trabajo jaime.doc

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS DE LA NUTRICIN

PROYECTO DE TESIS:

EXTRACCIN, CARACTERIZACIN Y EL EFECTO HIPOLIPEMIANTE DEL ACEITE ESENCIAL DE CASCARA DE NARANJA (Citrus sinensis osbeck) EN RATTUS NORVERGICUS VARIEDAD WISTAR.AREQUIPA- 2014Presentado por:

BACH. Jaime Luis Mendoza HuaytaBACH. Juan Napolen Ventura VenturaAREQIPA PERU

2014INDICE1. ANTECEDENTES 1

2. JUSTIFICACION 3

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 6

4. OBJETIVOS 6

4.1 OBJETIVO GENERAL 6

4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 6

5. HIPOTESIS 7

6. VARIABLES 7

6.1 VARIABLE IDEPENDIENTE 7

6.2 VARIABLE DEPENDIENTE 7 6.3 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES 87. DISEO METODOLOGICO 8

7.1 TIPO DE INVESTIGACION 8 7.2 AMBITO DE ESTUDIO 9

7.3 MUESTRA 9 7.4 CARACTERISTICAS DE LAS UNIDADES EXPERIMENTALES 9

7.5 CRITERIOS DE EXCLUSION 9

7.6 DISEO EXPERIMENTAL 10 7.6.1 CONDICIONES AMBIENTALES 7.6.2 IDENTIFICACION DE LOS ANIMALES

7.6.3 ALIMENTACION DE LOS ANIMALES

7.6.3.1 GRUPO CONTROL

7.6.3.2 GRUPO BLANCO

7.6.3.3 GRUPO 1

7.6.3.3 GRUPO 2

ESQUEMA DEL DISEO EXPERIMENTAL

7.7 PROCEDIMIENTO Y TECNICAS 7.7.1 PROCEDIMIENTOS 7.7.1.1 ESTANDARIZACION DE LOS ANIMALES

7.7.1.2 DIETA NORMAL

7.7.1.3 PREPARACION DE LA DIETA HIPERLIPIDEMICA

7.7.1.4 INDUCCION DE LA HIPERLIPIDEMIA

7.7.1.5 ELABORACION DE LA SOLUCION DE LOVASTATINA

7.7.1.6 EXTRACCION DEL ACEITE ESENCIAL DE CASCARA DE NARANJA

FLUJOGRAMA DE LA EXTRACCION DEL ACEITE ESENCIAL 7.8 TECNICAS 7.8.1 OBTENCION DE SANGRE 7.8.1.1 METODO DE DORMAN

7.8.2 ADMINISTRACION DEL ACEITE ESENCIAL DE CASCARA DE NARANJA 7.8.3 DETERMINACION DEL COLESTEROL TOTAL 7.8.3.1 FUNDAMENTO 7.8.3.2 PROCEDIMIENTO 7.8.4 DETERMINACION DEL c-HDL 7.8.4.1 FUNDAMENTO 7.8.4.2 PROCEDIMIENTO 7.8.5 DETERMINACION DEL c-LDL 7.8.5.1 FUNDAMENTO 7.8.5.2 PROCEDIMIENTO 7.8.6 DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS 7.8.6.1 FUNDAMENTO 7.8.6.2 PROCEDIMIENTO 7.9 METODO ESTADISTICO 7.10 RECURSOS, MTERIALES Y EQUIPOS 7.10.1 RECURSOS HUMANOS 7.10.2 RECURSOS BIOLOGICOS 7.10.3 RECURSOS MATERIALES Y EQUIPOS 7.10.4 RECURSOS INSTITUCIONALES 7.10.5 REACTIVOS 7.10.6 PRESUPUESTO 8 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 9 BIBLIOGRAFIA ANEXOS

1-.ANTECEDENTES

Jing14 L. et al. 2013. Estudiaron los efectos preventivos del d-limoneno para dislipidemias e hiperglucemias en ratones con alto contenido de grasa, con obesidad inducida por la dieta. El d-limoneno es un constituyente importante en el aceite esencial de los ctricos, que se utiliza en diversos alimentos como un agente aromatizante. Aqu han determinado los efectos preventivos y teraputicos del d- limoneno sobre trastornos metablicos en ratones con alto contenido de grasa de la obesidad inducida por la dieta.En tratamiento preventivo, d-limoneno redujo el tamao de los adipocitos blancos y marrones, baja los triglicridos sricos (TG) y niveles de glucosa en sangre, evitando la acumulacin de lpidos hepticos en ratones. Ahmad S, Beg ZH. 2013. Estudiaron las acciones hipolipemiantes y antioxidantes de timoquina (TQ) y limoneno (LMN). Por dar 1ml de 10mg o 200mg TQ y LMN en suspensin, mediante alimentacin forzada en dos dosis iguales (maana y tarde) de 0,5 ml cada una durante 30 das, en ratas, alimentados con una suspensin iatrognico. Estos compuestos mejoraron eficazmente todos los parmetros de riesgo cardiovasculares alterados a travs de una reduccin en la actividad de la de la HMG-CoA reductasa, junto con un aumento en la actividad arilesterasa. Los resultados sugieren fuertemente un uso importante teraputico de los compuestos de ensayo, especialmente TQ, en la prevencin de la enfermedad cardiovascular.1

