Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ yÜksek ... · c58c1-pch32 which is...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Selay ELDOĞAN

KARPUZ (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai)’a VAT

(Aphis gossypii’ye DAYANIKLILIK) GENİNİN AKTARILMASI VE

TRANSFORMASYON ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI

BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2008

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KARPUZ (Citrullus lanatus (Thunb.)Matsum ve Nakai)’a VAT

(Aphis gossypii’ye DAYANIKLILIK) GENİNİN AKTARILMASI VE TRANSFORMASYON ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI

Selay ELDOĞAN

YÜKSEK LİSANS TEZİ

BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

Bu tez 11/01/2008 Tarihinde Aşağıdaki Juri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile

Kabul Edilmiştir.

İmza …………………… İmza………… İmza…………. Doç. Dr. Prof. Dr. Doç. Dr. Yeşim YALÇIN-MENDİ Nebahat SARI Nihal BUZKAN DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No:ZF2007YL45 • Not:Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve

fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ

KARPUZ (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai)’a VAT (Aphis gossypii’ye

DAYANIKLILIK) GENİNİN AKTARILMASI VE TRANSFORMASYON

ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI

Selay ELDOĞAN

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. N. Yeşim YALÇIN-MENDİ

Yıl : 2008, Sayfa: 70 Jüri : Doç. Dr. N. Yeşim YALÇIN-MENDİ

: Prof. Dr. Nebahat SARI : Doç. Dr. Nihal BUZKAN

Bu tezde, karpuz (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) bitkisinde

rejenerasyon için gerekli olan uygun ortam optimizasyonu ve Agrobacterium aracılığıyla gen aktarma tekniği çalışılmıştır. Test edilen rejenerasyon ortamlarından en etkili olan, 5 gün çimlendirme ortamında olan karpuz tohumları 2 mg/l BAP + 0.1 mg/l IAA ile desteklenmiş MS ortamında kültüre alınmasıyla yüksek rejenerasyon frekansı elde edilmiştir. Agrobacterium’un C58C1-pmp90 ve C58C1-pch32 suşlarının VAT bölgesi ve 2.5 kb’lık 5’ ve 3’regülatör dizinlerine sahip pBin19 binary vektör kullanılmıştır.

Bakteri solüsyonu ile muamele edilen karpuz tohumu eksplantları, 2 mg/l BAP, 0.1 mg/l IAA, 200 mg/l timentin ve 7.5 g agar içeren MS ortamında kültüre alınmıştır. Gen aktarımı olan bitkileri tespit edebilmek için seçici seleksiyon ortamı (2 mg/l BAP + 0.1 mg/l IAA + 750 mg/l sefuroksim sodyum + 200 mg/l kanamycin + 7.5 g agar) kullanılmıştır. Seleksiyon ortamında canlılığını devam ettiren bitkiler MSG (sürgün geliştirme ortamı) ortamında geliştikten sonra DNA izolasyonu, PCR, Jel elektroforezi sonucunda aktarılan bantlara UVP Jel dökümantasyon sisteminde bakılmıştır. Bantlar ilgili bölgelerde tespit edilmemiştir. Anahtar kelimeler: Citrullus lanatus, transformasyon, Agrobacterium tumefaciens, rejenerasyon, Aphis gossypii

I

ABSTRACT MSc THESIS

AN EFFICIENT TRANSFORMATION AND VAT (RESISTANCE to Aphis gossypii) GENE TRANSFORMATION OF WATERMELON (Citrullus lanatus

(Thunb.) Matsum and Nakai) Selay ELDOĞAN

DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisor : Assoc. Prof. Dr. N. Yeşim YALÇIN MENDİ Year : 2008, Page : 70

Jury : Assoc. Prof. Dr. N. Yeşim YALÇIN MENDİ : Prof. Dr. Nebahat SARI

: Assoc. Prof. Dr. Nihal BUZKAN In this thesis, optimum media for regeneration and gene transformation technique

with Agrobacterium tumefaciens to watermelon (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum and Nakai) plant was studied. The best result obtained from MS medium containing 2 mg/l BAP +0.1 mg/l IAA added, for regeneration of the watermelon seeds which are incubated for germination for 5 days. Regeneration protocol has been achively applied to obtain transformed plants, using Agrobacterium tumefaciens strain C58C1-pmp90 and C58C1-pch32 which is harboring a binary vector pBin19 carring Vat coding region, 2,5 kb of 5’ and 3’ regulatory sequences.

Watermelon seed explants which are treated with bacteria solution cultured in MS media containing 2 mg/l BAP + 0.1 mg/l IAA + 200 mg/l timentin + 7.5 g agar added. To determine the transformant plants, selective media containing (2 mg/l BAP + 0.1 mg/l IAA + 750 mg/l sefuroksim sodium + 200 mg/l kanamisin + 7.5 g agar) was used. The plants which are carried on living in selection medium were transferred to the MSG (medium of shoot growth). After completed their growth, the plants were harvested for DNA isolation. Transformed plants were detected by PCR, Gel Electrophoresis and UV decumantation system. Bands are not seen in the intended region. Key words : Citrullus lanatus, transformation, Agrobacterium tumefaciens, rejeneration, Aphis gossypii

II

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans öğrenimim ve çalışmam boyunca her türlü desteği benden

esirgemeyen, çalışma ortamımızı bir aile ortamına benzeten, öğrencisi olduğum için

kendimi şanslı hissettiğim, danışman hocam Sayın Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ’ye

sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım.

Bu tez çalışmasının başlangıç aşamasında materyallerimin belirlenmesinde

yardımcı olan ve her türlü konuda yardımlarıyla bizleri yönlendiren Sayın Hocam Prof.

Dr. Nebahat SARI’ya müteşekkirim.

Saygı duyduğum ve her zaman desteğini gördüğüm Sayın Hocam Doç. Dr.

Yıldız AKA-KAÇAR’a bizlere her türlü desteği sağlayıp, olumlu yönlendirmeleri

sebebiyle çok teşekkür ederim.

Bu çalışmada kullanılan genlerin temin edilmesinde ve çalışmayla ilgili

deneyimlerinden yararlandığım Dr. Catherine DOGIMONT’a teşekkürlerimi sunarım.

Yüksek lisansım boyunca desteğini gördüğüm, katkılarını esirgemeyen Ceren

ÜNEK’e, çalışmamın her aşamasında yardımlarını gördüğüm çok değerli arkadaşlarım

Arş. Gör. İknur SOLMAZ, Sera Teknikeri Semra GÖNÜL, Biyolog Özhan ŞİMŞEK,

Biyolog Tolga İZGÜ, Biyolog Ertan GENEYİKLİ, Biyolog Esra BOZ, Ziraat Mühendisi

Esra KOCAMAN ve Yüksek Ziraat Mühendisi Pembe ÇÜRÜK’e teşekkür ederim.

Bu çalışmayı destekleyen Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri

biriminin sayın yetkililerine ayrıca teşekkür ederim.

Hayatın bu safhasına gelmek hiç kolay değil farkındayım ama ‘bunu en çok onlar

biliyordur’ diyorum ve son olarak yaşamım boyunca bana gösterdikleri maddi - manevi

fedakarlıkları için Sevgili Aileme …

III

İÇİNDEKİLER Sayfa No

ÖZ...................................................................................................................................I

ABSTRACT..................................................................................................................II

TEŞEKKÜR.................................................................................................................III

İÇİNDEKİLER.............................................................................................................IV

ÇİZELGELER DİZİNİ................................................................................................VII

ŞEKİLLER DİZİNİ....................................................................................................VIII

SİMGELER VE KISALTMALAR................................................................................X

1. GİRİŞ.........................................................................................................................1

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR……………………………………………..............…..9

2.1. Karpuz (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum and Nakai) Bitkisinde

Yapılmış Olan Doku Kültürü Çalışmaları.............................................................9

2.2. Diğer Cucurbitaceae Familyası Türlerinde Yapılmış Olan Doku

Kültürü ve Gen Transformasyon Çalışmaları........................................................13

3. MATERYAL VE YÖNTEM……............................................................................18

3.1. Materyal.................................................................................................................18

3.1.1. Rejenerasyon ve Transformasyon Denemelerinde Kullanılan Bitki

Materyalleri...................................................................................................18

3.1.2. Transformasyon Denemesinde Kullanılan Plazmid ve Bakteri Irkları........18

3.2. Yöntem...................................................................................................................20

3.2.1. Rejenerasyon ve Transformasyon Denemeleri için Sterilizasyon

Uygulamaları.................................................................................................20

3.2.2. Tohumların Doku Kültürü Koşullarında Çimlendirilmesi…………......….22

IV

3.2.3. Genel Doku Kültürü Şartlarının ve Besi Ortamlarının Hazırlanması…......22

3.2.4. Rejenerasyon Ortamına İlave Edilecek Uygun Bitki Büyüme

Düzenleyicilerinin ve Uygun Konsantrasyonlarının Belirlenmesi…...…......24

3.2.5. Araştırmada Kullanılacak olan Eksplant Kaynağının Belirlenmesi..............26

3.2.6. Gen Aktarma Çalışmalarında Uygulanan Denemeler ...................................27

3.2.6.1. Transformayonda Kullanılacak olan Bakteri

Solusyonunun Yoğunluğunun Belirlenmesi.......................................27

3.2.6.2. Agrobacterium tumefaciens ve İnokulasyon

Solusyonunun Hazırlanması ..............................................................27

3.2.6.3. Eksplantların A. tumefaciens ile İnokulasyonu...................................30

3.2.6.4. A. tumefaciens ile İnokulasyondan Sonra Aktarılan

Besi Ortamları ....................................................................................31

3.2.6.5. Gen Aktarma Çalışmalarında Kullanılan Etkili Kanamisin

Konsantrasyonunun Belirlenmesi.......................................................32

3.2.7. Moleküler Uygulamalar...............................................................................33

3.2.7.1. DNA İzolasyonu.................................................................................33

3.2.7.2. PCR Protokolünün Optimizasyonu ve Uygulanması.........................36

3.2.7.3. DNA Kalitesi ve Kantitesinin Belirlenmesi.......................................38

3.2.7.4. Elektroforez Koşulları........................................................................39

4. BULGULAR VE TARTIŞMA.................................................................................40

4.1. Tohumlarda Sterilizasyon Koşullarının Belirlenmesi............................................40

4.2. Çimlenme ve Rejenerasyon için Uygun Ortam Koşullarının Belirlenmesi...........42

4.3. Katılaştırıcı Madde Miktarının Belirlenmesi.........................................................42

4.4. Bitki Rejenerasyon Ortamının Belirlenmesi..........................................................43

4.5. Transformasyon Çalışmaları...................................................................................49

V

4.5.1. Transformasyon Çalışmalarında Kullanılan Hormon

Konsantrasyonları ve Antibiyotik Uygulaması..............................................49

4.5.2. Transformasyon için Sürgün Geliştirme Ortamının Belirlenmesi...................51

4.5.3. Transformasyon Çalışmalarında Kanamisin Uygulaması...............................52

4.6. Moleküler Çalışmalar...............................................................................................54

4.6.1. DNA İzolasyonu...............................................................................................54

4.6.2. DNA’nın Kantite ve Kalitesinin Belirlenmesi................................................54

4.6.3. PCR Sonrası Elde Edilen Bantlar.....................................................................56

5. SONUÇ VE ÖNERİLER………………………………………..……….………....61 KAYNAKLAR…………………………………………………………….…..……….63

ÖZGEÇMİŞ……………………………….…………………………………..……….70

VI

ÇİZELGE DİZİNİ SAYFA NO Çizelge 3.1. M. S. Temel Besin Ortamında Bulunan Besin Maddeleri

ve Konsantrasyonları (Murashige ve Skoog, 1962)……………...………..23

Çizelge 3.2. Rejenerasyon Denemesinde Kullanılan Bitki Büyüme Düzenleyicileri,

Konsantrasyonları ve Kombinasyonları.......................................................25

Çizelge 3.3. Bakteri Geliştirme Ortamı (LB) için Kullanılan Kimyasallar Maddeler ve Konsantrasyonları (Luria,1951).............................................................28 Çizelge 3.4. PCR’da Kullanılacak Primerler...................................................................37

Çizelge 3.5. PCR Reaksiyonlarında Uygulanan Protokol……………………………...38

Çizelge 4.1. Sodyum Hipoklorit ile Yapılan Sterilizasyonda Meydana Gelen

Tomurcuk ve Kallus Oluşumu Oranları........................................................41

Çizelge 4.2. BA ve IAA’in Farklı Konsantrasyon ve Kombinasyonlarında

Tomurcuk ve Kallus Oluşumu Oranları........................................................45 Çizelge 4.3. Kanamisin Deneme Sonuçları......................................................................52

Çizelge 4.4. DNA’nın Kantite ve Kalitesinin Belirlenmesi.............................................55

VII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA NO

Şekil 1.1. Virus Hastalıklarına Sebep Olan Aphis gossypii................................................3

Şekil 1.2. Agrobacterium tumefaciens’in Ti plasmid bölgesi…………….………….......6

Şekil 1.3. A. tumefaciens ve Meydana Getirdiği Tümör…………………..……...……...7

Şekil 3.1. Kavun Genomik DNA’sı NPTII (Kanamysin’e dayanıklılık geni) ve Promotor Dizini...........................................................................................19 Şekil 3.2. A) Yüzey Sterilizasyonu için Hazırlanan Karpuz Tohumları;

B) Pens Yardımıyla Tohum Kabuklarının Çıkarılması;

C) Alkol ve Sodyum Hipoklorit Çözeltileri ile Tohumların Muamelesi;

D) Saf Su ile Tohumların Yüzeyinin Deterjandan Arındırılması;

E) Tohumların Filtre Kağıdı Üzerinde Kurutulması;

F) Tohumların Çimlendirme Ortamına Aktarılması……………………..…..21

Şekil 3.3. Hazırlanan Besi Ortamlarının Petrilere Dökülmesi……..……………...……26

Şekil 3.4. Eksplantların Kesilerek Yara Dokusu Oluşturulması ve MR Ortamına

Yerleştirilmesi..................................................................................................27

Şekil 3.5. Bakteri Solüsyonu Hazırlanmasında Kullanılan Materyal….………………28

Şekil 3.6. A) Sıvı LB Hazırlanışı; B)Tek Bakteri Kolonisi İşaretlenmesi;

C) Pipet Ucu ile Tek Koloni Alınışı; D) LB Ortamına Bakteri Ekilmesi….…29

Şekil 3.7. Bakteri Solüsyonunun Karıştırıcıya Alınması ve 24 Saat Çalkalayıcı

İnkübatörde Kalan Bakteri Solüsyonunun Hazırlanması…………………...30

Şekil 3.8. M3 Ortamında Gelişen Bitkiciklerde Meydana Gelen Kardeşlenme ve

Bitkiciklerin Temizlenerek MSG Ortamına Aktarılması ................................32

Şekil 3.9. Etkili Kanamisin Konsantrasyonlarının Belirlenmesi………….…………….33

Şekil 3.10. A) Karpuz Eksplantlarının İzolasyon İçin Öğütülmesi; B) Öğütülen

Materyalin Fırça Yardımıyla Ependorflara Alınması; C) Eksplatların

CTAB Solüsyonuyla Muamelesi; D) İçerisine CTAB Eklenen

Örneklerin Isıtıcıda Bekletilmesi.....................................................................35

Şekil 3.11. PCR Analizleri İçin Termal Cycler................................................................36

VIII

Şekil 3.12. DNA Kalite ve Kantitesinin Belirlenmesinde Kullanılan

Spektrofotometre…………………………………………………………….38

Şekil 3.13. Agarose Jel Elektroforez................................................................................39

Şekil 4.1. Hipokotil Eksplantın Gelişiminden Bir Görünüm...........................................46

Şekil 4.2. Farklı Bitki Büyüme Düzenleyiciler ve Konsantrasyonunun

Karpuz Bitkisinde Etkileri; A)Kotiledon; B) Proksimal………………......…48

Şekil 4.3. A, C, E, G)Kotiledon Kısım Eksplantlarının Gelişimi; B, D, F, H)

Proksimal Kısım Eksplantlarının Gelişimi…….…………………………....50

Şekil 4.4. Çoğalma Aşamasında Bitki Görünümü...........................................................51

Şekil 4.5. A) Seçici Seleksiyon Ortamında (M3) Bitkiciklerin Görünümü; B)

Kardeşlenen Bitkiciklerin MSG Ortamındaki Görünüşü; C) MSG

Ortamındaki Bitkiciklerin Görünüşü; D) GA3 Uygulamasından

Sonra DNA İzolasyonu İçin Kullanılan Bitkiciklerin Görünümü……………53

Şekil 4.6. A) Rejenere Olmuş Proksimal Kısım Görünümü; B) Kotiledon Kısımda Meydana Gelen Kallus Görünümü....................................................54

Şekil 4.7. V551R (forward) ve V588 (reverse) Primerine Ait Agaroz Jel

Görüntüsü……………………………………………………………………..57

Şekil 4.8. LRR1R (forward) ve LRR915 (reverse) Primerine Ait Agaroz Jel

Görüntüsü ……………………………..………………………………..….....58

Şekil 4.9. V1276F (forward) ve V1276R (reverse) Primerine Ait Agaroz Jel

Görüntüsü……..................................................................................................59

Şekil 4.10. 1 kb DNA Ladder’a Ait DNA Bant Büyüklükleri………….…………..….60

..

