T.C.

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI

TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK LABORATUVARI

UYGULAMA KILAVUZU

ANTALYA

2017-2018

HAZIRLAYANLAR:

Prof. Dr. İbrahim KESER

Prof. Dr. Sibel BERKER KARAÜZÜM

Prof. Dr. Osman Nidai ÖZEŞ

Prof. Dr. Salih ŞANLIOĞLU

Prof. Dr. Özgül ALPER

Prof. Dr. Fahri UÇAR

Prof. Dr. Ahter Dilşad ŞANLIOĞLU

Doç. Dr. Burçak YOLDAŞ ÇELİKTEN

Doç. Dr. Esra MANGUOĞLU

Yrd. Doç. Dr. Sezin YAKUT UZUNER

Arş. Gör. Mükerrem Hale TAŞYÜREK

Arş. Gör. Elanur YILMAZ

Arş. Gör. Dr. Ceren HANGÜL

Arş. Gör. Yunus Emre EKŞİ

Arş. Gör. Habibe Sema ARSLAN

Arş. Gör. Gamze KOÇAK

Arş. Gör. Pınar BAHŞİ

Arş. Gör. Tuğba KARAMAN

MERCAN

Önemli Telefonlar:

Tıp Fakültesi Dekanlık :249-6900

Teknik Destek :6947

Anabilim Dalı Sekreterliği :249-6970

Fakülte Güvenlik :2747

Polis İmdat :155

Yangın :110

Ambulans :112

i

İÇİNDEKİLER

Sayfa

ÖNSÖZ ii

LABORATUVAR YERLEŞİM DÜZENİ iii

LABORATUVAR DÜZENİ VE GEREKLİ KOŞULLAR iv

LABORATUVARDA UYULMASI GEREKEN KURALLAR v

SİZİN İÇİN vi

TAKVİM viii

PRATİK 1: HASTA HIKAYESI ALIMI VE DNA İZOLASYONU 1

PRATİK 2: PZR UYGULAMALARI VE PZR İLE TANISI KONAN

HASTALIKLARIN RAPORLANDIRILMASI 9

PRATİK 3: AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ 19

PRATİK 4: RFLP UYGULAMALARI VE RFLP İLE TANISI KONAN

HASTALIKLARIN RAPORLANDIRILMASI 27

PRATİK 5: DNA DİZİ ANALİZİ VE DNA DİZİ ANALİZİ İLE TANISI

KONAN HASTALIKLARIN RAPORLANDIRILMASI 35

PRATİK 6: MİKROSKOP KULLANMA BECERİSİNİN KAZANILMASI 44

PRATİK 7: GEN KLONLAMA VE BAKTERİYE TRANSFORMASYON 54

PRATİK 8: MİTOZ BÖLÜNME 64

PRATİK 9: HİKAYE ALIMI, PEDİGRİ VE KROMOZOM ELDESİ I 70

PRATİK 10: KROMOZOM ELDESİ II 75

PRATİK 11: KROMOZOMLARIN BANTLANMASI VE TANIMLANMASI 78

PRATİK 12: SİTOGENETİK BULGULARIN RAPORLANDIRILMASI 84

ii

ÖNSÖZ

Sevgili Öğrenciler,

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Laboratuvar Uygulamaları (Pratikleri), diğer anabilim dalları ile

ortak kullanılan laboratuar mekanlarında gerçekleştirilecektir. Bu durum bize,

laboratuvarda yaşanabilecek her türlü kazaya açık olduğumuzu, bu nedenle en küçük

çalışma ilkesini ve güvenlik kuralını göz ardı etmememiz gerektiğini söylemektedir.

Pratikten Sorumlu Öğretim Üyesi ve Araştırma Görevlilerinin uyarılarına kesinlikle

uyulmalıdır. Laboratuvarda temel çalışma ilkeleri ve güvenlik kurallarının öğrenilmesinin

yanı sıra, her bir deney araç-gereci ve kimyasal maddenin güvenli şekilde nasıl

çalışılacağı konusunda bilgi gerekir. Bu bilgileri her pratikten sorumlu öğretim üyesi,

araştırma görevlisi hocalarınızdan edinebilecek ve bilgilere elinizdeki bu kılavuzdan

ulaşabileceksiniz.

Sağlıklı ve amacına uygun, sonuçlarının kalıcı ve geleceğe temel oluşturması bakımından

yararlı bir pratik çalışması yapabilmek; Öğretim Üyesi, Araştırma Görevlisi ve siz

öğrencilerin istekli, dikkatli ve titiz çalışmasına, uyumlu davranış ve tutumlarına bağlıdır.

Elinizde bulunan Tıbbi Biyoloji ve Genetik Laboratuvarı Uygulama Kılavuzundaki

kuralları ve bilgileri laboratuvara girmeden önce okumanız ve öğrenmeniz gerekmektedir.

Pratiklerin değerlendirmesi; öğrencinin her pratikteki tutum ve davranışı, laboratuar

ilkelerine uyup uymadığı, devamsızlıkları ve ilgili ders kurulu sonunda yapılan Pratik

Sınav notundan oluşacaktır. Bu yüzden, bugün multidisipliner biçimde baş döndürücü bir

hızla gelişen Tıbbi Biyoloji ve Genetik biliminde, teorik bilgilerin pratiklerle

pekiştirilmesi ve tartışılması, kalıcılığının sağlanması, yarınlarınıza yön vermesi

bakımından, büyük önem taşımaktadır.

Hepinize sağlıklı ve başarılı bir eğitim-öğretim dönemi diliyorum.

Saygılarımla,

Prof. Dr. İbrahim KESER

Tıbbi Biyoloji ve Genetik

Anabilim Dalı Başkanı

iii

LABORATUVAR YERLEŞİM DÜZENİ

iv

LABORATUVAR DÜZENİ VE GEREKLİ KOŞULLAR

1- Laboratuvar Altyapısı: Laboratuvarın kuruluş amacına göre bulunması gereken araç-

gereç ve cihaz altyapısı ve sarf malzemelerinden oluşur. Eğitim Laboratuvarı’mızda

başta mikroskoplar ve kapalı devre görüntülü sistem olmak üzere, değişen pratiklere

göre, santrifüj, su banyosu, PZR cihazı (Thermal Cycler), UV-Transillimunatör,

Elektroforez seti gibi hem elektrik hem kimyasal hem de fiziksel özellikli cihazlar ile

kan gibi biyolojik materyallerin zaman zaman yer alması,

2- Deney Hakkında Bilgi, Hazırlık ve İşlem Basamakları: Deneyle ilgili önceden bilgi

toplama, kılavuzu okuma ve varsa öğrenciye ait gerekli malzemeleri temin etme,

deneysel malzemelerin hazırlanması, deneyin işlem basamaklarının bilinmesi,

3- İyi Uygulama; Dikkat, Özen ve Temizlik: Deneyin başarılı olabilmesi için,

laboratvuara giriş yaptıktan sonra, laboratuvar çalışma ilkelerine ve yapılan uyarılara

uyulması, dikkatli ve özenli çalışılması, kendinizin ve arkadaşlarınızın riske

atılmaması, deneysel düzeneklerden zarar görmemek için temiz çalışılması,

4- Tartışma ve Raporlandırma: Deney sonuçlarının ilgili teorik bilgilerle

değerlendirilmesi, harmanlanması, deneyin amacına ulaşıp ulaşmadığı, neden ve sonuç

ilişkisinin tartışılması, çıkan sonucun raporlandırılması ve kalıcı bilgiye

dönüştürülmesi,

5- Bilginin Aktarılması: Edinilen bilimsel bilgilerin, gelecek kuşaklara aktarılması.

v

LABORATUVARDA UYULMASI GEREKEN KURALLAR

1- Laboratuvara zamanında gelinmelidir.

2- Laboratuvara mutlaka önlükle girilmelidir.

3- Laboratuvara yiyecek ve içecek getirilmemelidir.

4- Laboratuvar saatini etkin geçirmek için, deney akışına ve zamanlarına uyulmalıdır.

5- Laboratuvarda not tutmak için kalem ve kağıt bulundurulmalıdır.

6- Laboratuvarda bulunan malzemeler deney dışı kullanılmamalı ve koklanmamalıdır.

7- Laboratuvarda dikkat dağıtıcı hareketler ve gürültü yapılmamalıdır.

8- Laboratuvarda izinsiz olarak elektrikli cihaz, araç-gereç ve kimyasal madde

kullanılmamalıdır.

9- Deney yapanlar mutlaka eldiven giymeli, gerekli durumlarda maske ve koruyucu

gözlük kullanmalıdırlar.

10- Laboratuvarda ortaya çıkan atıklar, uygun biçimde atık kaplarına atılmalıdır.

11- Laboratuvar çalışması bittikten sonra, laboratuar bir sonraki grup ve kendiniz için

temiz ve düzenli bırakılmalıdır.

vi

SİZİN İÇİN

“Tıbbi Biyoloji ve Genetik Laboratuvarı Uygulama Kılavuzu”, Akdeniz

Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Dersi uygulamalarında yol

gösterici olarak hazırlanmıştır.

Laboratuvar; kelime olarak Latince “laborare”den (“çalışmak”tan) köken almakta

olup, bilimsel, teknik araştırma ve inceleme yapmak için gerekli araç, gereç ve

düzeneklerin bulunduğu, “toplam kalite standartları” ile çalışılan yer olarak

tanımlanmaktadır.

Laboratuvarlar genel olarak 3 grup altında toplanırlar;

Eğitim Laboratuvarları: Temel eğitim, lisans veya lisansüstü eğitim amaçlı

laboratuvarlardır. Şuan sizin bulunduğunuz laboratuvar buna en güzel örnektir.

Araştırma Laboratuvarları:

Bilim Laboratuvarları: Üniversitelerde ve Enstitülerde bilimsel soruları

aydınlatmak için kurulan laboratuvarlar

Sanayi Laboratuvarları: Üretimde ilerleme sağlayacak laboratuvarlar olup, sanayi

ve üniversite işbirliği içinde çalışırlar.

3- Rutin Analiz ve Tetkik Laboratuvarları: İnsanların günlük yaşamda

karşılaştıkları sağlık sorunlarına klinik yaklaşımda destek olan, doğum öncesi ve

sonrası örneklerle verilerin elde edildiği laboratuvarlardır.

Bir bilimsel çalışmadan beklenen sonuçların elde edilmesi; probleme ilişkin

sorunun sorulması, dikkatli gözlem ve kontrollü deneyin yapılması, sonuçların

değerlendirilmesi ve bu sonuçların benzer çalışmalarla tartışılması esasına

dayanır.

Bu amaçla, laboratuvarlar; hem eğitim, hem araştırma hem de rutin analizlerin

bilimsel yöntemlerle yapıldığı uygulama alanlarıdır.

Çalışmalardan iyi ve kesin sonuç alınmasının en önemli koşulları, deney araç ve

vii

gereçlerinin eksiksiz olması, laboratuvarın temiz olması, yapılacak çalışma

hakkında önceden bilgi edinilmesi ve çalışma protokolünün hazır

bulundurulmasıdır. “Aktif eğitim-aktif insan” ilişkisi çerçevesinde, laboratuvar

çalışmalarına hazırlanmak, ilgili konu hakkında önceden araştırma yapmak, grup

çalışmaları içinde ulaşılan sonuçları tartışmak, kişinin özgüvenini kazanmasına

katkıda bulunacak ve öncelikle kendisine, sonra da çevresine saygı duymasını

geliştirecektir.

Çalışmaya başlamadan önce ön bilgilerin dikkatlice okunması, kılavuzda

belirtilen yöntemlerin titizlikle izlenmesi, gözlemlerden çıkarılan sonuçların

kısaca not edilmesi ve çizimlerin yapılması gelecekte de bu bilgilerin

kullanılmasına olanak sağlayacaktır.

viii

TAKVİM

A GRUBU B GRUBU

PRATİK

NO TARİH SAAT TARİH SAAT

1 23.10.2017.PZT 10:30-12:20 23.10.2017.PZT 13:30-15:20

2 24.10.2017.SALI 8:30-10:20 24.10.2017.SALI 15:30-17:20

3 25.10.2017.ÇRŞ 15:30-17:20 25.10.2017.ÇRŞ 10:30-12:20

4 30.10.2017.PZT 13:30-15:20 30.10.2017.PZT 10:30-12:20

5 31.10.2017.SALI 15:30-17:20 31.10.2017.SALI 13:30-15:20

PRATİK

SINAV 01.11.2017.ÇRŞ 13:30-15:20 01.11.2017.ÇRŞ 13:30-15:20

TEORİK

SINAV 03.11.2017.CUMA 14:30-17:20 03.11.2017.CUMA 14:30-17:20

6 08.11.2017.ÇRŞ 9:30-11:20 08.11.2017.ÇRŞ 13:30-15:20

7 20.11.2017.PZT 13:30-15:20 22.11.2017.ÇRŞ 13:30-15:20

8 27.11.2017.PZT 8:30-10:20 24.11.2017.CUMA 13:30-15:20

9 02.01.2018.SALI 10:30-12:20 02.01.2018.SALI 8:30-9:20

10 05.01.2018.CUMA 13:30-15:20 05.01.2018.CUMA 10:30-11:20

11 08.01.2018.PZT 13:30-15:20 09.01.2018.SALI 9:30-11:20

12 11.01.2018.PRŞ 8:30-10:20 11.01.2018.PRŞ 10:30-12:20

PRATİK

SINAV 15.01.2018.ÇRŞ 13:30-15:20 15.01.2018.ÇRŞ 13:30-15:20

TEORİK

SINAV 19.01.2018.CUMA 8:30-12:20 19.01.2018.CUMA 8:30-12:20

1

PRATİK 1:

HASTA HİKAYESİ ALIMI VE DNA İZOLASYONU

A) DENEYİN AMACI:

Genetik temelli bir hastalık için klinik ön tanı ile başvuran hastadan bireysel ve

ailesel öykü almak ve periferal kandan genomik DNA izolasyonu gerçekleştirerek,

izole edilen DNA’yı agaroz jelde görüntülemek.

B) GEREKLİ MALZEMELER:

1. K3-EDTA’lı tüp

2. Genomik DNA izolasyon kiti

3. Mikropipet ve steril pipet uçları

4. Steril, DNaz içermeyen 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri

5. Mikrosantrifüj

6. Su banyosu (55°C)

7. Etanol (%96-100)

C) GENEL BİLGİLER:

Hasta hikayesi (anamnez), bir sağlık sorunu için başvuran hastanın kendisinden

veya sağlık kurumuna başvuran kişiden bireysel veya ailesel bilgi alınmasıdır.

Anamnez alırken, mevcut sorunun ve geçmiş hikayenin sorgulanmasına, varsa ön

tanının belirtilmesine dikkat edilmelidir. Hasta bilgileri ve klinik ön tanı, hastaya

uygulanan genetik testin seçimi ve uygulanan genetik testin sonucunun

yorumlanması ve genetik danışma verilmesi açısından önemlidir.

Son yıllarda hızla gelişmekte olan ve birçok hastalığın tanısında yararlanılan

moleküler genetik tekniklerin ilk aşaması, genomik DNA izolasyonudur. Kan

örneği almak ve kandan DNA izole etmek nispeten kolay olduğu için, genelde

periferal kan hücrelerinden DNA izolasyonu tercih edilmektedir. Bunun dışında

başka doku ya da hücrelerden de DNA izolasyonu yapmak mümkündür. Örneğin;

fibroblast, saç, kıl, kemik iliği, amniyosentez materyali, koryonik villus dokusu

gibi materyaller de kullanılmaktadır.

Periferik kandan genomik DNA elde etmek için kullanılan teknik dört aşamalıdır.

Birinci aşama; kanda sayısal olarak fazla bulunan ve çekirdek içermeyen

2

eritrositlerin parçalanarak ortamdan uzaklaştırılmasıdır. İkinci aşama; çekirdekli

lökositlerin parçalanması ve hücre içindeki proteinlerin sindirilmesidir. DNA,

nükleus içerisinde kromozomlar halinde sıkı paketlenmiş (Şekil 1) olarak

bulunduğu için, bu aşamada nüklear membran ve plazma membranı parçalanır,

kromozom paketi açılarak DNA’nın açığa çıkması sağlanır. Üçüncü aşama;

sindirilen membran, protein ve diğer hücre parçalarının uzaklaştırılması ve

DNA’nın alkol ile çöktürülmesidir. Dördüncü aşama ise, elde edilen DNA’nın

uygun bir solüsyon içerisinde (steril distile su, Tris-EDTA tamponu) çözülerek

saklanmasıdır. DNA, kısa süre içinde bir genetik testte kullanılacak ise +40C’de,

uzun süre saklanacak ise –200C’de veya –80

0C’de saklanmaktadır. Bu teknik

kullanılarak 10 ml periferik kan örneğinden yapılan DNA izolasyonu sonrasında

yaklaşık olarak 600 mikrogram DNA elde edilebilmektedir.

Şekil 1. Hücre, kromozomlar ve DNA

3

Genomik DNA izolasyonu yukarıda anlatıldığı gibi geleneksel yöntemlerle

yapılabildiği gibi, ticari olarak satılan “Genomik DNA İzolasyon Kiti”

kullanılarak da yapılabilmektedir. Genomik DNA izolasyon kiti, hızlı ve verimli

bir şekilde DNA izolasyonu yapılabilmesi için dizayn edilmiş ürünlerdir. Kit

kullanılarak çok az miktarlardaki biyolojik örneklerden yüksek miktarda ve

yüksek saflıkta DNA elde edilebilmektedir (Tablo 1).

Tablo 1. Genomik DNA izolasyon kiti kullanılarak DNA izolasyonu yapılabilen

örnekler ve miktarları

Kullanılacak örnek Kullanılacak örnek miktarı

Memeli hücresi ya da memeli

dokusu 5x10

6 hücre, ≤25 mg doku (dalak dokusu için

≤10 mg)

Kan ≤200 µl

Bakteri ≤2 × 109 hücre

Maya ≤5 × 107 hücre

Buccal swab Ağız içi mukozasına ucu pamuklu bir çubuğun

(swab) sürülmesi yoluyla alınan doku örneği

Parafine gömülmüş doku kesiti 1-8 doku kesiti (2-15 µm kalınlıkta, 20-50

mm2’lik yüzey alanı olan)

Tükürük ≤4 ml

Kağıt üzerindeki kan damlası 2–5 parça (2–3 mm büyüklüğe sahip)

Piyasada farklı firmalara ait birçok genomik DNA izolasyon kiti satılmaktadır. Bu

genomik DNA izolasyon kitlerinin uygulanış yöntemlerinde ufak farklılıklar olsa

da (kullanılacak solüsyon miktarı, santrifüj hızı ya da santrifüj süresi gibi),

temelde tüm kitler aynı “spin-kolon temelli santrifügasyon” prosedürünü

kullanmaktadır (Şekil 2, Tablo 2). Bu prosedüre göre öncelikle DNA’nın elde

edileceği hücreler sindirilerek “hücre lizatı” hazırlanır. Hazırlanan lizat kolondan

geçirilir ve DNA’nın kolona bağlanması sağlanırken, istenmeyen moleküller

yıkanarak kolondan uzaklaştırılır. En son olarak genomik DNA kolondan ayrılır

(elüe edilir) ve temiz bir tüpte toplanır.

