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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
AUMENTO DE LA CAPACIDAD TRIPANOCIDA DE NIFURTIMOX Y BENZNIDAZOL A TRAVÉS DE LA INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE
PROSTAGLANDINAS
Tesis entregada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología por:
RODRIGO ANDRÉS LÓPEZ MUÑOZ
Directores de Tesis
Dr. Juan Diego Maya Arango Dr. Antonio Morello Casté
Santiago, Chile
2010
A Karin, que con amor ha
soportado férreamente los malos
ratos, la distancia y el aislamiento
que a menudo produce este oficio
A mis padres y hermanos, por
su apoyo incondicional
ii
“GRACIAS, GRACIAS, QUIERO AGRADECER A QUIEN CORRESPONDA…
Al Dr. Juan Diego Maya, con quien he recorrido codo a codo este camino de aciertos y errores, celebrando logros y “tratando” de explicar fracasos. Gracias por brindar la orientación necesaria para poder llegar a puerto, y ser un pilar fundamental en mi formación académica.
Al Dr. Antonio Morello, maestro en todo el sentido de la palabra, cuyos consejos académicos y personales siempre aportan al crecimiento de sus estudiantes. Los años transcurridos en su laboratorio han sido los más importantes en mi formación académica y personal, por lo que solo debo agradecer.
Al Dr. Jorge Ferreira, no sólo por su invaluable aporte académico, también por su apoyo personal, con las cuotas de humor que a veces se requieren para hacer este trabajo más llevadero.
A la Dra. Ulrike Kemmerling, por su amistad, aportes científicos y conversaciones que han enriquecido este trabajo en todo sentido.
A la Dra. Yolanda Repetto, que si bien ya está retirada de la actividad del laboratorio, fue un aporte importantísimo en mis primeros años de tesis y sigue siendo un apoyo inmenso cada vez que nos encontramos.
A los académicos miembros de la comisión de esta tesis. Por la revisión crítica de este trabajo y por los aportes y consejos científicos hechos durante todo este periodo de tesis.
Los caminos de la ciencia son insondables, y jamás pensé en encontrar un amigo como el Dr. Mario Faúndez. Mario, mil gracias por tus aportes, que más de una vez me sacaron de las penumbras. Pero por sobre todo por la amistad que hemos logrado forjar durante estos años. Si realmente uno pudiera hablar de la “familia de la ciencia”, tu rango sería el de hermano mayor. Y algo parecido a un hermano también ha sido el Dr. Gonzalo Cabrera, quien, con filias y fobias, ha sido el compañero de ruta más crítico con los errores y (a veces) efusivo con los logros. Y qué decir de la Dra. Galia Ramirez!, la mejor amiga que el mundo de la ciencia pudo haberme dado y de quien sólo tengo elogios para describirla como persona. Simplemente gracias.
iii
La vida en el laboratorio permite la interacción con gente que hace que el trabajo sea llevadero y agradable, es en ese sentido que quiero agradecer sinceramente a los profesores Mario Pavani, Myriam Orellana y Americo López, además de la Sra. Mary Aranguren, quienes han sido una compañía importantísima en mis labores en el laboratorio y más de una vez me brindaron consejos que se ven plasmados directa o indirectamente en este trabajo.
No menos importante es la vida estudiantil del laboratorio, y por eso agradezco a Fabián, Alfredo, José, Michel, Daniela, David, Félix, Andrea y todos aquellos quienes han pasado por el laboratorio, no sólo por ser personas que han generado un excelente ambiente de trabajo, sino porque realmente han sido un aporte a esta tesis, con conversaciones, bromas, almuerzos, café y cigarrillos, con discusiones científicas y visiones parciales que en su conjunto han ayudado a armar este puzle que comencé hace cuatro años.
Sin embargo debo destacar a tres personas que fueron importantísimas para este logro: Sebastián Klein, Sebastián Escanilla y Dasfne Lee, quienes fueron parte fundamental de esta tesis, aportando ideas, técnicas, formas de análisis, interpretaciones, subiendo y cayendo conmigo, combatiendo en la misma trinchera por más de un año. Mi logro es el suyo y espero que no sólo el camino de la ciencia nos siga encontrando.
Quiero agradecer también la labor constante de los Sres. Enrique Moraga y Juan Rivas, por el apoyo técnico sin el cual el laboratorio no sería capaz de funcionar. Además de ser grandes amigos que siempre brindan una risa y una broma que hace más liviano el pasar científico.
Los aportes científicos no siempre se reflejan en un gráfico, por eso debo agradecer al Dr. Rafael Radi, de la Universidad de la República, en Montevideo, Uruguay. La estadía en su laboratorio me permitió conocer a excelentes científicos como los Dres. Gonzalo Pellufo, María Noel Álvarez y Lucía Piacenza, todos ellos me dieron una visión sobre la investigación que me enriqueció profundamente en lo científico y personal. También
iv
quiero agradecer a Verónica, Adrián, Pablo y Lucía, amigos que hicieron la estadía en MVD una experiencia única. Por los mates, los asados y la grapamiel!
Uno es resultado de sus circunstancias, por eso mi familia siempre ha sido la plataforma sobre la cual he podido despegar para alcanzar mis logros, mis padres, María Eliana y Gaspar, mis hermanos Eduardo y Mario. Quienes SIEMPRE me han apoyado y se han enorgullecido de lo que he alcanzado. Este grado académico es para ellos también.
Un agradecimiento especial quiero hacer a mi hermano Fermín González, con quien casualmente nos encontramos al comienzo de esta ruta, con muchos años de diferencia, pero un origen común. Ahora podemos decir: “The circle is complete”.
Finalmente el agradecimiento más importante, ya que lejos, pero lejos el principal apoyo de este trabajo es mi amor, Karin Colpo Roig, quien ha sido absolutamente incondicional durante todo este tiempo y ha sufrido, reído y celebrado todos y cada uno de los sucesos que han acompañado nuestra vida durante estos cinco años de doctorado. De una manera extraña el destino nos juntó, pero como buen científico puedo comprobar que este amor no es derribable por terremotos ni volcanes. Gracias por siempre, esto te lo debo principalmente a ti. . .
…Y A NOSOTROS DOS EL PREMIO A LA AUDACIA, POR ENTRAR AL MAR POR LA PARTE MÁS HONDA”
v
Esta tesis ha sido financiada por los proyectos FONDECYT 1090070 y ACT112
Durante esta tesis se contó con el financiamiento de la Beca de postgrado otorgada por CONICYT
vi
PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES A CONGRESOS ORIGINADAS DE ESTA TESIS
PUBLICACIONES:
• Trypanosoma cruzi: In vitro effect of aspirin with nifurtimox and
benznidazolee. López-Muñoz R., Faúndez M., Klein S., Escanilla S., Torres G., Lee-Liu D.,
Ferreira J., Kemmerling U., Orellana M., Morello A., Ferreira A. and Maya JD. Exp Parasitol.
2010. Feb; 124: 167–171
PRESENTACIONES A CONGRESOS NACIONALES:
• XXXI Congreso anual de la sociedad de Farmacología de Chile. Concepción,
Chile. Octubre 2009. “Efecto sinérgico in vitro de aspirina con nifurtimox y
benznidazol contra Trypanosoma cruzi”. López-Muñoz R., Faúndez M., Klein S.,
Escanilla S., Lee-Liu D., Ferreira J., Kemmerling U., Orellana M., Morello A., Maya JD.
• I Congreso chileno de parasitología. Antofagasta, Chile. 10-11 Enero 2008.
“Potenciación de Drogas Antichagásicas, nifurtimox y benznidazol”. Morello A.,
Faúndez M., Maya JD., López-Muñoz R., Kemmerling U, Orellana M, Ferreira J.
• XXIX Congreso anual de la sociedad de Farmacología de Chile. Iquique, Chile.
Septiembre 2007. “Modulación de la respuesta del hospedero ante la infección por
Trypanosoma cruzi con inhibición de ciclooxigenasa”. Maya JD., Faúndez M., Torres
G., Kemmerling U., Sepúlveda A., Morello A., Orellana M., López-Muñoz R.
vii
• XXIX Congreso anual de la sociedad de Farmacología de Chile. Iquique, Chile.
Septiembre 2007. “Efecto de Aspirina sobre macrófagos infectados con
Trypanosoma cruzi y tratados con nifurtimox”. López-Muñoz R., Orellana M.,
Sepúlveda A., Kemmerling U., Morello A., Maya JD.
• XLIX Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Chile, Pucón, 22 al 25 de
Noviembre del 2006. “Trypanosoma cruzi: PCR real-time como herramienta para
medir infección y efecto tripanocida de drogas en cultivos infectados”. López-
Muñoz R., Sepúlveda A., Faúndez M., Torres G., Kemmerling U., Morello A. y Maya JD.
• XXVIII Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile, Olmué, 20 al
22 de Agosto del 2006. “Evaluación de índice endocítico a través de real-time PCR
en macrófagos infectados con Trypanosoma cruzi”. López-Muñoz R., Sepúlveda A.,
Faúndez M., Torres G., Kemmerling U. y Morello A.
PRESENTACIONES A CONGRESOS INTERNACIONALES:
• XIX Congreso latinoamericano de Parasitología, Asusnción, Paraguay, 22 al 24
de Octubre, 2009. Aspirina mejora la capacidad antiparasitaria de macrófagos
infectados con T. cruzi. López-Muñoz R., Faúndez M., Klein S., Escanilla S., Torres G.,
Lee D., Ferreira J., Kemmerling U., Orellana M., Morello A., Ferreira A., Maya JD.
viii
• XVIII Congreso Latinoamericano de Farmacología, III Congreso Iberoamericano
de Farmacología, XXX Reunión Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile
y XXIII Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Ciencias Fisiológicas.
Coquimbo, Chile, 12 al 16 de Octubre 2008. “Efecto sinérgico entre aspirina y
drogas anti T. cruzi en un modelo in vitro de la enfermedad de Chagas”. López-
Muñoz R.; Klein S., Escanilla S., Morello A. y Maya JD. Revista de Farmacología de
Chile Vol. 1 Nº 1, Libro de resúmenes pág. 175.
ix
ÍNDICE
RESUMEN .................................................................................................................................. XIII
SUMMARY .................................................................................................................................. XV
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
ANTECEDENTES HISTÓRICOS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS 1
EPIDEMIOLOGÍA 2
CICLO BIOLÓGICO DEL T. CRUZI 4
ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS 5
INFECCIÓN PRIMARIA DEL T. CRUZI Y RESPUESTA DEL HOSPEDERO 8
PAPEL DEL ÓXIDO NÍTRICO EN LA INFECCIÓN POR T. CRUZI 10
ROL DE PROSTAGLANDINAS EN LA INVASIÓN DEL T. CRUZI 15
TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS 19
HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 27
OBJETIVO GENERAL .................................................................................................................. 27
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................................... 28
MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................................... 29
CULTIVOS DE CÉLULAS Y MODELO IN VITRO DE INFECCIÓN POR T. CRUZI. 29
TRIPOMASTIGOTES DE TRYPANOSOMA CRUZI. 29
DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE CÉLULAS INFECTADAS. 29
VIABILIDAD CELULAR. 30
DETERMINACIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO. 31
LIBERACIÓN DE TRIPOMASTIGOTES AL MEDIO DE CULTIVO. 31
DETERMINACIÓN DE PROSTAGLANDINA E2. 32
DETERMINACIÓN DE POLIAMINAS. 33
x
REACTIVOS Y MATERIALES. 34
ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 35
RESULTADOS ............................................................................................................................. 36
ÁCIDO ACETILSALICÍLICO DISMINUYE LA TASA DE INFECCIÓN EN MACRÓFAGOS RAW 264.7 INFECTADOS CON T.
CRUZI. 36
ÁCIDO ACETILSALICÍLICO DISMINUYE LA LIBERACIÓN DE TRIPOMASTIGOTES AL MEDIO DE CULTIVO. SINERGISMO
ENTRE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO Y NIFURTIMOX O BENZNIDAZOL. 38
ÁCIDO ACETILSALICÍLICO NO AFECTA LA VIABILIDAD DE CÉLULAS RAW NI TRIPOMASTIGOTES DE T. CRUZI. 46
ÁCIDO ACETILSALICÍLICO NO AFECTA LA VIABILIDAD DE TRIPOMASTIGOTES DE T. CRUZI. 48
RELACIÓN ENTRE EL EFECTO DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO Y LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINAS 50
ÁCIDO ACETILSALICÍLICO AUMENTA LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO EN CÉLULAS RAW INFECTADAS CON T.
CRUZI. PARTICIPACIÓN DEL ÓXIDO NÍTRICO EN EL EFECTO DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO. 54
ÁCIDO ACETILSALICÍLICO NO AFECTA LOS NIVELES DE POLIAMINAS EN MACRÓFAGOS INFECTADOS CON T. CRUZI. 60
DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 63
CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 71
REFERENCIAS ............................................................................................................................. 72
xi
INDICE DE FIGURAS Y TABLAS
FIGURA 1. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS. .......................................................................................... 3
FIGURA 2. CICLO BIOLÓGICO DEL TRYPANOSOMA CRUZI...................................................................................................................... 7
FIGURA 3. METABOLISMO DE LA L-ARGININA EN T. CRUZI Y EL HOSPEDERO MAMÍFERO. ................................................................ 17
FIGURA 4. ACTIVACIÓN DE MACRÓFAGOS EN LA INFECCIÓN POR T. CRUZI. ..................................................................................... 21
FIGURA 5. MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS DROGAS ANTICHAGÁSICAS NIFURTIMOX Y BENZNIDAZOL. ......................................... 24
FIGURA 6. MODELO TEÓRICO DEL EFECTO COMBINADO DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO Y DROGAS ANTICHAGÁSICAS. .................... 26
FIGURA 7. ÁCIDO ACETILSALICÍLICO DISMINUYE EL PORCENTAJE DE INFECCCIÓN CÉLULAS RAW 264.7 INFECTADAS CON T.
