................................................58
5.1.5 Modelo de dor induzida pelo Glutamato ...........................................................60
5.1.6 Modelo de dor induzida pelo calor (Hot Plate)..................................................62
5.1.7 Efeito Antihiperalgésico ....................................................................................63
5.2 Modelos complementares ...................................................................................67
5.2.1 Modelo de toxicidade aguda.............................................................................67
5.2.2 Modelo de citotoxicidade induzida pela Artemia salina ....................................69
5.2.3 Modelo do campo aberto (Open Field) .............................................................70
5.3 Determinação do mecanismo de ação da propriedade antinociceptiva do
ácido mirsinóico B.............................................................................................71
5.3.1 Participação do sistema α-adrenérgico ............................................................71
5.3.2 Participação da via colinérgica .........................................................................73
5.3.3 Participação do sistema dopaminérgico ...........................................................75
5.3.4 Participação do sistema GABAérgico...............................................................76
5.3.5 Participação do sistema glicocorticóide............................................................79
5.3.6 Participação da via L-arginina-óxido nítrico......................................................80
5.3.7 Participação do sistema opióide .......................................................................81
5.3.8 Participação do sistema serotoninérgico ..........................................................84
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6 CONCLUSÕES ......................................................................................................89
REFERÊNCIAS......................................................................................................... 90
ANEXOS ...................................................................... Erro! Indicador não definido.
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1 INTRODUÇÃO
Numerosas classes de produtos naturais foram isoladas e tiveram suas
estruturas caracterizadas durante o século XX (BASSO et al, 2005). A elucidação
dos mecanismos biológicos e bioquímicos dos produtos naturais com ação
terapêutica tem sido uma ferramenta de valor inestimável para a química orgânica e
medicinal. A partir destes mecanismos tem sido possível decifrar a lógica da
biossíntese dessas substâncias, além do desenvolvimento de estratégias para a
produção de novos fármacos (NEWMAN; WILDING; HIRST, 2000).
Aproximadamente 25% dos fármacos empregados nos países industrializados
advém direta ou indiretamente, de produtos naturais, especialmente de plantas
superiores (YUNES; CALIXTO, 2001), sendo ainda a maior fonte de inovação
terapêutica para doenças infecciosas, câncer, desordens lipídicas, imunomodulação
e dor (ALTMANN, 2001).
A Rapanea sp. é um arbusto encontrado em todo sul do Brasil. O gênero
pertence à família Myrcinaceae e apresenta-se como arbustos ou árvores de
pequeno porte com folhas elípticas, frutos arredondados que se distribuem, assim
como as flores, em cachos de coloração variada, dependendo da espécie a ser
considerada (HARDEN, 1990). É usada pela medicina popular no tratamento de
algumas patologias, como processos inflamatórios e dolorosos. Esta planta exibe
uma grande concentração do ácido benzóico prenilado 5-carboxi-7-(3”,3”-dimetilalil)-
2-(1’-hidroxi-1’,5’-dimetilex-4’-enil)2,3-dihidrobenzeno-furano, o Ácido Mirsinóico B,
principalmente nas cascas (TESTONI, 2004).
Tanto o extrato quanto o composto Ácido Mirsinóico B (AMB), isolado da
Rapanea sp., apresentaram atividade antinociceptiva quando testados no modelo de
dor de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos, sendo
o AMB mais ativo do que a aspirina no modelo analisado. (TESTONI 2004). Deste
modo nos propomos então a ampliar os estudos farmacológicos com o composto
verificando sua possível atividade antinociceptiva em diversos modelos animais de
dor, bem como proceder a execução de experimentos que pudessem evidenciar seu
mecanismo de ação com relação à propriedade antinociceptiva.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Investigar a atividade antinociceptiva do Ácido Mirsinóico B (AMB), extraído da
Rapanea sp.
2.2 Objetivos Específicos:
− Avaliar a atividade antinociceptiva do AMB nos modelos experimentais de
nocicepção química: modelo de dor induzida pelo ácido acético, formalina,
capsaicina e glutamato;
− avaliar a atividade antinociceptiva do AMB no modelo experimental de
nocicepção térmica: modelo de dor induzida pelo calor (hot plate);
− avaliar a atividade antinociceptiva do AMB no modelo experimental de
nocicepção mecânica: modelo de Randall-Sellito, utilizando os agentes
álgicos adrenalina, bradicinina, capsaicina, carragenina e substância P;
− avaliar o tempo de reação (Time course) do AMB através do modelo do
acido acético;
− avaliar o efeito do AMB sobre o desempenho motor de animais utilizando o
teste do campo aberto – Open Field;
− comparar os efeitos do AMB e seus derivados com fármacos analgésicos
utilizados terapeuticamente;
− proceder o estudo de toxicidade, através da exposição de curta duração ao
AMB (Toxicidade Oral Aguda);
− avaliar o efeito do AMB através do modelo de citotoxicidade – Teste da
Artemia salina;
− proceder estudo do mecanismo de ação da propriedade antinociceptiva do
AMB através do emprego de agonistas e antagonistas de vários receptores
que modulam a nocicepção.
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3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Aspectos gerais do processo doloroso 3.1.1 Conceito
“A dor é uma emoção que mora na alma”
Platão (370 a.C.)
A dor é uma experiência complexa e de múltiplas dimensões, que geralmente
se origina no sítio da lesão, sendo transmitida pelo sistema nervoso periférico,
processada em diversos níveis do sistema nervoso central e, finalmente, percebida
no córtex cerebral (PRADO; DEL BEL, 1998). Pode ser definida, segundo o Comitê
de Taxonomia da Associação Internacional para o Estudo da Dor (I.A.S.P.), como
uma sensação ou experiência desagradável associada com um dano tecidual real ou
potencial, ou descrita como tal dano (MERSKEY; BOGDUK, 1994; MILLAN, 1999).
3.1.2 Classificação
A classificação do processo doloroso é diversificada e depende do critério
adotado. Do ponto de vista fisiológico a dor pode ser classificada em três tipos
mecanísticamente distintos: nociceptiva, inflamatória e neuropática.
A dor nociceptiva é um mecanismo crucial de defesa que protege um
organismo de um dano potencial ou eminente e é produzida, assim como suas
conseqüências fisiológicas, pelo funcionamento normal tanto do Sistema Nervoso
Central (SNC) quanto do Sistema Nervoso Periférico (SNP). As dores inflamatória e
principalmente a dor neuropática, em contraste, são reflexos do funcionamento
patologicamente modificado desses dois sistemas (SALTER, 2005). A dor
inflamatória é caracterizada pela espontaneidade da sensação dolorosa e pela
hiperalgesia (MAMET; LAZDUNSKI; VOILLEY, 2003), quando ainda há a presença
de mediadores inflamatórios enquanto a dor neuropática é uma condição crônica que
ocorre ou persiste após uma lesão primária ou disfunção no sistema nervoso central
ou periférico (ZIEGLGANSBERGER; BERTHELE; TOLLE, 2005).
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Somando-se a isso, algumas desordens ocorrem em pacientes que
experimentam a dor, devido a importantes modificações que o processamento da
informação nociceptiva sofre durante estados patológicos como a hiperalgesia
(sensibilidade exacerbada à um estímulo doloroso), alodinia (dor em resposta à um
estímulo não-doloroso) e hiperestesia (sensibilidade anormal à um estímulo
sensorial) (BESSON, 1999).
O estado hiperalgésico se caracteriza pela diminuição do limiar da dor e
resposta exagerada a estímulos supraliminares (GOADSBY, 2005), enquanto a
alodinia é um fenômeno observado, sobretudo, na dor neurogênica. Esta é a dor
produzida por estímulos mecânicos normalmente não dolorosos. Origina-se por
ativação neuronal que, em condições normais transmitem informação tátil ou
sensações de vibração (GILRON et al, 2006).
Um episódio doloroso também pode ser classificado de acordo com o critério
temporal em transitório, agudo e persistente ou crônico. Na dor do tipo transitória os
nociceptores da pele ou de outros tecidos do corpo podem ser ativados sem
necessariamente ocorrerem danos no tecido. Este tipo de dor tem como função a
proteção do organismo contra danos físicos provocados pelo meio ou ainda devido
ao estresse excessivo dos tecidos corpóreos (LOESER; MELZACK, 1999).
A dor aguda é caracterizada pela injúria substancial de um tecido com a
subseqüente ativação dos nociceptores locais. A injúria altera a resposta
característica dos nociceptores, suas conexões centrais e o sistema nervoso
autônomo. Este tipo de dor é sentida após trauma ou intervenção cirúrgica. Estudos
pré-clínicos têm demonstrado que a expressão ou amplificação neuronal de novos
genes (a base para sensibilização e remodelamento neuronal) pode ocorrer dentro
de 20 minutos após uma lesão. Alguns trabalhos clínicos sugerem que a dor aguda
pode tornar-se crônica rapidamente (CARR; GOUDAS, 1999).
A dor persistente ou crônica, característica de neuropatias é geralmente
iniciada a partir de uma injúria ou patologia e pode ser perpetuada por fatores alheios
aos que dispararam o processo doloroso. Este tipo de dor tem a duração de meses e
fatores como estresse, e problemas afetivos podem contribuir para a sua
persistência e intensidade (CATERINA, et al., 1999).
21
3.1.3 Mecanismos envolvidos na transmissão e modulação do processo
doloroso
Os neurônios que respondem preferencialmente a estímulos nocivos são
chamados de nociceptores. Eles conduzem as informações nociceptivas ao sistema
nervoso central, e seus corpos celulares encontram-se dentro dos gânglios das
raízes dorsais, adjacente à medula espinhal (CATERINA et al., 1999).
O conceito das distintas classes de fibras nervosas periféricas que conduzem
os sinais dolorosos foi descrito por Sherrington em 1906. Depois disto, as classes de
fibras nervosas têm sido descritas de acordo com o tipo de estímulo doloroso que
está sendo vivenciado (RAJA et al., 1999). Os sinais nocivos são gerados em fibras
aferentes finas do tipo Aδ e C, que respondem a uma variedade de estímulos
fisiológicos intensos tais como calor, frio, compressão e substâncias potencialmente
nocivas.
As fibras finas mielinizadas aferentes do tipo Aδ respondem à alterações na
temperatura e à estímulos mecânicos. Os Aδ-nociceptores são classificados em
fibras AI ou AII, dependendo da velocidade de condução do sinal. A outra classe de
nociceptores, as fibras C não-mielinizadas são de condutância relativamente lenta e
conferem uma sensação de dor de forma irradiada (BROOKS ; TRACEY, 2005).
Praticamente todos os tecidos são inervados por fibras aferentes. Apesar
disso, as propriedades dessas fibras diferem, dependendo se as mesmas são
aferentes somáticas (que inervam a pele, as articulações, os músculos), ou aferentes
viscerais (que inervam os tecidos cardiovasculares e respiratórios, o trato
gastrointestinal, ou os sistemas renal e reprodutivo (DRAY; HANG, 1998; GRUBB,
1998; RUSSO; BROSE, 1998; BESSON, 1999; MILLAN, 1999).
Conforme figura 1, após a ocorrência de um estímulo doloroso (1), se um
número suficiente de nociceptores forem ativados, um estímulo aferente é produzido.
Este, viaja ao longo de fibras primárias até o corno dorsal da medula espinhal, onde
acontece a sinapse com neurônios de segunda ordem, predominantemente na
lâmina II (substância gelatinosa) (2). Os neurônios de segunda ordem cruzam a
medula espinhal para ascender ao trato espinotalâmico (3), projetando suas fibras
terminais principalmente ao tálamo (4). No tálamo, neurônios de terceira ordem
emitem axônios através da cápsula interna ao córtex somatossensor, onde a
somatização do estímulo nocivo ocorre, ou emitem axônios ao giro cingulado anterior
22
(5), onde existe o componente emocional da dor (RUSSO; BROSE, 1998). A via da
dor descrita acima representa uma rota clássica, mas existem também conexões
diretas da medula com o cérebro via trato espinoreticular e espinomesencefálico, e
com o hipotálamo via trato espinohipotalâmico (BROOKS; TRACEY, 2005).(Figura 2)
Figura 01. Via sensorial primária (condução do processo doloroso) Fonte: (http://www.crookes.co.uk/upload/tplt_Nurofen_.asp?page=2100002612)
23
Figura 02. Rotas alternativas para a condução do estímulo doloroso. A) Trato paleoespinotalâmico, B) Trato neoespinotalâmico. Fonte: (OTERO, 2004).
Além das projeções neuronais lançadas ao tálamo, existem projeções
espinhais para a medula ventrolateral, núcleo parabraquial, substância cinzenta
periaquedutal (PAG) e formação reticular. Todas essas estruturas representam um
importante papel tanto na inibição quanto na facilitação da transmissão nociceptiva e
subseqüente percepção dolorosa (MAYER; PRICE, 1976; TRACEY; DUNCKLEY,
2004).
É sabido que a transmissão nociceptiva na coluna espinhal é modulada pelo
Núcleo Magno da Rafe (NRM) e estruturas adjacentes da medula Ventro-Medial
Rostral (RVM). A RVM recebe projeções da PAG e então as projeta para o corno da
espinha dorsal ao longo do Funículo Dorsolateral (DLF). A PAG e a RVM, com estas
projeções espinhais, constituem o canal eferente do Sistema Descendente de
Controle da Dor, o qual pode inibir ou facilitar a transmissão espinhal do sinal
doloroso (VANEGAS, 2004).
A B
24
A existência deste sistema de modulação descendente da dor é conhecida
desde 1911, porém apenas em 1954 Hagbarth e Kerr o confirmaram empiricamente.
Além disso, a teoria do portão de controle da dor, descrita por Melzack e Wall em
1965 enfatiza algumas das interações polimodais, envolvidas na dor, embora a sua
base neural não seja completamente entendida. Essa teoria postula “portões”, no
corno dorsal da medula espinhal, que determinariam quais de toda uma série de
influências convergentes, provenientes de receptores sensíveis a estímulos nocivos,
táteis e térmicos seriam transmitidas para o SNC, a cada momento em particular.
Mais tarde um estudo demonstrou que a estimulação da PAG produzia
analgesia sem alteração na performance motora (MAYER e PRICE, 1976). Há
também fortes indicações de que este controle está relacionado com o sistema
opióide endógeno (YAKSH, 1999).
Estudos por imagem das estruturas cerebrais envolvendo o controle
descendente da dor vêm demonstrando o seu papel nos estados de dor clínica e, por
outro lado, a participação destas estruturas na facilitação do processo doloroso
(TRACEY et al., 2000; TRACEY; DUNCKLEY, 2004; ZAMBREANU et al., 2005).
A dor, além de uma sensação, é uma experiência. Isto é importante porque as
sensações possuem vias neuroanatômicas importantes, com receptores específicos
que permitem a detecção e a medida de um estímulo. A relação entre a sensação
dolorosa e o estímulo periférico evocado depende de muitos fatores externos como
ansiedade, depressão, atenção e expectativa (BROOKS; TRACEY, 2005).
O componente sensorial da dor é denominado nocicepção, que pode ser
definida como a resposta fisiológica a uma lesão tecidual. A nocicepção é a
progenitora da dor, que por sua vez causa o sofrimento. Além disso, a nocicepção
não é uma sensação uniforme. A qualidade da dor e o início das respostas
protetoras são determinadas por muitos fatores dentro da medula espinhal e
estruturas cerebrais superiores envolvidas na integração e modificação dos sinais
nociceptivos (RUSSO; BROSE, 1998).
Os SNC e SNP são dinâmicos e são modulados e/ou ativados por estímulos
provenientes dos tecidos. Na coluna espinhal, células imunes da glia, como
astrócitos e a microglia, são ativadas em resposta a inflamação subcutânea, trauma
no nervo e tumores. Atualmente, uma série de evidências apontam a glia envolvida
na criação e manutenção dos estados patológicos da dor, em parte pela liberação de
25
citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral (TNF) e a interleucina-1
(IL-1) (TSUDA; INOUE; SALTER, 2005).
Existem evidências de que os estímulos nocivos poderiam, também, produzir
variações de longa duração nos processos celulares do SNC através da modulação
da expressão de genes de ativação imediata como o c-fos e o c-jun (PRADO; DEL
BEL, 1998).
Uma pequena proporção de fibras aferentes, denominadas nociceptores
silenciosos ou latentes encontrados na pele, articulações e vísceras são
normalmente irresponsíveis a estímulos dolorosos intensos. Entretanto, quando
influenciadas por mediadores inflamatórios ou após a administração de substâncias
irritantes, estas fibras exibem atividade espontânea ou se tornam sensibilizadas e
então respondem a estímulos sensoriais (YAO; QI; CHEN, 2006).
Embora os muitos mecanismos moleculares envolvidos na sensibilização
central tenham sido estabelecidos, os mecanismos de sensibilização periférica ainda
não foram completamente elucidados. Entretanto, o conhecimento da biologia
molecular dos receptores permitiu extraordinário progresso no entendimento do
mecanismo de ação de diversos neurotransmissores e drogas envolvidas na
modulação central e periférica da nocicepção (MILLAN, 1999).
Existem importantes fontes geradoras de mediadores patofisiológicos como
por exemplo, dano tissular, tecidos vasculares, células imunes e tecidos adjacentes,
nervos sensoriais e do sistema simpático. Estes mediadores agem via diversos
receptores acoplados, na maior parte, a um limitado repertório de reguladores
celulares intermediários como a proteína G e a tirosina-quinase, ou ainda através da
interação com canais iônicos de membrana tipo voltagem-dependente (LEVINE;
TAIWO, 1994; AKOPIAN; ABSON; WOOD, 1996; WOOD; DOCHERTY, 1997;
MILLAN, 1999, CALIXTO et al., 2000 a/b). Esses processos afetam a excitabilidade
da membrana além de modificarem a transcrição gênica induzindo alterações de
longa duração na bioquímica dos neurônios sensoriais com conseqüências na
regulação neuroquímica, expressão de novos canais iônicos (canais de Na+) e
receptores (capsaicina, NPY) bem como na indução de enzimas (VANEGAS, 2004).
