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MICROCULTIVO

Los mohos viven como saprofitos en el suelo y agua donde contribuyen a la descomposición de la materia orgánica y al reciclado de materia orgánica, utilizando enzimas extracelulares como celulasas y pectinasas, manteniendo de esta manera la fertilidad del suelo.

Los hongos se aprovechan directamente como alimento (por ejemplo los champiñones) e indirectamente en la elaboración de cerveza, vino y pan (Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas con ésta). Además el queso Roquefort se produce inoculándolo con Penicillium roquefortii durante su elaboración y otros quesos suaves como el camembert se producen inoculando Penicillium camemberti. El moho crece sobre la superficie produciendo una proteasa que descompone la estructura del queso. Otros ejemplo es el interés en la producción de proteína de origen unicelular a partir de mohos, ya sea apara alimento del hombre o del ganado, por ejemplo el uso de Candida utilis y la levadura desecada Saccharomyces cerevisiae Además de la producción de alimentos, los mohos producen ácido cítrico para bebidas embotelladas, se basa en el crecimiento de Aspergillus niger, el descubrimiento de penicilinas como productos metabólicos de Penicillium notatum revolucionó la medicina moderna, hoy en día se produce con una variedad denominada Penicillium chrysogenum. Existen otros antibióticos producidos por mohos estos son las cefalosporinas, griseofulvina, ácido fusídico

Algunas características de los mohos.

• Los mohos tienen las siguientes características:

• Son eucariontes, presentan un núcleo rodeado de membrana

• No contienen clorofila

• Se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza

• Los filamentos se llaman hifas y al conjunto de hifas se le llama micelio

• El interior de la hifa puede estar septada o no

• Son inmóviles, aunque existen esporas móviles

• La mayoría son esporulados

• La espora se forma por la fusión de los núcleos de dos células

• Si las esporas asexuales están contenidas en un saco, este recibe el nombre de esporangio, a la hifa que lo sostiene, esporangióforo, y a las esporas esporangiosporas. Si se forma fuera de un saco, se les designa conidiosporas.

• Las esporas sexuales que se forman dentro de un saco (ascas) se denominan ascosporas

• Muestran requerimientos nutricionales mínimos y su pH es cercano a 5,6

• Los límites de temperatura para su desarrollo es de -6 > 70°

• Se multiplican abundantemente a humedades elevadas

• La mayoría de los mohos son aeróbicos

• Son heterótrofos, pero crece bien en cultivos simples

• Algunos son termodúricos

• Algunos producen micotoxinas

Las levaduras se distinguen de los mohos en que son unicelulares, no suelen formar filamentos y se reproducen por fisión binaria o gemación. Generalmente son de forma ovalada

La identificación de los mohos, unicelulares o filamentosos se realiza a través de:

• Morfología colonial

• Microcultivo

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• Morfología microscópica

• Pruebas metabólicas (levaduras)

• Composición de la pared celular

• Respiración

• Nutrición

• Reproducción

• Genética molecular.

Morfología colonial: Los mohos unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el diámetro oscila entre 2-4 mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. cóncavas de aspecto brillante o mate, opacas, de bordes lisos.

Morfología colonial: Los mohos filamentosos (mohos), tienen colonias de 2-3 cm de diámetro, de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. con aspecto polvoso, rugoso, terroso, aterciopelado, algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares.

Morfología microscópica: La morfología microscópica se observa con la ayuda del microscopio a seco fuerte mediante la realización del microcultivo, observándose las siguientes estructuras:

1.- Según su nivel de organización celular pueden ser:

- Unicelulares (levaduras)

- Pluricelulares (mohos)

- Dimórficos (posee ambos tipos de micelio)

Fig. 71 a.- Unicelular b.- Pluricelular

Por su tamaño

Fig. 71 Macroscópicos Microscópicos

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Por su forma

Fig. 72 Amorfos (masa algodonosa) Definida (crecimiento circular)

Fig. 73 Por su ausencia o presencia de septos

Aéreo fuera del sustrato

Profundos dentro del sustrato

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Fig. 74 Por su localización

Por su aspecto

Algodonoso, aterciopelados, terrosos, húmedo, seco.

Por su función:

- Micelio vegetativo: se encarga de la captación de nutrientes.

- Micelio aéreo o reproductor: producción de esporas (sexual y asexual)

b) De acuerdo al color de las hifas:

- Hialino: cuando no está pigmentado.

- Dematiáceo: cuando posee color café oscuro.

c) Su sistema de reproducción es asexual y sexual:

- Las esporas asexuales son:

Talosporas.

a) Artrosporas: Son esporas que se forman por fragmentación de las hifas.

b) Blastospora: Se forman en las levaduras por la gemación a partir de una célula ya preexistente.

c) Clamidospora: Estas esporas son redondas y tienen doble pared gruesa que les confieren resistencia.

Conidiosporas

a) Microconidias: Son esporas unicelulares

b) Macroconidias: Son esporas multinucleadas.

Esporangiosporas

Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo, por una estructura llamada esporangióforo.

- Las esporas sexuales son:

Zigosporas: esporas contenidas en cigosporangios en los Zimomycetes.

Ascosporas: esporas contenidas en saquitos denominados ascas en los Ascomicetes.

Oosporas: esporas contenidas en oosferas correspondientes a los Oomycetes.

Basidiosporas: esporas contenidas en basidios correspondientes en Basidiomicetes.

Morfología colonial de mohos y levaduras

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Fig. 75 Diferentes forma de levaduras y mohos

OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE MOHOS.

Determinar: Tamaño, forma, aspecto, color, producción de pigmento difusible y anotar los días de incubación. A continuación se muestran dibujos de mohos filamentosos.

Una vez realizada las observaciones las cepas se pueden sembrar en tubo para su conservación o para la realización del microcultivo

Sembrar por punto en tubos con PDA y ADS

Fig. 75 Conservación de cepas de mohos.

IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (MICROCULTIVO)

1. Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bisturí estéril y caliente.

Fig.76 Forma en que se cortan los cuadros de agar par el microcultivo

2. Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que está sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” en una caja de Petri (previamente esterilizada).

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Fig. 77 Material parta el microcultivo y puesta del cuadro de agar

3. Tomar con el asa él inoculo del moho previamente seleccionado.

4. Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar.

5. Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio.

Fig. 78 Inoculación del cubo de agar, y colocación del glicerol para mantener la huemdad

6. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri.

7. Incubar la caja a 28° C durante 48 h.

REALIZAR OBSERVACIONES MÍNIMO CADA 12 h PARA IDENTIFICAR LOS CUERPOS FRUCTÍFEROS.

1. Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, retirar el glicerol con una pipeta Pasteur.

Fig. 79 Observación del crecimiento del hongo y retiro del glicero para su inactivación

2. Adicionar 5 ml de formaldehído para inactivar el moho durante 15 minutos.

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Fig. 80.- Inactivación del moho

3. Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un portaobjetos que contenga una gota de azul de algodón, sellar la preparación con barniz de uñas transparente.

4. Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodón, colocar un cubreobjetos sobre el colorante y sellar la preparación. Observar las preparaciones a 10X y 40X.

Fig. 81.- Realización de la preparación en fresco del microcultivo

5. Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía realizar la comparación de las estructuras reproductoras y vegetativas, identificar de que moho se trata. Por ejemplo: Rizopus sp

Fig. 82 Aspergillus Penicillium Alternaria

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Fig. 83 Rhizopus sp

OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LEVADURAS

Para la identificación de levaduras utilizamos generalmente reacciones de fermentación de carbohidratos. Observar las levaduras que pueden aparecer sobre la superficie o en el seno del agar. En el primer caso son circulares y de diámetro mayor al de las bacterias; en el seno del agar suelen aparecer estrelladas y algo más pequeñas, son de aspecto húmedo y pueden ser coloridas.

Fig. 84 Crecimiento de levaduras

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS.

1. De una placa de PDA incubada a 35°C seleccionar una colonia de levadura. 2. Fijar la levadura de la misma manera como se fija una bacteria.

3. Teñir la preparación con cristal violeta, lavar y dejar escurrir.

4. Observar la preparación en 10X y 40X y dibujar.

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Fig. 85 Observación microscópica de levaduras

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Métodos de conservación de cepas

En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que conservar, teniéndose varios métodos para su conservación pero es necesario tomar en cuenta las características del microorganismos, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues sucede que nuestras cepas tipo pueden en un momento sufrir las siguientes daños como la deshidratación, cambios genéticos o perdida de la viabilidad y finalmente la muerte celular.

Fig. 91 Deshidratación del medio en tubo con tapón de algodón.

Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiología son:

Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación;

Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y

Que estas células permanezcan genéticamente estables.

Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios métodos de conservación para los microorganismos. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados, que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y métodos restringidos.

A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.

Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método preparatorio en si mismo. Los métodos de conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.

a) Conservación por congelación.

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método son los siguientes:

1º.- Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomórficos e incluso en algunos más sencillos.

2º.- Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para la congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar conviene poner las células a 37ºC.

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3º.- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene una temperatura de –195ºC, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de –140ºC.

Aquellos congeladores que sólo alcanzan temperaturas entre –20ºC y –40ºC, como ocurre con la mayoría, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentración de solutos que existen en la suspensión celular, su punto de congelación baja. El daño que se produce en las células es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentración iónica.

Para la conservación en congeladores, las células se almacenan en criotubos (tubos de plástico esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Este método no se debe emplear para la conservación de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el género bacteriano Clostridium, ya que al estar las células en una superficie hay un mayor contacto con el oxígeno y puede afectarse la viabilidad.

4º.- Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa o inositol. En su elección influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar.

b).- Conservación por liofilización.

Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores. Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es muy cómodo.

Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilización son lógicamente los mismos que influyen en la congelación, a los que habrá que añadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratación. Sin embargo, antes de pasar a explicar éstos, tenemos que hacer unas breves consideraciones sobre los que antes hemos mencionado para el caso de la congelación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, ya vimos que se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas, mezclas de glucosa con caldo hígado o chopped meat (sin carne) para bacterias anaerobias.

Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservación son:

1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos mohos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos.

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2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden de 108-109 células /ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de mohos filamentosos y levaduras.

3. Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC.

4. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que no es perjudicial.

5. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células.

6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad.

B.- Métodos alternativos.

Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

a).- Conservación por transferencia periódica.

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características. Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inoculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos; y almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC. A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.

b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.

Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células /ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar diluida.

Para demostrar la eficiencia de un método en nuestras cepas se tiene que determinar el porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica, bioquímica y la virulencia..

C.- Métodos restringidos.

En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro métodos que vamos a citar se basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células.

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a).- Desecación en papel de filtro.

Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelación incontrolada de las células.

b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.

Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es barato y de fácil conservación.

Fig. 92 Deshidratación del medio para generación de esporas en mohos

Fig. 93 Conservación de esporas en aceite mineral y arena estéril

Desecación en bolitas de alginato.