IX

SİMGE VE KISALTMALAR

ABA : Absisik Asit

BAP : 6-Benzylamino Purin

bp : Base pair 0C : Santigrat derece

CTAB : Cetyltrimethylamoniumbromide

IAA : Indole-3-asetik Asit

GA3 : Giberellik Asit

HCI : Hidroklorik Asit

KOH : Potasyum Hidroksit

kb : Kilobaz

LB (sıvı) : % 5 Yeast extract + % 1 Tyrptone + % 1 NaCI (Ph=7)

LB (katı) : % 5 Yeast extract + % 1 Tyrptone + % 1 NaCI + 7.5 g/l Agar (Ph=7)

l : Litre

MS : Murashige and Skoog ortamı

mg : Miligram

mg/l : Miligram/Litre

ml : Mililitre

NAA : Naftalen Asetik Asit

ng : nanogram

µm : Mikromolar

µl : Mikrolitre

rpm : revolutions per minute

UV : Ultra Viyole

Taq : Thermus aquatic

TAE : Tris/ acetate/ EDTA (Buffer)

% : Yüzde

X

1. GİRİŞ Selay ELDOĞAN

1. GİRİŞ

Dünyada geniş bir alana sahip olan karpuz üretiminde, 69 315 000 ton üretimi

olan Çin’den sonra Türkiye 2. sırada yer almaktadır. Türkiye’den sonra 3. sırada 2 150

000 ton üretim ile İran, 4. sırada 1 718 920 ton üretimi ile ABD gelmektedir. Türkiye’de

1 milyon ha’lık alanda yaklaşık 23 milyon ton sebze üretimi yapılmaktadır. Bu üretimin

yaklaşık % 33’ünü Cucurbitaceae familyasına ait sebze türleri oluşturmakta ve karpuz

bu familya içerisinde üretim bakımından 3.8 milyon tonluk üretimi ile birinci sırada yer

almaktadır (FAO, 2006).

Ülkemiz tarımında büyük ölçüde öneme sahip olan karpuz, domates ve

patatesten sonra en fazla üretilen 3. sebzedir. Üretimin % 35’i Akdeniz Bölgesinde

yapılmaktadır. Ege, Güneydoğu Anadolu ve Marmara karpuz üretiminin yapıldığı diğer

bölgelerdir (Sarı, 2006).

Tüm Citrullus türlerinin gen merkezi Afrika’dır (Robinson ve Deckers-Walters,

1997). Hindistan’ın ise ikincil bir gen merkezi olduğu savunulmaktadır (Whitaker ve

Davis, 1962). Cucurbitaceae familyasına giren Citrullus cinsi, Afrika, Asya ve

Akdeniz’in sıcak bölgelerinde yetişen 4 diploid (n=11) tür içermektedir (Jeffrey, 1975).

Bunlar günümüzde ticari olarak yetiştiriciliği yapılan C. lanatus (Thunb.) Matsum ve

Nakai, C. colocynthis (L.) Schrad., C. ecirrhosus ve C. rehmii De Winter’dir. C. lanatus

ve C. rehmii tek yıllık türler iken, C. colocynthis ve C. ecirrhosus çok yıllık türlerdir.

Yazlık bir sebze olan karpuz, iştah açıcı, ferahlatıcı bir etkiye sahiptir. Aynı

zamanda mide rahatsızlığına, göz ağrılarına, baş ağrılarına iyi geldiği bilinmektedir

(Sarı, 2006). Karpuz, içeriğinde oldukça fazla bulunan likopenin etkili bir antioksidan

olmasından dolayı insanda pankreas, prostat ve mide kanseri riskini azalttığı ve deriyi

UV zararından koruduğu bilinmektedir (Garster, 1997; Anonymus, 2003; Perkins,

2005).

1


Citrullus lanatus var. citroides’in kabuklarından turşu ve konserve yapımında

yararlanılabilir, tohumları haşlanarak ya da un haline getirilerek tüketilebilir (Robinson

ve Decker-Walter, 1997).

Günümüzde birçok yeni çeşit geliştirilmiş olmasına rağmen, hastalık ve

zararlılara dayanıklılığın iyileştirilmesi konusunda çalışmaların devam etmesi

gerekmektedir. Genetiği değiştirilmiş bitkiler, hastalık ve zararlılara dirençli olmasını

sağlamak, tarımsal üretim maliyetlerini azaltmak, ürün kalitesini yükseltmek (elde

edilecek ürünün görünüşü, besin değeri işleme veya muhafazaya ilişkin özelliklerini

iyileştirmek) amacıyla üretilmektedir.

Diğer bitki türlerinde olduğu gibi kabakgillerde de üretimi sınırlandıran en

önemli faktörlerin başında hastalıklar ve zararlılar gelmektedir. Hastalık ve zararlılar;

birim alandan alınan verimin azalmasına, bazı çeşitlerimizin kaybolma tehlikesi ile karşı

karşıya kalmasına, ürün ve kalitenin azalmasına neden olmaktadır. Bunlar içerisinde de

doğrudan mücadelesi olmadığı için virüs hastalıkları önemli bir yere sahip olmaktadır.

Virüs hastalıklarının şiddeti yıldan yıla, virüs, konukçu, vektör ve çevre faktörlerinin

bireysel veya kompleks etkisine göre değişebilmektedir (Sarı ve ark., 1994). Virüs

hastalıkları karpuzda önemli zararlar yapmaktadır ve kontrolleri de oldukça zordur

(Sherf ve Macnab, 1986). PRSV-W (Papaya Ring Spot Virüs), WMV (Watermelon

Mozaic Virüs) ve ZYMV (Zucchini Yellow Mozaic Virüs), Amerika’da karpuzda

önemli zararlara neden olan virüs hastalıkları arasındadır (Adlerz ve Crall, 1967).

Türkiye’de ise bunlardan en yaygın olarak bulunanlarının ZYMV ve CMV (Yılmaz ve

Davis, 1984; Yılmaz ve ark., 1992) olduğu tespit edilmiştir.

En önemli kontrol stratejileri; vektör böcekler için insektisidlerin, konukçu

bitkiler için ise herbisitlerin kullanılması veya genetik dayanıklılıktır (Provvidenti ve

Kyle, 1993). Dayanıklılık genellikle patojen spesifik olmasına rağmen (Grumet, 1989),

virüs hastalıklarının kontrolünde en ekonomik metottur. Bazı kabakgillerde virüs

hastalıklarına dayanıklılık, virüs kılıf proteinleri ile sağlanmakla birlikte (Namba ve

ark., 1992; Quemada ve ark., 1990) karpuzlarda ıslahçıların yararlanabileceği doğal

2


dayanıklılık kaynakları da bulunmaktadır. Kabak Sarı Mozayik Virüsü (ZYMV;

Zucchini Yellow Mosaic Virus); yapraklarda belirli mozayikler oluşturan, yaprak

kenarlarının dişli bir yapı almasına neden olan, yaprakta kloklar, sararma,

deformasyonlar, damar açılmaları, boğum aralarının kısalması ile çeşide ve patotiplere

göre öldürücü semptomlara da neden olabilen bir virüstür; yaprak biti (Aphis gossypii ve

Myzus persicae) ile taşınır. Şekil 1.1.’de Aphis gossypii gösterilmiştir.

Şekil 1.1. Aphis gossypii’nin görünümü

Hastalığa karşı değişik kabakgil türlerinde dayanıklılık özelliği bulunmaktadır.

Kavun türünde de C. melo’ya giren PI414723 materyalinde ZYMV’ye dayanıklılık ve

bu dayanıklılığın tek bir genle idare edildiği saptanmıştır (Pitrat ve Lecoq, 1984). Virüs

hastalıkları dışındaki hastalık ve zararlılarla mücadelede kimyasal preparatlar

kullanılarak kayıplar bir miktar azaltılabilmektedir. Ancak hastalık etmenlerinin

kimyasal maddelere dayanıklı ırklar (suşlar) geliştirmeleri, yeni kimyasalların

kullanımını gerekli kılmakta, bu da doğal dengeyi bozarak önemli çevre sorunlarına yol

açmaktadır. Özellikle son yıllarda çevre bilincinin artmasıyla kimyasal ilaçların ekolojik

denge ve insan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri daha fazla tartışılır hale gelmiş ve

3


böylece kimyasal maddelere alternatif olabilecek sistemler üzerindeki çalışmalar

artmıştır (Çetiner, 1993).

Tarımsal üretimin arttırılmasında modern biyoteknolojik yöntemler arasında

şüphesiz en fazla ilgi çekeni genetik mühendisliği ya da ‘Rekombinant DNA’

teknikleridir. Birçok nedeninin yanında genetik mühendisliğinin açtığı yeni ufuklar bu

yöne doğru harekete meyil vermiştir (Çetiner, 1993).

Genetik mühendisliği ya da Recombinant-DNA teknikleri ile bitkilere gen

transferinde; transgenik hücrelerin doku kültürü koşullarında uygun besi ortamlarında

rejenere olması ve bunlardan bitki elde edilmesi son derece önemlidir. Farklı

genotiplerin ve farklı eksplantların farklı düzeylerde rejenere olduğu karpuzda da bu

konu özellikle dikkat çekecek düzeydedir. Transformasyon çalışmalarında da,

öncelikle söz konusu genotiplerin en yüksek düzeyde rejenere olabildikleri

protokolün optimize edilmesi ile transformasyon sisteminin etkinliğinin arttırılacağı

bilinmektedir (Çürük, 1999).

Powel-Abel ve ark. (1986)’na göre virüslere dayanıklı bitkilerin elde

edilmesinde izlenen yol bakteri ve funguslara dayanıklılıktan oldukça farklıdır. Virüs

kılıf proteinlerini şifreleyen genler saptanıp gerekli konstrüksiyon işlemlerinden sonra

bitkilere aktarıldığında, yeterli çapraz korunmanın sağlandığı görülmüştür. Bu temel

prensip ile farklı taksonomik gruplara ait virüslerin kılıf proteinlerini şifreleyen genlerin

aktarıldığı çeşitli ürün bitkilerinde sera veya tarla denemelerinde de hastalık

simptomlarının geciktiği veya hiç görülmediği saptanmıştır. Bunlara örnek olarak;

tütünde tütün mozaik virüsü (TMV), tütün şerit virüsü (TSV), tütün çıngırak virüsü

(TRV), yonca mozaik virüsü (AIMV), hıyar mozaik virüsü (CMV), soya mozaik virüsü

(SMV), patateslerde patates yaprak kıvırcıklığı virüsü (PLRV), patates X ve patates Y

virüsleri verilebilir.

Bugüne kadar elde edilen transgenik bitkilerin önemli bir bölümünde,

Agrobacterium aracılığı ile gen aktarma yöntemi kullanılmıştır. Çift çenekli bitkilerde

kanser gibi tümör oluşturan A. tumefaciens’in bu özelliği bilim adamlarının ilgisini

4


çekmiş ve bu hastalığa neden olan etmenler biyokimyasal ve genetik olarak saptanmıştır.

Elde edilen sonuçların birleştirilmesi ile tümör oluşturan etmenlerin, Agrobacterium

tumefaciens içerisindeki büyük bir plasmid (pTi= tümör oluşturan plazmid) üzerinde

bulunan ve oksin biyosentezi (iaaM ve iaaH) ile sitokinin biyosentezinde (ipt) rol

oynayan enzimleri şifreleyen genler olduğu belirlenmiştir (Zambryski, 1992).

A.tumefaciens bakterisi, bitki hücresini infekte ettiğinde, hücre genomu ile

bütünleşen ve Ti-plasmidi üzerinde bulunan bir T-DNA bölgesi vardır (Şekil 1.2.). Bu T-

DNA üzerinde bulunan genlerin bir kısmı (ilk ve son 25 baz çifti) hücre genomu ile

bütünleşmeyi sağlayan genlerdir. Bunların arasındaki genlerden üçü oksin ve sitokinin

biyosentezinde rol oynayan enzimlerin sentezlenmesinden sorumludur. İşte bu genler

eğer çıkartılır, yerine istenilen özellikleri karakterize eden gen veya genler yerleştirilir ve

bitki hücresi yeni oluşturulan A. tumefaciens ile bulaştırılırsa, sözü edilen gen veya

genlerin hücre genomuna aktarılmış olacağı kabul edilmektedir. Ancak çok sayıda bitki

hücresi ile çalışıldığı için, istenilen genleri almayan hücreler de olacaktır. Bu nedenle

transgenik hücrelerin erken dönemde tanımlanması ve geni almamış hücrelerin elimine

edilmesi gerekmektedir. Bu amaçla istenilen genler dışında bir de işaret genleri T-

DNA’ya eklenir. İşaret genleri seçilebilir olabileceği gibi ölçülebilir de olmaktadır.

5


Şekil 1.2. Agrobacterium tumefaciens’in Ti Plasmid Bölgesi

Aminoglycosid, hygromycine, streptomycine ve spectynomycine ile

gentamycine gibi antibiyotiklere, herbisitlere dayanıklılık sağlayan genler ve diğer seçici

genlerdir. Bu genler arasında en çok kullanılan, Neomycine PhosphoTransferaz II (NPT

II)’dir. NPT II geni Aminoglycoside olarak adlandırdığımız kanamycine, gentamicine ve

paromgycine gibi antibiyotiklere dayanıklılık sağlamaktadır. Basta (PPT) diye bilinen

bir herbisite karşı dayanıklılığı karakterize eden ise Bar geni olup, seçilebilir gen olarak

gen transformasyonlarında kullanılmaktadır (Hinchee ve ark., 1994).

Araştırmacılar T-DNA sınırları içerisine yerleştirilen herhangi bir DNA

parçasının kolaylıkla bitki hücresine aktarılabildiğini keşfetmişlerdir (Leemans ve ark.,

1982; Schell ve Montagu, 1983).

6


Rhizobiaceae familyasının bir türü ve aynı zamanda doğanın genetik mühendisi

olan Agrobacterium, bitkinin kök boğazında oluşan yaralardan bitkiyi enfekte ederek

kök boğazı uruna neden olan Gram (-) negatif bir bakteridir (Şekil 1.3.). Agrobacterium

enfeksiyonu sonucunda bitki hücresinde bulunan Ti (Tumor inducing) plazmidi üzerinde

yer alan hareketli bir DNA parçası olan T-DNA (Transfer DNA) bitki hücrelerine

aktarılmakta ve kromozomlarla sabit olarak bütünleşmektedir (De la Riva ve ark.,

1998; Zaenen ve ark., 1974).

