tesis doctoral aranzazu urresola olabarrieta

1

Tesis Doctoral Aranzazu Urresola Olabarrieta

Topografía Precisa de las Subunidades de los Canales de

Potasio Kv3.1b y Kv3.3 en la Capa Molecular de la Corteza

Cerebelosa de la Rata

Resumen

......................................................................................................... 3

Introducción

......................................................................................................... 8

Hipótesis de trabajo

........................................................................................................ 43

Objetivos

......................................................................................................... 48

Material y métodos

......................................................................................................... 50

Resultados

........................................................................................................ 60

Discusión

......................................................................................................... 73

Conclusiones

......................................................................................................... 94

Bibliografía

........................................................................................................ 98

2


RESUMEN

3


RESUM EN

Los canales de potasio dependientes de voltaje Kv3.1 y Kv3.3

intervienen en la generación de potenciales de acción rápidos, que

permite a las neuronas que los poseen disparar potenciales de acción

a alta frecuencia (Rudy y McBain 2001). Son canales activados a

potenciales de membrana relativamente positivos, y se caracterizan

por sus cinéticas de activación extraordinariamente rápidas,

moldeando así la repolarización del potencial de acción (Rudy and

McBain 2001). Estudios de hibridación in situ e inmunohistoquímica

han demostrado que Kv3.1 y Kv3.3 se expresan en abundancia en la

corteza cerebelosa (Goldman-Wohl y cols., 1994; McMahon y cols.,

2004), en particular, en las células granulares (Weiser y cols., 1994,

1995; Sekirnjak y cols., 1997; Grigg y cols., 2000; Li y cols., 2001;

Rudy McBain 2001; Ozaita y cols., 2002; Alonso-Espinaco y cols.,

2008; Puente y cols., 2010). Desde el punto de vista funcional, los

ratones que carecen de los canales Kv3.1 y Kv3.3 presentan un

síndrome cerebeloso caracterizado por ataxia severa y temblor,

además de ser particularmente sensibles al alcohol (Espinosa y cols.,

2001, 2004; Matsukawa y cols., 2003, Joho y cols., 2006). Estas

evidencias en conjunto sugieren que la presencia de Kv3.1 y Kv3.3 es

crítica en el mantenimiento de una función cerebelosa normal.

4


Por otra parte, se ha visto que ratones sin Kv3.3, pero con Kv3.1,

cursan con incoordinación motora (McMahon y cols., 2004, Joho y

cols., 2006; Hurlock y cols., 2008), que desaparece tras la expresión de

nuevo de Kv3.3 en las neuronas de Purkinje de estos ratones, al igual

que ocurre al introducir Kv3.3 en ratones que carecen de los dos alelos

de Kv3.3 y un alelo de Kv3.1 (Hurlock y cols., 2008). No obstante, el

aprendizaje de habilidades motoras no se ve afectado en los ratones

mutantes sin Kv3.3 (Hurlock y cols., 2008). Merece una especial

mención el hecho de que la mutación del gen que codifica el canal

Kv3.3 es la responsable de la ataxia espinocerebelosa 13 de carácter

familiar, caracterizada por un cuadro de ataxia y degeneración

cerebelosa de aparición en individuos adultos (Waters y cols., 2006;

Waters y Pulst, 2008; Schorge y cols., 2010).

La coexpresión en las células granulares de los canales Kv3.1 y

Kv3.3, ambos con propiedades biofísicas similares, es asumida como

una redundancia functional (Ho y cols., 1997; Sánchez y cols., 2000),

ya que los alelos de Kv3.1 y Kv3.3 eliminados genéticamente en una

manera dosis-dependiente, causa anormalidades en la plasticidad a

corto plazo de la transmisión sináptica de las fibras paralelas con las

células de Purkinje, lo cual está unido a la aparición de deficiencias

motoras (Matsukawa y cols., 2003). A pesar de los hallazgos que

5


apuntan hacia un papel cofuncional de los canales Kv3.1 y Kv3.3 en

las fibras paralelas, no se conoce la localización ultraestructural

precisa ni la contribución de cada una de estas subunidades en los

compartimentos específicos (terminales sinápticas/ porciones

intervaricosas) de los axones de las células granulares (las fibras

paralelas), lo que es fundamental en la fisiología sináptica

excitadora de las fibras paralelas con las espinas dendríticas de las

células de Purkinje.

Esta investigación por tanto se ha concebido con el fin de

estudiar estas cuestiones en la corteza cerebelosa de la rata,

utilizando para ello antisueros específicos frente al canal Kv3.1b y

Kv3.3 en combinación con técnicas inmunocitoquímicas de alta

resolución para microscopía electrónica.

Los resultados de esta Tesis Doctoral han demostrado la

presencia de numerosas inmunopartículas que señalan la

localización de Kv3.1b y Kv3.3, en membranas de las terminales

sinápticas y segmentos intervaricosos de las fibras paralelas. En

particular, Kv3.1b está aproximadamente en el 85% de los botones

sinápticos, y en cerca del 47% de las porciones intervaricosas de las

fibras. Sin embargo, sólo el 28% de las intervaricosidades y un 23%

de las terminales sinápticas de las fibras paralelas contienen Kv3.3.

6


Por otro lado, el análisis también revela que las espinas dendríticas

de las células de Purkinje son el principal recipiente de Kv3.3 (54%).

En conclusión, aunque ambas subunidades de canales de

potasio comparten localización en las mismas porciones

presinápticas de las fibras paralelas, los resultados de esta Tesis

Doctoral indican que el canal de potasio Kv3.1b en la corteza

cerebelosa contribuye en gran medida a la construcción de la

arquitectura molecular de las fibras paralelas, mientras que Kv3.3

ejerce sobre todo una influencia postsináptica a través de su

localización mayoritaria en las espinas dendríticas de las células de

Purkinje.

7


INTRODUCCIÓN

8


INTRODUCCIÓN

El cerebelo es una parte del sistema nervioso central que ejerce

una función crucial en el control motor. Desde el punto de vista

clínico, la lesión del cerebelo ocasionada generalmente por tumores o

por causas vasculares, da origen a la aparición del denominado

síndrome cerebeloso. Este síndrome en su forma más florida se

caracteriza por pérdida del equilibrio y la postura, alteración de los

movimientos oculares (nistagmo), dificultad en el habla (disartria,

palabra escandida), temblor intencional, ataxia (marcha inestable,

temblorosa), hipotonía, dismetría, adiadococinesia (incapacidad de

realizar movimientos rápidos alternantes) y falta de coordinación de

los movimientos finos. Además, estos pacientes tienen una gran

dificultad en el aprendizaje de actos motores. La base celular de esta

sintomatología radica en la afectación de los circuitos a nivel de la

corteza cerebelosa y de los núcleos profundos. Ambos están

interconectados por las células de Purkinje, únicas células de la

corteza cerebelosa que proyectan a los núcleos profundos. A partir de

estos últimos se organizan las proyecciones a diferentes centros

nerviosos, sobre todo a la corteza cerebral a través del tálamo, a

centros subcorticales como el núcleo rojo y la formación reticular y a

la médula espinal, ejerciendo así su efecto sobre el control del

movimiento.

9


El cerebelo, para realizar su función, recibe abundante

información del estado de nuestro cuerpo a través de dos tipos de

proyecciones nerviosas: las fibras musgosas y las fibras trepadoras,

originadas estas últimas exclusivamente en la oliva inferior. Las

primeras terminan en la capa granular de la corteza cerebelosa

formando parte de los glomérulos cerebelosos. A este nivel, hay un

relevo sináptico desde las fibras paralelas de las células granulares a

las espinas dendríticas de las células de Purkinje. Por su parte, las

fibras trepadoras terminan directamente sobre el árbol dendrítico de

las células de Purkinje. Ambos sistemas aferentes convergentes en

las células de Purkinje son glutamatérgicos, por lo tanto excitadores,

mientras que las células de Purkinje son gabaérgicas, inhibidoras. A

su vez, las fibras musgosas y trepadoras durante su recorrido dan

colaterales axónicas excitadoras a las neuronas de los núcleos

profundos, que en su mayoría son excitadoras.

En definitiva, la función del cerebelo va a depender de la

integridad de los circuitos cerebelosos y de la correcta activación de

los diferentes receptores excitadores (de glutamato) e inhibidores (de

GABA) que existen en el cerebelo en conjunto. Además, se ha

observado que determinadas subunidades de canales de potasio, en

concreto las denominadas Kv3.1 y Kv3.3 son fundamentales para el

10


correcto funcionamiento del cerebelo, ya que ratones knockout que

carecen de los genes que codifican estas subunidades de canales,

presentan un cuadro cerebeloso caracterizado por ataxia, temblor,

mioclonias y una sensibilidad extraordinaria al alcohol (Espinosa y

cols., 2001). Por otra parte, se ha demostrado que los ARN

mensajeros que codifican para Kv3.1 y Kv3.3 se expresan mucho en

las células granulares de la corteza cerebelosa (Weiser y cols, 1994;

Grigg y cols, 2000; Li y cols., 2001; Rudy y McBain, 2001).

En los últimos años se ha descubierto un gran número de

canales de potasio, la mayoría de los cuales se encuentran en el

sistema nervioso central. La subfamilia Kv3 forma canales

dependientes de voltaje que modulan la excitabilidad neuronal. En

los vertebrados, los genes de los Kv3 están relacionados con los genes

Shaw de Drosophila y están asignados a la subfamilia 3 de los Shaw.

Esta subfamilia de canales de potasio Kv3 consta de cuatro genes

independientes: Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4. Tres de estos cuatro

genes (Kv3.1, Kv3.2 y Kv3.3) se expresan principalmente en el

sistema nervioso central (SNC) en forma de heteromultímeros.

Los canales que contienen las subunidades Kv3.1 y Kv3.3 se

caracterizan por presentar una activación e inactivación muy rápidas

11


y por abrirse ante potenciales de membrana que oscilan entre –10mV

y 0mV. Por lo tanto, los canales de potasio con Kv3.1-Kv3.3

participan en la rápida repolarización que sigue tras un potencial de

acción, confiriendo a las células que las contienen las características

de disparo rápido, conocido como fast-spiking. Si estas circunstancias

se ven alteradas como ocurre en los ratones knockout que carecen de

dichas subunidades, las células afectadas son incapaces de disparar

potenciales de acción a alta frecuencia (Rudy y McBain, 2001),

además de presentar alteraciones de la plasticidad sináptica a corto

plazo, en concreto, a nivel de las sinapsis excitadoras entre las fibras

paralelas y las células de Purkinje (Sabatini y Regehr, 1997; Zucker

y Regehr, 2002).

En un estudio previo en colaboración con el Dr. Thomas Knöpfel

(Laboratory for Neuronal Circuit Dynamics, RIKEN, Brain Science

Institute, Japón), utilizamos ratones transgénicos que contenían el

gen que codifica la proteína fluorescente amarilla aumentada

(Enhanced Yellow-Fluorescent Protein, EYFP), bajo el control del

promotor del canal de potasio Kv3.1 (pKv3.1). Así describimos los

tipos celulares que expresaban fluorescencia (y por lo tanto la

subunidad Kv3.1) detectada con microscopía confocal en el cerebelo

12


(Metzger y cols., 2002). Este fue el punto de partida del presente

trabajo.

CANALES DE POTASIO

En las últimas décadas se ha descubierto un gran número de

canales de potasio, la mayoría de los cuales se encuentran en el

sistema nervioso central (Pongs, 1992; Jan y Jan, 1997; Coetzee y

cols., 1999). Un importante objetivo de la investigación actual es

comprender el significado funcional de los mismos. Es por ello que la

caracterización de los canales de potasio formados por diferentes

subunidades en sistemas heterólogos de expresión y la identificación

celular y subcelular de los patrones de expresión en tejido, resulta

crucial para entender el papel de estos canales en la función

neuronal.

Las técnicas de ADN recombinante han demostrado la

existencia de dos grupos de genes que codifican canales de potasio

dependientes de voltaje. Estas dos familias de genes, ambas

pertenecientes a la superfamilia S4 de proteínas de canales iónicos,

son el gen homólogo de eag de Drosophila y el gen homólogo de

Shaker de Drosophila. Esta segunda familia de proteínas,

denominada familia de genes Sh, se divide en cuatro subgrupos.

13


Figura 1. Estructura de las subunidades de

un canal de potasio dependiente de voltaje.

En la parte superior, se representa la subunidad α

formada por 6 hélices transmembrana unidos por

lazos intracelulares y extracelulares, con dos

extremos amino y carboxilo intracelulares. Entre

las hélices 5 y 6 está el poro del canal, en la hélice

4 está el sensor de voltaje.

Cada uno está compuesto

por un homólogo de cuatro

genes muy relacionados:

Shaker, Shab, Shaw y Shal

(Perney y Kaczmarek, 1991;

Pongs 1992; Salkoff y cols.,

1992; Jan y Jan, 1997; Rudy y

cols., 1999), que corresponden

a las distintas subunidades α

que se han denominado Kv1,

Kv2, Kv3 y Kv4. Esta familia

de proteínas Kv codifican

subunidades que forman

poros de canales de potasio

dependientes de voltaje

tetraméricos que se clasifican

en distintos grupos según las

analogías de secuencia (Coetzee y cols., 1999; Gutman y cols., 2005).

Cada subunidad individual de Sh forma tetrámeros funcionales de

canales de potasio dependientes de voltaje, con una dependencia de

voltaje, cinética y farmacología propias, observadas al expresar las

subunidades en ovocitos de Xenopus laevis o en otro sistema de

14


expresión heterólogo (Perney y Kaczmarek, 1991; Salkoff y cols.,

1992; Rudy y cols., 1999). El centro tetramérico de estas subunidades

α puede estar compuesto por subunidades idénticas o por una

combinación de diferentes subunidades (Sheng y cols., 1993; Scott y

cols., 1994) (Figura 1).

