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Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN

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PRÁCTICA No. 8

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO

UNIDAD V: Crecimiento microbiano

1. OBJETIVOS

El alumno realizará la producción de un metabolito de importancia industrial de origen microbiano, medirá algunos parámetros para verificar su producción.

I.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno determinará cuantitativamente el lactato producido.

1.2.2 El alumno establecerá la correlación entre el crecimiento microbiano y la producción de un del metabolito primario.

2. INTRODUCCIÓN

Por biotecnología se entiende “Toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y

organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos

específicos”, según la definición de la ONU. Desde los inicios de la civilización, la humanidad ha

hecho uso de los microorganismos para obtener productos específicos como pan, cerveza, vino,

yogurt, etc., en lo que se conoce como biotecnología tradicional o de primera generación. En la

década de los 40´s, se emplearon las herramientas de la bioquímica y la microbiología en el uso y

manipulación de organismos para la obtención de metabolitos (aminoácidos, antibióticos, enzimas),

como biotecnología de segunda generación. Actualmente, la biotecnología de tercera generación hace

uso de las herramientas de la biología molecular y la ingeniería genética para la producción de

compuestos, enzimas, vacunas, anticuerpos, etc.

Uno de estos metabolitos de origen microbiano es el ácido láctico, obtenido generalmente a partir de

bacterias lácticas homofermentativas. Fue el primer ácido orgánico producido mediante fermentación

microbiana industrial en 1880. Se emplea en medicina para estabilización hemodinámica, en

cosmética como queratinolítico, para curtir pieles en peletería, y como acaricida en el ganado. El ácido

láctico tiene múltiples aplicaciones en la industria alimentaria como aditivo y conservante en productos

cárnicos y lácteos, en industria derivada de cereales y en numerosas industrias de bebidas. De hecho

el yogurt se produce por la fermentación de la lactosa de la leche hasta ácido láctico, cuya acidez

genera la precipitación de la caseína, dando el aspecto grumoso del yogurt. Se producen otros

alimentos a partir de fuentes de carbono diversas, en donde se genera acido láctico, tales como la

leche búlgara, el yakult, el jocoque, etc. En la producción de saeukrut (col fermentada), la primera fase

del proceso incluye la fermentación láctica. La producción sólo del ácido es de 20,000 toneladas

anuales.

El ácido láctico se produce a través de la degradación de lactosa ó glucosa por la ruta de Embden –

Meyerhoff –Parnas o glicólisis, hasta producir piruvato, el cuál es reducido por la Lactato

deshidrogenasa (LDH) a L – (+) Lactato. El lactato es un ácido carboxílico, y la acidez que genera, la

cual llega a ser de pH 4.5, detiene el crecimiento de los microorganismos, lo que da fin al proceso

fermentativo, y permite conservar los productos, pues la acidez evita la contaminación por otros

microorganismos.

Las cepas utilizadas desde hace tiempo en la producción de lactato (sal sódica del ácido láctico, y que

es la forma como se comercializa) son principalmente lactobacilos (homofermentativos), como son

Lactobacillus delbruckii sub. delbrueckii, sub. bulgaricus y sub. lactis, y L. helveticus. Estos

microorganismos son anaerobios aerotolerantes, por lo que la fermentación se puede llevar a cabo en


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condiciones parcialmente anaerobias, y no es necesaria la anaerobiosis absoluta. Otros lactobacilos

son heterofermentativos (grupo III), y además de producir lactato, producen acético, etanol u otros

productos, por lo que no son útiles para la producción. L. delbruckii sub. delbrueckii fermenta la

glucosa y la fructosa, pero no la lactosa; L. delbruckii sub. bulgaricus y lactis si pueden fermentar la

lactosa. Actualmente la mitad del lactato que se genera se produce por fermentación, y el resto por

síntesis química.