Şekil 1.3. A. tumefaciens ve Meydana Getirdiği Tümör Dokusu

Agrobacterium tumefaciens kullanılarak ‘Karpuz Mozaik Virüs II’ (WMV) ve

‘Zucchini Yellow Mosaic Virus’in (ZYMV) kılıf protein geni Nicotiana benthamiana

bitkisine aktarılmıştır. VMV II veya ZYMV’nin kılıf protein genini ekspres eden

transgenik N. benthamiana bitkileri, WMVII ve diğer 6 potyvirüs (BYMV, PVY,

PeaMV, CYVV, PeMV, TFV) ile inoküle edildiği zaman simptom gelişimine karşı

korunma göstermişlerdir.

Sunulan bu tez çalışmasında, Crimson Sweet karpuz çeşidine, Vat (Aphis

gossypii’ye dayanıklılık) genini aktararak afit saldırılarına karşı dayanıklılığı sağlamak

ve virüs taşınımını engellemek amaçlanmış, aynı zamanda Crimson sweet karpuz

7


çeşidinin rejenerasyon etkinlikleri, direkt organogenesis ile bitki elde edilmesi ve

transformasyon etkinliği araştırılmıştır.

8

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Selay ELDOĞAN

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

2. 1. Karpuz (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum and Nakai) Bitkisinde

Yapılmış Olan Doku Kültürü Çalışmaları

Dong ve Jia (1991), sekiz adet farklı karpuz çeşidi ile yaptıkları bir rejenerasyon

çalışmasında, sürgün organogenesisi üzerine kotiledon yaşı ve hormonların etkilerini

incelemiş ve 0.5 mg/l IAA içeren MS ortamında 5 gün çimlendirildikten sonra kesilmiş

kotiledon eksplantlarının 0.2 mg/l Kinetin içeren MS ortamında kültüre alınması ile en

başarılı sonuçların elde edildiği bildirilirken; elde edilen sürgünlerin 0.1 mg/l NAA

içeren MS ortamında köklendirildiği ifade edilmiştir.

Compton ve ark. (1993), in vitro şartlarda çimlenmeye alınan karpuz bitkisinin

21 günlük fidelerinden alınan sürgün uçlarını, 8 hafta boyunca BA, kinetin (0, 1, 5 veya

10 μM) ve thidiazuron (TDZ; 0, 0.1, 1 ya da 5 μM) içeren katı MS ortamında inkübe

etmişlerdir. Araştırmada, optimum BA seviyesi (1 μM) içeren ortamlar, TDZ’nin en iyi

(0.1 μM) ve kinetinin 10 μM konsantrasyonuyla karşılaştırılmıştır. BA eklenmiş MS

ortamlarında yaklaşık 1.5-2.8 kat daha fazla aksiller sürgünlerin oluşumu gözlenmiştir.

Çeşitli diploid ve tetraploid genotiplerin 1 μM BA içeren ortamda aksiller sürgünlerinin

uzun süreli hızlı çoğaltma yeteneklerinin gözlendiği çalışmada ; Minilee, Dixielee ve

tetraploid genotiplere göre Bush Jubilee ve Jubilee ΙΙ’nin, aksiller sürgün sayısının daha

fazla olduğu tespit edilmiştir. Genotiplerin genelinde kültüre alındığı ilk dönemlerde, her

eksplant başına düşen sürgün sayısının düşük olduğu (2.7-4.0), 2-3 ayda (5.3-12.5) en

yüksek seviyeye ulaştığı ve 6 ayda (3.7-7.7) düştüğü bildirilmiştir. Bunun tam tersine

"Bush Jubilee" genotipinde eksplant başına sürgün sayısının, kültürün 1. ayında

maksimum değerde (11.7) olduğu, 6. alt kültürde ise bu değerin 7.7’ye düştüğü ifade

edilmiştir. Köklenen sürgünlerin oranının genotip ve kültür süresine bağlı olarak % 60

ile % 100 arasında olduğu, dış koşullara alıştırılmış bitkilerin oranının ise % 21 - % 96

9


arasında değiştiği bildirilmiştir. Bu uygulamalara göre 250 fide kullanılarak 3 ayda

13200 bitki üretilmiştir.

Compton ve Gray (1994), yaptıkları çalışmada 4 karpuz hattında (F92U8,

SP90-1, SP90-2, SP90-4) 2, 4, 6, 8, 10 günlük çimlenmeden (1 litresinde MS + 20 g

şeker + 100 mg myo-inositol + 2 mg glycine + 0.5 mg pyridoxine HCl + 0.5 mg

nicotinic asit + 0.1 mg thiamine HCl + 7 g agar olan ortam içerisine tohum ekimi

yapılmış) sonra aldıkları kotiledon eksplantlarını, 8 hafta boyunca rejenerasyon

ortamında (MS + 30 gram şeker + 10 μM N- (phenylmethyl)-1 H –purin-6 amine (BA))

geliştikten sonra sürgünler, 4 hafta sürgün geliştirme ortamında (MS + 20 g şeker)

kültüre almışlardır. Bu çalışmada, 2 günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından ve

F92U8 (% 66) ve SP90-2 (% 60) hatlarından en yüksek sürgün miktarı elde edilmiştir. 4

günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından elde edilen SP90-4 genotipinde % 40

oranında sürgün bulunduğu bildirilmiştir. Araştırmacıların, bu çalışmada 2 ve 4 günlük

çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından elde edilen sonuçlarda sürgün miktarının daha

çok bulunduğu bildirilmiştir.

Compton ve ark. (1994), yaptıkları çalışmada diploid karpuz çeşidi olan

Mickylee’nin kotiledonlarını 6 hafta sürgün rejenerasyon ortamına almışlar ve adventif

sürgünlerin elde edildiğini bildirmişlerdir. 1-2 cm’lik sürgün uçlarının 1 μM IBA’lı

ortama aktarılması ile bitkilerin elde edildiğini belirtmişlerdir. Rejenerasyon düzeneği

ile elde edilen tetraploid ve diploid bitkilerin yapraklarında bulunan bekçi hücrelerindeki

kloroplast miktarı ile tanımlamışlardır. Bu çalışma sonunda her bitkide en az 30 bekçi

hücresi çifti sayılmıştır ve diploid bitkilerde ortalama 11.2, tetraploid bitkilerde ise 18.6

kloroplast gözlemlediklerini bildirmişlerdir.

Tang ve ark. (1994), in vitro’da çimlendirilen triploid karpuzlardan elde edilen

kotiledon yapraklarından meydana gelen tomurcuk eksplantlarını 16 farklı ortam

içerisinde kültüre almışlardır. Araştırmacılar, yüksek rejenerasyonu (% 93.33), 3 mg/l

BA’yı MS ortamı içerisine ilave ettiklerinde sağlamışlardır ve çoğalma katsayısının da

8.71 olduğunu bulmuşlardır. Bu bitkileri, farklı BA ve IAA konsantrasyonlarının 9 farklı

10


kombinasyonunu içeren MS ortamına alan araştırıcılar, en iyi sonucu 2 mg/l BA ve 1

mg/l IAA içeren MS ortamının verdiğini ve ilk 20 generasyonda 5, 10 generasyonda ise

8 ortalama çoğalma katsayısı verdiğini bildirmişlerdir. Böylece, 6 ayda sekiz generasyon

(80.000 - 100.000) üretilmiştir. Bu bitkilerin, Lagenaria siceraria var. Clavata anacına

aşılanmadan önce MS ortamına 2 mg/l BA + 1 mg/l IAA + 2 mg/l GA3 (giberellik asit)

eklenmesiyle geliştirildiğini belirtmişlerdir. Aşılanan bitkilerin % 90’ından fazlasının

yaşadığı ve % 95’inden fazlasının da toprağa aktarıldıktan sonra yaşamaya devam

ettiğini bildirmişlerdir.

Compton ve ark. (1996), Dixielee, Jubilee II, Mickylee, Minilee ve Royal

Sweet karpuz çeşitlerinin kotiledon eksplantlarının kullanımı ile 6 haftalık sürgün

rejenerasyon ortamında adventif sürgünlerin elde edildiğini bildirmişlerdir. Araştırmada,

rejenerasyon sonucunda elde edilen bitkilerin ploidi düzeyleri bekçi hücrelerindeki

kloroplast miktarı sayılarak belirlenmiştir.

Guo ve ark. (2000), yaptıkları çalışmada in vitro kültürde eksplant kaynağı

olarak 5 farklı diploid karpuz çeşidinde kotiledon kullandıklarını bildirmişlerdir.

Adventif sürgün ayırt edilmesinde eksplantların sürgün oluşturma oranı, çoğalma

katsayısı, sürgün anormallik yüzdesi ve tetraploid çeşitlerde eksplantın alındığı yer ve

ortam içeriğindeki hormon konsantrasyonunu etkilediğini belirtmişlerdir. Tetraploid

bitkilerin, sürgünlerin apikal hücrelerindeki kromozom sayısının incelenmesi ile kolayca

tespit edildiğini bildirmişlerdir. Tetraploid bitkilerin diploid bitkilere göre kültür

ortamında besi stresine karşı adaptasyonunun daha iyi olduğunu yaptıkları çalışmada

belirlemişlerdir.

Compton (2000), karpuz kotiledonlarının organogenik yetenekleri üzerine

eksplant büyüklüğü ile çeşit etkilerini araştırdığı bir çalışmada; kotiledonların proksimal

bölgelerinden hazırlanan eksplantlarda yaklaşık % 52 oranında organogenesis tespit

edilirken, bu oranın kotiledonun distal bölgelerinde sadece % 6 oranında kaldığını

saptamışlardır. Araştırıcılar, sürgün oluşumunun basal eksplantlar tarafından

sınırlandırıldığını bildirmişlerdir. Sürgün oluşturan eksplant yüzdesinin Sweet Gem,

11


Crimson sweet ve Minilee’de yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Eksplant büyüklüğünün

Yellow Doll’da adventif sürgün rejenerasyonunu etkilemediğini saptamışlardır. Bunun

da çeşit ve eksplant büyüklüğü arasında önemli bir bağlantı olduğunu bildirmişlerdir.

Araştırıcılar bu çalışma ile çeşitlerin çok azının in vitro prosedürlere yanıt verdiği ve

sürgün rejenerasyonu için çok az miktarda etkili hücreye sahip olduğunu saptamışlardır.

Yalçın Mendi ve ark. (2003), Crimson Sweet karpuz çeşidinde yaptıkları

çalışmada steril edilmiş tohumların MS rejenerasyon ortamında çimlendirildiğini ve 5

günlük tohum kotiledonlarından alınmış eksplantların benzyl adenine (BA) (0, 5, 10, 20

μM) ve indole-3-acetic acid (IAA) (0, 0.5, 5 μM) kombinasyonları içeren MS

rejenerasyon ortamında kültüre alındığını belirtmişlerdir. Araştırma sonucunda

maksimum sürgün gelişimi 10 μM BA + 0.5 μM IAA ve 20 μM BA (% 75 ve % 78)

içeren rejenerasyon ortamında direkt organogenesis yoluyla oluşmuştur.

Krug ve ark. (2005), Citrullus lanatus’da kültür ortamı içerisine sitokinin

eklenmesi ile kotiledon parçalarından in vitro organogenesis yolu ile sürgün ucu elde

edilmesini amaçladıkları bir çalışmada, eksplant kaynağı olarak 1, 3 ve 5 günlük

çimlenen tohumlardan distal ve proksimal kotiledon bölgelerini kullanmışlardır.

Araştırma sonucunda in vitro organogenesisin karpuzda yüksek bulunduğu, üç günlük

çimlenen tohumlardan alınan kotiledonların proksimal bölgelerini MS ortamı içerisine

aldıklarını, bu ortam içerisine BAP (1 mg/l) ve hindistan cevizi suyu (% 10)

eklediklerini belirtmişlerdir. Bu çalışmada, karpuzda organogenesisin, kallus

oluşturmaksızın, eksplantın epidermal ve subepidermal katmanlarında meydana geldiği

tespit edilmiştir. Ayrıca adventif sürgünlerin, sürgün ucu meristemleri ve yaprak

primordiyasının gelişmesiyle karakterize olduğu ve şişkinlik oluşumlarında adventif

gözlerin gelişmediği gözlenmiştir.

Nasr ve ark. (2005), yaptıkları çalışmada tetraploid ve diploid karpuzun

çoğaltımında sürgün uçları ve nodüllerin kesilmesiyle oluşturulan eksplantlardan, basit

ve hızlı bir protokol ile yüksek başarı sağladıklarını belirtmişlerdir. Karpuz tohumları

çimlendirme ortamında 6 - 14 günlük zaman aralıklarında çimlenme göstermişler ve

12


kotiledon yapraklardan alınan eksplantlar BA (0, 0.25, 0.5, 1, 2.5 ve 5 mg/l)’nın ve IBA

(0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/l)’nın farklı kombinasyonlarında test edildiklerinde en

yüksek yüzde sürgün oluşumunu 1 mg/l BA içeren, kök oluşumunun en iyi 0.5 mg/l IBA

içeren MS ortamlarında meydana geldiğini görmüşlerdir. Araştırıcılar yüksek miktarda

sitokinin konsantrasyonunun MS ortamına eklenmesiyle tohumların aksillar

tomurcuklarının gelişmesine teşvik edici özelliğe sahip olduğunu gözlemlemişlerdir.

İnan (2007), in vitro yöntemlerle tetraploid bitki elde edilmesini amaçlandığı

çalışmada, Crimson sweet karpuz bitkisi için 4 farklı BA (0, 1, 2, ve 4 mg/l) içeren MS

rejenerasyon ortamını kullanmıştır ve 7 günlük aralıklarda, 4 hafta boyunca yeşil kallus,

tomurcuk ve sürgün oluşumu oranlarını incelemiştir. Yapılan gözlemler sonucunda, ilk 7

günlük sürede en düşük yeşil kallus oranı % 78.3 ile 4 mg/l BA konsantrasyonunda, en

yüksek oran ise % 93.3 ile 2 mg/l BA konsantrasyonunda gözlenmiştir. Araştırıcı

yapmış olduğu son gözlemlerde en düşük yeşil kallus oluşturma oranı % 96.6 ile 4 mg/l

BA konsantrasyonunda gözlenirken, en yüksek oran % 100 ile 1 mg/l BA

konsantrasyonunda gözlemlenmiştir. En düşük sürgün geliştirme oranı % 21.6 ile 2 mg/l

BA konsantrasyonunda bulunurken, en yüksek % 68.3 ile 1 mg/l BA konsantrasyonunda

bulunmuştur. En düşük tomurcuk geliştirme oranı % 41.6 ile 4 mg/l BA

konsantrasyonunda bulunurken, tomurcuk geliştirme oranının en yüksek olduğu 2 mg/l

BA konsantrasyonunda bu oran % 66.6 olarak gözlenmiştir.

2.2. Cucurbitaceae Familyası Türlerinde Yapılmış Olan Doku Kültürü ve

Gen Transformasyon Çalışmaları

Karpuzda (Citrullus lanatus) genetik kaynak koleksiyonu bazı virüs

hastalıklarına dayanıklılık açısından taranmış ve bazı PI genotiplerinin ZYMV’ye

(Boyhan ve ark., 1992) ve WMV’ye (Gillaspie ve Wright, 1993) dayanıklı olduğu

tespit edilmiştir.