Tais mecanismos de transdução nociceptiva geralmente envolvem a atuação
dos mediadores inflamatórios em receptores específicos que se encontram
acoplados a sistemas efetores que quando devidamente ativados promovem a
formação de segundos mensageiros, como o AMPc (adenosina 3,5-monofosfato
26
cíclico) e GMPc (guanosina 3,5-monofosfato cíclico), responsáveis pela ativação de
proteínas-quinases intracelulares ou de terceiros mensageiros, como o Ca2+, o qual
pode interferir na atividade de outras proteínas celulares e na regulação de outros
canais iônicos. Os principais sistemas efetores dos receptores ativados pelos
mediadores inflamatórios são representados pela adenilato ciclase, guanilato ciclase,
fosfolipase C (PLC), fosfolipase A2 (PLA2), tirosina quinase, proteínas quinase A, C e
G e canais iônicos (MILLAN, 1999). Quando o mediador interage com o receptor,
uma resposta operada por estes receptores acoplados aos seus sistemas efetores é
transmitida para centros rostrais através da linguagem elétrica desencadeada. Tem
sido descrito receptores de canais iônicos relacionados com a transdução sensorial
do estímulo álgico, como o receptor vanilóide ativado pelo calor, receptor sensível a
prótons e receptor sensível a produtos do metabolismo das purinas (CAVALCANTI;
MADDALENA, 2003).
Muitas substâncias produzem ativação direta de nociceptores como a
bradicinina, o ATP e a capsaicina, provocando dor aguda. Porém mediadores
inflamatórios induzem hiperalgesia através da sensibilização do nociceptor,
resultantes da ativação direta de quinases celulares e alterações na excitabilidade da
membrana ou indiretamente via síntese e liberação de outros reguladores celulares
(prostanóides, citocinas, Fator de Crescimento do Nervo - NGF) (SALTER, 2004).
Além disso, a excitabilidade anormal surgida da inflamação e da injúria no
nervo pode envolver o aparecimento de novos canais iônicos e receptores.
Um maior conhecimento destes eventos permite modificações processuais
seletivas e são caminhos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos
analgésicos (LIPSCOMBE; RAINGO, 2006).
3.1.4 Farmacologia do controle da dor
Vários trabalhos demonstram que o processo inflamatório, intimamente
relacionado com a manifestação da dor, ocorre como uma resposta do tecido à lesão
celular e caracteriza-se por um fenômeno complexo, dinâmico e multimediado,
podendo manifestar-se a partir de qualquer agente lesivo, como físico (queimadura,
radiação e trauma), biológico (microorganismo e reações imunológicas) ou químico
(substância cáustica) (DRAY; RANG, 1998; MILLAN, 1999). A dor inflamatória
desponta, entre as demais, por causar sofrimento intenso aos pacientes, ser
27
duradoura, intermitente e comprometer psicológicamente seu portador. Um grande
número de fármacos disponíveis na clínica reduzem tal processo por inibirem seus
mediadores.
Durante a inflamação numerosos eventos ocorrem resultando em nocicepção
por estímulo periférico. As células inflamatórias e os nervos periféricos liberam uma
variedade de mediadores incluíndo as prostaglandinas (PGs), o que leva a uma
sensibilização dos nociceptores. Alterações no sistema nervoso central também
podem ocorrer. Em conjunto, essas alterações resultam em hiperalgesia (CARDOSO
et al., 2003). Tradicionalmente se acredita que os antiinflamatórios não-esteroidais
(AINEs) reduzem a atividade do nociceptor periférico através do bloqueio dos efeitos
sensibilizantes das PGs. Isto se baseia no fato dos eicosanóides hiperalgésicos
induzirem positivamente o AMPc, que é o mediador da hiperalgesia nos
nociceptores aferentes primários. Entretanto, vários outros mecanismos
antinociceptivos são atribuídos aos AINEs, que possuem como principal vantagem o
fato de, ao contrário dos opióides, não desenvolverem tolerância nem depressão
respiratória (RAEHAL; BOHN, 2005).
O ácido araquidônico é parte integrante da membrana fosfolipídica das células
e é liberado via ação da fosfolipase A2 sobre a fosfatidilcolina ou da fosfolipase C
sobre o fosfatidilinositol. Uma vez gerado, o ácido araquidônico é convertido nos
peróxidos cíclicos PGG2 e PGH2. O PGH2 é então convertido em PGs e tromboxano
pelas ciclooxigenases (COX) e em leucotrienos pelas lipooxigenases (TORIYABE et
al., 2004).
Em adição a ação direta das PGs na hiperalgesia ela também está envolvida
no processo de indução de sinais nociceptivos por outros agentes. A ativação de
receptores dos aminoácidos excitatórios como o N-metil-D-aspartato (NMDA) e
receptores metabotrópicos resulta num influxo do Ca2+ extracelular e na sua
mobilização intracelular, respectivamente (KEW; KEMP, 2005). Isto estimula o
metabolismo do ácido araquidônico pela fosfolipase A2. A ativação de receptores
metabotrópicos de aminoácidos excitatórios também estimula a fosfolipase C, que
metaboliza diacilglicerol, resultando também num aumento do ácido araquidônico. O
ácido araquidônico é então metabolizado pela COX resultando em PGs (KEW;
KEMP, 2005). A hiperalgesia induzida pela inflamação, obviamente, não depende
somente da ação das PGs. A interleucina -1β (IL-1β) regula positivamente o fator de
crescimento do nervo (NFG), que também participa do processo de hiperalgesia.
28
Tanto o meloxican (inibidor seletivo da COX-2) como a indometacina (inibidor
preferencial da COX-1) são capazes de reduzir os níveis desses mediadores bem
como da substância P (BROGDEN et al., 2005). Outro AINE, o diclofenaco, também
pode bloquear os efeitos da substância P por se ligar aos seus receptores. Como
ele, o cetoprofeno pode inibir a liberação de substância P no hipotálamo e na coluna
espinhal (CARDOSO; PEREIRA; CARVALHO, 2003). O papel da substância P na
dor inflamatória é bem estabelecido. A depleção de substância P através do
tratamento com capsaicina reduz significativamente a inflamação e a nocicepção em
experimentos de dor crônica e neuropática (MOORE et al., 2004). A administração
de aspirina ou paracetamol também pode atenuar a nocicepção induzida pela
substância P (BROGDEN et al., 2005). Assim, os AINES podem não apenas diminuir
a quantidade de substância P no sitio da inflamação como também bloquear seus
efeitos nociceptivos.
Outros efeitos centrais dos AINEs podem ser via regulação da expressão de
genes de ativação imediata, os quais são regulados positivamente durante a
nocicepção. A injeção intraplantar de carragenina em ratos resulta em edema
periférico e expressão de genes c-fos no corno dorsal destes animais. O tratamento
com piroxicam reduz de forma dose-dependente a expressão destes genes (PRADO;
DEL BEL, 1998).
A aspirina pode inibir o Fator de Transcrição Nuclear (NF-κB), um fator de
transcrição envolvido na ativação das citocinas inflamatórias IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α e
interferon-β (KOPP; GHOSH, 1994; GRILLI; CHEN-TRAN; LENARDO, 1993).
Outra classe muito importante e potente de fármacos para o tratamento da
dor são os chamados opióides. Fármacos opióides, como a morfina, são
analgésicos fortes utilizados para dor crônica. Entretanto, essa classe de
medicamentos possui ação central e elevado risco de depressão respiratória,
tolerância, constipação e dependência fisica (CAVALCANTI; MADDALENA, 2003;
RAEHAL; BOHN, 2005). Esses fármacos agem em receptores opióides, que fazem
parte da grande família de receptores acoplados a proteína-G e estão espalhados
por todo o corpo, mas especialmente no sistema nervoso (RAEHAL; BOHN, 2005).
Nos neurônios nociceptores os receptores opióides são responsáveis por diversas
ações envolvidas com o controle da sensação dolorosa, entre elas a inibição da
adenilato-ciclase diminuindo a síntese intracelular de AMPc, além de inativar canais
29
de Ca 2+ voltagem-dependente. Estas ações resultam numa redução da liberação de
neurotransmissores envolvidos na indução do processo doloroso (CHEVLEN, 2003).
Outros fármacos também podem modular a transmissão nociceptiva e dessa
forma controlar a dor, como os antidepressivos tricíclicos, os anticonvulsivantes, os
bloqueadores de canais de sódio, os neurolépticos, os esteróides, entre outros. No
entanto, a efetividade desses fármacos é muito variável entre os indivíduos, assim
como outros tratamentos alternativos, por vezes pouco eficientes, como a
estimulação elétrica dos nervos cutâneos, “biofeedback” e acupuntura
(MACFARLANE; JONES; HANNAFORD, 1997).
3.2 Importância das plantas como fonte de medicamentos
Perdoa-me por te apanhar. Não que eu pense que sou
melhor do que tu. Quero apenas que me faças bem,
E só apanharei o que for necessário. (Canção Navaja para o estramônio)
Ultimamente os pesquisadores têm mostrado interesse no enorme volume de
conhecimento acumulado pela medicina popular, a partir da qual, a cada dia, novas
drogas são obtidas (YUNES; CALIXTO, 2001).
A partir de uma perspectiva histórica, a produção de medicamentos e o
tratamento farmacológico de doenças tiveram seu início com o uso de plantas
medicinais (SCHULTZ, 2002). Além dos incontáveis gêneros alimentícios e
estimulantes como o café e o tabaco que se originaram do continente americano, o
mundo moderno tem de agradecer aos povos indígenas do Novo Mundo pelas
grandes contribuições que têm dado para o conhecimento e o uso de plantas
medicinais tropicais, das quais diversas substâncias já foram isoladas e sintetizadas
(BALDINGER, 1996).
A farmácia e a medicina modernas devem aos curandeiros e, sobretudo, às
mulheres herbanárias dos povos indígenas da América do Sul o conhecimento de
drogas muito importantes. Excelentes exemplos são encontrados no enorme
progresso no combate a malária a partir da quinina (obtida da casca de diversas
espécies de cinchonas) e no curare, veneno para flechas do qual se obteve
30
relaxantes musculares como a succinilcolina, bastate utilizada na clínica.
(BALDINGER, 1996). As plantas que contém glicosídeos cardíacos já eram
conhecidas dos antigos egípcios há cerca de 3.000 anos, como a Digitalis purpurea,
da qual é extraída a digoxina (SMITH et al., 1999). Da planta Atropa belladonna,
também conhecida como “Beladona”, foi isolado o alcalóide atropina, um antagonista
muscarínico largamente utilizado por bloquear os efeitos autonômicos
parassimpáticos (BRODDE; MICHEL, 1999). O safrol, presente no óleo de sassafrás
(Ocotea sp.) deu origem a antidepressivos largamente utilizados como a paroxetina,
derivado sintético que inibe seletivamente a reabsorção de serotonina (DECHANT;
CLISSOLD, 1991).
Vários compostos ativos (ou seus derivados semi-sintéticos) extraídos de
plantas têm sido avaliados por sua eficácia e tolerabilidade no tratamento do câncer.
Algumas espécies de plantas, incluindo Taxus baccata (paclitaxel, docetaxel),
Podophyllum peltatum (etoposide), Camptotheca acuminata (camptothecin) e Vinca
rosea (vinblastina e vinorelbina) possuem atividade antitumoral reconhecida,
enquanto outras espécies como a Panax ginseng e Allium sativum estão sendo
avaliadas em estudos experimentais utilizando culturas celulares e modelos animais
(MANTLE; LENNARD; PICKERING, 2000).
Ao se considerar a perspectiva de obtenção de novos fármacos, dois aspectos
distinguem os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a
função biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior
àquela derivada dos processos de síntese, que, apesar dos avanços consideráveis,
ainda é limitada. Além disso, como produtos de organismos que possuem muita
similaridade com o metabolismo dos mamíferos, os produtos naturais muitas vezes
exibem propriedades adicionais àquelas a eles associadas (NISBET; MOORE, 1997,
apud CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL. In: SIMÕES et al., 1999). Os recentes
avanços do nosso entendimento sobre os mecanismos de ação de substâncias
derivadas de plantas juntamente com a utilização de técnicas de biologia molecular
têm facilitado a identificação de alvos para o desenvolvimento de novos
medicamentos, mais seguros e eficazes (CALIXTO et al., 2001).
31
3.3 Compostos obtidos de plantas com comprovado efeito analgésico
A dor é considerada um dos mais freqüentes motivos pelos quais pacientes
são tratados em todo o mundo. Agentes analgésicos convencionais representam um
importante papel na terapia moderna da dor, porém apresentam uma série de efeitos
adversos (OTERO, 2004). Desta forma, é crescente a procura por novos e melhores
agentes analgésicos, que possuam ação seletiva e conseqüentemente uma menor
quantidade de efeitos colaterais.
A prática de friccionar óleos essenciais na pele para aliviar a dor tem raízes
profundas na medicina popular. Óleos de coníferas, cânfora, preparações de
capsaicina, óleo de hortelã, de gautéria são comumente usados para esse propósito
(BALDINGER, 1996).
Os metabólitos secundários derivados de plantas têm contribuído em muito
para o nosso conhecimento sobre importantes mecanismos relacionados com o
processo de transmissão e o tratamento da dor, como a caracterização dos tipos de
receptores e dos ligantes endógenos envolvidos no processo nociceptivo (CALIXTO
et al., 2000a).
Diversos gêneros com comprovados efeitos analgésios têm sido
exaustivamente estudados e deles são obtidos compostos isolados. Um destes
gêneros, o Phyllantus (Euphorbiaceae) possui cerca de 750 espécies endêmicas nos
países tropicais. Plantas deste gênero têm sido empregadas na medicina popular
para o tratamento de cálculos renais e urinários, infecções intestinais, diabetes e
hepatite. Alguns constituintes isolados dessas plantas, como flavonóides, taninos,
cumarinas, e terpenos parecem ser os responsáveis pelas suas atividades
analgésicas, antiinflamatórias, antivirais e hipoglicemiantes (CALIXTO et al., 1997).
Muitas outras plantas de uso corrente na medicina popular têm apresentado
propriedades analgésicas experimentalmente comprovadas, como a Arnica brasileira
(Lychnophora ericoides) (LOPES, 2003), o “Gervão” (Bouchea fluminensis) (COSTA
et al., 2003) e a “Nogueira-da-India” (Aleurites moluccana) (CECHINEL FILHO,
2000). Também foi comprovado o efeito analgésico de um triterpeno obtido das
folhas da “Amora-branca” (Rubus imperialis) (NIERO et al., 2002) e do filiceno, obtido
da Adiantum cuneatum, popularmente conhecida como “Avenca” (BRESCIANI et al.,
2003), além de cumarinas isoladas das folhas da Calophyllum brasiliense
(GASPAROTTO et al., 2005) e a atividade analgésica e antiiflamatória da “Salsa-da-
32
praia” (Ipomoea pes-caprae) (DE SOUZA et al., 2000) que são plantas endêmicas de
regiões do sul do Brasil. Recentemente foi descrita a propriedade antinociceptiva de
flavonóides encontrados nas folhas de Eugenia uniflora (SANTOS et al, 2005) e
Bauhinia microstachya (GADOTTI et al., 2005) além de um triterpeno isolado das
flores da Combretum leprosum (PIETROVSKI et al., 2006).
Plantas como a Papaver somniferum, a Cannabis sativa e espécies de
Capsicum e Salix tiveram uma importância crucial no desenvolvimento de drogas
clinicamente relevantes, úteis no tratamento e manejo dos estados dolorosos
(CALIXTO et al., 2001).
Apesar do progresso ocorrido na elucidação do processo de transmissão da
dor, após décadas de utilização e de apresentar diversos efeitos colaterais, a morfina
ainda continua sendo uma das drogas mais eficazes no tratamento das desordens
dolorosas (CALIXTO et al., 2001).
Além das substâncias químicas isoladas de plantas com comprovada
atividade analgésica, algumas estruturas podem apresentar reatividade química
interessante para o desenho de novos fármacos. Um exemplo promissor é o safrol,
obtido de óleo de sassafrás. A partir deste composto novos análogos de compostos
farmacologicamente ativos como o piroxicam foram desenvolvidos (BARREIRO et
al., 1982; FRAGA, 1991; FRAGA; BARREIRO, 1992).
3.4 Ácido Mirsinóico B
Os compostos fenólicos pertencem a uma classe de substâncias que inclui
uma grande diversidade de estruturas, simples e complexas, que possuem pelo
menos um anel aromático no qual, ao menos um hidrogênio é substituído por um
grupamento hidroxila. Estão amplamente distribuídos no reino vegetal e nos
microorganismos, fazendo também parte do metabolismo animal (SIMÕES et al.,
2002).
Dentre os compostos fenólicos pertencentes ao metabolismo secundário dos
vegetais são encontradas estruturas tão variadas quanto as dos ácidos fenólicos,
dos derivados da cumarina, dos pigmentos hidrossolúveis das flores, dos frutos e
das folhas. Além disso, esta classe de compostos abrange as ligninas e os taninos,
33
polímeros com importantes funções nos vegetais. Estruturas fenólicas ainda são
encontradas fazendo parte de proteínas, alcalóides e terpenóides (YUNES;
CALIXTO, 2001).
Os compostos fenólicos podem ser classificados segundo o tipo de esqueleto
principal, pela seguinte fórmula C6-CX, onde C6 corresponde ao anel benzênico e
CX corresponde a cadeia substituinte com X átomos de carbono.
Outro tipo de classificação está relacionado com a ocorrência destes
compostos no reino vegetal. Assim, podem ser divididos em:
a) Compostos fenólicos amplamente distribuídos, como os derivados dos
ácidos benzóicos e de ácidos cinâmicos, cumarinas, flavonóides e
derivados de polimerização (taninos e ligninas);
b) Compostos fenólicos de distribuição restrita como cromonas e
naftoquinonas. Dos derivados de ácidos benzóicos C6-C1 que são
encontrados na natureza, pode-se citar o ácido salicílico (Figura 3 -1), o
ácido protocatético (Figura 3 – 2), o ácido vanílico (Figura 3 – 3) e o ácido
gálico (Figura 4 – 4), compostos estes que apresentam atividades
biológicas importantes (CARVALHO et al., 1999). Cada classe de
composto apresenta ampla variação estrutural, principalmente pela
presença de diferentes substituintes (hidroxilas e metoxilas) em um
esqueleto aromático comum (SIMÕES et al., 2002).