Las subunidades de la misma familia Sh, pero no de diferentes

subfamilias, suelen formar canales heteroméricos, sugiriendo que

cada conjunto de subunidades forma un sistema de canales

diferentes (Coetzee y cols., 1999). Los canales heteroméricos, a

menudo, presentan propiedades intermedias a las que presentarían

esas subunidades individualmente formando homómeros (Christie y

cols., 1990; Isacoff y cols., 1990; McCormack y cols., 1990;

Ruppersberg y cols., 1990; Covarrubias y cols., 1991; Weiser y cols.,

1994). Además, los canales formados por alguna subunidad Sh

pueden interactuar con otras subunidades, viéndose modificada de

esta forma las propiedades de los canales (Rettig y cols., 1994; Scott

y cols., 1994). Teniendo en cuenta todos estos factores, estas

subunidades pueden dar lugar a la formación de un amplio número

de canales de potasio dependientes de voltaje funcionalmente

distintos. Esta gran diversidad proporciona un mecanismo que

permite lograr sutiles diferencias en la integración neuronal.

15


Figura 2. En los vertebrados, los genes de los canales de potasio activados

por voltaje Kv3 están relacionados con los genes Shaw de Drosophila y están

asignados a la subfamilia 3 de entre los Shaw, también denominados ShIII.

Los canales de potasio son relativamente desconocidos, a pesar

de que todas las proteínas Sh y eag que se han descrito se

encuentran en neuronas, constituyendo un grupo muy diverso de

canales iónicos (Figura 2). Esta diversidad es uno de los factores

principales que contribuye a las dinámicas propiedades

electrofisiológicas y a la especificidad funcional de las acciones

moduladoras de los neurotransmisores (Hille y cols., 1999).

Entre las subunidades que han atraído mayor atención figuran

las de la familia Kv3, ya que forman canales dependientes de voltaje

con propiedades electrofisiológicas específicas en sistemas

16


heterólogos de expresión, lo cual les confiere un papel especial en la

modulación de la excitabilidad neuronal (Vega-Sáenz de Miera y

cols., 1994; Wang y cols., 1998a, Erisir y cols., 1999; Rudy y cols.,

1999; Rudy y McBain, 2001). El canal Kv3 se distingue de los demás

canales Kv por su rango positivo de activación y por su rápida

cinética de desactivación (Rudy y cols., 1999). La apertura de estos

canales Kv3 no tiene lugar hasta que el potencial de membrana es

más positivo que -10 mV. En la repolarización de la membrana, los

canales Kv3 se cierran muy rápidamente, con rangos de

desactivación 10 veces más rápidos que otros canales Kv (Grissmer y

cols., 1994; Coetzee y cols., 1999). En definitiva, los canales que

contienen subunidades Kv3 participan en la rápida repolarización

que sigue tras un potencial de acción, confiriendo a las células que

las contienen las características de disparo rápido, conocido como

fast-spiking. Según esto, se ha sugerido que los canales que

contienen subunidades Kv3 juegan un papel fundamental en la

reducción de la duración de los potenciales de acción, tanto en el

establecimiento de la frecuencia de los trenes de potenciales de

acción (controlando la resistencia entre espigas), como en la

modulación presináptica de la liberación de neurotransmisor

limitando, en definitiva, el transcurso postsináptico de la

despolarización inducida por la apertura del receptor-canal y

17


haciendo posible una transmisión sináptica fásica de alta frecuencia.

Esta subfamilia de canales Kv3 consta de cuatro genes

independientes: Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4 (Chandy y Gutman,

1993), que codifican al menos 12 tránscritos generados por

ensamblaje alternativo: Kv3.1a, Kv3.1b, Kv3.2a, Kv3.2b, Kv3.2c,

Kv3.2d, Kv3.3a, Kv3.3b, Kv3.4a, Kv3.4b, Kv3.4c, Kv3.4d (Vega-

Sáenz de Miera y cols., 1994; Rudy y cols., 1999; Rudy y McBain,

2001). Tres de los cuatro genes estudiados (Kv3.1, Kv3.2 y Kv3.3) se

expresan principalmente en el sistema nervioso central (Rudy y cols.,

1999), mientras que los tránscritos de Kv3.4 son más abundantes en

el músculo esquelético (Weiser y cols., 1994; Abott y cols., 2001;

Vullhorst y cols., 2001). Los datos obtenidos de la coexpresión de

algunas de dichas subunidades, sugieren que las más comunes

forman heteromultímeros en el SNC (Hernández-Pineda y cols.,

1999; Rudy y cols., 1999).

Por otra parte, la farmacología de los canales de la subfamilia

Kv3 se caracteriza por una relativa sensibilidad a 4-aminopiridina

(4-AP) e iones de tetraetilamonio (TEA) (Baranauskas y cols., 1999;

Erisir y cols., 1999; Hendriks y cols., 1999). De los tres subtipos que

se encuentran en el cerebro, el patrón de expresión de Kv3.1 y Kv3.2

18


es en gran parte complementario, mientras que Kv3.1 y Kv3.3 a

menudo se coexpresan en muchas regiones cerebrales (Weiser y cols.,

1994; Grigg y cols., 2000). El gen codificante para Kv3.1 exhibe un

patrón de expresión restringido según el tejido. En experimentos

llevados a cabo en líneas celulares, se ha observado que la

transcripción está regulada por calcio, AMP cíclico y cascadas de

transducción generadas por factores de crecimiento (Gan y cols.,

1996).

Como ha sido mencionado más arriba, los canales de potasio

dependientes de voltaje Kv3.1 y Kv3.3 están ampliamente

coexpresados en el SNC (Drewe y cols., 1992; Perney y cols., 1992;

Rudy y cols., 1992; Goldman-Wohl y cols., 1994; Lenz y cols., 1994;

Weiser y cols., 1994, 1995; Du y cols., 1996; Perney y Kaczmarek,

1997; Sekirnjak y cols., 1997; Baranauskas y cols., 1999; Hernández-

Pineda y cols., 1999; Rudy y cols., 1999; Rudy y McBain, 2001), en

especial en las áreas implicadas en el control de la actividad motora

y, por tanto, también en poblaciones neuronales del cerebelo (ver

más abajo). Este hecho revela el gran potencial que tienen para

formar heterómeros entre los productos de estos genes. Además se ha

visto que los ratones knockout carentes de los genes que codifican

Kv3.1 y Kv3.3 presentan ataxia severa, movimientos temblorosos,

19


mioclonía e hipersensibilidad al alcohol, aunque no un déficit de

aprendizaje o memoria (Espinosa y cols., 2001). Sin embargo, los

ratones knockout para un solo gen tienen alteraciones fisiológicas,

pero mucho más sutiles (Chan 1997; Ho y cols., 1997; Joho y cols.,

1999; Sánchez y cols., 2000; Porcello y cols., 2002; Macica y cols.,

2003).

Expresión de Kv3.1 y Kv3.3 detectada por hibridación in

situ

La distribución subcelular de los tránscritos de Shaw (ShIII) ha

sido analizada por técnicas de Northern blot e hibridación in situ.

Los estudios de hibridación in situ en el SNC han mostrado que

algunos ARNm de Shaw son tan abundantes como los tránscritos de

otros canales de potasio (Weiser y cols., 1994). La expresión de los

ARNm de los cuatro genes de la subfamilia Shaw, tiene lugar en

poblaciones neuronales específicas de proyección y de circuitos

locales (Perney y cols., 1992; Rudy y cols., 1992; Weiser y cols., 1994).

Cada gen de ShIII exhibe un patrón de expresión diferente,

pero una gran mayoría de las poblaciones neuronales que expresan

los tránscritos Kv3.1 también expresan el ARNm para Kv3.3. Los

genes que codifican Kv3.1 y Kv3.3 son, respectivamente, Kcnc1 y

20


Figura 3. Distribución de los ARNm de los canales de potasio activados por voltaje

Kv3 en el cerebro de los roedores. Kv3.1 y Kv3.3 presentan una amplia distribución en el

sistema nervioso central, incluidos el cerebelo y los ganglios basales implicados en el control y

la modulación de la actividad motora. Nótese la importante coexpresión de Kv3.1 y Kv3.3 en las

células granuleres del cerebelo. Rudy y cols. (1999).

Kcnc3. En general, el ARNm de Kv3.1 se expresa en gran cantidad

en el hipocampo y tálamo, mientras que los niveles del ARNm de

Kv3.3 son elevados en el tronco del encéfalo (Weiser y cols., 1994)

(Figura 3).

Ambos tránscritos se expresan ampliamente en el cerebelo.

Aquí, los ARN mensajeros que codifican para Kv3.1 y para Kv3.3 se

expresan en la corteza cerebelosa y en los núcleos cerebelosos

profundos. En las células granulares de la corteza se expresan

21


principalmente ambos ARNm, sin embargo, en las células de

Purkinje sólo se expresa el ARNm codificante para Kv3.3 (Goldman-

Wohl y cols., 1994; Ozaita y cols., 2002; Sekirnjak y cols., 1997;

Weiser y cols., 1994, 1995) (Figura 3). En las células de la capa

molecular se observan ambos ARNm, pero sin ser tan abundantes

como en las demás poblaciones neuronales de la corteza. Los núcleos

profundos del cerebelo muestran también un patrón de alta

expresión de los tránscritos de Kv3.1 y Kv3.3 (Weiser y cols., 1994).

Por tanto, estos dos ARNm tienen un patrón de distribución que, si

bien a veces es similar, no siempre tiene por qué coincidir (Figura 3).

ARN mensajero codificante para Kv3.1

El ARNm que codifica para Kv3.1 se expresa en el cerebelo del

ratón y de la rata adultos (Drewe y cols., 1992; Perney y cols., 1992;

Rudy y cols., 1992; Weiser y cols., 1994, 1995; Du y cols., 1996;

Perney y Kaczmarek, 1997; Sekirnjak y cols., 1997) (Figura 3). En

concreto, el ARNm de Kv3.1 presenta un patrón heterogéneo (Lenz y

cols., 1994).

Así, los niveles más elevados de mensajero se expresan en el

cerebelo, aunque también en el globo pálido, subtálamo y en la

porción reticular de la sustancia negra. Muchos núcleos talámicos,

22


pero sobre todo el núcleo reticular talámico, muestran una fuerte

señal de hibridación, al igual que algunas poblaciones de

interneuronas de la corteza cerebral e hipocampo (Perney y cols.,

1992). También se detecta la expresión del canal Kv3.1 en núcleos

del tronco del encéfalo, tales como el colículo inferior y los núcleos

cocleares y vestibulares y, sobre todo, en el núcleo medial del cuerpo

trapezoide (Grigg y cols., 2000) (Figura 3).

El ARNm que codifica para Kv3.1 se expresa mucho en las

capas granulares externa e interna desde los períodos postnatales

tempranos. Además, Kv3.1 se expresa en las fibras paralelas de

células granulares de dos días postnatal en cultivos de

microexplantes. Todo ello pone de manifiesto que estos canales

predominan en las células granulares inmaduras (Shibata y cols.,

1999). Otros experimentos realizados en neuroblastos cultivados del

núcleo magnocelular auditivo del romboencéfalo del pollo,

demuestran la existencia de corrientes de potasio muy sensibles a 4-

aminopiridina y tetraetilamonio (lo que indica que son del tipo

Kv3.1) detectables desde el segundo día embrionario y a lo largo de

toda la embriogénesis (Hendriks y cols., 1999).

Los canales de potasio Kv3.1 parecen tener un papel destacado

23


durante el desarrollo neuronal temprano y en la maduración, ya que

la actividad neuronal espontánea es fundamental en la modulación

de la excitabilidad neuronal (Gan y Kaczmarek, 1998). En este

sentido, se ha constatado una regulación de la isoforma Kv3.1b en la

subpoblación de interneuronas hipocampales que expresan

parvalbúmina, apareciendo ambas proteínas de forma simultánea.

Además, la proteína Kv3.1b predominante se expresa de manera

selectiva en los somas, dendritas proximales y axones de esas células

localizadas en la capa piramidal o en su proximidad (Du y cols.,

1996). De hecho, los registros electrofisiológicos en interneuronas de

la capa piramidal se asemejan a los de los canales formados por esta

subunidad en otras neuronas. La subunidad Kv3.1b en hipocampo es

detectado por primera vez en el octavo día postnatal (P8). Esta señal

alcanza un máximo de intensidad en P14 y se mantiene hasta P40.

Por otra parte, el aumento de las corrientes de potasio Kv en

neuronas medulares de embriones de Xenopus durante el desarrollo,

es crítico para la maduración de la excitación y de la onda del

potencial de acción. En este sentido, se ha demostrado que la

inyección de oligonucleótidos antisentido de Kv3.1 en estos

embriones reduce de forma espectacular los niveles de ARNm de

Kv3.1 en la médula espinal en desarrollo, lo cual acarrea una

24


reducción de la activación de la corriente de potasio Kv en esas

mismas neuronas cultivadas maduras. La corriente en estas

neuronas se asemeja a la existente en un estadio temprano de la

diferenciación, previo a la aparición del ARNm codificante para

Kv3.1 (Vincent y cols., 2000).

El gen Kv3.1 codifica dos proteínas distintas, las subunidades

Kv3.1a y Kv3.1b, formas corta y larga respectivamente (Luneau y

cols., 1991). Las dos proteínas comparten homología de secuencia en

su terminal amino, pero difieren en el terminal carboxilo (Perney y

cols., 1992). Ambas isoformas expresadas en ovocitos comparten

similares propiedades electrofisiológicas y farmacológicas (Schröter y

cols., 1991; Critz y cols., 1993). El ARNm que codifica para Kv3.1a es

menos abundante que la isoforma Kv3.1b. De todos modos, los

patrones de expresión de las variantes a y b son similares y está

claro que ambas coexisten en varios tipos neuronales. Generalmente,

Kv3.1b constituye la variante predominante en el cerebro adulto,

mientras que Kv3.1a está sobre todo en neuronas embrionarias y

perinatales (Perney y cols., 1992; Du y cols, 1996) y se expresa

predominantemente en axones. Existen excepciones como las células

mitrales del bulbo olfatorio y las neuronas mesencefálicas del

25


trigémino, en las que el Kv3.1a se expresa en las membranas de

somas y dendritas (Ozaita y cols., 2002).

ARNm codificante para Kv3.3

La distribución del ARNm que codifica para Kv3.3 es amplia

por todo el cerebro, siendo especialmente abundante en el tronco del

encéfalo y cerebelo (Figura 3).

