Terapia combinada de caspofungina y anfotericina B. Una nueva alternativa en el tratamiento de la histoplasmosis sistémica: ensayos en el modelo murino

RESUMEN

La pandemia del SIDA coincidió con el auge de la histoplasmosis en el mundo, dada la gran ubicuidad del patógeno y su carácter oportunista. Aunque la terapia anti-retrovirus disminuyó las asociaciones histoplasmosis-SIDA en muchos países, en México, el problema sigue vigente. Además, la histoplasmosis se ha incrementado en pacientes con diferentes tipos de inmunocompromiso. La mayoría de estos pacientes son tratados con antifúngicos por largos tiempos, predominando la terapia con anfotericina B. Sin embargo, la toxicidad de este fármaco es una limitante en usos prolongados, por lo que se requiere de nuevas alternativas para el tratamiento de esta micosis. El presente trabajo muestra el efecto de la caspofungina (10 mg/Kg de peso) y su combinación con bajas dosis (0.5 y 1 mg/Kg de peso) de anfotericina B, durante el tratamiento de la histoplasmosis diseminada experimental murina. Se realizó infección intraperitoneal en ratones BALB/c con cuatro cepas de H. capsulatum , posteriormente, se les suministró diferentes tratamientos antifúngicos. Se valoró la respuesta terapéutica mediante la evaluación clínica (signos de la enfermedad en ratones) y evaluación micológica (aislamiento y cuantificación de Unidades Formadoras de Colonias –UFC- de levaduras/g de bazo y de pulmón del animal infectado). Se realizaron observaciones histopatológicas para determinar la presencia del patógeno en los órganos de los ratones estudiados. Los resultados demostraron que la caspofungina fue mejor que la anfotericina B en el tratamiento de la histoplasmosis experimental murina. Se observó un efecto sinérgico cuando se combinó caspofungina con bajas dosis de anfotericina B. Los resultados fueron analizados por la prueba de Kruskall-Wallis. En conclusión, el tratamiento de la histoplasmosis con caspofungina sola o combinada con anfotericina B podría ser una alternativa para el tratamiento de la histoplasmosis refractaria a la anfotericina.

ABSTRACT

The AIDS pandemia induced a rise in histoplasmosis worldwide, given the ubiquity of the causing pathogen and its opportunistic character. Although the anti-retrovirus therapy decreased histoplasmosis-AIDS associations in many countries; in Mexico, the problem prevails. Besides, the disease has increased in patients with diverse types of immunocompromising disorders. Most of these patients are treated with antifungal agents for long times, predominating amphotericin-B therapy. However, the toxicity of this drug limits its use for long times, therefore, new treatment alternatives for this mycosis are needed. The present work shows the effect of caspofungin (10 mg/Kg of body weight) and its combination, at low (0.5 and 1 mg/Kg of body weight) doses, with amphotericin-B, to treat murine experimental disseminated histoplasmosis. BALB/c mice were intraperitoneally infected with four strains of H. capsulatum, and were then subjected to different antifungal treatments. The therapeutic response was assessed clinically (signs of the

disease in mice) and mycologically (isolation and quantification of CFU of yeasts/g of spleen and lung from the infected animal). Histopathological observations were made to determine the presence of the pathogen in the organs of the studied mice. Results showed that caspofungin yielded better results than amphotericin -B in the treatment of the murine experimental histoplasmosis. A synergic effect was observed when caspofungin was combined with low doses of amphotericin B. Results were analyzed by means of the Kruskall-Wallis test. In conclusion, treatment of histoplasmosis with caspofungin alone or in combination with amphotericin B could represent an adequate alternative for the treatment of histoplasmosis refractory to amphotericin.