COOH
OH
COOHHO
HO Ácido salicílico (1) Ácido protocatético (2)
COOHHO
CH3OCOOHHO
HO
HO
Ácido vanílico (3) Ácido gálico (4)
Figura 03. Estruturas de derivados do ácido benzóico encontrado na natureza
34
Os ácidos benzóicos prenilados são pouco comuns havendo apenas algumas
referências sobre o isolamento destes compostos nos gêneros Rapanea, Piper,
Ferula, Pedinophyllum e Prunus (ORJALA et al., 1993; BLUNT; CHEN; WIEMER,
1998; BALDOQUI et al., 1999; GREEN; TREADWELL; WIEMER, 1999; CHEN et al.
2000; FELD; RICROFT; ZAPP, 2004).
No gênero Pedinophyllum, dois ácidos benzóicos prenilados foram isolados da
espécie Pedinophyllum interruptum, sendo um deles muito instável na presença de
oxigênio (FELD; RICROFT; ZAPP, 2004).
Do gênero Prunus, obteve-se um acido benzóico prenilado inédito, o ácido 3-
prenil-4-O-β-D-glucopirasiloxi-4-hidroxibenzóico, isolado da espécie Prunus
amygdalus (SANG; LAPSLEY; ROSEN, 2002), enquanto que no gênero Piper,
ácidos benzóicos prenilados foram isolados das espécies P. taboganum, P.
arieianum, P. dilatatum, P. anduncum e P. hispidum (ROUSSIS; AMPOFO;
WIEMER, 1990; GREEN; TREADWELL; WIEMER, 1999; BALDOQUI et al., 1999;
FRIEDRICH et al., 2005).
Na medicina popular o gênero Piper é utilizado nos tratamentos dos males do
fígado e da amenorréia (SILVA et al.; 1998). De Piper anduncum, cinco derivados do
acido benzóico prenilado isolados de sua folhas apresentaram atividade moluscicida
(ORJALA et al., 1993) além do ácido 3-(3’, 7’-dimetil-2’, 6’-octadienil)-4-
metoxibenzóico que mostrou-se ativo contra Saccharomyces cerevisiae
genéticamente modificada (BALDOQUI et al.; 1999).
O arieianal, ácido benzóico 3,4-diidroxi-5-(E,E,E-11’-formil-3’,7’,15’-
trimetilhexadeca-2’,6’,10’,14’-tetraenil) foi isolado da espécie Piper arieianum
(GREEN; TREADWELL; WIEMER, 1999) e recentemente sintetizado por Odejinmi e
Wiemer (2005) que, além de sua síntese, estabeleceram uma rota para a produção
de derivados ativos.
Ácidos benzóicos prenilados com atividade antifúngica foram isolados da
espécie Piper dilatatum (GREEN; TREADWELL; WIEMER; 1999).
Oito diferentes estruturas de ácidos benzóicos prenilados foram isoladas de
Piper hispidum, das quais três delas apresentaram atividades citotoxicas
(FRIEDRICH et al, 2005).
Da espécie Ferula kuhistanica, planta medicinal do Uzbequistão, Chen et al.
(2000) e colaboradores isolaram quatro ácidos benzóicos prenilados que parecem
estimular o sistema imune.
35
Figura 04. Estrutura do ácido mirsinóico B isolado da Rapanea sp.
No gênero Rapanea, que apresenta atividade anti-helmíntica em ovinos
(GITHIORI et al., 2003), dois derivados do ácido benzóico prenilado foram isolados
na espécie R. myricoides (BLUNT; CHEN; WIEMER, 1998), e da Rapanea sp. foi
isolado o Ácido Mirsinóico B: 5-carboxi-7(3”,3”-dimetilalil)-2-(1’-hidroxi-1’,5’-dimetilex-
4’-enil) 2,3 diidrobenzeno-furano (Figura 4) que, por demonstrar interessante
atividade antinociceptiva e antitumoral (TESTONI, 2004) foi objeto do presente
estudo.
O
HOOC HO
36
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção do Ácido Mirsinóico B
O composto em estudo, o Ácido Mirsinóico B (AMB) foi obtido das cascas da
Rapanea sp. coletadas na cidade de Rancho Queimado, Santa Catarina, esta planta
encontra-se em fase de classificação botânica.
O material vegetal foi seco em estufa por 48 horas a 40-500C. Posteriormente
foi moído e submetido a um processo de extração exaustiva com clorofórmio. Após
filtração do extrato, o solvente foi removido por destilação em evaporador rotatório
sob pressão reduzida, para obtenção do respectivo extrato.
O extrato clorofórmico (37 g) foi submetido à cromatografia em coluna (φi 5,5
cm) de sílica gel (200 g), empacotada com hexano e eluída com hexano e
gradualmente enriquecida com acetato de etila e metanol. Foram coletadas 70
frações de 150 mL cada. As frações foram reunidas de acordo com semelhanças
observadas por cromatografia em camada delgada. Da fração 8-19 isolou-se o ácido
mirsinóico B (2,5 g).
4.2 Animais
Foram utilizados camundongos “Swiss” machos pesando entre 25 – 35g e
ratos “Wistar” pesando entre 250 e 300 g, criados e mantidos no biotério da
Universidade do Vale do Itajaí - UNIVALI. Os animais foram mantidos à temperatura
de 22 ± 3 º C, em ciclo claro/escuro de 12 horas, com acesso à água e ração ad
libitum. Os experimentos foram conduzidos de acordo com as normas internacionais
para o estudo com os animais de laboratório (ZIMMERMANN, 1983). O projeto de
dissertação foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVALI, tendo sido
aprovado com o Parecer 474/2004.
37
4.3 Drogas e reagentes
No presente estudo foram utilizadas as seguintes substâncias e soluções:
formalina (2,5%), morfina (5mg/kg) (Merck AG, Darmstadt, Alemanha) glutamato
(30μmol/pata), capsaicina (1,6µg/pata), L-arginina (600mg/kg), D-arginina
(600mg/kg), L-NOARG (75mg/kg), haloperidol (0,2mg/kg), apomorfina (1mg/kg),
yoimbina (0,15mg/kg), clonidina (0,1mg/kg), naloxona (1mg/kg) (Sigma chemical
Co., St. Louis, MO, EUA), , fenilefrina (0.2mg/kg), prazosin (0,15mg/kg), bicuculina
(0,7mg/kg), faclofeno (3mg/kg), muscimol (1mg/kg), baclofeno (1mg/kg) (Tocris,
Balwin, MO, EUA), PCPA (p-clorofenilalanina) (100mg/kg), ácido acético (0,6%),
ketamina (100mg/kg), atropina (1mg/kg), acetilcolina (1mg/kg), carragenina
(300µmol/pata), adrenalina (100ng/pata), bradicinina (3nmol/pata), imipramina
(10mg/kg), substância P (10nmol/pata), solução salina (NaCl 0,9%), captopril
(5mg/kg), dicromato de potássio (400, 600 e 800µg/mL). Os demais sais e reagentes
utilizados foram de alto grau de pureza analítica e procedência Merck. As diluições
foram realizadas em NaCl 0,9% estéril, Tween 20 ou DMSO (Dimetilsulfóxido).
4.4 Vias de administração
O composto em estudo foi administrado nos animais através das vias
intraperitoneal e/ou oral. Os controles positivos foram administrados somente por via
intra peritoneal. Para a via intraperitoneal o volume injetado foi de 0,1mL/10g de
peso em camundongos e 0,3mL/100g de peso em ratos. Para a via oral foi utilizado,
no máximo, 0,45 mL por aplicação. Após a administração dos compostos por via oral
e intraperitoneal foi aguardado um período de 60 min e 30 min, respectivamente, até
o início dos testes farmacológicos.
38
4.5 Ensaios farmacológicos utilizados
4.5.1 Analgesia
4.5.1.1 Teste das Contorções Abdominais induzidas pelo Ácido Acético
O modelo foi desenvolvido por Collier et al. (1968) e modificado por vários
pesquisadores ao longo dos anos. A resposta nociceptiva foi induzida pela injeção
intraperitoneal de ácido acético (0,6%) diluído em solução salina (0,9%). O
comportamento que se observa nos animais é o número de contorções abdominais
durante um período de 20 minutos. As contorções abdominais consistem na
contração da musculatura abdominal juntamente com a extensão de uma das patas
posteriores. Após o tratamento com o composto em estudo, nas vias intraperitoneal e
oral esperou-se 30 e 60 min., respectivamente, e procedeu-se à injeção
intraperitoneal do ácido acético. Os animais foram observados em pares, colocados
sob funis de vidro individuais e o número de contorções abdominais foi quantificado
cumulativamente. Nos grupos controle foi utilizado o veículo com o qual foi dissolvida
a substância testada. O composto (AMB) foi triturado em graal de porcelana,
dissolvido em Tween 20, e então diluído em salina nas concentrações específicas
para o ensaio. Foram testadas 5 concentrações do composto: 3, 6, 10, 30 e 60
mg/kg, pela via intraperitoneal e 4 concentrações, 150, 200, 300 e 500 mg/kg pela
via oral.
4.5.1.2 Avaliação do Tempo de Reação (Time Course)
Este teste visou avaliar o tempo de atividade antinociceptiva do ácido
mirsinóico B e para isto foi utilizado o modelo de dor induzida pelo ácido acético.
Grupos distintos de animais receberam AMB (60 mg/kg, i.p) e, após 30min, 1h, 2h,
4h, 6h e 8h foram tratados com ácido acético i.p. O comportamento observado nos
animais foi o número de contorções abdominais durante um período de 20 minutos
após a injeção i.p. de ácido acético.
39
4.5.1.3 Modelo de dor induzida pela Formalina
Este é um modelo mais específico do que o teste das contorções abdominais,
e permite avaliar dois tipos distintos de dor: a dor de origem neurogênica
(estimulação direta dos neurônios nociceptivos) e a de origem inflamatória
representando a resposta tônica à dor, acompanhada de uma resposta inflamatória
relacionada com a liberação de mediadores químicos da inflamação. O procedimento
foi descrito por Duibuisson e Dennis (1977) e aprimorado por Hunskaar et al. (1985).
Os animais foram tratados com o composto (AMB) nas concentrações 6, 10, 30 e
60mg/kg i.p. e, 30 minutos após, receberam 20µL de formalina a 2,5% (0,92% de
formaldeído) ou salina na região subplantar das patas posteriores direita e esquerda,
respectivamente. Após a injeção de formalina, os animais foram colocados,
individualmente, sob um funil de vidro o qual foi circundado por espelhos para
facilitar a observação do comportamento emitido. O tempo em que o animal
permaneceu mordendo ou lambendo a pata injetada com formalina foi cronometrado,
sendo este tempo considerado como indicativo de dor. Foi cronometrado
inicialmente os primeiros 5 minutos após a injeção de formalina (período
correspondente a dor neurogênica), aguardados 10 minutos, reiniciou-se a contagem
por 15 minutos consecutivos do tempo de lambidas que corresponde a dor
inflamatória. Ao final do tempo de observação, os animais foram eutanaziados por
deslocamento cervical e as patas posteriores cortadas na junção tíbio-tarsal e
pesadas em balança analítica para quantificação do edema induzido pela formalina.
A diferença de peso (em mg) entre a pata direta (injetada com formalina) e esquerda
(injetada com salina) foi considerada como índice do edema (DE SOUZA et al.,
2003).
4.5.1.4 Modelo de dor induzida pela Capsaicina.
Através deste modelo, que foi proposto por Sakurada, (1992), foi analisada a
possível ação modulatória do composto em estudo, sobre a dor de origem
neurogênica induzida pela capsaicina. Este teste é empregado com o objetivo de
evidenciar a possível interação dos compostos em estudo com os neuropeptídeos na
transmissão dolorosa, em especial no sistema taquicinérgico. Os animais foram
tratados com o composto nas concentrações 6, 10, 30 e 60 mg/kg i.p. Cada animal
40
foi colocado individualmente sob um funil de vidro transparente, por um período de
adaptação de, no mínimo, 20 minutos. Após este período, observou-se a reação à
dor induzida pela capsaicina, cronometrando-se durante 5 minutos o tempo em que o
animal permaneceu mordendo ou lambendo a pata. Cada animal recebeu 20 µL de
solução de capsaicina (1,6 μg/pata) injetada na região intraplantar da pata posterior
direita.
4.5.1.5 Modelo de dor induzida pelo Glutamato
Este é um dos mais recentes modelos para o estudo experimental da dor. Foi
proposto recentemente por Beirith (1998), sendo aplicado para o estudo de
substâncias que atuam sobre o sistema glutamatérgico, que está envolvido na
transmissão nociceptiva. A injeção de glutamato induz a estimulação direta dos
neurônios nociceptivos, causando a liberação de vários mediadores inflamatórios e
neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa. Assim, esse teste foi
empregado com o objetivo de evidenciar a possível interação do AMB com o sistema
glutamatérgico. Os animais foram tratados com o composto nas concentrações 10,
30 e 60 mg/kg i.p., e colocados individualmente sob um funil de vidro transparente,
por um período de adaptação de no mínimo 20 minutos, o qual foi utilizado para
observar a reação à dor induzida pelo glutamato. Foi cronometrado durante 15
minutos o tempo em que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata. Cada
animal recebeu 20μL de solução de glutamato (30 μmol/pata), injetada na região
intraplantar da pata posterior direita. O tempo que o animal levou para lamber ou
morder a pata injetada com glutamato foi considerado como indicativo de dor
(BEIRITH et al., 1998).
4.5.1.6. Modelo de dor induzida pelo Calor (Hot Plate)
A atividade antinociceptiva do AMB foi também analisada através do modelo
da placa quente ou “hot plate”, que mede o limiar antinociceptivo de compostos e/ou
substâncias com analgesia semelhante aos opióides. O modelo foi desenvolvido por
Woolfe e MacDonald (1944) com adaptações de Eddy e Leimback (1953) e
O’Çallaghan e Holzman (1975). Os animais foram colocados sob um funil de vidro
41
sobre a superfície de uma placa de metal previamente aquecida a uma temperatura
de mais ou menos 56ºC utilizando-se banho-maria. O tempo que o animal levou para
lamber, levantar ou morder as patas dianteiras ou traseiras foi considerado como
indicativo de dor. Os animais foram selecionados com 24 horas de antecedência e
submetidos ao teste sem qualquer tratamento. Foram selecionados aqueles animais
que apresentaram o indicativo de nocicepção nos primeiros segundos em contato
com a placa aquecida. Os animais cujo limiar de nocicepção foi alto (>25 segundos)
foram descartados. No dia seguinte os animais selecionados foram tratados com 10,
30 e 60 mg/kg i.p. do composto além do controle e, 30 minutos após foi realizado o
teste. A permanência dos animais sobre a placa quente foi permitida até um tempo
máximo de 30 segundos, evitando-se assim maiores danos teciduais decorrentes de
possíveis queimaduras.
4.5.1.7 Modelo de hiperalgesia
O potencial antihiperalgésico do AMB foi também avaliado em relação à dor
neuropática utilizando-se um modelo de hiperalgesia. Para isto foram utilizados ratos
Wistar (150-200g) machos obtidos do Biotério Central da UNIVALI. Os testes com o
composto obtido da Rapanea sp. foram realizados através do modelo de Randall e
Selitto, no qual a dor é induzida por estímulo mecânico, avaliando-se, em gramas, a
pressão exercida sobre um dos membros anteriores do animal (RANDALL;
SELITTO, 1957). Os animais foram pré-tratados com o AMB (10, 30 e 60 mg/kg, i.p.)
e/ou controles positivo (morfina 5mg/Kg, s.c)., imipramina (10mg/kg, i.p.) e negativo
(veículo) e, 30 min após a hiperalgesia (condição para a neuropatia) foi induzida
através da administração intraplantar dos seguintes agentes álgicos: carragenina
(30nmol/pata), capsaicina (1.6μg/pata), bradicinina (30nmol/pata), adrenalina
(5µg/pata) e susbtância P (10nmol/pata). Os animais tratados com bradicinina foram
pré-tratados com um inibidor da enzima conversora de angiotensina, o captopril
(5mg/kg), 1h antes do experimento para prevenir sua degradação (MENDES et al.,
1998). A hiperalgesia foi medida 30 min após a injeção dos agentes pró-
inflamatórios, com exceção da carragenina que foi avaliada após 4h.
Após a indução da neuropatia, os animais controle e tratado foram
submetidos ao estimulo da pressão crescente, até que apresentassem sinais de dor
aparente.
42
4.5.2 Modelos complementares
4.5.2.1 Modelo de toxicidade aguda
Para a avaliação da toxicidade aguda foi adotado o OECD/GUIDELINE FOR
TESTING OF CHEMICALS (2001). O AMB foi administrado na concentração de
2000 mg/kg v.o., em dose-única, ou veículo (grupo controle), em 4 animais (fêmeas
nulíparas). Os animais foram acomodados em caixas individualizadas. A temperatura
do laboratório foi mantida em 22±3°C, em ciclo claro/escuro de 12h. O período total
de observação foi de 24h com anotações da observação comportamental após 30
min, 1h, 2h, 4h, 6h e 24h do início do teste. Atenção especial foi dada nas primeiras
4 horas, onde geralmente os sinais de toxicidade são mais evidentes. Após este
período inicial a observação se estendeu por 14 dias, diariamente. A observação
clinica e anotação das respostas dos animais foi efetuada após os tempos
previamente determinados, em relação aos itens a seguir:
− alteração de pêlos, pele e mucosas;
− sistema circulatório (cianose);
− sistemas nervoso central e periférico (tremores, convulsões, sinal de
Straub);
− atividade somatomotriz (força de agarrar, resposta ao toque, tônus
muscular, micção, defecação, lacrimação);
− comportamento (irritabilidade);
− óbito;
− atenção especial aos sintomas: tremores, convulsões, salivação, diarréia,
letargia e coma.