Éste es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato. Este es un método que se está utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales.

c).- Desecación en sal para halobacterias.

Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.

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Por último, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el método empleado en la conservación de las cepas microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las células que se han estado guardando, porque éstas vienen de una situación de estress más o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de prueba. Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo más posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas en medios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad microbiana, cada microorganismo soportará determinados métodos de conservación mejor que otros, o será necesario tomar precauciones especiales en su conservación. Como ya dijimos al comienzo, no existe un método general de conservación de los microorganismos, aunque no resulta difícil determinar el más aconsejable en cada caso. La mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a largo plazo con los métodos generales de congelación y/o liofilización, y para periodos cortos pueden mantenerse vivos.

CULTIVO EN TUBO INCLINADO PARA CONSERVACIÓN DE CEPAS POR REFRIGERACIÓN

1.- Tomar un tubo con agar de soya y tripticaseína y sembrarlo por estría simple

2.- Adicionarle 3 ml de aceite mineral estéril. (El aceite se puede esterilizar en autoclave o en el horno)

3.- Cerrar el tubo con el tapón, etiquetar el tubo perfectamente, colocarlo dentro de un bote y guardarlo en el refrigerador.

Fig. 94.- Diferentes formas de conservación de cepas

Fig. 95 Una de las formas más usuales de conservar las cepas es en congelación

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Aislamiento

Una vez transcurrido el tiempo de incubación del cultivo, observamos la placa de Petri, escogeremos las colonias que estén separadas, a estas les realizaremos la morfología colonial previamente revisada, además haremos una tinción de Gram para determinar el grupo al que pertenece. Una vez conocido el Gram podremos realizar la Identificación del microorganismo y para ello es necesario elegir las más adecuadas acorde a lo que tenemos y a lo que nos sugiere la bibliografía, pues existen algunas marchas ya descritas las cuales nos son de gran valor para la Identificación.

La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias, por medio de las cuales podemos identificarlas hasta especie, es realizando un subcultivo de la colonia pura, aunque es posible efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario, selectivo o diferencial. Se recomienda que de una sola colonia hacer una suspensión bacteriana en 1 ml de solución salina fisiológica 0.85 p/v para que de ahí se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioquímicas.

Los siguientes pruebas de Identificación para bacterias están agrupados por bacterias Gram (-) y +).

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.)

TSI (fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico y producción de gas)

LIA ( Descarboxilación de la lisina)

MIO (movilidad, Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol)

SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico)

Rojo de metilo

Producción de urea

Reacción de Voges Proskauer

Utilización de Malonato

Utilización del citrato

Licuefacción de la gelatina

Crecimiento en caldo nutritivo

Utilización de la esculina

Utilización del gluconato

Requerimientos de oxígeno

Catalasa

Oxidasa

Reducción de nitratos

Fermentación O/F

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.)

TSI (fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico y producción de gas)

LIA ( Descarboxilación de la lisina)

MIO (movilidad, Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol)

SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico)

Catalasa

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Oxidasa

Reducción de nitratos

Hemólisis

Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %

Crecimiento en bilis al 40 %

Coagulasa

Licuefacción del a gelatina

Hidrólisis de la esculina

Voges - Proskauer

Prueba de la fosfatas

Prueba de la DNAsa

Incubación a 10 y 45 °C

Reducción con azul de metileno

Hidrólisis del hipurato

Formación de cápsula

Hidrólisis del almidón

Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura para hacer una selección de pruebas recomendable y lograr el objetivo lo más rápido posible y sin perdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas.

UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS

1.- HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

Fundamento.

Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.

a.- En una caja con agra almidón se procede a inocular por estrías simple la placa

b.- Incubar la caja a 35°C durante 24 h.

c.- Después de la incubación añadir unas gotas de lugol cubriendo la superficie de la placa.

- RESULTADOS:

+ Positivo.- Si se forma un halo claro alrededor de la estría.

- Negativo.- No se forma un halo claro alrededor de la estría.

Fig. 96 Siembra en agar almidón y realización de la prueba con lugol

2.- FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL

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Fundamento:

Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio, produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene rojo de fenol por lo que:

Indicador de pH: rojo de fenol

pH ácido: Color amarillo

pH alcalino: Color rojo

Prueba positiva: da una coloración amarilla y con la producción de gas (aerogénica)

Prueba negativa el color se mantiene de color rosa-rojiza. El tiempo de incubación es de 24 h

a.- Al tubo con campana de Durham y caldo rojo de fenol más el carbohidrato por ejemplo sacarosa, inocular 0.1 ml de la suspensión microbiana.

b.- Incubar a 35 °C de 24 a 48 horas

c.- Observar el tubo

- RESULTADOS:

+ Positivo.- Si hay cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham

- Negativo.- Si hay no cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham

Fig. 97 Fermentación de un azúcar con campana de Durham

3.- FERMENTACIÓN DE AZUCARES EN MEDIO TSI.

Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar hierro (TSI).

Fundamento:

Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.

La formula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar esta preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2 cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es relativamente anaerobia.

Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de flauta, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, para ello utilizar tubos de 13 X 100 mm. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18- 24 h.

Indicador de pH: rojo de fenol

pH ácido: Color amarillo

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pH alcalino: Color rojo

RESULTADOS:

Prueba positiva: La fermentación de la glucosa se lleva a cabo en anaerobiosis, por lo cual la prueba se lee en el fondo del tubo.

Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo

Glucosa negativa: Fondo alcalino, sin cambio.

Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla

Sacarosa y lactosa negativas: superficie roja

Lactosa positivo: Color amarillo en el pico de flauta.

Lactosa negativo: De color rojo en el pico de flauta.

Producción de H2S: Presencia de una coloración negra.

Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio del fondo dejando un espacio libre.

a.- Inocular con el asa recta por picadura y después por estría abierta en forma de “S” sobre el pico de flauta en un tubo con agar TSI a partir de la suspensión.

b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h y observar los cambios en el tubo.

Fig 98 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: Tubo sin inocular2.- A/A con producción de gas, 3 A/A sin producción de gas, 4 K/A sin producción de gas y H2S negativo, 5 A/A y H2S positivo sin producción de gas, 6K/A con producción de H2S y sin producción de gas.

Fig 99 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: A/A sin producción de gas y H2S negativo, 2: K/K y H2S negativo sin producción de gas, 3 K/K sin producción de gas y H2S negativo e inmóvil , 4 K/A con producción de gas y H2S negativo, 5: K/A con producción de gas y H2S positivo y móvil y Tubo 6: A/K

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4.- PRUEBA DE ROJO DE METILO

Fundamento:

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es cualitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos láctico, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen muchos microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.

La preparación de este medio se hace en tubos de 13 X 100, colocando 4 ml del medio de RM – VP y se inocula con el cultivo puro del organismo en estudio. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 – 72 h (no menos de 48 h, finalizando este período, añadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo.

Indicador de pH: Rojo de metilo

Rojo de metilo positivo: Color rojo estable en la superficie del medio que indica la producción de ácido suficiente como para bajar el pH a 4,4.

Rojo de metilo negativo: dado que algunos microorganismos produzcan cantidades menores de ácido puede producirse un color entre el amarillo y rojo lo que indicara que la prueba es negativa.

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes

a.- Inocular con 0.1 ml de la suspensión al caldo rojo de metilo.

b.- Incubar el tubo a 35°C durante 48 h.

c.- Después de la incubación, añadir al tubo 2 gotas de la solución de rojo de metilo y observar.

RESULTADOS:

Prueba positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.

Prueba negativa: El cultivo no cambia de color.

Fig. 100 Resultados del medio rojo de metilo

5.- PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

Fundamento:

La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en diacetilo por acción del KOH al 40 % y el oxígeno atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el α - naftol actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo.

Indicador de pH: Rojo de metilo

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Prueba Control negativo Control positivo

Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp

a.- Inocular un tubo que contenga caldo Voges Proskauer con 0.1 ml de la suspensión

b.- Incubar el tubo a 35°C durante 24 h.

c.- Después de incubar, agregar 6 gotas de solución de alfa-naftol y 2 gotas de solución de KOH, en ese orden estricto y agitar suavemente, dejar en reposo 10-15 minutos y observar los cambios en el medio.

RESULTADOS:

Prueba positiva: Color rojo ladrillo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetoina)

Prueba negativa: No hay cambio en el color del medio.

Fig. 101- Resultado de la prueba de VP, tubo 1 negativo, tubo 2 positivo y tubo 3 medio sin inocular

UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS

6.-CITRATO DE SIMMONS

Fundamento

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

Controles

Control positivo: Enterobacter aerogenes

Control negativo. Escherichia coli.

a.- Inocular por estría abierta en forma de “S” un tubo que contenga agar Citrato de Simmons a partir de la suspensión.

b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h.

c.- Observar los resultados

RESULTADOS:

Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).

Negativa: No hay desarrollo (medio de color verde).

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Fig. 102 Prueba del citrato de Simmons

7.-CALDO MALONATO

Fundamento

Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono, con la consiguiente alcalinidad.

El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido fumárico, inhibiendo la acción catalítica de la enzima succínico deshidrogenasa, mediante un proceso de inhibición competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima encerrando los sitios activos de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona un bloqueo en la oxidación del ácido succínico

Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto ácido es influido independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como el ácido fumárico, el ciclo de Krebs deja de funcionar, por lo tanto la célula bacteriana, entonces, recurre al ciclo del ácido glioxílico para la producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo continuo de esa manera poder regular la cantidad de acetil coenzima A introducida en el ciclo.

Indicador de pH: Azul de bromotimol

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Caldo malonato Salmonella sp Alcaligenes faecalis

a.- Inocular con 0.1 ml de la suspensión microbiana un tubo que contenga caldo malonato

b.- Incubar el tubo a 35°C durante 24 h y observar.

RESULTADOS:

Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul intenso

Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.

Fig. 103.- Prueba negativa y prueba positiva

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8. CALDO UREA

Fundamento

La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo puede hidrolizar a la urea que esta presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio.

Inocular un tubo con caldo urea con una asada de la suspensión microbiana a estudiar, si se utiliza agar urea se estría la superficie del medio e incubar el medio a 35 ° C durante 24 h.

Indicador de pH: Rojo de fenol.

Controles

Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo

Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli

a.- Inocular 0.1 ml de la suspensión microbiana a un tubo que contenga caldo urea

b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h.

RESULTADOS

- Hidrólisis por producción de ureasa Positiva: Color rosa fucsia en el medio.

Negativa: Sin cambio de color en el medio

Fig. 104 Prueba negativa y prueba positiva

HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:

9.- LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (método del tubo)

Fundamento:

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente. Estas enzimas que son capaces de gelatinólisis, se denominan gelatinazas.

Las proteínas que se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes más pequeños, las enzimas exocelulares de tipo proteolítico, gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El catabolismo de las proteínas por las gelatinazas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.