13


Pil ve ark. (1993), tarafından yapılan çalışmada Sweet Gem çeşidinin kotiledon

eksplantlarının proksimal kısmı kesilerek kullanılmıştır. Sürgün oluşumu için 1 mg/l-1

BA içeren MS ortamı denenmiştir. Kotiledon eksplantları, PB121 binary vektörünü

taşıyan CAMV 35S promotoru ve β-glocuronidose (GUS) geni, reportör gen olarak da

NOS promotoru ve neomycin fosfotransferaz genini içeren plasmidi bulunduran

Agrobacterium tumefaciens LBA44 04 ırkı ile inoküle edilmiştir. Eksplantlar, 1 mg/l

BA, 250 mg/l carbenicillin ve 100 mg/l kanamycin içeren MS rejenerasyon ortamında

16 saatlik fotoperriyotta mat beyaz florasan ışığında kültüre alınmıştır. Sweet gem

karpuz çeşidi için gen aktrama çalışmalarında ikili vektör pBI121 ortamında kültüre

alınmıştır. 4 hafta sonra eksplantlardan adventif sürgün formları görülmüştür. Southern

blot analizleri GUS geninin genomik DNA’daki varlığını doğrulamıştır.

Sang ve ark. (2005), yapmış oldukları çalışmada, karpuz bitkisinde, anaçların

daha az verimli olduğu için farklı fidelerle aşılanması gerektiğini belirmişlerdir. Ticari

anlamda önemli karpuz türlerinde meydana gelen CGMMV gibi virüslerinin

enfeksiyonundan kaynaklanan karpuz ürünü kaybını azaltmak için hastalıktan koruyucu

anaçlara ihtiyaç duyulduğunu belirtmişlerdir. Bu yüzden CGMMV kılıf protein genini(

CGMMV-CP) kodlayan cDNA’i kullanarak bir CGMMV dayanıklı karpuz anacını

geliştirmişlerdir ve Gongdae isimli bir karpuz anacına başarılı bir şekilde geni

aktarmışlardır. Transformasyon oranının % 0.1 - 0.3 kadar yavaş olmasının sebebinin

kullanılan transformasyon metodundan olabileceğini belirtmişlerdir. Southern blot

analiziyle CGMMV-CP geninin tekli ya da çoklu kopyalarının genomun farklı

bölgelerine de yerleştirildiğini belirtmişlerdir. CGMMV’ye yönelik dayanıklılık testleri

140 T1 bitkisinin 10’unun CGMMV enfeksiyonuna dayanıklı olduğunu

doğrulamışlardır.

Fang ve Grumet (1990), adlı araştırmacılar tarafından Agrobacterium

tumefaciens npt II, kanamisin dayanıklılık, genini taşıyan LBA 4404 suşunu içeren sıvı

bakteri kültürü içinde 4-5 günlük kavun fidelerine ait kotiledonlar kesilmiş, aynı sıvı

içerisinde 10-60 dk. bekletilerek kokültivasyon süresinin etkisi denenmiştir. 10 dakikalık

14


ko-kültivasyon süresinin transformasyon için uygun olduğu tespit edilmiştir.

Eksplantlar, seleksiyon ortamına konulmadan önce, 5 µM IAA, 5 µM BAP, 1 µM ABA

içeren MS ortamında 3 gün kültüre alınmıştır. Seleksiyon için 0-200 mg/l arasında

kanamisin dozları denenirken, en etkili kanamisin konsantrasyonu 75 mg/l olarak

saptanmıştır. 3-5 hafta içinde sürgün rejenerasyonu gözlenirken, Southern blot analizleri

ile bu sürgünlerin % 80’inin nptII geni taşıdığı tespit edilmiştir.

Dabauza ve ark. (1997), tarafından yapılan çalışmada BA, NAA veya IAA’in

farklı kombinasyonlarının Citrullus colocynthis’in kotiledonlarının rejenerasyonu

üzerine etkisi incelenmiş, en iyi sonucun 25 µM BA’dan elde edildiği saptanmış ve %

81.8 oranında organogenik kallus oluşumu gözlenmiştir. Organogenik kallus, gelişme

ortamına (MS + 0.5 µM BA) transfer edildiği zaman % 80 oranında gelişmiş sürgün

formasyonu gözlenmiştir. Oluşan sürgün formasyonları 2.5 veya 5 µM içeren IBA

içeren köklenme ortamına konuldukları zaman normal köklenme oluşumu görülmüştür.

Bitkiler sera koşullarında büyütülmüş ve normal meyve verdikleri gözlenmiştir.

Kotiledon eksplantları Agrobacterium tumefaciens LBA4404 ırkının pB1121 binary

vektöründe β -glucoronidase (gus) reportör genini ve neomycin phosphotransferase

(nptII) markır genini taşıyan bakteri ile ko-kültüvasyon ortamlarında muamele

edilmiştir. Transformantların büyüme kapasitesi 100 mg/l Kanamisin içeren ortamda

seçilmiştir. B- glucoronidase ekspresyonunun transformasyon oranı % 14.2 olarak

saptanmıştır. Genler transfer edildiğinde (gus, nptII) eşeysel transmisyon doğrulanmış ve

Fı’de birçok transgenik bitki elde edilmiştir.

Toppi ve ark. (1997), tarafından kabak (Cucurbita pepo L.) bitkisine,

Agrobacterium rhizogensis’in NCPPB 1855 suşu ile gen transformasyonu yapılmış, bu

amaçla Lungo Fiorentino ve Diamant hibrit çeşitlerinin tohumları in vitro koşullarda

steril olarak çimlendirildikten sonra 2, 6 ve 8 haftalık bitkiciklerin kök ve kotiledonları,

yara dokusu oluşturularak bakteri süspansiyonu ile muamele ettirilmiştir. Southern blot

tekniği uygulanan kabak bitkilerinde istenilen genin aktarılmış olduğu görülmüştür.

15


Gaba ve ark. (1999)’nın çalışmalarına göre; hıyar, kavun ve karpuz gibi çoğu

kabakgil türlerinde kotiledon yaprağının proksimal kısmının tohum apeksine yakın

kesim bölgesi regenerasyon açısından en çok aktif olan bölge olarak kabul edilmektedir.

Pang ve ark. (2000), yaptıkları bir çalışmada Kabak Mozaik

Komovirüsünedayanıklılık kazandırılmış 3 transgenik kabak hattını kullanarak kabak

mozaik komovirüsünün kılıf protein geninin ifadesini araştırmışlardır. Bu denemeyi

sera, açık arazi ve screenhouse koşullarında kurmuşlardır. Virüs inokulasyonu

sonucunda, SqMV-127 hattının diğer iki hattan daha dayanıklı (sera koşullarında % 86,

screenhouse koşullarında % 63 ve açık arazi koşullarında % 100 ) olduğunu

belirtmişlerdir.

Çürük ve ark. (2003), kavunda transgenik bitki elde edilmesine yönelik

yaptıkları bir çalışmada; Revigal, Topmark ve Kırkağaç kavun çeşitleri ile C. sativus

Lcv. Taoz hıyar çeşidinin hipokotil eksplantlarını kullanmışlardır. Araştırmada, 4.4 µM

BA içeren MS ortamında hızlı ve direkt rejenere olan çoklu sürgün oluştuğunu

gözlemişlerdir. Hipokotillerin rejenerasyonundan yaklaşık % 100 diploid sürgünler elde

edilirken, kotiledon eksplantlarından oluşan rejenerasyonda % 40’dan % 70’e kadar

değişen oranlarda poliploid bitki oluşumu saptanmıştır. Revigal kavun çeşidinin

kotiledon eksplantlarının rejenerasyon için ışığa ihtiyaç duyduğu, bununla birlikte

hipokotil eksplantlarının hem karanlık hem de aydınlıkta rejenerasyona uğradığını

gözlemişlerdir.

Martin ve ark. (2003), yapmış oldukları çalışmada, Vat geni taşıyan kavun

hatlarında A. gossypii tarafından oluşturulan virus taşınımına karşı dayanıklıklık

mekanizmasını araştırmışlardır. Vat geni, kavunlarda temel vektör olan A .gossypii

tarafından virüs taşınımının engellenmesini sağlamaktadır. Çalışmalarında, afitin bitki

üzerindeki davranışları araştırılmış fakat dayanıklılık arasındaki ilişki anlaşılamamıştır.

Ayrıca afit virulansa karşı hassas ve dayanıklı (Vat geni taşıyan) kavun türleri

incelenmiş, Cucumber Mozaik Virüs (CMV) inoküle edilmiş A. gossypii içeren hassas

bitkilerin bir önceki araştırılan dayanıklı bitkilere göre daha etkili olduğu saptanmıştır.

16


Selvaraj ve ark. (2006), Cucumis sativus’un kotiledon eksplanlarından yüksek

miktarda sürgün rejenerasyonu ve organogenik kallus elde etmişlerdir. 5 gün

çimlendirme ortamında kültüre alınan tohumların kotiledon eksplantları NAA (2.69 µM)

ve BA (4.44 µM) içeren rejenerasyon ortamına alınarak 20 gün aralıklarla alt kültüre

alınşmıştır. Bu deneme sonucunda yoğun miktarda organogenik kallus elde edilmiştir.

Meydana gelen organogenik kalluslar, NAA (1.34 µM), BA (8.88 µM), Zeatin (0.91

µM) ve I-glutamin (136.85 µM) içeren MS ortamına aktarıldıklarında % 75.6 adventif

sürgün elde etmişlerdir. 20 günlük aralıklarla alt kültüre alınan bu adventif sürgünlerin

kardeşlenme gösterdiği görülmüştür. Gelişme gösteren eksplantlar GA3 (1.44 µM) ve

BA (4.44 µM) ile desteklenen MS ortamı içerinde 1 cm oluncaya kadar sürgün

geliştirme ortamına aktarılmışlar, daha sonra köklendirme aşamasında IBA (3.42 µM) ve

BA (4.44 µM) içeren MS ortamında kültüre alınmışlar ve bu bitkiciklerden % 80

oranında canlılık elde edilmiştir.

17

3. MATERYAL VE YÖNTEM Selay ELDOĞAN

3. MATERYAL VE YÖNTEM

Çalışma 2007-2008 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe

Bitkileri Bölümü Doku Kültürü ve Biyoteknoloji Laboratuvarında yürütülmüştür.

3.1. Materyal

3.1.1. Rejenerasyon ve Transformasyon Denemelerinde Kullanılan Bitki

Materyalleri

Rejenerasyon ve transformasyon denemelerinde Crimson sweet karpuz çeşidine ait

tohumlar bitki materyali olarak kullanılmıştır.

3.1.2. Transformasyon Denemesinde Kullanılan Plazmid ve Bakteri Irkları

Genetik materyal olarak Fransa’nın Ulusal Tarımsal Araştırma Enstitüsünde

(INRA) pozisyonal klonlama yöntemi ile izole edilmiş ve farklı Agrobacterium suşlarına

yerleştirilmiş olan Vat geni (VatB1.3 ve Vat B1.1) kullanılmıştır.

VatB1.3: Agrobacterium tumefaciens C58C1-pmp90 (Goodner et al.Science, 294

(5550), 2323-2328, 2001) ırkı pBin19 plasmidini (Bevan et al, Nucleic Acids Res

12:8711-8721, 1984) içermekte ve bu plasmid içerisinde de 2.5 Kb uzunluğunda vat

regülatör dizinleri içeren 11 Kb’lik kavun genomik DNA’sı, NPTII (Kanamysin’e

dayanıklılık geni) ve promotor dizini bulunmaktadır.

VatB1.1: Agrobacterium tumefaciens C58C1-pch32 (Goodner et al, Science, 294

(5550), 2323-2328, 2001) ırkı pBin19 plasmidini (Bevan et al, Nucleic Acids Res

12:8711-8721, 1984) içermekte ve bu plasmid içerisinde de 2.5 Kb uzunluğunda vat

regülatör dizinleri içeren 11 Kb’lik kavun genomik DNA’sı, NPTII (Kanamysin’e

dayanıklılık geni) ve promotor dizini bulunmaktadır (Şekil 3.1).

18


Şekil 3.1. Kavun Genomik DNA’sı NPTII (Kanamysin’e dayanıklılık geni) ve

Promotor Dizini (Materyal Anlaşma Formu)

19


3.2. Yöntem

3.2.1. Rejenerasyon ve Transformasyon Denemeleri için Sterilizasyon

Uygulamaları

Bu tez çalışmasında karpuz tohum sterilizasyonundan kaynaklanan

kontaminasyon sorunuyla karşılaşılmamıştır. Optimize edilmiş olan sterilizasyon

koşulları transformasyon için kullanılacak olan karpuz tohumlarına uygulanmıştır.

Rejenerasyon denemeleri için 2 farklı sterilizasyon denemesi kurulmuştur.

Laboratuvar koşullarında pens yardımıyla kabukları çıkartılan tohumlar, steril

kabin içerisinde % 70’lik etil alkolde (% 96) 10 dk. bekletildikten sonra 1 defa saf su ile

yıkanmış ve 1-2 damla Tween 20 içeren % 5’lik sodyum hipoklorit çözeltisinde 10 dk.

bekletilmiştir. Daha sonra karpuz tohumları 5-6 defa saf su ile yıkanmıştır. Yüzeyi

deterjandan arındırılmış olan karpuz tohumları whatman filtre kağıdı üzerinde

kurutularak çimlendirme ortamına aktarılmıştır.

Rejenerasyon denemelerinde en iyi sterilizasyon koşullarını belirlemek amacıyla

farklı 2 uygulama yapılmıştır. Denemede kullanılacak olan tohumların yarısı % 70’lik

etil alkolde (% 96) 5 dk. bekletildikten sonra 1 defa saf sudan geçirilerek daha sonra %

20’lik sodyum hipoklorit çözeltisinde 10 dk. bekletilmiş ve 5-6 defa saf sudan

geçirilerek steril edilmiştir. Tohumların diğer yarısı ise etil alkol olmaksızın sadece %

20’lik sodyum hipoklorit çözeltisi içerisinde 10 dk. bekletilerek daha sonra 5-6 defa saf

sudan geçirilerek steril edilmiştir. Karpuz tohumları whatman filtre kağıdı üzerinde

kurutularak içerisinde 25 ml besi ortamı bulunan kavanozlara aktarılıp çimlendirilmek

üzere iklimlendirme odası koşullarına bırakılmıştır. Şekil 3.2.’de, uygulanan

sterilizasyon aşamaları gösterilmiştir.

20


Şekil 3.2. A) Yüzey Sterilizasyonu için Hazırlanan Karpuz Tohumları; B) Pens

Yardımıyla Tohum Kabuklarının Çıkarılması; C) Alkol ve Sodyum Hipoklorit Çözeltileri ile Tohumların Muamelesi; D) Saf Su ile Tohumların Yüzeyinin Deterjandan Arındırılması; E) Tohumların Filtre Kağıdı Üzerinde Kurutulması; F) Tohumların Çimlendirme Ortamına Aktarılması

21


3.2.2. Tohumların Doku Kültürü Koşullarında Çimlendirilmesi

Tohumlar steril edildikten sonra steril kurutma kağıtları üzerinde kurutulmuş ve

büyüme düzenleyici içermeyen MS tuzları (Murashige ve Skoog, 1962) + MS

vitaminleri + 0.1 mg/l myo-inositol % 3 sukroz +% 7.5 g/l agar içeren besi ortamında 16

saatlik fotoperiyotta 25-26 0C’de 5 gün kültüre alınmıştır.