La señal de hibridación del ARNm de Kv3.3 es heterogénea,

siendo especialmente fuerte en las astas ventral y dorsal de la

médula espinal, y en las células de Purkinje, así como en las células

granulares de la corteza cerebelosa y en las poblaciones neuronales

de los núcleos cerebelosos profundos (Figura 3). También se detecta

expresión del ARNm para Kv3.3 en diversos centros del tronco del

encéfalo, como la zona incerta, los núcleos oculomotores, el colículo

inferior, el núcleo rojo, los núcleos pontinos, el núcleo motor del

trigémino y los núcleos vestibulares (Figura 3). Sin embargo, su

distribución es mucho menor en otras zonas del encéfalo e incluso, a

veces, inexistente. Este es el caso de los ganglios basales (putamen y

globo pálido), septum, tálamo dorsal, epitálamo e hipocampo (Weiser

y cols., 1994; Chang y cols., 2007).

26


Distribución de las proteínas Kv3.1 y Kv3.3 en el SNC

Los canales de potasio juegan un papel primordial en la

regulación de diversos aspectos de la excitabilidad neuronal. Estos

canales están especialmente bien diseñados para una gran variedad

de funciones, debido a la gran diversidad de tipos de canales que

existen. Esta diversidad contribuye a la habilidad de algunas

neuronas (y posiblemente de diferentes compartimentos de una

misma neurona) de responder de manera única a un estímulo

recibido. La integración neuronal depende de la respuesta local de

las aferencias que se encuentran espacialmente segregadas y que

llegan a la célula, así como de la comunicación que se da entre estos

centros de integración con el axón. Por tanto, las implicaciones

funcionales de los canales de potasio varían dependiendo de su

precisa localización en la superficie neuronal (Weiser y cols., 1995).

Los canales de potasio dependientes de voltaje Kv3.1 y Kv3.3 están

ampliamente expresados en el cerebro, en especial en las áreas

implicadas en el control de la actividad motora y en áreas conocidas

por regular los estados de excitación (Espinosa y cols., 2004), como ya

hemos descrito.

Las proteínas Kv3 se distribuyen a lo largo de todo el SNC y

generalmente se coexpresan con otras proteínas Kv3, dando lugar a

27


patrones de expresión similares. Este hecho sugiere que las

proteínas Kv3 forman frecuentemente parte de los complejos de

canales heteromultiméricos, como es el caso de las subunidades

Kv3.1 y Kv3.3 que a menudo se coexpresan. Sin embargo, la

distribución de las proteínas Kv3.1 y Kv3.3 a lo largo de las

estructuras del cerebro no es idéntica, en consonancia con los

patrones de expresión de sus correspondientes tránscritos de ARNm

(Weiser y cols., 1994).

Proteína Kv3.1

Estudios inmunocitoquímicos en secciones de cerebro de rata

(Weiser y cols., 1995; Hernández-Pineda y cols., 1999; Rudy y

McBain, 2001) han demostrado la localización selectiva de Kv3.1b en

células granulares del cerebelo, neuronas de proyección de los

núcleos cerebelosos profundos, porción reticular de la sustancia

negra, globo pálido y tálamo ventral (núcleo reticular talámico,

núcleo geniculado ventral lateral y zona incerta). La isoforma Kv3.1b

se encuentra además presente en varios centros nerviosos implicados

en el procesamiento de señales auditivas, como son el colículo

inferior, núcleos del lemnisco lateral, la oliva superior, el núcleo

medial del cuerpo trapezoide y algunas partes de los núcleos

cocleares (Weiser y cols., 1995; Härtig y cols., 2001). La

28


inmunorreactividad frente a Kv3.1 también se localiza en otros

grupos neuronales del tronco del encéfalo (núcleo oculomotor común,

núcleos pontinos, núcleo reticulotegmental del puente, núcleos

vestibular y trigeminal y formación reticular) (Metzger y cols., 2002).

El uso de técnicas de inmunofluorescencia de doble marcado con

anticuerpos frente a la proteína Kv3.1b y la proteína ligadora de

calcio parvalbúmina o el neuropéptido somatostatina, ha puesto de

manifiesto que Kv3.1 está localizado en aproximadamente el 80% de

las interneuronas inhibidoras gabaérgicas que contienen

parvalbúmina (Weiser y cols., 1995; Du y cols., 1996; Sekirnjak y

cols., 1997) caracterizadas por ser de disparo rápido. En el

hipocampo, Kv3.1b se localiza en las células en cesto, aunque

también se encuentra en otras interneuronas positivas frente a

calbindina en el estrato oriens, y en algunas células que no contienen

proteínas ligadoras de calcio (Sekirnjak y cols., 1997). En la

neocorteza, la mayoría de las interneuronas positivas frente a

parvalbúmina que expresan el canal Kv3.1b (Weiser y cols., 1994,

1995; Du y cols., 1996), corresponden a células bipolares, en cesto y

en candelabro (Sekirnjak y cols., 1997). Por el contrario, Kv3.1b no se

encuentra en interneuronas positivas frente a la somatostatina.

29


Finalmente, no todas las neuronas Kv3.1b positivas tienen el

canal en sus axones. Por ejemplo, a pesar de que muchas poblaciones

neuronales están fuertemente marcadas (como los núcleos pontinos,

el núcleo reticulotegmental del puente y la formación reticular) que

proyectan fibras musgosas al cerebelo, no hay evidencias de marcado

en estas fibras.

Localización subcelular de Kv3.1

La subunidad Kv3.1b se localiza predominantemente en

membranas celulares de somas y axones (especialmente en campos

axónicos terminales), pero también en arborizaciones dendríticas (Du

y cols., 1996; Weiser y cols., 1995) y en protrusiones espinosas

adyacentes a membranas postsinápticas (Wang y cols., 1998b).

Mediante el empleo de técnicas inmunocitoquímicas para

microscopía electrónica, se ha observado que la proteína Kv3.1 está

concentrada en núcleos auditivos del tronco del encefálo, donde

aparece delineando los cuerpos celulares y el neuropelo. También se

encuentra asociada al retículo endoplásmatico y a cisternas del

aparato de Golgi. En el núcleo medial del cuerpo trapezoide, además

del habitual marcado en somas celulares, procesos dendríticos y

espinas, se ha observado marcado en las terminales presinápticas,

30


incluidos los cálices de Held (Elezgarai y cols., 2003). La localización

dual de Kv3.1, tanto presináptica como postsináptica, sugiere que

esta subunidad participa en la modulación de la transmisión

sináptica rápida en la vía auditiva. En el caso de la neocorteza y del

hipocampo, las células piramidales no son inmunorreactivas (como

ya se observaba a nivel de microscopía de luz), pero estas neuronas

aparecen delineadas por terminales presinápticas de interneuronas

que expresan Kv3.1b (Sekirnjak y cols., 1997). En el cerebelo, sólo las

células granulares contienen la subunidad que, al igual que las

interneuronas neocorticales e hipocampales, presentan la

inmunotinción distribuida en las membranas somáticas, axónicas y

en el citoplasma adyacente, así como en las porciones más

proximales de los procesos dendríticos (Sekirnjak y cols., 1997). Sin

embargo, existen pruebas electrofisiológicas y farmacológicas de la

presencia de canales Kv3 en las terminales sinápticas de las células

en cesto alrededor de los somas de las células de Purkinje (Southan y

Robertson, 2000).

Proteína Kv3.3

Su patrón de distribución más destacado se encuentra en el

tronco del encéfalo y la corteza cerebelosa (Chang y cols., 2007). La

proteína Kv3.3 se localiza en las células de Purkinje y en las células

31


granulares. Las estructuras cerebrales en general muestran una

inmunorreactividad más débil. Por otro lado, se observa marcaje de

moderado a fuerte en el bulbo olfatorio, el hipocampo y el núcleo

reticular talámico (Chang y cols., 2007). Con frecuencia, la

subunidad Kv3.3 aparece tanto en el soma como en el neuropelo de la

misma estructura. La inmunorreactividad para Kv3.3 también es

muy pronunciada en la formación reticular, en los núcleos motores

troncoencefálicos y en la médula espinal (Chang y cols., 2007).

Además, Kv3.3 se localiza ampliamente en el tronco del encéfalo, del

mismo modo que la proteína Kv3.1b (Weiser y cols., 1995; Li et al.,

2001), sobre todo en los centros auditivos (Chang y cols., 2007). Por

tanto, al igual que en el cerebro anterior y el cerebelo, Kv3.3 y

Kv3.1b pueden ser componentes de un canal heteromultímero en

muchas de estas poblaciones neuronales.

La proteína Kv3.3 está por lo general asociada a somas y

axones. Casi todas las poblaciones neuronales del cerebro anterior y

mesencéfalo que contienen Kv3.3, corresponden al sistema inhibidor

gabaérgico.

32


Figura 4. Maquinaria que integra la unidad neuronal del cerebelo. El cerebelo

contiene numerosos módulos, cada uno de los cuales está integrado por circuitos

neuronales uniformemente estructurados. En el dibujo aparecen las conexiones

neuronales más representativas de la unidad cerebelosa. 5-HT: fibras serotoninérgicas;

BC: célula en cesto; CN/VN núcleos cerebelosos profundos/núcleos vestibulares; Go:

célula de Golgi; Gr: célula granular; IO: oliva inferior; Lg: célula de Lugaro; MF: fibra

musgosa; N-C; proyección núcleo-cortical; N-O: proyección núcleo-olivar; PCN: núcleo

precerebeloso; Pd: fibra peptidérgica; pRN: porción parvocelular del núcleo rojo; R-O:

proyección rubro-olivar; SC: célula estrellada; UB: célula unipolar en pincel. Ito

(2008).

CIRCUITOS NEURONALES DEL CEREBELO

Las conexiones neuronales del cerebelo están constituidas por

axones aferentes, que transmiten la información de otras partes del

SNC al cerebelo; circuitos cerebelosos intrínsecos corticales y

nucleares que integran y procesan la información, y axones eferentes

que transmiten la información procesada a otras partes del SNC

(Figura 4).

33


Las fibras aferentes alcanzan la corteza cerebelosa tras dar

colaterales para los núcleos cerebelosos profundos y los núcleos

vestibulares. A su vez, la información es procesada en los circuitos

intrínsecos de la corteza cerebelosa, y el resultado es enviado por los

axones de las células de Purkinje a los núcleos profundos. En estos

núcleos la información es de nuevo procesada, surgiendo a partir de

ellos las fibras eferentes del cerebelo tanto en dirección ascendente

(tálamo, corteza cerebral), como descendente (médula espinal)

(Figura 4).

Los circuitos inhibidores de la corteza cerebelosa están

constituidos por tres tipos fundamentales de interneuronas: las

células de Golgi, las células estrelladas y las células en cesto (Figura

4). Pueden actuar directamente sobre las células de Purkinje (como

lo hacen las células estrelladas y las células en cesto), o

indirectamente a través de las células granulares, como en el caso de

las células de Golgi. Todas estas interneuronas utilizan GABA como

neurotransmisor inhibidor. Las células estrelladas y las células en

cesto son estimuladas por las fibras paralelas, y son las encargadas

de modular la activación de las células de Purkinje por las fibras

trepadoras produciendo un fenómeno de inhibición lateral. Esta

inhibición lateral hace más precisa la señal que llega a las células de

34


Purkinje, de la misma manera que otros mecanismos de inhibición

lateral acentúan el contraste de las señales en otros muchos circuitos

neuronales de sistema nervioso.

Las células de Golgi reciben estímulos excitadores de las fibras

paralelas y, en menor cantidad, por las células de Lugaro (Figura 4).

Actúan a nivel de los glomérulos cerebelosos haciendo sinapsis Gray

tipo II (inhibidoras) sobre las dendritas de las células granulares.

Mediante estas sinapsis modulan la activación de las células

granulares por las fibras musgosas y, por consiguiente, regulando la

actividad de las células de Purkinje. Así, las células de Golgi crean

un circuito de retroalimentación negativa para las células

granulares.

El circuito funcional básico del cerebelo queda constituido por

dos arcos: uno principal o excitador, que pasa por los núcleos

profundos, y otro secundario o inhibidor, que pasa por la corteza

cerebelosa y regula al anterior (Figura 5). Este circuito se repite

unas 30 millones de veces en todo el cerebelo y está formado por las

células de Purkinje y las neuronas nucleares de proyección

correspondientes, así como las interneuronas relacionadas con ellas.

35


Arco principal

El arco principal está constituido por las ramas colaterales de

las fibras musgosas y trepadoras, que terminan en las neuronas de

los núcleos profundos. Los axones de las neuronas de proyección de

los núcleos profundos salen del cerebelo a través de los pedúnculos

cerebelosos, para terminar en diferentes núcleos del tronco del

encéfalo y en el tálamo (Figura 5).

En los núcleos profundos hay sinapsis axosomáticas y, sobre

todo, sinapsis axodendríticas entre terminales sinápticas de las

colaterales axónicas de las fibras musgosas y trepadoras (elemento

presináptico) y una dendrita de una neurona de proyección o una

interneurona de los núcleos profundos (elemento postsináptico). Las

fibras musgosas y las fibras trepadoras usan el neurotransmisor

glutamato, aunque también pueden tener otros neurotransmisores.

Desde el punto de vista funcional, los núcleos profundos del

cerebelo poseen dos tipos básicos de neuronas de proyección: unas

neuronas pequeñas gabaérgicas (inhibidoras) que mandan su axón

hacia la oliva inferior, y otras neuronas glutamatérgicas

(excitadoras) que mandan sus axones a otros centros nerviosos.

36


Figura 5. Organización sináptica del módulo

básico de circuito cerebeloso. Las fibras musgosas

y trepadoras transmiten eferencias del cerebelo

mediante un arco excitador principal que pasa por los

núcleos profundos. Este arco está regulado por otro

inhibidor secundario que pasa a través de la corteza

cerebelosa. Kandel y cols., Principios de Neurociencia.

Mc Graw-Hill-Interamericana (2001).

Las neuronas de proyección de los núcleos profundos en

condiciones normales disparan permanentemente, a una frecuencia

de más de 100

potenciales de acción

por segundo. Esta

frecuencia puede

modularse al alza o a

la baja, dependiendo de

las señales excitadoras

e inhibidoras que

lleguen a la neurona.

Las señales excitadoras

provienen sobre todo de

las colaterales axónicas

de las fibras musgosas

y trepadoras, mientras

que las señales inhibidoras proceden de los axones de las células de

Purkinje, que forman parte del arco secundario. El equilibrio entre

estos dos efectos es ligeramente favorable a la excitación, lo que

explica por qué la frecuencia de descargas de las neuronas de

proyección se mantiene relativamente constante a un nivel moderado

de estimulación contínua.

