Utjecaj nedostatka Pax5 u B-ALLUvod Akutna limfoblastina/limfocitna leukemija nakupljanje maligno promijenjenih bijelih krvnih stanica u hematopoetskim organima i perifernoj krvi Najea maligna bolest kod djece (1:25 000) s 90% vjerojatnosti za izljeenjem B-ALL B-progenitorska akutna limfoblastina leukemija akumulacija nediferenciranih limfoblasta B u stadiju pre-B limfocita smanjena je koliina zrelih stanica Zbog istiskivanja drugih krvnih stanica umo, anemija, blijedilo, krvarenje desni, slabost, infekcije, krvarenja Subtipovi se dijele s obzirom na citogenetike promijene koje se dogaaju translokacije kromosoma koje dovode do fuzije onkoproteina ili cijepanja klastera gena U 2/3 sluajeva dolazi do loss-of-function mutacija ili delecija u genima za transkripcijske regulatore razvoja limfocita najvaniji je PAX5, ostali IKZF1, TCF3, EBF1... U 1/3 sluajeva dolazi do delecija, translokacija ili tokastih mutacija u genu PAX5 to onemoguuje pravilno vezanje proteina za DNA i regulaciju transkripcije PAX5 je gen iz PAX obitelji transkripcijskih faktora koji kodira za aktivacijski protein koji sudjeluje u ranoj diferencijaciji stanica B Nalazi se na 9. Kromosomu kod ljudi Sadri visokokonzerviranu DNA vezujuu domenu u obliku sparenih kutija (paired box) Vaan regulator u ranom razvoju sudjeluje u razvoju CNS-a i spermatogenezi Transkripcijski je aktivator gena specifinih za ranu proliferaciju i diferencijaciju stanica B loze i suprimira neke druge gene to omoguuje pravilno sazrijevanje limfocita B Tumor supresor - Utjecaj mutiranog PAX5 u mia s deficijentnim PAX5 diferencijacija stanica B loze u kotanoj sri je zaustavljena u ranom pro-B-limfocit stadiju U mia s null mutacijom pro-B stanica se moe razviti u razliite druge hematopoetske stanice ne-B linije Mutacija izaziva konstitutivno aktivan oblik STAT5 (signal transducer and activator of transcription 5 signalni aktivator i regulator transkripcije 5) protoonkogena STAT5 djeluje preko signalne kaskade koje ukljuuju JAK kinaze i aktivira transkripciju Kako gubitak funkcije Pax5 utjee na nastanak i odravanje leukemije? Hipomorfne mutacije u transkripcijskom faktoru PAX5 dovode do nastanka bolesti Pomou transgenih RNAi je reverzibilno suprimirana endogena ekspresija gena Pax5 u hematopoetskim tkivima mia zajedno s aktiviranim STAT5 inducira B-ALL Ponovna aktivacija endogene ekspresije PAX5 dovodi do uspostavljanja normalne transkripcije, sazrijevanje i diferencijaciju B-stanica te sprijeava nastanak i odravanje leukemije te njenog nestankaMetode i rezultati Utjecaj utiavanja gena Pax5 Inhibicija translacije Pax5 proteina na stanicama mia pomou shRNA in vitro shRNA vrsta RNAi - small/short hairpin RNA sekvenca koja stvara ukosnicu, a koristi se za utiavanje neke target mRNA te na taj nain sprijeava translaciju unosi se retroviralnim vektorima koji je eksprimiraju u stanici in vivo - u matine i progenitorske stanice fetalne jetre letalno ozraenih mieva je uneen LMP-shPax5 vektor koji koeksprimira GFP - kontrola je sadravala luciferazu (LMP-shLuc) kontrola je imala normalnu ekspresiju CD19 biljega (molekula na zrelim limfocitima B) i luciferaze transgenini mi s shPax5 je imao smanjenu ekspresiju GFP-a