Los fabricantes ponen especial interés en la selección de las condiciones adecuadas de cultivo para

lograr altas tasas de producción del ácido. En la producción se puede emplear glucosa o lactosa como

fuentes de carbono, pero se prefiere la glucosa por el precio. Además de la glucosa y de la fuente de

nitrógeno, generalmente fosfato de amonio, estas bacterias requieren vitaminas del grupo B para su

crecimiento, las cuales se pueden adicionar puras, o adicionar una fuente rica en ellas, como el

extracto de levadura. En los procesos continuos, se adiciona CaCO3 para mantener el pH alto y evitar

que la fermentación se detenga. La fermentación típica dura 72 horas y debe mantenerse una

temperatura entre 30 -35° C. En los últimos tiempos, se han desarrollado procesos para la obtención a

partir del suero lácteo desproteineizado que es un subproducto de queserías, con lo cual se

disminuyen costos, además de evitar contaminación por su desecho. Este suero contiene un 5%

aprox. de lactosa que funciona como fuente de carbono. También se emplea la melaza del azúcar,

dando un uso alternativo de la caña de azúcar.

Un proceso típico de fermentación “batch”, consiste en la preparación del inóculo, la inoculación del

fermentador semilla, la fermentación en el tanque de producción y la etapa de purificación del

metabolito. El estudio cinético de un proceso fermentativo para la obtención de un metabolito consiste

en la determinación y análisis de los componentes del sistema que nos permitan establecer las

mejores condiciones de producción y tener control sobre ellas, como son: determinación del

crecimiento del microorganismo como biomasa producida (x), el consumo de carbohidratos o de la

fuente de carbono empleada, es decir el sustrato (s) y la cantidad de metabolito producido (P).

La determinación de biomasa microbiana se puede hacer por peso seco o peso húmedo, ó por cuenta

directa. La determinación del consumo de la fuente de carbono o sustrato depende de la naturaleza

de éste, y y existen varias técnicas espectrofotométricas para ello. La técnica elegida para la

determinación del metabolito producido, también depende de la naturaleza de este. Dado que el ácido

es un metabolito asociado al crecimiento, la medición de la biomasa producida, puede ser indicativa

de la producción de láctico en un cultivo “batch”. En este caso la determinación de la acidez del medio

nos permitirá determinar su producción.

3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

3.1 EQUIPO Y MATERIAL

Estufa de incubación a 40 ºC

Microscopio

Balanza analítica

Refrigerador

Matraces Erlenmeyer de 125 ml y 250 ml.

Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml estériles

Potenciómetro

Cámara de Neubauer

Tubos de ensaye de 13 X 100 mm

Bureta graduada

Vaso de precipitados de 30 ml

Centrifuga

3.2 MATERIAL BIOLÓGICO

Cepa: Lactobacillus delbrueckii sub. lactis en tubos inclinados de medio MRS


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3.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Un matraz con 150 ml de Medio MRS

NaOH 0.1 N

Regulador de pH 4.0

Solución salina isotónica estéril

Colorantes para tinción de Gram

Solución de fenolftaleína

Regulador de pH 7.0

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

4.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO Y MATRAZ SEMILLA.

a) Tomar un tubo con medio inclinado con un cultivo de Lactobacillus lactis y adicionarle 2 ml de solución salina isotónica.

b) Homogeneizar perfectamente para tomar suspensión celular.

c) Inocular un matraz conteniendo 150 ml de medio MRS de cultivo con 2.0 ml de la suspensión celular. A fin de verificar la pureza de éste matraz semilla, se realizará una tinción de Gram y se revisará en el microscopio.

d) Incubar a 40 oC durante 48 horas sin agitación

PRIMERA SESIÓN

e) .Adicionar del matraz anterior 10 ml de la cepa semilla a un matraz conteniendo 150 ml de medio MRS y homogenizar.

f) Tomar 10 ml de la muestra del tiempo 0 h y colocarlo en un tubo previamente pesado, etiquetar perfectamente y guardar en el refrigerador.

g) Tomar 2 ml y colocarlo en un tubo de ensaye, etiquetar y guardarlo en el refrigerador.

SEGUNDA, TERCERA y CUARTA SESIÓN: (algunas de estas sesiones son extraclase).

1.- Tomar 10 ml de la muestra y colocarlo en un tubo de ensaye previamente pesado, tapar con parafilm y guardar en el refrigerador.

2.- Colocar los 2 ml en un tubo de ensaye y colocarle parafilm para guardarse en el refrigerador.

3.- Del volumen que quede en la pipeta esparcir un poco para la realización del Gram

4.- Realizar este procedimiento a las 24, 48 y 72 h.