A avaliação dos resultados foi feita de acordo com valores que são atribuídos
arbitrariamente a partir daqueles considerados normais. Os escores adotados foram:
diminuição ou aumento, presença ou ausência dos efeitos. Os resultados foram
resumidos e para cada grupo de ensaio foram consideradas as seguintes
informações:
− descrição dos efeitos tóxicos;
− o momento da morte de cada animal;
− outras manifestações tóxicas, além das anteriormente relacionadas;
43
− resultado da autopsia, no caso da morte de indivíduos.
4.5.2.2 Modelo de citotoxicidade induzida pela Artemia salina
Após o preparo da água do mar sintética (Sera Premium), (pH entre 8-9) os
ovos de Artemia salina foram colocados para eclosão por um período de 48 horas
em temperatura entre 24 e 26ºC. Uma solução-mãe de AMB foi obtida pesando-se
8mg do composto e adicionando-se 10% do volume total de DMSO para facilitar a
dissolução e então lentamente adicionou-se água do mar sintética até completar
10mL, a concentração final obtida foi de 800µg/mL. A solução foi deixada por alguns
minutos no ultra-som para total dissolução do composto. As baterias com diversas
concentrações do composto (500 - 8µg/mL) foram preparadas da seguinte maneira:
adicionou-se lentamente à solução-mãe, água do mar sintética até completar um
volume final de 10mL. Desta solução estoque tomou-se em triplicata: 1250, 620, 310,
120, 60 e 20µL que correspondem respectivamente as concentrações finais de 500,
248, 124, 48, 24 e 8µg/mL da amostra a ser testada, e completou-se com água
marinha para um volume final de 2mL.
Como controle positivo utilizou-se solução de dicromato de potássio nas
concentrações de 400, 600 e 800µg/mL. Para o preparo de tais concentrações,
pesou-se 16mg de dicromato de potássio que foi dissolvido em 20mL de água
marinha sintética. Desta solução estoque tomou-se em triplicata: 2,0, 1,5 e 1,0mL e
completou-se, quando necessário, o volume para 2mL com água do mar sintética,
resultando em soluções com as respectivas concentrações de 800, 600 e 400µg/mL.
Como controle negativo utilizou-se 2mL de água do mar sintética. Adicionou-se, com
auxilio de uma micropipeta, de 8-10 micro-crustáceos por experimento. Para facilitar
a micropipetação das larvas uma luminária fluorescente foi utilizada, devido à
migração das larvas para o local de incidência da luz. Após 24h a uma temperatura
entre 24 e 26ºC contou-se o número total e o número de mortos para cada
experimento (em triplicata).
O valor da DL50 foi obtido através da análise estatística (próbitos) do número
de micro-crustáceos mortos em cada experimento e o intervalo de confiança foi de
95% (MATTHEWS, 1994).
44
4.5.2.3 Modelo do campo aberto (Open Field)
A atividade exploratória foi observada através do modelo do campo aberto
(open field). Este modelo foi utilizado para avaliar a ação do AMB sobre a atividade
locomotora, procurando-se assim, eliminar a hipótese de que o animal estivesse sob
um efeito depressor do SNC, ao invés do efeito antinociceptivo esperado. O Open
field é utilizado para a avaliação de compostos estimulantes ou depressores do SNC,
e permite observar como o animal se comporta em um ambiente novo medindo o seu
estado emocional (CRUZ et al., 1997; DE SOUZA et al., 2003).
O aparato consiste em um campo aberto (caixa de madeira) com a superfície
inferior (chão) de cor preta (30x30x15cm), dividido em 09 quadrantes de igual área,
cujas dimensões podem variar de acordo com o animal estudado (CRUZ et al.,
1997). Um dos lados da caixa é feito de vidro, o que permite visualizar o
comportamento dos animais durante os 5 minutos do teste. O teste é simples de ser
realizado. Consiste na colocação do animal em estudo no referido aparato sendo
observado o tipo de movimento, a distância percorrida, o tempo dispendido para o
início das locomoções, as tentativas de levantar-se (rearing), as tentativas de fuga, o
número de cruzamentos (crossing), o tempo de imobilização e latência. Outros
parâmetros ainda podem ser avaliados, tais como a área visitada do campo,
interação com estímulos, número de vezes de auto-limpeza (grooming), ato de
cheirar, coçar, escavar, ranger os dentes, vocalização e exploração visual,
defecação e tempo de digestão, freqüência cardíaca e respiratória (CRUZ et al.,
1997; DE SOUZA et al, 2003).
Os parâmetros avaliados neste experimento foram os números de rearing
(levantamento do corpo sobre as patas traseiras para exploração do ambiente) e
número de crossing (cruzamento dos quadrantes), utilizados para avaliar a atividade
locomotora. Grupos distintos de animais foram pré-tratados pela via i.p. com veículo
(grupo controle) ou com AMB (60mg/kg). Após 30 min, os animais foram submetidos
ao teste do open field por 5 minutos.
45
4.5.3 Determinação do mecanismo de ação da propriedade antinociceptiva do
ácido mirsinóico B
Com o objetivo de determinar o(s) mecanismo(s) de ação da propriedade
antinociceptiva do AMB foi escolhida a dose de 60 mg/kg (dose mais efetiva nos
modelos preliminares de analgesia) bem como o modelo do ácido acético para a
avaliação do efeito do composto frente a vários sistemas de neurotransmissores
envolvidos na modulação do processo doloroso. A reversão da propriedade
antinociceptiva do composto por um antagonista específico de neurotransmissores
de várias vias que modulam o processo doloroso foi o critério adotado para a
determinação do mecanismo de ação do mesmo. As vias de neuromodulação
estudadas no presente trabalho foram: adrenérgica, colinérgica, dopaminérgica,
GABAérgica, dos glicocorticóides endógenos, opióide, oxidonitrérgica e
serotoninérgica.
Para a determinação do mecanismo de ação o seguinte delineamento foi
adotado, representado abaixo através do fluxograma:
46
Figura 05. Fluxograma do protocolo utilizado no estudo para determinação do mecanismo de ação do AMB 4.5.3.1. Participação do sistema α- adrenérgico
Visando evidenciar a participação do sistema α-adrenérgico sobre a
atividade antinociceptiva do AMB, grupos de animais foram pré-tratados com
antagonista dos adrenoceptores α2, ioimbina (0,15 mg/kg, i.p.) e antagonista dos
receptores α1, prazosina (0,15 mg/kg, i.p.) 15 min antes da administração do AMB
(60 mg/kg, i.p.), da clonidina (agonista α2-adrenérgico, 0,1 mg/kg, i.p.) ou de
fenilefrina (agonista α1- adrenérgico). Decorridos 30 min após os tratamentos, os
animais foram analisados pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético.
Administração do antagonista específico (i.p.)
Administração dos agonistas/AMB e/ou controle
negativo (i.p.)
30 min
15 min
Administração do ácido acético (i.p.)
20 minutos de observação
47
4.5.3.2. Participação do sistema colinérgico
Com o objetivo de evidenciar a participação do sistema
colinérgico sobre a atividade antinociceptiva do AMB, os animais foram pré-
tratados com o antagonista colinérgico não-seletivo atropina (1,0 mg/kg, i.p) 15
min antes da administração do AMB (60 mg/kg, i.p.) ou da acetilcolina (1,0 mg/kg,
i.p.). Decorridos 30 min do tratamento dos animais com o AMB e a acetilcolina, os
animais foram analisados pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético.
4.5.3.3. Participação do sistema dopaminérgico
Para a verificação da participação ou não dos receptores dopaminérgicos
no efeito antinociceptivo do AMB, os camundongos foram pré-tratados com
haloperidol (0,2 mg/kg, i.p., antagonista não-seletivo dos receptores
dopaminérgicos) e, após 15 min, receberam o AMB (60 mg/kg, i.p.), apomorfina (1
mg/kg, i.p., agonista dopaminérgico) ou veículo (10 mL/kg, i.p.). Decorridos 30
min, os animais foram analisados no modelo de dor induzida pelo ácido acético.
4.5.3.4 Participação do sistema GABAérgico
Visando investigar a possível participação do sistema GABAérgico (ácido γ-
aminobutírico) na atividade antinociceptiva do AMB, grupos de camundongos foram
pré-tratados com bicuculina (0,7 mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores
GABAA) ou faclofeno (3 mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores GABAB),
ambos administrados 15 min antes do AMB (60 mg/kg, i.p.), muscimol (1 mg/kg, i.p.,
agonista seletivo dos receptores GABAA), baclofeno (1 mg/kg, i.p., agonista seletivo
dos receptores GABAB) ou veículo (10 ml/kg, i.p.). Decorridos 30 min após os
tratamentos, os animais foram analisados pelo modelo de dor induzida pelo ácido
acético.
48
4.5.3.5 Participação do sistema glicocorticóide
Para a verificação do envolvimento do sistema de glicocorticóides frente à
propriedade antinociceptiva do AMB o procedimento experimental foi modificado.
Primeiramente os animais foram anestesiados com ketamina (100mg/kg i.p.) e as
glândulas adrenais foram retiradas através da incisão na região dorsal do animal.
Após a cirurgia, os animais retornaram para as suas caixas, tendo livre acesso a
água e comida, sendo que para o grupo de animais, os quais sofreram a retirada das
adrenais, a água foi substituída por solução fisiológica com o intuito de manter a
concentração fisiológica de sódio no plasma. Outros grupos de animais falso-
operados sem a retirada das adrenais (GRUPO SHAM) tiveram livre acesso a água e
comida.
Decorrido o período de 7 dias, os animais operados e os falso-operados foram
tratados com AMB (60mg/kg i.p.) e 30 min após o tratamento foi analisada a possível
reversão do seu efeito antinociceptivo em relação a nocicepção causada pelo ácido
acético.
4.5.3.6 Participação da via L-arginina-óxido nítrico
Foi investigada a participação da via L-arginina-óxido nítrico no efeito
antinociceptivo causado pelo AMB. Os animais foram pré-tratados com o
precursor do óxido nítrico, a L-arginina (600mg/kg, i.p.) ou com o seu isômero
inativo, a D-arginina (600 mg/kg, i.p.), e após 15 min receberam AMB (60 mg/kg,
i.p.) ou NG-nitro-L-arginina (L-NOARG, 75 mg/kg, i.p.), inibidor da síntese do óxido
nítrico (BEIRITH et al., 1998). Decorridos 30 min após o tratamento, os animais
foram analisados no modelo de dor induzida pela injeção i.p. de ácido acético. Os
animais controle foram tratados com o AMB (60mg/kg, i.p.), L-NOARG (75 mg/kg,
i.p.) ou com o veículo, 30 min antes da injeção do ácido acético.
49
4.5.3.7 Participação do sistema opióide
Com o objetivo de avaliar a participação do sistema opióide sobre o efeito
antinociceptivo do AMB, grupos distintos de animais foram pré-tratados com
antagonista opióide não seletivo, naloxona (1 mg/kg, i.p.) 15 min antes da
administração do composto (60 mg/kg, i.p.) ou de morfina (5 mg/kg, s.c.), utilizada
como controle positivo. Após um período de 30 min foi avaliado o efeito deste
tratamento em relação a nocicepção induzida pela injeção i.p. de ácido acético 0,6%.
4.5.3.8 Participação do sistema serotoninérgico
Num primeiro momento, visando investigar a relação liberação e síntese da
serotonina no efeito antinociceptivo causado pelo ácido mirsinóico, os animais foram
pré-tratados com p-clorofenilalanina (PCPA, 100mg/kg, i.p. inibidor da síntese de
serotonina, 1 vez ao dia durante 4 dias consecutivos). Transcorridos 30 min após o
último tratamento, os animais pré-tratados com PCPA receberam o AMB (60mg/kg,
i.p.) ou veículo e após 30 min foram analisados na nocicepção induzida pelo ácido
acético. Outro grupo de animais foi tratado, durante 4 dias consecutivos, com
solução fisiológica (NaCl 0,9%, 10ml/kg, i.p.), antes da administração do AMB
(60mg/kg, i.p.) ou veículo (10ml/kg, i.p.) e, analisado em relação à nocicepção
induzida pelo ácido acético.
Posteriormente, para avaliar a participação dos receptores serotoninérgicos
no efeito antinociceptivo causado pelo AMB, outros grupos de animais foram pré-
tratados com Ondasetron (0,5 mg/kg, i.p., antagonista 5-HT3), cetanserina (1 mg/kg,
i.p., antagonista 5-HT2a) ou somente com o veículo (10 mL/kg, i.p.). Decorridos 15
min, os animais foram tratados com o composto (60 mg/kg, i.p.) ou veiculo (10
mL/kg, i.p.) e após 30 min analisados em relação à nocicepção induzida pelo ácido
acético.
4.6 Análise estatística
Os resultados foram avaliados através de análise de variância (ANOVA) de
uma ou duas vias, conforme o protocolo experimental, seguido do teste de Student-
Newman-Keuls ou Dunett. Os resultados foram apresentados como a média dos
50
experimentos seguidos do erro padrão da média (EPM), exceto as DI50 (dose de
AMB que reduz a resposta em 50% em relação ao grupo controle), que foram
apresentadas como médias geométricas acompanhadas de seus respectivos limites
de confiança, em nível de 95%. As diferenças estatísticas entre os grupos foram
consideradas quando p<0,05. As DI50 foram estimadas a partir de experimentos
individuais utilizando-se o método de regressão linear através do programa
GraphPad® (Prism).
51
C 150 200 300 5000
10
20
30
40
50
60
70ControleAMB
**
***
Tratamento (mg/kg v.o.)
Núm
ero
de c
onto
rçõe
s ab
dom
inai
s
C 3 6 10 30 600
10
20
30
40
50
60
70ControleAMB
**
****
****
Tratamento (mg/kg i.p.)
Num
ero
de c
onto
rcoe
s ab
dom
inai
s5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Analgesia 5.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
Para melhor compreensão dos resultados expressos através das figuras que
seguem, as barras pretas correspondem aos controles negativos (tratados com o
veículo) e as demais os efeitos do AMB em diferentes concentrações.
Os resultados apresentados na Figura 06A demonstram que o ácido
mirsinóico B, administrado via i.p. apresentou potente ação antinociceptiva nas
concentrações de 30 e 60mg/kg, enquanto as concentrações de 3, 6 e 10mg/kg
demonstraram ação antinociceptiva mais branda, porém significativa se comparada
ao controle. A IM calculada para a administração i.p. foi de 76 ± 1,0% e a DI50 foi de
20,2 (17,4 – 24,4)mg/kg ou 59.06(50.87 - 71.34)µmol/kg.
Figura 06. Efeito antinociceptivo do AMB no teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético pela administração i.p. (A) e v.o. (B). Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle, **p< 0,01, *p< 0,05.
Na mesma figura (Painel B), os resultados demonstram que o ácido mirsinóico
B administrado por v.o. apresentou ação antinociceptiva nas doses de 200mg/kg,
300mg/kg e 500mg/kg, enquanto a dose de 150mg/kg não se mostrou significativa. A
IM calculada para o experimento foi de 43 ± 8,0%.
O modelo do ácido acético, apesar de ser relativamente simples e de pouca
A B
52
especificidade, é de fácil observação, apresenta boa sensibilidade a vários fármacos
analgésicos e antiinflamatórios não esteroidais, bem como os fármacos semelhantes
à morfina e outros analgésicos que atuam centralmente (SIEGMUND; CADMUS; LU,
1957; BLANE, 1967). Os resultados obtidos com várias classes de drogas
analgésicas, neste modelo, mostram boa correlação com a ação analgésica
encontrada em outros modelos pré-clínicos, bem como com estudos clínicos
(SIEGMUD; CADMUS; LU, 1957; KOSTER; ANDERSON; DE BEER, 1959;
BLUMBERG; WOLF; DAYTON, 1965; BLANE, 1967). Em 1964, Whittle demonstrou
que o ácido acético atua indiretamente causando a liberação de mediadores
endógenos envolvidos na modulação da dor, incluindo a bradicinina, serotonina,
histamina e as prostaglandinas. Ribeiro et al. (2000) mostraram que nocicepção
induzida pelo ácido acético depende da liberação de citocinas, que são proteínas
reguladoras produzidas principalmente por células imunocompetentes como
macrófagos e basófilos. A IL-1(interleucina-1), TNF-α (fator de necrose tumoral alfa)
e a IL-6 (interleucina-6) são as principais citocinas produzidas em resposta a
estímulos inflamatórios e também estão envolvidas na regulação positiva do eixo
hipotalâmico-hipofisário-adrenal (PIEK; WINTER, 2003). Além disso, o TNF-α induz
a síntese de prostaglandinas que, por sua vez modulam a atividade neuronal,
aumentando ou diminuindo a liberação de neurotransmissores, sensibilizando
neurônios sensoriais a estímulos nociceptivos e induzindo ações centrais como a
febre e o sono (MAMET; LAZDUNSKI; VOILLEY, 2003). Portanto, a dor abdominal
induzida pelo ácido acético pode ser prevenida por vários fármacos, destacando-se
entre estes os antiinflamatórios não-esteroidais.
Como controles positivos foram utilizados neste estudo o ácido acetil salicílico
e o diclofenaco potássico, antiinflamatórios não-esteroidais que atuam inibindo tanto
a ciclooxigenase-1 quanto a ciclooxigenase-2. Também foi utilizado o meloxicam,
inibidor seletivo da ciclooxigenase-2. Tais fármacos inibiram significativamente as
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.
De acordo com a tabela 01 pôde-se verificar que houve, também, significativa
inibição das contorções pelo AMB, que pode estar atuando na cascata do ácido
araquidônico e, assim como os controles positivos, inibindo as ciclooxigenases.
Apesar desta inibição, o AMB apresentou menor efetividade na inibição dolorosa
(IM%) do que os controles positivos quando administrado pela via i.p. Também
demonstrou menor potência do que o ácido acetil salicílico e foi ligeiramente inferior
53
ao diclofenaco potássico (DI50). Obteve-se efetividade consideravelmente menor (em
torno de 50%) quando o composto foi administrado pela via oral se comparado à via
i.p., o que pode significar que o AMB pode apresentar dificuldade de absorção no
trato gastrointestinal, sofrer metabolismo de primeira passagem e, portanto, ser
necessário doses maiores por essa via para que seja obtida a mesma eficácia
quando comparado com a via i.p.