3.2.3. Genel Doku Kültürü Şartlarının ve Besi Ortamlarının Hazırlanması

Doku kültürü ve transformasyon uygulamalarının tümü laboratuvar koşulları

altında yürütülmüştür. Çalışmada, steril koşulların sağlanması için steril kabinler

kullanılmıştır. Kabin içerisinde kullanılan bistüri ve pensler önceden otoklavda steril

edilmiş ve % 96’lık etil alkole batırıldıktan sonra elektrikli sterilizatörde sterilizasyona

devam edilmiştir. Ön hazırlık odasında hazırlanan besi ortamları, 121 0C’de, 1.5 atm

basınç altında 15 dakika otoklav edildikten sonra amacımıza uygun olarak 20 ml steril

petrilere ya da 25-30 ml steril cam kavanozlara aktarılmıştır. Besin ortamı olarak MS

(Murashige ve Skoog, 1962) temel ortam bileşimi kullanılmıştır. Tohum çimlendirme

aşaması için bitki büyüme düzenleyici içermeyen MS ortamına % 3 sakkaroz ve % 7,5

agar ilave edilerek pH 5.7’ye ayarlanmıştır. Rejeneresyon denemelerinin farklı

aşamalarında besin ortamlarına bitki büyüme düzenleyiciler ve transformasyon

çalışmalarının farklı aşamalarında besin ortamlarına bitki büyüme düzenleyiciler ve

antibiyotik ilavesi yapılmıştır. Antibiyotik ilavesi gereken çalışmalarda, antibiyotik

sterilizasyonu 0.2 mikron çapta por genişliğine sahip filtreler kullanılarak yapılmış ve

daha sonra steril edilen besin ortamlarına ilave edilmiştir. Otoklav şartları altında

antibiyotiklerin kimyasal yapısı bozulacağından besin ortamlarına sonradan eklenmiştir.

MS ortamına göre mineral tuzların ve vitaminlerin isim ve konsantrasyonları Çizelge

3.1’de olduğu gibidir.

22


Çizelge 3.1. M.S. Temel Besin Ortamında Bulunan Besin Maddeleri ve

Konsantrasyonları (Murashige ve Skoog, 1962)

Makro Elementler (MURASHIGE ve SKOOG, 1962)

(mg/l) KNO3 NH4NO3 MgSO4.7H2O CaCl2 KH2PO4

1900 1650 370 332.2 170

Mikro Elementler (MURASHIGE ve SKOOG, 1962) (mg/l)

MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O FeNaEDTA

16.9 8.6 6.20 0.83 0.25 0.025 0.025 36.72

Vitaminler (MURASHIGE ve SKOOG, 1962) (mg/l)

Myo-inostol Pyridoxine-HCI Nicotinik Asit

Amino asit (MURASHIGE ve SKOOG, 1962) (mg/l)

Thiamine-HCI Glycine

0.4 2.0

Diğer Sakaroz (g/l) Agar (g/l) pH

30 7 5.7

23


3.2.4. Rejenerasyon Ortamına İlave Edilecek Uygun Bitki Büyüme

Düzenleyicilerinin ve Uygun Konsantrasyonlarının Belirlenmesi

Etkili bir rejenerasyon protokolü oluşturarak adventif sürgün gelişimini elde

etmek amacıyla standart MS ortamı içerisine Çizelge 3.2.’de gösterilen çeşitli

hormonların farklı konsantrasyonları ve farklı kombinasyonları eklenerek besin

ortamları hazırlanmıştır. Her denemede 5 petri kullanılmış ve her petride 8 eksplant

olacak şekilde kültüre alınmıştır. Deneme, kotiledon ve proksimal eksplant kısımları

yanında 2’şer petri de hipokotil eksplant kısım olarak 3 eksplant tipi denenmiştir.

Büyütme odasında 16 saatlik fotoperiyotta 25-26 0C’de kültüre alınan eksplantlar 4

haftada bir alt kültüre alınarak 2 ay boyunca gözlenmiştir. Gözlemlerde eksplantlar

üzerinde tomurcuk, sürgün ve kallus oluşumları oranlarına bakılmıştır.

24


Çizelge 3.2. Rejenerasyon Denemesinde Kullanılan Bitki Büyüme Düzenleyicileri

Konsantrasyonları ve Kombinasyonları

Kullanılan Bitki Büyüme

Düzenleyiciler

Konsantrasyonları

BAP 0.0 mg/

BAP 0.5 mg/l

BAP 1.0 mg/l

BAP 2.0 mg/l

BAP 4.0 mg/l

IAA 0.0 mg/l

IAA 0.1 mg/l

IAA 0.2 mg/l

BAP + IAA 0.5 mg/l+ 0.1 mg/l

BAP + IAA 1.0 mg/l + 0.1 mg/l







25


3.2.5. Araştırmada Kullanılacak Olan Eksplant Kaynağının Belirlenmesi

Araştırmada, rejenerasyon ve transformasyon denemelerinde karpuz bitkisine ait

tohumlar 5 günlük çimlendirme ortamından alındıktan sonra, rejenerasyon uygulamaları

saf su içerisinde (testasının çıkması ve tohumun kurumaması için), transformasyon

uygulamaları ise bakteri solüsyonu içerisinde gerçekleşmiş, tohumların apikal meristemi

ve distal kısmı kesilerek atılmış ve karpuz tohumlarının arta kalan kısımları ise

proksimal ve kotiledon kısımları olarak ayrılmıştır. Proksimal ve kotiledon kısımlara ek

olarak karpuz tohumlarından çimlenme görülen hipokotil kısımları da eksplant kaynağı

olarak kullanılmıştır. Şekil 3.3’de hazırlanan kültür ortamının petrilere dökülmesi ve

Şekil 3.4’de ise eksplantların kotiledon ve proksimal kısım oluşturmak amacıyla

kesilmesi gösterilmiştir.

Şekil 3.3. Hazırlanan Besi Ortamlarının Petrilere Dökülmesi

26


Şekil 3.4. Eksplantların Kesilerek Yara Dokusu Oluşturulması ve MR Ortamına Yerleştirilmesi

3.2.6. Gen Aktarma Çalışmalarında Uygulanan Denemeler

3.2.6.1. Transformayonda Kullanılacak olan Bakteri Solusyonunun Yoğunluğunun Belirlenmesi Spektrofotometrede okunan değerler sonucunda en uygun değerin 750 µl olduğu

görülmüştür.

Spektofotometrede uygun bakteri konsantrasyonu O.D. 600 nm Lamda

600 olarak belirtilmiştir .

3.2.6.2. Agrobacterium tumefaciens ve İnokulasyon Solusyonunun Hazırlanması

Çalışmada INRA araştırma enstitüsünden temin edilen Vat B1.1 ve Vat B1.3

bakteri suşları kullanılmıştır.

Bakterileri katı ortamda geliştirilmek amacı ile Katı LB ortamı, sıvı ortamda

geliştirmek için ise Sıvı LB ortamları hazırlanmıştır. LB ortamı içeriği Çizelge 3.3.’te

gösterilmektedir. Şekil 3.5’te ise bakteri solüsyonunun hazırlanmasında kullanılan

materyal gösterilmiştir.

27


Çizelge 3.3. Bakteri Geliştirme Ortamı (LB) için Kullanılan Kimyasallar Maddeler ve Konsantrasyonları (Luria, 1951)

Tryptone

NaCl

Yeast extract

Agar

pH

10 g

10 g

5 g

7 g

7

Şekil 3.5. Bakteri Solüsyonu Hazırlanmasında Kullanılan Materyal

Agrobacterium tumefaciens’e ait olan Vat B.1.1 ve Vat B.1.3. ırkları, LB ortamı

içerisine agar eklenerek hazırlanan katı ortamlarda öze yardımı ile çizilerek 28 0C’de

geliştirilmiştir. Vat B.1.1 için LB + 50 mg/l Kanamycin ve Vat B.1.3 için 50 mg/l

Kanamycin + 20 mg/l Gentamcyin kullanılmıştır.

28


Sıvı bakteri kültürünün hazırlanmasında, katı LB ortamında gelişen bakteri

kolonilerinden öze yardımı ile tek koloni seçilmiş ve içerisinde katı LB ortamında

bulunan aynı antibiyotik konsantrasyonları kullanılarak hazırlanmış olan Sıvı LB

içerisine aktarılmıştır (Şekil 3.6).

Şekil 3.6. A) Sıvı LB Hazırlanışı; B) Tek Bakteri Kolonisi İşaretlenmesi; C) Pipet Ucu ile Tek Koloni Alınışı; D) LB Ortamına Bakteri Ekilmesi

Bu şekilde hazırlanan bakteri kültürü 200 rpm/dk.’da ve 28-30 0C’de çalışan

çalkalayıcı içerisinde bir gece inkübe edilmiştir. Bir gece inkübe edilen bakteri

solüsyonundan yapılan spektofotometre ölçümleri sonucunda en uygun olan miktar 750

µl olarak belirlenmiş ve 750 µl bakteri solüsyonu her bir bakteri ırkı için farklı olan

29


antibiyotik konsantrasyonlarını içeren Sıvı LB içerisinde 200 rpm/dk.’da 3-4 saat kültüre

alınmıştır (Şekil 3.7).

Şekil 3.7. Bakteri Solüsyonunun Karıştırıcıya Alınması ve 24 Saat Çalkalayıcı İnkübatörde Kalan Bakteri Solüsyonunun Hazırlanması

3.2.6.3. Eksplantların A. tumefaciens ile İnokulasyonu

Doku kültürü şartlarında kabukları soyulduktan sonra sterilizasyonu yapılan

karpuz tohumları bitki büyüme düzenleyici içermeyen MS ortamına ekilerek 5 gün

çimlendirilmeye alınmıştır. 5 günlük çimlendirme sonunda tohumlar Şekil 3.6.’da

belirtildiği gibi hazırlanmış olan A. tumefaciens inokulasyon solusyonu içeren petri kabı

içerisinde kesilerek hazırlanmıştır. Tohumlarda, bakterinin dokulara girebilmesi için

yara dokusu oluşturularak proksimal ve kotiledon kısım şeklinde eksplantlar

oluşturulmuştur. Eksplantlar aynı bakteri solusyonu içerinde 30 dakika bekletildikten

sonra solusyonun fazlası, whatman no:1 filtre kağıdı ile alınmıştır.

30


3.2.6.4. A. tumefaciens ile İnokulasyondan Sonra Aktarılan Besi Ortamları

Eksplantlar, ko-kültivasyon ortamı olarak antibiyotik içermeyen, M1 (4.4 g/l MS

Bazal medium, 30 g/l sukroz, 0.1 mg/l IAA, 2 mg/l BAP, 7.5 g/l agar, pH.5.8) ortamında

karanlıkta 25-26 0C’de 3 gün boyunca kültüre alınmıştır. 3. günün sonunda eksplantlar

rejenerasyon ortamından alınarak steril edilmiş saf su ile 5-6 defa yıkandıktan sonra

geliştirme ve seçici seleksiyon ortamı olan M2 (M1 ortamı ile birlikte 750 mg/l

sefuroksim sodyum) ve M3 (M1 ile birlikte 750 mg/l sefuroksim sodyum ve 200 mg/l

kanamysin) ortamlarına proksimal ve distal kısım olarak yerleştirilmiş ve her petride 16

eksplant olacak şekilde yerleştirilen karpuz tohum eksplantları 16 saatlik fotoperiyotta

25-26 0C ’de 3 haftada bir alt kültüre alınmak suretiyle 9 hafta boyunca kültüre

alınmışlardır. 9 hafta sonunda rejenere olan bitkicikler rejenerasyon ortamına ek olarak

içerisinde kanamisin ve sefuroksim sodyum içeren M3 seciçi seleksiyon ortamına

alınmışlardır.

Tüm rejenerasyon seçim uygulamaları 25-26 0C da 16 h fotoperiyotta (30. μ

mol.m-2 s-1 floresan beyaz ışık) in vitro’da kültüre alınmıştır. Rejenerasyon seçimini

takiben 4 hafta M3 ortamında kalan bitkiciklerden gelişimini devam ettirenler sürgün

geliştirme ortamı olan MSG (4.4 g/l MS Bazal ortamı, 30 g/l sukroz, 2 mg/l BAP, 8.0 g/l

agar, pH:5.8+ M1 ile birlikte 750 mg/l sefuroksim sodyum ve 200 mg/l kanamysin)

ortamına aktarılmışlardır ve gelişmeye devam eden bitkiciklerin transgenik olabileceği

düşünülmüştür. Köklendirme aşamasında ise MSR ortamı (4.4 g/l MS Bazal ortamı, 30

g/l sukroz, 0.01 mg/l NAA, 8.0 agar, ph:5.8) kullanılmıştır(Şekil 3.8).

31


Şekil 3.8. M3 Ortamında Gelişen Bitkiciklerde Meydana Gelen Kardeşlenme ve

Bitkiciklerin Temizlenerek MSG Ortamına Aktarılması

3.2.6.5. Gen Aktarma Çalışmalarında Kullanılan Etkili Kanamisin

Konsantrasyonunun Belirlenmesi

Transformasyon için kurulan denemelerde kanamisinin en etkili

konsantrasyonunu belirlemek amacıyla, 50, 100, 200, 400 mg/l kanamisin

konsantrasyonu denenmiştir (Şekil 3.9.). Denemelerde kanamisinin farklı

konsantrasyonları, en iyi rejenerasyon ortam içeriğine eklenmiştir. Eksplant kaynağı

olarak transformasyon denemeleri düzeneğinde mevcut olan, 2 mg/l BAP + 0.1 mg/l

IAA + 750 mg/l sefuroksim sodyum içeren (M2), rejenerasyon ortamında gelişme

gösteren bitkicikler kullanılmıştır. Her denemede 10 kavanoz, her kavanozda 3 bitkicik

olacak şekilde deneme kurulmuştur. Büyütme odası koşulları rejenerasyon denemeleri

ile aynı olacak şekilde ayarlanmıştır. Bitkiciklerde, kardeşlenme ve yapraklarda sararma

32


oranlarına bakılmış ve ortam içerisindeki antibiyotik en fazla 20-25 gün etkili

olduğundan dolayı 3 hafta gözlem yapılmıştır.

Şekil 3.9. Etkili Kanamisin Konsantrasyonlarının Belirlenmesi için Denemede Uygulanan Konsantrasyonlar

3.2.7. Moleküler Uygulamalar

Gen aktarma çalışmaları sonunda karpuz bitkilerinde Vat geninin varlığını tespit

etmek için moleküler çalışmalar yapılmıştır. Moleküler uygulamalara ait analizler

Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü Bitki Biyoteknolojisi

laboratuvarında gerçekleştirilmiştir.

3.2.7.1. DNA İzolasyonu

Transformasyon çalışmaları sonucunda MSG (2 mg/l BAP + 0.1 GA3 +

Kanamisin + 750 mg/l sefuroksim sodyum) ortamı içerisinde karpuz eksplantlarında

meydana gelen sürgünlerden alınan örneklerle DNA izolasyonu yapılmıştır.

33


İzolasyon sırasında uygulanan aşamalar aşağıda belirtildiği gibidir (Şekil 3.10).

0.1 g yaprak dokusu alınarak havan içerisinde sıvı azot ile birlikte öğütülür,

Öğütülen yaprak örnekleri 1.5 ml’lik tüplere aktarılır,

Tüpler içerisine 400 µl CTAB ekstraksiyon solusyonu eklenir (400 ml CTAB

ekstraksiyon solüsyonu içerisinde 396 ml CTAB, 4 µl β -mercaptoetanol vardır),

Tüpler homojenizasyon sağlanana kadar karıştırılır,

Tüpler 65 0C de 20 dk. ısıtıcıda bekletilir. Bu işlem sırasında tüpler 2 defa karıştırılır,

Tüpler içerisine 400 µl kloroform:izoamilalkol (24:1) eklenir, 15 dk. karıştırıcıda

çalkalanır ve 13000 rpm’de 5 dk. santrifüj edilir,

İçerisine 400’er µl soğuk (-20 0C) izopropanol eklenen temiz epondorf tüplerine,

santrifüjden çıkan örneklerin süpernatant kısımları pipet yardımıyla çekilerek

eklenir,

Örnekler 1 saat süreyle – 20 0C’de bekletilir,

13000 rpm’de 5 dk. santrifüj yapılır,

Süpernatant dikkatli bir şekilde dökülür, peletin kuruması için tüpler ters çevrilir,

Pelet 100 µl TE buffer içerisinde yeniden çözdürülür, hemen ardından her örneğe 4

µl RNaz eklenir,

Tüpler hafif bir şekilde karıştırılır, 15 dk. oda sıcaklığında bekletilir,

Her tüpe % 100 soğuk etanol eklenir, tüpler hafifçe karıştırılarak 1 saat -20 0C’de

bekletilir,

13000 rpm’de santrifüj yapılır,

Süpernatant kısmı dikkatli bir şekilde dökülür, tüpler peletin kuruması için ters

çevrilir,

Pelet 100 µl TE buffer içerisinde yeniden çözülür,

PCR’da kullanılmak üzere örnekler -20 0C’de bekletilir.