tj. manje CD19 biljega inhibicija Pax5 pomou shPax5 naruava normalnu diferencijaciju stanica B loze in vivo Reverzibilno utiavanje Pax5 Tetraciklin ovisna transkripcijska aktivacija metoda inducibilne genske ekspresije gdje se transkripcija pali i gasi s obzirom na prisustvo antibiotika tetraciklina RNAi regulirana tetraciklinima (doxycycline Dox) sadrava TRE ( promotor koji omoguuje ekspresiju RNAi, transaktivator koji aktivira TRE promotor i Dox koji kontrolira funkciju transaktivatora tako to ga inhibira + GFP TRE kontrolira koekspresiju Pax5 i GFP-a sastavili bitransgeninog mia krianjem s transgeninim miem koji sadrava Vav-tTA transaktivator kako bi se mogao prouavati uinak tetraciklina na bitransgeninog mia i ekspresiju Pax5 Kontrola je umjesto Pax5 sadravala Renilla luciferazu Rezultati su pokazali manju ekspresiju CD19 i GTP-a s obzirom na kontrolu Utiavanje Pax5 i konstitutivno aktivan STAT5 potiu leukemogenezu Stvaranje tritransgeninog mia koji ima Stat5b-CA koji je konstitutivno aktivan, ima shPax5 koji inhibira Pax5 i vav-tTA koji omoguuje reverzibilnu ekspresiju Tritransgenini mievi su potpuno obolili od B-ALL s medijanom latencije od 146 dana, dok je kontroli trebalo 345 dana Reaktivacija Pax5 gena dovodi do povlaenja B-ALL Transplatacija stanica leukemije iz tritransgeninog mia u Rag-/- mia koji je za 2 tjedna razvio agresivnu B-ALL s velikom koliinom WBC (peripheral white blood cells), poveanom slezenom i limfnim vorovima Dodatak Dox-a inhibira ekspresiju tTA smanjuje ekspresiju GFP-a = utiavanje transgena shPax5 normalna ekspresija Pax5 Za 18 dana su se mievi oporavili, znakovi bolesti su nestali Za odravanje leukemije in vivo potrebna je supresija Pax5 Reaktivacija Pax5 omoguava diferencijaciju u pre-B stadij limfocita Transplatirane leukemije su imale fenotip pre-B stadija CD19+Kit-CD25+IgM- (Kit tirozinska protein kinaza CD117) Nakon tretiranja mieva s Dox-om, nakon treeg dana je koliina malignih stanica poela padati do 18. Dana kada je bilo 10% takvih Tijekom normalnog razvitka B-stanica u kotanoj sri, pravilnim preslagivanjem Igh gena pre-B stanini receptor (pre-BCR) signal za klonalnu ekspanziju kojom nastaju small resting pre-B stanice koje sada sintetiziraju laki lanac IgM nastaju nezreli limfociti B koji imaju CD19+IgM+ (80% stanica nakon 15 dana) Reaktivacija Pax5 promovira rekombinaciju gena za laki lanac Igk i Igj i sintezu IgM karakteristinog za zrele stanice Takoer se smanjila ekspresija CD93 biljega koji je karakteristian za pro-B, pre-B i nezrele limfocite B Identifikacija gena reguliranih s Pax5 u B-ALL RNA sekvenciranje je otkrilo da su stanice leukemije iz netretiranog tritransgeninog mia imale 40% transkribirane Pax5 mRNA s obzirom na normalnu kotanu sr CD19+Kit-CD25+IgM- pre-B stanica Trodnevno tretiranje Dox-om je povealo ekspresiju Pax5 na vrijednosti skoro divljeg tipa te shodno tome povealo ekspresiju ostalih proteina 52% proteina je pod direktnom regulacijom Pax5 (koriteni za istraivanja s RNAi), dok je 45% bilo neosjetljivo na obnovu Pax5 Obnova Pax5 Omoguuje ponovno uspostavljanje normalne diferencijacije limfocita B Rag1 i Rag2 geni (rekombinacija V(J)D gena) su najosjetljiviji na obnavljanje