Goncalves C. 2011. Estudio la caracterizacin qumica del aceite esencial (AE) de hojas de naranja Citrus sinensis (L) Osbeck (encontrando compuestos como limoneno, neril acetato, citronelol, neral y trans geranio). Os efectos de la administracin oral con dosis repetidas de (AE) de hojas de C. sinensis fueron investigadas sobre los parmetros bioqumicos y hematolgicos en camundongos Swiss machos adultos. Los camundongos (grupo=9) fueron tratados por un periodo de 30 das con (AE) de C. sinensis en las dosis de 50, 100 y 200 mg /kg por peso de animal y los parmetros hematolgicos e bioqumicos fueron validados. Concluyendo que la administracin aguda de (AE) de C. sinensis no produjo efectos txicos. Encontrndose una disminucin significativa en los triglicridos detectados en los animales tratados con dosis de 200 mg/kg de aceite esencial. 49Por otro lado, Campelo L. 2010. Realizo la caracterizacin qumica de aceite esencial de hojas de Citrus limon (Rutaceae) resulto en la identificacin de una mistura de mono terpenos (limoneno, linalol, cis-oxido de limoneno, trans-oxido de limoneno, citronelal, neral, geranial, nerol e acetato de geranil). Los animales (n=10/grupo) fueron tratados por va oral diariamente durante 30 das con aceite esencial de hojas de Citrus limn, en las dosis de 50,100 y 150 mg/kg de masa corporal. El tratamiento no causo ninguna muerte o toxicidad en los animales. La administracin de aceite esencial no altero los parmetros bioqumicos, hematolgicos y la masa de los rganos, excepto por la disminucin de 21 y 11% en urea y acido rico, respectivamente, y 9%, en los niveles plasmticos de aspartato transaminasas (AST). Para los parmetros hematolgicos hubo pequeos cambios en el recuento de neutrofilos, linfocitos, eosinofilos y monocitos, mas estos no fueron diferentes a los valores de referencia. Adems de eso, hubo una disminucin significativa en los triglicridos detectados en los animales tratados con dosis de 150 mg/kg de aceite esencial. 4Ticona M, Villalta C. 2011. Estudiaron la Extraccin y Caracterizacin del aceite esencial de Cipres (Cuvirenspressus Semper).Determinando los parmetros tecnolgicos para la extraccin de aceite esencial y Caracterizacin fsico, Qumica y organolptica del aceite esencial de Cipres. Utilizando para el mismo un Extractor de aceite esencial por arrastre de vapor, marca APIN, con sistema de tuberas por el cual circula agua, con una presin de trabajo de 98 Lb/pulg2; Un condensador de acero inoxidable y un dispositivo para la entrada y salida del agua de refrigeracin que acta en contracorriente.27Retegui L. 2005. Estudio la Hidroextraccin y fraccionamiento del aceite esencial de cascara de naranja dulce (Citrus sinensis osbeck). Donde se determino parmetros adecuados para la hidroextraccin y la obtencin de d-limoneno por destilacin del aceite esencial al vacio. La hidrodestilacin, lo realizo en una batera de 19 pruebas, para obtener materia prima para la fase de fraccionamiento del aceite esencial, as poder evaluar su rendimiento y composicin. Los resultados del anlisis qumico del aceite esencial muestra un 95.58% de Limoneno y las caractersticas fisicoqumicas fueron: Gravedad especifica a 20 C: 0.8424; ndice de refraccin, 1.472; Rotacin ptica: +100 y la temperatura de ebullicin 175 C.212.-JUSTIFICACION

