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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANADIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD-
IZTAPALAPA
INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL
PRESENTADO POR:
José Rodolfo Mora Linares
Teléfono: 57-51-66-71
Matrícula: 88227661
Licenciatura en Biología Experimental
Título del Proyecto:Detección y Evaluación de las Propiedades Hematopoyéticas de
Plantago major L in vitro.
Clave de registro del Servicio Social: BE.009.97
Directores:M. en B. E. Rodolfo Velasco Lezama. Profesor Titular "C" de T. C.
Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar. Profesor Titular "B" de T. C.
Lugar de Realización: Laboratorio de Hematología Experimental
del Departamento de Ciencias de la Salud.
Fecha de terminación: 19 de Diciembre de 1997.Alumno
José Rodolfo Mora Linares
Director Directora
M. en B. E. Rodolfo Velasco Lezama Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar
2
CONTENIDO PAG.
RESUMEN 3
INTRODUCCIÓN 5
JUSTIFICACIÓN 12
NATURALEZA DEL PROYECTO 14
HIPÓTESIS 15
OBJETIVO GENERAL 16
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 16
MATERIAL Y MÉTODOS 17
RESULTADOS 21
DISCUSIÓN 32
CONCLUSIONES 34
BIBLIOGRAFÍA. 35
Nombre: José Rodolfo Mora Linares.
Matrícula: 88227661.
3
Licenciatura: Biología Experimental.
Título del Trabajo: Detección y Evaluación de las propiedades
Hematopoyéticas de Plantago major L in vitro.
Clave de registro del Servicio Social: BE.009.97
Fecha de entrega: 13 febrero de 2003.
M. en B. E. Rodolfo Velasco Lezama. Profesor Titular "C" de T.C.
Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar. Profesor Titular "B" de T.C.
RESUMEN
En la medicina tradicional mexicana se recomienda el empleo de las
partes aéreas de Plantago major L (Plantaginaceae), para el tratamiento de
cáncer (leucemia), heridas, llagas, anemia. En Asia se utiliza la raíz para el
tratamiento del cáncer. Considerando el uso de la planta contra la anemia,
en el presente trabajo se evaluó el efecto de las estructuras de Plantago
major L. sobre la proliferación de células hematopoyéticas de la médula ósea
y de bazo de ratón in vitro.
Se obtuvieron los extractos acuoso y metanólico de las espigas, hojas.
raíz y partes aéreas de la planta: Se prepararon disoluciones con 0.4, 0.2,
0.1 y 0.05 g/mL de los extractos en medio de Leibovitz (L-15) , se
adicionaron a cultivos de células de médula ósea o de bazo de ratón, de 8 a
12 semanas de edad. Los cultivos se incubaron 72 y 48 horas
respectivamente a 37°C y con humedad relativa de 90% y 5 % de CO2.
4
Simultáneamente, se prepara-ron cultivos testigos libres de extracto. Las
células se cosecharon, lavaron y contaron en cámara cuentaglóbulos.
El extracto acuoso de la espiga, hoja, raíz o de las estructuras aéreas
por separado, aparentemente estimularon la proliferación de las células en
cultivo. Sin embargo, debido a la amplia dispersión de la desviación
estándar, los incrementos no fueron estadísticamente significativos, Gráficas
1 a 5. El extracto metanólico de las estructuras aéreas a las concentraciones
de 0.4 y 0.2 g/mL incrementó la cuenta de células de médula ósea, Gráficas
6,7 y 8. Con la hoja los incrementos en la cuenta celular fueron de 31 y 5
veces, respectivamente, Gráficas 9 a 10. Se observó una relación directa
entre concentración del extracto y capacidad estimulante de la proliferación
celular, se observaron diferencias estadísticamente significativas las
diferentes concentraciones de los extractos. Ninguno de los extractos
ensayados estimuló la proliferación de células de bazo en cultivo. Gráficas
11 a 15.
La concentración de 0.4 g/mL del extracto metanólico de la hoja presentó la
mayor actividad hematopoyética. Queda por conocerse: El tipo y estado de
maduración de las células mieloides estimuladas. El extracto metanólico
podría servir como fuente para la obtención y caracterización de principios
activos de utilidad en el tratamiento de diferentes tipos de anemias.