CRUZI. ....................................................................................................................................................................................... 37
FIGURA 8. EFECTO DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO, NIFURTIMOX Y SU COMBINACIÓN SOBRE LA LIBERACIÓN DE TRIPOMASTIGOTES AL
MEDIO DE CULTIVO. ................................................................................................................................................................. 42
FIGURA 9. EFECTO DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO, BENZNIDAZOL Y SU COMBINACIÓN SOBRE LA LIBERACIÓN DE TRIPOMASTIGOTES
AL MEDIO DE CULTIVO.............................................................................................................................................................. 43
FIGURA 10. ÁCIDO ACETILSALICÍLICO PRESENTA EFECTO SINÉRGICO AL SER COMBINADO CON NIFURTIMOX O BENZNIDAZOL.
ANÁLISIS ISOBOLOGRÁFICO. .................................................................................................................................................... 44
TABLA 1. ÁCIDO ACETILSALICÍLICO PRESENTA EFECTO SINÉRGICO AL SER COMBINADO CON NIFURTIMOX O BENZNIDAZOL.
CÁLCULO DEL ÍNDICE DE COMBINACIÓN. ................................................................................................................................ 45
FIGURA 11. ÁCIDO ACETILSALICÍLICO, NIFURTIMOX, BENZNIDAZOL Y COMBINACIONES ENTRE ELLOS NO AFECTAN LA VIABILIDAD
DE MACRÓFAGOS RAW 264.7. .............................................................................................................................................. 47
FIGURA 12. ÁCIDO ACETILSALICÍLICO NO TIENE EFECTO SOBRE LA VIABILIDAD DE TRIPOMASTIGOTES DE TRYPANOSOMA CRUZI. . 49
FIGURA 13. LA PRODUCCIÓN DE PROSTAGLANDINA E2 NO ESTÁ RELACIONADA CON EL EFECTO DE ASA SOBRE CÉLULAS
INFECTADAS ............................................................................................................................................................................. 52
FIGURA 14. EFECTO DE INHIBIDORES SELECTIVOS DE COX1 Y 2 SOBRE LA LIBERACIÓN DE TRIPOMASTIGOTES AL MEDIO DE
CULTIVO.................................................................................................................................................................................... 53
FIGURA 15. EFECTO DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO EN MACRÓFAGOS INFECTADOS CON
T. CRUZI. ................................................................................................................................................................................... 57
FIGURA 16. EFECTO DE LA INHIBICIÓN DE LA NOS SOBRE MACRÓFAGOS INFECTADOS CON T. CRUZI Y TRATADOS CON ÁCIDO
ACETILSALICÍLICO. .................................................................................................................................................................... 58
FIGURA 17. EFECTO DE NOC-18 SOBRE MACRÓFAGOS INFECTADOS CON T. CRUZI. ..................................................................... 59
FIGURA 18. EFECTO DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO SOBRE LOS NIVELES DE POLIAMINAS EN CÉLULAS RAW INFECTADAS CON T.
CRUZI. ....................................................................................................................................................................................... 62
xii
RESUMEN
La enfermedad de Chagas, causada por el Trypanosoma cruzi constituye uno de
los problemas de salud pública más importante en América Latina. Las drogas
disponibles para su tratamiento, nifurtimox (NFX) y benznidazol (BZL) presentan
limitada efectividad terapéutica y una amplia gama de efectos adversos.
Los macrófagos representan la primera línea defensiva en la infección por T. cruzi.
En la interacción parásito hospedero se produce el aumento de una serie de moléculas
tendientes a disminuir la capacidad inmune del hospedero, entre ellas el factor de
crecimiento transformante β (TGF-β), interleuquina 10 (IL-10) y prostaglandina E2 (PGE2).
PGE2 es sintetizada por la COX, enzima que puede ser inhibida por ácido acetilsalicílico
(ASA), por lo tanto ASA podría contribuir a aumentar la capacidad tripanocida del
macrófago, mejorando la respuesta del hospedero a la infección.
PGE2 se ha relacionado con la modulación del equilibrio óxido nitríco/poliaminas
en el hospedero, por lo que inhibir su síntesis se puede traducir en un aumento del
óxido nítrico y una disminución de las poliaminas (por ej. putrescina), generando un
ambiente intracelular desfavorable para la proliferación parasitaria. Este efecto, sumado
al uso de los fármacos antichagásicos nifurtimox o benznidazol pueden dar paso un
control efectivo de la infección parasitaria.
xiii
Se estudió la siguiente hipótesis: “ácido acetilsalicílico potencia la eficacia de
nifurtimox y benznidazol y aumenta la capacidad tripanocida del macrófago”. Entonces,
se estudió el efecto de ácido acetilsalicílico en macrófagos RAW infectados con T. cruzi y
se encontró que ASA 1 mM es capaz de disminuir el número de células infectadas en un
41% y la liberación de tripomastigotes al medio de cultivo aproximadamente un 100%.
Además al analizar combinaciones de ácido acetilsalicílico con NFX y BZL se encontró
que tienen efecto sinérgico, con un índice de combinación de 0,71 para NFX-ASA y de
0,61 para BZL-ASA.
La infección por T. cruzi aumentó significativamente la síntesis de PGE2 en
macrófagos, efecto que fue revertido por ASA. De igual manera, mientras la infección
por T. cruzi disminuyó los niveles de óxido nítrico, ASA 1 mM restableció los niveles de
óxido nítrico. Ni la infección por T. cruzi ni el tratamiento con ASA produjeron cambios
significativos en los niveles de poliaminas. El efecto de aspirina se asoció principalmente
al aumento en la síntesis de óxido nítrico.
El efecto sinérgico entre ácido acetilsalicílico y las drogas antichagásicas sienta las
bases para una posible terapia combinada, que permita disminuir las dosis de NFX o BZL
permitiendo un mejor efecto antichagásico de estas drogas. De esta forma, la hipótesis
propuesta ha sido comprobada.
xiv
SUMMARY
Chagas’ disease, caused by Trypanosoma cruzi is one of the most important
public health problems in Latin America. Currently available drugs for treatment-
nifurtimox (NFX) and benznidazole (BZL) have limited therapeutic effectiveness and a
wide range of adverse reactions.
Macrophages represent the first line of defense in infection by T. cruzi. The host-
parasite interaction increases a series of molecules, such as transforming growth factor β
(TGF-β), interleukin 10 (IL-10) and prostaglandin E2 (PGE2) weakening the host’s immune
response. PGE2 is synthesized by COX, which can be inhibited by acetylsalicylic acid
(ASA). Therefore, ASA could contribute to enhance macrophage trypanocidal capacity,
improving the host response to infection.
PGE2 has been linked to modulation of the nitric oxide/polyamine equilibrium in
the host. Inhibiting its synthesis could yield an increase in nitric oxide levels and thus a
decrease in polyamines such as putrescine, generating an unfavorable intracellular
environment for parasite proliferation. This effect coupling with current Chagas Disease
drugs nifurtimox and benznidazole could eradicate the parasite from the host.
xv
xvi
We tested the following hypothesis “acetylsalicylic acid potentiate the efficacy of
nifurtimox and benznidazole, and enhances the trypanocidal capacity of macrophage”.
Then, we studied the effect of aspirin on T. cruzi-infected RAW macrophages, and found
that 1 mM ASA reduces the number of infected cells by 41% and release of
trypomastigotes to culture medium by almost 100%. Furthermore, when we analyzed
combinations of aspirin with NFX and BZL, we found a synergistic effect with
combinatory indexes of 0.71 for NFX-ASA and 0.61 for BZL-ASA.
Infection with T. cruzi significantly increased PGE2 synthesis in macrophages,
effect reversed by ASA. Similarly, T. cruzi infection decreased nitric oxide levels and 1 mM
ASA restored it to normal levels. Neither infection with T. cruzi or treatment with ASA
produced significant changes in polyamine levels. The effect of aspirin was mainly
associated to increased nitric oxide synthesis.
Detection of synergistic effect between aspirin and antichagasic drugs lays the
basis for a possible combination therapy, allowing lower doses of NFX or BZL for a better
therapeutic effect. Therefore, the proposed hypothesis has been satisfied.
INTRODUCCIÓN
Antecedentes históricos de la enfermedad de Chagas
La tripanosomiasis americana, conocida como enfermedad de Chagas es una
enfermedad parasitaria causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi,
perteneciente al orden Kinetoplastida, familia tripanosomatidae.
En 1907 el médico brasileño Carlos Chagas fue enviado a combatir la malaria a
Lassance, un pequeño poblado al interior del estado de Minas Gerais. En ese lugar
comenzó el descubrimiento de un nuevo parásito, el cual asoció a las patologías
cardiacas presentes en parte de la población del poblado. Carlos Chagas bautizó a ese
parásito como Trypanosoma cruzi, en honor a su mentor, el Dr. Osvaldo Cruz y se dedicó
a la descripción de esta nueva patología parasitaria. Además de descubrir el parásito
causante de esta “nueva tripanosomiasis”, describió el ciclo biológico, insecto vector y
reservorios naturales del parásito, algunos aspectos clínicos de la enfermedad, el rol de
la autoinmunidad en la patogénesis e inclusive anticipó el impacto social que se le
atribuye actualmente a esta patología, transformándose así en uno de los trabajos más
completos en cuanto a parasitología se han realizado hasta la fecha (Chagas 1909;
Bestetti, Martins et al. 2009). La enfermedad es transmitida por insectos estrictamente
hematófagos, principalmente del género Triatoma, en Chile se ha descrito al Triatoma
infestans o vinchuca, como vector principal.
1
Además existen antecedentes de que esta enfermedad está presente desde hace
más de 9000 años en el continente americano, dado que estudios de PCR de DNA de
kinetoplástido, han confirmado la presencia del Trypanosoma cruzi en momias de la
cultura chinchorro que han sido encontradas en costa y valle de la zona central de Chile
y el sur de Perú (Aufderheide, Salo et al. 2004). Más aún, restos momificados
encontrados en algunas regiones de Texas (EE.UU) y Minas Gerais (Brasil) han resultado
positivos a la detección de T. cruzi e inclusive se han podido determinar rasgos
patológicos de la enfermedad como megacolon chagásico en estas momias naturales
(Araujo, Jansen et al. 2009).
Epidemiología
En términos de salud pública, la enfermedad de Chagas es una de las mayores
preocupaciones para América Latina, siendo después de la malaria, la enfermedad ligada
a vectores, de mayor prevalencia y mortalidad. Es una enfermedad ligada a la pobreza,
dado las condiciones de transmisión y los países en los cuales se encuentra. Es la
enfermedad tropical que produce mayor carga económica en América latina, causando
la pérdida de 670.000 años de vida ajustados por discapacidad. Existen entre 10 y 20
millones de personas expuestas al riesgo de la infección entre el sur de California hasta
la sexta región en Chile (figura 1). Las tasas de mortalidad de la enfermedad varían entre
8 y 12% dependiendo del país estudiado, la edad, estado fisiológico de los pacientes y
2
modalidad de tratamiento recibido. Si bien las medidas de control vectorial han logrado
disminuir la tasa de incidencia, se estima que la población infectada en América alcanza
los 15 millones de casos, mientras que aún se registra un aproximado de 41.000 casos
nuevos por año (OMS/TDR 2007; Reithinger, Tarleton et al. 2009).
Por otra parte la migración de población desde países endémicos a países
desarrollados ha expandido el riesgo de contagio, especialmente a través de la donación
de sangre y órganos, ya que dichos países no cuentan con controles que permitan
detectar el parásito en bancos de sangre. Es así como la reciente preocupación sobre
esta materia ha permitido encontrar poblaciones de inmigrantes infectados en países
como Japón, Australia y principalmente España y Estados Unidos, transformando a esta
enfermedad como un problema emergente a escala mundial (Schmunis and Yadon
2009).
Figura 1. Distribución geográfica de la
enfermedad de chagas. Las áreas coloreadas en
rojo representan las zonas endémicas de la
enfermedad de Chagas. (Adaptado de
Reithenger y cols., 2009)
3
Ciclo biológico del T. cruzi
El ciclo de vida del T. cruzi incluye un hospedero mamífero, incluyendo al ser
humano, y un insecto vector (triatominos hematófagos), el cual al consumir sangre de
un mamífero portador de T. cruzi, se infecta de por vida con el parásito (Atías 1998).
El ciclo biológico del parásito incluye tres estados morfológicos, que le sirven
como adaptación a las distintas condiciones de los hospederos (figura 2). Entre las
características principales que diferencian cada estado se incluyen las posiciones
relativas del flagelo, kinetoplasto y núcleo (Prata 2001).
1. Tripomastigotes: Constituyen la forma infectante para mamíferos, se
encuentran en la sangre de los individuos infectados y en el intestino posterior
de los triatominos; no tienen capacidad de multiplicarse. Tienen 20 micrometros
de largo, kinetoplasto subterminal, y son fusiformes.
2. Epimastigotes: Representan la forma de multiplicación del parásito en el
intestino del triatomino y la predominante en cultivos axénicos, por lo cual la
mayoría de los estudios bioquímicos se han realizado empleando esta forma
celular. Al igual que los tripomastigotes su tamaño es de 20 micrómetros de
largo, su kinetoplasto es anterior al núcleo y son fusiformes.
4
3. Amastigotes: Es la forma multiplicativa del parásito dentro de las células del
hospedero mamífero. Se multiplica por fisión binaria al interior de las células,
produciendo su ruptura, liberando tripomastigotes al torrente sanguíneo.
Presentan aproximadamente 2 micrones de diámetro, son redondeados y flagelo
no emergente. Pueden ser cultivados en diversos tipos celulares, como células
musculares, fibroblastos y macrófagos (Morello, Letelier et al. 1987; Faundez, Pino
et al. 2005).
Aspectos clínicos de la enfermedad de Chagas
La enfermedad de Chagas se divide en 3 fases: aguda, indeterminada (o latente) y
crónica. La fase aguda, con una duración entre 4 y 8 semanas, puede ser asintomática, o
puede presentar signos y síntomas tales como fiebre, dolores musculares, malestar
general, sudoración, aumento en el tamaño de hígado y bazo, falla cardiaca debido a
miocarditis, derrame pericárdico y, menos frecuentemente, afecciones cerebrales tales
como meningo-encefalitis. El compromiso cardiaco está presente en más del 90% de los
casos. El diagnóstico se establece en menos del 10% de los casos, posiblemente debido
a síntomas moderados. El curso clínico en la mayoría de los casos resulta en
recuperación espontánea; sin embargo existe un riesgo de mortalidad de un 10% en
esta fase (Punukollu, Gowda et al. 2007; Yacoub, Mocumbi et al. 2008).