4.2 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS

a) Centrifugar los cuatro tubos, para ello recuerda que hay que tararlos.

b) Verter el sobrenadante en un vaso de 15 ml para la determinación de pH

c) Posteriormente vaciar el sobrenadante en un matraz y colocarle 3 gotas de fenolftaleína para realizar el procedimiento de titulación.

d) De los dos ml que tienes en el tubo, agitar perfectamente y proceder a colocar una gota en la cámara de Neubauer para el recuento de células.

e) Realizar la tinción de Gram y proceder a observar la pureza y morfología microscópica

4.2.1 DETERMINACIÓN DEL PESO HÙMEDO.

a) Pesar cuatro tubos de 0. 24,48 y 72 h previamente etiquetados

b) En estos tubos se pondrá los 10 ml de la muestra de cada tiempo


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c) El día de la práctica, sacar los tubos del refrigerador y tarar los tubos, centrifugar 5 min a 4000 rpm.

d) Una vez centrifugado decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados de 15 ml. Etiquetar el vaso con el tiempo y pasarlo a la sección de determinación de pH con el potenciómetro.

e) Pesar el tubo que contiene las células y con la diferencia de peso de los tubos vacíos y los centrifugados sacar el peso en g/ml

f) Realizar lo mismo para las otras muestras.

4.2.2. DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO PRODUCIDO POR DETERMINACIÓN DE pH.

a) Ajustar el potenciómetro según las indicaciones del profesor con un regulador de pH= 4 y otro de pH= 7 y medir el pH de las muestras. Esto será indicativo de la producción de ácido láctico.

b) Medir el pH de la muestra y pasar el vaso a la sección de titulación

c) Realizar lo mismo para las otras muestras

4.2.3. DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO PRODUCIDO POR DETERMINACIÓN DE ACIDEZ.

d) Vaciar el contenido del vaso a un matraz, colocarle 3 de gotas de fenolftaleína y mezclar bien.

e) Realizar la titulación con NaOH 0.1 N a las cuatro muestras

f) Registrar el volumen de álcali gastado, para calcular los moles de ácido orgánico láctico.

4.2.4. DETERMINACIÓN DE LA PUREZA

a) Para verificar la pureza del cultivo se realizarán las cuatro tinciones de Gram.

4.2.5 CUENTA DIRECTA EN CÀMARA DE NEUBAUER PARA MEDIR EL CRECIMIENTO.

a) Tomar una gota de la alícuota previamente homogenizada del tubo que contiene los 2 ml y colocarla en la cámara de Neubauer.

b) Colocar la cámara en el microscopio y enfocar a 10X, eligiendo el campo de la cuadricula.

c) Cambiar a 40X y realizar el conteo de bacterias. Registrarlas para el cálculo posterior del número de células.

5. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

5.1 Anotar en la tabla siguiente anotar los resultados obtenidos. Los resultados obtenidos serán utilizados para elaborar la gráfica de la cinética de producción de lactato

Tiempo Peso húmedo Valor de pH Acidez Pureza No. de Cel / ml

0

24

48

72

5.2 Con los datos del gasto en ml de NaOH de cada una de las muestras y con las formulas calcula los moles de NaOH.

* La solución de sosa es 0.1N, lo que equivale a 0.1 moles / L


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Después se calculan los moles de lactatos presentes en la muestra:

5.3 ¿Cuántos moles de lactato se produjo en el matraz que se corrió? Comparar la cantidad de lactato producido en los matraces con suero de leche y con glucosa, e indicar cuál es más conveniente para la producción de lactato.

5.4 Con los resultados de pH, y número de células, elaborar una gráfica, de tiempo contra crecimiento y pH a los diferentes tiempos. Con esto tendremos una gráfica donde se muestre como se comporta el cultivo con respecto al pH. Recuerda que es una sola gráfica para pH y número de células.

5.5 Escribir la vía metabólica utilizada en la fermentación para la producción de ácido láctico.

5.6 Explicar porque se eligió esta cepa para la producción de lactato.

5.7 Mencionar dos usos del ácido láctico.

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Discutir los resultados obtenidos en función del medio empleado y la cantidad de lactato producido en cada medio. Explicar las ventajas de producir lactato en cada uno de los medios.

7. CONCLUSIONES

Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.