La alteracin del perfil lipidico es considerado actualmente, un importante problema de salud pblica, que tiende a incrementarse a medida que la poblacin envejece.18Durante las ltimas dcadas, la mortalidad por enfermedades del corazn ha mostrado un incremento constante, de la misma manera, la OMS seala que la causa numero uno de muerte a nivel mundial son las enfermedades cardiovasculares, donde los ataques cardiacos representan 70% del total de muertes. Existen pruebas epidemiolgicas que relacionan la hipercolesterolemia prolongada con la aparicin de la ateroesclerosis, el cual es un trastorno en el que se depositan placas de material graso en las paredes de las arterias de mediano y gran calibre, lo cual produce una disminucin y obstruccin del flujo sanguneo, en donde se desarrollan ateromas.26 La hipercolesterolemia consiste en valores sanguneos anormalmente elevados en grasas (colesterol, triglicridos o ambos).Su origen puede ser por predisposicin gentica o desarrollarse por factores de riesgo como: tabaquismo, hipertensin, diabetes, edad avanzada, niveles elevados de estrgenos y sedentarismo.18 Cada ao mueren alrededor de 17 millones de personas en el mundo por esta enfermedad y se estima que cada cuatro segundos ocurre un evento coronario y cada cinco segundo un evento vascular cerebral. Hoy en da constituye la primera causa de enfermedad y muerte en el mundo occidental y continua avanzando en los pases en va de desarrollo hasta sobrepasar a las enfermedades infecciosas.27Segn la OMS desde 1980, la obesidad se ha ms que doblado en todo el mundo. En 2008, 140 millones de adultos (de 20 y mas aos) tenan Perfil Lipidico elevado. Dentro de este grupo, ms de 200 millones de hombres y cerca de 300 millones de mujeres eran Obesos. El 65 % de la poblacin mundial vive en pases donde el sobrepeso y la obesidad cobra ms vidas de personas que la insuficiencia ponderal. En 2010, alrededor de 40 millones de nios menores de cinco aos tenan sobrepeso.26

Se han realizado investigaciones sobre los efectos preventivos del aceite esencial de los ctricos (naranja, limn, mandarina, lima y pomelo) donde el d- limoneno es el uno de los compuestos que se encuentran en mayor concentracin.4, 9,14 El d-limoneno aparece en el cdigo de regulaciones federales como seguro (GRAS) por ser un agente de sabor.13

El d-limoneno se uso en un estudio para dislipidemias e hiperglucemias en ratones con alto contenido de grasa, con obesidad inducida por la dieta. Donde el d-limoneno es un constituyente importante en el aceite esencial de los ctricos, que se utiliza en diversos alimentos como un agente aromatizante (Jing L. et al. 2013).14 La caracterizacin qumica del aceite esencial (AE) de hojas de Citrus sinensis (L) Osbeck; tiene compuestos como limoneno, neril acetato, citronelol, neral y trans geraniol en mayor concentracin (Goncalves C. 2011).9 En la caracterizacin qumica de aceite esencial de hojas de Citrus limon (Rutaceae) se identificaron una mistura de mono terpenos; limoneno, linalol, cis-oxido de limoneno, trans-oxido de limoneno, citronelal, neral, geranial, nerol e acetato de geranil ( Campelo LM. 2010) .4El d-limoneno se ha estudiado la carcinogenicidad en ratones y ratas. Aunque los resultados iniciales mostraron que el d-limoneno aumento la incidencia de tumores tubulares renales en ratas machos, mas en ratas hembras y ratones en ambos gneros no mostraron evidencia de cualquier tumor. Estudios posteriores han determinado como se producen estos tumores y se estableci que el d-limoneno no representa un riesgo mutagnico, carcinognico o nefrotxico en los seres humanos. En los seres humanos el d- limoneno ha demostrado baja toxicidad despus de la administracin nica y repetida por un ao. Al ser un disolvente de colesterol el d-limoneno se ha usado clnicamente para disolver clculos biliares que contienen colesterol. Debido a su efecto de neutralizacin de acido gstrico y su apoyo de peristalsis normal, tambin se ha utilizado para el alivio de la acidez y el reflujo gastroesofagico (ERGE). D-limoneno tiene una actividad quimiopreventivo contra muchos tipos de cncer. La evidencia de una fase I de ensayos clnicos demostr una respuesta parcial en un paciente con cncer de mama y la enfermedad estable en tres pacientes con cncer colorectal.13Es por eso la importancia que le damos al aceite esencial de cascara de naranja donde el d-limoneno es el componente mayoritario, teniendo concentraciones de 90 a 96%.22 Y las caractersticas fisicoqumicas: Gravedad especifica a 20 C: 0.8424; ndice de refraccin, 1.472; Rotacin ptica: +100 y la temperatura de ebullicin 175 C (Retegui L. 2005).21No se conoce en nuestro medio estudios que identifiquen la extraccin, caracterizacin y efecto del aceite esencial de cascara de naranja en el tratamiento de las hiperlipidemias en Rattus norvergicus variedad wistar, de all, es que nace nuestra inquietud por conocer los alcances que este producto podra tener en nuestra poblacin teniendo como base su composicin.Por lo tanto se pretende determinar la extraccin, caracterizacin y efecto del aceite esencial de la cascara de naranja para que ayude a controlar las hiperlipidemias, dada la alta incidencia de enfermedades cardiovasculares y otras relacionadas tanto en el mundo como en nuestro pas la cual es alarmante, es por ello que se decide realizar el presente trabajo de investigacin.3.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMACul ser el porcentaje de rendimiento, densidad Relativa, ndice de refraccin, solubilidad en etanol y el efecto del aceite esencial de cascara de naranja (Citrus sinensis osbeck) sobre la hiperlipidemia experimental en ratas albinas durante los meses de Agosto-Setiembre 2014?4.-OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar la extraccin, caracterizacin y el efecto del aceite esencial de cascara de naranja (Citrus sinensis Osbeck) sobre la hiperlipidemia experimental en ratas mediante la administracin de una dieta rica en colesterol.4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Evaluar el rendimiento del aceite esencial de la cascara de naranja (Citrus sinensis osbeck).