37


Arco secundario

El arco secundario pasa a través de la corteza cerebelosa y está

constituido en torno a una pieza neuronal fundamental: la célula de

Purkinje. En la célula de Purkinje terminan dos tipos de circuitos:

los circuitos excitadores o principales, que son los que la estimulan, y

los circuitos inhibidores, formados por interneuronas inhibidoras.

Finalmente, los axones de las células de Purkinje proyectan sobre las

neuronas de los núcleos cerebelosos y vestibulares, ejerciendo sobre

ellos una acción inhibidora mediante sinapsis gabaérgicas. De esta

forma se modula y regula el arco principal excitador (Figura 5).

Las células de Purkinje se estimulan por dos vías distintas:

mediante las fibras trepadoras (vía directa) y las fibras musgosas

(vía indirecta) (Figura 5). Las fibras trepadoras, al terminar sobre el

soma y el árbol dendrítico de las células de Purkinje, producen una

estimulación directa y muy específica mediante sinapsis Gray tipo I

(excitadora) que utilizan el neurotransmisor glutamato. Al formar

múltiples contactos con cada célula de Purkinje, una sola fibra

trepadora produce una acción excitadora mucho más eficaz que las

fibras musgosas.

38


Las fibras musgosas no actúan de forma directa sobre las

células de Purkinje, sino que lo hacen a través de las células

granulares excitadoras. A nivel del glomérulo cerebeloso, las fibras

musgosas hacen sinapsis excitadoras sobre las dendritas de las

células granulares y los impulsos son vehiculizados por las fibras

paralelas hasta alcanzar las espinas dendríticas de las células de

Purkinje. Las fibras hacen sinapsis excitadoras asimétricas, que

acumulan vesículas esféricas con glutamato en su interior. En

conjunto, las fibras musgosas actúan sobre las células de Purkinje

con una amplia convergencia y divergencia, estableciendo por tanto

conexiones más inespecíficas que las fibras trepadoras.

Las células de Purkinje no cumplen el principio de que todos los

potenciales de acción producidos por una neurona son iguales, ya que

presentan dos tipos de potenciales de acción distintos dependiendo

de la vía de estimulación. Si se estimulan directamente a través de

las fibras trepadoras, generan una despolarización prolongada y un

potencial de acción de pico complejo con una frecuencia de descarga

de 3 o 4 herzios. La estimulación de las células de Purkinje a través

de la vía indirecta de las fibras musgosas, genera en ellas un

potencial de acción breve denominado pico sencillo, con una

frecuencia de descarga de 100 a 200 herzios. Para generar un pico

39


Figura 6. Circuito cerebeloso simplificado (sin interneuronas ni neuronas inhibidoras

de los núcleos profundos -DCN- proyectantes a la oliva inferior) ilustrando la

dirección del flujo de información y la localización de los canales Kv3. Las aferencias

cerebelosas musgosas (mossy fibers) y trepadoras (climbing fibers) estimulan las neuronas de

DCN y la corteza, donde las fibras trepadoras estimulan las células de Purkinje, y las células

granulares excitadas por fibras musgosas hacen lo propio sobre las células de Purkinje a través

de las fibras paralelas. Las células de Purkinje, por su parte, inhiben las neuronas de los núcleos

profundos propiciando la recuperación de la excitación. Hurlock y cols. (2009).

sencillo, es necesaria la suma temporal y espacial de la estimulación

producida por varias fibras paralelas. Por lo tanto en conjunto, la

información aportada por los dos tipos de fibras extrínsecas

(trepadoras y musgosas) que llegan al cerebelo, es diferente y es

procesada de manera distinta.

Localización de Kv3.1 y Kv3.3 en la corteza cerebelosa

Kv3.1b y Kv3.3 se localizan ampliamente en la corteza

cerebelosa, como hemos visto anteriormente, donde colocalizan en

varios tipos celulares (Figura 6).

40


La inmunorreactividad para Kv3.3 en la capa molecular

coincide con el patrón de marcado de la calbindina en dendritas

proximales, lo que concuerda con la localización de Kv3.3 en

dendritas de células de Purkinje. En la parte más distal de sus

arborizaciones dendríticas, Kv3.3 sólo se colocaliza parcialmente con

la calbindina (Martina y cols., 2003). Por otra parte, las fibras

paralelas expresan mucho Kv3.3 (McMahon y cols., 2004), lo que

concuerda con la expresión del ARNm en las células granulares

(Goldman-Wohl y cols., 1994; Weiser y cols., 1994; MacMahon y cols.,

2004).

Existen evidencias de la localización de Kv3.1b en axones de la

corteza cerebelosa. La capa molecular es muy inmunopositiva para

Kv3.1b (Alonso-Espinaco y cols., 2008). La intensidad del marcado es

mayor que la observada en la capa granular, a pesar de ser donde se

concentra el ARNm (Weiser y cols., 1994). Este marcado se debe al

entramado de fibras paralelas, los axones de las células granulares

(Alonso-Espinaco y cols., 2008). Las colaterales de las fibras

paralelas también son inmunopositivas para Kv3.1b produciendo un

patrón de finas líneas horizontales. Las células en cesto y

estrelladas, así como las dendritas de las células de Purkinje de la

capa molecular son inmunonegativas para Kv3.1b (McMahon y cols.,

2004).

41


El marcado de Kv3.3 se observa en las capas molecular, de

Purkinje y granular del cerebelo, pero es especialmente sobresaliente

en los somas de las células de Purkinje y en la capa molecular

(McMahon y cols., 2004; Chang y cols., 2007; Alonso-Espinaco y cols.,

2008). Los axones de las células de Purkinje tienen este canal en su

trayecto por la capa granular en dirección a la sustancia blanca

cerebelosa. Kv3.3 también se localiza en porciones proximales de las

dendritas primarias de las células de Purkinje (Chang y cols., 2007).

Es posible que las fibras paralelas contengan Kv3.3, dada su

presencia en los somas de las células granulares. Este es un objetivo

de la presente Tesis Doctoral.

42


HIPÓTESIS DE TRABAJO

43


Figura 7. Trayectorias de la marcha de ratones

silvestres (WT1949) y de ratones que carecen de Kv3.1 y

Kv3.3 (DKO1684). Obsérvese el aumento de las fluctuaciones

respecto al centro, indicando una ataxia severa en los ratones

DKO. Matsukawa y cols. (2003).

HIPÓTESIS DE TRABAJO

Como ya ha sido explicado, las subunidades de los canales de

potasio dependientes de voltaje Kv3.1 y Kv3.3 poseen un alto umbral

de activación que tiene lugar durante la fase ascendente del

potencial de acción, modelando así su repolarización (Rudy y

McBain, 2001). Los ratones que carecen de Kv3.1 y Kv3.3 presentan

deficiencias motoras (temblor, mioclonias, ataxia severa), y son muy

sensibles al alcohol (Espinosa y cols., 2001). Sin embargo, los ratones

que carecen sólo de Kv3.1 o Kv3.3 no exhiben alteraciones

manifiestas de la función motora (Chan, 1997; Ho y cols., 1997,

Sánchez y cols., 2000). En comparación con otras regiones cerebrales,

la expresión de los ARN mensajeros codificantes para Kv3.1 y Kv3.3

44


A CB

1

FWHM

0.0

-0.4

F/F

[%

]

2 3

200 µm

D1.61.51.41.31.21.11.00.90.80.7

WT Kv3.1,3.3 -/-,+/- Kv3.1,3.3 -/-,-/-

E F

*

1

2

3

V VI

0.0

0.5

1.0

1.5

* * * * ** * * * *

WTKv3.1,3.3 -/-,+/-Kv3.1,3.3 -/-,-/-

1 ms

*

WT TM

FW

HM

[m

s]

* *

DKO

G

50 850 16500.5

1.0

1.5

2.0

FW

HM

[m

s]

Distance ( m)

WTKv3.1,3.3 -/-,-/-

Figura 8. Mapas en códigos de colores de la amplitud de los potenciales de

acción de un ratón silvestre (WT), de un ratón que carece los dos alelos de Kv3.1 y uno de

Kv3.3 (Kv3.1,3.3-/-,+/) y de un ratón que carece de los dos genes (Kv3.1,3.3-/-,-/-).

Matsukawa y cols. (2003).

es muy importante en la corteza cerebelosa, lo que induce a pensar

que al menos algunas de las anomalías motoras observadas en los

ratones que carecen Kv3.1 y Kv3.3 podrían ser debidas a una

disfunción cerebelosa.

Las células granulares de la corteza cerebelosa contienen

ambas subunidades Kv3.1 y Kv3.3 (Weiser y cols., 1994; Grigg y

cols., 2000; Li y cols., 2001; Rudy y McBain, 2001), por lo que es

posible que debido a ello y a sus características biofísicas similares,

se dé una situación de redundancia funcional, que explicaría la falta

de cambios fenotípicos severos en ratones que carecen solamente de

Kv3.1 o Kv3.3. Las alteraciones motoras severas mencionadas son la

consecuencia de la alteración de la transmisión sináptica entre fibras

45


A CB

1

FWHM

0.0

-0.4

F/F

[%

]2 3

200 µm

D1.61.51.41.31.21.11.00.90.80.7

WT Kv3.1,3.3 -/-,+/- Kv3.1,3.3 -/-,-/-

E F

*

1

2

3

V VI

0.0

0.5

1.0

1.5

* * * * ** * * * *

WTKv3.1,3.3 -/-,+/-Kv3.1,3.3 -/-,-/-

1 ms

*

WT TM

FW

HM

[m

s]

* *

DKO

G

50 850 16500.5

1.0

1.5

2.0

FW

HM

[m

s]

Distance ( m)

WTKv3.1,3.3 -/-,-/-

Figura 9. E: Anchura de los potenciales de acción trazados versus la

distancia del electrodo de estimulación en preparación de corteza cerebelosa de

ratón silvestre (WT) y doble Kv3.1 y Kv3.3 knockout (Kv3.1,3.3-/-,-/-). Nótese un

pequeño aumento en la anchura del potencial de acción medido cuanto más

alejado del lugar de estimulación, lo que indica unas velocidades de conducción

no homogéneas de los potenciales de acción. F: Media ± SEM de la forma de los

potenciales de acción. G: Media ± SEM de la anchura de los potenciales de

acción. Matsukawa y cols. (2003).

paralelas y células de Purkinje, y dependen del número de alelos de

Kv3.1 y Kv3.3 suprimidos genéticamente (Matsukawa y cols., 2003).

(Figuras 7, 8, 9).

Según la localización subcelular, ambas subunidades estarían

implicadas en la fase de repolarización de los potenciales de acción.

La alteración de la repolarización de los potenciales de acción

axónicos afecta la capacidad de mantener el disparo de potenciales

de acción de alta frecuencia (Rudy y McBain, 2001), así como la

fiabilidad y plasticidad a corto plazo en las sinapsis de las fibras

paralelas con las células de Purkinje (Sabatini y Regehr, 1997;

Zucker y Regehr, 2002).

46


En base a estos hallazgos fisiológicos, nos planteamos la

hipótesis de la existencia de una colocalización de Kv3.1 y Kv3.3 en

compartimentos subcelulares neuronales dispuestos en la capa

molecular de la corteza cerebelosa, en particular, en las fibras

paralelas. Esta colocalización sería fundamental en la actividad

fisiológica de las sinapsis de los axones de las células granulares con

las células de Purkinje, viéndose seriamente alterada al faltar

alguna de estas subunidades de Kv3.

47


OBJETIVOS

48


OBJETIVOS

En base a la hipótesis propuesta, nos planteamos los siguientes

objetivos en esta Tesis Doctoral:

Estudiar la localización subcelular de Kv3.1 y Kv3.3 en la

capa molecular de la corteza cerebelosa de la rata, empleando

métodos inmunocitoquímicos de alta resolución para microscopía

electrónica.

Determinar semicuantitativamente la densidad de

inmunomarcado de ambas subunidades de canales de potasio en

aquellos compartimentos subcelulares en los que se localicen.

49


MATERIAL Y MÉTODOS

50


MATERIAL Y MÉTODOS

Los procedimientos empleados en esta Tesis Doctoral se han

ajustado estrictamente al cumplimiento de la normativa vigente en

materia de investigación para la protección de los animales

utilizados en experimentación y otros fines científicos (Real Decreto

1201/2005; BOE 21-10-2005), y aprobados por el Comité de Ética de

Bienestar Animal de la UPV/EHU (CEBA/94/2010/GRANDES

MORENO).

Introducción a las técnicas inmunocitoquímicas

En este trabajo utilizamos técnicas inmunocitoquímicas en

combinación con anticuerpos específicos frente a secuencias

peptídicas del fragmento intracelular carboxilo de las subunidades

de los canales de potasio Kv3.1b y Kv3.3. Las técnicas

inmunocitoquímicas se basan en la capacidad específica de los

anticuerpos para unirse al antígeno y en el uso de marcadores de los

anticuerpos. Concretamente, de cara a determinar inicialmente la

localización celular de las subunidades a nivel de microscopía de luz,

utilizamos el método de la avidina-biotina-peroxidasa (Hsu y cols.,

1981) junto con anticuerpos específicos frente a Kv3.1b y Kv3.3.

Este método de la avidina-biotina-peroxidasa (Figura 10) se

basa en la gran afinidad que presentan las moléculas de avidina y

51


biotina entre sí. La avidina es una glicoproteína de elevado peso

molecular (68 kilodal-

tons) presente en

grandes cantidades en la

clara de huevo. Está

formada por cuatro

subunidades compuestas

cada una de ellas por

una cadena sencilla de

128 aminoácidos, que

configuran una estructura terciaria con cuatro regiones hidrófobas

de unión a la biotina. Además, la avidina se puede utilizar como

puente entre diferentes moléculas biotiniladas, como son, en este

caso, el anticuerpo y la peroxidasa.

Por su parte, la biotina es una vitamina de bajo peso molecular

(244 daltons) perteneciente al complejo B (vitamina H) que se

encuentra presente en la yema de huevo, además de en numerosos

tejidos animales y en vegetales. La biotinilación es un proceso

bioquímico que permite conjugar la biotina a diferentes moléculas,

tales como enzimas, lectinas, anticuerpos o ácidos nucleicos, entre

otros. Durante este proceso, la biotina es transformada previamente

Figura 10. Esquema de los pasos de la técnica

inmunocitoquímica de la avidina-biotina-

peroxidasa para microscopía de luz. DAB: 3-3´-

diaminobencidina.