Tabela 01. Comparação dos valores das DIs50 e inibição máxima para a atividade antinociceptiva do AMB, da ácido acetil salicílico, do diclofenaco potássico e do meloxicam na nocicepção induzida pelo ácido acético.
ND – Não determinado *Retirado de PEREIRA (2004)
5.1.2 Avaliação do tempo de reação (Time Course)
A fim de verificar a duração do efeito antinociceptivo do AMB, quando
administrado através da via i.p, e para determinar o tempo ideal de tratamento para
realização dos experimentos subseqüentes, grupos distintos de camundongos
receberam ácido mirsinóico B (60mg/kg, i.p.), e foram avaliados no modelo do ácido
acético durante 8 horas após sua aplicação. Os resultados apresentados na figura 07
demonstram que a resposta antinociceptiva do ácido mirsinóico B iniciou após 30
min de sua administração e que seu efeito perdurou por cerca de 6 horas, sendo em
torno de 1 hora após a injeção o pico máximo da ação antinociceptiva do composto
quando administrado por via i.p.
Teste do Ácido Acético
Tratamento Via
DI50(µmol/kg) Inibição (%) AMB i.p. 59.06 (50.87 -71.34) 76±1,0 AMB v.o. ND 43±8,0 AAS* i.p. 133.33 (72.22 – 244.44) 83,0±1,0 Diclof. Potássico* i.p. 69.25 (55.74 – 84.79) 100,0 Meloxicam* i.p. 19.83 (14.73 -27.76) 100,0
54
C 1/2h 1h 2h 4h 6h 8h0
10
20
30
40
50
60
70
ControleAMB
**
****
****
Tratamento (60mg/kg i.p.)
Num
ero
de c
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rcoe
s ab
dom
inai
s
Figura 07. Duração do efeito antinociceptivo do AMB no teste das contorções abdominais induzidas pelo acido acético, administrado na dose de 60mg/kg, i.p. Cada grupo representa a media de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle, **p< 0,01.
5.1.3 Modelo de dor induzida pela Formalina
Quando avaliado através do modelo de dor induzida pela formalina (Figura
8A) verificou-se que o ácido mirsinóico B produziu efeito antinociceptivo
estatisticamente significante para todas as concentrações testadas na primeira fase
desse modelo, enquanto que na segunda fase do modelo (Figura 8B) somente as
concentrações de 30 e 60mg/kg demonstraram efeito antinociceptivo considerável.
As IMs e DIs50 calculadas para a primeira fase foram respectivamente 51,8 ± 2,0% e
20,6 (17,4 – 24,4)mg/kg ou 60.23 (50.87 – 71.34)µmol/kg enquanto que para a
segunda foram 60,7 ± 1,0% e 32,8 (26,8 – 40,2)mg/kg ou 95.90 (78.36 -
117.54)µmol/kg.
Na Figura 8C também se verificou uma potente ação do ácido mirsinóico B na
diminuição do edema de pata causado pela formalina, sendo que as doses de 30 e
60 mg/kg foram as mais efetivas em diminuir o edema. A IM do edema foi calculada
em 77.50%, demonstrando efeito antinflamatório do composto.
55
C 6 10 30 600.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5ControleAMB
****
Tratamento (mg/kg i.p.)
Edem
a (g
)
C 6 10 30 600
100
200
300ControleAMB
****
**
Tratamento (mg/kg i.p.)
Tem
po d
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acao
(s)
C 6 10 30 600
50
100
150ControleAMB
******
**
Tratamento (mg/kg i.p.)Te
mpo
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reac
ao (s
)
Figura 08. Efeito antinociceptivo do AMB no teste da injeção intraplantar de formalina pela administração i.p. (painel A – dor neurogênica, painel B – dor inflamatória e painel C – atividade antiedematogênica). Cada grupo representa a media de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle, **p<00,1.
Neste experimento pôde-se verificar que o AMB produziu efeito significativo
na inibição da dor neurogênica, sugerindo possível participação do composto na
diminuição da liberação de neurotransmissores como a acetilcolina. O teste da
formalina consiste na injeção intraplantar de solução de formaldeido diretamente na
pata posterior do animal. O formaldeído é conhecido por induzir dor intensa pela
estimulação direta dos nociceptores. A dor, causada pela injeção intraplantar de
A
B
C
56
formalina, é caracterizada por vigorosas lambidas, mordidas e batidas na pata
injetada com o irritante. Como já relatado, podem ser caracterizadas duas fases
distintas de nocicepção, que parecem envolver diferentes mediadores
(DUIBUISSON; DENNIS, 1977; HUNSKAAR; FASMER; HOLE, 1985; HUNSKAAR;
HOLE, 1987; SANTOS; CALIXTO, 1997 a, b).
A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de formalina,
estendendo-se pelos primeiros 5min, o que se acredita dever-se à estimulação
química direta dos nociceptores (DUBUISSON; DENNIS, 1977; HUNKAAR; HOLE,
1987). Nesta fase inicial do teste a informação conduzida pelos neurônios aferentes
primários volta à periferia por ramificações eferentes dos mesmos neurônios,
induzindo a liberação de neuropeptídeos e outras substâncias que produzem uma
grande quantidade de respostas locais, denominadas em conjunto inflamação
neurogênica (MAMET; LAZDUNSKI; VOILLEY, 2003).
A segunda fase da nocicepção observada nesse modelo, ocorre entre 15-30
min após a injeção de formalina. Esta fase tardia ou inflamatória da nocicepção está
relacionada com a liberação de vários mediadores químicos como as citocinas, a
substância P e a bradicinina (HUNSKAAR; HOLE, 1987; TJOLSEN; HOLE, 1997). As
citocinas são produzidas principalmente em resposta a estímulos inflamatórios e
participam da resposta imune inata e adquirida (MAMET; LAZDUNSKI; VOILLEY,
2003). A susbstância P atua como neurotransmissor em neurônios aferentes
primários, participando da sinalização de estímulos nociceptivos na medula espinhal
(RUPNIAK et al, 1999) enquanto que a bradicinina é gerada rapidamente, logo após
a lesão tecidual, e modula a maioria dos eventos observados durante o processo
inflamatório, como aumento da permeabilidade vascular, extravasamento plasmático,
migração celular, dor e hiperalgesia (CALIXTO et al., 2000b).
As drogas opióides e os agonistas α2 são mais efetivas na diminuição da dor
na primeira fase do teste. Em 1997, Simonin et al. demonstraram que animais
“knock-out” para o receptor opióide κ não são capazes de alterar a nocicepção
induzida pela formalina. Já a segunda fase deste modelo está associada à resposta
inflamatória e envolve a produção de prostaglandinas e outros mediadores
inflamatórios, sendo melhor controlada por drogas antiinflamatórias não esteroidais e
por antiinflamatórios glicocorticóides (PIEK; WINTER, 2003).
Em recente estudo foi demonstrado que a formalina promove alterações nos
animais de experimentação em relação aos níveis dos hormônios ACTH, β-endorfina
57
e corticosterona, que se apresentam diminuídos (CAPONE; ALOISI, 2004). Além
disso, é sabido que a injeção intraplantar de formalina em ratos conscientes causa
significativo aumento de vários aminoácidos excitatórios como o glutamato, o
aspartato, a taurina, a glicina, a citrulina, além de aumentar os níveis de
prostaglandina E2, principalmente na segunda fase do teste. Porém não apresenta
aumentos significativos em relação à serina, asparagina e glutamina na primeira fase
da dor induzida pela formalina (MALMBERG; YAKSH, 1995)
Os efeitos do composto em estudo foram comparados com controles positivos
como os fármacos antiinflamatórios ácido acetil salicílico, diclofenaco potássico e
meloxicam. Conforme dados relacionados na tabela 02 pode-se observar que, em
relação à inibição da dor causada pelo processo inflamatório (fase tardia), o
composto apresentou potência 12 vezes inferior ao meloxicam, mas superior ao
diclofenaco potássico e ao ácido acetil salicílico. Porém sua efetividade em diminuir o
processo doloroso foi menor que as dos fármacos utilizados como controles
positivos.
Tabela 02. Comparação dos valores das DIs50 e inibição máxima para a atividade antinociceptiva do AMB, do ácido acetil salicílico, do diclofenaco potássico e do meloxicam na nocicepção induzida pela formalina.
ND – Não determinado *Retirado de PEREIRA (2004)
Teste da Formalina Tratamento Via
Primeira Fase DI50 (µmol/kg)
Inibição (%)
Segunda Fase InibiçãoDI50(µmol/kg) (%)
AMB i.p. 60.23 (50.87 – 71.34) 51,8±2,0 95.90 (78.36 – 117.54) 60,7±1,0 AAS* i.p. ND 17,0±3,0 683.33 (427.77 – 1161.11) 85,0±4,0 Diclof. Pot.* i.p. ND 35,0±6,0 116.55(85.81 – 157.09) 73,0±8,0 Meloxicam* i.p. 20.11 (9.63 – 41.07) 58,0±3,0 7.93 (5.66 – 12.18) 82,0±4,0
58
C 6 10 30 600
25
50
75
100
125
150
175 ControleAMB
**
****
**
Tratamento (mg/kg i.p.)
Tem
po d
e re
ação
(s)
5.1.4 Modelo de dor induzida pela Capsaicina
Na figura 09 estão representados os resultados obtidos com o AMB quando
realizado o modelo de dor induzida pela capsaicina. Os resultados obtidos
demonstraram efeito antinociceptivo significativo em todas as doses ministradas.
Pode-se observar ainda, que o efeito resultante do tratamento com AMB foi do tipo
dose-dependente.
Figura 09. Efeito antinociceptivo do AMB no teste da injeção intraplantar da capsaicina pela administração i.p. Cada grupo representa a media de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle, **p< 0.01. A capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida), substância álgica de ocorrência
natural derivada de plantas da família Piperaceae, possui um importante papel no
estudo das fibras sensoriais C e Aδ aferentes incluindo os nociceptores polimodais e
termoreceptores (PIETROVSKI et al.,2006). Foi proposto que a nocicepção induzida
pela capsaicina é conseguida através da ativação do receptor de capsaicina,
também conhecido como receptor vanilóide (TRPV), denominado TRPV1, ligado a
canais de cátions não-seletivos, presentes nos neurônios sensoriais primários
(CATERINA et al., 1997; SZALLASI; BLUMBERG, 1999).
A diminuição do pH ativa canais catiônicos (permeáveis a Na+, K+ e Ca++) que
induzem despolarização prolongada de inativação lenta na membrana celular. As
principais fontes de H+ são os exsudatos, os leucócitos, o músculo isquêmico, os
59
hematomas e o tecido que rodeia os tumores. Durante muito tempo se pensou que
os H+ eram ligantes endógenos dos TRPV1. Entretanto, parece que o estímulo
específico para esses receptores são temperaturas maiores de 43◦C. Notavelmente,
a resposta de TRPV1 à temperatura ou à capsaicina é facilitada pelos H+, mas não
ativada por eles (PREMKUMAR, 2001). Estudos tem mostrado que a capsaicina
provoca a liberação de neuropeptideos (SP, NKA, NKB e CGRP), aminoácidos
excitatórios (glutamato e aspartato), óxido nítrico e mediadores pró-inflamatórios nos
nervos periféricos e que esta informação nociceptiva é transmitida para a medula
espinhal (SZALLASI; BLUMBERG, 1999; SANTOS; CALIXTO, 1997a; SAKURADA
et al., 1996).
Considerando que a nocicepção causada pela capsaicina é de origem
neurogênica, nossos achados segurem que o AMB exerce importante inibição na dor
dessa origem, possivelmente inibindo a liberação de mediadores da inflamação
como os neuropeptídeos, impedindo assim a ativação de outros sistemas efetores
como o aumento dos níveis de AMPc, síntese de derivados do ácido araquidônico e
formação de NO, reforçando os resultados encontrados na primeira fase do modelo
de dor induzida pela formalina.
Conforme mostra a Tabela 3, verificou-se também resultados de efetividade
de inibição da nocicepção do AMB superiores aos fármacos meloxicam e diclofenaco
potássico, utilizados como controles-positivos para este teste.
Tabela 03. Valores das DIs50 e inibição para o AMB na nocicepção induzida pela
capsaicina.
ND – Não determinado *Retirado de PEREIRA (2004)
Teste da Capsaicina
Tratamento Via
DI50(µmol/kg) Inibição (%) AMB i.p. Npc 88,0±2,0 Diclof. potássico i.p. 160.13 (116.55 – 220.06) 72,0±7,0 Meloxicam i.p. 11.33 (7.36 – 20.84) 62,0±6,0
60
C 10 30 600
50
100
150
200
250 ControleAMB
**
***
Tratamento (mg/kg i.p.)
Tem
po d
e re
ação
5.1.5 Modelo de dor induzida pelo Glutamato
Os resultados obtidos neste modelo mostram que o tratamento dos animais com o
AMB pela via i.p. (10, 30 e 60 mg/kg) não foi efetivo em reduzir a nocicepcão
induzida pelo glutamato (30μmol/pata) nas concentrações de 10 e 30mg/kg,
conforme figura 10. Porém, a concentração de 60mg/kg de AMB reduziu
significativamente o tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata
injetada.
Figura 10. Efeito da atividade antinociceptiva do AMB no teste da injeção intraplantar do glutamato pela administração i.p. Cada grupo representa a media de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle **p<0,01, ***p<0,001.
A IM calculada para o experimento foi de 79,71% e a DI50 109.23 (45.02 –
220.08)µmol/kg. Tal resultado sugere que o AMB pode possuir um efeito
modulatório, atuando como antagonista dos receptores glutamatérgicos, uma vez
que este modelo vem sendo utilizado para o estudo de drogas que atuam na
transmissão nociceptiva mediada pelo glutamato (CULL-CANDY; LESZKIEWICZ,
2004).
Vários trabalhos descritos na literatura demonstram que diversos
transmissores químicos, entre eles os aminoácidos excitatórios (glutamato e
aspartato), apresentam papel relevante no processo de sensibilização do corno
dorsal da medula espinhal, já que a estimulação das fibras aferentes primárias induz
a liberação desses neurotransmissores e substância P (FERREIRA; DUARTE;
LORENZETTI, 1991; SORKIN et al., 1992; MALMBERG; YAKSH, 1995; SKILLING et
61
al., 1998; FERREIRA, 1999). O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório
no SNC e suas ações são mediadas via ativação tanto de receptores ionotrópicos
quanto de metabotrópicos (KEW; KEMP, 2005).
O estímulo nociceptivo inicial dos neurônios aferentes primários é mediado
por sinapses glutamatérgicas com neurônios de segunda ordem no corno dorsal da
medula espinhal através da ativação de receptores AMPA/kainato e NMDA
(SALTER, 2005). A ativação do receptor NMDA pode levar a uma hiperatividade
central pela estimulação das fibras C, pois a atividade deste receptor é facilitada pela
convergência intracelular de cascatas bioquímicas nos neurônios do corno dorsal
(SALTER, 2005). Evidências imunocitoquímicas e de microscopia eletrônica indicam
que receptores NMDA pré-sinápticos estão presentes nos terminais aferentes
primários tanto centrais quanto periféricos e que também podem estar envolvidos no
processamento da informação nociceptiva, visto que sua ativação inibe a liberação
de glutamato afetando a transmissão sensorial. Por outro lado, há evidências da
liberação de substância P e BDNF (fator neurotrófico cerebral) nos terminais das
fibras-C devido à ativação desses receptores (CULL-CANDY; LESZKIEWICZ, 2004).
O aumento da transmissão sináptica excitatória no processo da dor parece ser
um substrato neural para o desenvolvimento da dor crônica e assim, mecanismos
celulares e moleculares podem ser alvos potenciais para o desenvolvimento de
novas formas terapêuticas (KEW; KEMP, 2005) Sabe-se que antagonistas do
receptor NMDA suprimem o aumento da excitabilidade neuronal que se segue à
estimulação de fibras nociceptivas na coluna espinhal (CULL-CANDY;
LESZKIEWICZ, 2004). O desenvolvimento de ligantes seletivos, incluindo agonistas
e antagonistas competitivos e moduladores alostéricos positivos e negativos tem
possibilitado investigações sobre o papel funcional dos receptores glutamatérgicos
no processo doloroso (KEW; KEMP, 2005), porém a interferência do glutamato no
desenvolvimento neural, na plasticidade sináptica, no aprendizado e na memória, na
epilepsia, na isquemia neural, na tolerância e na dependência a drogas, na dor
neuropática, na ansiedade e na depressão tem limitado o uso de compostos que
agem nos receptores glutamatérgicos, quando existe a necessidade de ações mais
seletivas dessas drogas (CAROBREZ, 2003).
62
C 5 10 30 600
5
10
15
20
ControleMorfinaAMB
** ****
**
Tratamento (mg/kg)
Lim
iar
noci
cept
ivo
5.1.6 Modelo de dor induzida pelo calor (Hot Plate)
Os resultados apresentados na Figura 11 demonstram que os animais
tratados com AMB (10, 30 e 60 mg/kg) tiveram o seu limiar antinociceptivo
aumentado quando comparados com animais que receberam o controle negativo
(veículo). O aumento do limiar nociceptivo calculado foi de 364.58% no teste da
placa quente, mostrando que o AMB também é efetivo em reduzir a nocicepção
mediada por estímulos térmicos.
Figura 11. Efeito antinociceptivo causado pelo AMB no teste da placa quente administrado pela via i.p. e pela morfina administrada via s.c. Cada grupo representa a media de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,**p< 0,01.
Neste teste, um estímulo térmico ativa nociceptores que transmitem
informação nociceptiva aguda a regiões especificas no SNC, produzindo uma
resposta nociceptiva organizada (MOGIL e ADHIKARI, 1999). Por esse motivo a
placa quente é um dos métodos mais utilizados no estudo de drogas analgésicas,
principalmente aquelas com ação central, como os opióides e os anestésicos gerais
(WALKER; FOX; URBAN, 1999).
O aumento da temperatura corporal pode ativar o receptor vanilóide (TRPV-1).
Este receptor está ligado a um canal iônico que pode ser aberto em resposta a
estímulos térmicos. A despolarização provocada pela movimentação de íons Ca2+ na
63
fibra nervosa através do TRPV-1 opera a abertura de canais de Na+ voltagem-
dependente, os quais disparam potenciais de ação (ZIEGLGANSBERGER;
BERTHELE; TOLLE, 2005).