Controles

Control positivo: Staphylococcus aureus

Control negativo. Listeria monocytogenes

a.- Inocular por picadura un tubo que contenga gelatina nutritiva a partir de la suspensión

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b.- Incubar a 35 °C durante 24 h

c.- En cada revisión de la prueba sacar de la incubadora y colocar el tubo en el refrigerador por cinco minutos junto con el testigo para verificar el resultado

d.- Observar si hay licuefacción de la gelatina, en el caso de que la prueba sea negativa hay que volver a incubar. Descartar la prueba negativa hasta los 14 días

Fig. 105 Tubo de arriba negativo y el de abajo positivo

10.- MEDIO SIM

a.- Inocular por picadura con el asa recta un tubo con medio SIM a partir de la suspensión

b.- Incubar a 35 °C durante 24 h.

c.- Después de incubar observar el tubo, una coloración negra indica la formación de ácido sulfhídrico y posteriormente añadir 3 gotas del reactivo de Kovac’s o Ehrlich al tubo para observar la presencia o ausencia de indol.

RESULTADOS:

Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tubo

Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s.

Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.

Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamente negro.

Fig.- 106Tubo 1 SIM äcido sulhidrico positivo y movilidad (+), tubo dos Indol negativo, Tubo 3 microorganismo

inmóvil, tubo 4 tubo sin inocular, tubo 5 äcido sulfhídrico (+) e indol (-) y tubo 6 H2S (-), e indol (+)

11.- MEDIO MIO

Fundamento

Es un medio semisólido, se siembra por picadura y se incuba 24 h a 35 °C. Sirve para leer la movilidad, producción de Indol y descarboxilación de la ornitina. Cada tubo debe de contener 4 ml del medio utilizando

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tubos de vidrio de 13 X 100 mm con tapón de rosca para evitar la entrada de aire y el medio se deja solidificar en forma vertical.

La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. La prueba de Indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de desdoblar el indol de la molécula de triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuada por varias enzimas que en conjunto se denomina “triptofanasa ” .

Para esta prueba también se puede inocular la muestra en caldo triptosa o nutritivo incorporado con triptófano al 1 %.

La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.

El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina.

Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.

Control

Sustancia Control positivo Control negativo

Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae

Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp

Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp

a.- Inocular por picadura un tubo con medio MIO a partir de la suspensión.

b.- Incubar a 35 ºC durante 24 h y observar si hay descarboxilación de la ornitina

c.- Después de observar adicionar 3 gotas del reactivo de Kovac´s y observar la presencia de indol.

RESULTADOS

pH ácido: vire de color a amarillo (Desaminación)

pH alcalino: vire del color a púrpura o morado (descarboxilación)

Movilidad positiva: El medio se enturbia y se ve crecimiento en todo el tubo

Movilidad negativa: El crecimiento es sólo a lo largo de la picadura.

La descarboxilación de la ornitina se lleva a cabo en condiciones anaeróbicas, por lo tanto la prueba solo se lee en el fondo del tubo.

Descarboxilación de la Ornitina positiva: El fondo del tubo debe alcalinizarse y presentar un color púrpura o morado.

Descarboxilación de la Ornitina negativa: Fondo del tubo amarillo.

Para llevar a cabo la prueba del indol se adiciona a el medio 5 gotas del reactivo de Ehrlich o de Kovac´s y se deja durante unos 2 minutos.

Indol positivo: Anillo de color rojo

Indol negativo: Anillo incoloro o café.

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Fig. 107 Medio MIO con producción de indol + y -

12.- DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA.

Fundamento:

En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la Desaminación de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis.

La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa , la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Además la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.

El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina cadaverina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina.

Al Preparar el medio es importante que se deje solidificar en pico de flauta, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, para ello utilizar tubos de 13 X 100 mm. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta., primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18- 24 h.

Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.

Controles:

Aminoácido Control positivo Control negativo

Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae

Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes

a.- Inocular por picadura y estría un tubo con medio LIA a partir de la suspensión.

b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h y observar

RESULTADOS:

- Desaminación de aminoácidos: Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.

Negativa: La superficie no tiene cambios.

- Descarboxilación de aminoácidos: Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura.

Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo

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Fig. 108 Prueba de LIA

DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO

13.- REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS

Fundamentos

La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada para la identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.

Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo α - naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo - α - naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 segundos de añadir los reactivos y dado que los reactivos solo detectan nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.

Indicador de pH: No tiene indicador.

Controles:

Prueba Control positivo Control negativo

Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus

a.- Inocular 0.1 ml de la suspensión a un tubo con caldo nitrato

b.- Después de incubar, determinar la presencia de nitritos, añadiendo al tubo 3 gotas de alfa-naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico. Observar si hay cambios de color en el medio: Anotar las observaciones

RESULTADOS:

- Reducción de nitratos a nitratos Positiva: Aparición de un color rojo en 30 s

Negativa: Sin cambio de color.

Fig. 109 Prueba positiva y prueba negativa

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14.- DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO DE HUGH Y LEIFSON

Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa fermentativamente u oxidativamente, los subproductos de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que se pueden detectar en un medio de fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación mas sensible, como el medio OF.

Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:

a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.

b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.

c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.

La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción de ácido. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es también apto para determinar la movilidad de un microorganismo.

La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta llegar casi al fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el otro tubo abierto al aire. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o más.

Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.

Interpretación.

Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto

Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde

Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo

No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde

Controles

Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico

OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp

a.- Inocular por picadura dos tubos con medio de Hugh Leifson, a partir de la suspensión, a un tubo se le agrega 0,4 ml de aceite mineral.

b.- Incubar a 35 °C y observar a las 24 h y anotar el color del tubo después de la incubación y comparar con el siguiente cuadro:

Color del tubo Tubo con sello de aceite

Tubo sin sello de aceite

Tipo de Metabolismo

Amarillo + + Fermentativo

Amarillo - + Oxidativo

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Verde + + No asimila glucosa

Fig. 110’Metabolismo oxidativo y metabolismo fermentativo

15.- PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO

Fundamento:

Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de potasio.

La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación – reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor de hidrógeno final, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la especie bacteriana y su sistema enzimático.

Controles

Control positivo: Klebsiella

Control negativo. Escherichia col.

a.- Inocular por asada un tubo con caldo cianuro de potasio (KCN) a partir de la suspensión e incubar a 35 °C. durante 24 a 48 h

b.- Después de incubar, observar si hay crecimiento o no en el medio.

RESULTADOS:

Positiva: Presencia de crecimiento (turbidez)

Negativa: Ausencia de crecimiento (medio claro)

Fig. 111 Crecimiento en KCN

16.- PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA

Fundamento

Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo

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oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas)

Esta prueba ocupa el diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.

La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:

1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas que se han desarrollado en la placa.

2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,

3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.

En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.

Controles:

Prueba Control positivo Control negativo

Citocromo oxidasa

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli

a.- Impregnar un pedazo de papel filtro con el reactivo de oxidasa (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).

b.- Tomar una asada del cultivo de TSI y frotarla en el papel y observar.

RESULTADOS:

Positiva: Color azul violeta.

Negativa: No hay cambio de color.

Fig. 112 Prueba de oxidas positiva y negativa

17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

• Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

• Bacillus (+) de Clostridium (-).

• Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:

Método del portaobjetos (recomendado):

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• Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.

• Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.

• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

• Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

• Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo

Fundamento.

Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo.

La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina.

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

Controles

Control positivo: Staphylococcus aureus

Control negativo. Streptococcus sp

RESULTADOS:

Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno.

Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno.

Fig. 113 Prueba positiva, negativa y positiva de la enzima peroxidas

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PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA, MANEJO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

En el análisis microbiológico de alimentos, la adecuada selección de la muestra, la toma correcta, los medios de conservación y su transporte al laboratorio, son de primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamaño o el volumen, en lo posible, serán representativos del producto y del lote o partida de donde provienen.

La recolección de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminación externa, tanto ambiental como humana para asegurar la integridad de la misma.

Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos pertinentes que pudieran afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo tome en consideración. Las condiciones de conservación y transporte, tiempo comprendido entre la recolección de la muestra, su entrega al laboratorio, así como la realización del análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la población microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos. Esto es especialmente cierto en los alimentos perecederos.

Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservación para los alimentos perecederos, ya que para, fines oficiales la Ley General de Salud señala claramente que después de la notificación de los resultados del análisis practicado, si existe alguna duda sobre la veracidad de estos, el particular puede impugnar dentro del plazo contemplado en la misma Ley, lo que da como consecuencia que la Secretaría de Salud analice la muestra testigo en un laboratorio que ésta señale en presencia dé las partes interesadas y el resultado obtenido sea el que en forma definitiva acredite si el producto en cuestión reúne o no los requisitos y especificaciones sanitarias. Sin embargo los alimentos, aún en condiciones apropiadas de conservación, pueden sufrir cambios significativos en sus características biológicas y/o fisicoquímicas, provocando que los resultados de las muestras testigo sean improcedentes.

PARÁMETROS QUE PUEDEN AFECTAR EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

a.- Tiempo de transportación. Si es muy largo y no se mantiene en condiciones adecuadas el número de microorganismos puede aumentar o disminuir.

b.- Temperatura. Si no es la adecuada el número de microorganismos se eleva o disminuye según la temperatura a la que se transporte o almacene.

c.- pH. Si los microorganismos continúan su metabolismo y aumentan el pH el número puede disminuir

VOCABULARIO

1.- Asépticamente, forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio.

2.- Fecha de caducidad, fecha limite en que se considera que un producto, almacenado en las condiciones sugeridas por el fabricante, conserva las características sanitarias que debe de reunir para su consumo. Después de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse.

3.- Muestra representativa, es un número de unidades tomadas de un lote, que han sido seleccionadas en forma aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del que procede.

4.- Muestra testigo, muestra que queda en poder del interesado y en disposición de la autoridad competente.

5.- Productos perecederos, grupo de alimentos que por su naturaleza biológica y físico-química, su vida útil es de hasta 30 días, dando lugar al establecimiento de una fecha de caducidad, la cual debe ostentarse en su etiqueta o envase.

6.- Toma de muestra, es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad del lote o partida.

7.- Vida útil o vida de anaquel, es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel de calidad sanitaria aceptable para su consumo, bajo condiciones específicas de procesamiento, envasado y almacenamiento.

SIGNIFICADO SANITARIO

La adecuada toma de muestra para el análisis es de primordial importancia. Si la muestra esta recolectada en forma impropia, esto no es representativo del lote y el resultado final puede ser erróneo. Una muestra representativa es esencial cuando se buscan microorganismos patógenos o toxinas.

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MUESTREO Y ALMACENAMIENTO

En la siguiente tabla se enlistan los productos competencia del control Sanitario de Bienes y Servicios, así como el tamaño mínimo de muestra necesario para la realización de un análisis básicos y especiales.