4

Şekil 2. Spin-kolon prensipli DNA izolasyon yöntemi

Örnek üzerine Sindirim tamponu ve Proteinaz K

eklenerek hücre lizatının hazırlanması

Hücre lizatı üzerine Bağlama

Tamponu ve Etanolün eklenmesi

Hazırlanan karışımın kolondan

geçirilmesi

Yıkama Tamponu ile kolonun

yıkanması

Yıkama Tamponu ile kolonun

tekrar yıkanması

Ayrıştırma Tamponu ile DNA’nın

kolondan ayrılması

5

Tablo 2. Genel olarak genomik DNA İzolasyon Kiti’nin içinde yer alan

malzemeler

İçerik Kullanım Amacı

Proteinaz K (20

mg/ml)

Hücre sindirimi ve protein degredasyonu yapar.

RNaz A (20 mg/ml) RNA moleküllerini sindirir.

Sindirme Tamponu

(Digestion Buffer)

Hücrelerin sindirimi sırasında protein degredasyonu yapar

ve Proteinaz K enziminin aktivitesini artırmaya yardımcı

olur.

Bağlama Tamponu

(Binding Buffer)

Açığa çıkan DNA moleküllerinin silika membrana

bağlanmasını sağlar.

Yıkama Tamponu

(Wash Buffer)

Kolona bağlanmış olan DNA’yı kolondan ayırmadan,

diğer moleküllerin uzaklaştırılmasını sağlar.

Ayrıştırma Tamponu

(Elution Buffer)

Kolona bağlanmış olan DNA’yı kolondan ayırır. İçeriği;

10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 mM EDTA.

Spin kolon DNA moleküllerinin bağlanabileceği silika membran

yapısına sahiptir.

Toplama tüpleri Santrifüj sonrası kolondan süzülen sıvının toplanması için

kullanılır.

D) DENEYİN YAPILIŞI:

I. Aşama: Örnek hazırlama ve ön işlemler

DNA’nın elde edileceği biyolojik materyal temiz bir mikrosantrifüj tüpüne alınır ve

üzerine Sindirim Tamponu ve Proteinaz K eklenerek karıştırılır. Proteinaz K enziminin

aktivitesinin artması ve etkin bir şekilde protein degredasyonu yapabilmesi için karışım

kullanılan kitin protokolüne göre 55-700C sıcaklık aralığında 10-15 dakika süreyle

bekletilir. Elde edilen hücre lizatına RNaz A eklenerek oda sıcaklığında 2-5 dakika

tutulur. Daha sonra hücre lizatının üzerine Bağlama Tamponu ve Etanol (%96 ya da

%100) eklenerek ikinci aşamaya geçilir.

6

II. Aşama: DNA’nın kolona bağlanması

Kitin içerisinden çıkan kolon, toplama tüpünün içine yerleştirilir. Kolonun içine

bir önceki aşamada hazırlanan hücre lizatı eklenir ve 10.000 rpm hızda 1 dakika

santrifüj edilir. Bağlama Tamponu ve Etanol sayesinde hücre lizatı içinde bulunan

DNA, kolonun içindeki silika yapılı membrana bağlanır ve geri kalan sıvı

kolondan süzülerek alttaki toplama tüpünde toplanır. Santrifüj sonrası altta

toplanan bu sıvı atılır ve kolon temiz bir toplama tüpünün içine yerleştirilir.

III. Aşama: DNA’nın yıkanması

Kolonun içine Yıkama Tamponu eklenir ve 10.000 rpm hızda 1 dakika santrifüj

edilir. Böylece kolona bağlanmış olan DNA, diğer hücre parçalarından temizlenir.

Kolondan süzülerek altta toplanan sıvı atılır ve kolon temiz bir tüpe alınarak tekrar

yıkama işlemi yapılır.

IV. Aşama: DNA’nın toplanması

Kolon temiz bir tüpe alınır ve üzerine Ayrıştırma Tamponu (10 mM Tris-HCl, pH

9.0, 0.1 mM EDTA) eklenerek 1 dakika oda sıcaklığında tutulur ve en yüksek

devirde santrifüj edilir. Bu tampon sayesinde kolona bağlanmış olan DNA’nın

kolondan ayrılması sağlanır ve DNA kolondan süzülerek alttaki tüpte toplanır.

Elde edilen DNA kısa süreliğine +4°C’de, uzun süreliğine –20°C’de saklanabilir

ve daha sonraki deneylerde (elektroforez, RFLP, PZR, DNA dizi analizi vs.)

kullanılır.

Elde edilen DNA miktarının hesaplanması

DNA izolasyonu sonrasında elde edilen DNA’nın miktarı spektrofotometre cihazı

kullanılarak belirlenir. Bunun için DNA’nın 260 nm dalga boyundaki UV

absorbansı ölçülür ve aşağıda verilen formül ile DNA miktarı hesaplanır.

DNA (µg/ml) = A260 × 50 × sulandırma faktörü

= ?

A260/A280 = 1.8

= ?

7

Farklı örneklerde genomik DNA izolasyon kiti ile elde edilen yaklaşık DNA miktarları

Tablo 3’de verilmektedir.

Kullanılan Örnek Kullanılan Örnek

Miktarı

Elde Edilen DNA

Miktarı

E.coli hücresi 2 × 109 10–30 µg

HeLa hücresi 5 × 106 20–40 µg

Kan 200 µl 3–10 µg

Fare karaciğer dokusu 25 mg 10–30 µg

Fare dalak dokusu 10 mg 10–40 µg

Tablo 3. Farklı örneklerde genomik DNA izolasyon kiti ile elde edilen yaklaşık DNA

miktarları

8

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz

9

Döng

ü

Sayısı

Kopya Ürün

Sayısı (2n)

0 1

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

7 128

8 256

9 512

10 1.024

20 1.048.576

30 1.073.741.824

PRATİK 2:

PZR UYGULAMALARI VE PZR İLE TANISI KONAN HASTALIKLARIN

RAPORLANDIRILMASI

A. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) (Polymerase Chain Reaction - PCR)

Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR); deneysel ortamda çoğaltılmak istenilen

herhangi bir DNA bölgesinin, çoğaltılmak istenilen bölgeye uygun olarak

hazırlanan oligonükleotid primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik tekrarlayan

reaksiyonlarla kopyalarının sentezlenmesine dayanan bir yöntemdir.PZR prensip

olarak, çift iplikli bir DNA’nın çoğaltılmak istenilen bölgenin her iki zincirine özgün

olarak düzenlenen iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına

dayanır. Öncelikle kalıp DNA molekülleri yüksek sıcaklıkta denatüre edilerek

tamamlayıcı kalıp DNA’nın iki zincirinin birbirinden ayrılması sağlanır. Sonra

primerlerin tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı

(komplementer) olan bölgelerle, primerlere özgün olarak belirlenen sıcaklıklarda

birleşmesi sağlanır. Primerlerin komplementer DNA dizilerine bağlanmasından sonra

DNA polimeraz enzimi, uygun tampon, MgCl2 ve dört çeşit deoksiribonükleotit

trifosfat (dNTP) varlığında, primerlerin serbest 3’OH uçlarından uygun sıcaklık

koşullarında uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni

DNA molekülü sentezlenmiş olur. Çoklu ısısal döngü ile aynı şekilde çok sayıda

kopya sentezlenmesi sağlanmış olur (Şekil 1).

Şekil 1. Polimeraz Zincir Reaksiyonunun basamakları.

10

PZR’ın temel bileşenleri:

a. Kalıp DNA olarak kullanılan ana DNA molekülü

b. DNA polimeraz enzimi

c. Primerler

d. dNTP

e. PZR Tamponu

f. MgCl2

a- Kalıp DNA: İlgili geni çoğaltılmak istenilen canlıdan elde edilen DNA

örneğidir.

b- DNA Polimeraz: DNA’nın çoğaltılması işleminde kullanılan ve primerlerin

3’OH gruplarına ortamda bulunan serbest dNTP’leri ekleyen enzimdir. PZR

reaksiyonu ısıya dayalı döngülerden oluşan bir enzimatik reaksiyon olduğu

için doğada yüksek ısıda yaşamına devam edebilen (termofil) bakterilerden

elde edilen enzimlerdir. Örneğin bir termofil bakteri olan Thermus

aquaticus’dan izole edilen ve yüksek sıcaklıklarda çalışabilen Taq DNA

polimeraz enzimi en sık kullanılan DNA polimeraz enzimlerinden biridir.

Bu enzim DNA’nın denatürayon sıcaklığı olan yüksek ısılarda (95˚C)

aktivitesini koruyabilmektedir. Standart bir reaksiyon için 1-2,5 ünite enzim

kullanılır. Enzimin standart aktivitesi, her bağlandığı primerin 3’OH ucuna

ortamda serbest bulunan dNTP’lerden dakikada ortalama 1000 baz ilavesidir.

c- Primerler: DNA’nın çoğaltılması için, kalıp DNA’ya komplementer

( tamamen tamamlayıcı) olan primerlere gereksinim vardır. Primerler

laboratuvar ortamında yapay olarak sentezlenen dNTP’lerden oluşan nispeten

kısa zincirli, uzama işlemi için gerekli serbest 3`OH ucuna sahip DNA

molekülleridir ve ortalama 15-30 nükleotit uzunluğundadırlar.

Primer Tasarımı: Primer tasarımı yaparken çoğaltılması istenen DNA dizisi

üzerindeki spesifik bölgelerden yararlanılır. Bu bölgelere komplementer olan

primerler dizayn edilir. Sentezlenen primer dizisinin genomda başka

bağlanabileceği bölgeler olup olmadığını da kontrol etmek gerekir. İstatiksel

olarak bir primerin ikinci bir benzer bağlanma bölgesinin olması çok düşük bir

olasılıktır. Ancak bu olasılık benzer yapıda protein veya tekrarlayan bölgelerin

varlığı sebebiyle beklenenden yüksek olabilmektedir.

11

Tasarım yapılırken mümkün olduğunca 4 bazın eşit sayıda kullanımına dikkat

edilmelidir. Primerlerin baz dizilenmesinde; Guanin, Sitozin (GC) miktarı ve

primerlerin yapışması için gerekli sıcaklık miktarı (Tm) arasında çok iyi bir

denge kurmak gerekir. Bu dengenin sağlanamadığı durumda PZR

uygulamalarından başarı beklemek mümkün olmamaktadır. Tasarlanan primerin

son 4-7 bazının G veya C içeriğinin fazla olması özgün bağlanma olasılığını

arttırır.

Primer konsantrasyonunun 0,1-0,5 µM arasında olması sistemin iyi çalışması

için gereklidir. Yüksek primer konsantrasyonu primerlerin yanlış bağlanmasına ve

özgün olmayan DNA bantlarının üretilmesine sebep olur. Ayrıca primer-dimer

oluşumunu teşvik ederek elde edilecek ürünün az olmasına sebep olmaktadır.

d- dNTP (deoksiribonükleotit trifosfat) karışımı: Yüksek saflıkta ticari olarak

tek tek veya karışım halinde sağlanan dATP, dGTP, dTTP ve dCTP

molekülleridir. Normal koşullarda PZR 100-200 µM dNTP konsantrasyonu ile

gerçekleştirilir.

Optimal dNTP konsantrasyonu: MgCl2 konsantrasyonuna, reaksiyon koşullarına,

primer konsantrasyonuna, çoğaltılacak ürünün boyuna, PZR döngü sayısına

bağlıdır.

e- Tamponlar ve MgCl2: Enzime (DNA polimeraz) özgü tamponlar kullanılır

(Genellikle KCl ve Tris HCl içeren tamponlar). Çoğunlukla satın alınan

enzimle birlikte 10X konsantrasyonda sağlanabilmektedir. PZR

uygulamalarında genel olarak 10-50 mM arasında Tris-HCl tampon çözeltisi

(pH 8.3-8.8) kullanılır.

MgCl2’ün PZR’nun verimi üzerine etkisi: Mg+2

iyonları dNTP’ler ile

çözünebilir kompleksler oluşturur, polimeraz aktivitesini stimüle ederler ve

primer-kalıp etkileşimi sağlarlar.

Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu 1.0-3.0 mM arasındadır. Düşük

MgCl2 konsantrasyonu, ürün oluşumunda azalmaya, yüksek MgCl2

konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. MgCl2 içeren

tamponlar kullanılıyorsa ayrıca MgCl2 kullanıma gerek yoktur.

12

PZR cihazları (Thermal Cycler)

PZR farklı sıcaklık derecelerini istenilen sürelerde otomatik olarak ayarlayabilen

özel aletlerde gerçekleştirilir. PZR cihazlarında, DNA’nın çoğaltılması tekrarlayan

ısısal döngü uygulanarak gerçekleşir (Şekil 2).

Şekil 2. PZR cihazı (Thermal cycler)

PZR Döngüleri:

İlk Denatürasyon 95oC 5-15 dakika

1- Denatürasyon 95oC 1-2 dakika

2- Primerlerin bağlanması 50-70oC 1-2 dakika

3- Zincirin uzaması 72oC 1-2 dakika

S o n Zincir Uzaması 72oC 7-10 dakika

1,2 ve 3 basamaklar 20 – 45 defa tekrarlayan döngüler şeklinde gerçekleştirilir.

Son zincir uzaması 72oC 7-10 dakika’dır ve eksik kalan olası boşlukların DNA

Polimeraz enzimi tarafından doldurulmasına olanak sağlar.

20 - 45 döngü

13

Çoğaltılmış ürünlerin görüntülenmesi ve doğrulanması için çeşitli yöntemler

kullanılabilir. En sık kullanılanı agaroz jel elektroforezidir. Böylece çoğaltılmış

ürünün boyutu belirlenebilir.

PZR yönteminde çok küçük DNA miktarları bile çoğaltma (amplifikasyon)

için yeterli olduğundan, örnek hazırlanması sırasında yanlışlıkla karışabilen

yabancı DNA’dan dolayı (kontaminasyon) birçok yanlış DNA bandının elde

edilmesi mümkündür. Bu kontaminasyon pipetleme ve PZR örneklerinin

eklenmesi esnasında meydana gelebilir. Bu sebeple çalışırken çok dikkatli ve

özenli olmak gerekir.

PZR’de kontaminasyondan korunmak için alınabilecek çeşitli önlemler:

PZR çalışması, steril kabinde veya özel bir laboratuvarda yapılmalıdır.

Kullanılacak malzeme ve materyallerin, çözeltilerin steril edilmeleri ve steril

malzemelerin kullanılması gerekir. Araştırıcılar, kontaminasyonu engellemek

amacı ile eldiven, önlük, koruyucu gözlük vb kullanmalıdır.

PZR Optimizasyonu: PZR teknolojisinin gelişmesiyle çok farklı PZR

uygulamaları da ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, yeni başlatılacak bir PZR

uygulamasının düzenli ve başarılı bir şekilde çalışması için her laboratuarda

yeniden ayarlanması gerekmektedir. Eğer PZR şartları yeni PZR uygulaması

için uygun bir şekilde yeniden ayarlanmazsa bazı problemlerle

karşılaşılabilmektedir.

Örneğin;

A) PZR’den beklenen miktarda ürün elde edilemeyebilir veya hiç ürün elde

edilemeyebilir.

B) Primerlerin yanlış bağlanmasından dolayı istenmeyen yanlış DNA bölgeleri

çoğaltılabilir.

C) Primer-dimer oluşumu ortaya çıkabilir ve bu oluşumlar çoğaltma işlemini

yavaşlatır.

14

ÖRNEK PZR YAPILIŞI

GEREKLİ MALZEMELER;

PZR Kimyasalları

Pipetler ve Pipet uçları (1 µl, 20 µl, 200 µl)

200 µl’lik PZR tüpü

Thermal Cycler

Hedef gen: Ailesel Akdeniz Ateşi (FMF) hastalığına sebep olan MEFV Genine

AMAÇ: Deney amacımız MEFV geninin 10 numaralı ekzonunun PZR ile çoğaltılması.

BASAMAKLAR

1- Ailesel Akdeniz Ateşi (FMF) hastalığına sebep olan MEFV Genine ait baz

dizisinin elde edilmesi.

Gene ait bilgiler internette bulunan çeşitli veri tabanlarından elde edilebilir. Burada

kullanılan gene ait genel bilgiler www.ensembl.org adresinden alınmıştır. Benzer bilgiler

UCSC, NIH gibi çeşitli biyoinformatik içerikli web sayfalarından elde edilebilir. Gerekli

bilgi internet üzerinden sürekli yenilenmekte ve gerekli değişiklikler yapılmaktadır. Bu

sebeple sürekli değişen verilerin varlığı, verinin büyüklüğü ve çeşitliliği de dikkate

alınarak çevrimiçi olarak ve ücretsiz sunulmaktadır.

15

2- MEFV Geni Ekzon 10 bölgesine uygun primerler hazırlanması.

Bu amaçla çeşitli internet sayfaları veya bu amaçla hazırlanmış programlar kullanılabilir.

İnternette bulunan program ile (http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html) uygun primerler

dizayn edilerek sentezi sağlanır.

CCTTAGCTCT CAGGCCCAGT GGCCTGTTTG CTTCCTCACT GGATGGAAGT

CGGGGGAGGA CAAGCTAGGA AGTGGGCAGA GTCTAACTGA GAACTCGCAC

ATCTCAGGCA AGGGCTGTGT CCGCTGTGCT TTGTGATACC TCTGTGTAAG

MEFV Geni İleri Primeri

CAACTTGGGT TTGCCATTCA GGGGGTTTTT CCACTGCATG TCCCCAGGAA

GGCCACCAGA CACGGCTGCG AGTCCCCGCT GCCACGCCCA GGAAGGAGAC

CCAGTTGACG GTACCTGTGT GCGTGATTCC TGCAGCTTCC CCGAGGCAGT

TTCTGGGCAC CCCCAGGCCT CAGGCAGCCG CTCACCTGGC TGCCCCCGGT

GCCAGGACTC CCATGAAAGG AAGAGCCCGG GAAGCCTAAG CCCCCAGCCC 450 baz

CTGCCACAGT GTAAGCGCCA CCTGAAGCAG GTCCAGCTGC TCTTCTGTGA

GGATCACGAT GAGCCCATCT GCCTCATCTG CAGTCTGAGT CAGGAGCACC

AAGGCCACCG GGTGCGCCCC ATTGAGGAGG TCGCCCTGGA ACACAAGGTA

GGCACTCCCT GCCTGTGGGC TCTTCTCTGC CAGGCACTTG GACACACTGG

MEFV geni Geri Primeri

GCCTTACTTC ATTTTCCCAA CAACTCTGGG TTGTTGGTGC ATTAACCAGC

ATTCTTGGGC TGGAAATGGC AAGAACACAA TATAAACCAG TCCAGCAAAG

AGGGGAGCTA CAGGTTTATG TTGCTCAGAG ATCCAGGGGG AGCTGGCTTC

AGGTATGGCT GAATCCAGAG GCTCAGAGGA AGTGCCTCTC AGCTCTGCTG

CCTTTGGCAA TTCAGCCATT CCTCCCTCCT CTTTCCTGAG CACCCCTCCC

16

3- MEFV geni için PZR Kimyasal Protokolü:

PZR’da kullanılan malzemeler ve miktarları, kullanıma hazır ticari KİT’ler halinde veya

aşağıdaki örnekte olduğu gibi hazırlanabilmektedir.