Além do TRPV-1, outros receptores como o VLR-1 (receptor relacionado ao
TRPV-1) e o ASIC (canal iônico ativado pelo estiramento) foram clonados e
identificados como proteínas termoreceptoras. A ativação destas proteínas causa
influxo de íons em neurônios sensoriais, iniciando o processo de condução da
informação nociceptiva térmica (REICHLING; LEVINE, 2000; ZIEGLGANSBERGER;
BERTHELE; TOLLE, 2005).
5.1.7 Efeito Antihiperalgésico
Os resultados demonstrados na Figura 12 são decorrentes dos estudos de
hiperalgesia induzida em ratos, avaliados no modelo Randall-Sellito, sob o pré-
tratamento do AMB. De acordo com os dados obtidos, o composto em estudo foi
efetivo em reverter o processo hiperalgésico induzido por capsaicina, carragenina,
adrenalina e bradicinina com IMs calculadas, respectivamente, de 49.55%, 60.86%,
62.39% e 116.27% (Quadro 01).
Ao contrário do que se esperava não foram observados efeitos do AMB
quando a hiperalgesia foi induzida por Substância P (Figura 12 E). Também
observou-se que os animais tratados com o composto tiveram 100% de reversão do
processo hiperalgésico induzido pela bradicinina. Em termos de eficácia, pôde-se
também observar que o composto exibe atividade farmacológica superior à
imipramina, quando a hiperalgesia é induzida por bradicinina, tendo eficácia inferior a
esse fármaco e à morfina nos demais processos de indução da hiperalgesia. Quando
se comparou a potência, pôde-se verificar que na hiperalgesia induzida por
bradicinina, a DI50 para o composto foi aproximadamente igual a 10mg/kg. Já no
processo hiperalgésico induzido tanto por carragenina quanto por adrenalina, a
potência do composto é reduzida em 5 vezes, sendo necessárias doses maiores do
mesmo para a obtenção do efeito farmacológico (Quadro 01).
Estes resultados mostram que o composto em estudo foi capaz de reduzir de
forma significativa (e algumas vezes dose-dependente) a atividade de diversos
agentes flogísticos, que participam o processo inflamatório e doloroso. Supõe-se
então, que o AMB esteja atuando por inibir a síntese ou a liberação de alguns
64
mediadores inflamatórios, ou ainda, por estar atuando em algum mecanismo de
bloqueio de canais iônicos e/ou antagonizando receptores de mediadores do
processo inflamatório envolvidos na gênese da hiperalgesia e/ou dor neuropática. Tal
hipótese pode ser reforçada pelos resultados obtidos não só neste estudo, mas em
outros onde o composto foi também eficaz em reduzir processos dolorosos nos quais
mediadores da inflamação são liberados (dor induzida por ácido acético e formalina)
como também por resultados encontrados na literatura. Hirota et al (2002)
descreveram que do extrato de Mirsínea foram obtidos compostos diferenciados
denominados mirsinóicos B, C e F, os quais exibiram efeitos antiinflamatórios
quando avaliados em modelos de inflamação (HIROTA et al., 2002).
Figura 12. Efeito do AMB em relação à hiperalgesia induzida pela injeção intraplantar de capsaicina, carragenina, adrenalina, bradicinina e substância P, pela administração i.p.. Cada grupo tratado foi com diferentes doses de AMB (barras com listras). Diferem significativamente dos experimentos que receberam os agentes hiperalgésicos (barras com pontos), *p<0,05,**p<0,01, ***p<0,001 quando comparadas com os controles hiperalgesicos.
Hiperalgesia com Capsaicina
Tratamento (mg/Kg, i.p.)
Peso
(g)
Cp Ch 10 30 600
100
200Controle puroControle hiperagésicoÁc. Mirsinóico B
***
Ác. Mirsinóico B
Hiperalgesia com Carragenina
Tratamento (mg/Kg, i.p.)
Peso
(g)
Cp Ch 10 30 600
100
200
300Controle puroControle hiperagésicoÁc. Mirsinóico B*
* *
Ác. Mirsinóico B
Hiperalgesia com Bradicinina
Tratamento (mg/Kg, i.p.)
Peso
(g)
Cp Ch 10 30 600
100
200
300Controle puroControle hiperagésicoÁc. Mirsinóico B
*****
***
Ác. Mirsinóico B
Hiperalgesia com Substância P
Tratamento (mg/Kg, i.p.)
Peso
(g)
Cp Ch 10 30 600
100
200
300Controle puroControle hiperagésicoÁc. Mirsinóico B
Ác. Mirsinóico B
A B
C D
E
65
Quadro 01. Comparação do efeito do AMB sobre a hiperalgesia induzida pela capsaicina (A), carragenina (B), adrenalina (C), bradicinina (D) e substância P (E).
A – Hiperalgesia com capsaicina Tratamento Dose (mg/kg) I.M.% DI50 (mg/kg) AMB 60 49.53 ≡ 60 Imipramina 10 168.52 Npc Morfina 5 118.52 Npc B – Hiperalgesia com carragenina Tratamento Dose (mg/kg) I.M.% DI50 (mg/kg) AMB 60 60.86 57.88 (40.45 – 82.84) Imipramina 10 161.21 Npc Morfina 5 112.24 Npc C – Hiperalgesia com adrenalina Tratamento Dose (mg/kg) I.M.% DI50 (mg/kg) AMB 60 62.39 54.18 (42.18 – 69.59) Imipramina 10 98.34 Npc Morfina 5 135 Npc D – Hiperalgesia com bradicinina Tratamento Dose (mg/kg) I.M.% DI50 (mg/kg) AMB 60 116.27 ≡ 10 Imipramina 10 94.64 Npc Morfina 5 121.43 Npc E – Hiperalgesia com substância P Tratamento Dose (mg/kg) I.M.% DI50 (mg/kg) AMB 60 33.58 Npc Imipramina 10 114.55 Npc Morfina 5 132.73 Npc
Npc – não possível calcular
A dor neuropática é definida como uma condição de dor crônica que ocorre ou
persiste após uma lesão primaria, ou ainda como uma disfunção no sistema nervoso
central ou periférico (ZIEGLGANSBERGER; BERTHELE; TOLLE, 2005). A injúria
traumática de nervos periféricos pode aumentar a excitabilidade dos nociceptores e
envolver, assim, a liberação de substâncias nas terminações nervosas, como os
mediadores inflamatórios (prostaglandinas, bradicinina, serotonina, citocinas) e de
células adjacentes ao sítio da injúria (componentes imunológicos e vasculares)
(LEVINE; TAIWO et al., 1994; ZIEGLGANSBERGER; BERTHELE; TOLLE, 2005).
Potenciais de ação gerados em nociceptores e fibras nervosas lesadas liberam
neurotransmissores excitatórios nos terminais sinápticos como o glutamato e a
substancia-P, disparando eventos celulares no sistema nervoso central
(MACFARLANE; JONES; HANNAFORD, 2006).
66
A síndrome da dor neuropática, como a neuralgia pós-herpética, a neuropatia
diabética periférica e a neuralgia do trigêmeo afetam milhares de pessoas em todo o
mundo. Muito do progresso do nosso entendimento sobre dor neuropática se deve a
estudos experimentais com modelos animais de dor, como os modelos de
hiperalgesia e modelo de dor neuropática causada por injúria do nervo. Estes
modelos têm mostrado que a dor neuropática é provavelmente, o resultado não
apenas de um evento patofisiológico isolado mas o produto final de processos
periféricos, espinhais e supra-espinhais alterados (RODE et al., 2006).
A dor neuropática resulta de danos nos nervos periféricos, nos gânglios da
raiz dorsal e espinhal, ou ainda no sistema nervoso central. Isto é caracterizado por
uma combinação complexa de déficits sensoriais incluindo a perda completa ou
parcial das sensações e a parestesia. A injúria no nervo leva a neuromas que podem
reduzir o limiar dos terminais nociceptores aos estímulos mecânicos e térmicos e
assim aumentar e manter o estímulo aferente. Este estado de dor é provavelmente
independente de estímulos periféricos adicionais, podendo também envolver
atividade espontânea ou a geração de potenciais de ação nas fibras Aδ-mielinizadas
(TRACEY, 2005).
Numerosos mediadores podem ativar ou sensibilizar nociceptores silenciosos,
ou influenciar fibras nervosas não efetadas pela injúria tecidual em si. Em muitos
pacientes a etiologia da dor é mais complexa por causa dos componentes
inflamatórios e imunológicos, os quais surgem em combinação com a dor
neuropática, caracterizando uma dor mista. (WOOLF, 2004; CODERRE et al., 1993).
As respostas favoráveis nos tratamentos da dor neuropática com a injeção de
glicocorticóides suportam a idéia de que não apenas a injuria nervosa deve ser
considerada como a causa deste tipo de dor (FERNÁNDEZ, 2002).
Muitas drogas têm sido utilizadas para o tratamento da dor neuropática, como
os antidepressivos tricíclicos, antiarrítmicos e antiepiléticos, que podem estar agindo
por interferirem no aumento e na geração dos potenciais de ação nos nervos
injuriados ou potencializando os sistemas de inibição do processo doloroso
(MOSHIREE et al, 2006).
67
5.2 Modelos complementares
O composto em estudo também foi avaliado em dois modelos de toxicidade
para verificação de algum possível efeito tóxico.
5.2.1 Modelo de toxicidade aguda
No modelo de toxicidade aguda onde foi utilizada a dose de 2000 mg/kg, a
DL50 é superior a esta dose, uma vez que não foi constatado nenhum óbito com o
tratamento.
O modelo de toxicidade aguda adotado no presente trabalho como já relatado
anteriormente, é o OECD GUIDELLINE FOR TESTING OF CHEMICALS edição de
2001. O guia preconiza o uso de doses padronizadas, e foi adotado pela British
Toxicology Society desde os anos 90. O método é mundialmente realizado por vários
motivos, mas o primordial é que o número de animais é bastante reduzido, o que
evita as inúmeras discussões com os comitês de ética em pesquisa quanto ao
emprego de animais para se determinar a DL50 (Dose Letal) de uma substância.
Durante o teste os animais demonstraram considerável diminuição da
atividade geral após o tratamento com AMB na dose de 2000mg/kg. Observou-se
resposta diminuída ao toque e diminuição na força de agarrar, entretanto não houve
diminuição no tônus muscular. Percebeu-se diminuição de micção e defecação. Os
animais apresentaram também pequeno grau de cianose e piloereção. Não foram
observados tremores, convulsões, lacrimação, irritabilidade ou sinal de Straub.
Todos os sinais de toxicidade cederam após a primeira hora da ingestão do AMB.
Não houve óbito durante o período de observação, não sendo necessárias assim, as
autópsias.
68
Quadro 2. Efeito do AMB sobre a toxicidade aguda. Adaptado de OECD Guidelines for the testing of chemicals (2001).
Parâmetro observado (machos)
1h 2h 4h 6h 24h Observações
Forca de agarrar - - - -
Resposta ao toque - - - -
Tônus muscular - - - -
Micção - - - -
Defecação - - - -
Cianose - - - - -
Piloerecão - - - - -
Tremores - - - - -
Convulsões - - - - -
Lacrimacão - - - - -
Irritabilidade - - - - -
Sinal de Straub - - - - -
Óbito - - - - -
Parâmetro observado (fêmeas)
1h 2h 4h 6h 24h Observações
Forca de agarrar - - - -
Resposta ao toque - - - -
Tônus muscular - - - -
Micção - - - -
Defecação - - - -
Cianose - - - - -
Piloerecão - - - - -
Tremores - - - - -
Convulsões - - - - -
Lacrimacão - - - - -
Irritabilidade - - - - -
Sinal de Straub - - - - -
Óbito - - - - -
(diminuição), (aumento), + (apresentação do efeito), - (ausência do efeito)
Considerando-se que nenhum óbito foi registrado e que os efeitos observados
nos animais tratados foram brandos, pode-se afirmar que o composto é dotado de
69
baixa toxicidade quando ingerido v.o. na dose de 2000mg/kg. De acordo com este
resultado preliminar pode-se considerar o AMB promissor para estudos
subseqüentes por apresentar ausência de toxicidade significativa quando
administrado por via sistêmica.
5.2.2 Modelo de citotoxicidade induzida pela Artemia salina
A Artemia salina é um pequeno crustáceo que tem sido objeto de diversos
estudos eletrofisiológicos e de testes de toxicidade devido a sua capacidade de
formar cistos dormentes, fornecendo deste modo, material biológico que pode ser
armazenado por longos períodos de tempo (superiores a 6 meses) sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contínuas de organismos-
teste (CALOW, 1993).
O ensaio com Artemia salina é considerado uma das mais úteis ferramentas
para testes preliminares de toxicidade, sendo que este bioensaio pode mostrar boa
relação com atividade citotóxica contra vários tumores sólidos humanos e também
com a atividade pesticida (McLAUGHLIN; CHANG; SMITH, 1991; LUNA et al., 2005),
além de ser utilizado para mensurar a toxicidade de espécies reativas de oxigênio
(MATTHEWS, 1995).
No modelo de citotoxicidade, desenvolvido em Artemia salina obteve-se uma
DL50 de 71.13 (50.19 – 100) µg/mL. A Organização Mundial de Saúde preconiza que
uma substância que apresenta valores de DL50 < 1000µg/mL no teste de Artemia
salina exibe toxicidade, especificamente citotoxicidade (BRITO, 1994). Com relação
a este teste, a DL50 determinada através do teste indica que o composto em estudo
exibe efeito citotóxico.
Num primeiro momento, a diversidade de resultados obtidos nos dois modelos
parece arbitrária. Uma dose alta administrada ao camundongo não causa óbito nos
animais e uma dose muito pequena administrada a um organismo unicelular é tóxica.
Parra et al. (2001) fizeram um estudo comparativo entre os resultados de DL50
obtidos através do modelo de Artemia salina e os resultados de DL50 obtidos através
do modelo tradicional realizado com camundongos. Os autores encontraram boa
correlação entre os testes realizados in vivo e in vitro. Dos vinte extratos de plantas
analisados, mais da metade exibiu toxicidade nos dois métodos. A não correlação
observada com os outros extratos não foi abordada pelos autores (PARRA et al.
70
2001). As discussões encontradas na literatura enfatizam mais o fato de o método ter
utilidade para indicação de possíveis propriedades antitumorais, antifúngicas e
antibacterianas uma vez que o efeito observado através dele é especificamente
citotóxico (PARRA et al. 2001; PIMENTA et al. 2003; MORENO et al. 2005;
CHOHAN et al. 2006). A transposicão e correlacão da citotoxicidade e toxicidade
sistêmica observada em outros modelos é pouco comentada na maioria dos
trabalhos.
Com relação aos nossos resultados, em termos de toxicidade sistêmica, a
DL50 maior que 2000mg/kg indica que entre o efeito farmacológico antinociceptivo e
um possível efeito tóxico, a janela terapêutica (para camundongos) seria bem ampla,
refletindo uma segurança em termos de superdosagem. Por outro lado, o efeito
citotóxico detectado no modelo in vitro pode ser correlacionado com os resultados da
literatura, com relação às propriedades farmacológicas de triterpenos como o AMB
com respeito aos efeitos antitumorais e antibacterianos. Também deve ser abordado
que há consideráveis diferenças quanto a mecanismos de inibição de toxicidade
presentes em uma célula especificamente (indivíduos unicelulares como a Artemia
salina) e um sistema fisiológico muito mais elaborado, como é o caso do organismo
de um mamífero (DAS; BANERJEE; GUPTA, 1992; GITHIORI et al. 2002, 2003).
5.2.3 Modelo do campo aberto (Open Field)
Os resultados apresentados na figura 13A demonstram que o tratamento com
AMB diminui de forma estatisticamente significante o número de cruzamentos
(crossing) no modelo apresentado. No entanto, não foram encontradas alterações
significativas em relação às tentativas de levantar-se (rearing) (Figura 13B).
Considerando que, no teste de toxicidade aguda, realizado com o composto numa
dose aproximadamente 30 vezes superior, os resultados demonstraram efeitos
tóxicos mínimos e que não houve diminuição significativa na atividade locomotora
em relação à capacidade de suspender o corpo sobre as patas traseiras, o AMB
parece apresentar atividade neurobloqueadora muscular pouco significativa. Porém,
a redução do número de cruzamentos efetuados pelos animais durante o teste
sugere que outros modelos experimentais que avaliem os efeitos depressores do
sistema nervoso central podem ser úteis na verificação da real ação antinociceptiva
do AMB.
71
C 600
20
40
ControleAMB
Tratamento (mg/kg)
Núm
ero
de r
eari
ng
C 600
40
80
120
ControleAMB
**
Tratamento (mg/kg)
Núm
ero
de c
ruza
men
tos
Figura 13. Efeito do AMB (60mg/kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais “crossing” (cruzamentos) – Painel A e atividade exploratória “rearing” – Painel B, no modelo do Open Field. Cada grupo representa a media de 10 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle **p<0,01.
5.3 Determinação do mecanismo de ação da propriedade antinociceptiva do ácido mirsinóico B
Em virtude dos resultados obtidos nos modelos experimentais de analgesia, o
estudo do mecanismo de ação do AMB foi desenvolvido através da utilização de
agonistas e antagonistas das principais vias de mediação da nocicepção em estudos
“in vivo”. Para isso foi utilizado o modelo de contorções abdominais induzidas pelo
ácido acético e a dose de 60 mg/kg i.p. de AMB foi utilizada tendo em vista ter sido a
mais efetiva nos modelos anteriormente testados.
5.3.1 Participação do sistema α-adrenérgico
Os resultados obtidos na Figura 14 sugerem interação do composto na via
adrenérgica tanto com α1 quanto com α2-adrenoceptores uma vez que os
antagonistas α1 (prazosina) e α2 (ioimbina) reverteram seu efeito antinociceptivo,
além de bloquearem completamente os efeitos agonistas antinociceptivos da
fenilefrina (agonista α1-adrenérgico) e da clonidina (agonista α2-adrenérgico)
(BUTELMAN, 1998; OBATA et al. 2004).