INTRODUCCIÓN

HISTOPLASMOSIS Histoplasma capsulatum var. capsulatum es el agente causal de la micosis sistémica “histoplasmosis capsulati”. Es un hongo dimórfico que crece en fase micelial-saprobia y geofílica en la naturaleza (forma infectiva, a 25 ºC), y en fase levaduriforme y parasítica (forma virulenta, a 37 ºC) cuando infecta hospederos susceptibles. La distribución de este patógeno es mundial, en particular, en las zonas tropicales y subtropicales del globo terráqueo, entre los paralelos 45° Norte y 30° Sur. En México, está muy relacionada a sitios con alto riesgo de infección, como los ambientes cerrados: cuevas, túneles y minas. Sin embargo, también se ha encontrado el hongo en los denominados sitios con bajo riesgo de infección, ambientes abiertos, como: parques, paseos públicos y patios caseros, donde se acumulan guano de aves y murciélagos. Las personas con inmunocompromiso de distinta índole son los blancos naturales de la infección en los sitios con bajo riesgo. La “histoplasmosis capsulati” es la micosis más relevante en el continente americano [Kwon-Chung y Bennett, 1992; Rippon, 1992; Tewari et al., 1998]. En México, la forma clínica más importante es la histoplasmosis pulmonar primaria (HPP), se manifiesta inicialmente como una infección con compromiso pulmonar y en general es de curso benigno. Sin embargo, la HPP tiene una gama de manifestaciones clínicas que pueden evolucionar de una forma leve a grave, dependiendo de la cantidad del propágulo inhalado, así como del estado inmune del individuo. La forma clínica diseminada aguda es predominante en individuos con inmunocompromiso severo. En México, la HPP ocupa la más alta tasa de letalidad en el mundo, debido a su frecuente asociación con brotes epidémicos, donde los individuos están más expuestos a altas concentraciones de propágulos infectivos; la enfermedad ha sido propuesta como un problema de salud y es considerada de índole ocupacional. A partir de 1995, la enfermedad dejó de ser notificada por el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica, SSA, lo que contribuyó a una falta de datos sobre su incidencia actual. Auque antecedentes aislados refieren el incremento de brotes en el país, no se dispone de información oficial para esgrimir un panorama real de la histoplasmosis en México [Vaca-Marín et al., 1998; Velasco-Castrejón, 1998]. Como prueba veraz de que la enfermedad es

relevante en nuestro medio, lo constituye el reciente reporte de uno de los mayores brotes de histoplasmosis en zona urbana, que ocurrió en el puerto de Acapulco en 2001 [Morgan et al., 2003; Taylor et al., 2005]. La pandemia del SIDA coincidió con el auge de la histoplasmosis en el mundo y asimismo en el país, dada la gran ubicuidad del patógeno y su carácter oportunista en estos casos. Aunque la terapia anti-retrovirus (HAART) ha disminuido las asociaciones histoplasmosis-SIDA en muchos países, en México, el problema sigue vigente. Además, la enfermedad se ha incrementado en los pacientes inmunodeprimidos por diferentes etiologías (transplantados, neoplásicos, diabéticos, etc.). La mayoría de estos pacientes son tratados con antifúngicos por periodos largos de tiempo e incluso de por vida, predominando en los tratamientos el uso de anfotericina B como estándar de oro. Antes de la aparición de los azoles, la única droga disponible para el tratamiento de la histoplasmosis era la anfotericina B, la cual es altamente nefrotóxica. Actualmente, la terapia recomendada para la histoplasmosis diseminada incluye a la anfotericina B, tanto en su forma convencional como en sus nuevas presentaciones (liposomal, coloidal y lipídica), y algunos triazoles como el itraconazol y el fluconazol. Sin embargo, en la histoplasmosis no se ha probado las equinocandinas como terapia opcional a la anfotericina B, como lo han hecho en la aspergilosis refractaria a la anfotericina B [McCormack y Perry, 2005; Zaas y Alexander, 2005].

MATERIALES Y MÉTODOS

Histoplasma capsulatum Se emplearon cuatro cepas, en fase levaduriforme, de H. capsulatum, aisladas de casos clínicos (Tabla 1). Las cepas EH-53, H.1.07.W y EH-359 forman parte de la Colección de Cepas de Histoplasma capsulatum del Laboratorio de Inmunología de Hongos del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Medicina, UNAM. La cepa de referencia G-186B (ATCC 26030) fue donada por el Dr. G. S. Kobayashi†, de la Universidad de Washington, St. Louis, MO. Todas las cepas fueron proporcionadas por la Dra. Maria Lucia Taylor y se puede acceder a la información sobre ellas en un catálogo de la colección (Taylor et al., 1999) o en la página web: http://histoplas-mex.unam.mx. La colección se encuentra registrada en la base de datos del Centro Mundial de Datos sobre Microorganismos (World Data Centre for Microorganisms, WDCM) con el acrónimo LIH-UNAM WDCM817. La fase levaduriforme de cada cepa fue mantenida a 37 ºC en medio de infusión-cerebro-corazón (BHI) (Bioxón, Becton-Dickinson, México, DF) suplementado con 0.1 % de L-cisteína y 1 % de glucosa. Todas las cepas han sido previamente tipificadas según las normas de ingreso a la colección.