52


en una molécula activa a través de una esterificación en la cual su

grupo carboxílico queda unido de forma covalente a residuos NH2

proteicos. Esta posibilidad de obtener múltiples asociaciones permite

una gran variedad de reacciones citoquímicas de localización. El

pequeño tamaño de la biotina hace que el proceso de biotinilación no

modifique las propiedades inmunológicas, enzimáticas o físicas de las

moléculas marcadoras. Esto ofrece una gran variedad de

posibilidades a la hora de unir a cualquier molécula varias biotinas,

lo cual dota de una elevada sensibilidad a las técnicas que utilizan

esta vitamina. El número de moléculas de biotina que pueden unirse

a un anticuerpo se estima del orden de 150, por lo que se puede

incubar el anticuerpo primario a concentraciones muy bajas.

Con respecto a la técnica propiamente dicha, el tejido se incuba

con un anticuerpo primario frente a la proteína (subunidad de canal)

que queremos detectar. Sobre éste se aplica un segundo anticuerpo

biotinilado. El anticuerpo biotinilado se une a un complejo formado

por avidina conjugada a peroxidasa biotinilada. El cromógeno que se

emplea más habitualmente es la 3,3´-diaminobencidina (DAB), la

cual se oxida en un medio que contiene tanto la peroxidasa del

complejo avidina-biotina como el peróxido de hidrógeno, dando lugar

a un producto de reacción de color marrón (Figura 10).

53


Figura 11. Esquema de los pasos de la técnica

de inmuno-oro preinclusión para microscopía

electrónica. Fab: fragmento de unión de la

inmunoglobulina.

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es investigar la

distribución subcelular de las subunidades de los canales de potasio

Kv3.1b y Kv3.3 a nivel de

microscopía electrónica.

Este propósito se aborda

mediante un método de

inmuno-oro preinclusión

(Figura 11). La alta

precisión y resolución de

esta técnica se fundamenta

en la conjugación del

segundo anticuerpo a una partícula de oro, la cual permite, al ser

examinada en un microscopio electrónico, determinar el lugar de

localización de la proteína. Tiene la ventaja de que al ser un método

preinclusión, la reacción antígeno-anticuerpo no presenta problemas

con el osmio ni con la polimerización a 60ºC de las resinas. Otro

aspecto a favor es la utilización de partículas de oro de 1,4

nanómetros conjugadas a fracciones Fab’ de los anticuerpos

secundarios. Estas características permiten una mayor penetración

del anticuerpo en el tejido, aumentando así la sensibilidad del

método. Después de la unión antígeno-anticuerpo, las pequeñas

partículas de oro se intensifican con plata para aumentar su tamaño

y hacerlas visibles en el microscopio electrónico (Figura 11).

54


Anticuerpos policlonales primarios empleados en

el estudio

• Anti-Kv3.1b (clon Kcnc1), Alomone Labs. Jerusalén, Israel.

La secuencia peptídica que reconoce este antisuero es

CKESPVIAKYMPTEAVRVT, que corresponde a los aminoácidos

567-585 del extremo carboxilo terminal intracelular de la isoforma

Kv3.1b de la rata. Ha sido producido en conejo y presenta reactividad

en rata, ratón, mono y perro. Peso molecular de la proteína que

reconoce: 97 kDa.

• Anti Kv3.3 (clon KNC3), Alomone Labs. Jerusalén, Israel.

Este anticuerpo policlonal ha sido sintetizado frente a la

secuencia peptídica KSPITPGSRGRYSRDRAC, que corresponde a

los aminoácidos 701-718 del extremo carboxilo terminal intracelular

de la subunidad Kv3.3 de la rata. Ha sido producido en conejo y

presenta reactividad en rata y ratón. Peso molecular de la proteína

que reconoce: 120 kDa.

55


Técnica inmunocitoquímica para microscopía de luz

Técnica de la avidina-biotina peroxidasa

En este trabajo hemos utilizado ratas albinas (Sprague-Dawley,

200-250gr, n=12) sedadas con hidrocloruro de ketamina (25 mg/kg,

inyección intramuscular) y anestesiadas con pentobarbital sódico

(60mg/kg, inyección intraperitoneal), tras lo cual fueron prefundidas

a través del ventrículo izquierdo con tampón fosfato salino (TFS, pH

7,4, temperatura ambiente) durante 20 segundos, seguido por 1 litro

de una solución fijadora de 4% de formaldehído (preparado a partir

de paraformaldehído) y 0,2% de una solución saturada de ácido

pícrico en tampón fosfato (TF, 0,1M, pH 7,4, temperatura ambiente)

durante 15 minutos. A continuación, procedimos:

1. Extracción de los cerebros.

2. Crioprotección: sacarosa 15% peso/volumen en TF (0,1M) y a

continuación sacarosa 30% en TF.

3. Corte de secciones de tejido de 30 m de grosor, recogidas en pocillos

con TFS a temperatura ambiente.

4. Preincubación con suero normal de cabra (SC) al 1,5% en TFS

durante 1 hora.

5. Incubación con antisuero primario: Kv3.1b: 0,60 g/ml 1,5%

(SC)/TFS; Kv3.3: 2 g/ml 1,5% (SC)/TFS. Tiempo de incubación del

tejido con los antisueros primarios: 48 horas.

6. Lavado de secciones flotantes: en TFS durante 1 hora.

7. Incubación con el anticuerpo secundario biotinilado (IgG anti-conejo

sintetizado en cabra. Vector Laboratories Inc. Burlingame,

Califonia, EE.UU.): 1:200 en TFS durante 1 hora.

8. Lavado de las secciones flotantes: en TFS durante 1 hora.

9. Incubación con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC; Elite,

Vector Laboratories Inc. Burlingame, Califonia, EE.UU.):

previamente mezclado (1:50), durante 1 hora.

10. Lavado de las secciones en TFS.

11. Preincubación con 3,3'-diaminobencidina (DAB; Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO, USA) al 0,05% en TF durante 5 minutos.

56


12. Incubación con DAB al 0,05% en TF más peróxido de hidrógeno al

0,01% durante 5 minutos (o el tiempo óptimo de reacción

determinado por el investigador).

13. Lavado de secciones en TF durante 30 minutos.

14. Montado de secciones sobre portaobjetos.

15. Secado.

16. Deshidratación en alcoholes de graduación creciente. 17. Las muestras se cubren usando el medio de montaje DPX

(Fluka,Chemie AG, Buchs, Suiza).

Técnica inmunocitoquímica para microscopía

electrónica

Método preinclusión de inmuno-oro intensificado con plata

Ratas albinas (Sprague-Dawley, 200-250gr, n=18) previamente

sedadas y anestesiadas como ya hemos mencionado, fueron

perfundidas transcardiacamente con una mezcla fijadora fría de

formaldehído al 4%, ácido pícrico al 0,2% y glutaraldehído al 0,025%

en tampón fosfato (0,1M, pH 7,4). El protocolo aplicado fue el

siguiente:

1. Extracción de los cerebros.

2. Lavado de los bloques de tejido en TF durante 3 horas.

3. Crioprotección: inmersión en una solución de sacarosa al 15%,

seguida por otra al 30% en TFS.

4. Paso rápido por nitrógeno líquido (varios segundos).

5. Corte en vibrotomo de secciones de 70 m de grosor.

6. Preincubación de secciones flotantes en suero normal de cabra al 20%

en TFS durante 1 hora a temperatura ambiente.

7. Incubación con antisueros primarios frente a Kv3.1b (0,60 g/ml

1,5%(SC)/TFS), o Kv3.3 (2 g/ml 1,5%(SC)/TFS), a 4ºC durante 2 o 3

días.

8. Lavados durante 1 hora en TFS.

9. Incubación con la fracción Fab' del anticuerpo secundario unido a una

partícula de oro de 1,4 nanómetros durante 2 horas, en agitación y a

4ºC (Nanoprobes Inc. Yaphank, Nueva York, EE.UU.), diluído 1:100

en suero normal de cabra al 1,5% en TFS.

10. Lavado de las secciones en TFS.

57


11. Postfijación con glutaraldehído al 1% durante 10 minutos en

agitación.

12. Lavado de las secciones en agua bidestilada.

13. Intensificación de las partículas de oro con plata, utilizando el

intensificador HQ Silver Kit (Nanoprobes Inc. Yaphank, Nueva York,

EE.UU.), durante 12 minutos.

14. Osmificación del tejido con tetraóxido de osmio al 2% durante 40

minutos.

15. Deshidratación en alcoholes de graduación creciente (50º, 70º, 96º y

100º).

16. Lavado con óxido de propileno.

17. Inclusión en resina Epon 812.

18. Polimerización de la resina (2 días en estufa a 60º C).

19. Corte de secciones de 50nm de grosor en ultramicrotomo.

20. Contraste con acetato de uranilo al 2% durante 30 minutos.

21. Contraste con citrato de plomo al 2,5% durante 30 minutos.

22. Observación en el microscopio electrónico.

Controles

Control de sustitución

Incubación del tejido con suero de cabra no inmunizada en lugar

del anticuerpo primario. El resto de los pasos inmunocitoquímicos

fueron similares y se realizaron en paralelo al tejido incubado con

antisuero primario. De esta manera, puede detectarse un posible

marcado por reacción cruzada del anticuerpo secundario y problemas

de precipitación inespecífica del cromógeno.

Control de preabsorción

Preincubación del antisuero primario con el péptido frente al

que ha sido sintetizado. Después el tejido es incubado con el

58


antisuero preabsorbido. En principio, este control determina si el

anticuerpo primario detecta otros antígenos además del deseado.

Control de reacción cruzada

Con el fin de descartar la posibilidad de reconocimiento de

ambas proteínas por cada uno de los dos antisueros frente a KV3.1b

y Kv3.3, cada uno de los anticuerpos fue preabsorbido con la

secuencia peptídica reconocida por el otro. La incubación del tejido

fue con las mismas concentraciones de los antisueros empleadas en

la inmunodetección tisular.

59


RESULTADOS

60


RESULTADOS

Patrón de distr ibución de Kv3.1b y Kv3.3 en la corteza cerebelosa de la rata en el microscopio de luz

La inmunorreactividad frente a las dos subunidades es muy

evidente en la corteza cerebelosa (Figuras 12, 13). En particular, la

capa molecular presenta una intensidad de marcado muy superior al

resto de capas que conforman la corteza (Figuras 12, 13).

Asimismo en la capa granular, la inmunorreación en las

membranas de los cuerpos celulares de las neuronas granulares es

mucho más intensa para Kv3.1b que en el caso de los somas

granulares teñidos con el anticuerpo frente a Kv3.3 (Figuras 12, 13).

Por el contrario, los cuerpos celulares de las neuronas de Purkinje

sólo son inmunopositivos para Kv3.3 (Figura 13).

En general, el patrón de inmunorreactividad observado tanto

para Kv3.1b como para Kv3.3 concuerda con lo descrito por otros

autores (Ozaita y cols, 2002; Chang y cols, 2007) y nosotros mismos

en el ratón (Alonso-Espinaco y cols., 2008).

61


Figura 12. Localización inmunocitoquímica de Kv3.1b en el cerebelo de la

rata. Método de la avidina-biotina-peroxidasa a nivel de microscopía de

luz. A: en la imagen de un corte parasagital del cerebelo, la inmunorreactividad

frente a Kv3.1b (la isoforma más abundante en el cerebro adulto) se observa

concentrada en la superficie de la corteza cerebelosa. Nótese la uniformidad de

tinción en todos los lóbulos cerebelosos. B: lo más destacado es la intensa

inmunorreactividad en la capa molecular (CM) y la ausencia de marcado en los

somas de las células de Purkinje dispuestos en su capa (CP, asteriscos en B´). Este

patrón sugiere la presencia de Kv3.1b en las fibras paralelas (puntas de flecha en

B´), y no en las arborizaciones dendríticas de las células de Purkinje en CM.

Obsérvese en la capa granular (CG), procesos fibrosos inmunopositivos para Kv3.1b

(flechas en B´) de trayecto ascendente hacia CP que atraviesan la capa células de

Purkinje para perderse en CM, evocando la localización de Kv3.1b en los axones de

las células granulares en su camino hacia CM, donde terminan formando las fibras

paralelas. Barras de escala: A: 200μm. B: 20μm. B´: 10μm.

62


Figura 13. Localización inmunocitoquímica de Kv3.3 en la cerebelo de la

rata. Método de la avidina-biotina-peroxidasa a nivel de microscopía de

luz. A: en un corte parasagital completo del cerebelo, la inmunorreactividad frente

a Kv3.3 está concentrada en la superficie de la corteza cerebelosa. Nótese la

uniformidad de tinción en todos los lóbulos cerebelosos. El patrón de distribución de

Kv3.3 a este nivel de magnificación es comparable al presentado por Kv3.1b. Sin

embargo, obsérvese en B una intensa inmunorreacción en los somas de las células

de Purkinje dispuestos en su capa (CP), en particular en la membrana

citoplasmática (flechas en B´). El fuerte marcado en la capa molecular (CM en B)

indica la presencia de Kv3.3 en el árbol dendrítico de las células de Purkinje, así

como en las fibras paralelas (puntas de flecha en B´). La inmunorreactividad aun

siendo visible en la capa granular (CG en B), es más débil que en las capas más

superficiales descritas. Barras de escala: A: 200μm. B: 20μm. B´: 10μm.

63


Compart imentos neuronales que cont ienen Kv3.1b y Kv3.3 en la capa molecu lar de la cor teza cerebelosa de la ra ta en el microscopio e lect rón ico

Con el fin de identificar los compartimentos subcelulares en los

que están localizados las subunidades de los canales de potasio Kv3.1b

y Kv3.3, empleamos una técnica de inmuno-oro preinclusión para

microscopía electrónica (Figuras 14, 15, 16).

Al estudiar la localización de Kv3.1b, observamos que las células

granulares de la corteza cerebelosa, tienen una gran densidad de

inmunopartículas. Esta subunidad se encuentra rodeando el

citoplasma del soma y dendritas de dichas células en la capa granular,

así como en los botones terminales de las fibras paralelas que

establecen sinapsis con las espinas dendríticas de las células de

Purkinje en la capa molecular (Figura 14). Típicamente, el marcado en

estos botones no se encuentra cerca de la especialización de las

membranas presinápticas, sino en porciones de membrana alejadas de

ella.