Para el análisis básico que comprende microbiológicos, fisicoquímicos y algunas veces biológicos, se indica el tamaño mínimo de muestra que se debe tomar, tanto en unidades (frascos, botes, latas, cajas, etc. Según sea la presentación comercial del producto), como en masa o volumen: gramos (g), kilogramos (kg) o litros (l).

Nivel de análisis y mínimo tamaño de la muestra para su entrega al laboratorio.

No. Producto Cantidad mínima Cantidad adicional especial Básico Microbiológico Fisicoquímicos Metales pesados Plaguicidas Otros 1 Agua purificada 2 Un o 2 l 1 l 1 l 1 l 2 Hielo 2 Un o 2 g 1 kg 1 kg 1 kg 3 Leche pasteurizada, no

pasteurizada 2 Un 2 l 1 l 1 l 2 l

4 Leche ultrapasteurizada 2 Un 2 l 1 l 1 l 2 l 5 Leche evaporada 2 Un o 25 g 1 Un 2 Un 2 Un 2 l 6 Leche condensada

azucarada 3 Un o 250 g * 1 Un

7 Leche deshidratada 2 Un o 500 g * 250 g 2 kg 8 Leche rehidratada 2 Un o 2 l * * 2 UN o 2l 1kg Radioactivo

9 Quesos 2 Un o 500 g 250 g 250 g 1 kg 10 Mantequilla 2 Un o 500 g 250 g 250 g 1 kg 11 Grasa butírica 2 Un o 500 g 1 kg 12 Sueros 2 Un o 500 g * 250 g 2 kg 13 Crema 2 Un o 500 g * 250 g 1 kg 14 Yogurt 2 Un o 500 g * 1 kg 15 Jocoque 2 Un o 500 g * 250 g 16 Cajeta 2 Un o 250 g * 500 g 17 Flan 3 Un o 500 g * 18 Helado 2 Un o 500 g * 250 g 19 Leche reconstituida 2 Un o 2 l 1 l 2 l 2 l 20 Cremas vegetales 2 Un o 500 g * 250 g 21 Imitación de quesos 2 Un o 500 g * 250 g 22 Helado de crema vegetal 2 Un o 500 g * 250 g 23 Carne 1 kg * 1 kg Biológico

24 Productos de carne 2 Un o 250 g 250 g 250 g 500g 1 kg 25 Aves 1 Un o 250 g Pieza completa 26 Productos de la pesca

(pescados y mariscos) 2 Un o 500 g 250 g 1 kg 1 kg Biológico

27 Productos industrializados de la pesca

2 Un o 500 g 250 g 500 g 1 kg

28 Productos derivados de la pesca

2 Un o 500 g 2 Un ó 200 g

2 Un o 200 g

500 g 500 g

29 Huevo 4 Un o 200 g 1 Un o .5 l 0.5 l 30 Huevo y sus derivados 4 Un o 200 g 1 Un o .5 l 0.5 l 31 Aceite comestible 1 Un o 1 l 1 Un o .5 l 0.5 l 32 Manteca de cerdo 1 Un o 1l 1 Un o .5 l 0.5 l 33 Sebo 1 Un o 1 l 500 g 500 g 34 Manteca vegetal 1 Un o 1 l 35 Grasas compuestas 1 Un o 1 kg 500 g 2 kg 500g 36 Aditivos para alimentos 200 g 250 g 500 g 37 Frutas, hortalizas, legumbres

frescas procesadas 1 kg ó 5 Un * 500 g

38 Fórmulas para lactantes 2 Un o 500 g * 500 g 39 Alimentos envasados para

lactantes y niños de corta edad 2 Un o 500 g 250 g

100

40 Alimentos a base de cereales para lactantes

2 Un o 500 g

41 Cacao y sus derivados 250 g 500 g 2 kg 42 Cocoa 250 g 500 g 2 kg 43 Café y sus derivados 250 g 500 g 2 kg 44 Café tostado 250 g 500 g 2 kg 45 Té y sus derivados 500 g * 500 g 2 kg 46 Productos para infusiones 500 g * 500 g 2 kg 47 Bebidas no alcohólicas 5 Un * 3 Un 48 Productos para regímenes

especiales 5 Un * 3 Un

49 Productos para preparar bebidas no alcohólicas y refrescos

2 Un, 1l ó 500 g

* 1 l ó 250 g

50 Bebidas no alcohólicas congeladas

2 Un, 1 l ó 500 g

* 1 l o 250 g

51 Cereales 2 Un ó 500 g * * 3 kg 3 kg 52 Harinas de cereales 500 g * 500 g 3 kg 3 kg 53 Harina de leguminosas

secas y sus derivados 500 g * 500 g 3 kg 3 kg

54 Productos de harina de cereales

2 Un o 1 kg * 500 g 3 kg 3 kg

55 Productos amiláceos y frituras

2 Un o 500 g * 250 g 500 g 500g

56 Edulcolorantes nutritivos 2 Un o 500 g 2 Un o 500g 250 g 500 g 57 Gelatinas y sustitutos 3 Un ó 750 g 250 g 58 Golosinas 4 Un o 400 g * 59 Condimentos 500 g 60 Sal 1000 g * 61 Aderezos 2 Un ó 500 g * 250 g 62 Conservas y enlatados

ácidos 6 Un del mismo lote

*

63 Alimentos preparados deshidratados

2 Un ó 200 g * 200 g

64 Conservas y enlatados de baja acidez

6 Un del mismo lote

* 1 Un del mismo lote

2 Un o 500 g

65 Alimentos preparados refrigerados o congelados

1 Un o 250 g 1 Un o 250g *

66 Bebidas alcohólicas 2 Un o 1500 ml * 1 Uno 750 ml 1 Un o 750 ml

67 Bebidas alcohólicas fermentados

1 Un o 250 g * 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml

68 Bebidas destiladas 2 Un o 1500 ml * 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml

69 Licores 2 UN o 1500 ml

* 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml

70 Bebidas alcohólicas preparadas y envasadas

2 Un o 1500 ml

1 Un o 750 ml 1 Un o 750

ml

71 Tabaco, sus productos y sucedáneos

5 Un o 1 envasa( tabaco pipa)

5 Un o 1 envase

(tabaco de pipa)

72 Productos para modificar el olor del cuerpo

2 Un o 50 –100 ml

2 UN 50 – 100 ml

73 Productos para el cabello 5 Un 2 Un o 50 – 100 ml, 3 Un ó 200 g

Biol 1 Un

74 Productos para el cuerpo 4 Un 2 Un o 50 – 100 ml, 3 Un ó 200 g n

Biol 1 Un

75 Productos para manos y uñas

4 Un 2 Un o 50 – 100 ml, 3 Un ó 200 g

Biol 1 Un

101

n 76 Productos para el aseo de

la persona 6 Un 2 Un o 50 – 100

ml, 3 Un ó 200 g n

Biol 1 Un

77 Productos de aseo 200 g 2 Un o 50 – 100 ml, 3 Un ó 200 g n

Biol 1 Un

78 Productos repelentes a insectos (que se aplican directamente sobre la piel)

4 Un 2 Un o 50 – 100 ml, 3 Un, 2 Un o 50 – 100 ml,

Biol 1 Un

79 Faciales cremas, maquillajes, rubores, mascarillas, delineadores, lápices, etc.)

5 Un * 2 Un 3 Un Biol

80 Para niños (talcos, aceites, etc.)

5 Un * 2 Un 3 Un Biol

81 Alimentos preparados listos para servirse

250 g 250 g

Tomado de:

HERRAMIENTAS PARA EL MUESTREO

Las herramientas de que puede disponer un analista varia desde instrumentos comunes para fines de carácter general hasta herramientas especiales, que han de utilizarse en determinadas situaciones para hacer exámenes específicos de productos alimenticios especiales. Todo el equipo para el muestreo deberá estar limpio y seco cuando vaya a utilizarse.

Para la toma de muestras para análisis microbiológico, es esencial disponer herramientas de muestreo, envueltas individualmente, previamente esterilizadas, y de recipientes irrompibles esterilizados.

Las herramientas tales como los espátulas, cucharillas, etc., deberán ser lisos, sin ningún diseño en la superficie, totalmente de acero inoxidable, envueltos individualmente y esterilizados en la autoclave antes de llevarlos al lugar donde van a utilizarse.

Cuando sea necesario esterilizar una herramienta de muestreo en la fábrica, el analista debe seguir el siguiente procedimiento: lavarla perfectamente en la pila de lavado del equipo de la empresa, secarla con una toalla limpia; flamearla después con la llama de una lámpara de alcohol, y enfriarla antes de utilizarla, la herramienta puede enfriarse con alcohol.

INSTRUMENTAL Y EQUIPO BÁSICO DE MUESTREO

- Recipientes isotérmicos: Cajas de material aislante equipados con tapas y espacios suficientes para colocar los refrigerantes y las muestras que deberán permanecer en la temperatura deseada hasta su ingreso al laboratorio.

- Bolsas limpias de polietileno estériles de varias medidas para submuestras.

- Pinzas, tijeras, espátulas, cucharas, cuchillos afilados, termómetro con un intervalo de 0 a 100 grados centígrados; hielo o líquidos precongelados.

- Hielo seco para las muestras congeladas, hielo o recipientes con líquido precongelados para la refrigeración.

- Papelería: plumones marcadores de agua, etiquetas adhesivas, masking tape, diurex, plumas.

- Bata, cubrebocas, malla para pelo o cofia.

- Herramientas comunes como alicates, destornilladores y cuchillos, son útiles para abrir los envases, cortar sacos y vaciar los productos alimenticios. Puede disponerse de una herramienta especial para abrir las cajas de cartón que se utilizan para el transporte, ocasionándoles daños mínimos.

- Una lámpara sorda de luz brillante es muy útil cuando hay que trabajar en zonas poco iluminadas. En zonas polvorientas como molinos harineros o elevadores de grano, deberá utilizarse una linterna a prueba de explosiones. Se pueden utilizar unas tijeras para cortar los embalajes de tela, o unas pinzas para manipular los cortes hechos en los sacos.

102

- Una taladradora seca tubular puede emplearse para la harina, la leche en polvo y los productos lácteos en polvo. Usualmente habrá que sacar el producto de la probeta con una espátula. Esta probeta no deberá usarse para la toma de muestras microbiológicas. Puede utilizarse también un cucharón adecuado de acero inoxidable o aluminio.

- Sondas o probetas especiales se usan para el muestreo de la mantequilla y el queso. Se hace penetrar la probeta en el producto, y después se la hace girar para cortar un trozo cilíndrico. Para la toma de muestras de queso solamente, se necesitará un compuesto obturante hecho a base de parafina o cera de abejas, para cerrar de nuevo herméticamente las zonas de las que se han tomado las muestras.

- Un manguito o probeta para harina sirve para el muestreo de las tolvas (fondos) de los elevadores de molinos harineros u hornos de pan de grandes dimensiones. La probeta se clava en el material estático del equipo, y después se saca para su examen.