La fase indeterminada o latente puede durar de 10 a 30 años, y se caracteriza por
la ausencia de síntomas clínicos, pero la serología es positiva. Además, mediante
5
monitoreo Holter y ecocardiografía se ha descrito en prácticamente la totalidad de los
pacientes algún grado de compromiso cardiaco (Punukollu, Gowda et al. 2007).
La fase crónica se caracteriza por la aparición de manifestaciones digestivas
(megacolon y megaesófago) y/o, cardiacas, siendo estas últimas las características
asociadas a la letalidad de la enfermedad. La miocardiopatía chagásica crónica, se
presenta con tres grandes síndromes, que pueden coexistir en el mismo paciente:
trastornos del ritmo cardíaco, insuficiencia cardíaca y el tromboembolismo (sistémica y
pulmonar). La presentación clínica es muy variable según la duración de la enfermedad y
la extensión y localización de las lesiones cardíacas. La miocardiopatía chagásica afecta
a individuos de ambos sexos por igual, por lo general entre 30 y 45 años de edad,
detectada por deterioro electrocardiográfico progresivo. Un 37,5% puede sufrir muerte
súbita, mientras que el 58% presenta signos de insuficiencia cardíaca y generalmente
mueren dentro de los 7 a 24 meses. (Rassi, Rassi et al. 2006; Rassi, Rassi et al. 2009).
6
Figura 2. Ciclo biológico del Trypanosoma cruzi. En la figura se muestran los estados
morfológicos del parásito en el mamífero (A) y en el insecto vector (B). Al ingerir sangre de un
mamífero infectado, el Triatoma infestans ingiere tripomastigotes los cuales se transforman en
epimastigotes en el sistema digestivo del insecto. Estos epimastigotes se multiplican en el
intestino del vector y se transforman nuevamente a tripomastigotes en la región terminal del
intestino donde son eliminados junto con las heces al momento que el insecto se alimenta de un
nuevo mamífero. Estos tripomastigotes “metacíclicos” ingresan al torrente sanguíneo, donde
son capaces de infectar células nucleadas, al interior de las células se transforman en
amastigotes, forma replicativa intracelular. Estos amastigotes se transforman nuevamente a
tripomastigotes, los cuales son liberados al torrente sanguíneo, diseminando la infección.
7
El diagnóstico puede hacerse por observación microscópica de sangre fresca en
la fase aguda. Infecciones crónicas requieren de procedimientos diagnósticos más
sensibles con amplificación de DNA de parásitos por medio de PCR. Otra opción es el
xenodiagnóstico, que consiste en permitir que triatominos libres de parásitos succionen
sangre desde el candidato clínicamente sospechoso y examinar los excrementos de las
vinchucas 30 y 60 días después para observar la presencia de parásitos. Se puede
complementar este procedimiento con la detección por PCR de DNA parasitario en los
excrementos de las vinchucas (Zulantay, Apt et al. 2007). La detección inmediata de
enfermedad de Chagas crónica requiere de la demostración de anticuerpos específicos
anti-T. cruzi en suero de pacientes o en test basados en ácidos nucléicos, aunque el PCR
complementa muy bien esta modalidad diagnóstica (Teixeira, Nascimento et al. 2006)
Infección primaria del T. cruzi y respuesta del hospedero
Una vez que los tripomastigotes ingresan al organismo invaden a una gran
diversidad de células nucleadas del hospedero, incluyendo macrófagos, donde se
transforman en amastigotes. Los macrófagos, en contacto con el tripanosoma montan
una primera línea de defensa a través de procesos inflamatorios mediados
principalmente por la producción de óxido nítrico. Simultáneamente y para evadir esta
respuesta, el parásito induce en el macrófago una respuesta antiinflamatoria, en el cual
intervienen mediadores como las prostaglandinas y citoquinas como el TGF-β (Maya,
Cassels et al. 2007).
8
En su superficie, el T. cruzi posee una serie de glicoproteínas (gp35/50, gp82 y
gp90), transialidasa y moléculas de glicosilfosfatidilinositol (GPIs) las cuales le permiten
interaccionar con el hospedero y activar las vías de señalización que facilitan su entrada
a la célula (Yoshida 2006). Dentro de las vías de señalización activadas por el parásito se
encuentran las relacionadas con la liberación de Ca+2 desde el retículo sarcoplásmico de
la célula del hospedero, como fosfatidilinositol-3 kinasa, fosfatidilinositol 3 fosfato (IP3) y
fosfolipasa. Además de AMP cíclico y sistemas de señalización mediados por el factor
nuclear kappa beta (NF-κβ) (Campos, Almeida et al. 2001; Ropert, Almeida et al. 2001;
Burleigh and Woolsey 2002; DosReis, Pecanha et al. 2002); y por el factor transformante
del crecimiento (TGF-β) (Waghabi, Keramidas et al. 2005), que están involucrados en los
mecanismos de evasión de la respuesta inmune.
Como respuesta del macrófago se forma una vacuola compuesta por lisosomas,
que contiene al parásito. Con el estímulo fagocítico, las subunidades citosólicas de la
NADPH oxidasa se asocian con sus contrapartes en la membrana lipídica formando un
complejo activo, una flavoenzima responsable de la producción de grandes cantidades
de anión superóxido (O2•-), el cual contribuye a la muerte del parásito, junto a otras
especies radicalarias derivadas de este anión superóxido, como el peroxinitrito (ONOO-)
(Alvarez, Trujillo et al. 2002; Piacenza, Alvarez et al. 2009). El parásito escapa de esta
vacuola mediante la acción de una proteína lítica cuya actividad depende de pH ácido y
una vez en el citoplasma, se transforma en amastigote (Caler, Morty et al. 2000;
Rosestolato, Dutra Jda et al. 2002; Vieira, Dutra et al. 2002; Andrade and Andrews 2004).
9
Ya transformado en amastigote, el parásito comienza su replicación, para lo cual toma
nutrientes desde el medio intracelular, incluyendo putrescina, molécula necesaria para
la formación de tripanotión, principal agente antiradicalario del parásito (Piacenza,
Peluffo et al. 2001).
El macrófago también se activa a través de la interacción de los GPIs de T. cruzi
con receptores tipo Toll-2 (TLR2) aumentando su acción antiparasitaria (Ropert and
Gazzinelli 2004; Piacenza, Alvarez et al. 2009). Durante este proceso se activan vías
dependientes de MAP quinasas (Ropert, Almeida et al. 2001), capaces de aumentar la
síntesis de óxido nítrico (NO•) y de citoquinas proinflamatorias (Magez, Stijlemans et al.
1998) como interleukinas (ILs) 1, 6, 8, 12 y TNF-α. Estas dos últimas inducen la síntesis de
interferón-γ (IFN-γ) en células NK (Une, Andersson et al. 2003). También se ha observado
incremento en la producción de H2O2 (Melo, Fabrino et al. 2003), por lo que el estallido
respiratorio es un mecanismo importante en la actividad tripanocida del macrófago. Sin
embargo, este no es el único mecanismo y el NO• juega un papel central en esta
actividad.
Papel del óxido nítrico en la infección por T. cruzi
El óxido nítrico es un radical sintetizado a través del aminoácido L-arginina (figura
3). Una vez que se establece la infección por T. cruzi en el macrófago y se produce su
activación a través de IL-12 e IFN-γ, citoquinas derivadas de linfocitos T helper (Th1),
aumenta la expresión de la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS). El consecuente
10
aumento en la producción de NO• tiende a controlar la invasión parasitaria produciendo
estrés oxidativo en el parásito. Este efecto se ha observado tanto in vitro como in vivo
(Michailowsky, Silva et al. 2001; Alvarez, Trujillo et al. 2002; Fabrino, Leon et al. 2004;
Ramos-Ligonio, Lopez-Monteon et al. 2004; Gutierrez, Mineo et al. 2009).
El mecanismo antiparasitario propuesto para el NO• implica la formación de
peroxinitrito (ONOO-) a partir del anión superóxido proveniente del estallido respiratorio
(Alvarez, Trujillo et al. 2002) (figura 4). Sin embargo no se puede atribuir al óxido nítrico
la capacidad total antiparasitaria del hospedero, dado que existen trabajos en que
emplearon ratones deficientes en iNOS, los que demostraron ser resistentes a la
infección por T. cruzi (Cummings and Tarleton 2004; Fabrino, Leon et al. 2004),
sugiriendo la activa participación de otros componentes del sistema inmune. No
obstante, cepas de ratones que difieren en su resistencia a la infección por T. cruzi
también difieren en su producción de NO•. Por ejemplo, macrófagos peritoneales de
ratones C57BL/6 (resistentes a la infección), producen mucho más óxido nítrico, al ser
estimulados con T. cruzi, que macrófagos de ratones sensibles, como son los Balb/c
(Hideko Tatakihara, Cecchini et al. 2008).
Por otra parte, hay una modesta producción de iNOS que es independiente de
interferón y que favorece la proliferación del parásito. Inclusive se ha visto que fármacos
donantes de NO• facilitan la proliferación de amastigotes (Rottenberg, Castanos-Velez et
al. 1996), por lo que bajos niveles intracelulares de NO• proveniente del hospedero o del
propio parásito son favorables para el T. cruzi. Si bien T. cruzi no es capaz de sintetizar L-
11
arginina, posee un transportador específico para captarla y así utilizarla en la síntesis de
NO•. Se piensa que el NO• producido por esta sintetasa de NO• del T. cruzi (tcNOs) puede
influir en funciones como estimulación de la motilidad celular y regulación negativa de
la apoptosis inducida por el suero humano (Peluffo, Piacenza et al. 2004).
Otro mecanismo inmunosupresor del hospedero es el aumento de la actividad
de citoquinas antiinflamatorias como el factor de crecimiento transformante β (TGF-β).
El (TGF-β) se encuentra como un complejo latente que es activado por proteasas,
integrinas o trombospondinas específicas y su actividad es inversamente proporcional a
la producción de óxido nítrico en el macrófago. El T. cruzi secreta proteasas capaces de
activar al TGF-β. Adicionalmente, la fagocitosis de cuerpos apoptóticos de linfocitos T o
de neutrófilos, producidos por acción del TNF-α generado en macrófagos infectados con
T. cruzi, induce la producción de TGF-β y también de prostaglandinas. En consecuencia,
el contenido de NO• en el macrófago disminuye y el parásito prolifera (Li, Wan et al.
2006). Otros componentes de este complejo proceso incluyen otras citoquinas como IL-
10 e IL-12. La activación de TGF-β también está relacionada con la cardiomiopatía
chagásica, dado su rol regulador sobre la proliferación celular, la remodelación de la
matriz extracelular y la angiogénesis (Araujo-Jorge, Waghabi et al. 2008). Además, la
inhibición farmacológica de ALK5, una serina/treonina kinasa activada por el receptor de
TGF-β ha demostrado disminuir el daño y mantener la funcionalidad cardiaca, además
de reducir la mortalidad en un modelo agudo de infección por T. cruzi (Waghabi, de
Souza et al. 2009). Por otra parte el TGF-β favorece la actividad de arginina y ornitina
decarboxilasa, enzimas relacionadas con la producción de poliaminas, por lo que el
12
aumento de TGF-β induce un aumento de los niveles de poliaminas necesarias para la
proliferación del parásito (Freire-de-Lima, Nascimento et al. 2000)
El aumento en la producción de TGF-β, así como también el estado de
inmunosupresión inducido por esta citoquina está relacionado con la inducción de
apoptosis en diversos tipos celulares. TNF-α es capaz de inducir apoptosis en un
porcentaje de células T, las cuales serían fagocitadas por macrófagos disminuyendo la
capacidad de respuesta antiparasitaria (Freire-de-Lima, Nascimento et al. 2000). Sin
embargo el parásito también sería capaz de activar estas vías “apoptóticas”, dado que al
momento del ingreso de los parásitos al torrente sanguíneo cierta población de T. cruzi
entra en apoptosis, inducido las proteínas del suero humano (Piacenza, Peluffo et al.
2001). Además calreticulina de T. cruzi, una proteína parasitaria, es capaz de unirse a C1q
(Ferreira, Valck et al. 2004), una proteína del sistema del complemento que está
implicada en la fagocitosis de cuerpos apoptóticos (Lu, Teh et al. 2008), facilitando así la
entrada del parásito a células como macrófagos. Adicionalmente, la infección por T.
cruzi aumenta la expresión de receptores de vitronectina (VnR), que están involucrados
en la fagocitosis de células o parásitos en apoptosis (de Souza, Araujo-Jorge et al. 2003).
Otras enzimas parasitarias también son capaces de afectar la actividad del
macrófago. Es así como se ha reportado que cruzipaína, una serina proteasa de T. cruzi
es capaz de activar vías de MAP Kinasas que llevan a la disminución de la síntesis de NO•
y además aumentan la expresión de arginasas, reduciendo la disponibilidad de sustrato
para la iNOS, favoreciendo la proliferación parasitaria dentro de macrófagos (Stempin,
13
Garrido et al. 2008). Este efecto ha sido demostrado tanto in vitro, como in vivo. Así, en
ratones resistentes a la infección por T. cruzi, (C57BL/6) se ha visto una menor expresión
de arginasas (arginasa I, II y Ornitina Decarboxilasa), mientras que en ratones
susceptibles a la infección (BALB/c) se ha visto una mayor expresión de estas enzimas,
tanto en macrófagos como en tejido cardiaco. Éste es un fenómeno inverso a lo que
sucede con la síntesis de NO• en macrófagos de ambos tipos de ratones, dando a
entender que la relación entre los productos de L-arginina puede ser modulada por el
parásito para favorecer su proliferación (Cuervo, Pineda et al. 2008; Hideko Tatakihara,
Cecchini et al. 2008; Durand, Mukherjee et al. 2009).