64


Figura 14. Localización subcelular de la subunidad del canal

de potasio Kv3.1b en la corteza cerebelosa de la rata adulta.

Método de inmuno-oro preinclusión para microscopía electrónica. En

la capa granular (a), la membrana somática y dendrítica de las

células granulares (CG) están densamente decoradas con

inmunopartículas que indican la rica distribución de la subunidad en

estos compartimentos. En b, la acumulación de partículas (flechas) es

en la membrana de un terminal de fibra paralela (ter FP), respetando

la típica especialización sináptica con la espina dendrítica (es) de una

célula de Purkinje. Un patrón de distribución similar es observado en

c, donde varias terminales típicas de fibras paralelas (ter FP)

contienen inmunopartículas (flechas) asociadas a sus membranas.

Nótese que las espinas dendríticas (es) de las células de Purkinje en

contacto con botones sinápticos de fibras paralelas, son Kv3.1b

inmunonegativas. Barras de escala: a: 2 m; b,c: 0,4 m.

a

CG

CG

CG

b

es

ter FP

c

ter FP

ter FP

ter

FP

ter FP

es

es

e

s

65


A continuación, investigamos más en detalle la distribución

inmunocitoquímica de Kv3.1b y Kv3.3 en la capa molecular de la

corteza cerebelosa (Figuras 15, 16). Numerosas partículas de oro

intensificadas con plata se localizan en membranas de axones,

terminales sinápticas y espinas dendríticas. Pudimos observar un

fuerte marcado para Kv3.1b en varicosidades presinápticas de fibras

paralelas, caracterizadas por contener vesículas sinápticas

redondeadas y claras, y por hacer sinapsis asimétricas con espinas

dendríticas de células de Purkinje (Palay y Chan-Palay 1974; Grandes

y cols., 1994) (Figura 15). Por otra parte, el inmunomarcado para

Kv3.1b es particularmente denso en membranas de perfiles axónicos

seccionados de través (Figura 15) y a lo largo de membranas de axones

de pequeño tamaño cortados longitudinalmente, que corresponden a

segmentos intervaricosos de fibras paralelas (Figura 15). Es de

destacar que el marcado de membrana en todos los casos queda

confinado más allá de las especializaciones presinápticas, sin llegarse

a identificar en esta especialización de la sinapsis. Finalmente, no

pudimos demostrar a este nivel de resolución con la técnica empleada,

la localización de Kv3.1b en espinas ni en dendritas de las células de

Purkinje.

66


Figura 15. Compartimentación subcelular de Kv3.1b en la

capa molecular del cerebelo de la rata. Método de inmuno-oro

preinclusión para microscopía electrónica en secciones cerebelosas

parasagitales. Numerosas partículas de oro intensificadas con plata

(flechas) se observan en membranas de terminales sinápticas de

fibras paralelas (ter FP en a-d) que hacen contactos sinápticos

asimétricos con espinas dendríticas inmunonegativas de células de

Purkinje (es). Apréciese en c, una espina dendrítica completa (es;

sentido de flecha entrecortada) emergiendo de una dendrita (den) de

célula de Purkinje, que recibe una terminal paralela (ter FP)

inmunopositiva (flechas). Los segmentos intervaricosos finos de las

fibras paralelas (ax en a y c-d) también aparecen marcados para

Kv3.1b. En d, Kv3.1b se distribuye en la membrana de una terminal

de fibra paralela (ter FP) que está junto a un perfil axónico cortado

longitudinalmente (ax) que también contiene la subunidad.

Obsérvese que Kv3.1b está en las membranas perisinápticas y

extrasinápticas más allá de las zonas activas. Las especializaciones

sinápticas entre las terminales de las fibras paralelas (ter FP) y las

espinas dendríticas de las células de Purkinje (es) carecen por lo

general de inmunopartículas (puntas de flecha en a-d). Barras de

escala: 0,4µm.

67


La subunidad Kv3.3 también está presente en las membranas de

las fibras paralelas (Figura 16), mientras que los contactos sinápticos,

al igual que Kv3.1b, están desprovistos de esta subunidad (Figura 16).

El principal marcado de Kv3.3 se da en las espinas dendríticas de las

células de Purkinje, que reciben contactos sinápticos excitadores de las

terminales sinápticas de las fibras paralelas (Figura 16). Como ocurre

con la distribución de ambas subunidades de Kv3 en otros perfiles

neuronales, las densidades postsinápticas de las espinas dendríticas

inmunorreactivas carecen de la presencia de Kv3.3, estando siempre

las partículas intensificadas con plata en un anillo periférico o más

alejadas de la especialización postsináptica (Figura 16).

No observamos la localización de Kv3.1b y Kv3.3 en botones

sinápticos de fibras trepadoras, que pudimos identificar según sus

típicas características ultraestructurales de varicosidades bulbosas o

perfiles más elongados, agrupando en su interior abundantes vesículas

sinápticas redondeadas y translúcidas dispuestas en la proximidad de

las uniones sinápticas con las dendritas de las células de Purkinje

(Palay y Chan-Palay 1974; Grandes y cols., 1994).

68


Figura 16. Localización ultraestructural de Kv3.3 en la capa molecular

de la corteza cerebelosa de la rata adulta, por medio del método de

inmuno-oro preinclusión. Las espinas de las células de Purkinje (es) que reciben

sinapsis asimétricas de las terminales de las fibras paralelas (ter FP) son Kv3.3

inmunopositivas (flechas en a-e). Las partículas de plata se disponen

perisinápticamente, aunque también en posiciones extrasinápticas (flechas en

a-e). Se observa un discreto marcado a lo largo de las membranas de las

terminales de las fibras paralelas (flechas pequeñas en a y e) y en típicos

segmentos intervaricosos de las fibras paralelas (ax en a, c-f). Nótese que las

zonas activas están desprovistas de partículas de plata (puntas de flecha en a-

e). Barras de escala: 0,4µm.

69


Figura 17. Especificidad de los antisueros frente a las

subunidades Kv3 estudiadas en la corteza cerebelosa de la

rata adulta. La preabsorción de los anticuerpos frente a Kv3.1b y

Kv3.3 con el péptido correspondiente, causa la desaparición completa

del inmunomarcado. Barras de escala: 0,4µm.

Contro les

Finalmente, la especificidad del marcado inmunocitoquímico fue

comprobada realizando la preincubación de los antisueros para Kv3.1b

y Kv3.3 con el péptido correspondiente frente al que el antisuero ha

sido sintetizado y, por lo tanto, es reconocido en el tejido. En estos

experimentos de preabsorción, el inmunomarcado desapareció en su

totalidad, indicando que las herramientas utilizadas en la

inmunodetección de Kv3.1b y Kv3.3 eran altamente específicas

(Figura 17). Por otra parte, tampoco fue posible detectar

inmunotinción en secciones de tejido cerebeloso procesadas

inmunocitoquímicamente sin antisuero primario, o en los

experimentos en los que el anticuerpo policlonal primario fue

sustituido por suero de cabra (no mostrado).

70


Figura 18. Frecuencia relativa de las estructuras marcadas

para Kv3.1b y Kv3.3 en la capa molecular de la corteza

cerebelosa de la rata adulta. Las barras representan los

porcentajes de dominios neuronales de Kv3.1b y Kv3.3

inmunopositivos, sobre el número total de perfiles sinápticos

analizados en la capa molecular (n=325 para Kv3.1b y n=355 para

Kv3.3). Kv3.1b se localiza en membranas de terminales sinápticas

de fibras paralelas (ter FP; 85,16±3,155%) y en porciones

intervaricosas de estas fibras (FP; 47,50±4,578%). Kv3.3 se

distribuye en espinas dendríticas de las células de Purkinje (es CP;

53,98 ± 4,710%) y también en ter FP y en porciones intervaricosas

(FP) de las fibras paralelas (22,76 ± 3,796% y 27,73 ± 4,121%,

respectivamente). Los números dentro y fuera de los paréntesis en

cada columna indican el tamaño de muestra y la media de los

porcentajes. Barras de error indican la media ± SEM.

Anál is is estadís t ico

El análisis estadístico revela que Kv3.1b se localiza en

aproximadamente el 85% de las terminales sinápticas de las fibras

paralelas, y en el 47% de sus porciones intervaricosas (Figura 18). La

localización de Kv3.3, sólo alcanza el 28% de las intervaricosidades y

el 23% de los botones presinápticos de las fibras paralelas (Figura

18). Es de destacar que el 54% de las espinas dendríticas de las

células de Purkinje son Kv3.3 inmunopositivas.

71


Por otra parte, la densidad de inmunomarcado para Kv3.1b (partículas

de oro intensificadas con plata por longitud de membrana) fue mucho

más alta en segmentos intervaricosos de las fibras paralelas, seguido

por las terminales sinápticas de estas fibras (***; p < 0,001; Tabla 1).

La densidad de Kv3.3 en estos compartimentos fue también

significativamente mayor que la densidad en las terminales sinápticas

de las fibras paralelas (***; p < 0,001; Tabla 1). Sin embargo, las

SUBUNIDAD CANAL

PERFIL PARTÍCULAS/

m

ÁREA ANALIZADA

( m2)

Nº TOTAL

DE PERFILES

MARCADOS

COMPARACIÓN

ESTADÍSTICA

Kv3.1b A. ter FP 1,23 ± 0,75 39,15 105

A versus B: ***; p < 0,001 B. FP 2,16 ± 0,16 8,90 57

A

Kv3.3

C. ter FP 0,99 ± 0,11 23,36 28 C versus D: ***; p < 0,001

C versus E: ***; p < 0,001

D versus E: ns; p > 0,05

D. FP 2,07 ± 0,26 5,52 33

E. es CP 1,73 ± 0,13 9,82 63

diferencias de densidad de Kv3.3 en las espinas dendríticas de las

células de Purkinje respecto a las intervaricosidades de las fibras

paralelas fueron estadísticamente no significativas (ns; p = 0,1947;

Tabla 1).

Tabla 1. Densidad de inmunopartículas en membranas de perfiles

neuronales en la capa molecular de la corteza cerebelosa de la rata

adulta. Las secciones parasagitales de cerebelo fueron procesadas con

anticuerpos específicos frente a Kv3.1b y Kv3.3 en combinación con un método

de inmuno-oro preinclusión. La densidad es el número de partículas de plata

de Kv3.1b y Kv3.3 por micra de membrana plasmática de terminales de fibras

paralelas (ter FP), porciones intervaricosas de fibas paralelas (FP) y espinas

dendríticas de células de Purkinje (es CP). La acumulación de Kv3.1b y Kv3.3

es aproximadamente 2 veces mayor en “FP” que en “ter FP” (***diferencias

estadísticamente significativas a p < 0,001). La densidad de Kv3.3 en “es CP”

es significamente más alta que en en “ter FP” (***diferencias

estadísticamente significativas a p < 0,001). Sin embargo, las diferencias de

densidad de Kv3.3 en “es CP” (1,73 ± 0,13) respecto a “FP” (2,07 ± 0,26) no son

estadísticamente significativas (p = 0,1947; ns: p > 0,05). El área total de los

diferentes perfiles y el número de perfiles inmunopositivos analizados

aparecen en las dos últimas columnas.

72


DISCUSIÓN

73


DISCUSIÓN

En este trabajo de Tesis Doctoral, hemos estudiado la

distribución de las subunidades de los canales de potasio Kv3, Kv3.1b

y Kv3.3, en compartimentos subcelulares específicos de la capa

molecular de la corteza cerebelosa de la rata adulta.

En los últimos años, el conocimiento de la localización y función

de Kv3.1 y Kv3.3 en la corteza cerebelosa ha aumentado

significativamente (Perney y cols., 1992; Goldman-Wohl y cols., 1994;

Weiser y cols., 1994, 1995; Sabatini y Regehr, 1997; Sekirnjak y cols.,

1997; Ozaita y cols., 2002; Zucker y Regehr, 2002; Martina y cols.,

2003; McKay y Turner, 2004; McMahon y cols., 2004; Akemann y

Knöpfel, 2006; Joho y cols., 2006; Chang y cols., 2007; Zagha y cols.,

2008; Hurlock y cols., 2008, 2009). Sin embargo, estos trabajos previos

estudiaron la localización de Kv3.1 y Kv3.3 con métodos de

inmunoperoxidasa, que tienen como consecuencia la identificación de

los lugares de distribución proteica por medio de un producto de

inmunorreacción difuso (Ozaita y cols., 2002; Chang y cols., 2007).

Los resultados de la presente Tesis Doctoral demuestran por

primera vez con un método de alta resolución de inmuno-oro

preinclusión, que existe un porcentaje más elevado de fibras paralelas

74


marcadas para Kv3.1b que para Kv3.3, y que además la intensidad de

marcado para cada una de estas subunidades es mayor en ciertos

subcompartimentos neuronales analizados que en otros.

Debido a las propiedades biofísicas que presentan, los canales

Kv3 facilitan el disparo de potenciales de acción a gran frecuencia, y

las interacciones que presentan estos canales con corrientes de sodio,

sustentan el disparo de potenciales de acción espontáneos en la

ausencia de impulsos sinápticos (Perney y cols., 1992; Weiser y cols.,

1995; Massengill y cols., 1997; Martina y cols., 1998; Erisir y cols.,

1999; Hernández-Pineda y cols., 1999; Raman y Bean, 1999; Rudy y

McBain, 2001; McKay y Turner, 2004; Song y cols., 2005; Akeman y

Knöpfel, 2006). En un estudio electrofisiológico relativamente

reciente, se observó que las neuronas de las núcleos profundos del

cerebelo que carecen del enzima de síntesis del neurotransmisor

GABA, decarboxilasa del ácido glutámico (GAD-), disparan a tasas

más altas y exhiben potenciales de acción más rápidos que las

neuronas GAD+ (Uusisaari y cols., 2007). Estas observaciones se

correlacionan con la diferente distribución de Kv3.1b y Kv3.3 en

neuronas GAD- y GAD+ del núcleo dentado (Alonso-Espinaco y cols.,

2008). Por lo tanto, en conjunto, la localización de Kv3.1b y Kv3.3 en

específicos compartimentos subcelulares puede suponer el sustrato

75


anatómico de las propiedades biofísicas diferenciales que caracterizan

a las neuronas GAD- y GAD+ de los núcleos profundos del cerebelo.