- Se emplean cucharas y pipetas de plástico desechables esterilizadas para un muestreo aséptico destinado al análisis microbiológico. Podrán utilizarse también guantes de cirujano de látex o PVC para poder manipular los instrumentos de muestreo sin introducir microorganismos en la muestra.

- Un tamiz metálico o un recogedor se utilizan para controlar si los cereales a granel tienen insectos, heces de roedores y otras materias extrañas.

- Termómetro completamente metálico, o dos si es necesario para abarcar la escala de temperatura de -35 a 100 grados centígrados, con intervalos de graduación no superiores a 2 grados centígrados. Su precisión deberá calibrarse regularmente con los laboratorios de metrología oficiales.

- Se usará alcohol isopropilíco o etílico al 70 %, que el muestreador puede llevar en una botella de plástico, para desinfectar las herramientas de muestreo. Podrán utilizarse indicadores de papel para determinar si existen residuos de cloro y tomar el pH del producto, pero este ensayo no debe constituir un sustituto de determinaciones precisas de pH.

- Papel aluminio. Papel estraza.

- Algodón.

- Cerillos o encendedor.

- Lámparas de alcohol.

- Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio para la toma de muestra

- Hielo o bolsas refrigerantes.

- Guantes estériles

EQUIPO

Autoclave equipada con termómetro de mercurio calibrada 121 ° C ±1 ° C

Horno que alcance una temperatura de 170 ± 5°C.

Termómetros metálicos (dos si es necesario) para toma de temperatura de alimentos intervalos de -40 a 100°C, con intervalos no superiores a 1 °C.

Preparación del Material para la Toma de la Muestra.

1.- Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de muestras, que van a estar en contado directo con el alimento, debe estar limpio, estéril y libre de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.

2.- El material para la toma de muestra que requiera esterilización, se envolverá en forma individual debidamente identificado, con papel de Kraf antes de esterilizado.

3.- La tapa de los frascos se protegerá con papel de estraza o aluminio fijándolos adecuadamente.

4.- Colocar cinta testigo en el material a esterilizar.

5.- El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121 °C durante 15 minutos o en homo a 170°C por dos horas, de acuerdo a su naturaleza.

6.- Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminación posterior.

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7.- De ser necesario, si se requiere mayor número de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y empaparlos con etanol o isopropanol al 70%, posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes estériles para evitar su contaminación o inmediatamente utilizarlos.

PROCEDIMIENTO

El procedimiento para la toma de muestra, dependerá del tipo de producto y de la finalidad del examen:

OBTENCIÓN

1.- La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica, tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis, enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.

2.- Tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana.

3.- Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamente asépticas.

4.- Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben tomarse en áreas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminación de las mismas.

5.- Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo se lave las manos antes de desarrollar éste. Para muestreo aséptico debe utilizarse bata, cofia y cubreboca. De ser necesario el contacto directo de las manos con el producto deberán usarse guantes estériles.

6.- La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine.

7.- Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis.

8.- Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon, esto únicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración.

9.- En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.

10.- En alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados, cucharas y o cuchillos.

11.- En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa.

12.- Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.

PRODUCTOS PERECEDEROS

1.- Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a granel se consideran como alimentos perecederos y los productos no envasados en los cuales no está definida su vida útil o de anaquel, se determinará la fecha de caducidad, con base en productos de características similares.

2.- Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad, se consideran para fines de esta norma, como no perecederos.

3.- Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria será únicamente por duplicado, la primera se enviará al laboratorio oficial para su análisis y la segunda se quedará en poder del interesado para su análisis particular si es necesario.

4.- En caso de impugnación presentada en los términos que señala la Ley General de Salud, en productos perecederos, la toma de muestra subsecuente la llevará a cabo personal autorizado tomando como muestras en forma aleatoria del lote existente o la cantidad o número estipulado en la norma correspondiente del producto, la

104

cual será analizada por el laboratorio acreditado para realizar tercerías y el resultado obtenido será el que definitivamente acredite que el producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas. El número de submuestras del total que determinen el cumplimiento serán tres de cinco o lo que estipule la norma correspondiente.

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA

1.- En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra, mediante rótulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos:

2.- Fecha, lugar, hora del muestreo, número de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede.

3.- La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco la caja, en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.

CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE

1.- El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteración o contaminación, evitando su exposición a la luz solar directa.

2.- Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8°C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C, empleando para conservarla hielo seco. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con liquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.

3.- En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura.

4.- En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o contaminen con otras.

5.- Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente, siempre y cuando ésta no exceda de 45°C

6.- Para la conservación, durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas.

7.- Las muestras que se entreguen al laboratorio de preferencia deberá acompañarse de un informe y el número de unidades y/o cantidad.

a.- Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante, representante y/o distribuidor.

b.- Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la marca comercial y cualquier otra información que se considere importante.

c.-Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios.

d.- La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación. Tomado de: NOM-109-SSA1–1994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico

MUESTRAS PARA AGUA

1 Frasco para muestra de agua.

a.- Lavar y secar perfectamente un frasco de boca ancha de 500 ml con tapa.

b.- Si la muestra proviene de agua que no ha sido clorada esterilizar el frasco en estufa a 170º C, por una hora o a 121º C durante 15 min.

c.- Si la muestra de agua posee cloro residual los frascos se deben esterilizar en estufa a 170º C, por una hora o en autoclave a 120º C durante 15 min, los cuales deben contener 0.1 ml de tiosulfato de sodio al 3% por cada 125 ml de capacidad de los mismos.

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d.- Cubrir la tapa la boca del frasco con papel Kraft y asegurando con una liga.

e.- Esterilizar por medio de calor húmedo a 121ºC durante 15 minutos.

f.- Después de esterilizar, dejar enfriar y colocarlo en una bolsa de plástico nueva

g.- Para muestrear hielo, traer una bolsa si es posible, en caso de no utilizar frascos de vidrio de boca ancha de 500 a 1000 ml de capacidad.

2. Muestreo

2.1.- En bomba de mano o grifo del sistema de distribución.

a.- El agua de los grifos debe provenir directamente del sistema de distribución. No debe efectuarse toma de muestra en grifos que presenten fugas entre el tambor y el cuello, ya que el agua puede correr por la parte exterior del grifo y contaminar la muestra. Deben removerse los accesorios o aditamentos externos como mangueras, boquillas y filtros de plástico o hule antes de tomar la muestra.

b.- Debe limpiarse el orificio de salida con una torunda de algodón impregnada de solución de hipoclorito de sodio con una concentración de 100 mg/l.

c.- Debe dejarse correr el agua aproximadamente 3 min o hasta asegurarse que el agua que contenían las tuberías ha sido vaciada totalmente.

d.- Cerca del orificio de salida, deben quitarse simultáneamente el tapón del frasco y el papel de protección, manejándolos como unidad, evitando que se contaminen el tapón, o el papel de protección, o el cuello del frasco.

e.- Debe mantenerse el tapón hacia abajo para evitar contaminación y procederse a tomar la muestra sin pérdida de tiempo y sin enjuagar el frasco; se debe dejar el espacio libre requerido para la agitación de la muestra previa al análisis (aproximadamente 10% de volumen del frasco). Efectuada la toma de muestra, deben colocarse el tapón y el papel de protección al frasco.

2.2.- En captación de un cuerpo de agua superficial o tanque de almacenamiento.

a.- Deben lavarse manos y antebrazos con agua y jabón,

b.- Debe quitarse el papel de protección evitando que se contamine, y

c.- Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo hasta una profundidad de 15 a 30 cm, abrir y enderezar a continuación con el cuello hacia arriba (en todos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superficial o del fondo, donde puede haber nata o sedimento y en el caso de captación en cuerpos de agua superficiales, no deben tomarse muestras muy próximas a la orilla o muy distantes del punto de extracción); si existe corriente en el cuerpo de agua, la toma de muestra debe efectuarse con la boca del frasco en contracorriente. Efectuada la toma de muestra debe colocarse el tapón, sacar el frasco del agua y colocar el papel de protección.

d.- En el caso de tanques de almacenamiento, si no es posible la toma de muestra como se indica en este punto, debe procederse como se menciona a continuación.

2.3.- En pozo profundo.

a.- Si el pozo cuenta con grifo para toma de muestra, debe procederse como en inciso b del 4.2.1

b.- Si el pozo no cuenta con grifo para toma de muestra, debe abrirse la válvula de una tubería de desfogue, dejarse correr el agua por un mínimo de 3 min. y a continuación se procede como en el oinciso d y e del 4.2.1

2.4 En pozo somero o fuente similar.

a.- Cuando no es posible tomar la muestra con la extensión del brazo, debe atarse al frasco un sobrepeso usando el extremo de un cordel limpio.

b.- Deben quitarse simultáneamente el tapón y el papel de protección, manejándolos como unidad, evitando que se contaminen el tapón, o el papel de protección, o el cuello del frasco.

c.- Debe mantenerse el cuello del frasco hacia abajo y se procede a tomar la muestra, bajando el frasco dentro del pozo, y desenrollando el cordel lentamente, evitando que el frasco toque las paredes del pozo.

d.- Efectuada la toma de muestra, deben colocarse el tapón y el papel de protección al frasco.

2.5.- Manejo de Muestras

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Si el tiempo de llegada es largo la muestra debe colocarse en hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo para su transporte al laboratorio, de preferencia a una temperatura entre los 4 y 10ºC, cuidando de no congelar las muestras, el periodo máximo que debe transcurrir entre la toma de muestra y el análisis microbiológico es de 6 horas.

2.6 Identificación y Control de Muestras

Para la identificación de las muestras deben etiquetarse los frascos y envases con la siguiente información:

a.- Número de registro para identificar la muestra.

b.- Fecha y hora de muestreo.

c.- Identificación del punto o sito de muestreo

d.- Temperatura ambiente y temperatura del agua

e.- pH

f.- Cloro residual si es posible.

g.- Tipo de análisis a efectuar Tomado de: NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-014-SSA1-1993 "Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano en sistemas de abastecimiento de agua públicos y privados

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DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS MESOFÍLICOS AEROBIOS EN ALIMENTOS.

Las bacterias mesofílicas aerobias son las que crecen a 35 ± 2°C, de 24 a 48 ± 2 horas, en agar cuenta estándar o en agar triptona extracto de levadura, este grupo esta formado por cocos o bacilos Gram positivos, Gram negativos, así como un amplio grupo de especies como: cromógenos, proteolíticos, fermentativos, lipolíticos, psicrotróficos, patógenos, saprofitos, etcétera.

En muchos alimentos este grupo de microorganismos arroja los máximos recuentos, aunque dependiendo de la naturaleza de los ingredientes, así como de las condiciones higiénicas en las que se prepararon y conservaron los alimentos se puede predecir la vida de anaquel.