5
INTRODUCCIÓN
La hematopoyesis es el proceso dinámico de producción y desarrollo
de las células sanguíneas a partir de un grupo de células precursoras toti-
potenciales (stem), que se encuentran en la médula ósea y que bajo la
influencia de sustancias humorales como las citocinas y el microambiente, se
diferencian y dan origen a las líneas de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.
Las células madre hematopoyéticas (stem) hacen su primera aparición
en el saco vitelino del embrión humano, migran después al hígado del feto,
donde aumenta el número de líneas celulares que se producen.
Posteriormente, la hematopoyesis se desplaza al bazo y finalmente a la
médula ósea, lugar que se mantiene como sitio único de producción de
sangre a lo largo de la vida del individuo (Golde, 1992).
Existen varios tipos de células madre (tallo) con diferentes capacida-
des de replicación y diferenciación, de esta manera unas células pueden
replicarse ampliamente y en contrapartida poseer capacidad limitada para la
diferenciación. El principal miembro de este conjunto es la célula madre
totipotencial; la cual es la base para la renovación de los sistemas hemato-
poyético e inmune (Golde, 1985, Iscove, 1990).
Como es conocido, la sangre humana consta de elementos plasmá-
ticos y celulares que en conjunto cumplen las funciones siguientes:
1. Transporte de oxígeno de los pulmones a los tejidos y CO2 de los tejidos a
los pulmones.
6
2. Nutrición: Transporte de los materiales alimenticios.
3. Excreción: Transporte del gasto metabólico a riñones, pulmones, piel o
intestino para renovación o eliminación.
4. Mantenimiento del equilibrio ácido-base corporal.
5. Regulación del balance de agua.
6. Regulación de la temperatura corporal.
7. Defensa celular y humoral ante agentes infecciosos o antigénicos.
8. Regulación del metabolismo a través del transporte de
metabolitos (McKensey, 2000).
Entre los principales elementos formes de la sangre se encuentran
los
eritrocitos, leucocitos y plaquetas.
ERITROCITOS:
La función primaria de los eritrocitos es llevar el oxígeno desde los
pulmones a los tejidos y devolver el CO2 de los tejidos a los pulmones para
su eliminación mediante la hemoglobina, por medio de la actividad de la
enzima anhidrasa carbónica, la cual al acelerar la reacción entre bióxido de
carbono y el agua permite la absorción de grandes cantidades de bióxido de
carbono en la sangre, de esta manera los eritrocitos contribuyen a mantener
el equilibrio ácido-base del organismo (Hoffbrand y Pettit, 1993).
H2O + CO2 H2CO3
7
LEUCOCITOS:
Los leucocitos están distribuidos en neutrófilos, eosinófilos, basófilos,
monocitos y linfocitos. Los nombres de los tres primeros reflejan su afinidad
ante los colorantes de Romanowsky. Los monocitos y linfocitos son células
mononucleares. los monocitos son fagocíticos, se transforman en macrófa-
gos y se localizan en los tejidos.
LINFOCITOS:
Son células de gran importancia para la inmunidad humoral y celular,
se desarrollan en los ganglios linfáticos, bazo, timo, amígdalas y tejido
linfoide del intestino, los linfocitos junto con los neutrófilos comprenden la
mayor parte de los leucocitos en la sangre. En la inmunidad celular los
linfocitos derivados del timo, esto es los T sensibilizados se unen a
antígenos heterólogos específicos y los destruyen. La inmunidad humoral
implica la producción de anticuerpos circulantes por parte de los linfocitos B
(Lee, 1995).
PLAQUETAS:
Los trombocitos o plaquetas se derivan de los megacariocitos de la
médula ósea, protegen las superficies vasculares al presentarse una lesión
el vaso sanguíneo se contrae, por lo que disminuye el paso sangre a través
de él, en seguida las plaquetas se adhieren a la colágena del endotelio del
vaso dañado, liberan adenosina difosfato (ADP), trombina y serotonina, cuyo
papel es reforzar la agregación de las plaquetas hasta llegar a la formación
8
de un trombo plaquetario, el cual detiene momentáneamente la pérdida de
sangre, mismo que es reforzado simultáneamente y substituido por la
formación de fibrina, posteriormente se inicia la reparación del sitio dañado
(Velasco, 1991).
