MOLEKULARNA MOLEKULARNA TIPIZACIJA TIPIZACIJA LEUKEMIJELEUKEMIJEPRAČENJE MINIMUMA PRAČENJE MINIMUMA REZIDUALNE BOLESTIREZIDUALNE BOLESTI

GENI I EKSPRESIJA GENAGENI I EKSPRESIJA GENA

HROMOSOMSKE REGIJEHROMOSOMSKE REGIJE REPETITIVNE SEKVENCEREPETITIVNE SEKVENCE PROCES TRANSKRIPCIJE I RNA PROCES TRANSKRIPCIJE I RNA

SPLICINGSPLICING PCRPCR ANALIZA PCR PRODUKATAANALIZA PCR PRODUKATA

PROJEKAT HUMANOG PROJEKAT HUMANOG GENOMAGENOMA

PROJEKAT HUMANOG PROJEKAT HUMANOG GENOMAGENOMA

Protein-coding genProtein-coding gen

TRANSKRIPCIJATRANSKRIPCIJA

5'……TTTACCGGAAAAGGGCTAG……3'sense ( + ) DNA 3'……5'……TTTACCGGAAAAGGGCTAG……3'sense ( + ) DNA 3'……AAATGGCCTTTTCCCGATC…….5' antisense ( - ) DNAAAATGGCCTTTTCCCGATC…….5' antisense ( - ) DNA

↓ ↓ transkripcija (-) DNA lancatranskripcija (-) DNA lanca

UUUACCGGUUUUGGGCUAG hnRNAUUUACCGGUUUUGGGCUAG hnRNA

RNA-splicingRNA-splicing

POLYMERASE CHAIN POLYMERASE CHAIN REACTIONREACTION

PROJEKAT HUMANOG PROJEKAT HUMANOG GENOMAGENOMA

Elektroforeza PCR Elektroforeza PCR produkataprodukata

ELEKTROFOREZAELEKTROFOREZA

SDS-PAGESDS-PAGE

WESTERN BLOTINGWESTERN BLOTING

SOUTHERN VAKUM SOUTHERN VAKUM BLOTINGBLOTING

RT-PCR MULTIPLEXRT-PCR MULTIPLEX

REKOMBINANTNO ANTITJELOREKOMBINANTNO ANTITJELO

PCR ANALIZA MUTACIJA CYP2D6 PCR ANALIZA MUTACIJA CYP2D6 GENAGENA

GENETIČKA PREDIKCIJA HEMOFILIJEGENETIČKA PREDIKCIJA HEMOFILIJE

PCR DETEKCIJA MUTACIJA CFTR PCR DETEKCIJA MUTACIJA CFTR GENAGENA( CISTIČNA FIBROZA )( CISTIČNA FIBROZA )

PCR ANALIZA DMD GENAPCR ANALIZA DMD GENA

LEUKEMIJA-MRDLEUKEMIJA-MRD

Monitoring pacijenata sa akutnom Monitoring pacijenata sa akutnom leukemijom ( AL), leukemijom ( AL),

Tokom I nakon tretmana, na prisustvo Tokom I nakon tretmana, na prisustvo preostalih leukemicnih celija ( minimal preostalih leukemicnih celija ( minimal residual disease –MRD ), vrsi se sa tri residual disease –MRD ), vrsi se sa tri metode koje imaju dovoljnu senzitivnost metode koje imaju dovoljnu senzitivnost od 10¯³ ( jedna leukemicna celija na 10³ od 10¯³ ( jedna leukemicna celija na 10³ normalnih celija ).normalnih celija ).

MRD-METODEMRD-METODE

Protocna citometrija – imunofenotipizacijaProtocna citometrija – imunofenotipizacija PCR analiza Ig I T cell receptor genaPCR analiza Ig I T cell receptor gena PCR analiza break-point fuzion regiona PCR analiza break-point fuzion regiona

hromosomskih aberacijahromosomskih aberacija ( RT-PCR analiza fuzionisanih genskih ( RT-PCR analiza fuzionisanih genskih

transkripata u slucajevima akutne transkripata u slucajevima akutne leukemije).leukemije).

HROMOSOMSKE ABERACIJE HROMOSOMSKE ABERACIJE KARAKTERISTIČNE ZA ALKARAKTERISTIČNE ZA AL

t(1;19)(q23;p13)t(1;19)(q23;p13) t(4;11)(q21;q23)t(4;11)(q21;q23) t(8;21)(q22;q22)t(8;21)(q22;q22) t(9;22)(q34;q11)t(9;22)(q34;q11) t(9;22)(q34;q11)t(9;22)(q34;q11) t(12;21)(p13;q22)t(12;21)(p13;q22) t(15;17)(q22;q21)t(15;17)(q22;q21) inv(16)(p13;q22) →CBFB/MYH11-1982.-inv(16)(p13;q22) →CBFB/MYH11-1982.-

DP-terapija sa BMT-subtipovi 10DP-terapija sa BMT-subtipovi 10 del(1)(p32;p32)del(1)(p32;p32)

LEUKEMIJALEUKEMIJA

Leukemija Leukemija je progresivna maligna je progresivna maligna bolest koja se karakterise, povecanim bolest koja se karakterise, povecanim brojem obicno abnormalnih ili nezrelih brojem obicno abnormalnih ili nezrelih leukocita u krvi. Takodjer broj eritrocita i leukocita u krvi. Takodjer broj eritrocita i krvnih plocica se reducira. Uobicajeni krvnih plocica se reducira. Uobicajeni simptomi za leukemiju su anemija, simptomi za leukemiju su anemija, hemoragicna tendencija, i povecana hemoragicna tendencija, i povecana sklonost ka infekcijama.sklonost ka infekcijama.