Sin embargo, el eje iNOS/Arginasa (figura 3) no solamente es regulado
directamente por el parásito, ya que el propio sistema inmune del hospedero es capaz
de desplazar este equilibrio hacia la formación de poliaminas, a través de una vía de
activación alternativa, mediada por citoquinas como IL-10, TGF-β y otras moléculas
como la prostaglandina E2 (PGE2). El objetivo de esta vía de activación alternativa sería
prevenir la excesiva producción de óxido nítrico, disminuyendo el daño patológico que
este radical pudiera producir en el mismo hospedero (Boutard, Havouis et al. 1995;
Corraliza, Soler et al. 1995; Munder, Eichmann et al. 1998).
Las prostaglandinas además funcionan como retroalimentador positivo en este
equilibrio del NO• ya que aumentan la actividad de TGF-β (Brandonisio, Panaro et al.
2001), lo que a su vez disminuye el funcionamiento de la iNOS (Plum, Huang et al. 2002).
Además, su efecto antiinflamatorio en macrófagos activados, disminuye la proliferación
14
celular y la producción de citoquinas proinflamatorias (Pinge-Filho, Tadokoro et al. 1999;
Brandonisio, Panaro et al. 2001) incluyendo a IL-10 (Shinomiya, Naraba et al. 2001) y TNF-
α (Kim and Hahn 2000) favoreciendo el crecimiento intracelular del T. cruzi (Freire-de-
Lima, Nascimento et al. 2000).
Rol de prostaglandinas en la invasión del T. cruzi
Se ha apreciado en diversos modelos in vivo que la infección por T. cruzi produce
un aumento en los niveles plasmáticos de prostaglandina E2 (PGE2) (Borges, Kloetzel et
al. 1998) y otros derivados de la ciclooxigenasa (COX) como Tromboxano A2 (TXA2) y
prostaglandina F2α (PGF2α) (Cardoni and Antunez 2004). De estos eicosanoides, la PGE2
toma fundamental importancia, ya que se ha reportado que el aumento en la
producción de prostaglandina E2 estimula la actividad de arginasa y ornitina
descarboxilasa (ODC), lo que eleva la producción de poliaminas en el macrófago (Freire-
de-Lima, Nascimento et al. 2000). Estas poliaminas son utilizadas por el T. cruzi en la
síntesis de tripanotión T(SH)2, principal tiol antioxidante del parásito, y para la
producción de ácidos nucleicos. El T. cruzi es incapaz de sintetizar poliaminas, por tanto
debe tomarlas del medio intracelular del hospedero.
El ácido acetilsalicílico (ASA) disminuye la síntesis de prostaglandinas y
tromboxanos, por inhibición inespecífica de la ciclooxigenasa (COX) en sus dos
isoformas, COX-1 (constitutiva) y COX-2 (inducible) (Mitchell, Akarasereenont et al.
15
1993). Por lo tanto el ASA puede disminuir la actividad de ODC en macrófagos
infectados (Freire-de-Lima, Nascimento et al. 2000), lo que conduciría a disminución en
la capacidad de síntesis de T(SH)2 en el T. cruzi.
16
Figura 3. Metabolismo de la L-arginina en T. cruzi y el hospedero mamífero. L-arginina es
una encrucijada metabólica en diversas vías involucradas en la interacción entre el T. cruzi y la
célula de mamífero. La óxido nítrico sintasa (NOS) cataliza la producción de Nω-hidroxi-L-arginina
(NOHA), citrulina y óxido nítrico (NO•), en un proceso bloqueado por inhibidores como Nω-
arginina metil ester (L-NAME). L-arginina también es utilizada como precursor de putrescina a
través de la vía de la arginina decarboxilasa (ADC)/agmatinasa o la vía de la arginasa/ornitina
decarboxilasa (ODC). Putrescina es luego metabolizada por la espermidina sintetasa (SpdS) y
espermina sintetasa (SpmS). ADC, ODC y arginasa son inhibidas por difluorometilarginina
(DFMA), difluorometilornitina (DFMO) y NOHA, respectivamente. Tripanotión sintetasa (TrpS)
conjuga dos moléculas de Glutatión con una molécula de espermidina para formar Tripanotión.
En azul se indican los inhibidores endógenos, en verde las enzimas presentes sólo en el parásito,
en púrpura las enzimas presentes sólo en el mamífero y en rojo los inhibidores farmacológicos.
(Adaptado de Peluffo y cols, 2004).
17
Por otro lado, la prostaglandina E2 (PGE2) es capaz de inducir la producción de
TGF-β en macrófagos expuestos a células apoptóticas (Fadok, Bratton et al. 1998). De
forma recíproca, TGF-β es capaz de inducir la producción de PGE2 en células
inflamatorias no fagocíticas (Fong, Pang et al. 2000). Por ello, la inhibición de COX con
ASA es capaz, no solamente de bloquear la producción de PGE2 sino también la de TGF-β
(Freire-de-Lima, Nascimento et al. 2000), aumentando la producción de TNF-α (Kim and
Hahn 2000) y facilitando la actividad antiparasitaria del macrófago. De hecho, la
administración de ASA a ratones infectados con T. cruzi, y que además fueron inoculados
con células apoptóticas, disminuyó la parasitemia de manera dependiente de la dosis
(Freire-de-Lima, Nascimento et al. 2000).
En resumen, el contacto del T. cruzi, con los macrófagos, desencadena señales
que favorecen la invasión del parásito a la célula. Simultáneamente se producen por un
lado, señales proinflamatorias a través de la secreción de IFN-γ e IL-12 y TNF-α, con el
consecuente aumento de NO• intracelular. Y por otro lado, el parásito induce una
respuesta antiinflamatoria conducente a evadir la respuesta inmune del hospedero.
Entre los mecanismos usados para evadir la repuesta inmune del hospedero se
encuentra la inducción de apoptosis en diversas células, como linfocitos T y neutrófilos
(de Souza, Araujo-Jorge et al. 2003), la fagocitosis de estos cuerpos apoptóticos produce
una respuesta antiinflamatoria (activación alternativa) que provoca permisividad a la
infección por T. cruzi. Esta activación alternativa es consecuencia de la activación de
TGF-β que bloquea la producción de NO• inducida por IFN-γ, responsables de la
actividad tripanocida del macrófago (Ramos-Ligonio, Lopez-Monteon et al. 2004;
18
Waghabi, Keramidas et al. 2005) y por otro lado estimula la síntesis de poliaminas,
esenciales para la proliferación parasitaria (Boutard, Havouis et al. 1995; Corraliza, Soler
et al. 1995; Munder, Eichmann et al. 1998; Stempin, Garrido et al. 2008). El resumen de las
vías de activación se muestra en la figura 4.
Tratamiento de la enfermedad de Chagas
Actualmente, para el tratamiento de la enfermedad de Chagas las drogas
utilizadas son el nifurtimox (4-[(5-nitrofurfurilideno)amino]-3-metiltiomorfolino-1,1-
dióxido), derivado del nitrofurano y el benznidazol (N-benzil-2-nitroimidazol-1-
acetamida) derivado nitroimidazólico. La dosis de nifurtimox (NFX) recomendada en la
fase aguda de la enfermedad es de 8-10 mg/kg/día por 90 días en adultos y de 15
mg/kg/día en niños; y para el benznidazol (BZL), de 5 mg/kg/día por 60 - 90 días. La
duración promedio de la terapia es 60 días, pero en casos de reactivación de la
enfermedad crónica, como en pacientes inmunosuprimidos, la duración puede
prolongarse hasta 5 meses o más. Sólo en infecciones accidentales, sea a través del
vector, por transfusión de sangre o por contaminación en el laboratorio, la duración del
tratamiento es de 10-15 días (Atías 1998).
El mecanismo de acción de las drogas antichagásicas NFX y BZL se muestra en la figura
5. Se ha propuesto que el mecanismo de acción de estos fármacos es por formación de
radicales libres y/o metabolitos electrofílicos . El grupo nitro de ambas drogas, por
acción de nitroreductasas, se reduce a un grupo amino, generando en el camino
19
radicales libres y metabolitos electrófilos (Moreno, Docampo et al. 1982). El proceso
mediante el cual se forman los radicales libres se inicia por una reacción catalizada por
flavoproteínas, incluyendo la NADPH-citocromo P-450 reductasa, que actúa
directamente sobre el grupo nitro de las moléculas (R-NO2), produciendo un radical
intermediario nitro anión (R-NO2•-), capaz de interactuar covalentemente con
macromoléculas esenciales, como DNA y proteínas (Moreno, Docampo et al. 1982). En el
caso del NFX, el radical intermediario entra en reciclaje redox con el oxígeno molecular
produciendo una reducción parcial del oxígeno y regenerando la droga (Mason and
Holtzman 1975). El anión superóxido (O2•-) es dismutado a H2O2 por la enzima
superóxido dismutasa (SOD) (Temperton, Wilkinson et al. 1998). El anión superóxido
(O2•-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), en presencia de Fe3+ forman el radical libre
hidroxilo (OH•) (Reacción de Haber-Weiss Fenton). Estos radicales libres,
fundamentalmente el OH•, alteran la estructura de macromoléculas biológicas,
produciendo la lisis del parásito. (Castro and Diaz de Toranzo 1988; Goijman, Dubin et al.
1988).
20
Figura 4. Activación de macrófagos en la infección por T. cruzi. En la figura se muestran las
vías de activación clásica (A) y alternativa (B) que sufren los macrófagos durante la infección por
T. cruzi. Durante la activación clásica, citoquinas Th1 (IFN-γ, TNF-α e IL-1) activan los macrófagos
induciendo una serie de enzimas, incluyendo iNOS, la cual genera NO•. El NO• en combinación
con radicales libres provenientes del estallido respiratorio (O2•-) genera ONOO-, agente
altamente tóxico para el parásito. La fagocitosis de células y/o parasitos apoptóticos, además de
otras vías activadas directamente por el parásito inducen la síntesis de TGF-β y PGE2 que, en
conjunto con citoquinas como IL-10 generan una activación alternativa, caracterizada por un
aumento en la producción de poliaminas, tendiente a proteger al hospedero del estrés oxidativo
inducido por la activación clásica. El ambiente producido por la activación alternativa es
favorable para la proliferación del parásito (Adaptado de Peluffo y cols, 2004).
21
Existen diversos estudios que confirman que la reducción intracelular de NFX
generando radical nitro y radicales libres del oxígeno es su modo de acción contra T.
cruzi (Docampo and Stoppani 1979; Docampo and Stoppani 1980; Docampo, Moreno et
al. 1981; Docampo and Moreno 1984), mientras que el efecto tripanocida del BZL ocurre
por generación de metabolitos electrofílicos capaces de conjugarse con las
macromoléculas mencionadas (Moreno, Docampo et al. 1982; Docampo and Moreno
1984; Diaz de Toranzo, Castro et al. 1988; Maya, Rodriguez et al. 2004). Si bien la
participación del reciclaje redox en el mecanismo de acción de NFX es aún tema de
controversia, se ha clarificado que la reducción de ambos agentes antichagásicos (NFX y
BZL) por una nitroreductasa específica de T. cruzi (TcNTR) forma parte esencial de este
mecanismo. Esta nitroreductasa del tipo I no generaría radicales capaces de generar un
reciclaje redox, pero sí puede generar especies capaces de interactuar con el DNA y otras
macromoléculas escenciales para la vida celular (Wilkinson, Taylor et al. 2008). También
se ha visto que el BZL mejora la fagocitosis y aumenta la muerte de los tripanosomas a
través del IFN-γ (Romanha, Alves et al. 2002); por otro lado, se ha reportado que el BZL
inhibe la NADH-fumarato reductasa de T. cruzi (Turrens, Watts et al. 1996).
El NFX y el BZL tienen acción tripanocida contra todas las formas del parásito
(Rodriques Coura and de Castro 2002). Sin embargo, dado su mecanismo de acción
presentan efectos colaterales que van de leves a graves. Los efectos adversos más
frecuentes reportados con el uso de NFX son anorexia, pérdida de peso, alteraciones
psíquicas, excitabilidad o insomnio, naúseas, vómitos y ocasionalmente cólicos y diarrea,
siendo la polineuropatía la presentación más severa de reacciones adversas a esta
22
droga.(Castro, de Mecca et al. 2006) Con respecto al BZL, los efectos tóxicos observados
difieren en tipo e intensidad, las manifestaciones cutáneas (hipersensibilidad y
dermatitis con erupciones) son las más notorias, además se puede presentar intolerancia
digestiva, polineuritis, linfomas y toxicidad hepática (Viotti, Vigliano et al. 2009). Sin
embargo, la manifestación clínica más severa de la toxicidad de BZL es la depresión de la
médula ósea, llegando a presentarse púrpura trombocitopénica y agranulocitosis
(Castro, de Mecca et al. 2006; Viotti, Vigliano et al. 2009). Se ha reportado además, que
estas dos drogas producen mutagénesis y daño al DNA, por lo que hay dudas acerca del
beneficio de su uso (Zahoor, Lafleur et al. 1987; Gorla, Ledesma et al. 1989). Sin
embargo, en grandes series de pacientes tratados con estos fármacos, no se ha
encontrado diferencias significativas en la incidencia de cáncer asociada al uso de estas
drogas (Apt 1999; Viotti, Vigliano et al. 2009), por lo que el riesgo es más teórico que
observado. Por otro lado, se ha reportado diferencia de susceptibilidad entre cepas para
estos dos agentes, lo que introduce un elemento adicional que complica el manejo
farmacológico de esta enfermedad (Filardi and Brener 1987).
23
Figura 5. Mecanismo de acción de las drogas antichagásicas nifurtimox y benznidazol. El
grupo nitro de ambas drogas antichagáscias es reducido a radicales libres y/o metabolitos
electrofofilicos por las nitroreductasas del T. cruzi. Los nitroradicales derivados del nifurtimox
pueden sufrir reciclaje redox con el oxígeno, produciendo anión superóxido, el cual a través de
la acción de la superóxido dismutasa (SOD) genera peróxido de hidrógeno. Los radicales libres y
metabolitos electrofílicos generados son capaces de unirse a macromoléculas como proteínas,
ácidos nucleicos o lípidos, produciendo daño intracelular. En el parásito, principalmente
tripanotión (T(SH)2) y en menor grado glutatión (GSH) neutralizan la acción de los metabolitos
electrofílicos derivados de NFX y BZL generando un conjugado droga-tiol, que será nuevamente
metabolizado y eliminado como mercapturato. Los radicales libres son neutralizados por
oxidación de GSH o T(SH)2, ambos tioles son regenerados por reductasas específicas. (Adaptado
de Maya y cols, 2007).