34


B

Şekil 3.10. A) Karpuz Eksplantlarının İzolasyon İçin Öğütülmesi; B) Öğütülen Materyalin Fırça Yardımıyla Ependorflara Alınması; C) Eksplatların CTAB Solüsyonuyla Muamelesi; D) İçerisine CTAB Eklenen Örneklerin Isıtıcıda Bekletilmesi

35


3.2.7.2. PCR Protokolünün Optimizasyonu ve Uygulanması

İzolasyonu gerçekleştirilen genotipler ve sentetik olarak hazırlanmış primerler

kullanılarak PCR reaksiyonları (Şekil 3.11) gerçekleştirilmiştir. PCR reaksiyonlarında

kullanılan primer kombinasyonları Çizelge 3.4’da gösterilmiştir.

Şekil 3.11. PCR Analizleri İçin Termal Cycler

36


Çizelge 3.4. PCR’da Kullanılacak Primerler

Primer Sekans (5'-3') TM V551R (forward) GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC 64°C V588 (reverse) CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG 62°C LRR1R (forward) GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC 61°C LRR915 (reverse) AACAATTAGAACCATCTCCCAGC 61°C V1276F (forward) TGTCACAAACTGAACTTTTAAGGA 58°C V1276R (reverse) CTGTTCAACTAACAGAACCAATTC 57°C

Primer Pozisyon uzunluk (Vat) PCR bant

PI161(Dayanıklı) Vedrantais (Duyarlı)

V551R (forward) Vat Promotor 1684 bp 1684 bp Vat Tek bant 1300 bp V588 (reverse) Ekzon 1

LRR1R (forward) Ekzon 2 1549 bp 1549 bp Vat-1372 bp Vat benzeri

4 bant 1300, 1100, 900 ve 750 bp

LRR915 (reverse) Ekzon 3 V1276F (forward) İntron 1 1276 bp 1276 bp Vat-1266 bp Vat benzeri Tek bant 1650 bp V1276R (reverse) İntron 2

PCR protokolünün optimizasyonu için çeşitli denemeler yapılmıştır. Bu

denemeler sonucunda optimum protokol tespit edilmiş olup, tüm genotipler ve ilgili

primerler kullanılarak bu protokole göre PCR reaksiyonları gerçekleştirilmiştir.

Çalışmada kullanılan 3 farklı Forward + Reverse primerlerin bağlanma sıcaklıkları tespit

edilmiş ve her primer ile PCR reaksiyonu gerçekleştirilirken ilgili bağlanma sıcaklıkları

uygulanmıştır. Uygulanan PCR protokolü Çizelge 3.5’de gösterilmiştir.

37


Çizelge 3.5. PCR Reaksiyonlarında Uygulanan Protokol

PCR Master Mix 15.625 μl Primer (Forward) 1.25 μl 10 μM Primer (Reverse) 1.25 μl 10 μM MgCI 1.25 μl ddH2O 3 μl Taq Polimeraz 0.125 μl

Toplam hacim 25 μl olacak şekilde aşağıda verilen koşullarda reaksiyon

gerçekleştirilmiştir.

PCR Döngü Programı

94 0C 2 dk ön ‘’denaturation’’

94 0C 1 dk DNA’nın çift ipliğinin ayrılması ‘’denaturation’’

57-64 0C 45 sn primerlerin bağlanması ‘’annealing’’

72 0C 2 dk yeni iplikçiğin yazılımı ‘’extention’’

72 0C 10 dk son yazılım

4 0C ∞

3.2.7.3. DNA Kalite ve Kantitesinin Belirlenmesi

DNA izolasyonları sonucu elde edilen DNA’ların konsantrasyonları ve saflıkları

spektrofotometrede (Nanodrop) 260 ve 280 nm’de okuma yapılarak belirlenmiştir (Şekil

3.12).

38


Şekil 3.12. DNA Kalite ve Kantitesinin Spektrofotometrede Belirlenmesi

3.2.7.4. Elektroforez Koşulları

Elde edilen PCR ürünlerine 5 µl 6 x boya solusyonu eklenmiş ve % 1.5’lik

agaroz jel’de Şekil 3.13.’de görüldüğü gibi, 1x TAE (Trizma Base, Glacial Asetic Asid,

EDTA (Na2.EDTA.H2O) solusyonu eklenerek koşulmuştur. Jel, % 0.1 oranındaki

ethidium bromide solusyonu ile boyanmıştır. İşlem sona erdikten sonra UV altında DNA

bantlarına bakılmış ve oluşan amlifikasyon ürünlerinin varlığı tespit edilmiştir.

Şekil 3.13. Agarose Jel Elektroforezde PCR Ürünlerinin Koşulması

39

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Selay ELDOĞAN

4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Tohumlarda Sterilizasyon Çalışmaları

Çalışmamızda tohumlara uygulanan sterilizasyon (% 70’lik alkolde 10 dakika +

% 5’lik sodyum hipoklorit çözeltisinde 10 dk. + 5 defa steril saf su ile yıkama)

sonucunda kontaminasyon ile karşılaşılmamıştır. Kontaminasyon dışında bitkilerde

gelişmeyi yavaşlatma ya da yanma gibi bazı olumsuz etkenleri ortadan kaldırmak

amacıyla sterilizasyon için farklı yöntemler denenmiştir.

Yüzey sterilizasyonunda alkol kullanmaksızın yapılan sterilizasyon sonucunda

bitkilerde meydana gelen kallus, rejenerasyon tomurcuğu gibi oluşumlar Çizelge 4.1.’de

verilmiştir.

Yapılan denemeler sonucunda alkol ve sodyum hipoklorit çözeltisinin ikisi

birlikte kullanılarak sterilizasyonu yapılan Crimson sweet tohumlarının 5 günden daha

uzun sürede hipokotil kısımlarının oluştuğu ve çimlenmeye başladığı görülmüştür.

Elde edilen eksplantların proksimal kısımlarında sürgün tomurcuklarının düşük

oranda meydana geldiği ve karpuz tohumlarında meydana gelen bu rejenerasyonun (10

hafta) uzun bir süre sonunda oluştuğu görülmüştür. Bu süre içerisinde eksplantlarda

sadece kallus oluşumu gözlenmiş, rejenerasyon tomurcuğu gözlenmemekle beraber, az

sayıda düzensiz hücre grupları görülmüştür.

40


Çizelge 4.1. Sodyum Hipoklorit ile Yapılan Sterilizasyonda Meydana Gelen Tomurcuk

ve Kallus Oluşumu Oranları

PROKSİMAL KOTİLEDON

Bitki Büyüme Düzenleyiciler

ve Konsantrasyonları

Kullanılan Eksplant

Sayısı

Tom. Sayısı

SürgünSayısı

Kallus Sayısı

Tom. Sayısı

Sürgün Sayısı

Kallus Sayısı

Kontrol 80 1 0 0 1 0 0

BA 0.5 mg/l 80 19 25 0 2 0 38

BA 1 mg/l 80 5 0 20 1 0 32

BA 2 mg/l 80 5 0 6 4 0 35

BA 4 mg/l 80 5 0 26 0 0 0

IAA 0.1 mg/l 80 0 1 0 0 0 0

IAA 0.2 mg/l 80 0 0 0 0 0 0

BA 0.5+IAA 0.1 mg/l 80 27 21 0 4 0 28

BA 1+IAA 0.1 mg/l 80 19 0 20 0 0 27

BA 2+IAA 0.1 mg/l 80 15 7 20 0 0 23

BA 4+IAA 0.1 mg/l 80 6 1 26 0 0 31

BA 0.5+IAA 0.2 mg/l 80 1 0 21 0 0 13

BA 1+IAA 0.2 mg/l 80 11 0 23 0 0 14

BA 2+IAA 0.2 mg/l 80 8 0 13 0 0 24

BA 4+IAA 0.2 mg/l 80 6 0 7 1 0 19

41


4.2. Çimlenme ve Rejenerasyon için Uygun Ortam Koşullarının Belirlenmesi

Karpuz tohumu eksplantlarının çimlenmesi ve rejenerasyonunda uygun ortam

koşullarını sağlamak amacıyla Compton (1999)’un yapmış olduğu bitki dokusuna

karanlık uygulamasıyla ilgili çalışmasında, Crimson sweet karpuz çeşidinin tohumlarının

kabuklarını çıkarttıktan sonra 5 gün süre ile karanlık ve aydınlık ortamlarda çimlendirme

ortamına yerleştirmiş ve kotiledonların proksimal kısımları 5 μM BA içeren MS

rejenerasyon ortamına yerleştirmiştir. Araştırıcı, 3 hafta aralıklarla alt kültüre alınan

eksplantları 6 hafta boyunca gözlemlediğinde, karanlıkta çimlenen embriyoların, 16

saatlik fotoperiyotta çimlenenlere göre daha iyi oranda sürgün oluşturduğunu

gözlemlemiştir.

Bizim çalışmamızda sterilizasyon uygulandıktan sonra çimlendirme ortamına

yerleştirilen Crimson sweet tohumları 6 gün 16 saatlik fotoperyotta ve yarısı da karanlık

ortamda bırakılmıştır. 6 gün sonra proksimal ve kotiledon olarak oluşturulan eksplant

kısımları 10 μM BA + 0.5 μM IAA içeren rejenerasyon ortamına aktarılmıştır. 2 hafta

sonunda karanlık ortamda çimlendirmeye alınan tohumların eksplantların oluşan

proksimal ve kotiledon eksplant kısımlarında 16 saatlik fotoperiyotta çimlendirilen

tohumlardan 3 kat daha fazla çimlenme ve şişme gerçekleştiği gözlenmiştir.

4.3. Katılaştırıcı Maddenin Miktarının Belirlenmesi

Rejenerasyon çalışmalarında kullanılacak en uygun agar miktarı 8 g olarak

modifiye edilmiştir. Fakat yapılan trasnformasyon ve rejenerasyon denemeleri sırasında

bu agar miktarının bitki gelişimini engelleyici etkisi olduğu görülmüştür. Bu sonuçların,

firmalardan alınan farklı kalitedeki agarlarla yapılan denemelerden kaynaklanabileceği

düşünülmüştür. Agar miktarı % 7.5 g olarak ayarlanmıştır. Uygulanan bu agar

miktarının denemelerde daha iyi sonuç verdiği görülmüştür.

42


Bu tez çalışmasında transformasyon denemeleri için rejenerasyon aşamalarından

geçirilen Crimson sweet tohum eksplantlarında, proksimal kısımda daha yüksek olmakla

beraber, rejenerasyon ve kardeşlenme açısından iyi sonuç sağlanmıştır. Kotiledon

kısımlarda meydana gelen bu sapmaların kullanılan farklı genotipe ait tohumlardan ya

da alkol kalitesinden kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Bununla beraber çalışma

şartlarının sürekliliğini sağlayan dış etkenlerin; ışık, sıcaklık, nem gibi faktörlerin de

rejenerasyonda etkili olabileceği bilinmektedir.

4.4. Bitki Rejenerasyon Ortamının Belirlenmesi Çalışmalarda, Crimson sweet tohumlarının gelişimi için uygun bitki büyüme

düzenleyiciler MS ortamına eklenerek sağlanmıştır. Sterilizasyondan sonra su ile

meydana gelebilecek kontaminasyonu engelleyebilmek amacıyla filtre kağıdı üzerinde

kurutulan tohumlar MS bazal ortam içerisine yerleştirilmişlerdir.

Rejenerasyon ortamı, BA ve IAA bitki büyüme düzenleyicilerin farklı

konsantrasyon ve kombinasyonları denenerek optimize edilmiştir. Crimson sweet

tohumlarından rejenerasyon yeteneğini gözlemleyebilmek amacıyla proksimal,

kotiledon, hipokotil gibi farklı eksplant kısımları kullanılmıştır. Besi ortamında

kullanılan BA (0, 0.5, 1, 2, 4 mg/l) ve IAA (0, 0.1, 0.2 mg/l) hormon

kombinasyonlarından elde edilen sonuçlar Çizelge 3.2.’de gösterilmiştir.

Beş günlük çimlendirme ortamından sonra kesilerek rejenerasyon ortamlarına

alınan Crimson sweet tohum eksplantlarında 10 gün içinde proksimal kısımların

yaklaşık % 80’inde, kotiledon kısımların ise % 20’sinde şişmeler başladığı görülmüştür.

3 haftalık zaman içerisinde, kotiledon kısımlarda proksimal kısımlara oranla daha fazla

kallus oluşumları meydana gelmektedir. 6-8 hafta arasında değişen aralıklarda proksimal

kısımlarda rejenerasyon tomurcukları ve bunu takip eden bitkiciklerin ilk yaprakları

belirmektedir. Kotiledon kısımlarda ise aynı zaman diliminde kallus oluşumdan farklı

olarak düzensiz hücre toplulukları meydana gelmektedir. Eksplanta göre değişmekle

beraber 8-10 hafta içinde proksimal kısımdan çoğalma yeteneğine sahip, kardeşlenme

43


gösteren bitkicikler meydana gelmektedir. Kotiledon kısımda ise meydana gelen

oluşumlar, düzensiz hücre gruplarına doğru olmaktadır.

44


Çizelge 4.2. BA ve IAA’nın Farklı Konsantrasyon ve Kombinasyonlarında Tomurcuk

ve Kallus Oluşumu Oranları

PROKSİMAL KOTİLEDON

Bitki Büyüme Düzenleyiciler

ve Konsantrasyonları

Kullanılan Eksplant

Sayısı

Tomurcuk Sayısı

Kallus Sayısı

Tomurcuk Sayısı

Kallus Sayısı

Kontrol 80 0 0 0 0

BA 0.5 mg/l 80 5 0 0 11

BA 1 mg/l 80 9 0 0 23

BA 2 mg/l 80 15 0 0 21

BA 4 mg/l 80 5 0 0 18

IAA 0.1 mg/l 80 0 0 0 0

IAA 0.2 mg/l 80 0 0 0 0

BA 0.5+IAA 0.1 mg/l 80 3 0 0 8

BA 1+IAA 0.1 mg/l 80 11 0 0 1

BA 2+IAA 0.1 mg/l 80 20 0 0 22

BA 4+IAA0.1 mg/l 80 16 0 0 1

BA 0.5+IAA 0.2 mg/l 80 12 0 0 26

BA 1+IAA 0.2 mg/l 80 14 0 0 19

BA 2+IAA 0.2 mg/l 80 4 0 0 12

BA 4+IAA0.2 mg/l 80 2 0 0 15

45


Besi ortamlarına yerleştirilen eksplantların farklı bölgelerinde değişen zaman

aralıklarıyla tomurcuklar meydana geldiği görülmüştür. Çizelge 4.2’de görülüğü gibi

tomurcuk oluşumu ve bunun takibinde sürgün oluşumu gibi evrelerde en yüksek sonuç 2

mg/l BA + 0.1 mg/l IAA, 4 mg/l BA + 0.1 mg/l IAA kombinasyonları ile sadece 2 mg/l

BA konsantrasyonlarından meydana gelmiştir. Tohumların proksimal kısmında görülen

tomurcuk oluşumlarının yanında, yüksek BA konsantrasyonlarında kallus oluşumu da

gözlenmiştir. Kotiledon kısımlarda ise proksimale oranla daha uzun zamanda meydana

gelen tomurcuklar, kallus oluşumlarının takibinde meydana gelmektedir. Apikal

meristemi çıkartılan tohumların hızlı rejenere olma yeteneğine sahip hücrelere yakın

olan kısımlarından sürgün tomurcukları oluşmuş ve kotiledon kısmın bu oluşumlardan

yaklaşık 20 gün sonra, önce kallus daha sonra tomurcukların oluşumu gözlenmiştir.