Postoji Postoji akutnaakutna i i kronicna kronicna leukemija a po leukemija a po osnovu tipa celija koje su oboljele( granularni osnovu tipa celija koje su oboljele( granularni PMNs i njihovi prekursori, BiT limfociti ili PMNs i njihovi prekursori, BiT limfociti ili limfoblasti ili monociti, mijelociti ) postoji limfoblasti ili monociti, mijelociti ) postoji mijeloidnamijeloidna , limfaticna, limfaticna i monocitnai monocitna leukenija. leukenija. Leukociti su bijela zrnaca krvi i limfoidnog Leukociti su bijela zrnaca krvi i limfoidnog sistema ( sistema ( granulociti, makrofagi i limfocitigranulociti, makrofagi i limfociti ) ) te prekursorske forme svakog od navedenih te prekursorske forme svakog od navedenih tipova leukocitatipova leukocita

Termin leukociti se cesto upotrebljava Termin leukociti se cesto upotrebljava samo za granulocite. Neki virusi mogu samo za granulocite. Neki virusi mogu uzrokovati leukemije kod covjeka, uzrokovati leukemije kod covjeka, zivotinja i ptica ( adult T-cell leukemija, zivotinja i ptica ( adult T-cell leukemija, avian acute leukemija virusi, bovine viral avian acute leukemija virusi, bovine viral leukosis, feline leukemija virus, murine leukosis, feline leukemija virus, murine leukemija virus ).leukemija virus ).

LEUKOCITILEUKOCITI

DakleDakle, leukociti, leukociti mogu biti mogu biti granuliranigranulirani ( bazofilni, eozinofilni i neutrofilni ( bazofilni, eozinofilni i neutrofilni granulociti), te granulociti), te negranuliraninegranulirani ( limfociti B ( limfociti B i T- odgovorni za humoralni i celijski i T- odgovorni za humoralni i celijski imunitet i makrofagi).imunitet i makrofagi).

Granulociti Granulociti – leukociti sa neutrofilnim, – leukociti sa neutrofilnim, bazofilnim I eozinofilnim granulama u bazofilnim I eozinofilnim granulama u citoplazmi. Nazivaju se jos polimorfonuklearni citoplazmi. Nazivaju se jos polimorfonuklearni leukociti. Imaju razlicit afinitet citoplazmatskih leukociti. Imaju razlicit afinitet citoplazmatskih granulacija prema bojama. Kratko zive, nemaju granulacija prema bojama. Kratko zive, nemaju sposobnost diobe te se kontinuirano sposobnost diobe te se kontinuirano nadomjestaju novim celijama iz kostane nadomjestaju novim celijama iz kostane srzi.srzi.MijelocitMijelocit je razvojna forma izmedju je razvojna forma izmedju promijelocita i metamijelocita u procesu promijelocita i metamijelocita u procesu nastanka zrelog segmentiranog nastanka zrelog segmentiranog polimorfonuklearnog granulocita.polimorfonuklearnog granulocita.

LimfocitiLimfociti – tip leukocita koji su prisutni u – tip leukocita koji su prisutni u krvi, limfi I limfnim cvorovimaSfericni su krvi, limfi I limfnim cvorovimaSfericni su promjera 8-15 um sa negranuliranom promjera 8-15 um sa negranuliranom citoplazmom te velikim nukleusom. citoplazmom te velikim nukleusom. Postoje B I T limfociti, koji su morfoloski Postoje B I T limfociti, koji su morfoloski identicni ali se razlikuju po povrsinskim identicni ali se razlikuju po povrsinskim celijskim antigenima celijskim antigenima ( imunofluorescentna tehnika ). ( imunofluorescentna tehnika ).

T limfociti su brojniji te su odgovorni za celijski T limfociti su brojniji te su odgovorni za celijski imunitet a B limfociti za humoralni imunitet.imunitet a B limfociti za humoralni imunitet.B B limfocitilimfociti su odgovorni za formiranje su odgovorni za formiranje antitjelaNalaze se u krvotoku, limfi I limfnim antitjelaNalaze se u krvotoku, limfi I limfnim cvorovima. Kod sisara B limfociti se stvaraju u cvorovima. Kod sisara B limfociti se stvaraju u jetri fetusa a kasnije , nakon poroda u kostanoj jetri fetusa a kasnije , nakon poroda u kostanoj srzi.Ekspresijom Ig gena nastaju srzi.Ekspresijom Ig gena nastaju imunoglobulini ( IgG, IgM, IgA, IgE i IgD ).imunoglobulini ( IgG, IgM, IgA, IgE i IgD ).

Takodjer stvaraju receptore egzogenih Takodjer stvaraju receptore egzogenih IgG, klasu II antigena, receptore za T IgG, klasu II antigena, receptore za T limfocite, komplement komponente te limfocite, komplement komponente te receptore za viruse receptore za viruse T limfociti T limfociti su su odgovorni za formiranje antitjela I ima ih odgovorni za formiranje antitjela I ima ih vise tipova. Stvaraju se u vise tipova. Stvaraju se u hematopoetskim ishodnim celijamahematopoetskim ishodnim celijama

Nasuprot B limfocitima, T limfociti I to vecina Nasuprot B limfocitima, T limfociti I to vecina tipova, prolazi proces sazrijevanja u timusu.T tipova, prolazi proces sazrijevanja u timusu.T lifociti preko svojih membranskih povrsinskih lifociti preko svojih membranskih povrsinskih receptora interreagiraju sa antigenima, receptora interreagiraju sa antigenima, mitogenima, limfokinima, Blimfocitima, mitogenima, limfokinima, Blimfocitima, makrofagima.Postoje makrofagima.Postoje citotoksicni T citotoksicni T limfocitilimfociti,,helper T limfociti (TH,Th ihelper T limfociti (TH,Th i Thelper Thelper celijecelije). TH limfociti pomazu B limfocite u ). TH limfociti pomazu B limfocite u procesu formiranja antitjela. procesu formiranja antitjela. T limfociti-T limfociti-induktori i T limfociti –supresoriinduktori i T limfociti –supresori..