8. BIBLIOGRÁFIA

8.1 Crueger,D y Crueger, A. Biotecnología: Un texto de microbiología industrial. 2da. Edición. Ed. Omega. Barcelona. 1994.

8.2 Jakymec, M.; Moran, H.; Páez, G.; Ferrer, J.; Mármol, Z.; Ramones, E. 2001. “Cinética de la producción de ácido láctico por fermentación sumergida con lactosuero como sustrato”. Rev. Cient., FCV-LUZ. XI(1): 53-59.

8.3 Rodríguez Pascual, L. y Martínez Zúñiga R.1999. Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica Microbiana. UPIBI-IPN. México.

8.4 Río de Janeiro. Convenio de Diversidad Biológica. Secretariat of the Convention on Biological Diversity. UNEP. 1992. Disponible en WEB como [ref. marzo de 2007] http://www.biodiv.org/convention/convention.shtml

http://www.biodiv.org/convention/convention.shtml


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PRÁCTICA No. 9

CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

UNIDAD V: Crecimiento microbiano

1.-OBJETIVOS.

El alumno cuantificará bacterias coliformes por la Técnica de Número Más Probable de una muestra biológica.

1.1 Objetivos específicos:

1.2.1 El alumno aplicará adecuadamente la Técnica del Número Más Probable para cuantificar a los microorganismos coniformes totales o fecales presentes en una muestra.

1.2.2 El alumno interpretará la Técnica de Número Más Probable para el conteo de organismos coliformes totales o fecales en muestras según la NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable.

2.- INTRODUCCIÓN

Esta técnica esta basada en la estadística, matemática inobjetable, para expresar cuantitativamente la

densidad de microorganismos en una muestra. Se basa en la presunción de que las bacterias se hallan

normalmente distribuidas en un medio líquido.

La Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinación de bacterias

coliformes Técnica del Número Más Probable. Secretaria de Salud. México, establece el método

microbiológico para estimar el número de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del

cálculo del número más probable (NMP).

Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados

térmicamente, así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la

industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como

mínimo de una bacteria en 10 ml de producto líquido o una bacteria por gramo de alimento sólido.

Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la naturaleza del alimento lo permite,

utilizar el método de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por

mililitro o gramo de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa.

El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante

24 a 48 h, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de

fermentación.

La técnica NMP requiere de mucho más material que la utilizada en los recuentos en placa y se

considera en general, que posee una menor exactitud y precisión; es sin embargo, incomparablemente y

más sensible ya que pone de manifiesto unos cuantos microorganismos o uno solo, en un gran volumen

de muestra (teóricamente litros). Por esta razón encuentra aplicación en el análisis de agua, por ejemplo,

en donde la presencia de dos organismos coliformes en 100 ml, ya reclama atención especial en un

sistema de abastecimiento.

Con frecuencia en la aplicación de la técnica de NMP de un grupo particular de microorganismos, el

ensayo se extiende a dos o más estadios, en el primero, que constituye la prueba presuntiva, los tubos

positivos pueden ser el resultado de la actividad del microorganismos en cuestión, o también de otros

con comportamiento similar e incluso, de asociaciones de diferentes microorganismos. La que viene a

ser la prueba presuntiva en la investigación de organismos coliformes, consiste en inocular alícuotas de

la muestra en tubos de fermentación con caldo lactosado. En ellos, estos microorganismos proliferan

fácilmente fermentando la lactosa y liberando gas que se acumula en la campana de Durham. Un efecto


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semejante puede ocurrir en ausencia de organismos coliformes como resultado de la acción sinérgica de

dos tipos de bacterias; una capaz de fermentar la lactosa hasta ácido láctico y pirúvico; y otra que

metaboliza estos ácidos generando el gas aldehído y ácidos menores. Algunas bacterias Gram positivas

también pueden, aunque en menor grado producir gas a partir de la lactosa. Se hace por ello

indispensable efectuar un segundo ensayo, llamado prueba confirmatoria en la cual los organismos

coliformes, en caso de existir, proliferan activamente en tanto que los falsos positivos serán inhibidos por

la presencia de sustancias selectivas antibacterianas adicionadas al medio de confirmación.

Otra prueba para determinar la presencia de bacterias coliformes es la cuenta total en placa

El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra,

utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en

aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran

el indicador de pH y precipitan las sales biliares.