Nuestros resultados apuntan hacia la existencia de un mayor

porcentaje de fibras paralelas marcadas para Kv3.1b que para Kv3.3,

aun dándose un cierto solapamiento de localización de ambas

subunidades en estas fibras, como era de esperar a partir de la

expresión de los dos ARN mensajeros y correspondientes proteínas en

las células granulares. Ello está en consonancia con las observaciones

publicadas de que los potenciales de acción de las fibras paralelas son

más anchos en ratones sin Kv3.1 ni Kv3.3, y también en ratones

mutantes que carecen de ambos alelos de Kv3.1 y uno de Kv3.3

(Matsukawa y col., 2003). Estas subunidades probablemente tengan

una sinergia funcional, lo que permitiría en caso de lesión o

inactividad de una de ellas, que la otra realizase en solitario el mismo

trabajo. Curiosamente se ha observado que, aunque los dobles

mutantes presenten una severa disfunción motora, no se observa

diferencia anatómica alguna y, además, estos ratones muestran un

aumento locomotor y de la actividad exploradora. Tampoco sufren

alteración del aprendizaje ni de la memoria (Espinosa y cols., 2001).

Por tanto, no parece que participen directamente estas subunidades

de Kv3, en todos los procesos de intercambio de información entre

76


neuronas, por lo que la ausencia de ellas puede ser corregida por

algún otro mecanismo.

A pesar de la imposibilidad en este estudio de llevar a cabo

experimentos directos de colocalización de ambas subunidades en la

capa molecular del cerebelo, debido a limitaciones metodológicas

(ambos antisueros Kv3.1b y Kv3.3 fueron sintetizados en conejo), es

factible asumir que Kv3.1b y Kv3.3 coinciden en al menos algunos de

los dominios de las fibras paralelas (botones sinápticos,

intervaricosidades) que contienen estas subunidades. Ello contrasta

con la situación dada en las células de Purkinje, que sólo expresan

niveles elevados del ARN mensajero que codifica para Kv3.3. De tal

forma, la falta de Kv3.3 en neuronas de Purkinje resulta en una

reducción de la tasa de disparo, potenciales de acción más amplios y

una más lenta hiperpolarización tardía de las células (McMahon y

cols., 2004; Akemann y Knöpfel 2006). Es interesante destacar que la

actividad de Kv3.3 en el soma de las células de Purkinje es muy

importante en la regulación de las espigas complejas evocadas en

estas células tras la activación de las fibras trepadoras, lo que se ve

afectado en ratones sin Kv3.3 (Zagha y cols., 2008). Hay que añadir

que la falta de sólo Kv3.3 o la carencia de Kv3.3 y un alelo de Kv3.1

causan un fenotipo atáxico en ratones, que puede revertirse tras la

77


reinserción de Kv3.3 en las células de Purkinje (Hurlock y cols., 2008).

Este rescate no es observado en ratones que carecen de ambos Kv3.1 y

Kv3.3 (Hurlock y cols., 2009).

ANATOMÍA DE Kv3.1b y Kv3.3 EN LA CORTEZA CEREBELOSA

Estudios de hibridación in situ han demostrado que las

subunidades de los canales de potasio dependientes de voltaje Kv3.1 y

Kv3.3 se distribuyen ampliamente en distintas áreas del cerebro, con

una expresión relativamente alta en el cerebelo, tanto en la corteza

como en los núcleos profundos (Perney y cols., 1992; Goldman-Wohl y

cols., 1994; Weiser y cols., 1994). En primer lugar, quisimos

comprobar en esta Tesis si la distribución de Kv3.1b y Kv3.3 a nivel de

microscopía de luz mostraba el mismo patrón de distribución que los

correspondientes ARNm en la corteza cerebelosa. Asimismo, la

microscopía de luz nos permitió tener una primera visión general de la

distribución de ambas subunidades. La técnica inmunocitoquímica

aplicada sobre cortes parasagitales de cerebelo de ratas adultas,

demostró que Kv3.1b se distribuye en las capas molecular y granular

de la corteza cerebelosa, siendo el marcado más intenso en la capa

molecular. Sin embargo, los niveles de ARNm para Kv3.1 son más

altos en la capa granular que en la molecular, debido a que el ARNm

se localiza principalmente en las células granulares (Weiser y cols.,

78


1994). El marcado de la capa molecular no puede explicarse por la

presencia de Kv3.1b en las células en cesto y estrelladas, ya que estas

neuronas expresan niveles bajos de ARNm para Kv3.1.

Estudios de microscopía electrónica han revelado que la

abundancia de Kv3.1 en la capa molecular se debe a su presencia en

los axones de las células granulares, las fibras paralelas (Weiser y

cols., 1995; Puente y cols, 2010). Por el contrario, no observamos en la

capa molecular la localización de Kv3.1b en las células en cesto,

estrelladas, ni en las dendritas de las células de Purkinje, al igual que

en un trabajo previo (Weiser y cols., 1995).

El ARNm codificante para Kv3.3 tiene un patrón de expresión

similar al del Kv3.1, siendo especialmente abundante en el tronco del

encéfalo y la corteza cerebelosa. En esta última, el ARNm se expresa

mayoritariamente en las células de Purkinje, y no tanto en las células

granulares, a diferencia de lo que ocurría con el ARNm para Kv3.1

(Goldman-Wohl y cols., 1994; Weiser y cols., 1994). En nuestros cortes

histológicos de rata procesados con el antisuero frente a Kv3.3 para

microscopía de luz, observamos células inmunopositivas en las capas

molecular, de Purkinje y granular, aunque con mayor intensidad de

marcado en la capa molecular y de Purkinje. Este patrón coincide con

79


lo hallado por medio de técnicas de inmunoperoxidasa e

inmunofluorescencia, que han demostrado la distribución de Kv3.3

sobre todo en la capa molecular, las células de Purkinje y sus axones

que cruzan la capa granular en su camino a los núcleos cerebelosos

profundos (Chang y cols., 2007; Alonso-Espinaco y cols., 2008). Por

tanto, la diferencia fundamental que existe entre Kv3.1b y Kv3.3 en la

corteza cerebelosa es la localización de Kv3.3, y no de Kv3.1b. en las

neuronas de Purkinje. En definitiva, el patrón de distribución de estas

dos subunidades de canales potasio no es idéntico en la corteza

cerebelosa.

La isoforma Kv3.1b es la más larga de las dos que presenta

Kv3.1. La forma corta Kv3.1a es menos abundante que Kv3.1b

(Perney y cols., 1992; Gan y Kaczmarek, 1998). Asimismo, Kv3.1a es

reemplazada gradualmente por Kv3.1b en el adulto (Perney y cols.,

1992; Gan y Kaczmarek, 1998), siendo Kv3.1a prácticamente

inexistente en el animal maduro. Nuestros hallazgos en las células

granulares concuerdan con los datos existentes de la presencia de

Kv3.1b en dendritas proximales, somas, axones y terminales axónicas

(Weiser y cols., 1995; Sekirnjak y cols., 1997; Ozaita y cols., 2002).

Uno de los mecanismos que gobiernan la localización de Kv3.1 en

axones y dendritas, implica el dominio T1 del terminal amino de la

80


subunidad y la proteína ankirina que reside sobre todo en el segmento

inicial del axón. Esta proteína, a su vez, se une a un motivo

identificado en el terminal carboxilo de Kv3.1 (Xu y cols., 2007). Este

motivo está presente en Kv3.1a y Kv3.1b, aunque su unión es más

eficaz al terminal carboxilo de Kv3.1b, lo que permite que esta

isoforma atraviese el segmento inicial del axón y se localice a lo largo

del mismo y en su campo terminal (Xu y cols., 2007). El motivo en el

terminal carboxilo que determina la localización axónica de Kv3.1 y el

dominio T1 del terminal amino de las subunidades Kv3, están muy

conservados desde moscas a humanos, por lo que su interacción debe

representar un mecanismo filogenético a través del cual se regula la

localización de los canales Kv3 (Xu y cols., 2007).

SIGINIFICADO FUNCIONAL DE LA LOCALIZACIÓN DE Kv3.1b y

Kv3.3 EN FIBRAS PARALELAS Y DE LA PRESENCIA DE Kv3.3 EN

CÉLULAS DE PURKINJE

Como ya hemos mencionado, las corrientes Kv3 están presentes

en neuronas especializadas en disparos de alta frecuencia (Perney y

cols., 1992; Weiser y cols., 1995; Massengill y cols., 1997; Martina y

cols., 1998; Erisir y cols., 1999; Hernández-Pineda y cols., 1999; Rudy

y McBain, 2001; McKay y Turner, 2004; Song y cols., 2005; Akeman y

Knöpfel, 2006; McDonald y Mascagni, 2006), en las que la

dependencia de voltaje y cinética de rápida decaída de las corrientes

81


Kv3, ambas sintonizadas de forma precisa, facilitan una

repolarización rápida de los potenciales de acción (Erisir y cols, 1999;

Raman y Bean, 1999). En la corteza cerebral, la presencia de

corrientes Kv3 distingue las interneuronas gabaérgicas de disparo

rápido de las neuronas piramidales excitadoras (Massengill y cols.,

1997; Martina y cols., 1998). En los núcleos vestibulares y en los

núcles profundos del cerebelo, las neuronas gabaérgicas y no

gabaérgicas son capaces de soportar tasas de disparo muy elevadas

(Bagnall y cols., 2007; Uusisaari y cols., 2007), indicando el papel de

Kv3 en ambos tipos celulares de estos núcleos (Gittis y du Lac, 2007).

Es sabido que estos canales dependientes de voltaje presentan un

alto umbral de activación y son rápidamente activados durante la fase

de ascenso del potencial de acción. Por lo tanto, Kv3.1 y Kv3.3 actúan

modelando la forma de la repolarización del potencial de acción (Rudy

y McBain, 2001). Los ratones que carecen de los canales Kv3.1 y Kv3.3

tienen unos défictis motores muy manifiestos, fundamentalmente

presentan ataxia severa y temblor, además de una elevada

sensibilidad al alcohol (Espinosa y cols., 2001), como ya hemos

mencionado. Sin embargo, los ratones que carecen sólo de Kv3.1 o

Kv3.3 no presentan alteraciones de la función motora (Chan, 1997; Ho

y cols., 1997; Sánchez y cols., 2000). En cerebro, muchas de las

82


regiones que expresan Kv3.1 también expresan Kv3.3 (Weiser y cols.,

1994). Los ARNm que codifican para Kv3.1 y Kv3.3 se expresan a

unos niveles relativamente elevados en la corteza y en los núcleos

profundos del cerebelo, por lo que al menos algunos de los déficits

motores observados en los ratones deficientes de Kv3.1 y Kv3.3

pueden deberse a una disfunción cerebelosa. Por ejemplo, las células

granulares expresan (Weiser y cols., 1994; Grigg y cols., 2000; Li y

cols., 2001; Rudy y McBain, 2001) y localizan ambas subunidades

Kv3.1 y Kv3.3, como hemos demostrado en esta Tesis Doctoral. Es

posible que en este tipo celular la expresión de estas dos subunidades

con similares características biofísicas resulte en una redundancia

funcional, lo que explicaría la falta de cambios fenotípicos manifiestos

en ratones que carecen Kv3.1 o Kv3.3. Las dos estarían implicadas en

la fase de repolarización del potencial de acción en el soma y/o el axón

de las células granulares. La alteración de la repolarización del

potencial de acción axónico afecta la capacidad de soportar una

transmisión sináptica de alta frecuencia (Rudy y McBain, 2001), así

como la fiabilidad y plasticidad a corto plazo a nivel de las sinapsis

que hacen las fibras paralelas con las células de Purkinje (Sabatini y

Regehr, 1997; Zucker y Regehr, 2002). De hecho, en estas mismas

sinapsis en ratones deficientes de Kv3.1 y Kv3.3, la transmisión de

trenes de potenciales de acción a 200Hz (pero no a 100Hz) está

83


afectada; la anchura de los potenciales de acción de las fibras

paralelas aumenta; la facilitación del pulso por pares disminuye, así

como el umbral para la inducción de una corriente excitadora

postsináptica mediada por el subtipo 1 de receptor metabotrópico de

glutamato (Matsukawa y cols., 2003). Es de destacar que estos

cambios son dependientes del número de alelos afectados (Matsukawa

y cols., 2003), como ya ha sido comentado.

Las células de Purkinje disparan espontáneamente a una

frecuencia de 40Hz in vivo y en preparaciones de secciones de tejido

(Llinás y Sugimori, 1980). Estas células expresan (Goldman-Wohl y

cols., 1994) y localizan Kv3.3 en sus espinas dendríticas, como hemos

descrito. Los canales Kv3 en las neuronas de Purkinje impiden

activamente la propagación retrógrada de las espigas somáticas de

sodio, dan forma a las respuestas mediadas por la actividad de las

fibras trepadoras y facilitan el disparo en salvas (Martina y cols.,

2003; McKay y Turner, 2004). La tasa de disparos de potenciales de

acción espontáneos está sustancialmente reducida en células de

Purkinje carentes de Kv3.3 (Akemann y Knöpfel, 2006). Además,

estas células presentan unos potenciales de acción más anchos,

alcanzan potenciales más positivos y tienen una hiperpolarización

tardía más lenta (McMahon y cols., 2004; Akemann y Knöpfel, 2006).

84


Esta reducción de la actividad espontánea de las células de Purkinje

que no expresan Kv3.3, no se debe a un simple aumento de la entrada

de calcio, o al incremento de la actividad de los canales de potasio

activados por calcio. Es de destacar que la tasa normal de disparo es

rescatada al reintroducir la conductancia de Kv3 en estas neuronas,

por medio de la técnica dinámica de clampaje (Akemann y Knöpfel,

2006).