24
Se han evaluado diversos compuestos con potencial acción tripanocida, entre
ellos el alopurinol y sus análogos, antimicóticos imidazólicos como ketoconazol e
itraconazol, quinonas, derivados nitroheterocíclos como el megazol, antioxidantes y
drogas de uso clínico como fenotiacinas (Maya, Cassels et al. 2007). Sin embargo, por
diversos motivos, como insensibilidad o resistencia, solubilidad, toxicidad o eficacia, no
han resultado ser mejores que el NFX o el BZL. Por lo anterior, es razonable pensar en
aumentar la eficacia clínica de estas drogas mediante estrategias complementarias.
En conclusión, el ácido acetilsalicílico, al inhibir la formación de prostaglandinas,
disminuye activación de ODC, reduciendo el aporte de poliaminas necesarias para la
síntesis de T(SH)2. Adicionalmente, la inhibición de la COX induce proliferación del
macrófago y producción de IL-10 y TNF-α entre otras citoquinas, lo que favorece la
aparición de un medio proinflamatorio en el macrófago, aumentando la actividad
antiparasitaria en el hospedero. Sumando estos efectos a la acción de NFX o BZL, se
podría disminuir la proliferación parasitaria intracelular. En base a lo anterior la figura 5
muestra una aproximación teórica al efecto combinado de ASA con las drogas
antichagásicas NFX y BZL.
25
Figura 6. Modelo teórico del efecto combinado de ácido acetilsalicílico y drogas
antichagásicas. La infección por T. cruzi aumenta la producción de PGE2 (i), la cual favorece la
producción de poliaminas (ii) y desfavorece la producción de óxido nítrico, ambos fenómenos
favorecen la proliferación parasitaria (iii). NFX y BZL afectan la proliferación parasitaria
intracelular a través de la formación de radicales libres y/o metabolitos electrofílicos (iv). Ácido
acetilsalicílico al inhibir la síntesis de PGE2 (v) revertiría el efecto sobre el óxido nítrico y
poliaminas, generando una ambiente desfavorable para la proliferación, sinergizando con el
efecto de NFX o BZL.
26
HIPÓTESIS
El ácido acetilsalicílico potencia la eficacia de nifurtimox y benznidazol y aumenta la
capacidad tripanocida del macrófago.
OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto de ácido acetilsalicílico y las drogas antichagásicas nifurtimox o
benznidazol, solas y combinadas, en cultivos de macrófagos infectados con
Trypanosoma cruzi.
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OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar el efecto de ácido acetilsalicílico y sus combinaciones sobre la liberación
de tripomastigotes al medio de cultivo en macrófagos infectados con T. cruzi y
tratados con nifurtimox o benznidazol, y cuantificar la potenciación en las diferentes
combinaciones de fármacos.
2. Determinar el efecto de ácido acetilsalicílico y sus combinaciones con nifurtimox o
benznidazol sobre la viabilidad celular de macrófagos y tripomastigotes aislados de
T. cruzi.
3. Determinar el efecto de ácido acetilsalicílico sobre los niveles de prostaglandina E2,
óxido nítrico y poliaminas en macrófagos infectados con T. cruzi.
4. Determinar la participación de PGE2 y óxido nítrico como mediadores del efecto de
ácido acetilsalicílico sobre macrófagos infectados con T. cruzi.
28
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivos de células y modelo in vitro de infección por T. cruzi.
Se cultivaron células RAW 264.7 a 37° C en ambiente humidificado y CO2 al 5%, a
una densidad de 100.000 células/cm2, en medio RPMI suplementado con bicarbonato de
sodio 0,22%, estreptomicina 100 μg/mL, penicilina 100 μg/mL y suero fetal bovino al 5%.
A las 24 horas, se infectaron con tripomastigotes de T. cruzi, clon Dm28c, a razón de tres
tripomastigotes por macrófago.
Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi.
Se infectaron células RAW 264.7 con tripomastigotes aislados de macrófagos
peritoneales de ratones infectados. De esta manera se obtuvieron los primeros
tripomastigotes. Posteriormente células RAW 264.7 se infectaron directamente con
tripomastigotes obtenidos por este método, a la relación de tres parásitos por célula.
Determinación del porcentaje de células infectadas.
Para determinar el porcentaje de células infectadas se utilizó el método de
tinción de núcleos con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, Invitrogen, USA). Células RAW
264.7 fueron cultivadas en RPMI 1640 (SFB 5%) sobre cubreobjetos en placas de 24
29
pocillos a una densidad de 50.000 céls/cm2. Éstas células fueron infectados con
tripomastigotes de T. cruzi (clon Dm28) a una relación de 2:1 (tripos:macrófagos). 24
horas después de la infección, las células fueron lavadas con buffer fosfato salino pH 7,4
(PBS), para eliminar los parásitos que no lograron ingresar en ellas. Posteriormente, se
agregó medio fresco y se adicionó ácido acetilsalicílico 1 mM en sólo uno de los grupos,
dejando el otro como control sin tratamiento. Cada 24 horas se reemplazó el medio de
cultivo por medio fresco, agregando los tratamientos respectivos. Luego de 72 horas las
células fueron lavadas y fijadas con metanol al 70% durante la noche. Al día siguiente las
células fijadas fueron lavadas con PBS tres veces y se agregó DAPI a una concentración
de 1 μg/mL en buffer de tinción (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 10 mM EDTA). La muestra se
dejó durante 3 minutos a oscuridad, luego se lavó con PBS tres veces para eliminar el
exceso de DAPI, los cubreobjetos fueron retirados y colocados sobre portaobjetos con
aprox. 50 μL de medio de montaje (Dako North America Inc., USA). Luego se realizó
microfotografía de fluorescencia en un microscopio Nikon Eclipse 400© a una longitud
de onda de 358 nm de exitación y de 461 nm de emisión. Se tomaron 10 fotografías de
cada cubreobjetos y se contó el número de células infectadas.
Viabilidad celular.
La viabilidad celular se determinó por reducción mitocondrial de sales de
tetrazolio o MTT a formazán, que tiene un color púrpura y cuya absorbancia es
directamente proporcional al número de células vivas en el cultivo. En placas de cultivo
de 96 pocillos, con un cultivo celular con 100 μL de medio RPMI sin rojo fenol ni suero
30
fetal bovino, se adicionó 10 μL de MTT 5 mg/mL en presencia de fenazina metosulfato
0,22 mg/mL (como transportador de electrones). Las células se incubaron durante 4
horas a 37°C, y el precipitado de cristales de formazán fue disuelto en 100 μL de SDS al
10% en HCl 0,01M a 37°C durante toda la noche. La intensidad del color se midió por
absorbancia a 570 nm en un lector de microplacas Asys Expert Plus©, Austria.
Determinación de óxido nítrico.
El efecto sobre la síntesis de óxido nítrico se evaluó indirectamente,
determinando el contenido de nitritos en el sobrenadante de las células en cultivo. 100
μl de sobrenadante se incuban con 100 μl de una mezcla de sulfanilamida 1%,
naftiletilendiamida 0,1% y ácido fosfórico 2,5% (reactivo de Griess), a temperatura
ambiente por 10 minutos. Se midió la absorbancia de las muestras a 570 nm. La
concentración de nitritos se calculó a partir de una curva estándar derivada de la
reacción con NaNO2.
Liberación de tripomastigotes al medio de cultivo.
La determinación del efecto tripanocida se realizó mediante la determinación de
tripomastigotes liberados al medio de cultivo como estaba previamente descrito
(Nunes, Andrade et al. 1998). Células RAW 264.7 (macrófagos) fueron sembradas en
frascos de cultivo de 25 cm2 a una densidad de 500.000 células/mL (5 mL totales). Las
31
células fueron infectadas con 5x106 tripomastigotes de T. cruzi (clon Dm28), para lograr
una relación célula:parásito de 1:2. 24 horas luego de establecida la infección se
aplicaron los tratamientos, cambiando el medio de cultivo cada 24 horas (RPMI
suplementado al 5% con suero fetal bovino), manteniendo los tratamientos respectivos.
Luego de 3 días de tratamiento, se recolectaron los tripomastigotes en el sobrenadante
y se contaron por microscopía directa.
Determinación de Prostaglandina E2.
La producción de prostaglandina E2 se determinó midiendo el contenido de PGE2
en el sobrenadante de células RAW infectadas. Para esto se utilizó el Kit “Prostagladin E2
EIA Kit – Monoclonal” (Cayman ® Chemical Co. USA). Brevemente, se infectaron células
RAW con tripomastigotes de T. cruzi Dm28c a una relación 2:1 (tripomastigotes:células).
Después de 72 horas de infección se tomaron 50 μL del sobrenadante y se sometieron al
inmunoensayo competitivo de detección. Este se basa en la competencia entre el
analito (PGE2 muestra) y un conjugado de PGE2 unida a acetilcolinesterasa por una
cantidad limitada de anticuerpo monoclonal anti PGE2. La cuantificación se realiza
mediante un reactivo que al ser metabolizado por la acetilcolinesterasa genera un
compuesto capaz de absorber a 412 nm. La absorbancia es inversamente proporcional a
la cantidad de PGE2 presente en la muestra.
32
Determinación de poliaminas.
El contenido intracelular de poliaminas (putrescina, espermidina y espermina) fue
determinado por separación cromatográfica y detección fluorométrica. Células RAW
264.7 fueron infectadas con T. cruzi en relación 2:1 (parásito:célula), 24 horas después se
comenzó el tratamiento con ácido acetilsalicílico. Después de 72 horas de tratamiento
las células fueron removidas para derivatizar el contenido de poliaminas intracelular. 5 X
106 células fueron resuspendidas en 300 μL de PBS, luego fueron sonicadas y
centrifugadas 10’ a 16.000 g para eliminar membranas. El sobranadante fue mezclado en
volúmenes iguales con ácido tricloroacético (TCA) al 10% y dejadas en hielo por 5
minutos, luego la muestra fue centrifugada a 16.000 g por 15 minutos a 4°C para
precipitar proteínas. El sobrenadante fue llevado a pH alcalino con NaOH 5 M y se
sometió a derivatización con 9-fluorenil-metil-cloroformato (FMOC). La derivatización
consiste en formar un aducto entre la poliamina y el FMOC, capaz de emitir fluorescencia
a 316 nm, luego de ser excitado con una longitud de onda de 254 nm. La mezcla de
derivatización contenía 100 μL de muestra, 250 μL de borato de sodio 0,2 M (pH 9), 500
μL de acetona, que fueron mezclados a temperatura ambiente por 45 segundos y
dejado en oscuridad por 60 seg. Luego se agregó 50 uL de FMOC 10 mM (en
acetonitrilo) y 100 μL de glicina 130 mM, nuevamente se mezcló por 45 segundos y
dejados en oscuridad 60 segundos. Finalmente la mezcla se filtró y se sometió a análisis
por HPLC. La separación cromatográfica se realizó a través de una columna Phenomenex
Luna® 5u C18 250 X 4.6 mm, utilizando como fase móvil una solución acuosa de Ácido
acético glacial 0,25% más Trietilamina (TEA) 0,1%. Ajustada a pH 4,2 con NaOH y filtrada
33
(Solvente A) y metanol grado HPLC (solvente B). La bomba utilizada fue Merck-Hitachi L-
6200A Intelligent Pump® y el detector utilizado fue Merck-Hitachi F-1050 Fluorescence
Spectrophotometer®. El proceso de separación se realizó a través de un programa de 35
minutos, entre 0 y 10 min la mezcla es 20% A y 80% B, entre 10 y 20 min el porcentaje de
A varía de 20 a 8% en gradiente, entre 20 y 25 minutos el flujo de A baja en gradiente de
8 a 5%, luego de 25 a 35 minutos el flujo corresponde a un 20% de A y 80% de B.
Reactivos y materiales.
Ácido acetilsalicílico (Aspirina®) y nifurtimox (Lampit®) fueron obtenidos de Bayer
AG. (Leverkusen, Alemania). Benznidazol (Radanil®) fue obtenido de Roche Ltd. (Basilea,
Suiza). Meloxicam (Mobex®) fue obtenido de Boehringer Ingelheim (Ingelheim am
Rhein, Alemania. Indometacina fue obtenida de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).
Otros reactivos y solventes utilizados fueron obtenidos de los fabricantes indicados en
cada sección.
34
Análisis estadístico.
Las curvas concentración-efecto de los diferentes tratamientos y los análisis
estadísticos fueron realizadas con el software GraphPad Prism© 5.0 (GraphPad Software
Inc.). Todos los experimentos se realizaron por triplicado, excepto donde se indica. Los
resultados fueron comparados mediante análisis de varianza de las diferentes muestras
entre sí y respecto de los controles considerando que hay dos o más tratamientos que
influyen en el resultado final. Por lo tanto, corresponde hacer ANOVA de dos o tres vías
y los respectivos análisis de correlación. Para los experimentos que incluyen solamente
dos grupos de datos se ocupó el análisis T de Student. Para todos los experimentos se
consideró significativo aquellos resultados con valores de p≤0,05.
35
36
RESULTADOS
Ácido acetilsalicílico disminuye la tasa de infección en macrófagos RAW 264.7
infectados con T. cruzi.
Para comprobar que ASA es capaz de disminuir la carga parasitaria por
Trypanosoma cruzi en el modelo de macrófagos murinos, se infectaron macrófagos RAW
264.7 con tripomastigotes de T. cruzi (Dm28c) y se sometieron a tratamiento con ASA (1
mM) durante 72 horas, luego se determinó la cantidad de células infectadas por
microscropía de fluorescencia. Por medio de la tinción de núcleos con DAPI, es posible
diferenciar los núcleos de los amastigotes intracelulares de los núcleos de los
macrófagos, pudiendo así determinar y cuantificar el número de células infectadas en un
campo determinado, que corresponderá al número de células que cuenten con al
menos un amastigote en su interior, corroborado con la imagen de contraste de fase.