El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de colonias NOM-

113-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa.

Las bacterias coliformes son bacilos cortos, Gram negativos, que fermentan la lactosa y producen ácido

y gas, son anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 ºC.

Las bacterias coliformes incluyen la E. coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y

fisiológicamente.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO Y MUESTRAS

3.1 MEDIOS DE CULTIVO Organismos coliformes totales

5 frascos de dilución con 90 ml de agua peptonada al 0.1 %.

3 tubos con 10 ml de caldo lactosado de doble concentración y campana de Durham

6 tubos con 10 ml de caldo lactosado de concentración sencilla y campana de Durham.

9 tubos con 10 ml de caldo lactosa bilis verde brillante con campana de Durham.

Organismos coliformes fecales

6 frascos de dilución con 90 ml de agua peptonada al 0.1 %.

3 tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa de doble concentración y campana

6 tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa de concentración sencilla y campana.

9 tubos con 10 ml de caldo EC y campana

Un frasco con tiosulfato de sodio

Determinación de coliformes fecales en muestras de agua o hielo.

5 tubos con 20 ml de caldo lauril sulfato triptosa (CLST) de doble concentración con campana Durham

10 tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa de concentración sencilla y campana

15 tubos con 10 ml de caldo EC

Determinación de coliformes totales en muestras de agua o hielo.

5 tubos con 20 ml de caldo lactosado (CL) de doble concentración con campana Durham

10 tubos con 10 ml de caldo lactosado de concentración sencilla y campana

15 tubos con 10 ml de caldo de bilis verde brillante (CBVB)

Esterilización de frascos para muestras de agua con cloro residual libre. Previo a la esterilización agregar 0.1 ml

de tiosulfato de sodio al 3% por cada 120 ml de capacidad de los mismos.


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3.2 MATERIAL

Un pipetero metálico con pipetas de 1 ml estériles Cuatro pipetas de 10 ml

3.3 REACTIVOS

Tiosulfato de sodio Benzal

3.4 EQUIPO

Una autoclave.

Una balanza granataria

Un baño María a 44.5 ° C

Una incubadora a 35° C.

Un horno a 180° C.

4.- PROCEDIMIENTO

Para los equipos que van a traer muestras de agua potable, tendrán que llevar un frasco que

contenga 1 ml de tiosulfato de sodio al 10 % para inactivar el cloro residual.

Para muestras solidas se tomaran en una bolsa de plástico nueva y tendrán que realizar la dilución

primaria si es que la muestra aparentemente no tiene muncha carga microbiana.

Las muestras a traer serán las siguientes:

equipo Determinación

1 y 6 Agua Determinación de Organismos coliformes totales

2 y 7 Hielo Determinación de Organismos coliformes fecales

3 y 8 Queso Determinación de Organismos coliformes totales

4 y 9 Leche Determinación de Organismos coliformes fecales

5 y 10 Fresas Determinación de Organismos coliformes totales

4.1 Preparación de las diluciones. Realizar diluciones para muestras sospechosas de una gran carga microbiana

a. Etiquetar los frascos que contienen 90 ml de agua peptonada estéril como 10 –1, 10-2 y 10-3……

b. Para muestras liquidas medir 10 ml de la muestra y colocarla en el frasco o 10-1 y homogenizar según las recomendaciones de la NOM 110.

c. Con una pipeta estéril se transfiere 10 ml de la dilución 10-1 al frasco de la dilución 10-2 y así sucesivamente, utilizar una pipeta estéril para cada dilución.

d. Para muestras sólidas solo realizar la dilución 10-1 y continuar el procedimiento.

4.3 DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES: USANDO LA TABLA 333.

Prueba presuntiva

a) Inocular 10 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CL de doble concentración.

b) Inocular 1 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CL de concentración. sencilla.

c) Inocular 0.1 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CL de concentración. sencilla.

d) Incubar los tubos a 35° C durante 24 horas.

e) Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las 48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa.


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Prueba confirmativa

f) Agitar suavemente los tubos de caldo lactosado que resultaron positivos en la prueba presuntiva.

g) Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante.

h) Incubar a 35° C durante 24 horas.

i) Considerar la prueba (+) si hay formación de gas en cualquier cantidad, si no existe, incubar por 24 h más y si no existe producción de gas se reporta como negativa el análisis.

j) Determinar el número de organismos coliformes de acuerdo con la tabla correspondiente 333, tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas.

k) Reportar: Número más probable de coliformes por gramo o mililitro de muestra NMP/g ó NMP/ml.