1 örnek için kullanılacak miktar Son Konsantrasyon

10 x PZR Buffer 2.5 µl 1X

25mM MgCl2 2.0 µl 2.0 mM

dNTP karışımı 0.5 µl 200 µM

İleri Primer (10 uM) 1 µl 100 nM

Geri Primer (10 uM) 1 µl 100 nM

Taq Polimeraz (5U/ul) 0.2 µl 1 U

dH2O 16.8 µl

DNA (50-100 ng/ul) 1 µl

---------------------------------------------------------------------------------------------------

Toplam Miktar 25 µl

17

PZR ISISAL DÖNGÜ

950C 2 Dakika

35 döngü

720C 7 Dakika

+40C ∞

Şekil: MEFV geni için uygulanan PZR ısısal döngüsü örneği.

950C

580C

720C

30 Saniye

45 Saniye

1 Dakika

18

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

19

PRATİK 3:

AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ

Elektroforez

Elektroforez, ortamın pH değerine göre (+) veya (-) olarak yüklenen biyomoleküllerin

bir elektrik alanının etkisiyle hareket etmesini sağlayan bir tekniktir. Bu yöntemde

biyomoleküllerin birbirinden ayrılması taşıdıkları elektriksel yüke, büyüklüklerine ve diğer

fiziksel özelliklerine göre gerçekleşir.

Birçok önemli biyolojik molekül (örn. aminoasitler, peptitler, proteinler, nükleotidler

ve nükleik asitler) iyonlaşabilen gruplara sahiptir ve tampon çözeltisinde elektriksel olarak

yüklü halde bulunurlar. Moleküllerin hareket etmesini sağlayan gücü jelin her iki tarafında

bulunan aktif elektrotlar sağlar. Net yükün özelliğine bağlı olarak, yüklü partiküller katoda

veya anoda doğru hareket eder. Elektriksel alanda pozitif yüklü moleküller (katyonlar)

katoda, negatif yüklü moleküller (anyonlar) ise anoda doğru ilerler (Şekil 1).

Şekil 1. Agaroz Jel Elektroforezi

Yüklü moleküllerin sabit voltajdaki hareketi, sadece yük ve sürtünmeye bağlı olarak

gerçekleşir. Jelde yürüyen lineer DNA parçaları veya küresel proteinler gibi benzer

konformasyonlardaki bileşiklere etkiyen yer çekimi kuvveti aynı olduğundan, bu moleküller

için yük ve kütle ayırt edici özelliklerdir. Elektrik alanı altında jelin porlarında hareket etmeye

zorlanan makromoleküllerin hareket oranları şu faktörlere bağlıdır:

20

Alanın gücü

Ortamın por büyüklüğü

Moleküllerin büyüklüğü ve şekli

Örneklerin göreceli hidrofobisitesi

Kullanılan tamponun iyonik kuvveti ve sıcaklığı.

Elektroforezin kullanım alanları arasında aşağıdakiler sıralanabilir:

İzolasyon işleminin başarılı olduğunun teyit edilmesi

Saflık kontrolü

Molekül kütlesinin belirlenmesi

Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalıkların moleküler tanısı

Günümüzde; yürütülecek örneğe ve amaca yönelik olarak yaygın olarak

kullanılan elektroforez çeşitleri aşağıda listelenmiştir:

1. Agaroz Jel Elektroforezi

Agaroz jel elektroforezi, genellikle nükleik asit moleküllerinin ayrımı,

tanımlanması ve saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan standart bir yöntemdir.

1.1. Agaroz

Agaroz, bir deniz yosunu türünden elde edilen, oda sıcaklığında jel halde

bulunan ve nükleik asitlerin geçebileceği büyüklükte porları olan kolloidal bir

polisakkarittir Toz formundadır. Agarozdan elde edilen jelin yapısındaki porlu ortam,

elektroforez sırasında bir nevi “moleküler elek” görevi görür; yüklenen örnekler,

kullanılan agarozun konsantrasyonuna bağlı olarak jel içinde farklı hızlarda hareket

eder. Nükleik asitlerin agaroz jelde ayrımı için genel olarak kullanılan agaroz

konsantrasyonları %0,3 ile %3 arasında değişir.

1.2. Yürütme tamponu

Belirli büyüklükteki bir DNA parçasının agaroz jeldeki elektroforetik

hareketliliği elektroforez tamponunun kompozisyonuna, iyonik gücüne ve agaroz

konsantrasyonuna göre değişir. Yaygın olarak kullanılan elektroforez tamponları TBE

(Tris-Borat-EDTA), TAE (Tris-Asetat-EDTA) ve TPE (Tris-Fosfat- EDTA)

solüsyonlarıdır ve genellikle konsantre solüsyonlar olarak hazırlanıp, oda sıcaklığında

21

saklanır. Bu tamponlar hem ortamın pH değerini stabil tutar, hem de içerdiği iyonlarla

iletkenliği sağlar. Farklı konsantrasyonlarda hazırlanan agaroz ve/veya tampon

solüsyonlar sayesinde 20 ila 50.000 baz çifti arasındaki büyüklüklere sahip DNA

parçalarını ayırmak mümkündür.

1.3. Marker DNA ve Uygulanan Elektrik Gücü

Elektroforez için belirli konsantrasyonda hazırlanan jelin kuyucuklarına

yüklenerek, belirli bir voltaj altında yürütülen örneklerin hareketi, yüklenen materyalin

molekül ağırlığına bağlıdır. Elektroforez sonunda elde edilen bantların molekül

ağırlıklarının gözlenebilmesi için, jele bir ‘marker’ (belirteç; standart),

yüklenmelidir. Marker bir çeşit ölçüttür ve belirli sayıda, ağırlığı bilinen DNA

fragmentlerini içerir. Bu da elektroforez sonrasında, yüklenen örneğin hangi moleküler

ağırlıkta olduğunu görebilmemizi sağlar (Şekil 2). Marker genellikle jelin en sağ

ve/veya en sol yanındaki kuyucuklara yüklenir.

Şekil 2. Agaroz jel elektroforezinde örneklerin ve marker’ın yürütmeden sonraki bant

görüntüleri (M=Marker, S= Jele yüklenen DNA örneği).

1.4. Yükleme tamponu

Elektroforeze tabi tutulacak örnekler, kuyucuklara yüklenmeden önce

genellikle su, sükroz/gliserol ve boyadan (örneğin ksilen siyanol, bromofenol mavi,

M S S S

22

bromokresol yeşil vb.) oluşan bir ‘yükleme tamponu’ ile karıştırılır, daha sonra

kuyucuklara yüklenir. Yükleme tamponunun üç görevi vardır:

- yüklenen örneğin yoğunluğunu arttırarak DNA’nın kuyuya eşit bir şekilde

çökmesini sağlamak,

- yüklenen örneği renklendirerek yükleme işlemini basitleştirmek,

- elektrik alanında belirli bir hızda hareket eden örneğin bu hareketini çıplak

gözle takip edebilmek.

1.5. Görüntüleme

Yürütülen örneklerin büyüklüğünün ultraviyole (UV) ışık veren

transilluminatör altında görüntülenebilmesi için, bu örneklerin Etidyum Bromür

(EtBr) ile hazırlanmış agaroz jel elektroforezine tabi tutulması gerekmektedir. (Şekil

3). EtBr, DNA’ya interkalasyon ile bağlanan ve UV altında floresan sinyal veren

katyonik ve mutajenik bir ajandır. İnterkalasyon, bir molekülün iki molekül (veya

grubun) arasına geri dönüşümlü şekilde yerleşmesidir. EtBr, DNA çift zincirinin

kısmen açılması ile bazların arasında aralanan bölgeye girerek DNA’ya bağlanır.

Şekil 3. Agaroz Jel Elektroforezi Aşamaları.

NOT !!!

Etidyum Bromür, güçlü bir mutajen/karsinojendir ve toksiktir. Etidyum Bromür

içeren jellere ve solüsyonlarla çalışırken mutlaka eldiven giyilmelidir.

23

2. Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)

Elektroforez çeşitleri arasında yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem ise

Poliakrilamid Jel Elekteroforezi (PAGE)’ dir. Genellikle proteinlerin saflık kontrolü, molekül

ağırlıklarının saptanması ve konsantrasyon çeşitliliğinin belirlenmesi amacıyla

kullanılmaktadır. Ancak DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir.

Poliakrilamid jelin hazırlanmasında, sentetik bir madde olan akrilamid ile akrilamid

türevi olan N-N’-metilen bisakrilamid kullanılır. Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri jel

oluşumu sırasında polimerleşir. Bu reaksiyonda akrilamid molekülleri yan yana bağlanarak

düz zincirler oluştururken, bisakrilamid molekülleri iki akrilamid zinciri arasında çapraz

bağlanmalar oluştururur. Böylece ağımsı ve porlar içeren bir yapı meydana gelir. Akrilamid

miktarı ve akrilamid/bisakrilamid oranı ile molekül boyutu aralığı, jelin ayrıştırma

kapasitesini belirler. Düşük konsantrasyonda hazırlanan poliakrilamid jeller daha büyük

porlara sahiptir; dolayısıyla yüksek molekül ağırlığa sahip biyolojik moleküllerin analizi için

uygundur. Yüksek konsantrasyonlarda ise küçük porlar oluşur ve düşük molekül ağırlıklı

örneklerin ayrılmasında kullanılır (Şekil 4).

Şekil 4. Poliakrilamid jel elektroforezinde oluşan porlar ve moleküllerin hareketi.

3. Değişken Alanlı (Pulsed Field) Jel Elektroforezi (PFGE)

Değişken Alanlı Jel Elektroforezi (PFGE), büyük moleküllerin agaroz jelde

elektroforetik ayrıştırılması için geliştirilmiş bir yöntemdir. Bu yöntemde jele vuruşlu, dalgalı

ve dikey elektrik alanları uygulanır. Uygulanan akımın yönü belli aralıklarla değişir; böylece

moleküller yön değiştirerek daha kolay hareket ederler ve molekül ağırlıklarına göre

ayrışırlar. Küçük moleküller, uygulanan elektriksel alandaki değişikliklere daha çabuk uyum

sağlarlar, dolayısıyla daha hızlı hareket ederler. Geleneksel agaroz jel elektroforezinde, jelde

yürüme hızları hemen hemen aynı olan 20 kb’ den büyük DNA fragmentlerinin ayrıştırılması

güçtür. PFGE yöntemi ile, 20 kb ile 10 mb arasındaki DNA fragmentleri rahatlıkla

ayrıştırılabilir. Dolayısıyla, kromozomları jelde ayrı ayrı görebilmek mümkündür.

24

4. Kapiller (Kılcal) Elektroforez

Kapiller elektroforez, yüksek ayrım gücüne sahip elektroforez tekniklerindendir.

Küçük çaplı (25-75 µm) silika borular aracılığıyla gerçekleştirilir. Temel elektroforez

mantığına dayalı olarak çalışır, ancak farklı ekipman gerektirir. Geleneksel elektroforeze

kıyasla, analiz süresi daha kısadır, ayrım gücü daha fazladır, ve çok daha düşük hacimlerde

malzeme kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Moleküler genetikte sıklıkla kullanılan DNA dizi analizi, günümüzde yaygın olarak

kapiller elektroforez cihazları ile gerçekleştirilir. Örneğin Kistik Fibroz, müsküler distrofiler,

Konjenital Adrenal Hiperplazi gibi hastalıkların tanısında bu yöntemden sıklıkla yararlanılır.

AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ DENEYİNİN YAPILIŞI

1. %1’lik 150 ml agaroz çözeltisi için gerekli miktarda agaroz tartılıp TBE

tamponu kullanılarak bir erlen içerisinde hazırlanır.

2. Örnek hafif çalkalanıp mikrodalga içerisine konulur ve berrak bir görüntü

oluşana kadar yüksek derecede ısıtılır. Kaynamaya başladıktan sonra

hazırlanan çözelti mikrodalgadan alınır.

3. Hazırlanan agaroz çözeltisinin sıcaklığı 50-60oC’ye gelene kadar erlen girdap

oluşturacak şekilde çalkalanarak soğutulur.

4. Jel, oda ısısına gelerek polimerleşmeden önce uygun miktarda EtBr eklenerek,

EtBr’nin çözeltinin her yerine eşit şekilde dağılması sağlanır.

5. Hazırlanan çözeltinin döküleceği jel tepsisi kasete yerleştirilir ve taraklar

takılır. Uygun sıcaklığa gelen EtBr’li agaroz çözeltisi bir köşeden, baloncuk

oluşturmayacak şekilde ve yavaşça dökülür. NOT: Döküm esnasında mutlaka

eldiven giyilmeli ve maske takılmalıdır !!!

6. Agarozun polimerleşmesi için jel tepsisi oda sıcaklığında 15 dk bekletilir.

7. Polimerleşmeden sonra, kuyuya zarar vermeyecek şekilde taraklar jel

tepsisinden yavaşça çıkarılır ve jel, yürütme tankına yerleştirilir.

8. Tank, jelin üstünü kaplayacak şekilde TBE ile doldurulur. Bu tamponun,

hazırlanan jel içerisindeki tampon ile aynı olmasına dikkat edilmelidir.

9. PCR ürünleri, uygun miktarda yükleme tamponu ile karıştırılır.

10. İlk ve/veya son kuyucukta marker olacak şekilde, yükleme tamponu ile

karıştırılmış örnekler sırasıyla kuyucuklara yüklenir.

11. Yürütme tankının kapağı, katot (siyah kablo) ve anot (kırmızı kablo) uçlarına

dikkat edilerek kapatılır.

25

12. Örnekler, 100-150 V arasında 15-20 dk kadar yürütülür. Örneklerin yürümesi

aralıklarla kontrol edilir.

13. Yürütme işlemi tamamlandıktan sonra jel, tanktan çıkarılır ve

transillüminatörde görüntüleme gerçekleştirilir.

Yukarıda verilen agaroz jel elektroforezi sonucuna göre DNA bant büyüklüklerini

grubunuzda tartışınız.

26

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

27

PRATİK 4:

RFLP UYGULAMALARI VE RFLP İLE TANISI KONAN HASTALIKLARIN

RAPORLANDIRILMASI

1970’lerden bu yana moleküler genetik alanındaki gelişmeler, DNA analiz ve manipülasyon

tekniklerinin gelişmesi ve iyileştirilmesi ile sağlanmıştır. Bugün bilindiği şekliyle ‘Gen

Teknolojisi’nin bir çok pratik uygulaması mevcut olup hastalıkların teşhis ve tedavisinde yeni

metotlar geliştirilmiştir. Restriksiyon Enzimleri (Restriksiyon endonükleazlar), çift zincirli

DNA’yı özgün dizilerden tanıyıp, bu bölgelerden ya da yakındaki özgün bölgelerden

(restriksiyon bölgeleri) kesen bakteriyel enzimdir. Bu amaçla, çeşitli bakterilerden yaklaşık

400 restriksiyon enzimi türetilmiştir. Bunların isimleri genellikle kaynak organizmaların

isimlerinin kısaltılmış şekilleridir. Örneğin Eschericia coli R faktörü EcoRI enzimi;

Providencia stuarti’den PstI gibi.

Restriksiyon enzim tanıma bölgeleri, 4-8 nükleotid arasında değişebilmektedir. Bu bölgeler,

genelde palindromik (çift sarmalın her iki yönünde aynı okunan) dizilerden oluşmaktadır.

Restriksiyon enzim kesimi, DNA’da küt uç (blunt-end) ya da yapışkan uç (sticky-end)

oluşturabilir. Örnek olarak, küt uç bırakan bir enzimin (SmaI) ve yapışkan uç bırakan bir

enzimin (EcoRI) kesim bölgeleri aşağıda verilmiştir:

SmaI kesim bölgesi: EcoRI kesim bölgesi: Restriksiyon Fragman/Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP) analizi, restriksiyon

enzimlerinin sabit dizileri kesmesinden faydalanılarak geliştirilmiş bir tarama yöntemi olup

tıbbi genetik alanında rutin uygulamaları mevcuttur. Tek nükleotid değişimi sonucu gözlenen

hastalıkların tanısında, eğer bu nükleotid bir restriksiyon enziminin tanıma bölgesi içindeyse,

bütün genin dizilenmesi (sekanslanması) yerine RFLP analizi tercih edilebilir. Enzim kesim

bölgesinde, tek bir nükleotid bile mutasyona uğrasa, normalde o bölgeyi kesen enzim, artık

değişmiş olan diziyi kesemez. Dolayısıyla mutant ve yabanıl tip (mutasyona uğramamış)

DNA restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra elektroforezde yürütülünce farklı uzunlukta

bantlar gözlenir.

28

PZR-RFLP adı verilen metotta, öncelikle incelenecek olan gen bölgesi, uygun primerler

kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılır ve restriksiyon enzim kesimine

uygun miktarda DNA kopyası elde edilmiş olur. Ardından restriksiyon enzim kesimi

gerçekleştirilir ve ürünler jel elektroforezi ile yürütülür. Mutasyon taşımadığı (yabanıl tip

olduğu) bilinen bir DNA örneği de enzim kesimine uğratıldıktan sonra jel elektroforezinde

yürütülerek kontrol olarak kullanılmalıdır.

PZR-RFLP yöntemi, Şekil 1’de özetlenmiştir.

Şekil 1: PZR-RFLP yöntemi. PZR-RFLP yöntemi ile, öncelikle bireyden izole edilen DNA

taban olarak kullanılarak, uygun primerlerle sorgulanan gen bölgesi çoğaltılır. Ardından,

RFLP analizinde kullanılacak olan enzimle bu DNA kesilir ve agaroz jelde yürütülür. Elde

edilen bant paternine göre bireyin mutasyon taşıyıp taşımadığı saptanır.

RFLP ile Tanı Konan Bir Hastalık Modeli: Orak Hücreli Anemi

Orak hücreli anemi, eritrositlerin demir bağlamada kullandıkları protein olan hemoglobinin

beta zincirindeki bir mutasyondan kaynaklanır. Hemoglobin beta zincirinin altıncı aminoasidi

yabanıl tipte glutamik asit iken, bu hastalarda valin aminoasidine dönüşür. Bahsedilen

aminoasit değişimi, glutamik asidi kodlayan GAG dizisinin (6.kodon), nokta mutasyonu ile

valin aminoasidini kodlayan GTG’ye dönüşmesi ile oluşur. Glutamik asit proteine polar yan

zincir kazandırırken, bu aminoasit valine dönüştüğünde polar yan zincir kaybolduğu için

29

proteinin polimerleşmesi değişir. Bu mutasyon varlığında oluşan hemoglobin molekülüne

Hemoglobin-S adı verilir. Yabanıl tip hemoglobin bulunduğunda eritrositler basık kürecik

şeklinde iken, hemoglobin-S varlığında eritrositler orak şeklini alır. Şekil 2’de orak hücre

anemisi taşıyan bir hastanın kan yayması verilmiştir.