La hematopoyesis puede ser modificada por agentes físicos, químicos
o infecciosos dando origen a distintas enfermedades hematológicas. Las
enfermedades de la sangre y de órganos hematopoyéticos pueden dividirse
en: Trastornos que afectan primariamente a los glóbulos rojos, leucocitos,
plaquetas, la coagulación sanguínea o bien alterar la producción de todas
las líneas celulares como en la anemia aplástica y los diferentes tipos de
leucemias.
Los agentes que causan aplasia medular o anemia aplástica pueden
ser agrupados en:
1) Los que regularmente producen lesión de la médula ósea si se dan en
dosis suficientes como:
Radiación (isótopos radiactivos), exposición a radiaciones de explosiones
nucleares, benceno, agentes quimioterapéuticos de procesos malignos.
2) Los que ocasionalmente se asocian con insuficiencia medular ósea:
Cloranfenicol, sulfamidas, quinacrina (Atebrina), fenilbutazona
(Butazolidina), trinitrotolueno, arsenobenzoles y preparados de oro.
De ellos, el Cloranfenicol es el agente que mas frecuentemente se ha
asociado con el desarrollo de aplasia de la médula ósea en los Estados
Unidos de América en los últimos años. Es posible que en nuestro país
donde no existe un control para el consumo de este antibiótico, la incidencia
de aplasia medular debido al cloranfenicol sea mayor que en los Estados
Unidos de América. En algunos pacientes la aplasia medular puede evolucio-
9
nar a leucemia, caracterizada por proliferación anormal en la médula ósea de
los precursores hematopoyéticos (Huff, 1989).
La aplasia medular puede presentarse a cualquier edad, pero con
mayor incidencia alrededor de los 30 años, con ligero predominio en el
varón, puede presentarse en forma insidiosa como anemia, neutropenia o
trombo-citopenia. El paciente puede presentar hematomas, epistaxis,
gingivorragias, púrpura cutánea, sangrados a nivel digestivo, urinario,
muscular y del sistema nervioso central, siendo éste último el de mayor
gravedad y el que más frecuentemente acaba con la vida del paciente. Como
consecuencia de la leucopenia (neutropenia), los pacientes presentan
infecciones en la faringe, pulmones, recto, vías urinarias y piel, causadas
principalmente por bacterias gram negativas y hongos oportunistas. Con el
propósito de restablecer la hematopoyesis, en la medicina moderna se
centra en tres objetivos principales:
1. Identificación, evaluación y eliminación de los agentes etiológicos.
2. Terapia de apoyo mediante transfusión de paquetes de sangre total o de
concentrados celulares específicos, este tratamiento no es curativo, pero
permite al paciente atacar las infecciones y evitar los sangrados que
podrían incluso causarle la muerte. Esta terapia tiene efectos
secundarios, ya que el sistema inmune del paciente se sensibiliza y
después de varias transfusiones puede presentar rechazo inmunológico a
las células transfundidas o de éstas a las del paciente.
3. Restauración de la hematopoyesis normal mediante el tratamiento con
Globulina anti-linfocito (GAL), ciclosporina, glucocorticoides, andrógenos,
factores de crecimiento hematopoyético (Factor estimulante de colonias
de granulocitos-macrófagos -CSF-GM), interleucina 3. Ninguno de estos
tratamientos ofrece por sí solo una alternativa para la regeneración
definitiva de la hematopoyésis, por lo que en la mayoría de los casos se
emplea la combinación de medicamentos, con resultados alentadores,
10
pero con algunos efectos colaterales. En los casos de anemia aplástica
con mayor resistencia a los tratamientos se recurre a la esplenectomía,
quimioterapia, radioterapia y más reciente y exitosamente al transplante
de médula ósea (Morales et al., 1992).
Por su tecnología y costo el transplante de médula ósea no es accesible
para la mayoría de los enfermos., por lo que la anemia aplástica aún hoy en
nuestro país es causa de muerte en los adultos que la padecen. Es por ello
que la población mexicana utiliza plantas medicinales para el tratamiento de
ésta y de otras enfermedades hematológicas graves para las que la medicina
moderna no tiene tratamientos efectivos o accesibles.