También llamadas bacterias indicadoras ya que se utilizan como indicadores de la calidad sanitaria, del valor nutricional de alimentos perecederos, del agua potable, equipo y otros productos, así como indicadores de la posible presencia de microorganismos patógenos.

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta por vaciado en placa, donde la técnica ni pretende poner en evidencia a todos los microorganismos, pues tenemos una variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado.

PROCEDIMIENTO

1.- Pesar 10 g del alimento en condiciones de esterilidad y tratarla como indica la NOM-110-SSA1–1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

2.- Realizar diluciones hasta 10-4 en frascos que contengan 90 mL del diluyente.

3.- Colocar 1 mL de la dilución que le indiquen en una caja de Petri y realizar el procedimiento por duplicado.

4.- Agregar de 15 a 20 ml de agar cuenta estándar, mantenido a 45°C.

5.- Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en el sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja.

6.- El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

7.- Dejar solidificar el medio e incubar a 35 °C por 24 horas o si es necesario hasta las 48 horas.

8.- Colocar una Placa de Petri como testigo de esterilidad del medio

9.- Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias. Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Para los casos no contemplados seguir las recomendaciones de la NOM 092

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Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dígito al número inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400):

INFORME DE LA PRUEBA

Reportar como: Unidades formadoras de colonias,_________ UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estándar, incubadas a _________ horas a _______ ° C.

RESULTADOS

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110

DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES POR LA TECNICA DE VACIADO EN PLACA

El grupo de los microorganismos coliformes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.

El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para: La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos, La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo y la calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes areas del procesamiento de alimentos.

La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales.

El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.

Los organismos coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 ºC fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares.

MUESTREO, ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Seguir las indicaciones de la NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de las muestras de muestras en alimentos para su análisis microbiológico y la NOM-109-SSA1- 1994, Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras en alimentos para su análisis microbiológico.

1.- DESARROLLO EXPERIMENTAL

1.- Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la dilución realizada por lo menos de dos diluciones

2.- Vertir de 15 a 20 ml del medio agar de bilis rojo violeta fundido y mantenido a 45 en baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

3.- Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.

4.- Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad.

5.- Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 °C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.

6.- Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.

7.- Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias.

8.- Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.

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Expresión de resultados

INFORME DE LA PRUEBA

Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h.

En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja utilizada.

En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por ml".

RESULTADOS

112

113

DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varios. Existe poca evidencia que indique que estas bacterias coliformes pertenezcan a un solo género taxonómico.

La falta de certeza en cuanto a su filiación taxonómica y la imprecisa correlación entre los métodos recomendados para la detección de coliformes han presentado problemas. El primero, es que Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes que no producen gas de la lactosa o lo hacen después de 48 horas, por lo que no se les identifica por medio de esta técnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa está frecuentemente asociada a genes localizados en plásmidos. Estos determinantes extracromosomales son fácilmente transferidos entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que pueden, en consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del análisis. No obstante en la práctica, la técnica ha demostrado su efectividad.

El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Microorganismos Coliformes tales en Placa) o el uso de la técnica del número más probable. Esta última, también llamada técnica de dilución en tubo, proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.

Los organismos coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos, que a 35 °C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones de la NOM-112 –SSA-1994.

MUESTREO, ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Seguir las indicaciones de la NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de las muestras de muestras en alimentos para su análisis microbiológico y la NOM-109-SSA1- 1994, Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras en alimentos para su análisis microbiológico.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Preparación de la muestra

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

Procedimiento para la cuenta de organismos coliformes totales

Para alimentos.

Preparar diluciones según el criterio de tal forma que aseguremos el conteo

Prueba presuntiva serie 3,3,3

Inoculación.

1.- Si la muestra es líquida se inocula en los primeros 3 tubos 10 ml, en los siguientes 3 tubos 1 ml y en los ultimos 3 tubos con caldo lactosado 0,1 ml de la muestra.

En caso de que la muestra sea sólida hay que licuar la muestra con el diluyente y realizar diluciones hasta las que se consideren las necesarias y sembrar las ultimas tres.

2.- Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración. Usar una pipeta estéril para tranferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria inicial.

3.-Tomar tres tubos de concentración sencilla de caldo lactosado, usando una pipeta para cada dilución y transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra o de la dilución

4.- Tomar otros 3 tubos de concnetración sencilla y colocarle 1 ml de la dilcuión

5.- Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas.

Prueba confirmativa

De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación que es el caldo de bilis verde brillante e incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas.

Procedimiento para la cuenta de organismos coliformes fecales

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Para alimentos.

Preparar diluciones según el criterio de tal forma que aseguremos el conteo

Prueba presuntiva serie 3,3,3

Inoculación.

1.- Si la muestra es líquida se inocula en los primeros 3 tubos 10 ml, en los siguientes 3 tubos 1 ml y en los ultimos 3 tubos con caldo lactosado 0,1 ml de la muestra.

En caso de que la muestra sea sólida hay que licuar la muestra con el diluyente y realizar diluciones hasta las que se consideren las necesarias y sembrar las ultimas tres.

2.- Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento que el el caldo lauril sulfato triptosa Usar una pipeta estéril para tranferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria inicial.

3.-Tomar tres tubos de concentración sencilla de caldo lauril sulfato triptosa, usando una pipeta para cada dilución y transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra o de la dilución

4.- Tomar otros 3 tubos de concnetración sencilla y colocarle 1 ml de la dilcuión

5.- Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas.

Prueba confirmativa

De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación que es el caldo EC e incubar en baño maria a 44.5 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas.

115

INFORME DE LA PRUEBA

Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes. De la NOM 112 ..e Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra".

RESULTADOS

116

DETERMINACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS El recuento de mohos y levaduras tiene importancia como recurso para apreciar algunos aspectos de la higiene aplicada durante el procesamiento, para seguir la eficacia de su tratamiento germicida y en determinadas circunstancias para los riesgos que pueden resultar en la formación de toxinas al incrementar su número. En general, simultáneamente con el recuento de mohos puede realizarse el de las levaduras, ya que el medio de cultivo les proporciona también buenas condiciones para su desarrollo. Sin embargo, cuando se presenta un desarrollo excesivo de hongos, difícilmente puede efectuarse el recuento de las colonias de las levaduras. Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes, los mohos generalmente causan deterioro en el producto alimenticio originando mal olor o coloración en el producto, la importancia de determinar a los mohos es la producción de toxina. El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, dando como resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos.

MUESTREO, ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Seguir las sugerencias de la NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de las muestras de muestras en alimentos para su análisis microbiológico. y la NOM-109-SSA1- 1994, Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras en alimentos para su análisis microbiológico.

PROCEDIMIENTO

Preparación de la muestra

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

Desarrollo

1.- Realizar diluciones de la muestra hasta la que consideremos que nos registra un conteo de entre 15 a 150 UFC.

2.- Colocar por duplicado en cajas Petri 1 ml de la dilución correspondiente

3.- Repetir el procedimiento para las dos ultimas diluciones, utilizar una pipeta estéril diferente para cada dilución.

4.- Verter de 15 a 20 mL de PDA, fundido y mantenido a 45 en un baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

5.- Mezclar la muestra y el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. Dejar que solidifique el agar

6.- Preparar una caja control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad e invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25.

7.- Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis.

8.- Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.

117

INFORME DE LA PRUEBA

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.

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Recuento Dilución 10-3 Mohos 10 UFC en la placa Levaduras 184 UFC en la placa Cálculo, tomando en cuenta las consideraciones de la NOM 092 Mohos 11X103 / ml en la muestra

180X103 / ml en la muestra

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ELABORACIÓN DE YOGHURT, CONTROL MICROBIOLÓGICO DE MATERIA PRIMA Y PRODUCTO TERMINADO.

INTRODUCCIÓN

El yoghurt es la leche fermentada de mayor consumo y mejor conocida, lo que justifica que se le dedique una especial atención. La peculiaridad de este producto reside en la utilización de dos bacterias lácticas termofílicas, Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgarícus los propagan por separado y luego los mezclan para la preparación del yoghurt final. Los cultivos pueden obtenerse ya sea de colecciones microbianas o aislándose de un buen cultivo para yoghurt. La leche contiene aminoácidos y péptidos directamente utilizables por las dos bacterias, pero en cantidades limitadas, lo cual sólo permite satisfacer las necesidades de las bacterias al principio de la fermentación. La leche contiene los factores de crecimiento y los elementos minerales necesarios para el desarrollo de las dos bacterias. Algunas cepas producen polisacáridos a partir de la lactosa, es decir, glucanos que contribuyen a la viscosidad del producto. A partir del yoghurt se han desarrollado un gran número de productos obtenidos por modificación del medio de fermentación y/o cambiando la presentación final del producto lo que conduce a una diversificación de las formas de utilización ofrecidas a los consumidores: desayuno, postre helado, bebida, auxiliar para la cocina, etc. La legislación francesa especifica que el yoghurt debe contener después de la fabricación un mínimo de cien millones de bacterias lácticas por gramo. Las bacterias esenciales en los cultivos para yoghurt son Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus, propagados por separado y mezclándolos luego para la preparación del yoghurt final. Para lograr los mejores resultados, estos organismos deben hallarse en el cultivo en número aproximadamente igual; de no ser así, el yoghurt carecerá de la consistencia, el sabor y el olor más deseable. Cuando se inocula la mezcla en la leche, los cocos proliferan mucho más aprisa que los bacilos y al acabar la primera hora de incubación a 45ºC a menudo su número es superior al de los últimos en proporción de 3 ó 4 a 1. Así pues, la producción inicial de ácido se debe, en gran parte, a la actividad de Streptococcus thermophilus Los bacilos van aumentando paulatinamente en número hasta que al final del período de incubación, su número es otra vez aproximadamente el mismo que el de los cocos. La producción de ácido durante la última parte del periodo de incubación la llevan a cabo Lactobacillus bulgaricus. No se sabe bien cuál es la función de Streptococcus thermophilus en el cultivo para yoghurt aparte del hecho de que prolifera más aprisa que Lactobacillus bulgaricus y que, de esta manera, da comienzo a la producción de ácido. Algunos investigadores afirman que los cocos contribuyen al sabor y aroma del producto final.

PROCEDIMIENTO

A.- PREPARACIÓN DEL INOCULO.

1.- Agregar a un matraz de 500 ml estéril 300ml de leche pasteurizada.

2.- Frente a la flama del mechero realizar el sembrado de las cepas ATCC de los dos microorganismos en placas de agar nutritivo.

3.- Incubar a 35 °C por 24 -48 horas.

4.- Determinar pureza con una tinción de Gram.

5.- Pasado este tiempo en dos matraces estériles colocar 200 ml de leche (de la misma que se va a utilizar para la fermentación) y colocar la misma cantidad de inoculo de las dos cepas para aumentar la población.

6.- Incubar a 35 °C por 48 horas.

B.- ELABORACIÓN DEL YOGHURT.