El papel de los canales Kv3 es permitir una rápida repolarización

del potencial de acción, y por tanto posibilitar los disparos de alta

frecuencia (Wang y cols., 1998a; Erisir y cols., 1999; Wigmore y Lacey,

2000; Lien y Jonas, 2003). La expresión de los canales Kv3 en

dendritas podría tener un papel único en la fisiología de las células de

Purkinje (Martina y cols., 2003; McKay y Turner, 2004), a la vez de

ser importante en la modulación de los picos sinápticos de las

dendritas y en el flujo de calcio durante los picos. Recientemente, se

ha estudiado la función de Kv3.3 en la regulación de las espigas

complejas evocadas en las células de Purkinje tras la activación de las

fibras trepadoras (Zagha y cols., 2008). Los autores de este estudio

observaron que la expresión de estas espigas está regulada por la

actividad de Kv3.3 localizado a nivel somático y no dendrítico (Zagha y

cols., 2008). Muy importante es el hecho de que las propiedades

85


eléctricas de Kv3.3 y los canales de sodio actúan coordinadamente

para limitar la acumulación de canales de sodio inactivados y, de esta

forma, permitir que tengan lugar disparos repetitivos rápidos. Es de

destacar que las células de Purkinje de los ratones carentes de Kv3.3

producen espigas complejas alteradas, lo que es probable que sea el

sustrato celular de los fenotipos de síndrome cerebeloso observado en

estos ratones (Zagha y cols., 2008).

Las alteraciones de los potenciales de acción de las neuronas de

Purkinje deficientes en Kv3.3, producen una alteración tónica y

rítmica de la transmisión sináptica gabaérgica sobre las neuronas de

los núcleos profundos del cerebelo (McMahon y cols., 2004). Hay que

subrayar que los datos obtenidos en otros experimentos indican que la

presencia de Kv3.3 es necesaria para que se manifieste el temblor

inducido por la inyección intraperitoneal de harmalina y que afecta de

forma selectiva al circuito olivocerebeloso (McMahon y cols., 2004). El

papel fundamental de las células de Purkinje en este temblor fue

previamente sugerido por la observación de que la harmalina en los

ratones pcd/pcd (carentes de células de Purkinje por degeneración

progresiva), causa un temblor más leve en términos de amplitud y

frecuencia (Milner y cols., 1995).

86


Este circuito olivocerebeloso, que comprende la oliva inferior, las

células de Purkinje y los núcleos profundos del cerebelo, tiene un

papel principal en la generación de una actividad cerebelosa

coordinada y en el control de los movimientos intencionados (Welsh y

cols., 1995; De Zeeuw y cols., 1998; Fukuda y cols., 2001). Las

neuronas de la oliva inferior, que son el origen de las fibras

trepadoras, no expresan los ARNm para Kv3.1 ni Kv3.3 (Weiser y

cols., 1994). La vía constituida por las fibras musgosas-célula

granulares-células de Purkinje converge con el circuito olivocerebeloso

a nivel de las células de Purkinje. En un trabajo previo (Matsukawa y

cols., 2003), los autores observaron que la transmisión sináptica de las

fibras paralelas de las células granulares sobre las células de Purkinje

está afectada tanto por la ausencia de Kv3.1 como de Kv3.3. Por lo

tanto, es improbable que la falta de Kv3.3 en las células granulares

explique la ausencia de temblor inducido por harmalina en los ratones

deficientes de Kv3.3. Sin embargo, las alteraciones en estas sinapsis

podrían explicar los efectos de la pérdida de Kv3.1 sobre la amplitud y

frecuencia del temblor inducido por harmalina (McMahon y cols.,

2004).

87


RESUMEN GENERAL

Las células nerviosas han evolucionado con el fin de llevar a cabo

funciones específicas en circuitos complejos, requiriendo una

especialización de su capacidad de procesar la información y

transformarla en un patrón de disparo de potenciales de acción. Esta

capacidad de las neuronas de procesar y transmitir información

depende de sus corrientes iónicas intrínsecas. Diversos estudios han

demostrado que el nivel de expresión de canales iónicos en una misma

célula varía considerablemente de animal a animal, pero el patrón de

salida de la información se mantiene constante a través de la

correlación de expresión de canales, que mantiene un balance de

corrientes específico para un tipo particular de neurona (Prinz y cols.,

2004; Schulz y cols., 2006). La distribución de canales iónicos en las

diferentes partes de la célula tiene un importante significado

funcional (Almers y Stirling, 1984; Llinás, 1988). La integración

neuronal depende de la respuesta local a los diversos estímulos que le

llegan a la célula y la comunicación de estos centros con el axón. Por

tanto, la implicación de un determinado grupo de canales iónicos va a

depender de su precisa localización en la membrana celular. Las

subunidades de los canales de potasio dependientes de voltaje Kv3.1 y

Kv3.3 confieren propiedades de disparo rápido a aquellas neuronas

que los expresan, y se distribuyen en muchas áreas cerebrales,

88


incluyendo las implicadas en el control y la modulación de la actividad

motora y en la precisa ejecución de las habilidades motoras

adquiridas, como son el cerebelo, los ganglios basales y la médula

espinal (Drewe y cols., 1992; Perney y cols., 1992; Rettig y cols., 1992;

Rudy y cols., 1992; Goldman-Wohl y cols., 1994; Lenz y cols., 1994;

Weiser y cols., 1994, 1995; Sekirnjak y cols., 1997; Baranauskas y

cols., 1999; Hernández-Pineda y cols., 1999; Grigg y cols., 2000;

Deuchars y cols., 2001; Li y cols., 2001; Devaux y cols., 2003;

Matsukawa y cols., 2003; Brooke y cols., 2004). Por tanto, conocer la

precisa localización subcelular de Kv3.1 y Kv3.3 es muy importante de

cara a entender los mecanismos neurales en los que están implicados.

El hecho de que Kv3.1b y Kv3.3 se localicen en el cerebelo, tanto

en la corteza cerebelosa como en los núcleos profundos (Alonso-

Espinaco y cols., 2008; Puente y cols., 2010), como hemos descrito en

este estudio, plantea la pregunta de si las deficiencias motoras

observadas en los ratones que carecen de Kv3.1 y Kv3.3 pudieran ser

de origen cerebeloso. Se piensa que el circuito olivocerebeloso tiene un

importante papel en la generación de la actividad cerebelosa rítmica

que controla los movimientos voluntarios (Welsh y cols., 1995; De

Zeeuw y cols., 1998; Fukuda y cols., 2001). Una disfunción de este

sistema podría llevar a contracciones musculares anómalas,

89


manifestándose con movimientos incoordinados, temblores y

mioclonias. El circuito olivocerebeloso comprende la oliva inferior, las

células de Purkinje y los núcleos cerebelosos profundos. Las fibras

trepadoras de la oliva inferior no expresan Kv3.1 ni Kv3.3 (Weiser y

cols., 1994). Estas fibras olivocerebelosas establecen sinapsis con las

células de Purkinje, las cuales sólo expresan Kv3.3, mientras que sus

dianas directas, los núcleos cerebelosos profundos, expresan ambos

Kv3.1 y Kv3.3 (Goldman-Wohl y cols., 1994; Weiser y cols., 1994;

Alonso-Espinaco y cols., 2008). En el núcleo dentado observamos en un

estudio previo de nuestro laboratorio la distribución de Kv3.1b y

Kv3.3 en células excitadoras e inhibidoras (Alonso-Espinaco y cols.,

2008). Una subpoblación de estas neuronas inhibidoras gabaérgicas

proyecta a la oliva inferior, cerrando así el circuito. Este circuito entra

en contacto con la vía de las fibras musgosas-células granulares-

células de Purkinje, en la cual Kv3.1 y Kv3.3 se expresan en las

células granulares (Weiser y cols., 1994). Por su parte, las neuronas

glutamatérgicas del núcleo dentado proyectan al tálamo ventral

lateral y la porción parvocelular del núcleo rojo contralateral, por lo

que ambas subunidades de canales de potasio están implicados en la

transmisión de señales excitadoras en estas vías motoras. También

observamos la presencia de Kv3.3 en axones y terminales sinápticas

de las células de Purkinje (Alonso-Espinaco y cols., 2008). Estos datos,

90


junto con los descritos en la corteza cerebelosa en esta Tesis Doctoral,

ponen de manifiesto que Kv3.1b y Kv3.3 no siempre se encuentran

igualmente distribuidos.

También hay que tener en cuenta que los ratones que carecen de

los genes que codifican para Kv3.1 y Kv3.3 tienen deficiencias motoras

que no se observan en los ratones que sólo carecen de uno de estos dos

genes, lo que sugiere un solapamiento de la expresión de estas

proteínas y, por tanto, una sinergia funcional en algunas poblaciones

neuronales (Espinosa y cols., 2001; McMahon y cols., 2004; Joho y

cols., 2006). En este caso, es lógico pensar, como se ha apuntado

previamente por otros autores, en la puesta en marcha de un

mecanismo de compensación (Matsukawa y cols., 2003, Espinosa y

cols., 2001, 2004), debido además a que las cinéticas de activación de

estas dos subunidades de canales son muy similares. Esto está

avalado por la coexpresión de Kv3.1b y Kv3.3 en muchas estructuras

cerebrales, lo que sugiere que podrían ser componentes de complejos

de canales heteromultiméricos (Christie y cols., 1990; Isacoff y cols.,

1990; McCormack y cols., 1990; Ruppersberg y cols., 1990;

Covarrubias y cols., 1991; Weiser y cols., 1994). Sin embargo, los

resultados de este trabajo Doctoral, así como nuestros estudios en el

núcleo dentado que Kv3.1b y Kv3.3 (Alonso-Espinaco y cols., 2008),

91


sugieren la posibilidad de que estas subunidades modulen acciones

distintas, estando a su vez regidas por vías diferentes de señalización

intracelular.

Los ratones que sólo carecen de uno de los dos genes que

codifican Kv3.1 o Kv3.3 también apoyan esta hipótesis, debido a que

muestran fenotipos diferentes, hecho que no ocurriría si se expresasen

ambas subunidades en las mismas vías y fueran funcionalmente

redundantes. En definitiva, estos ratones knockout deberían tener un

fenotipo lo más parecido al silvestre, sin embargo no es así. Por

ejemplo, la falta de Kv3.1 es principalmente responsable del

incremento de la actividad motora, una reducción de respuesta a

estímulos acústicos y de pérdida de sueño, debido esto último a la

importante presencia de Kv3.1 en el núcleo reticular talámico y en la

corteza cerebral, participando por tanto esta subunidad en la función

talamocortical. De hecho, los ratones knockout de Kv3.1 exhiben una

alteración de los ritmos corticales con aumento de las oscilaciones

rápidas gamma y disminución de las lentas delta registradas en la

corteza somatosensorial (Joho y cols., 1999). Por lo demás, exhiben

actividades locomotoras y exploratorias similares a las de los ratones

control y no presentan una mayor proclividad a desarrollar crisis

epilépticas. Tampoco se ve alterada su capacidad de adquisición

92


(aprendizaje) ni de retención (memoria) (Ho y cols., 1997). La ausencia

de la subunidad Kv3.3 afecta la función cerebelosa, en particular a las

células de Purkinje y a las propiedades del sistema olivocerebeloso

(McMahon y cols., 2004; Zagha y cols., 2008).

Se ha visto en humanos que la carencia del gen que expresa la

proteína Kv3.3 causa una neurodegeneración cerebelosa que cursa con

ataxia cerebelosa en niños y adultos (Waters y cols., 2006; Schorge y

cols., 2010). No se conocen todavía los mecanismos que relacionan la

mutación de Kv3.3 con la atrofia cerebelosa, pero sí parece claro que

los eventos despolarizantes, la duración de los potenciales de acción y

la liberación de neurotransmisores están afectados en los

compartimentos somáticos, dendríticos y axónicos que expresan Kv3.3.

Es necesario iniciar nuevas investigaciones con el fin de

determinar si la alteración de la excitabilidad de las neuronas que

integran los circuitos neuronales corticocerebelosos y de proyección

corticonucleares que contienen Kv3.1 y Kv3.3 como hemos descrito en

este trabajo Doctoral en la corteza cerebelosa, contribuyen a la

aparición del síndrome cerebeloso observado en diferentes especies,

incluido el humano.

93


CONCLUSIONES

94


CONCLUSIÓN GENERAL

La convergencia de las fibras trepadoras y el sistema de fibras

musgosas-células granulares-fibras paralelas en las células de

Purkinje es crucial para un apropiado control motor por el cerebelo.

Ambos circuitos difieren en la presencia de Kv3.1b y Kv3.3 en las

fibras paralelas y en su ausencia de las fibras trepadoras (Weiser y

cols., 1994, Hurlock y cols., 2009). A la vista del hecho de la

localización de las subunidades Kv3.1b y Kv3.3 en las fibras

paralelas y sus terminales sinápticas, que sugiere una redundancia

funcional de estos canales (Matsukawa y cols., 2003), los resultados

anatómicos de esta Tesis Doctoral indican que la distribución

relativa de Kv3.1b contribuye, en mayor medida que Kv3.3, a la

arquitectura molecular de las fibras paralelas de las células

granulares, estando Kv3.3 principalmente localizada en las espinas

dendríticas de las células de Purkinje.

95


CONCLUSIONES

1. Los subunidades de los canales de potasio dependientes de voltaje Kv3.1b y Kv3.3 están localizadas en las membranas de terminales sinápticas y segmentos intervaricosos de las fibras paralelas.

2. En concreto, Kv3.1b está en el 85% de los botones sinápticos, y en cerca del 47% de las porciones intervaricosas de las fibras paralelas.

3. Kv3.3, por su parte, se localiza en el 28% de las intervaricosidades y el 23% de las terminales sinápticas de las fibras paralelas.

4. La densidad de inmunomarcado para Kv3.1b y Kv3.3 es aproximadamente el doble en segmentos intervaricosos que en las terminales sinápticas de las fibras paralelas.

5. Los principales compartimentos de localización de Kv3.3 (54%) son las espinas dendríticas de las células de Purkinje.

6. La densidad de Kv3.3 es significativamente más alta en las espinas dendríticas de las células de Purkinje, que en las terminales sinápticas de las fibras paralelas.

7. Sin embargo, las diferencias de densidad de Kv3.3 entre las espinas dendríticas de las células de Purkinje y los segmentos intervaricosos de las fibras paralelas no son estadísticamente significativas.

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AGRADECIMIENTOS

Esta Tesis Doctoral ha sido realizada con fondos de las subvenciones

recibidas a Proyectos de Investigación financiados por el Gobierno

Vasco (GIC07/70-IT-432-07) y la Universidad del País Vasco/Euskal

Herriko Unibertsitatea.

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tesis doctoral aranzazu urresola olabarrieta

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