A B
72
Figura 14. Influência do pré-tratamento de camundongos com ioimbina (0,15mg/kg i.p.) e prazosina ( 0,15 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.) ou clonidina (0,1 mg/kg i.p.) ou fenilefrina (7 mg/kg i.p.), respectivamente, no modelo de dor induzida pelo ácido acético. Cada grupo representa a media de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,**p< 0,01, #p<0,05 quando comparado com o grupo tratado somente com AMB.
A via noradrenérgica é ativada pela noradrenalina liberada das projeções
bulboespinhais para os neurônios do corno dorsal da medula espinhal (NICHOLSON
et al., 2005) e uma vez liberada, a noradrenalina modula a excitabilidade desses
neurônios através da ativação dos α1 e α2-adrenoceptores. Butelman et al. (1998)
demonstraram que a aplicação sistêmica dos agonistas α1 (fenilefrina) e α2
(clonidina) causa efeitos analgésicos em diversos modelos animais de dor e que são
antagonizados pela prazosina e ioimbina, respectivamente. Imbelloni (2001) reporta
a utilização da fenilefrina em anestesia raquidiana sugerindo aumento do efeito
analgésico, vasoconstrição no local da administração e diminuição dos efeitos
tóxicos sistêmicos do anestésico. Agonistas α2-adrenérgicos possuem efeito
potencializador da analgesia subaracnóide através da liberação de β-endorfinas,
porém acentuam o quadro hipotensivo provocado pelo anestésico local espinhal. A
clonidina aumenta a liberação de noradrenalina em resposta à estimulação neural
(UMEDA et al., 1996) e potencializa o seu efeito inibitório sobre as fibras A-δ e C,
responsáveis pela condução do estímulo doloroso (KAWASAKI et al, 2003).
Um dos mais significativos papéis dos neurônios noradrenérgicos na
modulação da dor é observado em pacientes durante a retirada do tratamento com
opióides. A interrupção abrupta da administração de opióides ou a aplicação aguda
de antagonistas opióides induzem uma série de respostas aversivas e sintomas que
0
10
20
30
40
50
60
70
VeículoPrazosinaYoimbinaFenilefrinaClonidinaAMB
+-----
-+----
--+---
+--+--
-+-+--
--++--
+---+-
-+--+-
--+-+-
+----+
-+---+
--+--+
**
**
******
**
**# #
# #
Núm
ero
de c
onto
rçõe
s ab
dom
inai
s
73
01020304050607080
*** ***
***#
VeiculoAtropinaAcetilcolinaAMB
+---
-+--
+-+-
-++-
+--+
-+-+
#
Núm
ero
de c
onto
rçõe
s ab
dom
inai
s
incluem um aumento anormal da hiperalgesia (HEISHMAN et al., 1989; McNALLY;
AKIL, 2002; RAGHAVENDRA; RUTKOWSKI, 2002). A retirada dos opióides pode
causar hiperatividade dos neurônios noradrenérgicos centrais e aumento dos níveis
de noradrenalina no cérebro. Assim, o aumento das sinapses noradrenérgicas no
Núcleo Magno da Rafe (NRM) pode mediar a hiperalgesia observada como efeito da
abstinência opióide. Bie et al. (2003) demonstraram que a administração de
antagonistas α1-adrenérgicos no NRM atenuou significativamente o estado de
hiperalgesia indicando que os adrenoceptores-α1 podem servir como alvos
potenciais para o tratamento dos problemas relacionados à abstinência opióide.
5.3.2 Participação da via colinérgica
Os resultados exibidos na Figura 15 demonstram que a atropina (antagonista
colinérgico não-seletivo) reverteu completamente os efeitos mediados pela
acetilcolina. Em relação ao AMB, houve significativa reversão do efeito
antinociceptivo mediante o pré-tratamento com o antagonista colinérgico. Isto sugere
que o efeito antinociceptivo do composto em estudo pode estar sendo mediado pela
via colinérgica considerando que existem vários estudos que demonstram a
participação desta via nos mecanismos de antinocicepção (HERZ, 1993; ABELSON;
KOMMALAGE; HOGLUND, 2004; HABERBERGER et al., 2004).
Figura 15. Influência do pré-tratamento de camundongos com atropina (1 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.) na nocicepção induzida pelo ácido acético. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,***p< 0,001 e #<0,05 difere significativamente do grupo tratado somente com o AMB.
74
A acetilcolina praticamente não tem aplicações terapêuticas por causa de sua
ação difusa e hidrólise rápida pela acetilcolinesterase sináptica e butirilcolinesterase
plasmática. Os níveis endógenos de acetilcolina podem ser mediados por diversas
substâncias envolvidas na transmissão do processo doloroso (TAGUCHI et al., 1999;
ABELSON; KOMMALAGE; HOGLUND, 2004; OBATA et al. 2004). Sua liberação é
aumentada nos neurônios do SNC a partir da ativação de receptores opióides pré-
sinápticos pela morfina, causando potencialização do efeito antinociceptivo
(TAGUCHI et al., 1999). O autor também demonstrou que a antinocicepção induzida
pela administração sistêmica de morfina pode ser antagonizada pela administração
intratecal de antagonistas muscarínicos, reforçando a idéia de sinergismo entre os
sistemas opióide e colinérgico.
O aumento dos níveis de acetilcolina intraespinhal durante a analgesia
induzida pelos antiinflamatórios não esteroidais, como a aspirina, também é
conhecido (ABELSON; KOMMALAGE; HOGLUND, 2004). Sugerindo a interação das
vias α-adrenérgica e colinérgica na modulação do processo doloroso, é reportado
que a clonidina (agonista adrenérgico) é capaz de aumentar a liberação de
acetilcolina na medula espinhal (OBATA et al. 2004). Considerando os resultados
anteriormente encontrados no teste de toxicidade aguda, os efeitos parasimpáticos
produzidos pelo AMB fundamentam a hipótese da efetiva participação da acetilcolina
neste processo de analgesia, reforçada pelo resultado obtido no teste que avaliou a
interação do sistema α-adrenégico com o composto em estudo, no qual parece haver
envolvimento dos dois receptores α.
Paradoxalmente, existem também evidências de que se pode esperar um
efeito antinociceptivo quando o sistema colinérgico é bloqueado pelo antagonista
atropina em doses muito pequenas, entre 1 e 100µg/kg, através do bloqueio seletivo
dos receptores muscarínicos pré-sinápticos, o que induz um aumento dos níveis de
acetilcolina extracelular (BANNON et al., 1998). A via colinérgica também participa
do controle exercido pela medula rostral ventrolateral (RVLM) sobre as funções
fisiológicas cardiovasculares e mecanismos antinociceptivos (TAGUCHI et al., 1999).
Os receptores colinérgicos nicotínicos possuem um importante papel na
modulação da transmissão dolorosa, promovendo efeitos antinociceptivos quando
ativados que podem ser demonstrados sobre uma variedade de espécies animais,
inclusive em humanos (MATTILA; AHTEE; SAARNIVAARA, 1968; PHAN et al., 1973;
ACETO et al., 1986; PERKINS et al., 1994; HABERBERGER et al., 2004). Apesar de
75
terem sido reportados como mais efetivos em modelos de dor induzida por estímulos
térmicos e por apresentarem consideráveis diferenças de amplitude de efeito
conforme a via de administração (CASTANE et al., 2002). Em recente estudo, foi
reportada a efetividade antinociceptiva do agonista colinérgico nicotina sobre ambas
as fases do modelo de dor induzida pela formalina, também sobre a dor induzida
pelo ácido acético, substância P e glutamato, além das citocinas IL-1β, TNF-α e INF-
γ (HAN et al., 2005).
Assim, o sistema colinérgico no SNC é considerado parte de um sistema
endógeno de controle da dor, sendo que sua ativação pode produzir antinocicepção
e analgesia em animais e em seres humanos (TAGUCHI et al., 1999).
5.3.3 Participação do sistema dopaminérgico
O efeito antinociceptivo do AMB foi testado em animais pré-tratados com
haloperidol, um antagonista dopaminérgico não-seletivo, para a verificação da
participação da via dopaminérgica na ação nociceptiva do composto. Conforme
mostrado na figura 16, o haloperidol não conseguiu reverter o efeito de
antinocicepção provocado pelo AMB, porém reverteu completamente o efeito
antinociceptivo da apomorfina (agonista dopaminérgico). Apesar desta ser uma via
importante na modulação do processo doloroso (VAN DIJKEN, et al., 1996), este
resultado elimina a possibilidade da sua participação na analgesia mediada pelo
composto em estudo.
Figura 16. Influência do pré-tratamento de camundongos com haloperidol (0,2 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p) ou apomorfina (1 mg/kg i.p.) no modelo de nocicepção induzida pelo ácido acético. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,***p< 0,001, #<0,05 difere significativamente do grupo tratado somente com o agonista (apomorfina).
76
A dopamina é uma catecolamina sintetizada nos terminais dos neurônios
dopaminérgicos a partir da tirosina. Suas ações no cérebro são mediadas por uma
família de proteínas receptoras da dopamina. As diversas ações fisiológicas da
dopamina estão mediadas por pelo menos cinco receptores (D1 - D5). Os receptores
D1 e D5 estão acoplados à proteína Gs e ativam a adenilato ciclase. Os receptores
D2, D3 e D4 inibem a adenilato ciclase e ativam certos canais de K+, o que lhes
confere características inibitórias (MISSALE et al., 1999). Os receptores
dopaminérgicos encontram-se amplamente distribuídos no SNC e estão envolvidos
nos controles da atividade motora, do comportamento emocional e em circuitos
neuroendrócrinos. Os circuitos dopaminérgicos do mesencéfalo (área tegmental
ventral, sistema mesolímbico) por sua vez, estão envolvidos no processo de adição a
certos fármacos e de substâncias como o álcool, a cocaína e os opióides (BLACK et
al., 2002) formando a chamada zona de recompensa. Mansikka et al. (2005)
demonstraram em recente estudo, que animais “knock-out” para receptor
dopaminérgico D2 apresentam maior sensibilidade à dor produzida por estímulos
mecânicos do que animais que possuem o receptor, reportando assim a participação
modulatória da dopamina no processo de nocicepção. A presença de receptores D2
em áreas do corno dorsal da medula espinhal, especialmente nas lâminas I, II e VI
também evidenciam atuação dopaminérgica no controle da dor (VAN DIJKEN et al.,
1996).
5.3.4 Participação do sistema GABAérgico
O sistema GABAérgico também foi investigado com respeito ao efeito
antinociceptivo do AMB. Na Figura 17 pode-se verificar que não houve a reversão do
efeito antinociceptivo do composto em estudo quando os animais receberam pré-
tratamento com antagonistas GABAA e GABAB (bicuculina e faclofeno,
respectivamente). No entanto, houve a completa reversão dos efeitos dos agonistas
Baclofeno e Muscimol perante o pré-tratamento com seus respectivos antagonistas,
sugerindo não haver participação deste sistema na antiocicepção produzida pelo
AMB.
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VeiculoBicuculinaFaclofenoMuscimolBaclofenoAMB
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Figura 17. Influência do pré-tratamento de camundongos com bicuculina (0,7 mg/kg i.p.) ou faclofeno (3 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.), muscimol (1 mg/kg i.p.) ou baclofeno (1 mg/kg i.p.) na nocicepção induzida pelo ácido acético. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,***p< 0,001. #p<0,05 quando comparado com o grupo pré-tratado com agonistas (bicuculina, muscimol).
O GABA é o principal neurotransmissor inibitório no SNC dos mamíferos.
Seus receptores são divididos em três tipos principais. O subtipo mais proeminente
do receptor GABA, o GABAA, é um canal de íon Cl- operado por ligante, que é aberto
após a liberação de GABA pelos neurônios pré-sinápticos. Um segundo receptor, o
receptor GABAB, é um membro da família dos receptores associados à proteína G os
quais são acoplados a vias bioquímicas e a regulação dos canais iônicos
(BONANNO; RAITERI, 1993; BOWERY, 1993). A proteína do receptor GABAA foi
muito bem caracterizada devido a sua abundância e a sua utilização por quase todos
os circuitos neuronais, além de possuir sítios de ligação para muitos agentes como o
etanol, os barbitúricos e os benzodiazepínicos (BELELLI; LAMBERT, 2006).
O receptor GABAB e seu mRNA são encontrados no corno dorsal da medula
espinhal (TOWERS et al., 2000). O GABA liberado endógenamente na medula pode
preferencialmente ativar receptor GABAB pré-sinápticos (CHERY; DE KONINCK,
2000).
A ativação dos receptores pré-sinápticos GABAB diminuem a liberação de
glutamato, principal neurotransmissor excitatório do SNC dos terminais aferentes
primários na medula espinhal (LEKAN; CARLTON, 1995).
78
Foi também reconhecido outro subtipo de receptor, o GABAC, que representa
uma forma relativamente simples do receptor GABAA. Em contraste com este, trata-
se de um receptor homoligomérico, constituído por subunidades do tipo ρ (MACKIE
et al., 2003).
Na medula espinhal neurônios contendo GABA são encontrados
predominantemente nas lâminas I e II, local da modulação inicial da informação
sensorial e nociceptiva, e também na lâmina III (MACKIE et al., 2003). As lâminas I e
II da medula espinhal recebem estímulos nociceptivos das fibras aferentes A-δ e C.
Muitos interneurônios na lâmina II são GABAérgicos, fazendo sinapses com os
neurônios aferentes primários, sugerindo assim um mecanismo de ação pré-
sináptico do GABA (HEINKE et al., 2004). Decorrente de várias evidências
fisiológicas e comportamentais observadas em roedores, acredita-se que o GABA
possui uma importante função inibitória primária na transmissão da informação
nociceptiva. Um exemplo disso é a alodinia produzida em ratos através do bloqueio
dos receptores espinhais GABAA, indicando que a liberação do GABA é necessária
para a manutenção de respostas somatosensoriais normais (HEINKE et al., 2004).
Compostos analgésicos estão sendo desenvolvidos com alvos nos receptores
GABAA e GABAB e enzimas GABAassociadas. Alguns análogos do GABA agem pela
inibição de canais iônicos, uma propriedade que contribui para os efeitos
analgésicos, porém pouco usados por causa dos efeitos adversos (JASMIN, 2004).
Os receptores GABAA são o alvo molecular dos fármacos benzodiazepínicos,
potentes depressores do SNC, além de drogas com efeito anestésico e do etanol
(HEINKE et al., 2004). Recentemente, Belelli e Lambert (2005) descreveram
interessante alteração na sensibilidade dos receptores GABAA frente a esteróides
endógenos no SNC de mulheres grávidas no dia anterior à parturição. Esses
receptores apresentam sensibilidade normalizada em até 24 horas após o parto.
Agonistas GABAB, como o baclofeno, e agonistas GABAA, como o topiramato,
também estão sendo utilizados na profilaxia da enxaqueca além de drogas análogas
do GABA, como a gabapentina e a pregabalina, que demonstram bons resultados no
tratamanto de dor neuropática diminuindo a liberação de neurotransmisores como o
glutamato (ROGAWSKI, 2006).
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Falso-operadosOperados
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VeiculoAMB
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5.3.5 Participação do sistema glicocorticóide
Os resultados apresentados na Figura 18 demonstraram que a
adrenalectomia bilateral dos animais causou uma reversão estatisticamente
significativa da antinocicepção induzida pelo AMB quando os animais foram testados
no modelo do acido acético. Estes dados sugerem que os hormônios secretados
pelas glândulas supra-renais participam da ação antinociceptiva do AMB, indicando
que a ativação do eixo Hipófise-Pituitária-Adrenal (HPA) parece ser importante na
antinocicepção produzida pelo AMB.
Figura 18. Influência da adrenalectomia bilateral em camundongos sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p.) na nocicepção induzida pelo ácido acético. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. **p< 0,01, ***p< 0,001 difere estatísticamente do veículo. # p< 0,05 difere estatísticamente do grupo falso operado.
Muitos estudos demonstraram que o eixo HPA está envolvido no controle da
dor e da inflamação (AASBOE; GROGAARD; ROADER, 1998; MILLAN, 1999;
DOWLING, 2001). Flower et al. (1986) observaram que a resposta inflamatória
induzida pela carragenina é reduzida em ratos adrenalectomizados, em relação aos
“falso-operados”, quando comparadas exsudação e migração celular, além dos
eicosanóides, tromboxanos e leucotrienos produzidos pela ativação das fosfolipases
nos exsudatos inflamatórios também diminuirem significativamente.
O principal glicocorticóide nos mamíferos é o cortisol, formado a partir do
colesterol. O cortisol é um hormônio fundamental na resposta ao estresse e possui
atividade metabólica e antiinflamatória, mantém a integridade cardiovascular e a
contratilidade cardíaca (FERNÁNDEZ, 2002). Os glicocorticóides diminuem a
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VeiculoL-argininaD-argininaL-NOARGAMB
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migração leucocitária até os tecidos inflamados e o número de linfócitos na
circulação periférica, deprimem a ativação linfocítica reduzindo sua participação na
inflamação. Além disso, inibem a produção e a ação de citocina pró-inflamatória
como a interleucina (IL-1, IL-2), interferon (IFN-α) e o fator de necrose tumoral (TNF).
Sua ação é devida a inibição da fosfolipase A2 limitando a produção de ácido
araquidônico, que é precursor das prostaglandinas (substâncias que agem
diminuindo o limiar nociceptivo) e dos leucotrienos (que causam hiperalgesia)
(FERNÁNDEZ ; POVEDANO; GARCÍA LÓPEZ, 1998)
Em pacientes portadores de câncer, os corticóides podem melhorar as
propriedades analgésicas de outras substâncias. Costumam possuir um lugar nos
tratamentos quimioterápicos em associação com agentes antineoplásicos por sua
atividade antiinflamatória. Também diminuem a percepção da dor e melhoram a
eficácia dos opióides (LAMONT; TRANQUILLI; MATHEWS, 2000).
5.3.6 Participação da via L-arginina-óxido nítrico
Os resultados apresentados na figura 19 demonstram a participação da via
oxidonitrérgica na antinocicepção causada pelo AMB através da reversão do seu
efeito antinociceptivo causado pela L-arginina. O efeito da L-NOARG foi também
revertido pela L-arginina.