En la figura 7A se aprecia que ASA 1 mM disminuye significativamente el número
de células infectadas. De hecho, la cuantificación de estas células (figura 7B) muestra
que el control sin tratamiento presenta un 46,4 ± 26,8% de células infectadas, mientras
que el grupo tratado con ASA presenta sólo un 5,6 ± 3% de células infectadas, con un
valor de p<0,001. Estos resultados sugieren fuertemente que ASA afecta la proliferación
intracelular de amastigotes.
Figura 7. Ácido acetilsalicílico disminuye el porcentaje de infección en células RAW 264.7
infectadas con T. cruzi. Células RAW 264.7 fueron infectadas con T. cruzi (Dm28c) y tratadas con
ácido acetilsalicílico (ASA) 1 mM durante 72 horas, luego se tiñeron los núcleos con DAPI y se
fotografió en un microscopio de fluorescencia. A. Las imágenes corresponden a fotos
representativas de los grupos control y tratados con ASA 1 mM. Se muestran las fotos de
fluorescencia y de contraste de fase (CF). Los núcleos grandes corresponden a núcleos de
macrófagos, mientras que los núcleos pequeños (señalados con flechas blancas) corresponden a
núcleos de amastigotes de T. cruzi. B. Cuantificación del porcentaje de células infectadas
respecto al control, para cada cuantificación se consideraron 10 fotos de cada grupo, los
resultados se representan como el promedio ± DS de 10 muestras en 2 experimentos
independientes ***: p < 0,001, t Test. 37
Ácido acetilsalicílico disminuye la liberación de tripomastigotes al medio de
cultivo. Sinergismo entre ácido acetilsalicílico y nifurtimox o benznidazol.
Diversos estudios han mostrado la efectividad de inhibidores de la COX, como
ASA, en modelos in vitro e in vivo de la enfermedad de Chagas; sin embargo, existe una
gran variabilidad entre las concentraciones y los modelos utilizados (Freire-de-Lima,
Nascimento et al. 2000; Michelin, Silva et al. 2005; Abdalla, Faria et al. 2008; Hideko
Tatakihara, Cecchini et al. 2008). Por lo tanto las relaciones de efecto respecto a la
concentración de ASA no son claras.
Como parámetro de la efectividad de ASA frente a la infección in vitro se estudió
la liberación de tripomastigotes al medio de cultivo. Al infectar un cultivo de células
RAW 264.7 a una relación de 2:1 (parásitos:células), se liberan tripomastigotes al medio
de cultivo al cuarto día. Éstos parásitos pueden ser cuantificados por microscopía directa
(Nunes, Andrade et al. 1998). En base a este parámetro se realizó el estudio sistemático
de las concentraciones efectivas de ASA, que permitieron corroborar el efecto de ASA y
hacer los estudios de sinergismo con NFX y BZL. Se comparó la liberación de
tripomastigotes en cultivos infectados y tratados con los diferentes fármacos y sus
combinaciones frente a un control preparado bajo las mismas condiciones que los
grupos tratados.
38
Se observó que el efecto de ASA sobre la liberación de tripomastigotes tiene un
comportamiento dependiente de la concentración, con un IC50 = 313,1 ± 36,0 μM.
(Figura 8A). También se determinó el efecto de NFX y BZL sobre este mismo modelo de
liberación, encontrando un IC50 de 0,083 ± 0,005 μM para NFX (Figura 8B) y de 0,34 ±
0,002 μM para BZL (Figura 9B). Luego de determinar estos valores, se combinaron ambas
drogas con ASA, buscando un efecto sinérgico, evaluado mediante isobologramas.
Los estudios de combinación se efectuaron de la siguiente manera: para
comprobar la influencia de ASA sobre el efecto de NFX, se realizó una curva de efecto a
concentraciones crecientes de NFX, en presencia de una concentración de ASA
inefectiva. En este caso se consideró como inefectiva la concentración correspondiente
al IC12,5 de ASA. De la misma forma, se agregó el IC12,5 de ASA a una curva de BZL y
también se realizaron curvas concentración-respuesta para ASA en presencia del IC12,5 de
cada droga antichagásica. De esta manera se obtuvieron los IC50 de las combinaciones,
los que fueron comparados con los IC50 de cada droga sola (figuras 8, 9 y tabla 1) y en
base a esos valores se construyeron los isobologramas de la figura 10.
Un isobolograma es una representación gráfica de la combinación equipotente
de varias concentraciones de dos drogas y es usado para ilustrar efectos aditivos,
sinérgicos o antagónicos entre ellas (Chou 2006). Se representa el IC50 para cada
fármaco en cada eje y con una línea continua se pueden interpolar los valores esperados
39
de IC50 para uno de los fármacos al aumentar la concentración del fármaco
complementario (línea de aditividad).
Al evaluar la variación del IC50 de ASA frente a una concentración fija de NFX, se
esperaba que el IC50 de ASA disminuyera en un 20%, de 313,1 μM a 250,5 μM, sin
embargo, el IC50 obtenido fue de 134,1 μM, es decir, una disminución de un 57,2% del
IC50 de ASA solo, (p < 0,0001, respecto al IC50 esperado, Figura 10A). De forma
complementaria, al agregar ASA a una curva concentración-respuesta de NFX, se
esperaba que el IC50 de NFX disminuyera de 0,0803 μM a 0,0626 μM (un 22%), sin
embargo, el IC50 obtenido fue de 0,0231 μM, es decir, una disminución de un 72,2% del
IC50 de NFX sólo, (p = 0,0018, respecto al IC50 esperado, Figura 10A).
La combinación de ASA con BZL se realizó con una concentración de BZL que en
teoría disminuiría en un 20% el IC50 de ASA (de 313 a 250 μM, aproximadamente), sin
embargo, el IC50 se redujo en un 76,6% (73,1 ± 11,4 μM, con p<0,0001 respecto al IC50
esperado). Por otra parte, la variación del IC50 de BZL frente a una concentración fija de
ASA fue de un 61,8% (0,127 μM, con p < 0,0001, respecto al IC50 esperado, Figura 10B).
Chou y Talalay en 1983 introdujeron el concepto de índice de combinación (CI),
bajo el cual se puede cuantificar el sinergismo o antagonismo entre dos drogas (Chou,
Chou et al. 1983). Matemáticamente, el estudio de la combinación de dos drogas puede
ser expresada como:
40
En esta ecuación, el denominador, (Dx)1 y (Dx)2 representa la concentración de las
drogas 1 y 2 que por separado inhiben el efecto en un X%; en los numeradores, (D)1 y (D)2
representan la concentración de las drogas 1 y 2, que en combinación inhiben el sistema
al mismo porcentaje (concentración equipotente). Según esto, los valores de CI pueden
ser menores, iguales o mayores a 1, lo que indica sinergismo, efecto aditivo y
antagonismo, respectivamente.
Al ser sometido al análisis anterior, encontramos que la combinación de ASA con
NFX entrega un CI = 0,706, lo que implica que ambas drogas tienen un efecto sinérgico
al ser combinadas. Por otro lado, La combinación entre ASA y BZL genera un CI = 0,611,
lo que da cuenta de un efecto sinérgico al combinar ambos fármacos (tabla 1).
41
Figura 8. Efecto de ácido acetilsalicílico, nifurtimox y su combinación sobre la liberación de
tripomastigotes al medio de cultivo. Células RAW 264.7 fueron infectadas con T. cruzi; luego
de tres días de tratamiento, se determinó la cantidad de tripomastigotes presentes en el
sobrenadante. A. Curva concentración-respuesta de liberación de tripomastigotes al medio
respecto a la concentración de ácido acetilsalicílico solo (ASA) y ácido acetilsalicílico + nifurtimox
(ASA + NFX). B. Curva concentración-respuesta de liberación de tripomastigotes al medio
respecto a la concentración de nifurtimox solo (NFX) y nifurtimox + ácido acetilsalicílico (NFX +
ASA). Los datos representados en las curvas concentración respuesta corresponden al promedio
± DS de tres experimentos independientes.
42
Figura 9. Efecto de ácido acetilsalicílico, benznidazol y su combinación sobre la liberación
de tripomastigotes al medio de cultivo. Células RAW 264.7 fueron infectadas con T. cruzi;
luego de tres días de tratamiento, se determinó la cantidad de tripomastigotes presentes en el
sobrenadante. A. Curva concentración-respuesta de liberación de tripomastigotes al medio
respecto a la concentración de ácido acetilsalicílico solo (ASA) y ácido acetilsalicílico +
benznidazol (ASA + BZL). B. Curva concentración-respuesta de liberación de tripomastigotes al
medio respecto a la concentración de benznidazol sólo (BZL) y benznidazol + ácido
acetilsalicílico (BZL + ASA). Los datos representados en las curvas concentración respuesta
corresponden al promedio ± DS de tres experimentos independientes.
43
Figura 10. Ácido acetilsalicílico presenta efecto sinérgico al ser combinado con nifurtimox
o benznidazol. Análisis isobolográfico. Células RAW 264.7 fueron infectadas con T. cruzi, y
tratadas con ácido acetilsalicílico, nifurtimox, benznidazol o mezclas de ácido acetilsalicílico con
los fármacos antichagásicos. Luego de tres días de tratamiento se determinó la cantidad de
tripomastigotes presentes en el sobrenadante por microscopía directa. A. Isobolograma
correspondiente a la combinación entre ácido acetilsalicílico y nifurtimox. B. Isobolograma
correspondiente a la combinación entre ácido acetilsalicílico y benznidazol. Para ambos
isobologramas la línea contínua corresponde las posiciones sobre las cuales se ubicarían los
puntos teóricos en caso de haber efecto aditivo. Los puntos sobre la línea discontinua
corresponden a los datos experimentales mostrados en las figuras 8, 9 y la tabla 1.
44
Tabla 1. Ácido acetilsalicílico presenta efecto sinérgico al ser combinado con nifurtimox o
benznidazol. Cálculo del índice de combinación.
‡Los valores de IC50 fueron obtenidos de los experimentos de liberación de tripomastigotes al
medio de cultivo (figuras 9 y 10). Los datos representan el promedio de tres experimentos ±
desviación estándar. §IC50 teórico corresponde al valor calculado a partir de los Isobologramas de
la figura 10. En las combinaciones, ácido acetilsalicílico, NFX y BZL fueron agregados a
concentraciones correspondientes al IC12,5. El valor de p corresponde a la comparación entre el
IC50 observado y el teórico, a través test de Fisher. El índice de combinación fue calculado de
acuerdo a Chou (2006). Los resultados están expresados como el promedio ± DS de tres
experimentos independientes.
45
Ácido acetilsalicílico no afecta la viabilidad de células RAW ni tripomastigotes de T.
cruzi.
Una explicación de la disminución de tripomastigotes liberados puede ser la
muerte de los macrófagos que los contienen, lo cual daría cuenta de un efecto citotóxico
sobre el macrófago y no un efecto sobre el parásito, por lo cual se estudió la toxicidad de
ácido acetilsalicílico, NFX, BZL y sus combinaciones en macrófagos no infectados. Se
analizó el crecimiento durante cuatro días de macrófagos RAW sin infectar, tratados con
ASA (1,3 mM), NFX (0,7 μM), BZL (10 μM) y combinaciones entre ellas a las mismas
concentraciones. Las concentraciones utilizadas corresponden a las concentraciones de
mayor efecto terapéutico aplicadas en las botellas de cultivo en los experimentos de
combinación. ASA, NFX, BZL y sus combinaciones no produjeron cambios significativos
en la constante de crecimiento de las células RAW, a concentraciones terapéuticamente
efectivas (Figura 11).
46
Figura 11. Ácido acetilsalicílico, nifurtimox, benznidazol y combinaciones entre ellos no
afectan la viabilidad de macrófagos RAW 264.7. Células RAW 264.7 fueron cultivadas en
medio RPMI y expuestas a diferentes tratamientos. Se evaluó el crecimiento de macrófagos
sanos por reducción de MTT. A. Curvas de proliferación respecto al tiempo de macrófagos
expuestos a tratamientos con: Ácido acetilsalicílico (ASA: 1,3 mM), nifurtimox (NFX: 0,7 μM),
benznidazol (BZL: 10 μM) y combinaciones entre ellas (NFX + ASA ó BZL + ASA, a las mismas
concentraciones que las drogas por separado). B. Constantes de crecimiento de macrófagos
expuestos a los mismos tratmientos descritos para el panel A. las barras negras corresponden al
grupo control o tratamientos con NFX o BZL y las barras blancas corresponden a los grupos
tratados con ASA y sus combinaciones con NFX o BZL. Ninguno de los resultados mostró
diferencias estadísticamente significativas. Los resultados se muestran como promedio ± DS de
tres experimentos independientes.
47
Ácido acetilsalicílico no afecta la viabilidad de tripomastigotes de T. cruzi.
Según el planteamiento teórico de este trabajo, ácido acetilsalicílico no afecta la
viabilidad del parásito, sino que genera un ambiente desfavorable para la proliferación
dentro del macrófago, por lo que es necesario corroborar la toxicidad de ASA
directamente sobre el parásito y si existe algún sinergismo al combinar ASA con las
drogas que si tienen efecto tripanocida directo (NFX y BZL)
Se analizó la viabilidad de tripomastigotes de T. cruzi expuestos a
concentraciones fijas de ASA, NFX, BZL y combinaciones entre estos fármacos. Los
resultados se muestran en la Figura 12. Se aprecia que el ASA a 5 mM (una
concentración cinco veces más alta que la utilizada en los experimentos de liberación de
tripomastigotes), no afecta la viabilidad de tripomastigotes. Esto confirma la idea que el
ASA no tiene un efecto antichagásico per se, sino que mejora la capacidad de respuesta
del macrófago para enfrentar la infección.
Como era esperable, tanto NFX y BZL (30 y 60 μM, respectivamente) son capaces
de disminuir de manera significativa la viabilidad de los tripomastigotes. Al combinar
NFX con ASA se aprecia una disminución significativa de la viabilidad de
tripomastigotes. Dado que no se conocen blancos terapéuticos para ASA en el parásito,
hasta este momento no es posible establecer una relación mecanóistica que explique a
48
este fenómeno. Al combinar BZL con ASA no se aprecia un aumento en el efecto
ripanocida de ASA respecto al efecto de BZL sólo.