Şekil 2: Orak hücreli bir hastanın kan yayma görüntüsü. Resim, www.sicklecellanemia.org sitesinden alıntıdır. Tek nükleotid değişiminden kaynaklanan bu hastalığın tanısında, dizileme analizi

kullanılabileceği gibi, nispeten daha hesaplı bir yöntem olan RFLP testi de kullanılabilir.

RFLP ile Orak Hücreli Anemi tanısının konması için öncelikle uygun PZR primerleri ile beta

globülin geninin mutasyon içerip içermediği sorgulanan bölgesi çoğaltılmalıdır. Tanı

koyulmasını sağlayabilecek kesim enzimi, DdeI’dir.

DdeI, CTNAG dizisini tanıyıp kesebilir. Yabanıl tip beta globülin allelinde, CTGAG dizisi

bulunmaktadır. Bu dizi, DdeI kesim bölgesi ile uyumludur. Orak hücreli anemiye neden olan

mutasyon sonucunda ise bu dizi CTGTG dizisine dönüşür. Bu diziyi ise DdeI enzimi

kesemez. Genellikle PZR-RFLP analizinde kullanılan primerler ile 233 baz çifti uzunluğunda

fragman elde edilip, DdeI enzimi ile kesildiğinde 55 baz çifti ve 178 baz çifti uzunluğunda

fragmanlar ortaya çıkar (Şekil 3). Şekil 4’de verilen jel görüntüsünde hangi kuyucukların

normal (sağlıklı, homozigot), taşıyıcı (heterozigot) ve orak hücreli anemi hastası (homozigot

HbS) bireylerin PZR-RFLP ürünleri olduğunu belirleyiniz.

30

PZR-RFLP Deneyi İçin Gerekli Malzemeler:

- 200 ng PCR ürünü

- Steril su

- DdeI enzimi (su içerisinde ½ seyreltilmiş)

- 10X FastDigest Tamponu

- Marker, DNA yükleme tamponu

- 2-20µl’lik mikropipetler ve pipet uçları

- Ependorf tüpleri

- 370C su banyosu

- Agaroz jel, yürütme tamponu ve yürütme tankı.

Deney Yöntemi

- PZR ürününden, 200 ng toplam DNA’yı elde etmek için gerekli hacim hesaplanır. Bu

hacime göre, aşağıda hacimi verilen malzemeler de eklendiğinde toplam hacimi 30µl

yapacak steril su miktarı hesaplanır.

Kullanılacak Malzeme Hacim

Steril su

10X Tampon 3µl

PCR ürünü

Enzim 2µl

Toplam 30µl

Hesaplanan miktarlarda malzeme, belirtilen hacimlerde ependorf tüpüne koyulur. Nazik bir

şekilde karıştırıldıktan sonra, 370C su banyosunda 5-15 dakika bekletilir.

- Karışım agaroz jele yüklenip, yürütüldükten sonra transillüminatörde gözlemlenir.

31

Şekil 3. PZR ile çoğaltılan beta-globin geninin yabanıl tip (üstte) ve mutant (HbS, altta)

allelde DdeI muamelesi ile ortaya çıkan fragmanlar

Şekil 4. Kutu içerisinde verilen jel görüntüsünde kuyucukların üzerinde boş bırakılan

alanlara, bu kuyucuklara hangi örneğin yüklendiğini yazınız.

32

Ek 1: HBB geni

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Yenidoğan Yoğun

Bakım

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Postnatal dönemde HbS’in

Moleküler Analizi

Onaylayan:

HbS-

Yapılan Test: Postnatal dönemde HbS’in moleküler analizi

Kullanılan Yöntem: PZR-RFLP

Sonuç: HBB geni 1.ekzon PCR amplifikasyonu

Yorum: Olgunun gDNA materyali üzerinde yapılan çalışma sonucunda, probandın HBB geninin

1.ekzonunda heterozigot p.Glu 6 Val / N [c.20A>T / +] değişimi gözlenmiştir. Aileye genetik

danışma verilmesi önerilmektedir.

Not: Bu analiz, DNA düzeyinde primerler ile belirlenen alan dışındaki sekonder

anomalileri ekarte etmemektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

33

Ek 2: HBB geni

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi

(Hastane)

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Yenidoğan Yoğun

Bakım

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Postnatal dönemde HbS’in

Moleküler Analizi

Onaylayan:

HbS-

Yapılan Test: Postnatal dönemde HbS’in moleküler analizi

Kullanılan Yöntem: PZR-RFLP

Sonuç: HBB geni 1.ekzon PCR amplifikasyonu

Yorum: Olgunun gDNA materyali üzerinde yapılan çalışma sonucunda, probandın HBB geninin

1 nolu ekzonunda homozigot p.Glu 6 Val / p.Glu 6 Val değişimi gözlenmiştir. Aileye genetik

danışma verilmesi önerilmektedir.

Not: Bu analiz, DNA düzeyinde primerler ile belirlenen alan dışındaki sekonder

anomalileri ekarte etmemektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

34

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

35

PRATİK 5:

DNA DİZİ ANALİZİ VE DNA DİZİ ANALİZİ İLE TANISI KONAN

HASTALIKLARIN RAPORLANDIRILMASI

DENEYİN AMACI

DNA dizileme tekniğinin temelinin kavranarak DNA dizi analizi ile tanımlanan

hastalıkların raporlandırılmasının öğrenilmesidir.

PRATİK MALZEMELERİ

1. 200 μl’lik reaksiyon tüpü (ependorf)

2. Pipet

3. Pipet ucu (Tip)

4. Steril su

5. Tek yönlü primer

6. Big Dye Terminator Enzim (Applied Biosystem)

7. Big Dye Terminator Tampon solusyonu (Applied Biosystem)

8. Temizlenmiş PZR örneği (Kalıp DNA)

9. Thermal Cycler

10. DNA dizi analiz cihazı (Applied Biosystem Genetic Analyzer 3130)

GENEL BİLGİ

DNA dizi analizi, DNA molekülündeki nükleotidlerin sırasının belirlenerek DNA

zincirinin okunmasını sağlayan moleküler bir tekniktir.

1953’te Watson ve Crick tarafından DNA molekülünün yapısının ortaya

çıkarılmasından sonra çalışmalar DNA dizisinin analizine yoğunlaşmıştır. Bu

alanda temel gelişimi 1977 yılında birbirlerinden bağımsız olarak çalışan iki bilim

adamı Frederic Sanger “Zincir sonlandırma inhibitörleri ile DNA dizi analizi”

(Sanger metodu) ve Walter Gilbert “Kimyasal degradasyonla DNA dizi analizi”

(Maxam Gilbert metodu) başlıklı yayınlarıyla ortaya koymuşlardır. Her iki teknik

de elektroforez sonucu DNA fragmentlerinin tek zincir düzeyinde

36

ayrımına dayanmakla beraber bazı farklılıklar göstermektedir.

Sanger’in dizi sonlandırma metodu dideoksi dizileme olarak da adlandırılmaktadır.

Bu teknik adından da anlaşılacağı üzere dideoksi nükleotidlerin (ddNTP)

kullanımına dayanmaktadır. ddNTP’lerde deoksinükleotid (dNTPs)’lerden farklı

olarak deoksiriboz şekerinin fosfodiester bağı yapımında kullanılan 3 numaralı

karbon atomunda hidroksil grubu yoktur (Şekil 1). Böylece atasal zincir kalıp

alınarak uzayan DNA dizisi, reaksiyona spesifik oranda konan deoksinükleotid

(dNTPs) ve ddNTP miktarına bağlı olarak ddNTP’nin uzayan DNA fragmentine

girdiği noktada sonlanır.

Şekil 1. dNTP (deoksinükleotid) ve ddNTP’nin (dideoksinükleotid) moleküler

yapıları.

Biyomedikal gelişmeler ile Sanger’in dizi sonlandırma metodu, PZR tekniği ile

birleştirilerek otomatize DNA dizi analiz sistemleri geliştirilmiştir. Bu sistemlerde

dizileme reaksiyonu “cycle sequencing (döngüsel dizileme)” olarak

adlandırılmakta ve tüm reaksiyon bir tüpün içerisinde gerçekleşmektedir.

Cycle sequencing reaksiyonunda; PZR reaksiyonunda da olduğu gibi ön

denatürasyon, denatürasyon, primer bağlanması ve uzama basamakları mevcuttur.

Normal P Z R reaksiyonundan ayrılan en temel farklılıklar, reaksiyonda herbiri

farklı floresan işaretli ddNTP ve sadece tek yönlü bir primerin kullanılmasıdır.

(Şekil 2).

BAZ BAZ

-OH yok

37

Şekil 2. Dizileme reaksiyonunun içeriği

Bu pratikte farklı floresan işaretli ddNTP’ler kullanılarak dizileme reaksiyonu

gerçekleştirilecektir. Reaksiyonun basamaklarından biri olan denatürasyon

aşamasında kalıp DNA’nın iki zinciri birbirinden ayrılmaktadır. Primer

bağlanma aşamasında reaksiyon ortamına konan ileri veya geri primerler kalıp

DNA’ya bağlanmaktadır. Uzama basamağında ise reaksiyonda spesifik oranda

bulunan floresan işaretli ddNTP’ler ile dNTP’ ler yarış halinde DNA polimeraz

tarafından primere eklenerek tek nükleotid uzunluk farkıyla yeni DNA

zincirleri oluşturulmaktadır. (Şekil 3)

Şekil 3. Dizileme reaksiyonunun basamakları

Dizileme reaksiyonundan sonra tüp içerisinde kullanılmayan ddNTP, dNTP ve

primer artıkları farklı kimyasal metodlarla (etanol, sephadex) ya da ticari kitler

aracılığıyla ortamdan uzaklaştırılır. Bu aşamada amaç sadece istenilen gen

bölgesine ait farklı boyutlardaki DNA dizilerinden oluşan saf bir reaksiyon ürünü

elde etmektir.

Ürün Denatürasyon Primer Bağlanma Uzama Enzim dNTP,işaretli

ddNTP

DNA-Kalıp Zincir

dNTP’ler Floresan işaretli

ddNTP’ler

Primer

DNA Polimeraz

38

Elde edilen reaksiyon ürünü, kapiller elektroforez sistemiyle çalışan otomatize DNA

dizi analiz cihazına yüklenir (Şekil 4) Bu pratikte ABI (Applied Biosystem)

dizileme reaksiyonu kiti ve analiz cihazı kullanılacaktır. Cihazdaki kapillerin içinde

DNA zincirlerinin büyüklüğüne göre ayrılmasını sağlayan polimer bulunmaktadır.

Bir tampon aracılığıyla örnekler elektrik akımı ile bu polimerlerin içinde elektroforeze

tabi tutulur. Elektroforez sırasında DNA zincirleri büyüklüklerine göre ayrışırlar. Bu

geçiş sırasında kapillerin bir noktasında bulunan ve floresan ışınları algılayan

kamera, fragmentlerdeki floresan işaretli ddNTP’leri (son nükleotidi) algılayarak

cihazın yazılım sistemine aktarır. Yürütme sonunda her bir ddNTP ile sonlanan

DNA fragmenti farklı renkli pikler halinde sistem tarafından kaydedilir (Şekil 5).

Şekil 4. DNA dizi analizi cihazi iç görünümü.

Örnek alanı

(TRAY)

Polimer alanı (POP)

Tampon alanı

Dedektör

Isıtıcı alanı

(Oven)

Kapiller

39

Şekil 5. DNA dizi analizi aşamaları

DENEYİN YAPILIŞI

1. Dizileme reaksiyonu aşağıda belirtildiği miktarlarda 200 μl’ lik PZR

tüpünde kurulur.

Reaksiyon için Gerekli Malzemeler

Steril distile su

ABI Big Dye Terminator 3.1 Tamponu

ABI Big Dye Terminator 3.1 Enzimi

Tek yönlü primer

Kalıp DNA

40

2. Reaksiyon thermal cycler (ısı döngüleyici) cihazına konur ve dizileme

programı başlatılır.

3. Program sonunda sekans ürünü temizlenir ve sekans cihazına yüklenir.

4. Elde edilen dizi, normal dizi ile karşılaştırılarak varsa değişimler saptanır.

DNA DİZİ ANALİZİ İLE TANISI KONAN HASTALIKLARA ÖRNEK:

AİLESEL AKDENİZ ATEŞİ (FMF) ( Familial Mediterranean Fever )

Ailesel akdeniz ateşi, otozomal resesif kalıtım gösteren otoinflamatuar bir

hastalıktır (Şekil 6). Hastalık 781 aminoasitten oluşan Pyrin proteinini kodlayan

MEFV geninde meydana gelen mutasyonlar sonucu oluşur. MEFV geni 16.

kromozomun kısa kolunda lokalize olan 10 ekzonlu bir gendir. Bu gen ağırlıklı

olarak makrofajlar, monositler, dendritik hücreler ve sinovyal fibroblastlarda

sentezlenir. Gen ürününün ana görevi, Interlökin-1 (IL-1) olgunlaşmasını sağlayan

Kaspaz-1 enzimini inhibe etmektir. IL-1 i s e TNF-α gibi yangı (ateş,

inflamasyon) oluşturan bir sitokindir. Mutasyonlar sıklıkla 2, 3, 5 ve 10.

ekzonlarda görülmektedir. En yaygın görülen mutasyonlar R202Q, M694V,

M680I ve V726A mutasyonlarıdır (Şekil 7). Söz konusu mutasyonları

homozigot veya “Compound-heterozigot” olarak bulunduran bireylerde mutant

pyrin proteini, Kaspaz-1’i inhibe edemeyeceği için, inflamatuar IL-1 ve TNF-α

gibi i n f l a m a t u a r sitokinlerin sentezi hızlanacağından hastalarda yaygın

inflamasyon ve tekrarlayan ateş gözlenir.

Şekil 6. Otozomal resesif kalıtım modeli

41

FMF tanısı DNA dizi analizi ile konmaktadır. Elde edilen dizi analizi sonuçları, Human

Genome Project (İnsan Genom Projesi) ile ortaya çıkarılmış normal gen dizisiyle

karşılaştırılarak değerlendirme yapılır.

42

MEFV Geni Ekzon 10F -Normal/Normal

MEFV Geni Ekzon 10F – M694V/M694V

MEFV Geni Ekzon 10F – M680I/Normal

MEFV Geni Ekzon 10R – M680I/Normal

MEFV Geni Ekzon 2R – R202Q/Normal

MEFV Geni Ekzon 10R –V726A/Normal

Şekil 7. FMF’ te yaygın olarak görülen mutasyonları içeren dizi analizi sonuçları örnekleri

43

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

KOMİTE SINAVINIZDA BAŞARILAR DİLERİZ!!!

44

1 mm = 1 000 μm = 1 000 000 nm

PRATİK 6:

MİKROSKOP KULLANMA BECERİSİNİN KAZANILMASI

A) DENEYİN AMACI

Mikroskobun optik ve mekanik kısımlarının tanıtılması, mikroskop kullanırken

dikkat edilecek hususların belirtilmesi, hayvan ve bitki hücresi örneklerinin

incelenmesi.

B) GEREKLİ MALZEMELER

1-Mikroskop

2-Lam ve lamel

3-‘e’ harfi yazılı bir parça gazete kağıdı

4-Soğan

5-İki farklı renkte birer parça dikiş ipliği

6-Metilen mavisi

7-Kan yayma lamları

8-Kurutma kağıdı

9-Distile su

C) GENEL BİLGİLER

İnsan gözü 200-250 mikrometreden (μm) büyük olan nesneleri görebilir. Çoğu

mikroorganizmanın boyutu ise, 0,1-10 mikrometre (μm) arasında değişiklik

göstermektedir. Bu nedenle, mikroorganizmaları görmede ve bunlar hakkında

bilgi edinmede özel ve büyütücü aletler kullanma zorunluluğu vardır.

Kullanılan ilk büyüteçlerin, büyütme kapasitelerinin 10 ile 20 kat arasında olduğu

bilinmektedir. Hollandalı bir gözlükçü olan, Zacharias Janssen 1590’ların sonunda

teleskopta bazı değişiklikler yaparak (2 veya daha fazla mercek kullanarak) objeleri

50 katın üzerinde büyütebilmeyi başarmıştır. Galileo’nun, occhiolino (küçük göz)

ismini verdiği alet için Giovanni Faber ilk defa mikroskop kelimesini kullanılmış

ve mikroskobun isim babası olmuştur. Mercek sisteminin, tersine çevrilmiş bir

teleskobun cisimleri büyütmek için kullanılabileceğini düşünen Kepler ve Robert

45

Hooke gibi bilim adamları ilerleyen yıllarda mikroskobun gelişmesine katkıda

bulunmuşlardır. Antonie Van Leeuwenhoek (1632-1723) yaptığı ve 275 kattan

daha fazla büyütebilen mikroskobu ile; tükürük, mantar, yaprak, su vb.,

maddeleri inceleyerek, bunlarda bulunan bakterileri görmüş, şekil ve

hareketlerini çizmiştir. Vakuol, sperm ve çizgili kas demetlerinin yapılarını da ilk

keşfeden bilim adamı olarak tarihe geçmiştir.

Bu tarihlerden sonra mikroskoplar daha da geliştirilmiş v e büyütme kapasiteleri

artırılmıştır. Günümüzde çeşitli amaçlar için yapılan mikroskoplar başlıca 7

bölümde incelenebilir.

1. Işık mikroskobu,

Örnek yüzeyinin çeşitli ayrıntılarının konumlarına göre, değişik açılarda

yansıtılan gelen ışık, yansıma açısına bağlı olarak mikroskobun merceklerinden

geçerek görüntüyü göze iletir. En yaygın kullanımı olan mikroskoptur.

2. Karanlık saha mikroskobu,

Boyanmamış ve canlı örneklerin incelenmesinde etkin olarak kullanılır. Bir

karanlık alan engelleyicisi yerleştirilen özel bir kondansör yardımı ile ışıklı bir

görüntü oluşturmaktadır.

3. Floresan mikroskobu,

Floresan ışıma özelliğine sahip moleküller ile işaretlenen örnekler incelenir. Bu

moleküllerin uyarılmasıyla ortaya çıkan ışıma, filtreler ile işlenerek, renk ve

kontrasta dönüştürülür. Floresan mikroskoplar, sitogenetik,parazitoloji ve

bakteriyoloji alanlarında önemli yer tutarlar.

4. Faz-kontrast mikroskobu,

Genellikle çalışılması zor olan boyanmamış, sıvı ortamdaki mikroorganizmaların

ve canlı hücrelerin morfolojisinin incelenmesinde kullanılmaktadır. Işık ya da

karanlık saha mikroskobu ile belirlenemeyen detayların incelenmesine fırsat tanır.

5. Konfokal mikroskop,

Floresan mikroskobun gelişmiş bir modelidir. Floresan boyalarla işaretlenmiş

moleküller, lazer tarafından taranır ve üç boyutlu görüntü elde edilir. Lazer

Taramalı Konfokal Mikroskop; kalın kesitli doku örnekleri, embriyolar gibi

küçük organizmalar ve bütün haldeki hücre örnekleri ile çalışma imkanı sağlar.

46

6. Diseksiyon mikroskobu

Bir stereo mikroskop türü olan diseksiyon mikroskopu normal göz ile ayırt

edilmesi zor olan makro yapıların daha net bir şekilde gözlemlenebilmesine

olanak sağlar. Stereo özelliği sayesinde incelenen yapı 3 boyutlu olarak

görüntülenir. Deney hayvanı çalışmalarında girişimsel uygulamalarda sıklıkla

kullanılır.