En la literatura mexicana, existe información de plantas utilizadas para
curar enfermedades de la sangre entre las cuales destaca Plantago major,
(Llantén) planta originaria del norte de Europa y del centro de Asia. En
México tiene amplia distribución, se emplea también como desinflamatorio,
antipirético, antihelmíntico, astringente, vulnerario, cicatrizante y purificador
de la sangre. En otros países se usa contra el cáncer y principios de cáncer
(Argueta et al., 1994).
P. major crece en climas cálido, semicálido y templado, desde el nivel del
mar hasta los 3500 m. sobre el nivel del mar. Es una planta asociada a
terrenos de cultivo, bosques tropicales caducifolio, bosque espinoso, pastizal
y bosques mesófilo de montaña, de encino, de pino y mixto de pino-encino
(Samuelsen, 2000).
Esta planta es anual o perenne, alcanza los 10 a 30 cm de altura, con
pequeños camotes. Tiene las hojas en roseta que surgen desde el nivel del
suelo, envolviendo parte del tallo, el envés de la hoja es mas ancho que el
11
haz. Las flores son diminutas y de color blanco-verdosas, acomodadas en
una espiga larga, dando la apariencia de una mazorca delgada, las semillas
son de color café.
A nivel nacional, la mayoría de los usos reportados para el llantén
corresponden a padecimientos digestivos, sin embargo se pueden distinguir
de manera general, dos grupos de acuerdo a las propiedades que se le
atribuyan de manera explícita: en el primero desempeñando una acción
desinflamante y en el segundo, como analgésico. En el resto de los
padecimientos desempeñará una o más funciones (INI, 1999).
12
JUSTIFICACIÓN
Debido a que el sistema hematopoyético tiene recambio constante, es
susceptible de ser alterado en su funcionamiento por agentes físicos, quími-
cos o infecciosos, que producen síndromes hematológicos de pronóstico
favorable como las anemias regenerativas o enfermedades de pronóstico
fatal como la anemia aplástica y las leucemias.
Considerando que el hombre a lo largo de su vida se expone a
agentes tóxicos para la médula ósea, bien sea por contaminación del medio
ambiente con hidrocarburos (benceno y derivados), el consumo de frutas y
verduras contaminados en campos tratados con plaguicida (Mirsalis et.al.,
1990), el uso indiscriminado de antibióticos (cloranfenicol) y alimentos que
contienen colorantes y saborizantes artificiales, es posible que estos sean
causantes de las enfermedades de la sangre como anemia aplástica y
leucemia, cada vez más frecuentes en individuos jóvenes en edad
productiva.
Para el control de la anemia aplástica y de los diferentes tipos de
leucemia, la medicina moderna emplea la quimioterapia, radioterapia y más
recientemente al transplante de médula ósea de un donador externo o
transplante de células totipotenciales del paciente aisladas de su sangre,
clonadas in vitro y trasfundidas posteriormente a él (Morales et al., 1992).
Sin embargo, debido al alto costo, a los recursos técnicos y materiales
necesarios para un transplante este procedimiento en nuestro país es
prácticamente inaccesible para la mayoría de los pacientes, por lo que aún
hoy, la anemia aplástica es causa de muerte en los adultos que la padecen.
13
Por tal motivo, la población acude al empleo de plantas para contrarrestar o
controlar estas enfermedades.
En la literatura mexicana e internacional se recomienda la decocción
de Plantago major (llantén) para el tratamiento de estas enfermedades. En
México se utiliza esta planta contra diversas enfermedades. En Puebla,
Veracruz y Chiapas se recomienda la infusión de las partes aéreas contra la
anemia. Las hojas se aplican en forma de emplastos como cicatrizante y
vulnerario (Márquez et al., 1999). Por otra parte, en Filipinas se ingiere la
infusión de la raíz contra el cáncer y leucemia. Por tal motivo, con el
presente trabajo se intenta conocer experimentalmente las propiedades
hematopoyé-ticas de la planta y determinar su posible utilidad posterior en el
manejo de la anemia aplástica.