MonocitMonocit je veliki (13-15 mikrona ) je veliki (13-15 mikrona ) mononuklearni leukocit, koji nastaje u mononuklearni leukocit, koji nastaje u kostanoj srzi I jetri, gdje sazrijeva I kostanoj srzi I jetri, gdje sazrijeva I razvija se u razvija se u makrofagmakrofag ( mononuklearni ( mononuklearni fagocit )fagocit )

AKUTNA LIMFOBLASTICNA AKUTNA LIMFOBLASTICNA LEUKEMIJA(ALL )LEUKEMIJA(ALL )

PROLIMFOCITNA LEUKEMIJA PROLIMFOCITNA LEUKEMIJA (PREKURSORI(PREKURSORI

B-LIMFOCITA )(PLL )B-LIMFOCITA )(PLL ) AKUTNA MIJELOIDNA AKUTNA MIJELOIDNA

LEUKEMIJA( AML )LEUKEMIJA( AML )

ALLALL

TIPTIP CITOGENETIKACITOGENETIKA Burkit-tipBurkit-tip t(8;14), t(8;22), t(8;14), t(8;22),

t(8;22 )t(8;22 ) HiperdiploidijaHiperdiploidija broj hromosoma veci broj hromosoma veci

od 50od 50 TEL/AML1TEL/AML1 t(12;21 )t(12;21 ) E2A/PBX1E2A/PBX1 t(1;19 )t(1;19 ) MLL/AF4MLL/AF4 t(4;11 )t(4;11 ) BCR/ABLBCR/ABL t(9;22 )t(9;22 ) HipodiploidijaHipodiploidija broj hromosoma manji broj hromosoma manji

od 45od 45 ALL T-limfocitaALL T-limfocita t(14q11 )t(14q11 )

Citogeneticke abnormalnosti su Citogeneticke abnormalnosti su pronadjene kod 60-75% pacijenata sa pronadjene kod 60-75% pacijenata sa ALL. Iako je frekvencija slicna, ALL. Iako je frekvencija slicna, distribucija genetickih abnormalnosti je distribucija genetickih abnormalnosti je razlicita kod djece I odraslih. Kada se razlicita kod djece I odraslih. Kada se radi o slucajevima hiperdiploidije ( broj radi o slucajevima hiperdiploidije ( broj hromosoma veci od 47 ), frekvencija hromosoma veci od 47 ), frekvencija ovog genetickog poremecaja je slicna ovog genetickog poremecaja je slicna kod djece I odraslih. kod djece I odraslih.

Povecanje broja hromosoma je redovno Povecanje broja hromosoma je redovno povezano sa dobrom prognozom a smanjenje povezano sa dobrom prognozom a smanjenje sa losom prognozom. BCR/ABL tip je mnogo sa losom prognozom. BCR/ABL tip je mnogo frekventniji kod odraslih I ima dobru prognozu frekventniji kod odraslih I ima dobru prognozu kao I tip TEL/AML1, kod koga pakje kao I tip TEL/AML1, kod koga pakje translokacija prikrivena I prisutna na translokacija prikrivena I prisutna na molekularnom nivou kod 25% djece sa ALL I molekularnom nivou kod 25% djece sa ALL I 2% odraslih sa ALL. 25% djece ima relaps ili 2% odraslih sa ALL. 25% djece ima relaps ili ponovno vracanje ove bolesti. ponovno vracanje ove bolesti.

PLL-B PLL-B Karakteristicna je po leukocitozi prolimfocita Karakteristicna je po leukocitozi prolimfocita

a radi se o kronicnoj leukemiji B limfocita. a radi se o kronicnoj leukemiji B limfocita. Hromosomi ukljuceni u citogeneticke Hromosomi ukljuceni u citogeneticke poremecaje su 1,3,6,7,11,14 I 17. Na 17 poremecaje su 1,3,6,7,11,14 I 17. Na 17 hromosomu je smjesten p-53 gen I to na hromosomu je smjesten p-53 gen I to na kracem kraku a u slucajevima B-PLL ovaj gen kracem kraku a u slucajevima B-PLL ovaj gen ima najveci broj mutacija u odnosu na sve ima najveci broj mutacija u odnosu na sve ostale malgnancije b limfocita. T( 11;14 )ostale malgnancije b limfocita. T( 11;14 )( q13;q32) i/ili ciklin D1 ekspresija.( q13;q32) i/ili ciklin D1 ekspresija.

3.AKUTNA MIJELOIDNA LEUKEMIJA-AML3.AKUTNA MIJELOIDNA LEUKEMIJA-AML Nastaje kao rezultatsomatskih mutacija. Nastaje kao rezultatsomatskih mutacija.