7. Elektron mikroskobu

Elektron Mikroskobu, organizmaların üç boyutlu ve daha detaylı bir şekilde

incelenmesine olanak veren yüksek enerjili elektronlar ile yüzeyin taranması

prensibiyle çalışır. Bu tip mikroskoplar, elektron enerjisine ve ölçüm aletinin

çalışma moduna göre, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), taramalı elektron

mikroskobu (SEM) gibi sınıflara ayrılır.

Pratik çalışmalarınız boyunca kullanacağınız mikroskop, bir mercekler sistemi ve

görünür ışık aracılığıyla küçük objelerin görüntülerinin büyütülmesine olanak

tanıyan binoküler ışık mikroskobudur. Mikroskop temel olarak iki kısımdan

oluşur (Şekil 1). Bunlar mercek sistemini kapsayan ‘optik kısım’ve optik

kısımları destekleyen ve çeşitli ayarlara olanak tanıyan ‘mekanik kısım’dır. Optik

ve mekanik kısımları oluşturan birimler aşağıda sıralanmıştır. Bu kısımlar Şekil

2’de mikroskop görüntüsü üzerinde de tanımlanmıştır.

47

Şekil 1:Işık mikroskobunun kısımları

Işık mikroskobunda inceleme yapılırken, ışık kaynağından gelen ışık, mikroskop

tablasının altında bulunan kondansör mercek yardımıyla yoğunlaştırılarak

incelenen örneğe odaklanır. Örnek üzerine gönderilen ışık miktarı ile ilişkili olarak

kontrast ayarı, tablanın hemen altındaki diyafram aracılığıyla yapılabilir.

Örnekten geçen ışık objektif mercek tarafından toplanır ve mikroskop tüpünde

büyütülmüş ve net bir görüntü oluşur. Görüntü daha sonra ikinci bir büyütücü

mercekten (oküler mercek) geçer ve göze ulaşır. İncelenen örneklerdeki doğal

pigmentasyon veya boyalar ışığı farklı oranlarda absorbe eder ve objeleri

görebilmemizi sağlar. Mikroskobun, cismin görüntüsünü büyütme gücüne

mikroskobun “ayırım (resolüsyon) gücü” ya da “büyütme gücü” denir.

Mikroskobun büyütme gücü, objektif mercek büyütmesi ile oküler mercek

büyütmesinin çarpımı ile hesaplanabilir. Kullandığınız mikroskopların objektif

mercek büyütmeleri 4, 10, 20, 40, 100 kat olabilir. Bu rakamları merceklerin

üzerinde görebilirsiniz. Mikroskoplarınızın oküler merceklerine baktığınızda ise

genellikle 10 kat büyütme gücünde olduklarını görebilirsiniz.

Mikroskopların çoğunda bulunan objektif mercekleri genellikle parfokaldir (eş

odaklı). Yani, bir objektif mercekle odaklanan görüntünün, diğer objektif

mercekler ile de aynı odak noktasında görüntülenmesi sağlanmış olur. Bu

yüzden en küçük objektif mercekte makrovida ile görüntünün bulunması

(odak ayarı), daha sonra mikrovida ile görüntünün netleştirilmesi gerekir.

Optik Kısım

Esas optik kısım

Oküler mercek

Objektif mercek

Aydınlatma Sistemi

Kondansör

Diyafram

Işık Kaynağı

Mekanik Kısım

Mikroskop tüpü

Mikroskop kolu (statif)

Mikroskop tablası

Makrovida-Mikrovida

Mikroskop ayağı

Şaryo

48

Objektif mercek değiştirilerek görüntü büyütüldüğü zaman, görülebilecek olan

toplam saha küçülmüş olur. Bu nedenle, merceği değiştirdiğinizde eğer obje

merkezde değilse görüntüsünü kolaylıkla mikroskop sahasından kaybedebilirsiniz.

Ancak, objektif merceği değiştirmeden önce objeyi merkezde tutmayı alışkanlık

haline getirirseniz, incelemek istediğiniz alana ulaşmanız için büyük bir kolaylık

sağlamış olursunuz.

Şekil 2. Binoküler Işık Mikroskobu

49

Işık Mikroskobunun Kullanımı:

1. Mikroskobun üzerinde bulunan kılıfı çıkarınız.

2. Kullanıma başlamadan önce mikroskobun optik parçalarının sağlam, tozsuz

ve lekesiz olduğuna dikkat ediniz. Optik kısım üzerindeki toz ve leke kağıt

mendiller ile silinerek giderilir.

3. Mikroskobunuzu yan kısımdaki düğmesinden açık konuma getirin.

4. Lam üzerinde hazırlanan preparatın alt kısmı mikroskobun tablasının

ortasındaki boşluğa gelmek üzere yerleştirilir veya preparat tam bu boşluğa

gelecek şekilde ayarlanır. Eğer üzerinde lamel varsa lamelli kısmın üst tarafta

olması gerekir. Preparat kıskaç içine alınarak, tabla üzerinden kaymaması ve

pozisyonunun değişmemesi sağlanır.

5. Preparat incelenirken bazı alanların yeniden incelenebilmesi amacı ile alanın

koordinatlarının kaydedilmesi gerekebilir. Bunun yapılabilmesi için lamın

hep aynı yönde yerleştirilmesi gerekir. Lamınızı numara veya hasta ismi sağda

olacak şekilde yerleştiriniz. Gireceğiniz pratiklerde koordinat almanız

gerekmeyecektir, ancak preparatın doğru yerleştirme yönünün öğrenilmesi

gerekmektedir.

6. Preparatınızı incelemeye geçmeden önce, oküler mercekleri gözünüze göre

ayarlamanız gerekecektir. Kullandığınız mikroskoplar, binoküler mikroskoplardır,

yani iki oküler mercekleri bulunur. Binoküler mikroskoplarda iki oküler mercek

arasındaki aralık göze göre ayarlanabilir. Bunun için iki gözünüzle bakarken, tek

ve büyük daire şeklinde bir görüntü alanı elde edinceye kadar okülerleri

birbirine yaklaştırınız veya uzaklaştırınız.

7. Preparatınızın boyalı veya boyasız olmasına göre diyaframın ayarlanması

gerekir. Boyalı preparatlarda diyaframın açık olması gerekirken, boyasız

preparatlarda kontrastın artırılması için diyafram kapalı olmalıdır.

Ayarlamayı, objeyi en iyi gördüğünüz kontrast miktarına göre yapabilirsiniz.

8. Preparatınızı tablaya yerleştirdikten sonra 4 veya 10 kat büyütmeli objektif

merceği obje üzerine getirerek makrovida yardımıyla odaklamaya geçebilirsiniz.

Makrovida ile ayarlama yapılırken en küçük büyütmeli objektifin aktif

durumda olmasına dikkat edilmelidir. Daha sonra mikrovidayla görüntüyü

netleştirebilirsiniz. Küçük büyütmeli objektiflerde mercek çapı daha geniş olduğu

50

için daha büyük bir alanı odaklayabilir. Bu alan daha ayrıntılı incelenmek

isteniyorsa daha büyük büyütme gücü olan objektifler kullanılabilir.

9. Eğer 100 kat büyütmeli objektifi kullanacaksanız, bu objektifi mutlaka

immersiyon yağı ile kullanmanız gerekmektedir. Ancak bu yağın diğer objektiflere

bulaşmaması için daha küçük büyütmeli objektifler ile görüntü bulunduktan ve

odaklandıktan sonra immersiyon yağı damlatmadan önce küçük büyütmeli

objektifleri merkezden uzaklaştırınız. İmmersiyon yağı ışık ışınlarının obje üzerine

odaklanmasını ve daha net bir görüntü elde edilmesini sağlar. Preparatı daha

ayrıntılı incelemek için, istenen bölgeye preparatın konumunu değiştirmeden ve

preparatı mikroskoptan çıkarmadan bir damla immersiyon yağı damlatılması

yeterlidir. 100 kat büyütmeli objektifi immersiyon yağı olmadan kullanmayınız

ve bu objektif ile alan bulmayınız. Sadece 10 kat büyütmeli objektifle

netleştirdiğiniz ve yağ damlattığınız alanda inceleme yapınız. Bunun yanında,

100 kat büyütmeli objektif ile inceleme yaparken asla makrovidayı

kullanmayınız. 100 kat büyütmeli objektif mercekle işiniz bittikten sonra objektifi

merkezden uzaklaştırıp en küçük büyütmeli objektifi merkeze getiriniz.

10. İncelemeniz bitiğinde kıskaçları açarak preparatı tabladan alınız.

11. İnceleme sonunda mikroskop, kağıt mendillerle mercek sisteminden

başlayarak temizlenmelidir. Silme işlemi, en küçük objektiften en büyük objektife

doğru yapılmalıdır. İmmersiyon yağı bulaşan kısımlar çok az eter-alkol (veya

alkol) emdirilmiş kağıt mendillerle silinebilir. Daha sonra en küçük büyütmeli

objektifi merkeze yerleştiriniz.

12. Mikroskobun ışığını kapatınız.

13. Mikroskop kılıfını tekrar mikroskop üzerine geçiriniz.

51

MİKROSKOBUN KORUNMASI VE BAKIMI

Mikroskopların uzun ömürlü ve devamlı kullanılabilir bir durumda olabilmesi,

bunların bakım ve kullanımına bağlıdır. Bunun için;

1. Mikroskop daima iki elle taşınmalıdır. Taşınırken bir elle mikroskop kolu

tutulurken diğer elle de mikroskop ayağının altından sıkıca tutulmalıdır.

Kesinlikle mercek sistemlerinden, vs. tutulmamalıdır.

2. Mikroskobunuzu masaya koyduğunuzda aydınlatma tertibatında bulunan

kabloların mikroskobun ayağının altında kalıp ezilmemesine dikkat ediniz.

3. Mikroskop ile çalışırken, o anda size gerekli olan araç ve gereç dışında hiçbir

şeyi mikroskop yakınında bulundurmayınız.

4. Mikroskopta çalışma daima en az büyüten objektifle başlar. Onun için en az

büyüten objektif preparat üzerine getirilir. Sonra makro vida saat yönü

istikametinde döndürülerek tabla aşağıya indirilir ve objektifin ucu lamele 3-5

mm kadar yaklaştırılır. Okülerden bakılırken tüp yani objektif yalnız yukarı

doğru hareket ettirilir, kesinlikle aşağı indirilmez. Çünkü preparat veya

objektifin ön merceği kırılabilir veya hasara uğrayabilir. Makro ve mikro

vidalar bir elle döndürülürken, diğer el de görüntünün x-y ekseninde hareketini

sağlayan şaryo üzerinde olmalıdır.

5. Mikroskopların merceklerine elle dokunulmamalıdır. Mercekleri kağıt

mendil ile temizleyiniz, merceğin herhangi bir zarar görmemesine her zaman

dikkat ediniz.

6. Mikroskobun herhangi bir parçası diğer bir mikroskobun parçasıyla

değiştirilmemelidir.

7. Çalışmalarınızın bitiminde, kullandığınız mikroskobu daima temizleyiniz ve

en küçük objektifi kullanım konumuna getiriniz. Mikroskobunuzu mutlaka kapalı

konumda bırakınız.

52

D) DENEYİN YAPILIŞI

1. Üzerinde ‘e’ harfi bulunan kağıtları alınız. Bunu temiz bir lam üzerine

yerleştiriniz. Preparatınızı yerleştiriniz daha sonra mikroskop kullanımı

bölümünde ilgili aşamalarda anlatılan kuralları uygulayınız. En sonunda 4, 10 ve

40 kat büyütmeli objektif ile elde ettiğiniz görüntüyü çiziniz.

2. İki farklı renkte birer parça dikiş ipliği alarak bunları bir lam üzerinde X

işareti yapacak şekilde birbiri üzerine koyunuz. Preparatınızı bu şekilde

hazırladıktan sonra mikroskop kullanımı bölümünde ilgili aşamalarda anlatılan

kuralları uygulayınız. En sonunda 4, 10 ve 40 kat büyütmeli objektifte

preparatınızı incelerken, mikrovida ile yavaş yavaş oynayınız ve gördüklerinizi

çiziniz.

3. Bitki hücresine örnek olarak soğan (Allium cepa) epidermis hücresini

inceleyeceksiniz. Bunun için size verilen soğan bitkisinin toprak altı gövdesinin

etli yapraklarının dış kısmından bir parça zar alarak lamın üzerine yerleştiriniz.

Sonra lamınıza bir damla distile su damlatıp, lamelinizi hava kabarcığı

kalmayacak şekilde kapatınız. Preparatınızı diyafram kapalı şekilde inceledikten

sonra, metilen mavisi ile boyayarak tekrar inceleyiniz ve hücrelerin şeklini çiziniz.

4. Hayvan hücrelerine örnek olarak yassı dil epitelini inceleyeceksiniz. Dilin

üzeri çok tabakalı yassı epitel hücreleri ile kaplıdır. Dilin epitel hücrelerini elde

etmek için tahta çubuğu dilinizin üzerine arkadan öne doğru hafifçe sürünüz. Bu

şekilde dil epitelinden alınan hücreler, bir miktar tükrük ile tahta çubuğun

kenarında toplanır. Bundan sonra tahta çubuğun ıslak tarafını lam üzerine

sürünüz ve üzerini lamel ile kapatınız. Hücreler saydam olduğundan, diyaframı

kapatarak inceleyiniz. Epitel hücrelerini, hücrelerin çekirdeklerini ve

sitoplazmasını görmeye çalışınız. Hazırladığınız bu preparatı boyasız

inceledikten sonra metilen mavisi ile boyayarak tekrar mikroskopta inceleyiniz.

Gördüklerinizi çiziniz.

Boyama işlemi: Boya bir taraftan lam ve lamel arasına pastör pipeti ile

damlatılırken, diğer taraftan kurutma kağıdı ile çekilerek boyama gerçekleştirilir.

5. Örnek Olarak İnsan Kan Dokusunun İncelenmesi

İnsan kanı ile hazırlanmış ve Hematoksilen-Eozin ile boyanmış yayma

preparatları mikroskopta inceleyiniz.

53

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

54

PRATİK 7:

GEN KLONLAMA VE BAKTERİYE TRANSFORMASYON

Bir genin klonlanması veya çoğaltılması amacıyla, bir bakteriye aktarılması oldukça

yaygın olarak kullanılan bir işlemdir ve transformasyon olarak adlandırılır. Bu DNA

materyalini (geni) kabul etme yeteneğine sahip hücrelere de kompetan hücreler denir.

Bir çok bakteri türünde transformasyon işlemi doğal yollarla gerçekleşiyor olsa da, bilim

insanları bakteri hücrelerinin bu kompetan özelliklerini yapay olarak indükleyecek

çeşitli yollar geliştirmişlerdir.

Şekil 1. Transformasyonun( bakteri hücresine) şematik gösterimi

ISI İLE ŞOKLAMA METODU

Bakteriye transformasyon işlemi için kullanılan en yaygın yöntem ısı ile şoklama

metodudur. Temel prensip olarak, ani sıcaklık değişimi ile bakterinin plazma

membranında oluşturulacak porlar yardımıyla aktarılacak DNA’nın hücre içerisine

alınması hedeflenmektedir. Bu metodun haricinde, sıcaklık değişimi yerine elektrik

akımı kullanılarak gen aktarımının yapılabildiği elektroporasyon işlemiyle de

transformasyon işlemi gerçekleştirilebilir.

55

Isı ile Şoklama Metoduyla Transformasyon İşleminin Temel Prensipleri

Bakteriye transformasyon işlemlerinde en sık ve yaygın olarak kullanılan DNA plasmid

DNA’dır. Plasmidler, küçük, halkasal, çift-zincirli DNA yapısında olup, super-sarmal

oluşturarak boyutlarını küçültebilme yeteneğine sahiptir. Bu özellikleri yardımıyla

kolaylıkla hücre membranındaki porlardan geçebilirler.

Bir plazmidde önemli olan birkaç özellik vardır. Ticari olarak satılan plasmidler, çoklu

klonlama bölgeleri (multiple cloning sites-MCS) içerirler. Bu klonlama bölgeleri,

DNA’yı kesen restriksiyon endonükleazlar (restriksiyon enzimleri) tarafından

tanınan spesifik sekanslar içerir. Araştırmacının ilgilendiği DNA fragmentleri (genler),

bu spesifik sekansların yardımıyla çoklu klonlama bölgelerine aktarılabilirler.

Şekil 2. Plazmidlerin şematik gösterimi

Bunun için DNA fragmentinin ve plasmidin aynı endonükleazlar ile kesilmesi

gerekmektedir. Transformasyon işlemine başlamadan önce ilgilenilen gen bölgesi

plazmid vektörüne klonlanabileceği gibi, firmalar tarafından geliştirilen plazmidlere

hazır olarak klonlanmış genler ticari olarak tedarik edilerek de kullanılabilir.

Plasmidler ayrıca, hücrelere plasmiddeki replikasyonun nereden başlaması gerektiğine

dair bilgi veren, Replikasyon Orijini (ORI) içerirler. Replikasyon orijini ve Çoklu

Klonlama (Kesim) Bölgeleri’ne ek olarak, birçok plasmid, antibiyotik dirençlilik geni de

içerir. Bu gen sayesinde, bu plasmide sahip olan tüm hücreler o antibiyotiğe dirençli hale

gelir, böylece bu hücreler antibiyotik içeren besiyerinde selektif olarak yaşayabilirler.

56

Kompetan Hücreler, plasmidlerin aktarılacağı hücrelerdir. Moleküler biyoloji

araştırmalarında ve transformasyonda en yaygın kullanılan bakteri türü E. coli’dir. Bu

bakteriler bağırsaklarda da doğal olarak bulunur. Hücreler genel olarak kalsiyumca

zengin bir ortama maruz bırakılarak kompetan hale getirilirler. Kalsiyum iyonlarındaki

pozitif yükler, hem plasmidin hem de bakteri hücre duvarının negatif yüklerini nötralize

ederler ve elektrostatik çekim kuvvetini dağıtarak hücre duvarını zayıflatırlar. Hücreler

ani bir sıcaklık artışına, ısı şokuna maruz bırakılarak, hücrenin içi ve dışı arasında bir

basınç farkı yaratılır, böylece süper-sarmal DNA’nın geçebilmesi için porların oluşması

sağlanır. Sonrasında sıçaklığın düşürülmesiyle hücre duvarı eski haline döner. Plazmidi

alan hüceler, plasmid üzerinde hangi antibiyotik dirençlilik geni taşınıyorsa ancak o

antibiyotiği içeren agar petriler üzerinde üreyebilirler.

Kompetan Hücre Hazırlanması

Kompetan hücre yapımından önce transformasyonda kullanılan bakteriler dondurucuda

saklanır.

Hücreler buz üzerinde çözdürülür.

Antibiyotiksiz agarlı petriye yayılır ve bir gece 37 0C’de üremeye bırakılır.

Aseptik teknik kullanılarak, agar petride gelişen kolonilerden biri seçilir ve 500

ml’lik kültürde gece boyu 37 0C, çalkalamalı inkübatörde çoğalmaya bırakılır.