Caracterizar la muestra de aceite esencial determinando la densidad relativa, ndice de refraccin y solubilidad en etanol. Inducir experimentalmente la hiperlipidemia con dieta rica en colesterol en Rattus norvergicus variedad wistar. Determinar la dosis que tiene un mayor efecto sobre la hiperlipidemia causada en las ratas.

Evaluar el efecto de la administracin de aceite esencial de cascara de naranja (Citrus sinensis) en dosis de 200 mg/kg/da y 300 mg/kg/da sobre el perfil lipidico en animales de experimentacin despus de ser inducidas a una hiperlipidemia.

5.-HIPOTESISLa buena calidad de extraccin, caracterizacin y la administracin de aceite esencial de cascara de naranja (citrus sinensis osbeck) disminuir el Perfil Lipidico (PL) en la hiperlipidemia inducida en ratas experimentalmente.El aceite extrado y caracterizado es de buena calidad y administrado en ratas hiperlipidmicas disminuye el perfil lipdico que presentan las mismas.

6.-VARIABLES

6.1 VARIABLE INDEPENDIENTE

Extraccin de aceite esencial

Consumo de aceite esencial 6.2 VARIABLE DEPENDIENTE

Caracterizacin del aceite esencial

Hiperlipidemia inducidaVARIABLESINDICADORESCALA

VARIABLE INDEPENDIENTEExtraccin del aceite esencial

Tamao de la muestra.

Humedad.

Consumo de aceite esencialcm

% de humedadmg/kg de peso corporal/daRazn

Razn

Razn

VARIABLE DEPENDIENTE

Hiperlipidemia inducidaCaracterizacin del aceite esencial

Rendimiento

Densidad Relativa ndice de refraccin

Solubilidad en etanol

Mg de CT/ dl de sangre.

Mg de TG/ dl de sangre.

Mg de LDL/ dl de sangre.

Mg de HDL/ dl de sangre.

% de aceite extradog/ml(se da en nmeros)

Razn

Razn

Razn

Razn

Razn

Razn

Razn

Razn

7.-DISEO METODOLOGICO 7.1 TIPO DE INVESTIGACION

El presente estudio de investigacin es de tipo experimental. 7.2 AMBITO DE ESTUDIO

El presente trabajo se llevar a cabo en las instalaciones del bioterio de la Escuela de Ciencias de Nutricin de la Universidad Nacional de San Agustn, lo cual nos permitir controlar las condiciones de temperatura y luz ambiental.7.3 MUESTRALos animales procedern del bioterio de la Universidad Catlica de Santa Mara que certifica su estado de salud.

Se adquirirn y aclimataran 20 ratas machos Rattus norvergicus variedad wistar, que sean de la misma camada, cuya edad ser de 6-7 meses de vida (adultas) con un peso promedio en el rango de 230-280 gramos. 7.4 CARACTERISTICAS DE LAS UNIDADES EXPERIMENTALES

Ratas machos Rattus norvergicus variedad wistar.

Los animales deben tener una edad de 6-7 meses de vida (adultas).

El peso promedio de los animales ser en el rango de 230-280 gramos.

7.5 CRITERIOS DE EXCLUSION

Animales que evidencian alguna patologa.

Animales que integraron otros estudios preliminares al presente.

7.6 DISEO EXPERIMENTAL

Los animales (ratas machos) que cumplan con las caractersticas de las unidades experimentales y criterios de exclusin se seleccionaran 20 ratas distribuyndolas en 5 grupos (n=5) y se alimentarn a voluntad durante 8 semanas que dura el experimento y una semana de aclimatacin.