14
NATURALEZA DEL PROYECTO
El presente proyecto forma parte de la línea de investigación que
estudia los agentes fisicos, químicos y biológicos que modifican la hemato-
poyesis, particularmente la producción de megacariocitos y de plaquetas.
Este trabajo se ubica en el campo de la investigación en hematología
e intenta validar o contraponer experimentalmente el conocimiento popular
acerca de las propiedades curativas de Plantago major en el tratamiento de
enfermedades hematológicas. Inicialmente, determinando el efecto de los
extractos acuoso y metanólico de la planta sobre la proliferación in vitro de
células hematopoyéticas del bazo y de la médula ósea de ratones sanos y
con base en los resultados, determinar la actividad hematopoyética en
ratones sanos y en ratones con anemia aplástica inducida.
15
HIPÓTESIS
Dentro del campo de la medicina tradicional mexicana se utiliza la
infusión de Plantago major para el tratamiento de enfermedades hematoló-
gicas como leucemia y anemia aplástica, es posible que esta planta presente
componentes que estimulen y restauren la hematopoyésis normal, motivo por
el cual se justifique su utilización en el tratamiento de anemia aplástica.
Por otra parte, es posible que la planta contenga componentes
inhibidores de la proliferación de células transformadas, lo que explicaría
que sea utilizada en el tratamiento de leucemia y cáncer.
La adición de extractos de la planta completa o de sus diferentes
partes a cultivos de células de bazo y de médula ósea de ratón podrían
estimular la proliferación de ellas e incrementar la concentración celular,
respecto a cultivos testigos libres de extractos de la planta.
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OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto de los extractos acuoso y metanólico de Plantago
major sobre la proliferación in vitro de células del sistema hematopoyético de
ratones sanos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Obtener los extractos acuoso y metanólico de Plantago major.
2. Realizar una curva dosis-respuesta con extractos de la planta aplicados a
cultivos de células de bazo y de médula ósea de ratón.
3. Evaluar el efecto de los extractos acuoso y metanólico sobre la
proliferación in vitro de células de bazo y de médula ósea de ratones
sanos.
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MATERIAL Y MÉTODOS
MATERIAL BIOLÓGICO:
Ratones machos CD1 de 8 a 12 semanas de edad
Estructuras aéreas y raíz de Plantago major L.
SOLUCIONES, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO:
Medio alfa-MEM
Medio de Leibovitz.
Azul de tripan al 0.4%.
Solución salina fisiológica.
MATERIAL:
Material desechable de uso frecuente en laboratorios de cultivo de tejidos.
Pipeta de Thomas para: glóbulos rojos y glóbulos blancos.
Equipo de disección.
EQUIPO:
Incubadora con entrada para CO2 (National)
Campana de flujo laminar (Vecco).
Potenciómetro (Beckman).
Centrifuga para microhematocrito (Hermle).
Centrifuga (Solbat).
Cámaras de Neubauer (Boeco).
Microscopio óptico con contraste de fases (Carl Zeiss).
Espectrofotómetro (Perkin Elmer).
Balanza analítica (Ohaus).
Microscopio Invertido (Carl Zeiss).
Rotavapor (Büchii).
Balanza Analítica (Ohaus).
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OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS:
- La planta se dejó secar a temperatura ambiente protegida del polvo y
de la luz solar.
- Las partes aéreas (hojas y espigas) y la raíz se molieron con un
molino de mano para preparar extractos únicos o de mezclas de
estas estructuras.
- Se colocaron 500 gramos del material molido en un matraz balón, se
adicionaron 700 ml agua destilada y la mezcla se calentó a reflujo
durante 4 horas, el extracto se filtró, el solvente se evaporó hasta
sequedad total en baño maría.
- En el caso del extracto metanólico, primero se sometió a reflujo con
- hexano durante 4 horas, el molido se dejó secar a temperatura
- ambiente y después se repitió el procedimiento con metanol.
- Se prepararon disoluciones con 0.4, 0.2, 0.1 y 0.05 g/mL del extracto
- y se evaluó su efecto sobre la proliferación in vitro de células de
- médula ósea y de bazo de ratón.
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CULTIVO DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN
- Se sacrificó por dislocación cervical un ratón macho CD1 de 8 a 12
semanas de edad.