Çalkalamalı inkübatör, hem bakterinin dibe çökmesini engellemek hem de

besiyerindeki yararlı maddelerin besiyeri içinde yayılmasını sağlamak amacıyla

gereklidir.

Hücreler çoğalırken, 0.1 M Kalsiyum Klorür ve %15 gliserol içeren 0.1 M

Kalsiyum Klorür solüsyonları hazırlanır, otoklavlanır ve soğutulur.

Bakterilerin, büyüme eğrisinin log fazının ortalarında olup olmadıklarını

belirlemek amacıyla absorbans ölçümleri yapılır.

Bakterilerin DNA’yı almaya hazır oldukları zaman büyüme eğrisinde log fazının

ortalarına denk gelen süredir.

Bu faza ulaşan hücreler, buz üzerine alınır ve işlem süresince buz üzerinde

tutulur.

Bakteri hücreleri 2 ayrı santrifüj tüpüne bölünür ve +4 C’de hızlıca döndürülür.

Süpernatant uzaklaştırılır ve pellet yaklaşık olarak 100 ml 0.1 M soğuk kalsiyum

klorürde resüspanse edilir. Hücreler 30 dakika buz üzerinde inkübe edilir. Bu

57

basamak en az bir kez daha tekrar edilir. Bu santrifüj ve resüspansiyon işlemleri

genellikle hücrelerin yıkanması olarak da tanımlanır.

Son yıkamadan sonra, hücreler 50 ml soğuk, %15 gliserol içeren 0.1 M kalsiyum

klorür solüsyonunda karıştırılır.

Elde edilen bu hücreler kimyasal olarak kompetan hale getirilmiş hücrelerdir.

50’şer µl olarak tüplere dağıtılır ve -80 0C’de saklanır.

Isı Şoku Reaksiyonu

Isı şoku ile transformasyona başlamadan önce, çalışma alanı temizlenir ve kullanılacak

bütün malzemeler sterilize edilir. Kompetan bakterinin üremesi için gerekli besinleri

içeren, yeterli miktarda sıvı ve agarlı besiyerleri hazırlanmalıdır. Bu maksatla tüm

solüsyonlar otoklavlanarak sterilize edilir. Kullanılmadan önce sıvı besiyerinin oda

sıcaklığına kadar soğuması beklenir. Agarlı besiyeri otoklavlandıktan sonra henüz sıvı

haldeyken 50-55 0C sıcaklığa kadar soğuması beklenir, bu sıcaklığa ulaştıktan sonra

gerekli antibiyotik besiyerine eklendikten sonra petrilere dökülüp katılaşması için oda

sıcaklığında soğumaya bırakılır. Bakteri ile çalışırken, steriliteyi korumak için her zaman

aseptik koşullar sağlanmalıdır. Aseptik teknikte genel olarak, malzemelerin

sterilizasyonu için ve bir konveksiyon akımı yaratarak hava kaynaklı kontaminantların

çalışma alanından uzak tutulması için Bunzen beki kullanılır.

Isı şoku reaksiyonuna başlamadan hemen önce;

sıvı besiyeri oda sıcaklığına getirilir,

antibiyotik içeren LB agar petrileri 37 0C’ye ısıtılır,

su banyosu 42 0C ‘ye ayarlanır,

kompetan hücreler buz üzerinde çözdürülür.

1ng/µl plasmid konsantrasyonunda, 1-5 µl plasmid soğuk olarak bakteri

hücrelerine eklenir, hafifçe karıştırılır, ve plasmid-hücre karışımı buz üzerinde 30

dakika bekletilir.

Süre sonunda, plasmid-hücre karışımı 42 0C de su banyosunda 30 saniye süreyle

ısı şokuna maruz bırakılır.

30 saniye sonunda tüp hemen buz üzerine alınır ve 450 µl sıvı besiyeri tüpe

eklenir.

Tüpler 37 0C’de çalkalamalı inkübatörde, 225 rpm hızda 1 saat inkübe edilir.

58

Uygun aseptik teknikler kullanılarak, 20-200 µl aralığında farklı hacimlerde

bakteri agar petrilere eklenir ve bakteriler agar üzerine yayılır.

Petriler, bakterilerin kondensasyondan korunması amacıyla ters çevrilerek 37

0C’de gece boyu inkübasyona bırakılır,

Ertesi gün, plazmidi almış olan bakteriler koloni oluşturur.

Oluşan koloniler, transformasyon etkinliğinin hesaplanması amacıyla sayılır.

Transformasyon etkinliği başarılı transformant sayısının, petriye yayılmış toplam

DNA miktarına bölünmesi ile hesaplanır.

Transformasyon etkinliği = Başarılı transformant sayısı / g DNA

Bu etkinlik cfu (colony forming unit), koloni oluşturan ünite olarak tanımlanır.

DNA miktarının birimi özellikle belirtilmelidir. Bazı durumlarda,

transformasyon etkinliği yayılan transformant hacmi başına (cfu/ml) veya petri

başına (cfu/petri) olarak da tanımlanabilir.

Daha sonra koloniler, ileri deneylerde kullanılmak amacıyla toplanır.

Alternatif bir yöntem olarak Elektroporasyon

Laboratuvar koşullarında yapay yollarla, yüksek voltajlı elektrik şoku uygulayarak

bakterilerin hücre membranlarında, plasmid DNA’ların geçebileceği porların

oluşturulması işlemine elektroporasyon denir.

Şekil 3. Elektroporasyon ile por oluşumu

Elektroporasyon işleminde elektroporatör adı verilen özel bir cihaz kullanılır. Bu

yöntem, ısı ile şoklama metoduna göre daha özel hazırlıklar gerektiren, daha pahalı ve

daha hassas bir yöntem olması dolayısıyla daha az tercih edilmektedir. Elektroporasyona

alternatif olan ısı şoku ile transformasyon tekniği genel olarak bakterilerin daha az

etkilendiği ve düşük tuz konsantrasyonuna ihtiyaç duyulmayan bir tekniktir. Ayrıca ısı

59

şoku ile transformasyon tekniği elektroporasyon işlemine göre çok daha ucuz bir

tekniktir. Bununla beraber, ısı şoku ile transformasyon tekniğinde transformasyon

etkinliği elektroporasyon işlemine oranla daha düşüktür ve daha uzun süren bir tekniktir.

Şekil 4. Elektroporatör

Ayrıca ısı şoku ile transformasyon tekniği sadece bakteriler, mayalar ve protoplastlara

uygulanabilirken elektroporasyon işlemi memeli hücrelerine de uygulanabilmektedir.

Bakteri Elektroporasyon İşlemi

Elektroporasyona hazırlanan E.coli hücreleri elektrokompetan hücreler olarak da

adlandırılır. Elektroporasyona başlamadan hemen önce, sıvı besiyeri oda sıcaklığına,

agar petriler 37˚C’ye getirilir.

Elektroporasyonda kullanılacak küvetler ise buz üzerinde soğutulur.

Elektrokompetan hücreler buz üzerinde çözdürülür.

1-5 μl, 1ng/μl konsantrasyonda plasmid bakterilere eklenir. Hafifçe karıştırılır ve

karışım soğuk küvete alınır. Köpük oluşturulmamasına dikkat edilir.

Elektroporatörün ayarları hücreler için uygun hale getirilir ve voltaj ayarlanır.

Küvetin dışı silinerek kurutulur ve elektroporatöre yerleştirilir.

Bir bip sesi duyulana kadar hücreler elektrik şokuna maruz bırakılır.

Başarısız bir şoklama elektriksel yük boşalmasına sebep olur ve böyle bir durum

gerçekleşirse gözle görülür bir kıvılcım ve küçük bir patlama sesi duyulur. Bu

yük boşalması, arklama olarak tanımlanır ve kompetan hücrelerde veya DNA’da

çok fazla tuz konsantrasyonu olmasından dolayı oluşabilir.

Transformasyonun başarısı, elektrik şokunun uygulanması ile voltajın geçişi

arasında geçen zaman sabiti not edilerek tahminlenebilir. Eğer reaksiyonda tuz

60

varsa ve elektroporasyon solüsyonu fazla iletkense, bu gecikme anında

gerçekleşir, yük boşalmasına neden olur ve hücrelerin çoğunun ölümü ile

sonuçlanır. Bakteriler için en iyi zaman sabiti 5-10 milisaniye arasındadır.

Şoklamanın hemen ardından, küvet cihazdan alınır ve 1 ml besiyeri direkt olarak

hücrelere eklenir.

Karışım bir tüpe yerleştirilir ve 37°C’de 1 saat boyunca, çalkalamalı inkübatörde

inkübe edilir.

Daha sonra aseptik teknik kullanılarak 20-200 μl aralığında farklı hacimlerde

hücre, antibiyotik içeren agarlı petrilere yayılır.

Petriler ters çevrilerek 37 °C’de gece boyu inkübe edilir.

Plazmid ile transforme olmuş olan bakteriler koloni oluşturur.

Oluşan koloniler sayılır ve transformasyon etkinliği hesaplanır.

İLGİLENİLEN GENİ İÇEREN PLAZMİDLERİ ALAN BAKTERİLERİN

SEÇİMİ İÇİN UYGULANILAN YÖNTEMLER

Antibiyotik Direnci

Aktarılmak istenilen plazmidin bakteriye başarılı olarak transforme edilip edilmediğinin

anlaşılması için, plazmidler üzerindeki antibiyotik dirençlilik genlerinden faydalanılır.

Kompetan hücre olarak kullanılan bakteri suşlarının herhangi bir antibiyotiğe karşı

dirençli olmaması gerekmektedir. İlgilenilen geni içeren plazmid üzerinde yer alan

antibiyotik dirençlilik geni, plazmidi alan bakterilerde bu antibiyotiğe karşı direnç

gelişmesine neden olacağından, başarılı transformantlar antibiyotik içeren selektif

besiyerinde çoğalabilirken, plazmidin aktarılamadığı hücreler agar üzerinde

gelişemeyecektir. Dolayısıyla agar üzerinde gelişen kolonilerden seçilen bakteriler ilgili

geni taşıyan plazmide sahip kolonilerdir. Bununla birlikte, bir plazmide laboratuvar

koşullarında çoklu kesim bölgelerinden faydalanılarak bir gen bölgesi yerleştirme

çalışması yapılıyorsa, her plazmide ilgili gen yerleştirilemeyebilir. Dolayısıyla

transformasyonda kullanılacak plazmid karışımı, ilgilenilen geni ve antibiyotik

dirençlilik genini taşıyan plazmidlerle birlikte sadece antibiyotiğe dirençlilik genini

içeren plazmidleri de içerecektir. Bu nedenle, antibiyotikli ortamda gelişen koloniler

sadece plazmidin başarılı bir şekilde bakteriye aktarıldığının göstergesidir. Asıl amaç,

ilgili geni içeren plazmidin aktarıldığı bakteri kolonisinin seçimini sağlamaktır. Bu

doğrultuda geliştirilen yaygın kullanılan yöntemlerden birisi Mavi Beyaz Tarama

61

yöntemidir.

Mavi Beyaz Tarama Yöntemi

Bu yöntemde kullanılacak plazmidler üzerindeki çoklu klonlama bölgesininin içerisine

beta galaktozidaz geni (LacZ) eklenmiştir. Bu gen, bakterilere laktozu parçalama

yeteneği kazandırmaktadır.

X-gal, renksiz, kromojen bir maddedir ve bir laktoz analoğudur. X-gal, -galaktozidaz

geni sentezlendiği zaman oluşan enzim ile parçalanır ve mavi renk oluşumu gözlenir.

Bu plazmidler kullanılarak yapılan gen klonlama ve transformasyon işlemleri

sonrasında, antibiyotik içeren besiyerine ekilen bakterilerde mavi ve beyaz koloniler

oluşur. Transformasyonun başarısız olduğu bakteriler antibiyotiğe karşı direnç

kazanamadığından agar üzerinde gelişemezler. Genin aktarılamadığı plazmidi alan

bakteriler ise agarda koloni oluşturacaklardır. Ancak bu bakterilerde, çoklu klonlama

bölgesinde bulunan beta galaktozidaz geninin bütünlüğü bozulmadığından, bu bakteriler

ortamda bulunan Xgal’ı parçalayarak mavi renk oluşumuna neden olur. Fakat ilgilenilen

genin çoklu klonlama bölgesine başarıyla yerleştirildiği plazmidlerde bu bölgedeki beta

galaktozidaz geninin bütünlüğü bozulduğundan bu plazmidleri taşıyan bakteriler laktozu

parçalama yeteneğinden yoksun kalır. Böylece herhangi bir renk oluşumu gözlenmez ve

koloniler beyaz görünür. İşlemler sonucunda agar üzerinde gelişen beyaz bakteri

kolonileri seçilerek istenilen geni taşıyan plazmidi alan bakteri kolonileri belirlenmiş

olur.

Şekil 5. Mavi-Beyaz Tarama Yöntemi

62

Uygulamalar

Çoğu transformasyon deneyinde, esas amaç, hedef geni taşıyan plazmidi alan bakterinin

bir an önce bölünerek yüksek hacimlerde ve miktarlarda plazmid üretmesini sağlamaktır.

Bakteriyel transformasyondan sonraki hedef, antibiyotik içeren besiyerinde yüksek

miktarda bakterinin üretilmesi ve plasmid saflaştırma işlemlerinin yapılmasıdır. Bu

işlem bakteriden plazmidin saf bir halde elde edilmesi için gereklidir. Bu amaçla

kullanılan çok çeşitli ticari kitler mevcuttur. Bazı durumlarda transformasyonun amacı

plasmid ile aktarılan genin kodladığı bir proteinin bakteri tarafından yüksek miktarda

üretilmesini sağlamak da olabilir. Yüksek miktarlarda elde edilen bu protein

saflaştırıldıktan sonra, kristalize edilerek ilgilenilen hedef proteinin yapısı tanımlanabilir.

Sonuç ve Özet

Transformasyon, bir hücrenin çevrede bulunan bir yabancı DNA’yı hücre içerisine

alması işlemidir. Doğada bulunan bazı özel bakteri tipleri transformasyonu

kendiliğinden gerçekleştirebilir. Moleküler biyolojik çalışmalarda, transformasyon

işlemi laboratuvar koşullarında yapay olarak, bakteriyel hücrelerin membranlarında

porlar yaratılması ile de gerçekleştirilebilir. Dış ortamdan yabancı DNA’yı hücre

içerisine alma yeteneğine sahip bakteri hücreleri kompetan hücreler olarak adlandırılır.

Isı şoku ile transformasyonda, kalsiyum klorür sayesinde kalsiyum açısından zengin bir

çevre oluşması sağlanır ve bu durum plasmid DNA ile bakteriyal hücre membranı

arasında var olan elektrostatik itme gücünü ortadan kaldırır. Sıcaklıkta gerçekleşen ani

bir artış ile bakterinin plazma membranında porlar oluşur ve plasmid DNA bakteri

hücresine girer. Farklı bir kompetan hücre tipi olan elektrokompetan hücreler de

laboratuvar şartlarında oluşturulabilir. Bu hücrelere elektrik akımı uygulanarak yapılan

elektroporasyon işlemi ile de bakteri hücrelerinin membranlarında DNA’nın

geçebileceği porlar yaratılarak transformasyon gerçekleştirilebilir.

Notlar the Journal of Visualized Experiments (JoVE) dergisindeki teknik bilgilere göre

hazırlanmıştır. Kullanılan şekillerin kaynakları:

Şekil1. http://slideplayer.com/slide/9050687/27/images/44/Transforming+Plants+44.jpg(değistirilerek)

Şekil2. https://ka-perseus-images.s3.amazonaws.com/6ce673289a1608e8f6b63ed115bca6395536e508.png

(değiştirilerek)

Şekil3. http://www.bioelectrochemical-soc.org/img/electroporation-1.jpg (değiştirilerek)

Şekil4.http://www.biorad.com/webroot/web/images/lsr/products/gene_transfer_rnai/product_detail/global/

gene-pulser-mxcell-electroporation-system-detail.jpg

63

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

64

PRATİK 8:

MİTOZ BÖLÜNME

A) DENEYİN AMACI

Her canlının büyüme ve gelişmesi, hücrelerinin büyüme ve çoğalmasına bağlıdır.

Bu da çekirdeğin kendi benzerini meydana getirmesi ve sitoplazma bölünmesi

ile olur. Bu deneydeki amaç, çimlendirilmiş soğan kökünde ezme (squash) metodu

ile mitoz bölünmenin çeşitli evrelerini gözlemektir.

B) GEREKLİ MALZEMELER

1- Lam ve lamel

2- Asetokarmen

3-1adet çimlendirilmiş soğan

C) GENEL BİLGİLER

Mitoz, bir hücrenin kendisi ile aynı özellikleri taşıyan iki ayrı yavru hücreye

bölünmesidir. Hücre çekirdeği içerisinde bulunan genetik materyal çekirdek

zarının kaybolması ile birlikte kondense olup kromozom şeklini alır. Bu sırada

hücre zarının çeşitli yöntemlerle (hipotonik ortama koyma, ezme gibi) ortadan

kaldırılması kromozomların incelenebilmesine olanak sağlar. Bitki ve hayvanlarda

büyüme, gelişme, onarım gibi olayların hepsi hücrelerin mitoz bölünmesi ile

olmaktadır. Mitoz bölünme, hayvan ve bitki hücrelerinde evreleri ve temel

ilkeleri yönünden benzerlik gösterir. Mitoz bölünme, birbirini takip eden dört

ayrı ana aşamada incelenebilir.

Profaz: Erken profazda, her kromozom nükleer zar üzerinde özgül bir bölgeye

tutunur ve devam eden DNA sentezinin sonucu, çiftli bir yapı (kardeş kromatidler)

şeklinde görülür. Geç profazda, kromozomlar daha kalın ve kısa olacak şekilde

kalınlaşır (kromatin kondensasyonu) ve nükleer zar kaybolur (Şekil 1).

Şekil 1. Profaz

65

Metafaz: Mitotik iğ ince iplikler şeklinde görülür. Kromozomlar sentromerleri ile

iğ ipliklerine tutunmuş biçiminde ekvator düzleminde dizilirler (Şekil 2).

Şekil 2. Metafaz

Anafaz: Erken anafazda kromozomlar ortadan boyuna ikiye ayrılır ve her

kromozomun iki kromatidi zıt kutuplara göç eder (Şekil 3).

Şekil 3. Anafaz

Telofaz: Her kromozomun iki kromatidinin zıt kutuplara göç etmesi ve bir nükleer

zarın oluşmasıyla telofaz evresi başlar. En sonunda sitoplazma bölünür (sitokinez)

(Şekil 4).

Şekil 4. Telofaz

Bitki hücrelerinde ekvatoryal bölgede hücre plağı oluşur ve geç telofaz evresinde hücre

buradan bölünerek, yeni hücre zarı meydana gelir. Hayvan hücrelerinde ise ekvatoryal

bölgede önce dıştan içe doğru bir boğumlanma görülür. Daha sonra hücre, bu

boğumdan ikiye ayrılır.

66

İki mitoz bölünme arasındaki evrede metabolik ve sentezleme faaliyetleri devam eder.