4.4 DETERMINACIÒN DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES: USANDO LA TABLA 333.

Prueba presuntiva

a) Inocular 10 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CLST de doble concentración.

b) Inocular con 1 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CLST concentración sencilla.

c) Inocular 0.1 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CLST concentración sencilla.

d) Incubar los tubos a 35° C durante 24 horas.

e) Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las 48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa.

f) Prueba confirmativa

g) Agitar suavemente los tubos de CLST que resultaron positivos en la prueba presuntiva.

h) Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo EC.

i) Incubar a 44.5 °C durante 24 horas.

j) Considerar la prueba (+) si hay formación de gas en cualquier cantidad, si no existe, incubar por 24 h más y si no existe producción de gas se reporta como negativa el análisis.

k) Determinar el número de organismos coliformes fecales de acuerdo con la tabla correspondiente 333, tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas.

l) Reportar: Número más probable de coliformes por gramo o mililitro de muestra NMP/g ó NMP/ml.


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4.5 DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES PARA AGUA POTABLE Y HIELO, usando la tabla (555):

Prueba presuntiva

a. En caso de hielo dejar fundir completamente la muestra, homogenizar la muestra y transferir 10 ml a cada uno de 5 tubos que contienen 20 ml de caldo lauril sulfato triptosa (CLST) de doble concentración, 1.0 ml a otros cinco tubos que contiene 10 ml de CLST de concentración sencilla y 0.1 ml de muestra a otros 5 tubos que contienen 10 ml de CLST de concentración sencilla.

b. Incubar los tubos a 35 °C, observar a las 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, si no tiene incubar otras 24 ± 2 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa

Prueba confirmativa

c. De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos que contienen 10 ml de caldo EC. Incubar a 44.5 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas, si en este tiempo no hay formación de gas, incubar otras 24 horas, en casi de no haber gas la prueba se considera negativo.

d. La presencia de gas, en cualquier cantidad, dentro del tiempo de incubación hace positiva la prueba.

b) Determinar el número de organismos coliformes de acuerdo con la tabla correspondiente 555 tomando como base el número de tubos (+) en la prueba confirmatoria.

c) Reportar: Número más probable de coliformes por gramo o mililitro de muestra NMP/g ó NMP/ml.

Para la determinación de organismos coliformes fecales es lo mismo, solo cambian los medios de cultivo.

Presuntivo: Caldo Lactosado y Caldo de bilis verde brillante y la temperatura de incubación es de 35°C

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

Anota los resultados de todos los equipos en el siguiente cuadro.

Equipo Muestra Organismos coliformes por NMP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

5.1.-¿Qué son los organismos coliformes?

5.2.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y menciona la función de cada uno de ellos.

5.3.- ¿Por qué se usa caldo lactosado de doble concentración para análisis de agua?

5.4.-Anota todos los componentes del caldo lauril sulfato triptosa y del caldo EC, menciona la función de cada ingrediente.


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5.5.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y el caldo de bilis Verde brillante menciona la función de cada uno de ellos.

5.6.- ¿Por qué se les llama microorganismos indicadores a los coliformes?

5.7.- A que se debe la presencia de organismos coliformes fecales en muestras de agua y alimentos.

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Analice la Técnica del Número Más Probable, presencia o ausencia de organismos coliformes totales y coliformes fecales en muestras de agua, así como el uso de las tablas.

Analiza la presencia o ausencia de organismos coliformes totales y coliformes fecales en agua

7.- CONCLUSIONES

Elabora las conclusiones con base a los resultados obtenidos y a los objetivos de la práctica.

8.- BIBLIOGRAFÍA

Anota la bibliografía consultada para el reporte de esta práctica.

9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

9.1 American Public Health association 1998. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Ed. Marvin L. Speck. E.U.A.

9.2 Fernández Escartín E. 1981. Microbiología Sanitaria Agua y Alimentos. Vol 1. Universidad de Guadalajara. ANUIES-SEP. México.

