Tecnologa del ADN

recombinante

Viridiana Lechuga Rosas

Clonacin de DNA

En 1970 surgen tcnicas que

permiten aislamiento del DNA

Enzimas de restriccin

Ingeniera gentica

Tcnicas del DNA recombinante

Clonacin

1. Preparacin del DNA

2. Preparacin del vector

3. Unin del DNA al vector

4. Incorporacin del DNAr

5. Propagacin celular y seleccin

6. Expresin del DNA (opcional)

Enzimas de restriccin

Endonucleasas Tijeras moleculares

Cortan la doble cadena de DNA a travs del esqueleto de fosfatos sin daar las

bases

Especificidad

Proteger a los organismos contra la invasin de DNA extraos

Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado

Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias

palindrmicas

Enzimas de restriccin

Tipo I Tipo II

Cortan las dos cadenas del DNA en una posicin aleatoria a cierta distancia del sitio

de restriccin

No se utilizan en investigacin de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es

preciso.

Reconocen una secuencia especfica y cortan las dos cadenas de la molcula de

DNA con absoluta precisin dentro de la

secuencia reconocida.

Se usan ampliamente en investigacin de DNA recombinante puesto que cortan en

sitios especficos.

Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simtricas (palindrmicas)

Nombran Tres letras tomadas del gnero y especie de la bacteria donde se aisl

Seguida por el serotipo

Nmero romano

Escherichia coli cepa RY13 Eco RI

DNA metilado

Enzimas de restriccin tipo II

Ligasas

Cataliza la formacin de enlaces fosfodister entre bases de DNA

Grupo fosfato en 5

Grupo OH en 3'

Extremos salientes complementarios

Extremos rasurados

Los extremos no compatibles son imposibles de ligar

Purificacin del DNA

Rompimiento de la estructura que lo contiene y eliminacin de cualquier

sustancia contaminante o molcula unida a l.

Protenas, membranas, sales, etc.

Mtodos

Disolventes

Precipitaciones

Origen de DNA

Tamao y estructura

Uso de molcula

Purificacin del DNA Pasos Objetivos Mtodos

Lisis Liberar los componentes

internos de la clula

Detergentes fuertes y desnaturalizantes para

lisis de clula

Mtodos para separar el ncleo del

citoplasma

Separacin inicial Remover los

contaminantes

mayoritarios

Precipitacin de cidos nucleicos

Tratamiento con enzimas especficas

Purificacin Remover contaminantes Extraccin

Purificacin final Remover contaminantes

residuales

Mtodos especficos

Confirmacin Determinar pureza y

concentracin

Espectroscopia con luz UV

Vectores

Portador de DNA que se unir al fragmento que se quiere clonar

Extracromosomales

Replicacin autnoma (replicones )

Plsmidos, virus y bacterifagos

Unin de vector o inserto

Cortar vector con mismas enzimas de restriccin

Unin con ligasas

DNA recombinante (DNAr)

Amplificar el DNA de inters

Vectores de insercin

Expresin del DNA por parte de la clula anfitriona

Vectores de expresin

El vector original tiene sitios de restriccin adecuados para unirlo con el mismo inserto de DNA

Mtodo directo

El vector original no tiene los sitios de restriccin adecuados para unirlo con el inserto de DNA

Policonector

Mtodo indirecto

Obtencin de fragmentos de DNA

Mtodos

Digestin por enzimas de restriccin Fragmentos de longitud pequeo

Rompimiento mecnico del DNA Fragmentos largos (10000 pb)

Sntesis enzimtica de DNA PCR

Sntesis qumica de DNA Formacin de enlaces fosfodister en

direccin 3-5'

Formacin del DNA recombinante

DNA que sufre clonacin

Combinar dos fragmentos de DNA de orgenes diferentes

Vector + inserto

Unin covalente in vitro

Ligasa

Productos secundarios no deseados

Incorporacin de DNA recombinante

Clula anfitriona

Clulas especializadas

Procariticas Eucariticas

Transformacin El inserto de DNA permanece unido a

plsmido

Recombinarse con el DNA del cromosoma

Expresin de una protena Levaduras

Mtodos de introduccin del DNAr

La permeabilidad de la membrana no permite el paso de DNAr

Mtodo pasivo (facilitar su captacin)

Mtodo activo (directo)

Transformacin (bacterias anfitrionas)

Trasfeccin (virus como vectores)

Mtodo de introduccin de DNAr

Fsico-qumico Incubacin con CaCl a 0C 37-43 C

Incorporacin pasiva de DNA Interaccin de cationes Fosfato clcico DEAE-dextrano

Agente qumico PEG( polietilenglicol)

Liposomas Fusin con membrana

Vectores vricos Transfeccin

Electroporacin Apertura de poros transitorios en la membrana

Biolstica bombardeo Microesferas recubiertas con DNAr Pistolas de genes

Deteccin y seleccin de clones

recombinantes Necesario conocer que clulas introducen el material clonado

Mtodos

Mtodo de hibridacin Deteccin de una secuencia del DNA clonado

Sonda marcada

Mtodo inmunoqumicos Deteccin de protena codificada Anticuerpo especfico

Mtodos genticos o de seleccin fenotpica Cambios en clula anfitriona Genes marcadores

Genes que codifican una protena detectable

Genes de resistencia a un antibitico Genes que complementan defectos

nutricionales

Asociaciones