Etiologija je uglavnom nepoznata izuzev Etiologija je uglavnom nepoznata izuzev poznatih slucajeva izlozenosti zracenju poznatih slucajeva izlozenosti zracenju ( Hirosima, Cernobil, Marsalovi Otoci ), ( Hirosima, Cernobil, Marsalovi Otoci ), radijacijska terapija ili kronicna izlozenost radijacijska terapija ili kronicna izlozenost benzenu. Od klasifikacija tipova AML mogu se benzenu. Od klasifikacija tipova AML mogu se izdvojiti kao opcepriznati klasifikacije Svjetske izdvojiti kao opcepriznati klasifikacije Svjetske zdravstvene organizacije I najnovija FAB ili zdravstvene organizacije I najnovija FAB ili Francusko-Americko-Britanska klasifikacijaFrancusko-Americko-Britanska klasifikacija

Klasifikacija AML po WHO ( World Health Klasifikacija AML po WHO ( World Health Organisation )Organisation )

AML sa rekurentnim ili povratnim AML sa rekurentnim ili povratnim citogenetickim abnormalnostimacitogenetickim abnormalnostima

AML sa t(8;21 )( q22;q22 ), AML1/ETOAML sa t(8;21 )( q22;q22 ), AML1/ETO AML sa inv(16)(p13q22), t(16;16 )(p13;q22), AML sa inv(16)(p13q22), t(16;16 )(p13;q22),

CBF/MYH11CBF/MYH11

(abnormalni eozinofili kostane srzi )(abnormalni eozinofili kostane srzi ) Akutna promijelocitna leukemija (APL) sa t(15;17 )Akutna promijelocitna leukemija (APL) sa t(15;17 )

(q22;q12 )(q22;q12 ) AML sa 11q23 ( MLL ) abnormalnostimaAML sa 11q23 ( MLL ) abnormalnostima

AML sa multilineage displazijamaAML sa multilineage displazijama AML sa mijelodisplasticnim sindromom-uzrokovan AML sa mijelodisplasticnim sindromom-uzrokovan

terapijomterapijom AML tipovi koji jos nisu kategoriziraniAML tipovi koji jos nisu kategorizirani

AML- minimalna diferencijacijaAML- minimalna diferencijacija AML- bez sazrijevanjaAML- bez sazrijevanja AML- sa sazrijevanjem AML- sa sazrijevanjem Akutna mijelomonocitna leukemijaAkutna mijelomonocitna leukemija Akutna monoblasticna/monocitna leukemijaAkutna monoblasticna/monocitna leukemija Akutna eritroidna leukemijaAkutna eritroidna leukemija Akutna megakarioblasticna leukemijaAkutna megakarioblasticna leukemija Akutna bazofilna leukemijaAkutna bazofilna leukemija Akutna panmijeloza sa mijelofibrozomAkutna panmijeloza sa mijelofibrozom Mijeloidni sarkomMijeloidni sarkom

Metodi za detekciju MRD ( minimal residual disease ) Metodi za detekciju MRD ( minimal residual disease ) tokom I nakon terapije pacijenata sa AML su: tokom I nakon terapije pacijenata sa AML su: metafazna citogenetika ( target-struktura hromosoma), metafazna citogenetika ( target-struktura hromosoma), FISH ( target- struktura hromosoma ), protocna FISH ( target- struktura hromosoma ), protocna citometrija ( ekspresija povrsinskih antigena ), klonogeni citometrija ( ekspresija povrsinskih antigena ), klonogeni eseji ( uzgoj malignih celija ) I PCR ( target- DNA I RNA eseji ( uzgoj malignih celija ) I PCR ( target- DNA I RNA sekvence ). Po vazecim parametrima senzitivnost PCR sekvence ). Po vazecim parametrima senzitivnost PCR je 0,0001-0,1000, protocne citometrije 0.1-1,0 , FISH-1, je 0,0001-0,1000, protocne citometrije 0.1-1,0 , FISH-1, a metafazne citogenetike 1-5. U novije vrijeme za a metafazne citogenetike 1-5. U novije vrijeme za pracenje ili monitoring MRD-a koriste se protocna pracenje ili monitoring MRD-a koriste se protocna citometrija, RT-PCR za detekciju fuzionisanih citometrija, RT-PCR za detekciju fuzionisanih transktipata himernih gena, te PCR za analizu Ig-gena I transktipata himernih gena, te PCR za analizu Ig-gena I gena odgovornih za receptore T-limfocita.gena odgovornih za receptore T-limfocita.

Monitornig pacijenata sa akutnom leukemijom, Monitornig pacijenata sa akutnom leukemijom, tokom I nakon tretmana na prisustvo preostalih tokom I nakon tretmana na prisustvo preostalih leukemicnih celija ( minimal rezidual disease – MRD ili leukemicnih celija ( minimal rezidual disease – MRD ili minimum rezidualne bolesti ), vrsi se danas sa tri minimum rezidualne bolesti ), vrsi se danas sa tri tehnike cija je senzitivnost 0,0001( jedna leukemicna tehnike cija je senzitivnost 0,0001( jedna leukemicna celija na 10000 normalnih celija ) :celija na 10000 normalnih celija ) :

imunofenotipizacija protocnom citometrijomimunofenotipizacija protocnom citometrijom PCR analize Ig gena I gena za receptore T-limfocitaPCR analize Ig gena I gena za receptore T-limfocita PCR analize fuzionisanih genskih transkripata PCR analize fuzionisanih genskih transkripata

( multiplex RT-PCR screening( multiplex RT-PCR screening split-out multiplex PCR ).split-out multiplex PCR ).