Tabla 1. Características de las cepas de H. capsulatum

CEPAS ENFERMEDAD/FORMA CLÍNICA PROCEDENCIA

EH-53 Histoplasmosis diseminada México H.1.07.W Histoplasmosis-SIDA Guatemala G-186B Histoplasmosis diseminada Panamá EH-359 Histoplasmosis diseminada México

RATONES Se emplearon ratones machos singénicos BALB/c, de cuatro semanas de edad y del mismo peso, proporcionados por el bioterio de la Facultad de Medicina de la UNAM, los cuales se mantuvieron en condiciones óptimas ambientales y alimentados ad libitum con purina (Purina de México, D.F.) y agua destilada acidificada. DETERMINACIÓN DEL EFECTO TERAPÉUTICO DE CASPOFUNGINA, ANFOTERICINA B Y LA COMBINACIÓN DE AMBAS EN LA HISTOPLASMOSIS DISEMINADA EXPERIMENTAL

A) En la histoplasmosis diseminada experimental murina con cuatro cepas diferentes de H. capsulatum Para cada cepa de H. capsulatum se formaron ocho grupos de ratones, cada uno con cuatro animales. Para reproducir una histoplasmosis diseminada experimental, se manejaron la combinación de la vía de inoculación y la dosis (multiplos de DL50%), según ensayos preliminares de estandarización en el laboratorio. De cada cepa estudiada, se preparó una suspensión de levaduras de H. capsulatum, ajustándola a 2 unidades de D.O. Las levaduras se inocularon por vía intraperitoneal (IP), 0.2 ml a cada uno de los siete primeros grupos. El último grupo se inoculó sólo con solución salina isotónica (testigos negativos). A las 48 h después de la infección se administraron los antifúngicos por vía IP a cada grupo de ratones, de acuerdo con lo especificado en la tabla 2.

Tabla 2. Grupos de ratones con diferentes tratamientos

GRUPOS TRATAMIENTOS DOSIS/Kg DE PESO (TIEMPO DE APLICACIÓN)

1* Solución salina isotónica 0.2 ml (6 días) 2 Caspofungina 10 mg (cada 12 h, 6 días)

3 Anfotericina B 0.5 mg (cada 48 h, 6 días) 4 Anfotericina B 1 mg (cada 48 h, 6 días) 5 Anfotericina B 2 mg (cada 48 h , 6 días)

6 Anfotericina B + caspofungina 0.5 mg (cada 48 h, 6 días) y 10 mg (cada 12 h, 6 días), respectivamente

7 Anfotericina B + caspofungina 1 mg (cada 48 h, 6 días) y 10 mg (cada 12 h, 6 días), respectivamente

8** Solución salina isotónica 0.2 ml (6 días)

*Grupo 1, testigo de infección; **Grupo 8, testigo de no infección. Efectividad terapéutica. La respuesta a la terapia se valoró mediante dos parámetros: i) evaluación clínica: signos de la enfermedad en ratones, incluyendo muerte; ii) evaluación micológica: aislamiento y cuantificación de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de levaduras/g en bazo y pulmón del animal infectado.

i) Evaluación clínica. Se registraron los signos de la enfermedad en los ratones durante ocho días (pérdida de peso, pelo hirsuto; encorvamiento de la columna, inmovilización, segregación y muerte). La disminución o desaparición de estos signos, posteriores a la administración del fármaco, fueron indicadores de terapia exitosa valorada por los parámetros clínicos.

ii) Evaluación micológica. Para las UFC se procesaron tres ratones por grupo. A partir de las 48 h posteriores a la

inoculación, los ratones muertos fueron procesados para extraerles bazo y pulmón, los cuales fueron pesados previo sus respectivos procesamientos. Los órganos fueron macerados en condiciones de esterilidad en cajas de Petri con RPMI, hasta

obtener homogeneizados de tejidos. Cada homogeneizado fue diluido y, posteriormente, sembrado por duplicado en placas de agar BHI suplementado y adicionado de factor de crecimiento para H. capsulatum obtenido en el medio sintético de Tewari y Kegel [1971]. Después de 7-14 días de incubación a 37 °C, se cuantificaron UFC/g de cada órgano. Los ratones que sobrevivieron al tiempo de observación de siete días, fueron sacrificados y procesados de igual forma. Se consideró efectividad terapéutica cuando se determinó ausencia de UFC/g en los órganos probados. Se realizaron observaciones histopatológicas para confirmar presencia del patógeno en los órganos de un cuarto ratón infectado, de cada grupo, no procesado para UFC.

Los ensayos con cada cepa se efectuaron una sola vez (por triplicado) como se describió anteriormente (n= 32 para cada cepa).