Figura 12. Ácido acetilsalicílico no tiene efecto sobre la viabilidad de tripomastigotes de
Trypan oma cruzi. Tripomastigotes de T. cruzi clon Dm28 fueron expuestos a ácido
acetilsalicílico (ASA) 5 mM, nifurtimox (NFX) 30 μM, benznidazol (BZL) 60 μM y combinaciones
entre e
más ASA. Los resultados están expresados como el promedio ± DS de tres experimentos
t
os
llos por 24 horas. Las barras negras corresponden a los grupos control y tratados con NFX
ó BZL, mientras que las barras blancas corresponden al control y tratamientos con NFX ó BZL
independientes.
49
Relación entre el efecto de ácido acetilsalicílico y la síntesis de prostaglandinas
Dado que el ácido acetilsalicílico es capaz de disminuir la síntesis de
prostaglandina E2 (PGE2) de manera inespecífica, tanto la producida por COX-1 como por
COX-2 (Mitchell, Akarasereenont et al. 1993), se estudió el efecto de ASA sobre la síntesis
de PGE2 en macrófagos infectados con T. cruzi.
Previamente se describió la producción de prostaglandinas en macrófagos
infectados con T. cruzi, al ser coestimulados con células apoptóticas (Freire-de-Lima,
Nascimento et al. 2000). En la figura 13 se aprecia que T. cruzi fue capaz por sí sólo de
aumentar la síntesis de PGE2 en macrófagos RAW 264.7 en aproximadamente siete veces
(control no infectado = 191 ± 6 versus control infectado = 1318 ± 44 pg/mL). La adición
de ASA 1 mM disminuyó la síntesis de PGE2. En células no infectadas, la producción de
PGE2 disminuyó de 191 ± 6 a 31 ± 20 pg/mL, mientras que en células infectadas por T.
cruzi el comportamiento fue concentración-dependiente, cayendo de 1318 ± 44 a 47,2
e PGE2, se agregó PGE2 1 mM de manera exógena a un cultivo de células RAW
infectadas con T. cruzi y tratadas con ASA 0,25 mM. La adición de PGE2 no produjo
± 10 pg/mL a una concentración de 0,5 mM de ASA (figura 13A). Un ajuste
concentración respuesta del efecto de ASA sobre la síntesis de PGE2 en células infectadas
entregó un IC50 = 7,7 ± 2,5 μM.
Para evidenciar que el efecto de ASA está mediado por la inhibición de la síntesis
d
50
reversión del efecto de ASA, indicando que PGE2 no tendría un rol fundamental en el
fecto de ASA sobre macrófagos infectados (figura 13B).
nhibidores COX-2 específicos (Tegeder,
Pfeilschifter et al. 2001). Para corroborar la participación de COX en el efecto de ASA, se
realiza
e
Se ha descrito que el ASA tiene efectos no relacionados con la actividad de
ciclooxigenasa (Amann and Peskar 2002), efectos que no son compartidos por otros
inhibidores de COX como indometacina e i
ron experimentos de liberación de tripomastigotes en presencia de otros
inhibidores de COX, meloxicam e indometacina. La figura 14 muestra que ambos
inhibidores fueron capaces de disminuir la liberación de tripomastigotes al medio de
cultivo, con valores de IC50 de 42,7 ± 0,36 y 97,6 ± 11,1 respectivamente, indicando la
participación de COX en el efecto de ASA sobre las células infectadas.
51
Figura 13. La producción de Prostaglandina E2 es independiente del efecto de ASA sobre
células infectadas. Células RAW 264.7 fueron infectadas con tripomastigotes de T. cruzi clon
tratados con ASA 1 mM. (B)
Liberación de tripomastigotes al medio de cultivo en macrófagos infectados tratados con ASA y
ASA + PGE2. Todos los resultados están expresados como promedio ± DS de tres experimentos
independientes. ns: no significativo; ***: p<0,001.
Dm28. (A) Producción de PGE2 en macrófagos infectados y
52
Figura 14. Inhibidores selectivos de COX disminuyen la liberación de tripomastigotes al
medio de cultivo. Células RAW 264.7 fueron infectadas con T. cruzi (clon Dm28), y tratadas con
(A) meloxicam o (B) indometacina a concentraciones crecientes. Luego de tres días de
tratamiento se determinó la cantidad de tripomastigotes presentes en el sobrenadante. Los
datos representados en ambas curvas concentración-respuesta y los resultados de IC
corresponden al promedio ± DS de dos experimentos independientes.
50
53
Ácido acetilsalicílico aumenta la producción de óxido nítrico en células RAW
infectadas con T. cruzi. Participación del óxido nítrico en el efecto de ácido
acetilsalicílico.
El óxido nítrico (NO•) en un mediador importante en la respuesta del hospedero
ante la infección por T. cruzi (Holscher, Kohler et al. 1998). Sin embargo la síntesis del
óxido nítrico está sujeta a la regulación del eje iNOS/Arginasa. PGE2 aumenta la
expresión de arginasas, disminuyendo la producción de NO•. En ese sentido, ASA podría
aumentar la síntesis de NO• en los macrófagos infectados con T. cruzi. Se estudió la
2 te de un cultivo celular.
sta cuantificación es posib e en nuestro modelo dado que el NO2- es el principal
producto de degradación del NO• en cultivos celulares. Al analizar la liberación en un
periodo de 72 horas, se observó que la infección por Trypanosoma cruzi produjo una
reducción en la liberación de NO•, que se mantiene en el tiempo, pero que es revertida
por ASA de una forma concentración-dependiente (Figura 15A). A las 72 horas, la
producción de NO• aumenta significativamente en los grupos tratados con ASA a
concentraciones de 0,5 y 1 mM, respecto a las células infectadas sin tratamiento,
equiparando la producción normal de NO• por células no infectadas (Figura 15B). La
relación entre el efecto de ASA y la síntesis de óxido nítrico en macrófagos infectados
con T. cruzi. Los resultados se muestran en la figura 15.
La síntesis de NO• se midió indirectamente a través de la reacción de Griess, que
cuantifica la cantidad de nitrito (NO -) presente en el sobrenadan
É l
54
producción de NO• por las células RAW infectadas con T. cruzi y tratadas con las
concentraciones más bajas de ASA (0,05 y 0,1 mM) es significativamente menor que la
cantidad de NO• producida por el control no infectado (p<0,001). Por otro lado,
oncentraciones mayores de ASA (0,5 y 1 mM) logran aumentar la producción de NO• de
anera indirecta, se utilizó como
ibidor de la óxido nítrico sintasa, aminoguanidina (AMG 5 mM) (Southan
inhibidor de la síntesis de NO•, el cual a una concentración de 1 mM revirtió parcialmente
c
forma significativa, al ser comparada con el control infectado (p<0,001), pero sin
diferencia respecto a la producción de óxido nítrico en células sanas (Figura 15B). En la
figura 15B se puede apreciar además que el aumento de la síntesis de NO• sigue un
patrón comparable a la inhibición de la liberación de tripomastigotes al medio de
cultivo, dando una primera aproximación que ambos fenómenos estarían relacionados.
Dado que la medición de NO• se hace de m
control un inh
and Szabo 1996). Al administrar este inhibidor la síntesis de NO• aumentada por ASA se
revirtió a niveles basales, demostrando que el nivel de nitrito detectado anteriormente
corresponde a un aumento de la síntesis de NO• (figura 16A).
Utilizando la misma concentración de aminoguanidina capaz de llevar al mínimo
la síntesis de NO• (5 mM), se estudió el efecto de la inhibición de la síntesis de NO• sobre
el efecto de ASA. Como se aprecia en la figura 16B, el grupo tratado con ASA (1 mM)
presenta una liberación de tripomastigotes de un 13,1 ± 3,9%, mientras que la adición
de 5 mM de AMG disminuye ese efecto, aumentando la liberación de tripomastigotes a
un 46,9 ± 7,4%. De manera similar se ocupó Nω-arginina metil ester (L-NAME) como
55
el efecto de ASA, llevando la liberación de tripomastigotes de un 22,3 ± 4,1% a un 39,6 ±
4,2% (p<0,05, figura 16C). El hecho que ambos inhibidores de la síntesis de NO•
disminuyeran el efecto de ASA nos que indica que NO• es un mediador en el efecto de
ASA; sin embargo, dado que la reversión no es completa no se puede atribuir
completamente a la síntesis de NO• el efecto apreciado al administrar ASA.
Por otro lado se utilizó un dador de óxido nítrico, NOC-18 ((Z)-1-[2-(2-aminoetil)-
N-(2-amonioetil)amino]diazon-1-io-1,2-diolato, Sigma, USA), para comprobar que el
aumento del NO• es capaz de disminuir la infección en macrófagos. NOC-18 en un
zwitterión que libera NO• de forma espontánea en solución, con una vida media de 3.400
minuto
concentraciones de NOC-
18. NOC-18 a 10 μM produjo una liberación de un 93,2 ± 9,6%, sin diferencia
signific
s a pH 7,4 (Hrabie, Klose et al. 1993). NOC-18 generó cantidades estables de NO•
que fueron determinadas indirectamente mediante la reacción de Griess. A
concentraciones de 10 y 50 μM de NOC-18 se observaron niveles de nitrito de 9,3 ± 0,4 y
38,1 ± 10,9 μM, respectivamente (Figura 17A). Como se muestra en la figura 17B, se
midió también la liberación de tripomastigotes a las mismas
ativa respecto al control infectado (95 ± 20,2%), mientras que una concentración
de 50 μM de NOC-18 redujo la liberación de tripomastigotes a un 49,1 ± 12,5% (p<0,001
respecto al control infectado). Este resultado nos indica que efectivamente el NO•
participa en la muerte parasitaria y podría ser entonces un mediador relacionado con el
efecto de ASA sobre macrófagos infectados con T. cruzi.
56
infectadas por T. cruzi. Células RAW 264.7 fueron infectadas con T. cruzi y se midió la
concentración de nitritos en el sobrenadante indirectamente mediante la reacción de Griess. A.
Producción de nitritos en el tiempo, expresadas como porcentaje del control (células RAW no
tripomastigotes al medio de cultivo (barras negras) y la producción de nitritos a las 72 horas
(barras blancas). Todos los resultados están expresados como promedio ± DS de tres
al control infectado.
Figura 15. Ácido acetilsalicílico aumenta la producción de óxido nítrico en células
infectadas). B. Efecto de ácido acetilsalicílico a concentraciones crecientes sobre la liberación de
experimentos independientes. §: p<0,001 respecto al control no infectado; ‡: p<0,001 respecto
57
Figura 16. El efecto de ácido acetilsalicílico
está relacionado con la síntesis de óxido
nítrico. (A) Determinación de los niveles de
nitrito en macrófagos sanos (RAW) e infectados
(RAW + T. cruzi) y tratados con ácido
acetilsalicílico (ASA) 1 mM. La determinación se
realizó 72 horas post-infección. §: p<0,01
respecto al control sano; ‡: p<0,05 respecto al
control infectado; ¶: p<0,05 respecto a células
infectadas y tratadas con ASA. (B) Liberación de
tripomastigotes al medio de cultivo en células
RAW infectadas con T. cruzi (clon Dm28) y
medio de cultivo en células RAW infectadas con
mM. ns: no significativo; *: p<0,05; **: p<0,01.
tratadas con ácido acetilsalicílico (ASA) 1 mM y
aminoguanidina (AMG) a concentraciones de 1
y 5 mM. (C) Liberación de tripomastigotes al
T. cruzi (clon Dm28) y tratadas con ácido
acetilsalicílico (ASA) 1 mM y Nω-arginina metil
ester (L-NAME) a concentraciones de 0,1 y 1
58
Figura 17. Óxido nítrico está relacionado con l
Células RAW 264.7 fueron infectadas con T. cru
concentraciones de 10 y 50 μM, a las 72 horas d
nitrito en el sobrenadante y (B) la liberación de
resultados están expresados como promedio ± D
significativo; ***: p<0,001
a disminución de la infección en macrófagos.
zi (clon Dm28) y fueron expuestas a NOC-18 a
e tratamiento de determinaron (A) niveles de
tripomastigotes al medio de cultivo. Todos los
S de dos experimentos independientes. ns: no
59
Ácido acetilsalicílico no afecta los niveles de poliaminas en macrófagos infectados
con T. cruzi.
En diversos estudios se ha descrito que el aumento de la síntesis de PGE2
contribuye a la activación alternativa de macrófagos, caracterizada por un aumento de
la actividad de arginasas como ornitina decarboxilasa (ODC) y arginina decarboxilasa
(ADC), enzimas claves en la síntesis de poliaminas (Corraliza, Soler et al. 1995; Freire-de-
Lima, Nascimento et al. 2000). Estas poliaminas, fundamentalmente putrescina, son
utilizadas por T. cruzi para sintetizar tripanotión (T(SH)2) (Peluffo, Piacenza et al. 2004). El
uso de inhibidores de la COX ha demostrado disminuir la actividad de ODC
específicamente en macrófagos infectados con T. cruzi, estimulados además con cuerpos
poptóticos (Freire-de-Lima, Nascimento et al. 2000). Como ya se comentó, T. cruzi es
La figura 18 muestra el efecto de la infección por T. cruzi sobre los niveles de las
poliaminas (putrescina, espermina y espermidina) en macrófagos infectados; además se
muestra el efecto de ASA 1 mM sobre los niveles de estas poliaminas a las 72 horas post-
infección. Sorpresivamente, la infección por T. cruzi no mostró un aumento significativo
a
capaz per se de estimular vías de señalización características de la fagocitosis de cuerpos
apoptóticos, incluyendo la síntesis de PGE2 (figura 13); por lo tanto T. cruzi podría inducir
la actividad de arginasas, produciendo un aumento en los niveles de poliaminas, lo que
podría ser revertido por inhibidores de la COX como ASA.