Postoji devet dobro definisanih hromosomskih Postoji devet dobro definisanih hromosomskih aberacija u osnovi kojih je fuzija odredjenih gena, koje aberacija u osnovi kojih je fuzija odredjenih gena, koje su najfrekventnije u slucajevima akutne leukemije.su najfrekventnije u slucajevima akutne leukemije.

t(1;19)(q23;p13 ) – Fuzija gena E2A/PBX1t(1;19)(q23;p13 ) – Fuzija gena E2A/PBX1 Prvi put definisana 1984. 25%-balansirana Prvi put definisana 1984. 25%-balansirana

forma, 75%-nebalansirana forma.forma, 75%-nebalansirana forma.Dva subtipa:E13/E2 I Dva subtipa:E13/E2 I E13-27bp-E2. Korelacija sa klinickim simptomima kao E13-27bp-E2. Korelacija sa klinickim simptomima kao sto sto su visoki nivo serumske laktat dehidrogenaze te su visoki nivo serumske laktat dehidrogenaze te involviranje centralnog nervnog sistema. Sensitivnost involviranje centralnog nervnog sistema. Sensitivnost detekcije sa PCR second round nested metodom je detekcije sa PCR second round nested metodom je 0,000010,00001

(4;11)(q21;q23) – Fuzija gena MLL/AF4(4;11)(q21;q23) – Fuzija gena MLL/AF4 50-70% pozitivitet na ovu translokaciju kod ALL 50-70% pozitivitet na ovu translokaciju kod ALL

djece I 5% kod pedijatrijskih slucajeva I odraslih sa ALL. djece I 5% kod pedijatrijskih slucajeva I odraslih sa ALL. 10 subtipova ( e8-e7;e8-e4;e9;e5;e9-e4; e10-e6;e10-e5; 10 subtipova ( e8-e7;e8-e4;e9;e5;e9-e4; e10-e6;e10-e5; e10-e4; e11-e6; e11-e5; e11-e4 ).Delecija exona 11 MLL e10-e4; e11-e6; e11-e5; e11-e4 ).Delecija exona 11 MLL gena je u osnogena je u osnovi T-ALL. To je utvrdjeno analizama vi T-ALL. To je utvrdjeno analizama priferne krvi kao I mononuklearnih celija kostane srzi.. priferne krvi kao I mononuklearnih celija kostane srzi.. Znatan broj subtipova se ne moze otkriti citogenetickim Znatan broj subtipova se ne moze otkriti citogenetickim metodama.Reciprocni AF4/MLL fuzionisani transkripti su metodama.Reciprocni AF4/MLL fuzionisani transkripti su pronadjeni kod 70% slucajeva.pronadjeni kod 70% slucajeva.Nepovoljan Nepovoljan prognosticki prognosticki faktor u slucajevima akutne leukemije djece. Kod faktor u slucajevima akutne leukemije djece. Kod odraodrasslih prognoza se poboljsava koristenjem visokih lih prognoza se poboljsava koristenjem visokih doza Ara-C.doza Ara-C.

(8;21) (q22;q22 ) – Fuzija gena AML1/ETO(8;21) (q22;q22 ) – Fuzija gena AML1/ETO Prvi put opisana 1973.Prvi put opisana 1973. AML1 gene ili AML1 gene ili

gen akutne gen akutne mijeloidne leukemije. RT-mijeloidne leukemije. RT-PCR pozitivitet fuzionisanih transkripata kod PCR pozitivitet fuzionisanih transkripata kod skorosvih slucajeva AML. Dobarskorosvih slucajeva AML. Dobar prognosticki prognosticki faktor a terapija sa citozin arabinozidom je vrlo faktor a terapija sa citozin arabinozidom je vrlo uspjesna. Uobicajena je kod mladjih uspjesna. Uobicajena je kod mladjih pacijenata. Najfrekventniji je M2 subtip. pacijenata. Najfrekventniji je M2 subtip. Senzitivnost sanested PCR dostize 0.00001Senzitivnost sanested PCR dostize 0.00001

t ( 9;22 )(q34;q11 ) Fuzija t ( 9;22 )(q34;q11 ) Fuzija gena BCR/ABL-p190, p210.gena BCR/ABL-p190, p210.

Philadelphia hromosom ( Ph-hromosom )je Philadelphia hromosom ( Ph-hromosom )je ukljucen u pojavu kronicne mijeloidne leukemije ukljucen u pojavu kronicne mijeloidne leukemije a takodjer I kod slucajeva ALL ( 5% djeca I 20-a takodjer I kod slucajeva ALL ( 5% djeca I 20-50% odrasli ).50% odrasli ).

Nepovoljan prognosticki faktor.Moze doci to Nepovoljan prognosticki faktor.Moze doci to ponovne pojave RT-PCR pozitiviteta I nakon ponovne pojave RT-PCR pozitiviteta I nakon izvrsene transplantacije kostane srzi. Zna ci da izvrsene transplantacije kostane srzi. Zna ci da se radi o relapsu. Osam subtipova: e1-a2; e1-se radi o relapsu. Osam subtipova: e1-a2; e1-a3, e6a2 ( p190 ); b2a2, b3a2, c3a2,b2a3 i a3, e6a2 ( p190 ); b2a2, b3a2, c3a2,b2a3 i b3a3( p210 )b3a3( p210 )

.Agresivna terapija, alogena ili autologna .Agresivna terapija, alogena ili autologna transplantacija kostane srzi ili ishodnih celija transplantacija kostane srzi ili ishodnih celija periferne krvi. U tom slucaju RT-PCR detekcija periferne krvi. U tom slucaju RT-PCR detekcija BCR/ABL fuzionisanih transkripata predstavlja BCR/ABL fuzionisanih transkripata predstavlja metod izbora kada se radi o monitoringu MRD-metod izbora kada se radi o monitoringu MRD-a. Adaptivna imunoterapija, antibody-based a. Adaptivna imunoterapija, antibody-based terapije ili terapija interferonom smanjuju terapije ili terapija interferonom smanjuju mogucnost post-transplantacijskog relapsa.mogucnost post-transplantacijskog relapsa.