B) En la histoplasmosis diseminada experimental murina, a partir de ensayos adicionales con la cepa G-186B de H. capsulatum, para la valoración estadística

En ensayos posteriores, para la valoración estadística, se seleccionó la cepa de referencia G-186B por ser una cepa ampliamente utilizada en la mayoría de los laboratorios que trabajan H. capsulatum en el mundo, con la cual se realizaron tres nuevos ensayos, cada uno por triplicado, siguiendo la misma metodología del inciso A, en tiempos diferentes. Los datos de las UFC de cada experimento, fueron analizados usando la prueba de Kruskall-Wallis [Kruskall y Wallis, 1952]. Al realizar esta prueba cada dato fue reemplazado por rangos, posteriormente, se realizó la suma de dichos rangos de cada experimento. Esta prueba determinó si la desigualdad entre las sumas de rangos fue lo suficientemente grande para indicar si las muestras procedían de la misma población (es decir, si los experimentos eran diferentes entre sí).

Figura 7. Cuantificación de UFC/g de bazo de ratones infectados con cuatro diferentes cepas. Los detalles de los ensayos están descritos en materiales y métodos. A) cepa EH-53; B) cepa H.1.07.W; C) cepa EH-359; D) G-186B. Grupo 1= testigos de infección; Grupo 2= caspofungina 10 mg/Kg de peso; Grupo 3= anfotericina B 0.5 mg/Kg de peso; Grupo 4= anfotericina B 1.0 mg/Kg de peso; Grupo 5= anfotericina B 2.0 mg/Kg de peso Grupo 6= caspofungina 10 mg/Kg de peso + anfotericina B 0.5 mg/Kg de peso; Grupo 7= caspofungina 10 mg/Kg de peso + anfotericina B 1.0 mg/Kg de peso.

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Figura 8. Cuantificación de UFC/g de pulmón de ratones infectados con cuatro diferentes cepas. Los detalles de los ensayos están descritos en materiales y métodos. A) cepa EH-53; B) cepa H.1.07.W; C) cepa EH-359; D) G-186B. Grupo 1= testigos de infección; Grupo 2= caspofungina 10 mg/Kg de peso; Grupo 3= anfotericina B 0.5 mg/Kg de peso; Grupo 4= anfotericina B 1.0 mg/Kg de peso; Grupo 5= anfotericina B 2.0 mg/Kg de peso; Grupo 6= caspofungina 10 mg/Kg de peso + anfotericina B 0.5 mg/Kg de peso; Grupo 7= caspofungina 10 mg/Kg de peso + anfotericina B 1.0 mg/Kg de peso.

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Figura 10. Cuantificación de UFC/g de bazo de ratones infectados con la cepa de referencia G-186B. Los detalles de los ensayos están descritos en materiales y métodos. A) primer ensayo; B) segundo ensayo; C) tercer ensayo. Grupo 1= testigos de infección; Grupo 2= caspofungina 10 mg/Kg de peso; Grupo 3= anfotericina B 0.5 mg/Kg de peso; Grupo 4= anfotericina B 1.0 mg/Kg de peso; Grupo 5= anfotericina B 2.0 mg/Kg de peso; Grupo 6= caspofungina 10 mg/Kg de peso + anfotericina B 0.5 mg/Kg de peso; Grupo 7= caspofungina 10 mg/Kg de peso + anfotericina B 1.0 mg/Kg de peso.

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C

Figura 11. Cuantificación de UFC/g de pulmón de ratones infectados con la cepa de referencia G -186B. Los detalles de los ensayos están descritos en materiales y métodos. A) primer ensayo; B) segundo ensayo; C) tercer ensayo. Grupo 1= testigos de infección; Grupo 2= caspofungina 10 mg/Kg de peso; Grupo 3= anfotericina B 0.5 mg/Kg de peso; Grupo 4= anfotericina B 1.0 mg/Kg de peso; Grupo 5= anfotericina B 2.0 mg/Kg de peso; Grupo 6= caspofungina 10 mg/Kg de peso + anfotericina B 0.5 mg/Kg de peso; Grupo 7= caspofungina 10 mg/Kg de peso + anfotericina B 1.0 mg/Kg de peso.