9.3 MOM-109-SSA-1994 Bienes y Servicios Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaria de Salud México.

9.4 NOM-110-SSA-1994 Bienes y Servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaria de Salud México.

9.5 NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinación de bacterias coliformes Técnica del Número Más Probable. Secretaria de Salud. México.


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PRÁCTICA No 10

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

No. DE UNIDAD: IV Metabolismo bacteriano

OBJETIVOS:

El alumno identificará bacterias de interés, a través de su metabolismo microbiano.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno realizará pruebas para determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y sales orgánicas como principales fuentes de carbono.

1.2.2 El alumno realizará pruebas de hidrólisis para aminoácidos y proteínas para demostrar su actividad enzimática.

1.2.3 El alumno realizará pruebas para demostrar la actividad enzimática en los procesos de óxido-reducción.

2. INTRODUCCIÓN

El metabolismo es un proceso químico, mediante el cual los seres vivos transforman una serie de

compuestos químicos con el fin de obtener energía. Los microorganismos son capaces de efectuar

reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificación, a

este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se han clasificado según su

origen:

a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera).

b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea).

c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y ornitina).

d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos, anaerobios facultativos y

anaerobios estrictos).

La identificación bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las características de las colonias

y la morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido en

género y especie se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos exclusivos de cada

especie.

En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia aislada a una

serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que detectan

los cambios de pH o la presencia de un subproducto.

Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los

microorganismos, ya que generalmente se parte de un cultivo mixto, de esta manera se logra aislar y

observar su morfología colonial. Una vez que se tiene el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo

en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura óptima de

crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la tinción de Gram para clasificarlo y

saber a qué grupo pertenece G+ ó G-. Además en la morfología microscópica permite conocer la forma y

agrupación del microorganismo (bacilo, coco, coma, etc.)

Recientes avances biotecnológicos son usados para el análisis microbiológicos. Las pruebas de

identificación bioquímica esta miniaturizada y automatizada haciéndose el análisis más rápido y

económico. Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen

enfermedades a cientos de personas causando daños económicos. Una vez aislados podemos medir


79

específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica aunque la

formulación de un producto con proteínas, aceites, ácidos grasos, conservadores hace que en un

momento dado favorezcan o inhiban el crecimiento microbiano.

Algunos métodos utilizados para identificar grupos microbianos o microorgansimos (género y especie)

son:

Placa Petrifilm, Detección de Salmonella por el sistema VIDAS, Sistema API, Coli-complete, Sistema

VITEK, Identificación por PCR, etc

En nuestro caso identificaremos a los microorganismos por medio de pruebas bioquímicas de manera

tradicional, ya que existen métodos “rápidos” que facilitan el trabajo, pero es necesario saber el

fundamento.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Fermentación de carbohidratos (glc lac,

sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol,

sorbitol, raf, ram, xilosa) en el medio base

CRF.

Fermentación de la glucosa, producción

de ácido sulfhídrico, producción de gas,

en el medio TSI

Descarboxilación de la lisina, en el

medio LIA

Movilidad, descarboxilación de la ornitina

y la producción de indo, en el medio MIO

Movilidad, producción H2S, producción de

indol, en el medio SIM

Prueba cuantitativa para la producción

de ácidos. Prueba de Rojo de metilo,

medio RM/VP

Producción de ureasa, en caldo urea

Producción de acetil metil carbinol.

Hidrólisis de la gelatina (licuefacción de

la gelatina), en el medio gelatina

Crecimiento en caldo nutritivo

Utilización de la esculina, medio de bilis

y esculina

Utilización del gluconato (oxidación),

medio caldo gluconato peptona

Requerimientos de oxígeno, condiciones

aerobias y anaerobias

Producción de Catalasa y oxidasa

Reducción de nitratos, en caldo nitrato.

Detección del metabolismo oxidativo

/Fermentativo, en el medio OF con

sacarosa

Utilización del citrato, en citrato de Sodio

Utilización de Malonato, en malonato

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Fermentación de carbohidratos (glc, lac, sac,

manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,

raf, ram, xilosa, etc.)