.Kod nekih pacijenata postoji ekspresija i .Kod nekih pacijenata postoji ekspresija i p-190 i p-210. P-210 protein kodiran od p-190 i p-210. P-210 protein kodiran od strane fuzije gena BCR/ABL ima strane fuzije gena BCR/ABL ima povecanu aktivnost tirozin kinaze. Studije povecanu aktivnost tirozin kinaze. Studije su pokazale da dvije trecine pacijenata su pokazale da dvije trecine pacijenata sa CML produciraju reciprocnu varijantu sa CML produciraju reciprocnu varijantu fuzije ova dva gena, dakle ABL/BCRcija fuzije ova dva gena, dakle ABL/BCRcija uloga jos nije razjasnjenauloga jos nije razjasnjena

BCR/ABL fuzijski protein varira u BCR/ABL fuzijski protein varira u molekulskoj masi od 190-230 kDa, molekulskoj masi od 190-230 kDa, zavisno od breakpoint mjesta BCR zavisno od breakpoint mjesta BCR gena.Ovaj diverzitet je u korelaciji sa gena.Ovaj diverzitet je u korelaciji sa fenotipom leukemije I njegovom nivou fenotipom leukemije I njegovom nivou agresivnosti. Sa RT-PCR-om BCR/ABL agresivnosti. Sa RT-PCR-om BCR/ABL transkripte je moguce detektovati u transkripte je moguce detektovati u skoro > 95% CML-a. Citogenetickim skoro > 95% CML-a. Citogenetickim metodama to nije bilo moguce.metodama to nije bilo moguce.

.Kvantitativni PCR predstavlja rani .Kvantitativni PCR predstavlja rani prediktorski metod u slucajevima prediktorski metod u slucajevima izvrsene alogene tranplantacije ili nakon izvrsene alogene tranplantacije ili nakon tretmana sa interferonom. Nested PCR tretmana sa interferonom. Nested PCR imao je senzitivnost u detekciji imao je senzitivnost u detekciji fuzionisanih transkripata cak 0,000001 ili fuzionisanih transkripata cak 0,000001 ili 10‾º I to neovisno o kojem tipu 10‾º I to neovisno o kojem tipu transkripata se radilo ( b2-a2 ili b3-a2 )transkripata se radilo ( b2-a2 ili b3-a2 )

t ( 12;21 ) ( p13;q22 ) Fuzija t ( 12;21 ) ( p13;q22 ) Fuzija gena TEL/AML1gena TEL/AML1

Prvi podaci datiraju od 1995. Ova Prvi podaci datiraju od 1995. Ova translokacija nije se mogla otkriti translokacija nije se mogla otkriti postojecim citogenetickim postojecim citogenetickim knonvencionalnim metodama. Velika knonvencionalnim metodama. Velika frekvencija ove translokacije je u frekvencija ove translokacije je u slucajevima ALL kod djece ( 25% ). slucajevima ALL kod djece ( 25% ). Dobar prognosticki faktor.Cetiri subtipa: Dobar prognosticki faktor.Cetiri subtipa: ex2, ex2∆ex3, ex3 i ex3∆ex3.ex2, ex2∆ex3, ex3 i ex3∆ex3.

T(15; 17 ) (q22;q21 ), Fuzija T(15; 17 ) (q22;q21 ), Fuzija gena PML/RARAgena PML/RARA

Ova translokacija je najcesce vezana za Ova translokacija je najcesce vezana za akutnu promijelocitnu leukemiju ( APL ). akutnu promijelocitnu leukemiju ( APL ). Radi se o fuziji gena za alfa receptor Radi se o fuziji gena za alfa receptor retinoidne kiseline – Retinoid acid retinoidne kiseline – Retinoid acid receptor alfa gen ili RARA ) te gena za receptor alfa gen ili RARA ) te gena za akutnu promijelocitnu leukemiju ( APL ). akutnu promijelocitnu leukemiju ( APL ). Kod pacijenata sa APL Kod pacijenata sa APL

Pronadjeni su himarni PML/RARA fuzionisani genski Pronadjeni su himarni PML/RARA fuzionisani genski transkripti, kao I reciprocni RARA/APL transkripti, koji transkripti, kao I reciprocni RARA/APL transkripti, koji nastaju kao posljedica reciprocne translokacije izmedju nastaju kao posljedica reciprocne translokacije izmedju navedena dva genaska lokusa. Los prognosticki faktor navedena dva genaska lokusa. Los prognosticki faktor jer cesto dolazi do hiperleukocitoze. Nested PCR ima jer cesto dolazi do hiperleukocitoze. Nested PCR ima senzitivnost 10 ‾3. Pojava ekstra elektroforetskih traka senzitivnost 10 ‾3. Pojava ekstra elektroforetskih traka uzrokovana je alternativnim splicingom PML exona. uzrokovana je alternativnim splicingom PML exona. Postoje subtipovi: ex3/ex3; ex3δ/ex3; ex6/ex3; Postoje subtipovi: ex3/ex3; ex3δ/ex3; ex6/ex3; ex6D/ex3. Postoji jos translokacija t( 15;17 )(q21;q22 ) ex6D/ex3. Postoji jos translokacija t( 15;17 )(q21;q22 ) uzrokovana fuzijom NPM/RARA gena. Los prognosticki uzrokovana fuzijom NPM/RARA gena. Los prognosticki faktor a imaju S i L subtipovi ( kratki i dugi transkripti ). faktor a imaju S i L subtipovi ( kratki i dugi transkripti ).