7.6.1 CONDICIONES AMBIENTALES

Los animales sern provistos de ciclos de luz y oscuridad, se mantendr una temperatura adecuada de entre 22+/-2. Las condiciones de las jaulas sern de las mas optimas posibles con de fin de que no perturbe a los animales y as poder obtener valores precisos y ms confiables.18 7.6.2 IDENTIFICACION DE LOS ANIMALES

Cada animal ser identificado por una marca (pintado) que estar en la cabeza, lomo y cola, que lo har nico entre todas evitando as la confusin con las otras.

7.6.3 ALIMENTACION DE LOS ANIMALES

La alimentacin de los animales de cada grupo despus del periodo de aclimatacin ser de una dieta hiperlipidemica (Cuadro pg.14) ms agua ad libitum. Al formar los grupos de experimentacin, la alimentacin de cada grupo ser de la siguiente manera:

7.6.3.1 GRUPO CONTROLFormado por 5 ratas de variedad wistar, a estas se les alimenta con una dieta hiperlipidemica (Cuadro pg. 15) en un peso de 35.5gr hasta conseguir el estado hiperlipemiante y adems de agua purificada, hasta el final del estudio y se les administra por va oral la solucin de Atorvastatina a una sola dosis de 0.06 mg/kg/da antes de la comida.

7.6.3.2 GRUPO BLANCO

Formado por 5 ratas de variedad wistar, a estas se les alimenta con una dieta hiperlipidemica (Cuadro pg. 15) en un peso de 35.5gr hasta conseguir el estado hiperlipemiante y adems de agua purificada, hasta el final del estudio.

7.6.3.3 GRUPO 1 (experimental)Formado por 5 ratas de variedad wistar, a estas se les alimenta con una dieta hiperlipidemica (Cuadro pg. 15) en un peso de 35.5gr hasta conseguir el estado hiperlipemiante y adems de agua purificada, hasta el final del estudio y se les administra por va oral aceite esencial de cascara de naranja (citrus sinensis osbeck) a una dosis de 200 mg/kg/da antes de la comida. 7.6.3.4 GRUPO 2 (experimental)Formado por 5 ratas de variedad wistar, a estas se les alimenta con una dieta hiperlipidemica (Cuadro pg. 15) en un peso de 35.5gr hasta conseguir el estado hiperlipemiante y adems de agua purificada, hasta el final del estudio y se les administra por va oral aceite esencial de cascara de naranja (citrus sinensis osbeck) a una dosis de 300 mg/kg/da antes de la comida.

DISEO EXPERIMENTAL

7.7.-PROCEDIMIENTOS Y TECNICAS

7.7.1 PROCEDIMIENTOS

7.7.1.1 ESTANDARIZACION DE LOS ANIMALES

Los animales estarn enjaulados despus de la seleccin de acuerdo con las caractersticas de

las unidades experimentales y criterios de exclusin, para luego proceder a uniformizar sus

hbitos alimentarios y forma de vida, en condiciones adecuadas libre de ruidos molestos, con

una temperatura de 22+/-2, permitindoles la ingesta de agua a voluntad y una alimentacin

balanceada con Purina Nutrimax por un tiempo de una semana.8, 11, 18 7.7.1.2 DIETA NORMAL

Para la dieta normal se utiliza PURINA NUTRIMAX que es lo que habitualmente se le brinda en los bioterios, se le administrara una cantidad de 35.5 gr por da, lo cual tiene una composicin qumica de:

PROTEINA12.00%

CARBOHIDRATO50.00%

GRASA3.00%

FIBRA10.00%

HUMEDAD14.00%

CALCIO0.80%

FOSFORO0.80%

Fuente: Composicin Nutricional de PURINA NUTRIMAX.11 7.7.1.3 PREPARACION DE LA DIETA HIPERLIPIDEMICA

La preparacin de la dieta hiperlipidemica estar en base a los siguientes alimentos de acuerdo

Con la bibliografa revisada.ALIMENTOCANT.KCAL.PROT.GRASACHOSCOLEST.

Sesos de vaca25.0033.802.832.400.00334.40

Aceite de girasol5.0044.200.005.000.000.00

Harina de trigo2.508.970.260.052.870.00

Manteca de cerdo3.0026.850.003.000.002.85

TOTAL35.50113.823.0910.452.87337.25

ADECUACION0.000.0012.3694.0511.480.00

POECENTAJE0.000.0010.8682.6310.090.00

REQUERIMENTOS0.0025.0014.1721.2664.570.00

Formula desarrollada de la dieta hiperlipidemica.11La dieta que se preparar estar fundamentada en el uso de sesos de vaca, aceite vegetal y manteca de cerdo como los ingredientes que ayudaran a elevar el perfil lipidico, los dems ingredientes solo sirven en la preparacin de la misma.