1.- Lavar muy bien dos matraces de 6 litros y esterilizar por calor seco

2.- Marcar los recipientes con A y B, agregar 4 litros de leche pasteurizada y 500 gramos de leche en polvo descremada a cada uno y homogeneizar muy bien.

3.- Inocular con 200 ml de inoculo cada recipiente y homogeneizar.

4.- Realizar un Gram y determinar el número de células por campo

120

5,- Colocar los matraces en baño María a 35 °C, el matraz A debe permanecer inmóvil y el matraz B es de donde se tomará muestra para realizar las pruebas

7.- Tomar 5 ml de leche del recipiente B cada 2 horas (agitando previamente) y medir pH.

8.- El matraz A dejarlo intacto y dar por terminada la fermentación cuando se alcance un pH de 4.

CARACTERÍSTICAS DEL YOGURT ELABORADO.

Observar el aspecto y textura del yogurt del matraz A y B. a) Color

b) Olor

c) Sabor.

d) Consistencia y textura.

e) Acidez.

ANÁLISIS DE LA MUESTRA Y MATERIA PRIMA

a.- Determinación de pH al yogurt:

Tomar 10 ml de la muestra y medir con un potenciómetro el pH ajustando previamente con una solución reguladora con pH = 7.

b.- Determinación de acidez al yogurt. 1) En un matraz de 250 ml colocar 10 ml de muestra, adicionar 50 ml de agua destilada y unas gotas de fenolftaleína;

titular con NaOH 0.1 N. hacer la determinación por duplicado.

c.- Determinación de coliformes totales mohos y levaduras para el yogur, para cumplir con la NOM 093 ..

1.- Al producto terminado realizarle la cuenta microbiana de mohos y levaduras u coliformes totales, hacer la prueba por duplicado.

d.- Realizar a la leche pasteurizada la determinación de:

Realizar los análisis de la NOM-091-SSA1–1994, Bienes y servicios. Leche pasteurizada de vaca. Disposiciones y especificaciones sanitarias, por lo menos, S. aureus, OMA y OCT en punto de venta Realizar a la leche en polvo los análisis que indica: NOM-130-SSA1–1995, Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético y sometido a tratamiento térmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias.

121

122

123

La siguiente lista es de NOM en donde se establecen los intervalos de microorganismos permitidos por la Secretaria de Salud. NOM-091-SSA1–1994, Bienes y servicios. Leche pasteurizada de vaca. Disposiciones y especificaciones sanitarias.

Especificaciones Limite Máximo Mesofílicos aerobios 30000 UFC/gSalmonella spp. en 25 ml. AusenteS. aureus en 25 ml AusenteListeria monocytogenes en 25 ml NegativoColiformes totales en planta 10 UFC/mlColiformes totales en punto de venta 20 UFC/ml

NOM-093-SSA1–1994, Bienes y servicios. Practicas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.

Cuenta total de mesolíticos aerobios UFC/g

Coliformes totales UFC/g

Mohos UFC/g

Levaduras UFC/g

Yoghurt ----------- 10 10 10

NOM-130-SSA1–1995, Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético y sometido a tratamiento térmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias. a) Alimentos con pH>4.6 esterilizados comercialmente

NOM-144-SSA1–1995, Bienes y servicios. Leche rehidratada y reconstituida, pasteurizada y ultrapasteurizada. Disposiciones y especificaciones sanitarias. LECHE REHIDRATADA Y RECONSTITUIDA, PASTEURIZADA Y ULTRAPASTEURIZADA

Especificaciones Limite Máximo Mesofílicos aerobios NegativoMesofílicos anaerobios NegativoTermofílicos aerobios NegativoTermofílicos anaerobios Negativo

Microorganismos Límites máximos Mesofílicos anaerobios (UFC/g) Negativo Mesofílicos aerobios (UFC/g) Negativo Termofílicos anaerobios (UFC/g)

Negativo

Termofílicos aerobios (UFC/g) Negativo

124

PREPARACIÓN DE REACTIVOS Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique el agua debe entenderse como agua destilada.

1.- SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE SODIO 1,0 N

Formula:

NaOH 4,0 g

Agua destilada 100 ml

Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.

2.- SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE SODIO AL 40 %

Formula:

NaOH 40 g

Agua destilada 100 ml

Colocar el recipiente en baño María para controlar la generación de calor y disolver los 40 g del NaOH en los 100 ml con agua.

3.- SOLUCIÓN DE ÁCIDO CLORHIDRICO 1,0 N

Formula:

HCl 10 ml

Agua destilada 100 ml

Colocar en un matraz aforado de 100 ml, aproximadamente 50 ml de agua y vetir el ácido con mucho cuidado, mezclar y aforar a 100l ( Nunca hacer lo contrario)

4.- SOLUCIÓN REGULADORA DE FOSFATOS (SOLUCIÓN CONCENTRADA).

Formula:

Fosfato de sodio monobásico 34,0 g

Agua 1,0 L

Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N, Llevar a un litro con agua.

Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C Y Conservar en refrigeración (solución concentrada).

Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo) Y Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.

Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos y después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.

5.- AGUA PEPTONADA

Formula:

Peptona 1,0 g

125

Cloruro de sodio 8,5 g

Agua 1,0 L

Disolver los componentes en un litro de agua y ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.

Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.

Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos y después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.

Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.

6.- ROJO DE METILO AL 0,2 % ( C14 H15N3 O2)

Formula:

Rojo de metilo 0,2 g

Etanol al 95% 100 ml

Disolver el rojo de metilo en el alcohol volumen o composición.

7.- FENOLFATALEÍNA AL 1 % ( C20H14 O4)

Formula:

Fenolftaleína 1 g

Etanol al 95% 100 ml

Disolver el rojo de metilo en el alcohol volumen o composición.

8.- ROJO DE FENOL AL 0,2 % ( C19 H14 O5S) Formula:

Rojo de metilo 0,2 g

Etanol al 95% 100 ml

Disolver el rojo de metilo en el alcohol 9.- VOGUES-PROSKAUER

Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.

Formula:

Alfa naftol 5 g

Alcohol etílico absoluto 100 ml

Disolver los 5 gramos de alfa naftol en los 100 ml de alcohol etílico

10.- OXIDASA

Formula:

N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino0,5 g

Agua destilada 100 ml

Conservar en frasco oscuro a 5 – 10 °C. El reactivo se conserva durante 14 días.

126

11.- REACTIVO DE KOVAC

Formula:

Alcohol amilico o isoamilico 150 ml

p-dimetil amino benzaldehido 10 g

Ácido clorhídrico concentrado 50 ml

Disolver el aldehído en el alcohol y agregar lentamente el ácido a la mezcla

12.- SOLUCIÓN DE ÁCIDO SULFANÍLICO

Fórmula:

Ácido sulfanílico 8,0 g

Ácido acético 5N (una parte de ácido acético glacial a 2.5 partes de agua) 1,0 L

13.- SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA 1:10

Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 ml en 9 ml de agua destilada.

14.- SOLUCIÓN DE α-NAFTIL AMINA

Fórmula:

Dimetil α- naftil amina 5,0 g

Ácido acético 5 N 1,0 L

15.- SOLUCIÓN DE α- NAFTOL

Fórmula:

Alfa naftol 5 g

Etanol 100 ml

16.- REACTIVO DE EHRLICH

Fórmula:

p-dimetil amino benzaldehído 2 g

Alcohol etílico absoluto 190 ml

Ácido clorhídrico concentrado 40 ml

17.- SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 40 %

Fórmula:

Hidróxido de potasio 40 g

Agua destilada 100 ml

18.- AZUL DE ALGODÓN LACTOFENOL

Formulación en g/100 ml:

Fenol 20

Ácido láctico 20

Glicerina 40

127

Agua destilada 20

Azul algodón 0,05

Disolver el fenol en el agua calentando en baño maría. Agregar el ácido láctico, la glicerina y el colorante. Mezclar perfectamente

19.- CRISTAL VIOLETA

Formulación en g/100 ml:

Cristal violeta 2

Agua destilada 80

Etanol al 95% 20

Oxalato de amonio 0,8

Disolver el cristal violeta en 20 ml de etanol al 95%. Posteriormente disolver 0,8 g de oxalato de amonio en 80 ml de agua. Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.

20.- YODO (LUGOL)

Formulación en g/100 ml:

Yoduro de potasio 2

Yodo 1

Solución de bicarbonato de sodio al 5 % 60 ml

Agua destilada 240 ml

1.- Moler el I2 y el KI en el mortero y disolver en 5 ml de agua, luego llevar a 240 ml, agregar los 60 ml de la solución de NaHCO3 y conservar en un frasco ámbar.

21.- ALCOHOL ACETONA

Formulación en g/100 ml:

Acetona 50

Alcohol etílico 100

Adicionar lentamente el alcohol etílico a la acetona y mezclar con cuidado. Guardar en frasco herméticamente cerrado, hasta su uso.

22.- SAFRANINA

Formulación en g/100 ml:

Agua destilada 100

Safranina 0,5

Disolver los 0,5 g de safranina en 20 ml de agua destilada. Después aforar a 100 ml con agua destilada.

23.- FUCSINA FENICADA

Formulación:

SOLUCIÓN A Fucsina básica 0,3

128

Alcohol etílico al 95% 10

Mezclar hasta disolución completa

SOLUCIÓN B

Cristales de fenol 5

Agua destilada 95

Combinar las dos soluciones A y B. Filtrar a través de un papel filtro Whatman No 2. Mantener la solución en un frasco ámbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.

24.- AZUL DE METILENO

Formulación:

Azul de Metileno 1 g

Agua destilada 100 ml

Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 ml. de agua destilada.

25.- VERDE DE MALAQUITA

Formulación:

Verde de malaquita 10 g

Agua destilada 100 ml

Preparación:

Disolver el colorante en el agua. Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 2. Guardar el colorante en frasco ámbar.

26.- SOLUCIONES PORCENTUALES

Solución porcentual (%) p/v

a.- Definición Cantidad en gramos de soluto en 100 ml de solución

b.- Para preparar una solución porcentual de este tipo utilizar la siguiente formula

(p/v %) (Volumen deseado)

gramos de soluto deseado = ----------------------------------------

100

27.- SOLUCIÓN MOLAR

Definición: peso formula de un compuesto en gramos

1 mol = Peso molecular gramo

Ejemplo 1 mol de NaOH = 40 g de NaOH

Milimol (mmol)

Definición: 1 /1000

129

Ejemplo 1 mol de NaOH 0 40 g 1 nmol de NaOH = 0.04 g

Definición: Cantidad de peso molecular gramo de un compuesto por litro de solución o cantidad de moles por litro de solución final o cantidad de moles de silito por decímetro cúbico de solución

Existen dos fórmulas básicas

(objetivo) Determinación del peso de un compuesto requerido para preparar una solución de una molaridad y un volumen deseado

(Peso molecular) (Molaridad deseada) (volumen final en ml)

gramos de reactivo = ------------------------------------------------------------------------------------------

1000

(Objetivo) Determinación de la cantidad de mililitros de un reactivo concentrado p/p requerida para preparar una solución de una molaridad y un volumen deseado.