del( 1 )( p32;p32 ) Fuzija del( 1 )( p32;p32 ) Fuzija gena SIL/TALgena SIL/TAL

TAL je oznaka za T cell leukemia gen ( gen za TAL je oznaka za T cell leukemia gen ( gen za leukemiju T limfocita ) a SIL je oznaka za stem leukemiju T limfocita ) a SIL je oznaka za stem cell leukemia lokus ili SCL interrupting lokus. cell leukemia lokus ili SCL interrupting lokus. Ovi fuzionisani genski transkripti se ne mogu Ovi fuzionisani genski transkripti se ne mogu detektovati klasicnim citogenetickim detektovati klasicnim citogenetickim metodama. Postoje tri tipa: 1a/4; 1a/3 i 1b/3. metodama. Postoje tri tipa: 1a/4; 1a/3 i 1b/3. Po BIO-RAD interpretacijskim tabelama za RT-Po BIO-RAD interpretacijskim tabelama za RT-PCR Split-out subtipizaciju moguce je PCR Split-out subtipizaciju moguce je detektovati d1+d2 kombinaciju od 184 bp. detektovati d1+d2 kombinaciju od 184 bp. SIL/TAL1 transkripti su karakteristicni za T-ALL SIL/TAL1 transkripti su karakteristicni za T-ALL ( djeca 5-25% ) I za T-ALL kod mladjih odraslih ( djeca 5-25% ) I za T-ALL kod mladjih odraslih osoba sa frekvencijom od 10%.osoba sa frekvencijom od 10%.

Dakle, za slucajeve AL najcesci geneticki Dakle, za slucajeve AL najcesci geneticki poremecaji su sljedeci:poremecaji su sljedeci:

1. t( 1;19 )(q23;p13 )1. t( 1;19 )(q23;p13 ) E2A/PBX1 E2A/PBX1 nested PCR 10 ALLnested PCR 10 ALL

2. t( 4;11 )(q21;q23 )2. t( 4;11 )(q21;q23 ) MLL/AF4 MLL/AF4 nested PCR 10 ALL I AML nested PCR 10 ALL I AML

3. t(8;21 )(q22;q22 ) AML1/ETO 3. t(8;21 )(q22;q22 ) AML1/ETO nested PCR 10 AMLnested PCR 10 AML

4. t( 9;22 )(q34;q11 )4. t( 9;22 )(q34;q11 ) BCR/ABL BCR/ABL nested PCR 10 ALL I AMLnested PCR 10 ALL I AML

5. t( 9;22 )(q34:q11 ) BCR/ABL nested 5. t( 9;22 )(q34:q11 ) BCR/ABL nested PCR 10PCR 10 ALL I AMLALL I AML

6. t( 12;21 )(p13;q22 ) TEL/AML1 6. t( 12;21 )(p13;q22 ) TEL/AML1 nested PCR 10 ALLnested PCR 10 ALL

7. t( 15;17 )(q22;q21 ) PML/RARA 7. t( 15;17 )(q22;q21 ) PML/RARA nested PCR 10 AMLnested PCR 10 AML

8. inv (16 )(p13;q22 ) CBFB/MYH11 8. inv (16 )(p13;q22 ) CBFB/MYH11 nested PCR 10 AMLnested PCR 10 AML

9. del(1)(p32;p32 ) SIL/TAL 9. del(1)(p32;p32 ) SIL/TAL nested PCR 10 ALL ( T-ALL )nested PCR 10 ALL ( T-ALL )

IZOLACIJA RNAIZOLACIJA RNA

Cista RNA ima apsorpciju A260/280 1.9-Cista RNA ima apsorpciju A260/280 1.9-2.1.Mjerenje koncentracije RNA se izvodi tako 2.1.Mjerenje koncentracije RNA se izvodi tako da se uzme 20 ul RNA u RNAse free water +80 da se uzme 20 ul RNA u RNAse free water +80 ul RNAse free water ( 1:5 ). U kivetu koja je ul RNAse free water ( 1:5 ). U kivetu koja je RNAse free ( isprana sa 0,1M NaOH, 1mM RNAse free ( isprana sa 0,1M NaOH, 1mM EDTA pa nakon toga ispiranje sa RNAse free EDTA pa nakon toga ispiranje sa RNAse free water ).Koncentracija RNA: 40 ug/ml x A260 x water ).Koncentracija RNA: 40 ug/ml x A260 x dilucioni faktor ( 5 ). dilucioni faktor ( 5 ). NPR. 40 ug/ml x 0,15 x 5 = NPR. 40 ug/ml x 0,15 x 5 = 30 ug/ml. Ukupni prinos je koncentracija x 100 30 ug/ml. Ukupni prinos je koncentracija x 100 ul a to je 3 ug.ul a to je 3 ug.

cDNA sintezacDNA sinteza

u 0,2 ml PCR epruvetice otpipetirati 10 ul u 0,2 ml PCR epruvetice otpipetirati 10 ul ekstrahovane RNA I 4 ul cDNA primer mixa. ekstrahovane RNA I 4 ul cDNA primer mixa. Miksati lagano pipetom smjesu 10 minuta.Miksati lagano pipetom smjesu 10 minuta.