Figura 19. Influência do pré-tratamento de camundongos com L-arginina (600 mg/kg i.p.) ou D-arginina (600 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo ABP (60 mg/kg i.p.) ou L-NOARG (75 mg/kg i.p.) na nocicepção induzida pelo ácido acético. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,***p< 0,001 e #p<0,05 difere significativamente do grupo tratado com L-NOARG.
81
O óxido nítrico (NO) é sintetizado a partir da L-arginina pela NO sintetase
(NOS). Existem pelo menos três isoformas da NOS (BREDT; SNYDER, 1994). Uma
delas parece ser responsável pela liberação neuronal de NP, dependente de Ca2+
(MONCADA; HIGGS, 1991). O NO foi reconhecido como importante regulador da
mediação vascular e inflamatória por mais de uma década, e últimamente tem sido
estudado o seu papel no SNC (DAWSON; SNYDER, 1994) em vários processos
biológicos e doenças neurológicas e neurodegenerativas tais como a depressão,
ansiedade, Alzheimer, Parkinson e a Esquizofrenia (DUNCAN; HEALES, 2005). A
disponibilidade de potentes ativadores (como nitroprussiato) e inibidores (como metil-
arginina e nitroarginina) de óxido nítrico-sintetase lançaram luz sobre a participação
do óxido nítrico em fenômenos cerebrais incluindo a ativação de adenilato ciclase,
liberação e recaptação de neurotransmissor e aumento da neurotoxicidade mediada
pelo glutamato via receptores NMDA (TUTEJA et al., 2004).
A injeção subcutânea de NO em humanos induz sensação dolorosa
(IGNARRO, 2002). Em contraste, experimentos em animais tem sugerido que a
geração de NO e subseqüente aumento dos níveis de GMPc estão envolvidos nos
mecanismos de antinocicepção periférica, principalmente em tecidos inflamados
(TORIYABE et al., 2004). Também é sugerida uma interação de NO e PG na qual a
produção de PGE2 é aumentada (NUSSLER; BILLIAR, 1993). A inibição da
produção de NO por inibidores da NOS parece diminuir a produção de PGE2 em
modelos in vitro e in vivo. Este efeito parece ser mediado pela habilidade do NO em
induzir a enzima COX, por um mecanismo ainda não bem definido (GELLER et al.,
1993). Na inflamação, a relação funcional entre o NO e a COX sugere que o NO
exacerba o processo inflamatório através da geração da produção adicional de PGs
(TUTEJA, et al., 2004).).
A formação de NO em resposta a ativação dos receptores NMDA justifica a
hipótese de que o NO pode também atuar como um mediador dos efeitos
nociceptivos induzidos pelo glutamato (BJORKMAN, 1995; GARTHWAITE, 1991;
FURST, 1995).
5.3.7 Participação do sistema opióide
Um dos sistemas mais estudados quando pesquisa-se o efeito nociceptivo
e/ou analgésico de fármacos é a via opióide. Continua a ser um dos principais
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objetivos para quem estuda a dor chegar a um fármaco com as propriedades
terapêuticas do grupo, porém sem os seus efeitos colaterais, principalmente aqueles
observados no uso da droga em processos dolorosos crônicos, ou seja, a
dependência e a tolerância. Nos resultados mostrados na Figura 20 podemos
verificar que o antagonista opióide não seletivo, a naloxona foi capaz de reverter
completamente o efeito antinociceptivo da morfina, porém não houve reversão do
efeito antinociceptivo do AMB, indicando em parte não haver participação do sistema
opióide sobre a antinocicepção causada pelo composto em estudo.
Figura 20. Influência do pré-tratamento de camundongos com naloxona (1 mg/kg i.p.) sobre o efeito antinociceptivo causado pelo AMB (60 mg/kg i.p) ou morfina (5 mg/kg s.c) no modelo de nocicepção induzida pelo ácido acético. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,***p< 0,001, #p<0,05 difere significativamente do grupo tratado somente com o agonista (morfina).
Este achado, num primeiro momento, parece contradizer o resultado
demonstrado no teste da placa quente, utilizado no estudo de drogas como os
opióides (WALKER; FOX; URBAN, 1999), no qual o AMB foi efetivo no aumento do
limiar nociceptivo. Porém estudos indicam que os receptores VR1 são ativados
mediante temperaturas superiores a 43◦C (ZIEGLGANSBERGER; BERTHELE;
TOLLE, 2005) e que, a partir de sua ativação ocorre a abertura de canais de Na+
voltagem-dependente, disparando potenciais de ação que induzem a transmissão
sensorial (PREMKUMAR, 2001). Uma hipótese para explicar o observado é a de
que o AMB possa agir antagonizando o receptor VR1, não exercendo efeito direto
sobre os receptores opióides.
Os opiáceos são drogas derivadas do ópio e incluem a morfina, a codeína e
uma ampla variedade de congêneres semi-sintéticos derivados deles e da tebaína,
83
outro componente do ópio. O termo opióide é mais abrangente , aplicado a todos os
agonistas e antagonistas com atividade morfino-símile, bem como aos peptídeos
opióides naturais e sintéticos (FILIZOLA; VILLAR; LOEW, 2001).
Os ligantes opióides possuem uma variedade de atividades fisiológicas e têm
sido extensivamente utilizados na medicina, predominantemente no tratamento da
dor, Entretanto, mesmo em doses terapêuticas, os agonistas totais ou parciais dos
receptores opióides podem induzir diversos efeitos adversos como depressão
respiratória e o desenvolvimento de tolerância e dependência (GHARAGOZLOU et
al., 2003).
Segundo Chen (1993) há vários tipos de receptores opióides, porém três são
os mais conhecidos: µ, δ e κ, todos pertencentes à família de receptores acoplados à
proteína G. Esses receptores têm sido rebatizados com as seguintes siglas: PO1 (δ),
OP2 (κ) e OP3 (µ) (STEFANO et al., 2005). A ativação desses receptores produz
diminuição nos níveis de AMPc, aumento da condutividade do K+, diminuição da
condutividade do Ca2+e inibição da liberação de neurotransmissores. O principal
efeito da ativação dos receptores opióides pela ligação de drogas agonistas nas
lâminas II e V do corno dorsal da medula é a diminuição da liberação dos
neurotransmissores excitatórios (acetilcolina e substância P). A ocupação dos
receptores opióides por um agonista determina alterações na bioquímica intracelular
do neurônio, levando a uma hiperpolarização da membrana com aumento da
condutância ao potássio e a inativação dos canais de cálcio, determinando a
diminuição dos neutransmissores excitatórios (IMBELLONI, 2001).
Os ligantes endógenos dos receptores opióides periféricos são a endorfina, as
encefalinas e dinorfinas, que se encontram em células relacionadas à imunidade,
como linfócitos B e T, monócitos e macrófagos. Esses peptídeos opióides localmente
produzidos e liberados podem ocupar os receptores nas terminações nervosas,
produzindo analgesia, também parecem exercer efeitos positivos sobre a
homeostase (CAVALCANTI; MADDALENA, 2003; STEFANO et al., 2005).
Apesar dos opióides endógenos não possuírem especificidade pelos
diferentes tipos de receptores, apresentam graus distintos de afinidade para cada um
deles, o que lhes confere certa seletividade. Assim, as encefalinas apresentam maior
afinidade pelos receptores μ, a dinorfina pelos receptores κ e as β-encefalinas pelos
receptores μ e δ (STEFANO et al., 2005).
84
As ações antinocicepticas dos agonistas opióides são exercidas tanto no
corno dorsal da medula quanto no tronco encefálico. Na medula espinhal esses
peptídeos inibem a liberação de taquicininas e glutamato nos terminais centrais de
aferentes nociceptivos primários, enquanto que no tronco encefálico estimulam as
vias descendentes nociceptivas (noradrenérgicas e serotoninérgicas) na substância
cinzenta periaquedutal, pela inibição de neurônios GABAérgicos inibitórios (ZAKI;
BILSKY, 1996).
Dentro do grupo de drogas que exercem seu efeitos por interação com
receptores opióides existem os chamados agonistas puros, como a morfina e o
fentanil, os agonistas-antagonistas, como a buprenorfina, o butorfanol e a nalbufina
e, por último, os antagonistas puros, como a naloxona (IMBELLONI, 2001).
A morfina, protótipo das drogas opióides, é um agonista µ puro com moderada
ação sobre os receptores κ e δ. O seu uso crônico pode ser acompanhado de vários
efeitos adversos, entre eles, náuseas, vômitos, retenção urinária, miose. Essas
manifestações se relacionam com um aumento da atividade catecolaminérgica
central e são reduzidas quando seu uso é associado com antagonistas
dopaminérgicos e agonistas α2-pré-sinápticos. Já a naloxona é um potente
antagonista µ, δ e κ. É utilizada principalmente para reverter o efeito tanto de
agonista puros quanto de agonistas-antagonistas (BARNHART; HUBBEL; MUIR,
2000).
Por outro lado, evidências clínicas sugerem que os opióides aumentam a
suceptibilidade do organismo à uma série de infecções porque parecem diminuir a
atividade de células fagocitárias e a capacidade de proliferação dos linfócitos na
circulação periférica (TAUB et al., 1991).
5.3.8 Participação do sistema serotoninérgico
Finalmente os efeitos antinociceptivos do AMB foram investigados através do
sistema serotoninérgico. Os resultados mostrados na Figura 21A demonstram que o
tratamento com PCPA (inibidor da síntese serotoninérgica) reverteu o efeito
antinociceptivo do AMB em relação à dor causada pelo ácido acético, enquanto que
a Figura 21B demonstra que o efeito antinociceptivo do AMB não foi revertido pelo
pré-tratamento com os antagonistas serotoninérgicos ondansentron e cetaserina. Os
resultados indicam que a modulação da dor causada pelo AMB pode estar sendo
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mediada em parte pela indução da liberação de serotonina, porém não parece haver
participação dos receptores serotoninérgicos 5-HT3 e 5-HT2a neste processo de
analgesia.
Figura 21. Influência do pré-tratamento de camundongos com PCPA (100 mg/kg i.p.) – Painel A , e do pré-tratamento com ondasetron (0,5 mg/kg i.p.) e cetanserina (1 mg/kg i.p.) – Painel B, sobre o efeito antinociceptivo causado pelo ABP (60 mg/kg i.p.), na nocicepção induzida pelo ácido acético. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,**p< 0,01 e #p<0,05 difere do grupo tratado somente com AMB.
Segundo Millan (1999), a 5-HT pode exercer tanto ações antinociceptivas
quanto nociceptivas, dependendo do tipo de receptor ativado.
No SNC a 5-HT está associada com o processamento e a modulação da dor.
Sua ação analgésica se dá quando liberada no corno dorsal da medula espinhal por
estimulação da PAG (substância cinzenta periaquedutal), através da excitação dos
interneurônios inibitórios resultando na inibição dos neurônios do corno dorsal
(SOMMER, 2004). A ação periférica da 5-HT é distinta das ações centrais. Na
periferia a 5-HT é considerada um mediador inflamatório e é liberada por plaquetas e
mastócitos. Seus níveis periféricos aumentam após a injúria de um nervo e em
pacientes com alodinia. É sabido que a inibição da transmissão dolorosa pela 5-HT
A
B
86
no corno dorsal da medula é mediada pelos receptores 5-HT2, embora o efeito
dominante seja atribuído aos receptores 5-HT1 (SAWINOK; REID, 1996).
Outro receptor serotoninérgico envolvido no processamento da dor, é o 5-HT3.
No SNC, o 5-HT3 está localizado principalmente na área postrema, nucleus
accumbens, amigdala, hipocampo e nos gânglios do corno dorsal, modulando a
liberação de neurotransmissores e neuropeptideos como a dopamina, acetilcolina,
GABA e a substância P. Os terminais periféricos de fibras C e Aδ expressam
receptores ionotrópicos 5-HT3, cuja ativação medeia uma despolarização rápida
desses neurônios (FABER et al., 2004).
Em ratos, a injeção intradérmica de serotonina produz hiperalgesia dose-
dependente com um curto período de latência, o que indica um efeito direto sobre os
neurônios aferentes primários (TAIWO; LEVINE, 1992). Outro estudo demonstrou
que a fase de hiperalgesia é prolongada em ratos que receberam injeção intraplantar
de carragenina e foram posteriormente tratados com 5-HT (ALEY et al., 2000). Já em
humanos, a injeção intramuscular de até 20nmol de 5-HT não produz dor ou
hiperalgesia, porém provoca um aumento nos níveis de bradicinina (BABENKO et al,
2000). Doses maiores (30mmol) induzem hiperalgesia que parece ser revertida pela
administração de antagonistas 5-HT3 (ERNBERG; LUNDEBERGER; KOPP, 2000).
Antagonistas seletivos da 5-HT3 como o ondasentron, estão sendo utilizados
na clínica para a prevenção da náusea aguda e vômitos em pacientes submetidos a
tratamentos com agentes quimioterápicos e na redução da dor crônica em pacientes
com diagnóstico de fibromialgia por estarem envolvidos no processo de percepção e
processamento da dor bem como da inflamação (HAUS et al., 2004; RIERING;
REWERTS; ZIEGLGANSBERGER, 2004). A aplicação tópica de ondasetron também
parece capaz de inibir a dor e a hiperalgesia provocadas pela capsaicina
(GIORDANO; DALEO; SACKS, 1998).
A sumatriptana, um agonista 5-HT1B/D, reduz a hiperalgesia térmica induzida
pela carragenina em ratos, além de prevenir a hiperemia induzida pela capsaicina
(ZOCHODNE; HO, 1994). O pré-tratamento, porém não o pós-tratamento, com o
antagonista cetanserina reduz a resposta dolorosa em ratos tratados com formalina,
indicando uma sensibilização periférica induzida pela 5-HT (ABBOTT; HONG;
BLIER, 1997).
Era esperado que os SSRI (Inibidores Seletivos da Recaptação de
Serotonina) mediassem de forma muito significativa a analgesia central, porém o que
87
se observa é que os antidepressivos tricílicos (ATC), compostos que inibem a
recaptação neuronal não-seletiva de serotonina e noradrenalina, reportam melhores
efeitos analgésicos (SOMMER, 2004). É sugerido que tal efeito possa se processar
pela interação com o sistema opióide endógeno, uma vez que os ATCs
potencializam a resposta antinociceptiva induzida por agonistas opióides
(VALVERDE et al., 1994).
Em síntese, os resultados apresentados ao longo deste trabalho indicam que
o Ácido Mirsinóico B apresenta importante efeito antinociceptivo nos modelos de
nocicepção química induzida pelo ácido acético, formalina, capsaicina e glutamato,
na nocicepção térmica e na hiperalgesia induzida pela capsaicina, carragenina,
adrenalina e bradicinina, não sendo efetivo na reversão da hiperalgesia induzida pela
substância P. Além disso, o AMB foi efetivo quando administrado tanto i.p. quanto
v.o. Dados interessantes foram encontrados quando foi estudada a ação tóxica do
composto que parece ser bem tolerado pelo organismo, com poucos efeitos tóxicos
mesmo em altas doses.
Porém, apesar da boa tolerabilidade, apresenta citotoxicidade quanto testado
em organismos unicelulares.
Nossos resultados também demonstram que a antinocicepção causada pelo
AMB pode ser mediada por diversos sistemas que participam do processo de
nocicepção. O composto parece interagir com os receptores α-1 e α-2 do sistema α-
adrenérgico, além dos sistemas colinérgico, oxidonitrérgico e com o eixo HPA. Seu
efeito também parece ser mediado pelo sistema serotoninérgico devido à indução da
produção de serotonina, não havendo participação dos receptores serotoninérgicos
5-HT2a e 5-HT3, que foram aqui estudados. O AMB pode também estar interagindo
com receptores vanilóides, responsáveis pela nocicepção térmica. Esta ampla
interação do AMB com as vias modulatórias do processo doloroso e a ausência de
efeitos tóxicos significativos indicam que o composto em questão possui um enorme
potencial terapêutico, podendo, futuramente apresentar-se como medicamento a ser
utilizado na farmacoterapia da dor.
A figura 22 abaixo mostra as vias estudadas no presente trabalho,
apresentando um esquema no qual estão demosntrados os possíveis sistemas
envolvidos no efeito do AMB sobre o processo doloroso.
88
dor Estímulo nociceptivo
Ativação das fibras C
Excitação e transmissão neuronal
GABA
Opióides
Formação de NO
Bradicinina e Prostaglandinas
Inflamação
NGFNeuropeptídeos(SP, CGRP)
AcetilcolinaNoradrenalinaSerotonina
Dopamina
Glicocorticóides
Modulação negativaModulação positiva
XXX
+
+++++
+ Via envolvida no efeito do AMB sobre o processo doloroso
X Via envolvida no efeito do AMB sobre o processo doloroso
Figura 22. Possíveis vias envolvidas no efeito do AMB sobre o processo doloroso.
89
6 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos mostram que o Ácido Mirsinóico B possui importante
efeito antinociceptivo tanto em relação à dor induzida quimicamente através do ácido
acético, glutamato, capsaicina e formalina, quanto à dor induzida por estímulos
térmicos. O AMB demonstrou prolongada ação quando administrado tanto pela via
intraperitoneal quanto pela administração oral.
Outro achado importante em relação ao composto foi sua efetividade em
reverter processos hiperalgésicos, o que sugere ação sobre a dor neuropática.
A antinocicepção produzida pelo AMB envolve o sistema adrenérgico, através
dos receptores α1 e α2, o sistema colinérgico, o sistema glicocorticóide, o sitema
oxidonitrérgico e, parcialmente, o sistema serotoninérgico, porém os sistemas
dopaminérgico, gabaérgico e opióide não parecem estar envolvidos em sua ação.
O composto apresenta poucos efeitos tóxicos, sendo bem tolerado quando
testado em camundongos, mas é citotóxico para organismos unicelulares.
Assim, os resultados do presente trabalho indicam que o Ácido Mirsinóico B
apresenta importante efeito antinociceptivo evidenciado em diversos modelos
experimentais de dor, o que torna este composto e seus análogos atraentes para o
estudo e desenvolvimento de fármacos analgésicos.
90
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