Bunun yanında hipokotil kısım eksplantlarında ise proksimal kısım ile eş zamanlı

meydana gelen oluşumlar gözlenmiştir (Şekil.4.1).

Şekil 4.1. Hipokotil Eksplantın Gelişiminden Bir Görünüm

46


Compton ve ark. (1994)’nın farklı karpuz hatlarında 1 mg/l BA içeren

rejenerasyon ortamını kullanarak farklı çimlenme süreleri sonunda meydana gelen

sürgün miktarını inceledikleri çalışmalarında, en iyi sürgün miktarını 2 ve 4 günlük

kotiledonlardan elde etmişlerdir. Yalçın-Mendi ve ark. (2003)’nın yapmış oldukları

çalışmada, Crimson sweet karpuz tohumlarında BA (0, 1, 2, 4 mg/l) ve IAA (0, 0.5, 5

µM) kombinasyonlarını içeren MS rejenerasyon ortamını kullanarak eksplantları kültüre

almışlardır ve en iyi sürgün gelişim miktarını 10 µM BA + 0.5 µM IAA ve sadece 20

µM BA içeren MS ortamında direkt organogenesis ile elde etmişlerdir. Bu tez

çalışmasında yapılan rejenerasyon denemeleri araştırıcılar tarafından optimize edilen

büyüme düzenleyicilerle paralellik göstermektedir.

Karpuz bitkilerinde meydana gelen rejenerasyonun farklı hormon

konsantrasyonlarında, farklı zaman periyotlarında meydana gelen oluşumlar Şekil 4.2’de

gösterilmektedir.

47


Şekil 4.2. Farklı Bitki Büyüme Düzenleyiciler ve Konsantrasyonunun

Karpuz Bitkisinde Etkileri A) Kotiledon; B) Proksimal

48


4.5. Transformasyon Çalışmaları

4.5.1. Transformasyon Çalışmalarında Kullanılan Hormon Konsantrasyonları ve

Antibiyotik Uygulaması

Gen aktarma çalışmalarında, antibiyotik (750 mg/l sefuroksim sodyum) içeren

besi ortamı M2 (4.4 g/l MS Bazal medium, 30 g/l sukroz, 0.1 mg/l IAA, 2 mg/l BAP, 7.5

g/l agar, pH.5.8 + 750 mg/l sefuroksim sodyum), rejenerasyon ortamı olarak

kullanılmıştır. Transformasyon denemelerinde yapılan en iyi bitki büyüme düzenleyici

konsantrasyon ve kombinasyonunun Yalçın-mendi ve ark. (2003) tarafından optimize

edilen konsantrasyon olduğu doğrulanmıştır. Yüksek BA konsantrasyonunda karpuz

eksplantlarında kallus oluşumu ve düzensiz hücre gruplarının meydana geldiği

görülmüştür (Şekil 4.3.).

49


Şekil 4.3. A, C, E, G)Kotiledon Kısım Eksplantlarının Gelişimi; B, D, F, H) Proksimal

Kısım Eksplantlarının Gelişimi

50


4.5.2. Transformasyon için Sürgün Geliştirme Ortamının Belirlenmesi

Rejenerasyon ortamında sürgün oluşumu görülen karpuz tohum eksplantları 6

hafta sonunda seçici seleksiyon ortamı olan M3 (4.4 g/l MS Bazal ortamı, 30 g/l sukroz,

0.1 mg/l IAA, 2 mg/l BAP, 7.5 g/l agar, pH.5.8, 750 mg/l sefuroksim sodyum ve 200

mg/l kanamysin) ortamına aktarılmıştır ve 6 hafta sonra sürgün geliştirme ortamı olan

MSG (4.4 g/l MS besi ortamı, 30 g/l sukroz, 2 mg/l BAP, 7.5 g/l agar, pH.5.8 + 750 mg/l

sefuroksim sodyum ve 200 mg/l kanamisin) ortamına aktarılan bitkilerin kardeşlenme

olan kısımları ayrılmıştır.

Karpuz eksplantlarındaki gelişim diğer Cucurbitaceae familyasındaki türlere

göre daha uzun sürede görülmesine rağmen meydana gelen bitkicikler, optimize edilen

rejenerasyon ortamı içerisinde her eksplanttan 6 tane kardeş bitkicik meydana

getirebilmektedir. Alt kültüre alınan bitkicikler canlılıklarını koruyarak sürgün

geliştirmeye devam etmektedirler (Şekil 4.4.).

Şekil 4.4. Çoğalma Aşamasında Bitki Görünümü

Karpuz eksplantlarında transformasyon çalışmalarında kullanılan bakterinin (Vat

B1.1 ve Vat B1.3, Agrobacterium tumefaciens), bitkinin aktif bir şekilde gelişebilmesi

için besi ortamına temas etmemesi gerekmektedir. Bu nedenle besi ortamında, hem

51


bakterinin hem de bitkinin seçilebilmesi için kullanılan antibiyotikler bulunmaktadır.

Kullanılan antibiyotiklerden Timentin=Sefuroksim sodyum, besi ortamında bakterinin

gelişmesini engellemek için; kanamicin, gentamisin ise Vat B1.1. ve Vat B 1.3’ün

seçilmesinde, aynı zamanda içerisinde bakteri olan bitkilerin ortamda canlılığını devam

ettirebilmesi için besi ortamlarına eklenmiştir. Denemede kullanılan antibiyotikler, bitki

gelişiminin ileri safhalarında gelişmeyi ket vurabilmekte ve bunun sonucunda bitki

yapraklarında sararmalar gibi bir takım simptomlar meydana gelebilmektedir.

4.5.3. Transformasyon Çalışmalarında Kanamisin Uygulaması

Bu tez çalışmasında transformasyon denemelerinde kullanılan bitki eksplantları

içerisinde 750 mg/l sefuroksim sodyum ve 200 mg/l kanamysin bulunan MSG (sürgün

geliştirme ortamı) ortamı bitkiler için en uygun seleksiyon ortamı olarak bulunmuştur.

Kullanılan bu antibiyotikler bakteri gelişimini engellemiş, aynı zamanda bakteriyle

bulaşık olan bitkilerin gelişiminin devam etmesini sağlayabilmiştir.

Bitki eksplantlarının seçici seleksiyon ortamında gelişebilmesi için ortam

içerisine eklenecek olan kanamisin konsantrasyonu, kanamisin denemeleri sonucunda

200 mg/l olarak optimize edilmiştir. Çizelge 4.3.’de uygun görülen kanamisin

konsantrasyonunun bitkiler üzerindeki sonuçları gösterilmektedir. En fazla canlı bitki

sayısı 200 mg/l kanamisin konsantrasyonundan elde edilmiştir.

Çizelge 4.3. Kanamisin Deneme Sonuçları

Kanamisin Konsantrasyonları (mg/l)

Eksplant Sayısı

Bakteri Oluşumu

Sararma, Kurumalar

Canlı Bitkiler

50 30 21 5 4 100 30 10 8 12 200 30 2 6 22 400 30 12 6 12

52


MSG ortamına aktarılan bitkiciklerin besi ortamına eklenen 0.1 GA3 ile

bitkiciklerin boyunda 1 cm’lik uzamalar Şekil 4.5.’de görülmektedir. Gelişme görülen

bu bitkiciklerden çelik alınarak DNA izolasyonunda kullanılmıştır. Bitkiciklerin,

kotiledon ve proksimal kısımlarında meydana gelen kallus oluşumları da Şekil 4.6.’da

gösterilmiştir.

Şekil 4.5. A) Seçici Seleksiyon Ortamında (M3) Bitkiciklerin Görünümü; B)

Kardeşlenen Bitkiciklerin MSG Ortamındaki Görünümü; C) MSG Ortamındaki

Bitkiciklerin Görünümü; D) GA3 Uygulamasından Sonra DNA İzolasyonu İçin

Kullanılan Bitkiciklerin Görünümü

53


Şekil 4.6. A) Rejenere Olmuş Proksimal Kısım Görünümü; B) Kotiledon Kısımda

Meydana Gelen Kallus Görünümü 4.6. Moleküler Çalışmalar

4.6.1. DNA İzolasyonu

Yapılan transformasyon çalışmaları sonucunda yaklaşık 25 bitki örneği ile DNA

izolasyonları gerçekleştirilmiştir. MSG ortamına kadar canlılıklarını sürdüren bu

bitkilerden izole edilen DNA bantlarında hiç bir amplifikasyona rastlanmamıştır.

4.6.2. DNA’nın Kantite Ve Kalitesinin Belirlenmesi

DNA izolasyonu sonucu elde edilen DNA’ların konsantrasyonları ve saflıkları

spektrofotometrede (Nanodrop) 260 ve 280 nm’de okuma yapılarak belirlenmiştir.

54


Çizelge 4.4. DNA’nın Kantite ve Kalitesinin Belirlenmesi

örnek ng/uL DNA Su 1 218.2 45.8 54.2 2 2129.2 4.7 95.3 3 1700.8 5.9 94.1 4 954.5 10.5 89.5 5 1529.6 6.5 93.5 6 895.9 11.2 88.8 7 850.3 11.8 88.2 8 1450.1 6.9 93.1 9 2536.1 3.9 96.1

10 1732.3 5.8 94.2 11 2585.3 3.9 96.1 12 2058.1 4.9 95.1 13 3048.0 3.3 96.7 14 2188.9 4.6 95.4 15 2910.9 3.4 96.6 16 4498.8 2.2 97.8 17 4704.1 2.1 97.9 18 2424.6 4.1 95.9 19 3269.0 3.1 96.9 20 2164.6 4.6 95.4 21 2463.2 4.1 95.9 22 2525.9 4.0 96.0 23 2247.4 4.4 95.6 24 4318.0 2.3 97.7 25 2503.2 4.0 96.0

55


4.6.3. PCR Sonrası Elde Edilen Bantlar

Yapılan PCR çalışmalarında elde edilen agaroz jel görüntüleri Şekil 4.7., 4.8. ve

4.9.’da gösterilmiştir. Şekillerde L harfiyle kodlanmış bantlar 1 kb DNA Ladder’a aittir.

1 kb DNA Ladder’a ait DNA bant büyüklükleri Şekil 4.10.’da gösterilmiştir. Agaroz Jel

görüntüleri üzerinde C harfiyle kodlanmış bantlar ise transformasyon çalışmaları

sonucunda gen aktarımının gerçekleştiği düşünülen Crimson sweet genotiplerini

göstermektedir. S harfiyle kodlanmış bölüm ise amplifikasyonunu beklemediğimiz su ve

PCR solüsyonlarını içeren bölgelerdir. Agaroz jel görüntüleri üzerinde B harfi ile

kodlanmış bölgeler tez çalışmasında kullanılan Agrobacterium tumefaciens bakterisinin

iki farklı suşuna ait DNA bantlarını göstermektedir. Çalışmada kullanılan bu suşlar Vat

B 1.1 ve Vat B 1.3’tür.

Bu suşların PCR’da çoğalması için bu suşlara ait bir koloni 500 µl otoklav

edilmiş saf su içerisinde çözülmüş ve 10 dakika süreyle 90 0C’ de bekletilmiş, bu

işlemden sonra her iki suşta 1/10, 1/100 ve 1/1000 oranında seyreltilmiş ve hazırlanan

her orandan PCR için 3 µl kullanılmıştır. 22 adet Crimson sweet genotipi ve Kontrol

olarak Crimson sweet genotipine ait örnekler test edilmiştir.

PCR analizleri sonucunda elde edilen agaroz jel görüntülerinde Vat B 1.1 ve Vat

B 1.3. suşu ile ilgili primerlerde amplifikasyon görülmemiştir (Çizelge 4.4.)

56


Şekil 4.7. V551R (forward) ve V588 (reverse) Primerine Ait Agaroz Jel Görüntüsü

57


Şekil 4.8. LRR1R (forward) ve LRR915 (reverse) Primerine Ait Agaroz Jel Görüntüsü

58


Şekil 4.9. V1276F (forward) ve V1276R (reverse) Primerine Ait Agaroz Jel Görüntüsü

59


Şekil 4.10. 1 kb DNA Ladder’a Ait DNA Bant Büyüklükleri (Nei ve Li, 1979)

60

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Selay ELDOĞAN

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu tez çalışmasında Crimson sweet karpuz tohumları ile rejenerasyon denemeleri

yapılmıştır. Rejenerasyon denemelerinde BA ve IAA’nın farklı konsantrasyon ve

kombinasyonları kullanılmıştır. Benzer olarak Crimson sweet’e ait farklı eksplant

kısımları rejenerasyon denemelerinde kullanılmıştır. Doku kültürüne alınacak bitkilerde

kontaminasyon sorunuyla karşılaşmamak amacıyla farklı sterilizasyon yöntemleri

uygulanmıştır. Çalışmanın diğer bölümünde ise Crimson sweet karpuz çeşidine VAT

(Aphis gossyphii’ye dayanıklılık) geninin aktarmak amacıyla transformasyon çalışmaları

sürdürülmüştür.

Çalışmaların transformasyon kısmına geçmeden önce sterilizasyonun ve

rejenerasyon ortamı için en uygun büyüme düzenleyicilerin optimize edilmesi

gerekmektedir. Yapılan rejenerasyon denemelerinde 5 gün çimlendirme ortamında

kültüre alınan Crimson sweet tohumları en uygun rejenerasyonu, daha önceden optimize

edilen hormon konsantrasyonlarında, 2 mg/l BA ve 0.1 mg/l IAA içeren rejenerasyon

ortamında sağlamışlardır. Bu konsantrasyonların yapılan diğer çalışmalarla paralellik

göstermesine rağmen meydana gelen tomurcuk oluşumlarının süresinde değişiklik

görülmüştür. Tohumun proksimal kısmı kotiledon kısımlarına oranla çok daha hızlı

gelişim göstermektedir. Çoğu kotiledon kısmında ise rejenerasyon meydana gelmemiştir.

Farklı bölgelerdeki bu gelişme hızı ve rejenerasyon yeteneğinin, tohumun apikal

meristeminden kaynaklandığı düşünülmektedir. Normal şartlarda çimlenme yeteneğine

sahip olan tohumlar, apikal meristemi çıkarıldığı zaman bu bölgeye yakın olan

baskılanmış hücreler harekete geçmekte ve düzenli hücre gruplarını meydana getirerek

bitkicikler oluşturmaktadırlar. Proksimal kısmın altında kalan bölgelerde ise hücre

bölünmelerinin daha yavaş olduğu görülmüştür.

Yapılan rejenerasyon ve sterilizasyon çalışmalarında ortaya çıkan sorunların farklı

genotiplerdeki tohumların kullanılmasından ve sterilizasyonda kullanılan materyallerden

kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Tohum eksplantlarında meydana gelen sapmaların,

eşit olmayan çimlenme yeteneğine sahip tohumların kullanılmasından da olabileceği

düşünülmektedir. Bunlara ek olarak rejenerasyon denemeleri çalışmalarında tüm dış

61

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Selay ELDOĞAN

etkenlerinin bitki gelişimi için gerekli olan en uygun koşullarının sağlanması önerilebilir.

Işık, nem, sıcaklık gibi önemli faktörler de rejenerasyonu etkileyebilmektedir.

Tez çalışmasının transformasyon bölümünde Crimson Sweet karpuz çeşidine, Vat

(Aphis gossypii’ye dayanıklılık) genini aktararak afit saldırılarına karşı dayanıklılığı

sağlamak ve bu sayede virus taşınımını engellemek amaçlanmıştır.