U posebnu 0,2 PCR epruveticu otpipetirati 10 U posebnu 0,2 PCR epruveticu otpipetirati 10 ul RNAse free vode I 4 ul cDNA prul RNAse free vode I 4 ul cDNA pr

Primer mixa ( negativna kontrola ).Primer mixa ( negativna kontrola ). inkubacija 5 minuta na 65ºC. Hladjenje na ledu.inkubacija 5 minuta na 65ºC. Hladjenje na ledu. Mix za cDNA sintezu:Mix za cDNA sintezu:

( 5 uzoraka )( 5 uzoraka ) 5x MMLV-RT pufer5x MMLV-RT pufer 27,5 ul27,5 ul 100 mM DTT100 mM DTT 13,75 ul13,75 ul 10 mM dNTP mix10 mM dNTP mix 13,75 ul13,75 ul MMLV-RTMMLV-RT 5,5 ul 5,5 ul Ukupno 60,5 ulUkupno 60,5 ul

u svaku epruveticu nakon inkubacije otpipetirati u svaku epruveticu nakon inkubacije otpipetirati po 11 ul cDNA synthesis mixa te lagano po 11 ul cDNA synthesis mixa te lagano miksati pipetom sadrzaj.miksati pipetom sadrzaj.

Inkubacija na 37ºC 45 minutaInkubacija na 37ºC 45 minuta U svaku epruveticu otpipetirati po 25 ul RNAse U svaku epruveticu otpipetirati po 25 ul RNAse

free vode radi razrijedjivanja cDNA.free vode radi razrijedjivanja cDNA. Inkubacija na 95ºC 5 minuta radi inaktivacije Inkubacija na 95ºC 5 minuta radi inaktivacije

reverzne transkriptaze.reverzne transkriptaze. Hladjenje na ledu. Cuvati na -20ºC.Hladjenje na ledu. Cuvati na -20ºC.

First PCR master mix ( F-First PCR master mix ( F-MIX ) – 1,5 ml ependorficaMIX ) – 1,5 ml ependorfica

10 x PCR pufer10 x PCR pufer 44 ul44 ul dNTPs mixdNTPs mix 9 ul9 ul Hot Star Taq polimeraza Hot Star Taq polimeraza 7 ul7 ul

Izmiksati pipetomIzmiksati pipetom RNAse free vodaRNAse free voda 205 ul205 ul

265 ul total265 ul total

PCR programPCR program

15 min 15 min 95ºC 95ºC X1X1

30 sekundi 95ºC30 sekundi 95ºC

30 sekundi 30 sekundi 58ºC58ºC x25 x25

1,5 minuta 72ºC1,5 minuta 72ºC

Hladjenje 4ºC Hladjenje 4ºC x1x1

II – NESTED MASTER PCR II – NESTED MASTER PCR AMPLIFIKACIJAAMPLIFIKACIJA

Nested master PCR mix ( N-MIX )Nested master PCR mix ( N-MIX ) - 10 x PCR pufer 44 ul- 10 x PCR pufer 44 ul - dNTP mix- dNTP mix 9 ul 9 ul Hot Star Taq polimeraza Hot Star Taq polimeraza 7 ul 7 ul - RNAse free voda- RNAse free voda 275 ul275 ul

PCR PROGRAMPCR PROGRAM

15 min15 min 95ºC95ºC 1x1x 30 sek30 sek 95ºC95ºC 30 sek 30 sek 58ºC58ºC 20x20x 1,5 min 1,5 min 72ºC72ºC 10 min10 min 72ºC72ºC 1x1x 4ºC Hold4ºC Hold 1x1x

10 min 72ºC 1x

M6A inv(16)M6A inv(16)(p13;q22) (p13;q22)

CBFB(16q22)CBFB(16q22) GENI GENI MYH11(16p13)MYH11(16p13)

CBFB/MYH11 (D) – 288bpCBFB/MYH11 (D) – 288bp

CBFB/MYH11 (E ) –495 bpCBFB/MYH11 (E ) –495 bp

CBFB/MYH11 (G) –192 bpCBFB/MYH11 (G) –192 bp

CBFB/MYH11 (H) –299 bpCBFB/MYH11 (H) –299 bp

TIP I SUBTIPOVI TIP I SUBTIPOVI LEUKEMIJELEUKEMIJE

BCR/ABLb3a2 – 472 bpBCR/ABLb3a2 – 472 bp

BCR/ABLc3a2 – 1012 bpBCR/ABLc3a2 – 1012 bp

BCR/ABLb2a3 - 233 bpBCR/ABLb2a3 - 233 bp

BCR/ABLb3a3 – 298 bpBCR/ABLb3a3 – 298 bp

TIP I SUBTIPOVI TIP I SUBTIPOVI LEUKEMIJELEUKEMIJE

BCR(22q11)BCR(22q11) BCR/ABLb2a2 –397 bpBCR/ABLb2a2 –397 bp ABL(9q34 )ABL(9q34 ) BCR/ABLb3a2 – 472 bp BCR/ABLb3a2 – 472 bp

BCR/ABLc3a2 – 1012 BCR/ABLc3a2 – 1012 bpbp

BCR/ABLb2a3 - 233 bpBCR/ABLb2a3 - 233 bp

BCR/ABLb3a3 – 298 bpBCR/ABLb3a3 – 298 bp