- Se aisló el fémur en condiciones de esterilidad, y se inyectó a través de
canal medular 1 ml de medio de Leibovitz (L-15) suplementado con 10%
de suero de caballo (Metcalf, 1975).
- La suspensión celular se diluyó 1:20 con disolución de Turk y se contaron
las células nucleadas totales en cámara cuenta-globulos al microscopio
de luz (Simmons, 1980).
- Se determinó la viabilidad celular con azul de tripan al 0.4% y se ajustó la
concentración a 2.0 X 105 células/mL (Hudson y Hay, 1980).
- Se colocó 0.1 ml de la suspensión celular en un sistema de cultivo con
0.8 g/mL de medio de Leibovitz con 10% de suero de caballo y 0.1 ml
del extracto de prueba.
- Se colocaron 0.5 ml de la mezcla anterior en placas Nunc de 1 cm2.
- Los cultivos se incubaron 72 horas a 37°C en humedad relativa de 90% y
5% de CO2 .
- Las células se recuperaron de las placas de cultivo, las cuales se lavaron
con 1 ml de medio de Leibovitz (L-15), todo el material se centrifugó a
2500 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente, se desechó el sobre
nadante, el botón celular se resuspendió en 0.5 ml de medio L-15 y se
contaron las células en un hemocitómetro, mediante microscopía de luz.
Simultáneamente se prepararon cultivos testigos libres de extracto. El
número de células en los cultivos testigos fue considerado como el 100%
de la proliferación celular y contra el se compararon las cuentas
obtenidas con los extracto de prueba.
20
CULTIVO DE BAZO DE RATÓN
- Se sacrificó un ratón macho CD1 de 8 a 12 semanas de edad por
dislocación cervical.
- Se aisló el bazo en condiciones de esterilidad, se dispersaron mecánica-
mente las células, se lavaron con 30 ml de medio Alfa-MEM frío con pH
7.2, se determinó la viabilidad celular con azul de tripan al 0.4% y se
ajustó la concentración a 2.0 X 106 células/mL en cámara cuenta-glóbulos
(Nakeff, 1981).
- Se cultivó un volumen de la suspensión celular con 8 volúmenes de
medio Alfa-MEM con suero de caballo al 10% y se adicionó 0.1 ml del
extracto de la prueba.
- Se colocaron 0.5 ml de la mezcla anterior en pozos de placas Nunc de 1
cm2 e incubaron durante 48 horas a 37°C en cámara con húmedad
relativa de 90% y 5% de CO2.
- Las células se recuperaron lavando las placas de cultivo con 1 ml de
medio Alfa MEM pH 7.2, la suspensión celular se centrifugó a 2500 rpm
durante 10 minutos a temperatura ambiente, se desechó el sobrenadante,
el botón celular se resuspendió en 0.5 ml de medio Alfa-MEM y se conta-
ron las células en un hemocitómetro mediante microscopía de luz.
Además, se prepararon cultivos testigos libres de extracto.
Análisis Estadístico
Los resultados se expresan como la media aritmética de los cultivos,
desviación estándar, error estándar y la prueba de t para pares de datos no
agrupados.
21
RESULTADOS
El extracto acuoso de las estructuras aéreas indujo de 2.76 a 4.30
incrementos en la concentración celular en cultivo de médula ósea de ratón, sin
embargo debido a la amplia dispersión en los valores de la desviación estándar,
dichos incrementos no fueron estadísticamente significativos. Gráfica 1.
Los extractos acuosos de la espiga, hoja o raíz no estimularon la prolifera-
ción de células en cultivo de médula ósea, debido a la amplia dispersión de la
desviación estándar los incrementos observados no presentaron significancia
estadística. Gráficas 2, 3, 4, y 5.
Por otra parte, los extractos metanólicos de las estructuras aéreas, espigas
y hojas, al ser empleados en las concentraciones de 0.4 y 0.2 g/mL al ser
ensayados en cultivos de médula ósea de ratón estimularon la proliferación
celular, causando incrementos significativos (p<0.02) en la concentración celular.
Gráficas 6, 7 y 8.