60
de ninguna de las poliaminas determinadas (putrescina, espermidina y espermina). De la
misma manera, el tratamiento con ASA 1 mM no mostró una disminución de la síntesis
las tres poliaminas estudiadas.
de ninguna de
61
Figura 18. Ácido acetilsalicílico no afecta los
niveles de poliaminas en macrófagos
T. cruzi. Células RAW 264.7
fueron infectadas con tripomastigotes de T. cruzi
clon Dm28 y tratados con ASA 1 mM por 72 horas,
luego se determinó los niveles intracelulares de
poliaminas. (A) Efecto de ASA sobre los niveles de
putrescina. (B) Efecto de ASA sobre los niveles de
espermidina. (C) Efecto de ASA sobre los niveles
de espermina. Los resultados son expresados
como el promedio ± DS de tres experimentos
independientes.
infectados con
62
DISCUSIÓN
Algunos estudios previos han reportado el efecto de inhibidores de la COX, como
ASA, en algunos modelos in vitro e in vivo de infección por T. cruzi. Sin embargo no
existen estudios sistemáticos acerca d
mecanismos que subyacen al efecto de AS
(Freire-de-Lima, Nascimento et al. 2000; Michelin, Silva et al. 2005; Paiva, Arras et al.
2007; Hideko Tatakihara, Cecchini et al. 200
En este modelo de estudio se enco
en macrófagos infectados con T. cruzi (figu
de magnitud más alta que la encontrada p SA no
tiene una gran capacidad tripanocida en sí, pero si es un potencial coadyuvante en la
terapia con las drogas antichagásicas NFX y BZL. Cabe destacar los baj s valores de IC50
encontrados en nuestro modelo para NFX (0,083 μM) y BZL (0,336 μM). Sin embargo,
esto puede deberse a la baja densidad de parásitos usada en los experimentos. En
reportes anteriores, donde se analiza el efecto de NFX y BZL sobre células VERO
infectadas con T. cruzi (Faundez, Pino et al. 2005), se encontró que 1 μM de ambas
drogas no fue capaz de disminuir al 50% la infección, indicando que en ese modelo
celular el valor de IC50 debiera estar por sobre 1 μM, un orden de magnitud por sobre los
valores reportados en esta tesis; sin embargo, en dichos experimentos la densidad de
e la relación dosis-respuesta, ni de los
A sobre la proliferación intracelular de T. cruzi
8).
ntró que ASA tiene un IC50 de 313,1 ± 36,0 μM
ra 8A, tabla 1), concentración varios órdenes
ara NFX y BZL, lo que corrobora que A
o
63
parásitos fue también un orden de ayor, lo que podría explicar esta
iferencia.
50
ncia significativa respecto a los valores
eóricos calculados (Tabla 1). De forma recíproca, el IC50 de ASA disminuyó en presencia
de NFX o BZL (Figuras 8A, 9A y tabla 1). Ambos resultados demuestran un efecto
sinérgico entre ASA y las drogas antichagásicas en nuestro modelo in vitro de infección.
Sin embargo, el efecto sinérgico observado no está relacionado a un efecto directo de
ambas drogas sobre un mismo parámetro (por ejemplo, la viabilidad del parásito). En
este caso, el efecto de ASA sobre el macrófago combinado con el efecto de las drogas
antichagásicas sobre el parásito dan cuenta del sinergismo detectado en el análisis
isobolográfico. Este concepto está de acuerdo con los mecanismos de sinergismo
reportados para otras combinaciones de fármacos (Jia, Zhu et al. 2009).
50
magnitud m
d
Por otra parte, se analizó el efecto sinérgico entre el ASA y las drogas
antichagásicas a través de la elaboración de isobologramas. Con este tipo de análisis
comprobamos que ASA aumenta el efecto de NFX y BZL en macrófagos infectados con
T. cruzi, llegando a reducir el IC NFX en un 72.% (figura 8B, tabla 1) y de benzdidazol en
un 62% (Figura 9B, tabla 1), con una difere
t
Llama la atención las concentraciones de ASA a las cuales se observó un efecto
terapéutico (IC = 313 μM). Por un lado estas concentraciones son muy altas
comparadas con las de NFX y BZL, lo que reafirma la idea que ASA no tiene utilidad
64
como antichagásico por sí sólo, sino que sólo sería útil en la eventual combinación con
las drogas antichagásicas conocidas. Pero por otro lado las concentraciones utilizadas en
estos experimentos (50 μM a 1 mM), se encuentran por debajo de la concentración en
estado estacionario reportada en humanos tratados con aspirina a altas dosis. La
). La inhibición
máxima de la síntesis de PGE2 se alcanza a una concentración aproximada de 0,15 mM
(figura 13A), concentración a la cual no hay efecto significativo en la liberación de
tripomastigotes. Por otra parte, no
2
2 2
literatura reporta concentraciones en estado estacionario (Cee) entre 1,1 a 2,2 mM
después de la administración de 3-4 g/día (Keystone, Paton et al. 1982; Anderson,
Knoben et al. 2002).
La producción de PGE2 aumenta significativamente en macrófagos infectados
con T. cruzi, comparado con macrófagos sanos, de la misma forma que en células
infectadas con T. cruzi y estimuladas con cuerpos apoptóticos (Freire-de-Lima,
Nascimento et al. 2000). Por lo tanto, la inhibición de la síntesis de PGE2 usando ASA
puede mejorar la respuesta del macrófago contra la infección por T. cruzi. En efecto, ASA
reduce los niveles de PGE2 de manera concentración-dependiente. Una extrapolación a
partir de los datos experimentales entrega un IC50 aproximado de 7,7 μM. Este valor es
aproximadamente 40 veces menor que el IC50 observado para la disminución de
tripomastigotes al medio de cultivo en un modelo similar (IC50 = 313 μM
existe evidencia suficiente que fundamente la idea
que PGE pueda incrementar la infección por T. cruzi. En base a esto, se determinó si
PGE está involucrado en el efecto de ASA sobre macrófagos infectados. Al agregar PGE
65
de manera exógena, no se apreció reversión del efecto inhibitorio sobre la liberación de
tripomastigotes, inclusive a concentraciones tan altas de PGE2 como 1 mM (figura 13B),
indicando que PGE2 no tendría un rol principal en el efecto de ASA. Sin embargo, el
efecto inhibitorio sobre la liberación de tripomastigotes de otros inhibidores de COX,
indometacina y meloxicam, con IC50 de 97,6 ± 11,1 y 42,7 ± 0,36, respectivamente (figura
14), sugiere fuertemente que la actividad de COX tiene un rol importante en el proceso
de proliferación de los parásitos intracelulares, siendo la inhibición de esta enzima un
mecanismo involucrado en el efecto de ASA. Si bien PGE2 no pareciera estar
involucrada en este mecanismo, podrían existir otras prostaglandinas que afecten la
proliferació
2 2 2
2
2
2
2
n intracelular parasitaria. Cardoni y cols (2004) mostraron que la infección
por T. cruzi en ratones produce un aumento en los niveles plasmáticos de otros
metabolitos de la COX como prostaciclina (PGI ) y tromboxano A (TXA ) (Cardoni and
Antunez, 2004). En el caso del TXA , se ha reportado que T. cruzi es capaz de sintetizarlo,
y que además juega un rol clave en la mantención de la homeostasis y la sobrevida del
hospedero. En efecto, los altos niveles de TXA detectados en ratones infectados son
atribuibles a la síntesis parasitaria más que a la síntesis del hospedero (Ashton,
Mukherjee et al. 2007). Si bien el T. cruzi posee una enzima que es capaz de sintetizar
este eicosanoide, se desconoce si esta enzima puede ser inhibida por ASA, por lo que
parte del efecto de ASA podría ser atribuible a la disminución del TXA parasitario.
Respecto a PGI , su rol en el proceso infeccioso aún permanece sin dilucidar. También se
ha detectado la producción parasitaria de PGF2α, a través de una enzima denominada
old yellow enzyme (TcOYE), enzima también involucrada en el metabolismo y activación
de los fármacos antichagásicos NFX y BZL; sin embargo, esta enzima no es inhibible por
66
inhibidores de la ciclooxigenasa (Kubata, Kabututu et al. 2002), por lo que, aunque exista
un rol importante de la PGF2α producida por el parasito en la infección, no se puede
atribuir el efecto de ASA a la inhibición de su síntesis.
El hecho que otros inhibidores de la COX como meloxicam o indometacina
tuvieran un efecto similar al de ASA, inclusive con IC50 menores (figura 14) podría sugerir
el uso de estos inhibidores en combinación con NFX o BZL. Sin embargo, indometacina
es un AINE asociado a daño gástrico (Pusztaszeri, Genta et al. 2007) y a aumento del
riesgo cardiovascular (McGettigan and Henry 2006), lo que descartaría su posibilidad de
ser usado como agente terapéutico en la enfermedad de Chagas. Por otra parte, si bien
no existe evidencia que asocie el uso de meloxicam a daño cardiovascular, recientes
estudios de meta análisis no han podido descartar esta posibilidad (McGettigan and
Henry 2006; Chen, Jobanputra et al. 2008).
•
En macrófagos infectados con T. cruzi, expuestos además a células apoptóticas, se
ha demostrado incremento de los niveles de TGF- β, PGE2 y disminución de NO . Es
importante destacar que los experimentos mostrados en esta tesis fueron hechos en
ausencia de células apoptóticas, indicando que T. cruzi es capaz per se de inhibir la
respuesta inflamatoria del macrófago, simulando la interacción con cuerpos
apoptóticos, posiblemente a través de la interacción entre proteínas como calreticulina
de T. cruzi y la proteína del complemento C1q (Ferreira, Molina et al. 2004; Ferreira, Valck
67
et al. 2004). Esta asociación es posible dado que en los experimentos presentados se
utilizó suero fetal bovino sin inactivar, es decir, con proteínas del complemento.
Previamente se ha reportado que T. cruzi es capaz de unirse a C1q humano, lo cual
aumenta la infección en modelos de infección de macrófagos aislados (Rimoldi, Tenner
et al. 1989).
s niveles de NO• en células infectadas, efecto
cida del macrófago inducida por ASA
(figuras 15 y 16); sin embargo, el aumento de la síntesis de NO• no se relaciona con una
disminución de los ni
En macrófagos infectados con T. cruzi, se ha relacionado el aumento en la síntesis
de PGE2 con la disminución de la actividad de ornitina decarboxilasa (ODC), enzima clave
en la síntesis de poliaminas a partir de L-arginina, por parte del hospedero mamífero
(Freire-de-Lima, et al., 2000). Dado que L-arginina es sustrato para la síntesis de
poliaminas y de óxido nítrico, la inhibición de esta enzima podría disminuir los niveles de
poliaminas y aumentar la disponibilidad de sustrato para la síntesis de NO•. En la figura 4
se aprecia que ASA es capaz de aumentar lo
que es determinante en la capacidad tripano
veles de poliaminas (figura 18), por lo que la disminución de la
actividad de ODC no daría cuenta del efecto apreciado para ASA en nuestro modelo de
infección. Dado que la síntesis de poliaminas a partir de L-arginina tiene como
intermediario a la ornitina, que luego es transformada en putrescina por la ornitina
descarboxilasa (ODC), no se descarta que exista una acumulación de ornitina, dado que
está descrito el aumento en la expresión de Arginasa I en macrófagos de ratones
infectados por T. cruzi (Cuervo, Pineda et al. 2008). No obstante, el sustrato útil para el
68
parásito es el producto final, putrescina, ya que no existen actividades metabólicas en el
parásito que utilicen ornitina como sustrato.
La síntesis de poliaminas por parte de
T. cruzi ha sido materia de discusión por
años. Por una parte Schwarcz de Tarlovsky y cols. han reportado que epimastigotes de
T. cruzi producen agmatina y poliaminas, y han detectado una pequeña actividad
arginina decarboxilasa (ADC), inhibible por difluorometil arginina (DFMA) (Schwarcz de
Tarlovsky, Hernandez et al. 1993; Hernandez and Schwarcz de Tarlovsky 1999). Estos
experimentos van acorde con lo propuesto por Piacenza y cols., quienes proponen que
la síntesis de poliaminas por T. cruzi puede ser un factor importante en la defensa
antiradicalaria del parásito (Piacenza, Peluffo et al. 2001). Sin embargo, otros
investigadores no han sido capaces de detectar actividad ADC en T. cruzi, ni poliaminas
derivadas de esta actividad, proponiendo que el pool de poliaminas con que cuenta el
tripanosoma proviene únicamente del medio externo, ingresando al parásito por
transportadores específicos que ya han sido descritos (Le Quesne and Fairlamb 1996;
Ariyanayagam and Fairlamb 1997; Carrillo, Cejas et al. 2003). De todas maneras, ni la
infección por T. cruzi ni el tratamiento con ASA 1 mM generó cambios significativos en
los niveles de las poliaminas estudiadas, por lo que la participación de las poliaminas en
nuestro modelo no es factible, ya que el parásito tiene actividad enzimática suficiente
para suplir sus necesidades de poliaminas, o los niveles de poliaminas en el macrófago
son lo suficientemente grandes para no verse alterados ante cambios en la actividad de
ODC.
69
Finalmente, cabe mencionar que inhibidores de la ciclooxigenasa como el ASA
han sido utilizados por mucho tiempo con otros fines, por lo que sus perfiles
toxicológicos son muy bien conocidos, lo que genera un ventaja al probar fármacos ya
en uso en la terapéutica, respecto al desarrollo de nuevas moléculas que deben ser
sometidas a las sucesivas fases de desarrollo de fármacos.
70
CONCLUSIONES
El ácido acetilsalicílico (ASA) disminuye la infección por T. cruzi en macrófagos
RAW 264.7. Si bien PGE disminuye al agregar ASA, esta disminución parece no tener
relación con la acción sobre la liberación de tripomastigotes al sobrenadante desde los
macrófagos infectados. Sin embargo la inhibición de la actividad de COX podría ser un
proceso importante en la actividad de ASA. Por otra parte, el mecanismo por el cual el
SA ejerce su efecto también estaría mediado, al menos en parte, por el aumento de la
El ácido acetilsalicílico tiene efecto sinérgico al ser combinado con las drogas
antichagásicas nifurtimox y benznidazol. Este efecto observado en un modelo de
infección in vitro proporciona las bases para el estudio de una terapia combinada in vivo
que permita reducir las dosis de nifurtimox y benznidazol sin perder efectividad
terapéutica. De esta manera, la hipótesis propuesta en esta tesis se encuentra
comprobada.
2
A
síntesis de óxido nítrico.
71
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