funkcije Pax5 gena aktivni su tijekom rekombinacije Igh u pro-B stanicama i Igl/Igk u pre-B stanicama dok su izmeu za vrijeme proliferacije utiani U stanicama leukemije dok su stanice u proliferativno stadiju ekspresija Rag gena je vrlo mala, a kad doe do obnove Pax5 dolazi do poveane ekspresije Rag gena te se inhibira proliferativni potencijal stanica B-ALL Utiavanje gena potrebnih za replikaciju ukljuujui PCNA, polimeraze, komponente prereplikacijskog kompleksa Inducira komponente pre-BCR signalnog puta Sklapanje pre-BCR kompleksa dovodi do klonalne ekspanzije pre-BII stanica koje se sastoje od tekog lanca imunoglobulina i od lakih surogatnih lanaca kao i signalnih molekula CD79a i CD79b svi geni pojaavaju ekspresiju nakon obnove Pax5 Neki od induciranih gena: Plcgl, Syk, Lyn, Blnk, Btk smatraju se tumor supresorima nakon sto Pax5 izgubi funkciju Utjee na represiju Myc-a Protoonkogen koji aktivira proliferaciju, a utiava diferencijaciju tako to modulira ekspresiju tisue gena potreban za normalnu proliferaciju pre-B stanica Pri obnovi Pax5, Myc se utiava Ekspresija Myc kod netretiranih tritransgeninih mieva i normalnih pre-B stanica Onemoguava stvaranje B-ALL stanica Obnova Pax5 uzrokuje represiju replikacije DNA, te se naglo smanjuje udio proliferativnih ALL stanica Izolirane su ALL CD19 stanice netretirane i tretirane s Dox-om i uneene u mia koji je sekundarni recipijent kako bi testirali utiavanje proliferacije s obnovom Pax5 Sekundarni recipijenti koji su dobili netretirane stanice su vrlo brzo dobili leukemiju za razliku od mieva koji su dobili stanice tretirane Dox-om to dokazuje da obnova Pax5 u in vivo znaajno smanjuje leukemogeni potencijal stanica Ljudski Pax5 mutanti Sustav tet-on Pax5 ekspresije (dodatak Dox-a aktivira gen rtTA reverzni tet transaktivator) s GFP-om pod istim promotorom U stanicama s frameshift mutacijom pri ekspresiji Pax5 je dolo do redukcije iz velikih u male pre-B stanice, ekspresije markera povezanih s diferencijacijom poput CD19, a ekspresija markera poput CD38 koji se pojavljuju u progenitorskim stanicama je znaajno utiana Pri ekspresiji Pax5 je takoer dolo do ekspresije CD10 to je antigen ALL stanica Usporedbom rezultata RNA sekvenciranja mijih i ljudskih mRNA nali su slinosti u genima koji reguliraju preivljenje na periferiji i Ig povezan s diferencijacijomDiskusija Loss-of-function mutacije u Pax5 i povezanim transkripcijskim faktorima se pojavljuju u veini B-ALL koje onda karakterizira akumulacija visoko proliferativnih limfoblasta koji se ne mogu pravilno diferencirati U ovim pokusima se na mijim modelima pokualo dokazati da nepravilna aktivnost Pax5 utjee na blokiranje diferencijacije u B-ALL ime su se povezali genetske i fenotipske znaajke bolesti Takoer je dokazano da nedostatak Pax5 ne ujee samo na nastanak bolesti ve i na njeno odravanje tu pomau TCF3 i EBF1 koji su takoer vjerojatno inaktivirani u ALL Obnavljanje funkcije Pax5 u B-ALL in vivo trenutno utjee na diferencijaciju velikih pre-B stanica u male odmarajue pre-B stanice i zaustavlja proliferaciju utiavajui gene DNA replikacije i aktivirajui Rag gene za rekombinaciju i sintezu lanaca Ig omoguuje sazrijevanje stanica i regresiju B-ALL