Con el extracto metanólico de la hoja se obtuvo la mayor actividad
estimulante de la proliferación celular, alcanzando los 31.34 incrementos en la
concentración celular respecto al cultivo testigo. Sin embargo la capacidad
disminuyó drásticamente al emplear la concentración 0.2 g/mL, alcanzando en
este caso incrementos de 5.24. Gráfica 9. En ambos casos los incrementos
fueron significativos estadísticamente con p<0.01. Gráfica 10.
22
Ninguna de las concentraciones empleadas, de los extractos acuoso o
metanólico estimuló la proliferación de células de bazo en cultivo, ya que no
obstante que provocaron incrementos en la concentración de las mismas, los
resultados presentaron amplia dispersión, por lo que no fueron estadísticamente
significativos. Gráficas 11 a 15.
EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN
In vitro
0
5
10
15
20
25
0
2
4
6
8
10
12
14
0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO
g/mL de Extracto
PARTES AERÉAS
Células X 105/mL
0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO
g/mL de Extracto
RAÍZ
Células X 105/mL
GRAFICA 6 GRAFICA 7
EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN
In vitroESPIGA
g/mL de Extracto g/mL de Extracto
Células X 105/mL Células X 105/mL
GRAFICA 8 GRAFICA 9
TESTIGO TESTIGO0.4 0.2 0.1 0.05 0.4 0.2 0.1 0.05
+* *
+ p < 0.02 Altamente significativa
**
* p < 0.05
No significativa
+ p < 0.02
Altamente significativa
0
10
20
30
40
50
60
0
5
10
15
20
25
+
*
*
* p < 0.05
No significativa
HOJA
+
27
EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN
In vitro
0
5
10
15
20
25
PARTES AERÉAS RAÍZ
g/mL de Extracto g/mL de Extracto
Células X 105/mL Células X 105/mL
GRAFICA 6 GRAFICA 7
TESTIGO TESTIGOO.4 0.2 0.1 0.05 0.4 0.2 0.1 0.05
+
+
+ p < 0.02
**
Altamente significativa
+
+ *
*
* p > 0.05* No significativa
0
2
4
6
8
10
12
14 + p < 0.02Altamente significativa
*p>0.05
No significativa
26
EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Plantago majorL. SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE MÉDULA ÓSEA DE
RATÓN In vitro
0
10
20
30
40
50
60
0
5
10
15
20
25
ESPIGA HOJA
Células X 105/mL Células X 105/mL
0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO
g/mL de Extracto g/mL de Extracto
GRAFICA 8 GRAFICA 9
EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE BAZO DE RATÓN In vitro
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
PARTES AÉREAS ESPIGA
Células X 105/mL Células X 105/mL
0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO
g/mL de Extracto g/mL de Extracto
GRAFICA 11 GRAFICA 12
**
*
*
*p>0.05
No significativa
*
*
*
*
*p>0.05
No significativa
29
EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Plantago major L.SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE BAZO DE RATÓN In vitro
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0
0.5
1
1.5
2
2.5
HOJA RAÍZ
Células X 105/mL Células X 105/mL
0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO
g/mL de Extracto g/mL de Extracto
GRAFICA 13 GRAFICA 14
*
*
*
*
*No significativa * *
* *
*No significativa
30
EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DEPlantago major L. SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE
MÉDULA ÓSEA DE RATÓN In vitro
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
HOJA RAÍZ
Células X 105/mL Células X 105/mL
0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO
g/mL de Extracto g/mL de Extracto
GRAFICA 3 GRAFICA 4
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.21.4
1.6
1.8* *
*
*
*No significativa *
* *
*
*No significativa
p>0.05, No significativa
24
EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DEPlantago major L. SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE
MÉDULA ÓSEA DE RATÓN In vitro
0
0.5
1
1.5
2
2.5
PARTES AÉREAS ESPIGA
0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO 0.4 0.2 0.1 0.05 TESTIGO
Células X 105/mL
g/mL de Extracto
Células X 105/mL
g/mL de Extracto
GRAFICA 1 GRAFICA 2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6*
*
*
*
*No signuficativa *
*
*
*
*No significativa
* P>0.05 No significativa
23
32
DISCUSIÓN
Plantago major es una de las plantas más estudiadas, se conocen gran
parte de sus componentes y la acción farmacológica de algunos de ellos. Sin
embargo, las partes aéreas en conjunto aún son empleadas en México para el
tratamiento de enfermedades o síndromes relacionados con procesos que
modifican la proliferación de las células de la médula ósea, no obstante en
nuestros días se desconoce su efecto sobre la proliferación de células del sistema
hematopoyético.