Se realizara la mezcla adecuada de los ingredientes para una mejor aceptacin por las unidades experimentales.

Se proceder primeramente a dar una coccin previa de los sesos para luego recin picarlos, mientras en un recipiente mezclamos la harina con agua y finalmente agregamos los sesos para proceder luego a frer la mezcla en la manteca de cerdo y el aceite vegetal .11 7.7.1.4 INDUCCION DE HIPERLIPIDEMIAPara obtener animales con hiperlipidemia se inducir experimentalmente, previamente se realizaran determinaciones basales del perfil lipidico, lo que servir de referencia para obtener valores que sobrepasen a los basales; cabe mencionar que se considerara hiperlipidemia cuando sobrepasen estos valores.5, 7 7.7.1.5 ELABORACION DE LA SOLUCION DE LOVASTATINA

Se ha de considerar que para determinar la dosis a utilizar para cada unidad experimental del grupo B (control), el patrn ser de una persona con peso promedio de 70 kg.

Es decir se recomienda el consumo de 20 mg por da, una tableta, entonces se deduce que para una rata con un peso promedio de 230 gr, la dosificacin ser de 0.07 mg.26 7.7.1.6 EXTRACCION DEL ACEITE ESENCIALPara la extraccin del aceite esencial, se utilizar el mtodo de arrastre de vapor de agua. Este proceso de extraccin de aceites esenciales, es a partir de diferentes materias primas vegetales, est supeditado de la materia prima a utilizar. Ello ligado al rendimiento de extraccin deseado, son los factores principales que condicionan el mtodo y equipos a emplear para dicho fin.25

Flujograma para la extraccin de aceite esencial de cascara de naranja (Citrus sinensis L.).25a) PREPARACIN, PELADO,SECADO Y PESADO DE LA MATERIA PRIMASe realizara las operaciones en el laboratorio de Ciencias de la Nutricin de la Universidad Nacional de San Agustn, en la cual la materia prima se someter al proceso del pelado y el secado se llevara bajo sombra sin presencia de luz solar por espacio de 72 horas, para luego poder pesarlo.25b) DESTILAIN- CONDENSACION Y SEPARACIN

Se efectuara por arrastre de vapor de agua, el que por su efecto fsico-qumico solubilizar y volatilizar la esencia, formado una mezcla azeotrpica la cual es condensada por un flujo de agua en contracorriente; y finalmente es separada la mezcla liquida por su diferencia de densidades, permaneciendo la esencia en su parte interior de la pera de decantacin debido a su menor densidad y si inmiscibilidad con el agua.25 7.7.1.7 CARACTERIZACION DEL ACEITE ESENCIAL

7.7.1.7.1 RENDIMIENTO El porcentaje de rendimiento se calcular de acuerdo con la siguiente ecuacin30: Volumen obtenido del aceite

% de rendimiento = ---------------------------------------- x 100

Peso de la materia

El porcentaje de rendimiento se realizara con materia prima seca. 7.7.1.7.2 DENSIDAD RELATIVA 7.7.1.7.2.1 METODO: NTN 319.08127 7.7.1.7.2.2 DEFINICION

Es la relacin entre la densidad del aceite esencial a 20 C y la del agua destilada a la misma temperatura27.

7.7.1.7.2.3 PROCEDIMIENTOConsiste en obtener el peso del picnmetro vaco, luego del agua destilada y luego de vaciar esta, llenar con el aceite esencial; realizando este proceso a temperatura de 20 C27.

7.7.1.7.2.4 EXPRESION DE RESULTADOS

La densidad relativa se determinar por la siguiente formula y se expresar con aproximacin de tres cifras decimales. P2 - P1

D = -----------------

P1 - P

En donde

D: Densidad relativa.

P: Peso en gramos del picnmetro a 20 C.

P2: Peso en gramos del picnmetro lleno con la esencia a 20 C.