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A UFC/g UFC/g

UFC/g

B

C

IMPACTO

El aumento en la frecuencia y gravedad de las micosis sistémicas en pacientes con alteraciones inmunológicas, así como, la aparición de diferentes formas clínicas asociadas a las micosis clásicas y a las llamadas infecciones fúngicas emergentes, ha ma rcado una nueva tendencia en la salud pública, epidemiología, tratamiento y profilaxis de las micosis, en las últimas décadas del siglo XX y el inicio del presente siglo. El papel cada vez más importante de los hongos en la patología humana ha generado un incremento en el empleo de los antifúngicos sistémicos y ejercido una presión importante para el desarrollo de nuevos fármacos con actividad antifúngica (Carrillo-Muñoz et al., 2001). En el caso particular de la histoplasmosis diseminada, se requieren tratamientos de largo plazo, e incluso de por vida. La monoterapia recomendada para las formas graves es la anfotericina B y para las formas menos graves el itraconazol. A la fecha, no se conocen datos sobre la aplicación de terapia combinada para esta micosis. No obstante que la caspofungina es un fármaco de reciente incorporación al mercado, su efecto antifúngico ha sido favorable en el tratamiento de diversas infecciones micóticas invasivas. Por ejemplo, McCormack y Perry [2005], reportaron estudios clínicos de la caspofungina en el tratamiento de la candidosis esofágica y orofaríngea, observándose eficacia comparable a la anfotericina B. También resultó efectiva como terapia de salvación en pacientes con aspergilosis invasiva refractaria o intolerante a la terapia estándar (polienos y azoles). Además, la tolerancia de los pacientes a la caspofungina, reportada en estos estudios, fue similar a la observada para el fluconazol y superior a la de anfotericina B, la cual como ya se mencionó produce efectos secundarios. Por tal motivo, se puede sugerir que la caspofungina es una buena alternativa terapéutica. Finalmente se puede concluir lo siguiente:

1. La respuesta terapéutica a la anfotericina B, observada en los ratones infectados con H. capsulatum a dosis equivalentes a la aplicada en humanos o menores a ésta, fue muy diversa, sin embargo, en todos los casos se presentó mejoría clínica y biológica (micológica), al compararla con los controles sin tratar.

2. La caspofungina, al ser aplicada como terapia contra la histoplasmosis diseminada experimental murina, presentó excelente actividad antifúngica (eliminación de las levaduras de los órganos blanco), y resolución de la infección.

3. Se observó efecto sinérgico en la terapia combinada de caspofungina + anfotericina B a dosis bajas, aplicada en la histoplasmosis diseminada experimental murina, lo cual podría tener un gran valor terapéutico y ser una nueva alternativa en el tratamiento de la histoplasmosis refractaria a anfotericina B.

INTRODUCCIÓN

"Mecanismo de acción de SC-2 de Solanum chrysotrichum sobre hongos de interés médico mediante microscopía electrónica"

Estudios previos, efectuados por éste grupo de trabajo, apoyados por CGPI han permitido determinar la actividad antifúngica de extractos de plantas utilizadas en Medicina Tradicional Herbolaria con resultados de alta eficiencia en dicha actividad sobre levaduras oportunistas de Candida. En éste proyecto se pretende analizar los mecanismos de actividad antifúngica de la saponina SC-2 de Solanum chrysotrichum participando con el Dr. Armando Herrera Arellano, Médico investigador del Centro de Investigación Bimédica del Sur, Departamento de Investigación y Desarrollo de Fitomedicamentos, Laboratorio de Farmacología, del IMSS, Xochitepec, Morelos. En trabajos previos nuestro grupo de trabajo y el del Dr. Arellano han participado activamente para demostrar el efecto antifúngico del extracto de S. chrysotrichum sobre Dermatofitos y sobre levaduras en ensayos tanto in vivo como in vitro, en por lo que en el presente estudio se pretende conocer a que nivel actúa este metabolito. En México existen estudios etnobotánicos que reportan tratamientos exitosos con extractos de Solanum chrysotrichum popularmente conocida como “sosa”, utilizada fundamentalmente en el manejo de la tiña de los pies. Se ha demostrado in vitro que S. chysotrichum posee actividad contra hongos y levaduras, microorganismos causales de micosis superficiales tales como C. albicans, T. mentagropytes, T. rubrum y M. gypseum. Más aún, se ha logrado identificar y cuantificar saponinas con actividad antimicótica, de las que sobresale el compuesto denominado SC-2 que corresponde a una saponina con estructura de espirostano triglicosilada. Actualmente sé esta en posibilidades de contar con un extracto de esta especie vegetal estandarizado en 2.8% de saponinas antifúngicas. Se ha concluído la parte experimental realizando todas las actividades propuestas en el proyecto: A partir de la saponina SC-2 de S. chrysotrichum determinar la concentración mínima inhibitoria del crecimiento sobre levaduras de Candida sp. y de Cryptococcus neoformans. 2.- Determinar las Concentraciones fungicidas mínimas de la saponina sobre levaduras de Candida sp 3.- Mediante microscopía electrónica describir el mecanismo de acción de la saponina Sc-2 de S. chrysotrichum sobre levaduras de Candida y de dermatofitos. El efecto observado se presenta a nivel de membrana fúngica.

MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL A) Material biológico

Cepas de referencia • Candida parapsilosis ATCC 22019 • Candida krusei ATCC 6258 • Candida albicans ATCC 10231

Candida albicans 60 Candida glabrata 24 Candida albicans 20 Candida glabrata 15 Candida albicans 19 Candida parapsilosis 18-2

Candida albicans 63 Candida tropicalis 146 Candida lusitinae 156 Cepas de Criptococcus : Critococcus neoformans var. gatti y Criptococcus neoformans var. neoformans.

Cepas de prueba • Aislados clínicos y ambientales de Candida, Cryptococcus neoformans y dermatofitos

B) Antifúngicos

• Anfotericina B (AmB). Sigma No. De Cat. A-4888 • Fluconazol • Ketoconazol • Itraconaol • Caspofungina. Merck

C) Medios de cultivo • Sabouraud Dextrosa Agar (SDA). Merck No. De Cat. 1.05438 • Dextrosa sabouraud líquido. Bioxon No. De Cat.210700 • Caldo rápido de Urea (Ruth broth). Bioxon No. De Cat.215-1 • RPMI 1640 0.2% glucosa. GIBCO BRL No. De Cat.31800-022

D) Reactivos

• Dimetilsulfóxido.(DMSO) Sigma No. De Cat. 5879 • Ácido morfopropilensulfónico (MOPS). Sigma No. De Cat.M6270

E) Material y reactivos utilizados en el Laboratorio de Micología F) Material específico

• Placas NUNC de 96 pozos, fondo plano estériles. NUNC No. De Cat.167008 • Agitadora mecánica • Lector de microplacas de ELISA Labsiystems Multi skan MS

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (MIC) DE LAS CEPAS DE Candida Y Crytococcus neoformans. Método de referencia para determinar la susceptibilidad de las levaduras a los antifúngicos. Standard aprobado por The National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS). Documento M27-A. modificado por European Committeé on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) Dilución del antifúngico. 1.-Para la preparación de la solución madre del antifúngico se siguió el siguiente procedimiento: Se pesaron (16 mg de AmB y 128 mg de Caspofungina) en un tubo eppendorf. 2.-Se diluyeron en 1 mL de Dimetil Sulfóxido (DMSO) a la AmB y en 1 mL de agua estéril a la Caspofungina. 3.- Se realizó una dilución 1:10 de cada antifúngico. Se colocaron en un tubo estéril 9 mL del disolvente y adicionaron el mL del antifúngico contenido en el tubo de eppendorf. Las concentraciones finales fueron de 1,600 µg/mL para la AmB y de 12,800 µg/mL de Caspofungina. 4.-Se realizó una dilución 1:2 de los antifúngicos, para ello se colocaron en una gradilla 10 tubos de 12 x 75 mm con tapón, estériles. Numerarlos del 1 al 10. 5.-En el tubo No. 1 colocaron 1 mL de la solución de la AmB o de Caspofungina. 6.-Del tubo 2 al 10 colocaron 0.5 mL de DMSO para la AmB o de agua estéril para la Caspofungina, en cada tubo. 7.-Se pasan 0.5 mL de AmB o 0.5 mL de Caspofungina del tubo 1 al tubo 2 agitar y continuar hasta el tubo 10. Descartar 1 mL del tubo 10. 8.- Se realizó una dilución 1:50 de cada una de las concentraciones anteriores del antifúngico. Colocar 10 tubos con tapón estéril. Numerarlos del 1 al 10. Colocar 9.8 mL de medio RPMI 0.2% de glucosa a cada uno. Transferir 0.2 ml a partir de cada uno de la dilución 1:2