En los estudios fitoquímicos de la planta, se han detectado flavonoides,
plantaglucósidos y siringinina. Las semillas contienes taninos, dos alcaloides
monoterpénicos; la plantagonina y la indicaína (Samuelsen, 2000). Sin embargo,
en la literatura científica no existen reportes respecto a la actividad
hematopoyética de estos compuestos (NAPRALERT, 1998).
La capacidad del extracto metanólico de P. major para estimular la
proliferación de las células de médula ósea, pudiera estar relacionada con la
presencia de moléculas que actúan como mitógenos, actividad que se ha ligado
habitualmente a moléculas polipeptídicas como la fitohemaglutinina y el mitógeno
pokeweed, aislados de los extractos acuosos de Phaseolus vulgaris y Phytolacca
americana, respectivamente: Estas lectinas (mitógenos) son utilizadas en el cultivo
de células hematopoyéticas (Nakeff y Velasco, 1981). Sin embargo y aún
considerando la posible presencia de estas u otras glucoproteínas mitogénicas en
el extracto acuoso, el calentamiento prolongado podría haberlas desnaturalizado o
precipitado, provocando la pérdida de actividad mitogénica en los cultivos. La
actividad hematopoyetica obtenida con el extracto metanólico, es posiblemente
33
debida a moléculas que son producto del calentamiento de la planta y uque no se
encuentran en su forma natural.
Por otra parte, La actividad hematopoyética obtenida con el extracto
metanólico pudiera atribuirse a la presencia de moléculas termoestables como los
ácidos carboxílicos, palmítico, esterárico, linoléico y linolénico reportados en las
semillas de la planta (el material ensayado incluía las espigas con semillas). Se ha
demostrado que estos ácidos ayudan a restablecer la hematopoyesis en ratones
que han sido irradiados letalmente con rayos X (Miyanomae y Friendel, 1988).
En estudios químicos de la planta se ha demostrado la existencia de
adenina (Duke), además de alantoinas, ácido clorogénico (Duke), ácido ferúlico
(EMP), y sinigina (CNC), que aislados de otras plantas, se demostró tienen efecto
inmunoestimulante, por lo que se esperaba que los extractos obtenidos
estimularan la proliferación de células de médula ósea (precursoras de las células
linfoides) y particularmente las del bazo (linfocitos T y B). Sin embargo no fue así,
lo cual podría atribuirse a que en la mayoría de los casos, estos compuestos han
sido obtenidos de infusiones (tés) o macerados de la planta (reposo en agua y
temperatura ambiente por al menos 12 horas), mientras que en nuestro caso los
extractos se prepararon mediante calentamiento a ebullición (decocción), por lo
que de estar presentes los compuestos arriba mencionados, podrían haberse
descompuesto o transformado en productos secundarios, no estimulantes de la
hematopoyesis.
34
CONCLUSIONES
Bajo las condiciones experimentales seguidas en este trabajo, el extracto
metanólico de P. major estimuló la proliferación de células de la médula ósea, por
lo que podría ser utilizado como fuente de obtención y caracterización de princi.-
pios activos de utilidad en el tratamiento de diferentes tipos de anemia
La concentración 0.4 g/ml del extracto metanólico de la hoja presentó la
mayor actividad de todos los extractos ensayados, provocando que las células de
médula ósea incrementaran 32 veces su concentración en el cultivo.
El extracto metanólico de las partes aéreas de la planta (hojas y espigas) y
de las espigas presentaron menor actividad estimulante que el extracto de las
hojas, es posible que en forma natural, las espigas desempeñen un papel regula-
dor o antagonista de la actividad mitogénica de la hoja.
La actividad ampliamente mitogénica de la hoja, podría respaldar su uso
popular en forma de emplasto o fomento para cicatrizar heridas.
Queda por conocerse, el linaje y el grado de maduración de las células que
proliferan en presencia del extracto metanólico.
35
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