(PM) (Molaridad deseada) (V final en ml)

ml del reactivo conc a usar =-----------------------------------------------------------------

1000

28.- SOLUCIÓN NORMAL

Definición: Cantidad de ésos equivalentes gramo por litro de solución o la cantidad de miliequivalentes por mililitros.

Determinación del peso de un compuesto requerido para preparar una solución de una normalidad y un volumen deseado.

(PM) (Normalidad deseada) (V final en ml)

Gramos requeridos =-----------------------------------------------------------------

(Valencia positiva total )(1000)

Por ejemplo: preparar 250 ml de una solución 2 N de MgSO4

PM 0 120 g

(60) (2N) (250 ml)

Gramos requeridos =--------------------------------------------- = 30 g

(1000)

29.- Preparación del nefelómetro de McFarland

Método para determinar la turbidez bacteriana en un cultivo líquido, para producir un cultivo con la densidad deseada. Se utilizan diferentes concentraciones de cloruro de bario al 1 % y ácido sulfúrico al 1 %, para darnos diferentes densidades.

Estándares de sulfato de bario

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

130

BaCl2 al 1 % (ml)

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H2SO4 al 1 % (ml)

9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

Densidad aprox. De células (X108 /ml

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Densidad aprox. De células en millones/ml

300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

MEDIDAS DE SEGURIDAD

En este Manual se han tomado las características de un laboratorio básico, en donde se toman las sugerencias propuestas por la OMS, la NOM-087-ECOL–2002, publicada por la Secretaría del Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca, que establece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico–infeccioso que se generan en establecimientos que presten atención Médica y la Ley General de Salud, Publicada por la Secretaría de Salud 1993.

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La NOM-087–ECOL–2002, establece que los residuos peligrosos biológico–infeccioso en los establecimientos que prestan atención médica constituyen un gran problema nacional, por lo que es necesario el establecimiento de los requisitos para su control. Debido a esto los laboratorios básicos que presten atención deben de seguir los lineamientos contemplados en dicha norma a fín de evitar riesgos a la salud, ya que se manejan ciertos residuos que, en un momento dado, pueden causar daño a un individuo, un grupo de personas o al medio ambiente. NORMAS GENERALES O HÁBITOS PERSONALES

Las normas generales para el laboratorio básico que aquí se exponen constituyen un conjunto completo y detallado que el personal deberá seguir en toda clase de laboratorios.

Código práctico:

Este código es una recopilación de los procedimientos de laboratorio más esenciales que constituyen la base de una práctica segura de laboratorio. En muchos laboratorios y programas nacionales de laboratorio, este código puede elevarse a la categoría de reglamento de los trabajos de laboratorio. En las presentes normas se puntualizarán y explicarán diversas partes de este código práctico.

Conviene tener muy en cuenta que una buena práctica de laboratorio es condición indispensable para la seguridad y no puede suplirse con material especializado, que no pasa de ser un complemento de aquella.

LAS REGLAS MÁS IMPORTANTES SE ENUMERAN A CONTINUACIÓN (PERO NO EN ORDEN DE IMPORTANCIA):

1.- No se permitirá pipetear pipetas sin el tapón de algodón.

2.- En la zona de trabajo del laboratorio no se permitirá al personal comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosméticos.

3.- Habrá que mantener el laboratorio ordenado, limpio y aseado, retirando del mismo cualquier material que no tenga relación con el trabajo.

4.- Las superficies de trabajo se descontaminarán al iniciar y terminar el trabajo de siembra.

5.- Los miembros del personal se lavarán las manos después de haber manipulado cualquier muestra, así como al abandonar el laboratorio.

6.- Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se evite en lo posible la formación de aerosoles.

7.-Todos los líquidos o sólidos contaminados se descontaminarán antes de eliminarlos o de volver a utilizarlos; los materiales contaminados que se vayan a esterilizar en autoclave deberán introducirse en recipientes resistentes e impermeables, que se cerrarán antes de sacarlos del laboratorio.

8.- En el laboratorio se utilizará bata, cofia y cubrebocas; no se llevará ropa de laboratorio fuera de éste.

9.- Sólo se autorizará el paso a la zona de trabajo del laboratorio a los empleados; durante el trabajo se mantendrán cerradas las puertas del laboratorio; los clientes sólo tendrán acceso a la sala de espera y al interior del laboratorio siempre y cuando lo soliciten por escrito y no se permitirá la entrada de niños en las zonas de trabajo del laboratorio.

10.- Debe limitarse las visitas al laboratorio. Si se permite la entrada a una persona al laboratorio, se debe acompañar de un miembro del personal y provista de una bata.

11.- Debe haber un programa de lucha contra los insectos y los roedores.

12.- No se permitirá la entrada en el laboratorio de animales.

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13.- Habrá que utilizar guantes en muestras de alto riesgo. Los guantes se deben quitar asépticamente y esterilizar en autoclave con otros desechos de laboratorio antes de proceder a su eliminación. Si no se dispone de guantes de un solo uso se utilizarán guantes reutilizables limpiándolos y desinfectándolos después de haberlos usado y antes de volverlos a utilizar.

14.- Todos los accidentes y exposiciones a material infeccioso se notificarán inmediatamente el jefe del laboratorio. Habrá que llevar un protocolo escrito de estos episodios y poner una vigilancia apropiada.

15.- El jefe del laboratorio se ocupará de que el personal reciba una formación apropiada sobre la seguridad en el laboratorio. Habrá que adoptar el presente manual de seguridad para reducir al mínimo o eliminar tales riesgos. A1 personal se le informará sobre la existencia de riesgos y se le pedirá que lea y observe las instrucciones sobre las prácticas y los procedimientos establecidos.

16.- Se prohíbe probar muestras y los olores solamente deben ser verificados con cuidado.

17.- Los artículos personales como abrigos, sombreros, paraguas y bolsas, deben ser guardados en el armario correspondiente y no deben usarse ni introducirse al laboratorio.

18.- Se requiere que las personas con el cabello largo lo amarren atrás o se cubran la cabeza con la cofia.

19.-Los hombres deben evitar la barba, o bien usarla muy corta.

20.- El agua para beber debe estar localizada fuera del laboratorio.

21.- Los escritorios deben mantenerse en orden.

22.- Debe usarse pañuelos desechables en lugar de pañuelos de tela cuando se necesiten para uso personal.

23.- Debe usar carteles precautorios apropiados cuando puedan ocurrir condiciones peligrosas.

24.- Todos los recipientes para almacenar sustancias deben estar etiquetados; los frascos sin etiquetas son automáticamente desechados.

25.- Debe proporcionarse recipientes adecuados para la basura, separando los que reciban papel, vidrios rotos.

26.- El material de vidrio usado debe ser vaciado de soluciones y solventes y enjuagado con agua antes de ser entregado para su lavado regular y, si se necesitan instrucciones especiales para su lavado, el personal de limpieza debe ser informado.

27.- Debe destruirse el material de vidrio astillado o quebrado.

28.- Revisar que las llaves de agua y gas estén bien cerradas al final de cada práctica

29.- Emplear reactivos sólo después de cerciorarse de que son los requeridos

30.- Poner atención a las indicaciones de riesgo impresas en las etiquetas

31.- No utilizar reactivos que carezcan de etiquetas

32.- Tapar de inmediato los frascos de reactivo y medios de cultivo.

33.- .Utilizar una espátula a1 manipular las sustancias sólidas que proteger el platillo de la balanza con un vidrio de reloj o pesar sobre un papel aluminio previamente tarado, limpiar el platillo después de utilizarla.

34.- Utilizar una pipeta diferente para medir cada líquido y enjuagarla si ya no se va a utilizar, o bien colocarla en un frasco que contenga benzal.

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35.- Al preparar una solución de un ácido o una base fuerte, en especial cuando se trate de un ácido, verter siempre el ácido sobre el agua y nunca al revés.

36.- Manejar con cuidado la cristalería.

37.- Cuando es más de una solución la que se va a desechar, hay que realizarlo de una en una.

38.- Extinguir todas las flamas cercanas y retirar rápidamente los materiales inflamables.

39.- Cuando ocurra un pequeño incendio debemos de apagarlo con una franela húmeda y si el fuego se extiende utilizar el extintor y recubrirlo con arena.

40.- Si no sabemos utilizar un equipo, hay que solicitar el apoyo del técnico.

41.- Asegurarse que las instalaciones de luz, agua, drenaje y aire estén funcionando correctamente

42.- Al preparar una solución hay que anotar de inmediato en el frasco el nombre del reactivo, la concentración, la fecha de preparación y el nombre de la persona que lo preparo, se sugiere una etiqueta como:

EQUIPO DE SEGURIDAD DE USO ESTRICTO Y OBLIGATORIO 1. Ropa de protección

2. Batas o mandiles de laboratorio.

3. Guantes.

TÉCNICAS DE MANEJO, EMPLEO Y CONSERVACIÓN DEL REFRIGERADOR

1.- El refrigerador debe inspeccionarse, limpiarse a fondo y deshelar periódicamente para eliminar todos los tubos, matraces, placas, etc. que no sean útiles.

2.- Todas las muestras, en especial si son infecciosos o tóxicos, que se almacenen en el refrigerador deben llevar la etiqueta correspondiente, la fecha de almacenamiento y el nombre de la persona que lo ha almacenado.

3.- No deben guardarse nunca soluciones inflamables en el refrigerador que presenten algún riesgo de explosión.

TRATAMIENTO.

Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deberán ser tratados por métodos físicos o químicos y deben: garantizar la eliminación de microorganismos patógenos.

ALMACENAMIENTO DE REACTIVOS Debe existir un inventario actualizado periódicamente de tal manera que se conozca la cantidad de sustancia existente.

NORMAS DE LA SECRETARIA DEL TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL

En un lugar de trabajo debemos de tomar en cuenta las normas oficiales que se estan ejerciendo a fin de homogenizar criterios y respetar nuestra reglamentación, para ello nos podemos auxiliar de estas NOM.

NOM-005-STPS-1998, Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas.

NOM-008-STPS-1998, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para la producción, almacenamiento y manejo de explosivos en los centros de trabajo.

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NOM-009-STPS-1993, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para el almacenamiento, transporte y manejo de sustancias corrosivas, irritantes y tóxicas en los centros de trabajo.

NOM-018-STPS-1993, Relativa a los requerimientos y características de los servicios e regaderas, vestidores y casilleros en los centros de trabajo.

NOM-020-STPS-1993, Relativa a los medicamentos, materiales de curación y personal que presta los primeros auxilios en los centros de trabajo.

NOM-026-STPS-1998, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos o fluidos conducidos en tuberías.

NOM-114-STPS, Sistema para la identificación y comunicación de riesgos por sustancias químicas en los centros de trabajo.