Bu evre ‘metabolik evre’ veya ‘ interfaz evresi’ adını alır (Şekil 5). İnterfaz 3 evreden

oluşur;

G1 evresi: Metabolik açıdan hücrenin aktif olduğu bu evrede hücre gelişimi

devam eder. DNA sentezi için gerekli hazırlıkların ve senteze geçmeden önceki

kontrollerin yapıldığı evredir.

S evresi: DNA'nın kendini eşlediği evredir.

G2 evresi: DNA replikasyonu sonrası evresidir. Hücrenin mitoz için

gereken hazırlıkları ve kontrolleri bu evrede gerçekleştirilir.

Şekil 5. İnterfaz

İnterfazın ardından gerçekleşen çekirdek bölünmesi (karyokinez) ve sitoplazma

bölünmesi (sitokinez) aşamaları mitozu oluşturmaktadır. İnterfaz ve mitozdan oluşan

hücre döngüsü aşamaları Şekil 6’da görülmektedir.

Şekil 6. Hücre Döngüsü Aşamaları

Mitoz

67

Mitotik hücreler mikroskobik yöntemler kullanılarak ayırt edilebilir. Hücrenin

interfazın hangi evresinde (G1, S, G2) olduğu ise ancak biyokimyasal içeriğin

analizleri ile saptanabilir.

Bazı özel teknikleri kullanmaksızın kromozomların gözlenmesi genellikle mümkün

olmamaktadır. Kullanılabilecek en hızlı yöntem spontan olarak bölünen hücrelere

sahip dokulardan elde edilecek materyalin, yapısını koruyacak şekilde

sabitlenmesinden sonra kromozomların gözlenmesine olanak verecek bir boya ile

boyanmasıdır. Bu işlemden sonra, ezme yöntemi ile zarı parçalanan hücrelerde

kromozomlar incelenebilir. Bunun dışında, uygun bir mitojenik uyaranla bölünmeleri

indüklenen hücrelerde mitoz bölünme, özel bazı kimyasallarla metafaz aşamasında

durdurulabilir. Bunu takiben uygulanan bazı yöntemler sonucunda kromozomlar

incelenebilir hale getirilebilmektedir. Ancak bunun izlenmesi için en azından hücrenin

döngüsü kadar bir sürenin geçmesi gerekmektedir.

Bu laboratuvar çalışmasında, diploid bir bitki olan soğanın (Allium cepa) spontan

hücre bölünmesi yüksek olan kök ucu (meristem) dokusunda mitozun çeşitli

evrelerinin görülmesi planlanmıştır.

D) DENEYİN YAPILIŞI

1. Mitoz bölünmenin evrelerini görebilmek için, 4-5 gün suda bırakılarak

çimlendirilmiş soğan köklerinin ucundan 5-6 mm’lik parçalar kesilir.

2. Kesilen soğan kökleri bir deney tüpü içerisine koyulur ve kök uçlarının

üzerini örtecek kadar asetokarmen boyası ilave edilir. Deney tüpü bir tahta maşa

ile tutularak 2-3 dakika kadar kaynatmadan, hafif alevde ısıtılır.

3. Isıtılan kök uçları soğuduktan sonra, bir tanesi pens ile temiz bir lam üzerine

alınır. 1 veya 2 damla daha asetokarmen damlatılarak lamel ile kapatılır.

4. Preparat iki parmak arasında sıkılarak, kökün parçalanıp hücrelerin

birbirinden ayrılması sağlanır. Lamelin kenarından taşan boya kurutma kağıdı ile

alınır.

5. Preparat önce küçük büyütme (10X objektif) ile incelenir. Bölünme aşamaları

görüldüğü zaman büyük büyütmeye (40X objektif) geçilir.

68

Asetokarmen boyasının hazırlanışı:

45 ml Asetik asit, 55 ml saf su ve 3 gr toz karmen karıştırılır.

Asetokarmen boyası; karmen Dactylopius coccus böceğinde mevcut olan kırmızı bir

pigment olan cochinela’dan elde edilen doğal bir boyadır. Bu boya hücre çekirdeklerinin

boyanmasında kullanılır. Asetokarmen dibazik özelliği olan asidik bir boyadır. Asidik

pH’ta çözüldüğünde pozitif yük kazanır ve bazik özellik göstererek kromozomları boyar.

Karışımdaki asetik asit hücre fiksasyonu yaparken kromozom boylarının uzun kalmasını

ve daha kolay incelenmesini sağlar.

Mitoz bölünmenin süresi hücre çeşidine ve çevre koşullarına bağlıdır. Ayrıca her

hücrenin kendine özgü bir bölünme döngüsü vardır. Dolayısıyla komşu hücrelerin bile

birbirlerinden farklı evrelerde olduğu görülebilir. Diğer taraftan hücre döngüsünün

1/20 kadar süresi mitozun aktif bölünmesine, 19/20 kadar süresi ise interfaz süresine

aittir. O halde preparatınızda meristematik dokuların bulunduğu bölgede ancak her 20

hücreden biri mitoz bölünme geçirmektedir. Bunlardan evrelerin süresine uygun olarak

sırası ile en çok profaz, daha az telofaz, en az da metafaz ve anafaz evresindeki

hücrelerin görülmesi beklenir.

Mikroskopta gözlemiş olduğunuz mitozun farklı evrelerinin şekillerini gerekli bilgileri

kullanarak çiziniz ve ayrıca gözlemlerinizi not ediniz. Hazırladığınız preparat

incelenmeye uygun değilse yeni bir preparat hazırlayınız.

69

Gözlemlerinizi çizmek için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

70

PRATİK 9:

HİKAYE ALIMI, PEDİGRİ VE KROMOZOM ELDESİ-I

A) DENEYİN AMACI:

Bu pratikte öğrenilmesi amaçlanan başlıklar şu şekildedir:

Kromozom analizi yapılacak bir olgudan anamnez alınması,

Pedigri çizimi,

Periferik kandan, kısa süreli (72 saat) kültürasyon ile metafaz kromozomlarının

elde edilmesi.

ANAMNEZ (SOY VE ÖZGEÇMİŞ BİLGİSİ) ALINMASI

Çeşitli endikasyonlar (Spontan düşüklerin, mental retardasyonun ve çoklu konjenital

anomalilerin yanı sıra Turner sendromu, Klinefelter sendromu gibi sayısal cinsiyet

kromozom anomalileri ile ilişkili sendromlar veya Down sendromu, Edwards sendromu

gibi sayısal otozomal kromozom anomalileri ile ilişkili sendromlar) ile sitogenetik analiz

için gönderilen hastalardan, daha önce hazırlanmış uygun anamnez formları kullanılarak

hastaya dair bilgiler alınır. Endikasyonlara özgül anamnez formları pratik saatinde

tartışılacaktır.

PEDİGRİ (SOY AĞACI) ÇİZİMİ

Hastalardan anamnez alımı sırasında, aile öyküsü bulunan olguların pedigrisi çıkarılır.

Bu pedigri sayesinde, ailede görülen herhangi bir hastalığın kalıtsal ya da çevresel olup

olmadığını ve eğer hastalık kalıtsal ise, kalıtım şeklini belirlemek mümkündür.

Pedigri çizimine, ailede hastalığın ilk gözlendiği kişiden başlanır ve bu kişiye “indeks

olgu” veya “proband” denir. Aile ağacı çiziminde, erkekler kare ( ) ve kadınlar

çember ( ) şeklindeki simgelerle gösterilir. İlk kuşaktaki erkek sola, kadın sağa çizilir,

evlilikler kadın ve erkek arasına yatay bir çizgi ( ) çekilerek belirtilir. Eğer

akraba evliliği varsa bu durum, yatay iki çizgi ( ) ile gösterilir. Kardeşler

doğum sırasına göre, cinsiyetleri de belirtilerek soldan sağa doğru çizilir. Pedigri

çiziminde kullanılan simgeler Şekil 1.’de gösterilmiştir. İndeks olgu (proband) ve aynı

zamanda genetik danışmanlık verilen kişi pedigride bir ok ile gösterilir. Pedigrideki

71

Bilinmeyen cinsiyet

Hasta birey

Taşıyıcı birey

Evlilik

Akraba evliliği

Monozigotik/Dizigotik ?

/ indeks olgu)

(infertilite)

Birden fazla evlilik

kuşaklar, romen rakamlarıyla (I, II, III, IV gibi) ve kuşak içerisindeki bireyler de, her

kuşakta yeniden başlayacak şekilde, soldan sağa doğru rakamlarla (1, 2, 3 gibi) gösterilir

(Şekil 1).

Şekil 1. Pedigri çiziminde kullanılan simgeler (Tıbbi Biyoloji ve Genetik A.B.D.

tarafından modifiye edilmiştir.)

KROMOZOM ELDESİ-I

Sitogenetik; kromozomların morfolojilerini, işlevlerini ve fenotiple olan ilişkilerini

inceleyen genetik biliminin bir alt dalıdır. Sitogenetik analiz için kromozom eldesinde;

periferik kan, kemik iliği, amniyon sıvısı, koryonik villüs materyali, kord kanı, deri ve

benzeri solid doku örnekleri kullanılabilmektedir. Kromozomların elde edilmesinde,

uzun süreli (amniyon sıvısı, koryonik villüs materyali ve deri) ve kısa süreli (periferik

kan, kord kanı ve kemik iliği materyali) hücre kültürü yöntemleri uygulanmaktadır.

72

Laboratuvar çalışmamızda, periferik kandan kısa süreli hücre kültürü yöntemi ile

kromozom eldesi gerçekleştirilecektir. Periferik kandan kromozom eldesinde,

lenfositlerden özellikle T-lenfositlerin in vitro ortamda üretilmesi sağlanmaktadır.

1. Kan alınması ve saklanması: Periferik kandan kısa süreli lenfosit kültüründe,

heparinize (kanın pıhtılaşmasını engeller) edilmiş steril enjektörlere alınan 0.5-2 ml.

venöz kan kullanılır. Alınan kanlar ekim saatine kadar 370C’de, aynı gün ekim

yapılmayacak ise +40C’de saklanabilir.

2. Besiyeri hazırlanması ve ekim: Hastanın klinik ön tanısına göre farklı örnekler,

farklı besiyerleri içerisinde üretilirler.

a) Lenfosit Kültürü İçin Kullanılan Besi Ortamının İçeriği:

Ticari olarak satılan steril 100 ml’lik besi ortamına (RPMI 1640, MEM, Ham’s F10, Mc

Coy’s A, Med 199) – günümüzde kullanılan besiyeri RPMI 1640’dır - steril koşullar

altında aşağıdaki maddelerden belirtilen oranlarda eklenir:

20 ml. Fötal dana serumu*

1 ml. L-Glutamin**

0.1 ml. Penisilin-Streptomisin karışımı ***

* Kültür ortamını zenginleştirmek ve kültürden kromozom elde etme başarı oranını

arttırmak amacıyla fötal dana serumu besiyerine eklenmektedir. Hücre büyüme

faktörleri, adhezyon faktörleri, eser elementler, hormonlar, bağlanma proteinleri ve

vitaminleri içeren pek çok serum içerikleri bulunmaktadır.

** L-glutamin, kültür ortamında hücrelerin enerji üretimi ve protein sentezi için gerekli

olan esansiyel bir amino asittir.

*** Besiyeri ve besiyerine ilave edilen tüm kimyasallar sterildir. Ancak, besiyeri

hazırlanması sırasında, ekim tüplerine materyalin ekimi sırasında olabilecek veya

materyalden kaynaklanabilecek herhangi bir kontaminasyon riskinden dolayı, penisilin-

streptomisin karışımı gibi antibiyotikler, profilaktik amaçla besiyerine ilave

edilmektedir.

b) Kültür tüplerinin hazırlanması

1. Fötal dana serumu, L-Glutamin, Penisilin-Streptomisin eklenen besiyeri, 10 ml’lik

steril vidalı kapaklı tüplere 3 ml. olacak şekilde bölünür.

73

2. 3 ml besiyeri üzerine 75 μl Fitohemaglutinin*, 50 μl Lökosit Büyüme Solüsyonu

(Leukocyte Growth Supplement, LGS)** ve enjektör ile 15 damla Timidin*** eklenir.

* Periferde dolaşan lenfositler olgun hücre olduklarından, normal in vivo koşullarda

yaklaşık %1 oranında mitotik aktivite gösterirler. Bu nedenle, T-lenfositler için mitoz

uyarıcı etkisi olan fitohemaglutinin, besiyerine ilave edilir. Fitohemaglutinin, yeterince

bilinmeyen fakat immünolojik olduğu düşünülen bir mekanizmayla, in vitro koşullarda

T-hücrelerini uyararak, blast yani genç embriyolojik şekillerine dönüştürür ve mitotik

aktivitelerini % 8’e kadar yükseltir.

** Büyüme faktörlerince zengin LGS de T hücrelerin büyümelerini hızlandırarak

bölünme indekslerini arttırır.

*** Timidin ise bir baz analoğu olup, DNA zincirine girerek daha uzun boylu

kromozomlar elde edilmesini sağlar.

c) Ekim: 3 ml besiyeri bulunan steril kültür tüpüne 6-8 damla heparinize edilmiş

periferik kan damlatılır. Vidalı kapaklı tüpler kapatılır ve yavaşça karıştırılır. Tüpler yan

yatırılarak, 37°C’lik etüvde 72 saat inkübe edilir.

74

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

75

PRATİK 10:

KROMOZOM ELDESİ-II. AŞAMA

a) Kromozomların Elde Edilmesi (Harvest):

1. 68’inci saatte Timidin uzaklaştırılır.

Kültür tüpü, 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilir, dökelti (süpernatant) atılır,

çökelti (pelet) üzerine 3 ml hazır besiyeri eklenir. Kültür tüpü 37°C’deki etüve

geri konur.

2. 69,5’inci saatte, kültür tüpüne 50 μl CRA eklenir.

(CRA: Chromosome Resolution Additive; kromozom çözünürlüğü arttırıcı)

CRA, kromozomun sıkı paketlenmiş yapısındaki kimyasal bağları gevşeterek,

kromozomların daha uzun boylu olarak elde edilmesine yardımcı olur. CRA

eklendikten sonra kültür tüpü 37°C’deki etüve geri konur. (Not: CRA eklenmesi

her ne kadar kromozomların daha kolay incelenmesine olanak sağlasa da

kromozom eldesi için mutlaka kullanılması gereken bir ajan değildir.)

3. 71’inci saatte 100 μl metafaz bloke edici solüsyon eklenir.

Metafaz bloke edici solüsyon olarak MAS kullanılır (MAS: Metaphase Arresting

Solution; metafaz bloke edici solüsyon). MAS, kolçisin ve vinblastin sülfat

karışımıdır. Kolçisin, serbest tübülinlere bağlanarak mikrotübül

polimerizasyonunu engellediğinden, mitotik bölünmeyi durdurmak için

kullanılan bir kimyasaldır. İğ iplikçiklerini kırarak mitozu metafaz evresinde

durdurur. Böylelikle kromozomlar, en belirgin ve mikroskop altında görülebilir

halinde elde edilebilir. Vinblastin sülfat da mitozu engelleyen bir başka ajandır.

MAS eklendikten sonra kültür tüpü 37°C’deki etüve geri konur. Bazı durumlarda

MAS yerine sadece kolçisin kullanılarak da bu aşama gerçekleştirilebilmektedir.

4. Süre sonunda (72’inci saat) kültür tüpü 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilir.

5. Dökelti atılır. Çökelti elle karıştırılır.

6. Üzerine 6 ml. hipotonik solüsyonu (0.075 M KCl) vorteks ile karıştırılarak

eklenir.

37°C’deki etüvde 15 dakika inkübe edilir.

Hipotonik solüsyonu, eritrositlerin parçalanmasını ve metafaz evresindeki

lenfositlerin şişmesini sağlamak için kullanılmaktadır.

76

7. Süre sonunda tüp vorteks ile karıştırılırken 0.5 ml yeni hazırlanmış fiksatif

solüsyonu eklenir. Bu aşama ön-fiksasyon olarak adlandırılır. Fiksatif solüsyonu,

3:1 oranında metanol ve glasiyel asetik asit karışımından oluşmaktadır.

8. Tüp 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilir.

9. Dökelti atılır. Çökelti elle yavaşça karıştırılır.

10. Üzerine 5 ml fiksatif solüsyonu vortekslenerek ilave edilir.

Fiksatif solüsyonu, hücreleri fikse etmek, patlayan eritrositleri ve hemoglobini

uzaklaştırmak için kullanılmaktadır.

11. 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilir.

12. Fiksatif solüsyonu ile yıkama işlemi 3 kez tekrarlanır.

13. Üçüncü fiksatif solüsyonu eklenince, tüpler -20oC’de 10 dakika bekletilir.

14. Tüp 2000 rpm’de 7 dakika santrifüj edilerek yayma için kullanılacak olan çökelti

elde edilir.

b) Yayma:

1. Santrifüj tüpünün dibinde çökelti üzerinde 0.5 ml. fiksatif kalacak şekilde üst

kısım atılır.

2. Çökelti iyice karıştırılır. Çökelti çok yoğun ise, 2:1 oranında metanol ve glasiyel

asetik asitten oluşan fiksatif solüsyonu ile seyreltilir (dilüe edilir). Uygun

şartlarda (ki bu şartlar ortalama olarak %45-50 oranında nem ve 25°C sıcaklıktır)

çökeltiden pastör pipeti yardımıyla bir damla alınarak nefesle yüzeyi

nemlendirilmiş lamlara (distile su içinde +4°C’de bekletilmiş) yayma yapılır.

3. Mikroskobun diyaframı kapatılarak 10X objektifte metafaz sıklığı ve kalitesi

kontrol edilir.

4. Yayma yapılan preparatlar, 37°C’de üç gün ya da 60°C’ de bir gece

yaşlandırılır.

77

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

78

PRATİK 11:

KROMOZOMLARIN TANIMLANMASI VE BANTLANMASI

GTG (G banding by Tripsin using Giemsa) Bantlama: GTG bantlama, kromozom

boyunca açık ve koyu bantlar meydana getirerek her bir kromozomun kendine özgü

tanınabilir bantlarını almasını sağlar ve böylece sayısal ve yapısal olarak

kromozomların incelenebilmesine olanak verir. Bu özelliklerinden dolayı sitogenetik

laboratuvarlarında en çok tercih edilen bantlama yöntemidir. Bu laboratuarda GTG

bantlama yöntemi gerçekleştirilecektir ve yöntemin uygulanabilmesi için gerekli

solüsyonlar aşağıda verilmektedir.

Tripsin Solüsyonu:

0.2 gr. Tripsin 100 ml KH2PO4 solüsyonu içerisinde çözülür.

Giemsa Boyası için kullanılan Sörensan Tamponu :

KH2PO4 ve Na2HPO4 solüsyonlarının farklı hacimdeki karışımları ile elde

edilir:

KH2PO4 solüsyonu: 9.08 gr KH2PO4, 1000 ml bdH2O (bidistile su

içerisinde çözülür, pH:7.00’ye ayarlanır.+4 °C’de saklanır.

Na2HPO4 solüsyonu: 11.88 gr Na2HPO4.12H2O, 1000ml bdH2O

içerisinde çözülür, pH:7.00’ye ayarlanır. +4°C’de saklanır.