P1: Peso en gramos del picnmetro lleno con el agua destilada a 20 C. 7.7.1.7.3 INDICE DE REFRACCION 7.7.1.7.3.1 METODO:

NTN 319.07527 7.7.1.7.3.2 DEFINICION

Es la relacin del seno del ngulo de incidencia al seno del ngulo de refraccin de un rayo luminoso de longitud de onda determinada que pasa del aire a la esencia mantenida a una temperatura constante27. 7.7.1.7.3.3 PROCEDIMIENTO

Consiste en la medicin del ngulo de refraccin del aceite esencial mantenida en condiciones de transparencia e isotropismo, siendo la longitud de onda de la luz de 589.3 nm que corresponde a la luz de sodio (Lnea D) a una temperatura de 20C27.7.7.1.7.3.4 EXPRESION DE RESULTADOS

El resultado se conseguir por lectura directa del aparato y se expresar por un nmero de cuatro decimales.

7.7.1.7.4 SOLUBILIDAD EN ETANOL

7.7.1.7.4.1 METODO:

NTN 319.084 ITINTEC27 7.7.1.7.2.2 DEFINICION

Es la solubilidad alcohlica de la presencia al ser diluida en un volumen determinado de etanol de cierta graduacin27. 7.7.1.7.2.3 PROCEDIMIENTO

Consiste en la adicin, a un volumen determinado de aceite esencial, de volmenes de etanol de concentracin conocida hasta que el aceite se disuelva completamente, agitndose frecuentemente y vigorosamente durante la adicin del solvente27.7.7.1.7.2.4 EXPRESION DE RESULTADOS

La solubilidad de la esencia en el etanol de concentracin conocida es: V S = ------------- V1 En donde

S: Solubilidad en etanol. V: Volumen en mililitros de la solucin en etanol a la dilucin conocida. V1: Volumen en mililitros del aceite esencial.

El resultado se expresar hasta con un decimal de exactitud, anotndose si aparece opalescencia.

7.8 TECNICA

7.8.1 OBTENCION DE SANGRE

Para la determinacin del perfil lipidico, se proceder a la obtencin de la sangre en un volumen de aproximacin 1.0 a 1.5 ml, previo ayuno de 8 horas de las ratas. Para eso se utiliza el siguiente mtodo.11 7.8.1.1 METODO DE DORMAN

Este mtodo se realizara con la ayuda de un profesional de laboratorio, el sangrado seno venoso orbital puede ser un mtodo til para obtener buenas muestras de sangre de animales.

Por puncin ocular con la ayuda de un tubo capilar. Esta tcnica implica pinchar el seno venoso detrs del globo del ojo y se le conoce con diferentes nombres: como retro-orbital, peri orbital, orbital, orbital posterior y sangrado del plexo venoso orbital.11, 18 7.8.2 ADMINISTRACION DEL ACEITE ESENCIAL DE CASCARA DE NARANJA (Citrus sinensis) Se sujetara al animal firmemente por la piel del cuello y espalda asegurndose que la cabeza y el cuello queden extendidos formando una lnea con la espalda.

Se introducir la sonda por el espacio interdental y rotndola lentamente se llega al esfago y al estomago si es necesario, se tendr mucho cuidado de que no entre a la trquea.

Las jeringas sern cambiadas diariamente para evitar alguna contaminacin.

7.8.3 DETERMINACION DE COLESTEROL TOTALSe determinara el colesterol total mediante el uso de la tcnica colesterol total enzimtico Bioclin diagnostics el cual nos explica lo siguiente: 7.8.3.1 FUNDAMENTO

El colesterol es oxidado enzimticamente por el colesterol oxidasa, previa hidrlisis enzimtica por el colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrlisis enzimtica de los esteres mediante un colesterol ester hidrolasa (CEH). El agua oxigenada generada en la oxidacin , produce la copulacin oxidativa del acido para hidrobenzoico (p-HBA) con la 4 aminoanpiridina (4-AAP) mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa (PAP).

Produciendo una quinona de coloracin roja con absorbancia a 505 nm de acuerdo al siguiente esquema reaccional.5, 7, 11steres de colesterol CEH Colesterol + cidos grasos

Colesterol + O2 CHOD Colesterol 4 -en - 3 - ona + H2O2H2O2 + 4 AAP + p HBA PAP Compuestos coloreado + 4 H2O2 7.8.3.2 PROCEDIMIENTO

Para determinar el colesterol total se tomara tres tubos de fotocolormetro signadas como blanco B, Estndar S, desconocido D.BlancoEstndarDesconocido

Estndar (Colesterol)0.01 ml

Muestra (Suero)0.01 ml

Reactivo de Trabajo1.00 ml1.00 ml1.00 ml

Mezclar e incubar 5 minutos a 37 C o 10 minutos a temperatura de ambiente (>20C). Leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos. .5, 7, 117.8.4 DETERMINACION DE HDL COLESTEROL

Se determinara las concentraciones de HDL colesterol total mediante el uso de la tcnica colesterol total enzimtico Bioclin diagnostics el cual nos explica lo siguiente:

7.8.4.1 FUNDAMENTO

Que las lipoprotenas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las pipoproteinas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de acido fosfotungstico en presencia de cloruro de magnesio procediendo luego a determinar el colesterol de la fraccin HDL, por el mtodo que se seala. El cual se observa en las siguientes reacciones.5, 7, 11steres de colesterol CEH Colesterol + cidos grasos

Colesterol + O2 CHOD Colesterol 4 -en - 3 - ona + H2O2H2O2 + 4 AAP + p HBA PAP Compuestos coloreado + 4 H2O2

7.8.4.2 PROCEDIMIENTO

Para determinar el HDL colesterol se saca 200 ul de muestra y 500 ul de reactivo precipitante se mezcla y se espera 15 min para luego centrifugar a 3000 rpm y se extrae el sobrenadante pasado 10 min luego se utiliza el procedimiento que se describe a continuacin Tomando como descripcin lo Siguiente: En tres tubos de fotocolormetro signadas como blanco B, Estandar S, desconocido D.BlancoEstndarDesconocido




Mezclar e incubar 10 minutos a 37 C o 20 minutos a temperatura de ambiente (>20C). Leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos. .5, 7, 117.8.5 DETERMINACION DE LDL COLESTEROLSe determinara las concentraciones de LDL colesterol total mediante el uso de la tcnica colesterol total enzimtico Bioclin diagnostics el cual nos explica lo siguiente:

7.8.5.1 FUNDAMENTO

Las pipoproteinas de baja densidad (LDL) se separan precipitando selectivamente las lipoprotenas de Alta y muy baja densidad (HDL VLDL ) mediante el agregado de citrato de sodio en presencia de heparina procediendo luego a la determinacin del colesterol de la fraccin LDL, por el mtodo ya sealado. El cual se observa en las siguientes reacciones.5, 7, 11steres de colesterol CEH Colesterol + cidos grasos

Colesterol + O2 CHOD Colesterol 4 -en - 3 - ona + H2O2H2O2 + 4 AAP + p HBA PAP Compuestos coloreado + 4 H2O2


Para determinar el LDL colesterol se saca 50 ul de muestra y 500 ul de reactivo precipitante se mezcla y se espera 10 min para luego centrifugar a 3500 rpm y se extrae el sobrenadante pasado 10 min, luego se utilizara el siguiente procedimiento. En tres tubos de fotocolormetro signadas como como blanco B, Estandar S, desconocido D.BlancoEstndarDesconocido




Mezclar e incubar 5 minutos a 37 C o 20 minutos a temperatura de ambiente (>20C). Leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.5, 7, 117.8.6 DETERMINACION DE TRIGLICERIDOSSe determinara los triglicridos el cual se realiza mediante el uso de la tcnica de trigliceridos Bioclin diagnostics el cual nos explica lo siguiente:

7.8.6.1 FUNDAMENTOLos triglicridos incubados con lipoproteinlipasas (LPL) liberan glicerol y cidos grasos libres. El glicerol es fosforilado por glicerol fosfato deshidrogenasa (GPD) y ATP en presencia de glicerol quinasa (GK) para producir glicerol 3 fosfato (G3P) y adenosina - 5 - difosfato (ADP). El G3P es entonces convertido a dihidroxiacetona fosfato (DAP) y perxido de hidrogeno por GPO. Al final el perxido de hidrogeno reacciona catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloracin roja. EL cual se observa en las siguientes reacciones.5, 7, 11Triglicridos Lipasa Glicerol + cidos grasosGlicerol + ATP GK Glicerol 3 fosfato + ADPGlicerol- 3- fosfato + O2 GPD Dihidroacetonafosfato + H2O2H2O2 + 4 AAP + DCBS PAP Quinona + H2O2


Para determinar el colesterol total se tomara tres tubos de fotocolormetro signadas como blanco B, Estndar S, desconocido D.

BlancoEstndarDesconocido




Mezclar e incubar 5 minutos a 37 C o 10 minutos a temperatura de ambiente (>20C). Leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.5, 7, 117.9 METODO ESTADISTICO

Para este proyecto se utilizaran los siguientes mtodos:MEDIA Y DESVIACION ESTANDAR.-Se utilizara para la descripcin de los datos de cada uno de los tratamientos.ANALISIS DE VARIANZA.-Se utilizara para realizar comparaciones entre los valores de los indicadores bioqumicos del grupo blanco, grupo control y de los grupos de tratamiento con aceite esencial de cascara de naranja (Citrus sinensis L.), si es que hay diferencias, con un nivel de significancia en esta prueba ser de p

trabajo jaime.doc

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