de los tubos anteriores. Agitar con vortex. Concentraciones finales de 16 a 0.03 µg/mL para la Anfotericina B. Proceder en la misma forma para la Caspofungina, concentraciones finales de: 128 a 0.25 µg/mL. Almacenar a -20 0C. Preparación del inóculo 1.-Se sembraron en agar Sabouraud las cepas a probar e incubarlas a 37 0C durante 48 horas. Se debe verificar que las cepas no estén contaminadas, antes de iniciar la prueba. 2.-El inóculo se preparó tomando una asada del cultivo y depositándola en un tubo de vidrio con tapón, el cual debe de contener 1 ml de agua destilada estéril, la suspensión se agita en un vortex por 15 segundos. 3.-La densidad de la suspensión celular se ajustó una turbidez de 0.5 Unidades de la escala de Mc Farland. Este ajuste produce una solución que contiene entre 1-5 x 106 UFC/ ml. Esta solución se diluye 1:10 con 9 ml de agua destilada estéril. La concentración final del inóculo es de 1-5 x 105 UFC/ml. Se siguieron los mismos pasos para cada cepa a probar. 4.-El inóculo puede guardarse máximo 15 minutos a temperatura ambiente y 2 horas a 4 0C. Llenado de microplacas 1.-Para el micrométodo se utilizaron microplacas NUNC de 96 pozos, fondo plano, estériles. Se llenaron las microplacas por columnas (la microplaca tiene 12 columnas y 8 filas). Se utilizaron pipetas multicanal de modo que se llenaran las 8 filas de cada columna simultáneamente. Para usar las pipetas multicanal fué necesario pasar las soluciones a un recipiente de reactivos, de manera que todas las puntas de la pipeta puedan cargar al mismo tiempo. 2.-La columna 12 es el blanco de reactivos y control de esterilidad. Debe llenarse con 200 µl de RPMI –1640 al 0.2 % de glucosa, sin antifúngico. La columna 11 corresponde al control de crecimiento del microorganismo y debe llenarse con 100 µL de RPMI –1640 al 0.2 % de glucosa. 3.-La columna 10 se llenó con 100 µl de la dilución de antifungico del tubo No.10. La columna 9 se llenó con 100 µl de la dilución del tubo No. 9 y así sucesivamente hasta la columna 1. En caso de contar con un solo recipientes de reactivos se respetó el orden de llenado iniciando con las columnas 12, 11 con medio RPMI-1640 y para colocar el antifúngico se inició con la dilución mayor y se terminó con la menor (tubos 10 al 1). 4.-Después de llenar la microplaca con las diluciones de los antifungicos correspondientes se procedió a inocular (cada cepa por duplicado) de la columna 1 a la 11 con 100 µL de cada suspensión de las levaduras preparado, utilizando pipetas multicanal con 11 puntas. En cada microplaca pueden probarse 4 cepas. Todos los pozos deben contener un volumen final de 200 µL.

5.-Se rotularon las microplacas con el nombre del antofúngico de prueba, el número de cepas inoculadas y el nombre del microorganismo. Las microplacas se sellaron con tiras de masking tape, pero no completamente; de manera que solo se aseguren las tapas para evitar la evaporación del medio de cultivo durante la agitación, pero de forma que se permita un adecuado intercambio del oxígeno exterior. 6.-Las microplacas se incubaron en una agitadora a 130 r.p.m. durante 48 horas en atmósfera normal. Lectura de los resultados 1.-Cada microplaca se leyó en un lector de placas de ELISA (agitando la microplaca previo a su lectura por 30 segundos) a densidad óptica de 540 nm. 2.-La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) para la Anfotericina B y la Caspofungina es la concentración más baja del antifúngico que inhibe completamente el crecimiento de C. neoformans detectado espectrofotometricamente, comparando la D.O. con la columna 12, que corresponde al testigo de reactivos y medio de cultivo. 3.-La CMI para la Anfotericina B y la Caspofungina corresponde a áquel pozo en el cual no se detecta crecimiento. 4.-Para que la CMI pueda considerarse válida, los pozos de la columna 11 que corresponden a el testigo de crecimiento levaduriforme (sin antifúngico) debe presentar una absorbancia de al menos 0.5 Unidades de Densidad Óptica (U.D.O.) a 540 nm.

Dilución 1:10

Dilución 1:2 1 mL Del tubo 2 al 10 pasar 0.5 mL al siguiente tubo y mezclar con vortex

1 ml AmB + 9 ml DMSO Conc. 1, 600 µg/ml / 1 ml Caspofungina + 9 ml de agua ésteril Conc. 12, 800 µg/ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl

Dilución 1:50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentraciones finales (µg / mL):

AmB: 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.06 0.03 Itraconzol, Ketoconazol y Caspofungina

Fluconazol: 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

0.5 mL DMSO para AmB y 1 mL de agua estéril para la Caspofungina

9.8 mL de RPMI

Dilución de los antifúngicos: Fluconazol, Itraconazol, Ketoconazol, Anfotericina B y Caspofungina.

RESULTADOS

Cuadro No 1. Susceptibilidad de especies de Candida de interés médico a antifúngicos de uso terapéutico frecuente. R –Resistentes; S-Susceptible; F –fluconazol; AmB -anfotericina B; K –ketoconazol; I –itrakonazol;. * Resultados por comprobar.