57.1 ml KH2PO4 solüsyonu ve 47.9 ml Na2HPO4 solüsyonu ile toplam hacim

100 ml olacak şekilde Sörensan solüsyonu hazırlandıktan sonra karışımdan 4,5 ml alınıp

atılır ve 4,5 ml Giemsa boyası eklenerek % 4,5’ luk Giemsa solüsyonu hazırlanmış olur.

1. Yaşlandırılmış olan preparatlar, 32°C’de tutulan % 0.2’lik tripsin

solüsyonu ile 1-2 dakika muamele edilir. Süre sonunda preparatlar çeşme

suyundan geçirilir. Tripsin, kromozom paketlenmesinde görev alan

proteinleri yıkan bir proteazdır.

2. Preparatlar oda ısısında tutulan ve taze hazırlanan % 4,5’luk Giemsa

boyasında 5-6 dakika tutulur. Giemsa, tripsin muamelesi sonunda

kromozom üzerinde açığa çıkan A=T’ce zengin DNA bölgelerine daha

79

yüksek afinite ile bağlanarak bu bölgeleri daha koyu boyayan bir DNA

boyasıdır.

3. Boyadan çıkarılan preparatlar çeşme suyundan geçirilir. Kurutma kağıdı

arasında nazikçe kurutulur. Mikroskop altında 10X’de metafazlar

bulunduktan sonra, preperat üzerine 1 damla immersiyon yağı damlatılarak

100X’de kromozomların bant alıp almadığı kontrol edilir (Şekil 1a) ve

karyogramı hazırlanarak analiz edilir (Şekil 1b). 100X objektifte kontrol

edebilmek için preparatların üzerine immersiyon yağı damlatıldığından,

preparatların bu yağdan arınabilmesi için 15 dakika Ksilol içinde tutulması

gerekir.

Şekil 1a. GTG bantlama tekniği ile hazırlanmış

normal bir erkek bireye ait metafaz örneği

80

Şekil 1b. GTG bantlama tekniği ile hazırlanmış

normal bir erkek bireye ait karyogram örneği

Alternatif Yöntemler

1.CBG (C-bands by Barium hydroxide using Giemsa) Bantlama: CBG

yöntemi, GTG bantlama yöntemi uygulandıktan sonra yapısal anomali

görülen kromozomların ve markır kromozomların (yapısal olarak

tanımlanmış hiçbir kromozama benzemeyen henüz tanımlanması

yapılmamış olan kromozom) değerlendirilmesinde, sentromerlerin ve Y

kromozomunun heteromorfik varyantlarının gösterilmesinde kullanılır.

CBG bantlama tekniği üç aşamalıdır:

I. aşama; 1N HCL (Asit) ile muamele); DNA omurgasına dokunmadan

pürin bazlarının uzaklaştırılması (Kısmi depürinizasyon)

II. aşama; Ba(OH)2: Baryum Hidroksit (Alkali) ile muamele; DNA’nın

denaturasyonu

III. aşama; 2xSSC ( sıcak tuz solüsyonu) ile muamele; Kromozomların

81

sentromer bölgeleri yüksek oranda heterokromatinizasyon gösterdiklerinden

ve bu bölgeler denaturasyona daha dayanıklı olduğu için yıkama

işleminden sonra uygulanan Giemsa boyama ile kromozomların

sentromerleri koyu renkte görülürler (Şekil 2).

Şekil 2. CBG bantlama tekniği uygulanmış metafaz örneği

2. NOR (Nucleolar Organizing Regions) Boyama : NOR boyama tekniği

ise GTG batlama yöntemi uygulandıktan sonra akrosentrik

kromozomların nükleolar bölgelerinin gümüş nitrat kullanılarak

boyandığı bir tekniktir. Nükleolar bölgeler, akrosentrik kromozomların

kısa kollarında ‘ satellit’ olarak adlandırılan bölgeler olup ribozomal

RNA genlerini içeren bölgelerdir. Bu bölgelerde bulunan Ag(gümüş)

bağlama affinitesi yüksek proteinler sayesinde bu bölgeler koyu renkte

boyanırlar (Şekil 3). Nükleolar bölgelerin farklı boyanma

özelliklerinden yararlanılarak, satellit yapısına özgü heteromorfizmler ve

markır kromozomların satellit içerip içermedikleri gösterilmektedir.

82

Şekil 3. NOR boyama tekniği uygulanmış metafaz örneği

Analiz sonucu hastanın karyotipi, Uluslarası Sitogenetik Terminolojisi’ne (ISCN-

International System for Human Cytogenetics Nomenclature) göre yazılarak rapor

hastaya verilir ve hekimine gönderilir. Raporun sonucuna göre hastaya ve yakınlarına

gerekli genetik danışmanlık verilir.

83

Notlarınız için bu sayfayı kullanabilirsiniz.

84

PRATİK 12:

SİTOGENETİK BULGULARIN RAPORLANDIRILMASI

SİTOGENETİK RAPOR YAZIMI

Sitogenetik analiz sonucunda gözlenen bulgular rapor halinde hastalara verilmektedir.

Örnekler EKTE sunulmuştur. Raporlandırmalarda kullanılan kısaltmalar ISCN 2013

indeksine göre aşağıda belirtilmiştir.

p: kromozomun kısa kolu

q: kromozomun uzun kolu

ter: kromozomun terminal bölgesi

+ : artış gösteren kromozomun ön tarafına konulan işarettir.

mos: mosaisizm

del: delesyon

dup: duplikasyon

inv: inversiyon

i: izokromozom

r: ring(halka) kromozom

t: translokasyon

mar: markır kromozom

der: derivatif (başkalaşmış)

dic: disentrik

mat: maternal

pat: paternal

dn: de novo (kromozom değişikliğinin ilk gözlendiği durum)

85

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU

RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NAS-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 47,-,+21

Sendromu: Down sendromu

Endikasyon: İkili testte risk

Yorum: : Dr. ............... tarafından gebeliğin16. haftasında uygulanan biyopsi ile

kazanılan 20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG

yöntemi ile metafazların analizi sonucunda Trizomi 21 gözlenmiştir.

Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon

ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom

anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

86

87

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU

RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NAS-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 47,-,+18

Sendromu: Edwards sendromu

Endikasyon: Üçlü testte risk

Yorum: : Dr. ............... tarafından gebeliğin18. haftasında uygulanan biyopsi ile

kazanılan 20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG

yöntemi ile metafazların analizi sonucunda Trizomi 18 gözlenmiştir.

Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon

ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom

anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

88

89

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

DÜŞÜK MATERYALİ/GONAD BİYOPSİSİNDEN/ DİĞER DOKULARDAN

KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Düşük Materyali/Gonad

Biyopsisinden/DiğerDokulardan

Kromozom Analizi

Onaylayan:

NFE-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 47,XX,+13

Sendromu: Patau sendromu

Endikasyon: İntrauterin ex

İncelenen Materyal: Düşük Materyali

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda incelenen tüm hücrelerde

47,XX,+13 karyotipi gözlenmiştir.

Not: Anne tekrar hamile kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

90

91

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Tıbbi Genetik

(Diğer Branşlar)

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 50

Karyotipi: mos 47,XX,+21[10]/46,XX[40]

Sendromu: Mozaik Down sendromu

Endikasyon: Down sendromu?

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda incelenen 50 hücrenin

10’unda (%20 oranında) 47,XX,+21 karyotipi gözlenmiştir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

92

46,XX

47,XX,+21

93

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

KORYON VİLLUS ÖRNEĞİNDEN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK

SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Koryon Villus Örneğinden

Kromozom Analizi Onaylayan:

CVS-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 45,X

Sendromu: Turner sendromu

Endikasyon: USG’de anomali

Yorum: Dr. ......... tarafından gebeliğin 12. haftasında uygulanan biyopsi ile kazanılan

CVS (Koryonik villus örneği) örneği hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG

yöntemi ile metafazların analizi sonucunda tüm hücrelerde 45,X karyotipi

gözlenmiştir.

Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon

ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom

anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

94

95

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU

RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NAS-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 47,XXX

Sendromu: Triple X sendromu

Endikasyon: İleri yaş

Yorum: Dr. ....... tarafından gebeliğin 18. haftasında uygulanan biyopsi ile kazanılan

20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG yöntemi ile

metafazların analizi sonucunda 47,XXX karyotipi gözlenmiştir.

Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon

ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom

anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

96

97

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU

RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NAS-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 47,XXY

Sendromu: Klinefelter sendromu

Endikasyon: İleri yaş

Yorum: Dr. ....... tarafından gebeliğin 19. haftasında uygulanan biyopsi ile kazanılan

20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG yöntemi ile

metafazların analizi sonucunda 47,XXY karyotipi gözlenmiştir.

Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon

ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom

anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

98

99

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU

RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NAS-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 47,XYY

Sendromu:

Endikasyon: İleri yaş

Yorum: : Dr. ............... tarafından gebeliğin17. haftasında uygulanan biyopsi ile

kazanılan 20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG

yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 47,XYY karyotipi gözlenmiştir.

Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon

ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom

anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

100

101

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 50

Karyotipi: mos 47,XXX[15] / 46,XX[35]

Sendromu: Mozaik Triple X sendromu

Endikasyon: IVF başarısızlığı

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda incelenen 50 hücrenin

15’inde (%30 oranında) 47,XXX karyotipi gözlenmiştir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

102

46,XX

103

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

DÜŞÜK MATERYALİ/GONAD BİYOPSİSİNDEN/ DİĞER DOKULARDAN

KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Perinatoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Düşük materyali/gonad

biyopsisinden/ diğer dokulardan

kromozom analizi

Onaylayan:

NFE-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 69,XXY

Sendromu:

Endikasyon: İntrauterin ex

İncelenen Materyali: Düşük materyali

Yorum:. GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 69,XXY karyotipi

gözlenmiştir.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

104

105

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Yenidoğan Kliniği

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 46,XX,del(1)(q42.1) dn,inv(9)(p11q13) mat

Sendromu:

Endikasyon: Mental retardasyon

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 1 numaralı

kromozomlardan birinin uzun kolunun q42.1-qter bölgesinin delesyonu saptanmıştır.

Bu değişikliğinin orijininin belirlenmesi için anne ve babaya kromozom analizi

yapılmış ve karyotipleri normal olarak bulunmuştur.

Ayrıca olguda, 9 numaralı kromozomlardan birinin p11 ve q13 bölgelerinin işe

karıştığı perisentrik inversiyon gözlenmiştir. Bu bulgu literatürde heteromorfizm

olarak değerlendirilmekte ve normal kabul edilmektedir. Ebeveyinlerinden yapılan

kromozom analizinde de bu inversiyonun anne tarafından taşındığı tespit edilmiştir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

106

107

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: TIBBİ GENETİK

(Diğer Branşlar)

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı:20

Karyotipi: 46,XY,dup(1)(q31.1q32.3) dn

Sendromu:

Endikasyon: MKA (Majör konjenital anomali),MR (Mental Retardasyon)

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların incelenmesi sonucunda 1 numaralı

kromozomlardan birinin uzun kolunda q31.3 ve q32.3 bölgesinin duplikasyonu

gözlenmiştir. Duplikasyon gözlenen 1 numaralı kromozomun orijinin belirlenebilmesi

için anne ve babadan kromozom analizi yapılmış ve ebeveynlerin kromozomal bir

anomali taşımadığı gözlenmiştir.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

108

109

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Ped. Endokrinoloji

Plk.

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG,CBG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 100

Karyotipi: mos 45,X[64]/46,X,idic(X)(p11.21)[36]

Sendromu: Varyant Turner sendromu

Endikasyon: Turner sendromu ?

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda %64 oranında 45,X ve

%36 oranında 46,X,idic(X) (çift sentromerli izokromozom) karyotipi saptanmıştır.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

110

45, X

46,X,idic(X)

111

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: TIBBİ GENETİK

(Diğer Branşlar)

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 46,X,r(X)(p22q28)

Sendromu:

Endikasyon: Gelişme geriliği

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda X kromozomlarından

birinin p22 ve q28 bölgelerinde meydana gelen iki kırık sonucu oluşan ring X

kromozomu gözlenmiştir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

112

113

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Ped.Nöroloji

Polikliniği

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG, CBG, NOR

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 47,XY,+der(14)t(10;14)(p15;q13) mat

Sendromu:

Endikasyon: Hidrosefali

Yorum: GTG yöntemiyle metafazların analizi sonucunda değerlendirilen tüm

hücrelerde 47. Kromozom olarak bir markır kromozom gözlenmiştir. Olgunun

kromozomlarının NOR ve CBG yöntemleri ile incelenmesi sonucunda markır

kromozomun tek sentromerli ve satellitli olduğu belirlenmiştir. Annenin

kromozomlarının incelenmesi sonucunda 10 numaralı kromozomlardan birinin p15

bandı ile 14 numaralı kromozomlardan birinin q13 bölgelerinin işe karıştığı karşılıklı

translokasyon belirlenmiştir. Bu bulgu, çocukta gözlenen markır kromozomun

orijinin, annenin kromozomlarında meydana gelen translokasyon sonucu oluşan

derivatif 14 numaralı kromozom olduğunu ve olgunun 10 numaralı kromozomun

p15→pter bölgesi ve 14q13→pter bölgelerinin parsiyel trizomisine sahip olduğunu

göstermektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

114

çocuk

anne

115

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

KEMİK İLİĞİNDEN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Hematoloji Birimi

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Kemik İliği Kromozom

Analizi Onaylayan:

NKİ-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Direkt ve Kısa Süreli Doku Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 15

Karyotipi:46,XY,t(9;22)(q34:q11)[13] / 46,XY[2]

Endikasyon: Kronik Myeloid Lösemi

Yorum: Olgunun incelenen 15 metafazının 13’ünde %87 oranında t(9;22)

translokasyonu gözlenmiştir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

116

K-Q

TSE-ISO-EN 9000

117

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDANKROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Pediatri Gen. Pol.

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG,CBG,NOR

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 47,XY,+mar

Sendromu:

Endikasyon: MKA

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda değerlendirilen hücrelerin

tümünde ilave bir markır kromozom gözlenmiştir.

Bu markır kromozomun CBG yöntemi ile tek sentromerli, NOR yöntemi ile de

satellitsiz olduğu belirlenmiştir. Markır kromozomunun orijininin saptanabilmesi için

FISH tekniği uygulanması gerekmektedir.

Not: Bu sonuç, submikroskobik koromozom aberasyonlarını, DNA’daki gen

defektlerini ve nadir mozaikliği dışlamamaktadır.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

118

119

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDANKROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Pediatrik Genetik

Polk.

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı:

Karyotipi: 45,XX,der(14;21)(q10;q10)

Sendromu:

Endikasyon: Anomalili çocuk öyküsü

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 45, XX karyotipi belirlenen

olguda, 14 ve 21 numaralı kromozomlardan birer tanesi arasında karşılıklı

translokasyon gözlenmiştir (14 ve 21 numaralı kromozomların kısa kollarında birer

kırık oluşmuş ve bu iki kromozom kırık noktalarından birleşerek yeni bir derivatif

kromozom oluşturmuştur). 14 ve 21 numaralı kromozomların kısa kollarının kaybı ile

oluşan bu derivatif kromozomdaki kayıplar genomik bir kayıp olarak

düşünülmemekte (akrosentrik diğer kromozomların kısa kollarında lokalizasyon

gösteren aynı genlerin sentezi nedeniyle) ve fetusta fenotipe yansıması

beklenilmemektedir.

Not: Anne gebe kaldığında genetik danışmanlık verilmesi önerilir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

120

121

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

PERİFERİK KANDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Pediatrik Genetik

Polk.

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Periferik Kandan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NKA-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Kısa Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı:

Karyotipi: 46,XX,der(14;21)(q10;q10) mat,+21

Sendromu: Robertsonyan Tipi Down Sendromu

Endikasyon: Down Sendromu?

Yorum: GTG yöntemi ile metafazların analizi sonucunda, 14 ve 21 numaralı

kromozomlardan birer tanesi arasında karşılıklı translokasyon gözlenmiştir (14 ve 21

numaralı kromozomların kısa kollarında birer kırık oluşmuş ve bu iki kromozom kırık

noktalarından birleşerek yeni bir derivatif kromozom oluşturmuştur). Olgunun

annesinde bulunan ve üzerinde 21 numaralı kromozomu da bulunduran derivatif

14’ün oğul döle geçmesiyle bu olguda toplam kromozom sayısı 46 olmasına rağmen 3

adet 21 numaralı kromozoma sahip olmasından dolayı olgu, translokasyon tipi Down

olarak değerlendirilmiştir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

122

123

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

AMNİYOTİK SIVIDAN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU

RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Gönderen Birim: Kadın Hast. ve Doğ.

Polk.

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Amniyotik Sıvıdan

Kromozom Analizi Onaylayan:

NAS-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Uzun Süreli Hücre Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 20

Karyotipi: 46,XY,inv(5)(p15.1q23.2) pat

Sendromu:

Endikasyon: Triple Testte Risk

Yorum: Dr. ................ tarafından gebeliğin 15. haftasında uygulanan biyopsi ile

kazanılan 20 ml’lik amniyotik sıvı, hücre kültürü yöntemi ile incelenmiştir. GTG

yöntemi ile metafazların analizi sonucunda 5 numaralı kromozomlardan birinde

perisentrik inversiyon (bu kromozomun kısa ve uzun kolunda birer kırık oluşarak

aradaki parçanın 180 derece dönüp aynı yere yapışması durumu) gözlenmiştir. Aynı

kromozom bulgusunun fetüsün babasında da gözlenmesi nedeniyle bu bulgunun

fenotipi etkilemeyeceği düşünülmektedir.

Bu test ile fetustaki tek gen hastalıkları, konjenital malformasyonlar, mikrodelesyon

ve mikroduplikasyonlar ile ancak özel incelemeler ile gösterilecek kromozom

anomalileri ve düşük oranlı mozaisizm ve maternal hücre kontaminasyon dışlanamaz.

Not: Anne tekrar gebe kaldığında prenatal tanı önerilmektedir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye.

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr.Üye

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

124

125

T.C

AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ REKTÖRLÜĞÜ

Sağlık, Araştırma ve Uygulama Merkezi (Hastane)

KEMİK İLİĞİNDEN KROMOZOM ANALİZİ TETKİK SONUCU RAPORU

Adı Soyadı: Kurum:

TC Kimlik No: Başvuru No:

Doğum Tarihi: Müracaat Tarihi:

Cinsiyeti: Erkek Gönderen Birim: Hematoloji Polk.

Dosya(Barkod): Gönderen Doktor:

İstem tarihi: Onay Tarihi:

Hizmet Adı: Kemik İliği Kromozom

Analizi Onaylayan:

NKİ-

Yapılan Test: Kromozom Analizi

Kullanılan Yöntem: Direkt ve Kısa Süreli Doku Kültürü

Kullanılan Bantlama Tekniği: GTG

Değerlendirilen Hücre Sayısı: 10

Karyotipi: //46,XX[10]

Endikasyon:

Yorum: : Olgunun incelenebilen 10 metafazında vericiye ait [46,XX] karyotip

gözlenmiştir.

Görevi Adı-Soyadı İmza

Tıbbi Biyoloji ve Genetik Öğr. Üye.

Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi Sorumlusu

K-Q TSE-ISO-EN

9000

126