Önemli bir zararlı olan Kabak Sarı Mozayik Virüsü (ZYMV; Zucchini Yellow

Mosaic Virus), yapraklarda belirli mozayikler oluşturan, yaprak kenarlarının dişli bir yapı

almasına neden olan, yaprakta kloklar, sararma, deformasyonlar, damar açılmaları gibi

hastalıklara yol açmaktadır. Bu virus Aphis gossypii ile taşınmaktadır. Cucurbitaceae

familyası türlerinde sık görülen bu virüs hastalığını ortadan kaldırmak amacıyla doğanın

genetik mühendisi olarak bilinen Agrobacterium tumefaciens gen aktarma çalışmalarında

kullanılmaktadır.

Gen aktarma çalışmaları için çok sayıda tohum ile uzun süre çalışmalar yapılması

önerilmektedir. Bitkinin aktarmak istediğimiz geni kabul etmesi için yüksek rejenere

yeteneğine sahip olması gerektiği düşünülmektedir. Bu nedenle tohumların, yüksek

rejenere yeteneği gösterebilecekleri besi ortamının optimizasyonunun sağlanması

gerekmektedir. Çünkü bitki tüm hücreleriyle geni kabul etmelidir. Ancak bu şekilde

gelişen bitkicikler geni kabul etmiş sayılacaktır.

Crimson sweet ile yapılan transformasyon çalışmalarında haftada 300-400 tohum

ile çalışılmıştır. Seçici seleksiyon ortamında canlılığını devam ettirebilen bitkilerde

yapılan DNA izolasyon sonuçlarında geni belirleyecek olan bantlar görülmemiştir.

Transformasyon çalışmaları devam etmekle beraber, farklı bakteri konsantrasyonları ve

farklı gen aktarma teknikleri üzerinde çalışılması önerilmektedir. Çalışmaların devamını

sağlamak amacıyla, transformasyon denemelerinde kullanılmak üzere farklı firmalardan

kimyasallar; agar, alkol, tripton, asetosiringon, antibiyotikler ve farklı karpuz genotipleri

üzerinde çalışılmalıdır.

62

KAYNAKLAR

ADLERZ ,W.C., CRALL, J.M., 1967. Epidemology of Control of Watermelon Mosaic

Virus. Florida Agric. Exp. Stn. Annu. Rep. 403.

ANONYMOUS (2003). Lycopene. Retrieved 22 May 2003 from

http://www.lycopene.org.

BOYHAN, G., NORTON, J.D., JACOBSEN, B.J., ABRAHAMS, B.R., 1992.

Evuluation of Watermelon and Related Germplasm For Resistance to Zucchini

Yellow Mosaic Virus. Plant Dis., 76, 251-252.

COMPTON, M.E., GRAY, D.J., ELMSTROM, G.W., 1993. A Simple Protocol

for Micropropagating Diploid and Tetraploid Watermelon Using Shoot-Tip

Explants. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 33, 211-217.

COMPTON, M.E., GRAY, D. J., 1994. Adventitious Shoot Organogenesis and Plant

Regeneration from Cotyledons of Tetraploid Watermelon. HortScience, 29 (3),

211- 213.

COMPTON, M.E., GRAY, D.J., ELMSTROM, G.W., 1994. Regeneration of

Tetraploid Plants from Cotyledons of Diploid Watermelon. Proc. Fla. State Hort.

Soc., 107, 107-109.

COMPTON, M.E., GRAY, D.J., ELMSTROM, G.W., 1996. Identification of

Tetraploid Regeneration From Cotyledons of Diploid Watermelon Cultured In

Vitro. Euphytica, 87, 165-172.

COMPTON, M.E., 1999. Dark Pretreatment Improves Adventitious Shoot

Organogenesis from Cotyledons of Diploid Watermelon. Plant Cell, Tissue and

Organ Culture, 58: 185-188

COMPTON, M.E., 2000. Interaction Between Eksplant Size and Cultivar Affects Shoot

Organogenic Competence of Watermelon Cotyledons. HortScience, 35(4), 749-

750.

63

http://www.lycopene.org/

ÇETINER, S., 1993. Hastalıklara Dayanıklı Bitki Islahında Genetik Mühendisliği.

Doğa-Tr. J. of Agriculture and Forestry, 17, 1121-1131.

ÇÜRÜK, S., ANANTHAKRISHNAN, G., SINGER, S., XIA, X., ELMAN, C.,

NESTEL, D., CETINER, S., GABA, V., 2003. Regeneration In vitro from the

Hypocotyl of Cucumis Species Produces Almost Exculsively Diploid Shoots and

Does Not Require Light. HortScience, 38(1), 105-109.

ÇÜRÜK, S., 1999. Bazı Kavun (Cucumis melo L.) Çeşitlerinde In Vitro Rejenerasyon

ve Genetik Transformasyon Üzerinde Araştırmalar. Ç.Ü. Doktora Tezi, Adana,

217 s.

DABAUZA, M., BORDAS, M., SALVADOR, A., ROIG, A.L., MORENO, V.,

1997. Plant regeneration and Agrobacterium-Mediated Transformation of

Cotyledon Explants of Citrullus colocynthis (L.) Schrad. Plant Cell Reports. 16,

888-892.

DE LA RIVA, G., A., GONZALEZ-CABRERA, J., VAZQUEZ-PADRON, R.,

AYRA-PARDO, C., 1998. Agrobacterium: a Natural Tool for Plant

Transformation. Elect. J. Biotech., 1: 2-16.

DONG, J.Z., JIA, S.R., 1991. High Efficiency Plant Rejeneration from Cotyledons of

Watermelon (Citrullus vulgaris (Schrad.)).Plant Cell Rep., 9: 559-562.

FANG, G., GRUMET, R., 1990. Agrobacterium tumefacienes Mediated

Transformation and Regeneration of Muskmelon Plants. Plant Cell Reports, 9,

160-164.

FAO., 2006. http://www.fao.org

GABA,V., SCHLARMAN, E., ELMAN, C., SAGEE, O., WATAD, A.A., GRAY,

D.J., 1999. In Vitro Studies on the Anatomy and Morphology of Bud

Rejeneration in Melon Cotyledons. In Vitro Cellular and Developmental

Biology-Plant, 35, 1-7.

64

http://www.fao.org/

GARSTER, H., 1997. The Potential Role of Lycopene For Human Health. J. Am.

Coll.Nutr, 16: 109-126.

GILLASPIE, A.G., WRIGHT, J.M., 1993. Evaluation of Citrullus sp. Germplasm for

Resistance to Watermelon Mosaic Virus. 2. Plant Dis, 77, 352-354.

GRUMET, R., 1989. Genetically Engineered Plant Virus Resistance. HortScience, 25

(5), 508-513.

GUO. Q., SONG. M., YANG, T., LIANG, G., 2000. Regeneration and Identification

of Tetraploids Originating From Cotyledons of Diploid Watermelon Cultured In

Vitro. Journal of Southwest Agricultural University, 22 (4), 298-300.

HINCHEE, M. A. W., CORBIN, D. R., ARMSTRONG, C. L., FRY, J. E.,

SATO, S. S., DEBOER, D. L., PETERSEN, W. L., ARMSTRONG, T. A.,

CONNOWARD, D. V., LAYTON, J. G., HORSCH, R. B., 1994. Plant

Transformation. I.K., Vasıl and T.A., Thorpe (Eds.), Plant Cell and Tissue

Culture, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht-Netherlands, 231-270.

HUDSON, L.C., CHAMBERLAIN, D., STEWART, C.N., 2001. GFP-Tagged Pollen

to Monitor Pollen Flow of Transgenic Plants. Molecular Ecology Notes, 1, 321-

324.

İNAN, S., 2007. Karpuz (Citrullus lanatus (Thunb.)Matsum ve Nakai)’da In vivo ve In

vitro Yöntemlerle Tetraploid Bitki Elde Edilmesi, Ç.Ü. Yüksek Lisans Tezi,

Adana, 61.

JEFFREY, C., 1975. Further Notes on Cucurbitaceae: III. Some African taxa. Kew

Bul., 30,475-493.

KRUG, M., STIPP, L., RODRIGUEZ, A., MENDES, B., 2005. In vitro

Organogenesis in Watermelon Cotyledons. Pesquisa Agropecuaria Brasileira

40(9), 861-865.

65

LEEMANS, J., LANGENAKENS, J., DE GREVE, H., DEBLAERE, R., VAN

MONTAGU, M., SCHELL, J., 1982. Broad Host Range Cloning Vectors

Derived from the W-plasmid Sa. Gene, 19: 361-364.

LURIA, 1951. Lysogeny broth.

MARTIN, B., 2003. Blokage of Stylet Tips as Mechanizm of Resistance to Virus

Transmission by Aphis gossypii in Melon Bearing the Vat Gene. Annals of

Applied Biology, 142(2), 245-250

COMPTON, M. E., GRAY, D. J., VICTOR, P. G., 2004. Use of Tissue Culture and

Biotechnology for the Genetic Improvement of Watermelon. Plant Cell, Tissue

and Organ Culture, 77: 231–243.

MURASHIGE, T., SKOOG, F., 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio

Assay with Tobacco Tissue Culture, Physiologia Plantarum, 15, 473-497.

NASR, M.I., IBRAHIM, I.A., HABIB, H.M., KAPIEL, T.Y., 2005. 1. Genetic

Engineering and Biotecnology Research Institue (GEBRI). Sadat City. Minufiya

University. Egypt. 2. Botany Department. Faculty of Science. Cairo University.

Egypt.

NEI, M., LI, W., 1979. Mathematical Model for Studying Genetic Variance in Terms of

Restriction Endonukleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5256 - 5273.

NAMBA, S., LING, K., GONSALVES, C., SLIGHTOM, J.L., GONSALVES, D.,

1992. Protection of Transgenic Plants Expressing the Coat Protein Gene of

Watermelon Mosaic Virus II or Zucchini Yellow Mosaic Virus Against Six

Potyviruses. Phytopathology, 82, 940 - 946.

PANG, S. Z., JAN, F. J., TRICOLI, M. D., RUSSELL, F. P., CARNEY, J. K., HU,

S. J., FUCHS, M., QUEMADA, D. H., GONSALVES, D., 2000. Resistance to

Squash Mosaic Comovirus in Transgenic Squash Plants Exspressing its Coat

Protein Genes. Molecular Breeding, 6: 87-93.

PERKINS, V.P., 2005. Watermelon and Human Health. 3rd International Cucurbit

66

Symposium, Townsville-Australia, 66.

PIL, S.C., WONG, Y.S., YOUN, S.K., OOK, J.Y., JANG, R.L., 1993. Genetic

Transformation and Plant Regeneration of Watermelon Using Agrobacterium

tumefaciens, Plant Cell Reports. Vol 13 Number : 6.

PITRAT, M., LECOQ, H., 1984. Inheritance of Zucchini Yellow Mosaic Virus

Resistance in Cucumis melo L. Euphytica, 33, 57-61.

POWEL-ABEL, P., NELSON, R.S., DE, B., HOFFMANN, N., ROGERS, S.G.,

FRALEY, R.T., BEACHY, R.N., 1986. Delay of Disease Development in

Transgenic Plants That Express Tobacco Mosaic Virus Coat Protein Gene.

Science, 232: 738-743.

PROVVIDENTI, R., KYLE, M.M., 1993. (ED), Resistance to Viral Diseases of

Vegetables.Timber Press, Portland, OR; 8-43.

QUEMADA, H., SIUE, L.C., SIEMIENIAK, D.R., GONSALVES, D.,

SLIGHTOM, J.L., 1990. Watermelon Mosaic Virus II and Zucchini Yellow

Mosaic Virus: Cloning of 3’– Terminal Region, Nucleotide Sequences, and

Phytogenetic Comparisons. J. Gen. Virol, 71, 1451-1460.

ROBINSON, R.W., DECKER-WALTERS, D.S., 1997. Cucurbits. CABI.,

Wallingford, UK. ISNB: 0 85199 1335.

SANG, M.P., JUNG, S.L., SUNG, J., BO, Y.J., MIN, J., YOON, S.P., SANG, L.H.,

YOON, S.S., NAM, H.H., JANG, H.L., MI Y.L., KI, H.R., SEUNG,

G.Y.,CHEE, H.H., 2005. Transgenic Watermelon Rootstock Resistant to

CGMMV (Cucumber Green Mottle Mosaic Virus) Infection. Plant Cell Rep., 24:

350-356.

SARI, N., 2006. Yazlık Sebzeler Ders Notları, Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi

Bahçe Bitkileri Bölümü, Adana.

SARI, N., PITRAT, M., ABAK, K., YÜCEL, S., 1994. Türkiye’de Yaygın Olarak

Yetiştirilen Karpuz ve Kavun Çeşitlerinin Bazı Fungal Hastalıklara ve Virüslere

67

Karşı Reaksiyonları Ç. Ü. Ziraat Fakültesi, 25. Kuruluş Yılı Özel Sayısı, 37-50.

SCHELL, J., VAN MONTAGU, M., 1983. The Plasmids as Natural and as Practical

Gene Vectors for Plants. Bio/Technol., 1: 75.

SELVARAJ, N., VASUDEVAN, A., MANICKAVASAGAM, M.,GANAPATHI, A.,

2006. In vitro Organogenesis and Plant Formation in Cucumber. Biologia

Plantarum, 50 (1): 123-126.

SHERF, A.L., MACNAB, A.A., 1986. Vegetable Diseases and Their Control, 2nd

Edition. Wiley, New York.

TANG, S., LIAO, Y., XU, R., 1994. Medium Selection and In vitro Culture of Seedless

Watermelon (Citrullus vulgaris schrad.). Journal of Southwest Agricultural

University, 16 (6), 540-542.

TOPPI, L.S., PECCHIONI, N., AND DURANTE, M., 1997. Cucurbita pepo L. Can

Be Transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell, Tissue and Organ

Culture, 51 : 89-93.

WHITAKER, T.W., DAVIS, G.N., 1962. CUCURBITS: Botany, Cultivation and

Utilization, Leonard Hill, London, UK.

YALÇIN-MENDI, N.Y., IPEK, M., KACAN, H., CÜRÜK, S., SARI, N., CETİNER,

S., GABA, V., 2003. A Histological Analysis of Regeneration in Watermelon. J.

Plant Biochemistry & Biotechnology, 12, 147-150.

YILMAZ, M.A., LECOQ, H., ABAK, K., BALOĞLU, S., SARI, N., 1992.

Türkiye’de Kabakgil Sebze Türlerinde Zarar Yapan Virüsler. Türkiye 1. Ulusal

Bahçe Bitkileri Kongresi, Cilt II: 439-442.

YILMAZ, M.A., DAVIS, R.F., 1984. Purification and Particule Morphology of TMV,

CMV and ZYMV Isolated From Various Cultivated Crops Grown Along the

Mediterranean coast of Turkey. J. Turkish Phytopath., 13 (1), 29-38.

68

ZAENEN, I., VAN LAREBEKE, N., TEUCHY, H., VAN MONTAGU, M.,

SCHELL, J., 1974. Supercoiled Circular DNA in Crown Gall-Inducing

Agrobacterium Strains. J. Mol. Biol., 86: 109-127.

69

ÖZGEÇMİŞ

1984 yılında Adana’da doğdum. İlk, orta ve lise eğitimimi 2000 yılında

Adana’da tamamladıktan sonra 2001 yılında Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi

Fen-Edebiyet Fakültesi Biyoloji Bölümü’nü kazandım. 2005 yılında mezun olduktan

sonra 2 ay özel bir firmada çalıştım. 2006 Şubat ayında Çukurova Üniversitesi

Biyoteknoloji Anabilim Dalın’da Yüksek Lisans programına başladım ve şu anda

Yüksek Lisans programına devam etmekteyim.

70

Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ yÜksek ... · c58c1-pch32 which is...

Documents