CMI en µg/ml CEPA R/S

F AmB K I Candida albicans 60 R * 0.5 16 0.07 Candida albicans 20 R * 0.5 8 0.07

Candida albicans 19 R 2* 1 16 0.28 Candida albicans 63 S 0.5 1 0.06 0.07 Candida glabrata 24 R 128 1 16 1 Candida lusitinae 156 S 1 0.5 0.03 16 Candida parapsilosis 18-2 S 4 1 0.03 0.14 Candida tropicalis 146 S * 1 0.5 4 Candida glabrata 15 R 128 1 16 16 Candida parapsillosis ATCC 22019 S 4 0.5 0.12 0.07 Candida krusei ATCC 6258 R 128 1 1 0.12 Candida albicans ATCC 10231 S 2 ? ? ? ? ? 0.07

Cuadro No 2. Susceptibilidad de especies de Candida de interés médico a la Saponina Sc2 de Solanum chrysotrichum. Se utilizó el Micrométodo NCCLS. La CMI se determinó por inhibición del 50% del crecimiento mediante lectura de UDO a 405 nm. La CFM se determinó por inhibición del 99% de crecimiento (UFC/ml).

CMI50% CFM CEPA ( µg/ml ) ( µg/ml)

Candida albicans 60 200 400 Candida albicans 20 200 400 Candida albicans 19ª175 200 800 Candida albicans 63122 400 800 Candida glabrata 24b 800 800 Candida lusitinae 156f87 200 400 Candida parapsillosis 18-2 200 800 Candida glabrata 15ª391 400 800 Candida tropicalis 146c78c 400 800 Candida krusei ATCC 6258 400 800 Candida parapsillosis ATCC 22019 200 800 Candida albicans ATCC 1031 200 800

Efecto de la saponina Sc-2 de Solanum chrysotrichum sobre levaduras de Candida . albicans. Fig A- Candida albicans célula testigo sin adición de la saponina SC-2. Fig. B Candida albicans + saponina Sc-2 a las 12 horas de incubación. La principal alteración es a nivel de membrana, se observa pérdida de los diferentes estructuras citoplásmicas. Además puede apreciarse rompimiento celular en uno de los extremos. Microscopia electrónica 3000 x.

A B

IMPACTO

Desde la prehistoria el hombre ha utilizado las plantas como alimento, en rituales de tipo ceremonial, además para curar sus males y enfermedades. Los pueblos que habitaban mesoamérica, se encontraban con una amplia gama de ecosistemas, producto de los diferentes climas, suelos y latitudes, y por consiguiente una amplia biodiversidad en la flora y fauna, ello les permitió utilizar las plantas para curar sus enfermedades. Nuestro país cuenta con una gran variedad de especies vegetales, donde más de la mitad de dichas especies se considera se le ha dado una aplicación en la medicina tradicional, sin embargo solo a una mínima parte se le efectuado investigación farmacológica. El saber tradicional sobre el uso medicinal de las plantas nos ha llevado a la búsqueda de nuevos recursos medicinales; estos conocimientos, conservados por los pueblos indígenas, han sido de gran trascendencia para encontrar alternativas viables que nos dirijan a resolver no solo las enfermedades en las áreas rurales, sino también en áreas urbanizadas. Esta investigación corresponde a un programa de investigación sobre una planta en particular llamada Solanum chrysotrichum. Esta planta es utilizada en el Hospital regional No. 1 del IMSS en Xochitepec, Morelos, como tratamiento empírico en tiña de los pies, tiña capitis y actualmente se está probando en infecciones candidódsicas vaginales (Herrera-Arellano A, A Herrera Arellano A, A Rodríguez -Soberanes, MA Martínez-Rivera, E Martínez -Cruz, A Zamilpa, L Alvarez & J Tortoriello. 2003. Effectiveness and tolerability of a standarized phytodrug derived from Solanum chrysotrichum on Tinea pedis: A controlled and randomized clinical trial. Plant Med. 69: 390-395 y Herrera-Arellano A, Jiménez-Ferrer E, Vega-Pimentel AM, Martínez-Rivera MA, Hernández-Hernández M, Zamilpa A y Tortoriello J. 2004. Clinical and mycological evaluation of therapeutic effectiveness of Solanum chrysotrichum standardized extract on patients with Pytirisis capitis (Dandruff). A double blind and randomized clinical trial controlled with ketoconazole. Planta Med . 70: 1-6.). Como puede apreciarse a la microscopia electrónica, (ver figuras A y B) la saponina Sc-2 como principio activo de S. chrysotrichum actúa a nivel de las membranas que integran la célula de Candida albicans, incluyendo: retículo endoplámico, vacuolas fagocíticas, aparato de golgi, núcleo y nucleolo, alterando las funciones propias de la célula. Los resultados obtenidos en este estudio justifican el uso terapéutico de S. chrysotrichumen como un fitofármaco en el tratamiento de infecciones causadas por dermatofitos, pitiriasis capitis y posiblemente infecciones vaginales causadas por especies de Candida. La utilización de las plantas medicinales que han sido estudiadas encaminan a tener terapias alternativas cuyos tratamientos sean cada vez más accesibles a la población en general, que no presenten efectos colaterales y sobre todo que sean de bajo costo.