Fermentación de la glucosa, producción de

ácido sulfhídrico, producción de gas, medio

de TSI

Descarboxilación de la lisina, medio de LIA

Movilidad, descarboxilación de la ornitina y la

producción de indol, medio de MIO

Movilidad, producción de indol y producción

Crecimiento en bilis al 40 %

Coagulasa

Hidrólisis de gelatina (licuefacción de la

gelatina), en el medio gelatina

Hidrólisis de la esculina, en caldo esculina

Producción de acetil metil carbinol, prueba

Voges – Proskauer, medio VP/RM

Producción de la fosfatasa, medio PDP

Prueba de la DNAsa, en el medio agar ADN


80

de ácido sulfhídrico, medio SIM

Producción Catalasa y oxidasa

Reducción de nitratos

Producción de hemólisis, en agar sangre

Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %

Sensibilidad a optoquina y bacitracina

Crecimiento a 10 y 45 ª C

Reducción con azul de metileno en leche

Hidrólisis en caldo hipurato de sodio

Formación de cápsula

Hidrólisis de almidón,

Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura

para hacer una selección de pruebas recomendable y logras su identificación lo más rápido posible y sin

pérdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos

realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas.

FUNDAMENTO DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS

1 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de

almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.

2 PRUEBAS DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL

Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio,

produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene

rojo de fenol.

3 PRUEBAS EN AGAR TRIPLE AZÚCAR Y HIERRO (MedioTSI)

Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar

hierro (TSI). Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de

la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro

férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de

los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.

La fórmula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de

glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar está preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2

cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su

superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es

relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de

flauta y el fondo, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin

de conservar este efecto de las dos cámaras. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el

pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego

se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado, el indicador de pH: rojo de fenol y un

pH ácido da una coloración amarilla y en un pH alcalino es rojo.

4. PRUEBA DE ROJO DE METILO

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es

cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos

láctico, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen

muchos microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos


81

organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h),

contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes

4.5. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en

diacetilo por acción del KOH al 40 % y el O2 atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el -naftol

actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo, el indicador de pH es el Rojo de metilo.

Controles


Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp

UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS

6. PRUEBA DE CITRATO

Algunos microorganismos pueden suministrar energía en ausencia de la fermentación o producción de

ácido láctico empleando como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende

una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los

productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce

más acetato y formato con una disminución del lactato y CO2. Por encima del pH de 7 no hay producción

de lactato y los productos son CO2 ácido fórmico y ácido acético.

Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilización del

citrato. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene también sales de amonio inorgánicas,

un organismo que es capaz de utilizar citrato como su única fuente de carbono utiliza también las sales

de amonio como su única fuente de nitrógeno. Cualquier medio empleado para detectar la utilización de

citrato por parte de las bacterias en estudio debe estar desprovisto de proteínas e hidratos de carbono

como fuente de carbono.

Controles


Citrato de sodio Escherichia coli. Enterobacter aerogenes

7. PRUEBA DE MALONATO

Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono,

con la consiguiente alcalinidad.

El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido

fumárico, inhibiendo la acción catalítica de la enzima succinato deshidrogenasa, mediante un proceso de

inhibición competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima bloqueando los sitios activos de

manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona

un bloqueo en la oxidación del ácido succínico.


82

Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la

oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto

ácido es influido independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma

otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como

el ácido fumárico, el ciclo se Krebs deja de funcionar, por lo tanto la célula bacteriana, recurre al ciclo del

ácido glioxílico para la producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo.

Indicador de pH: Azul de bromotimol

Controles


Caldo malonato Salmonella Alcaligenes faecalis

8. PRUEBA DE UREASA

La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de

amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la

urea que está presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco

reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un

aumento del pH del medio, el indicador de pH es el rojo de fenol.

Controles

Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo

Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli

HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:

9.- PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (MÉTODO DEL TUBO)

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son

detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente. Las proteínas que se producen son

demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a

componentes más pequeños, las enzimas extracelulares de tipo proteolítico son secretadas por ciertas

bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El

catabolismo de las proteínas por las proteasas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y

posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.

Controles


Gelatina Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus

10. PRUEBAS EN MEDIO SIM. (MOVILIDAD, PRODUCCIÓN DE H2S E INDOL).

El indol producido por las triptofanasas se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich,

para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la

turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de

sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del

tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.


83

11. MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA).

La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un

microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La

descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas

específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una

diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la

cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido

en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la

alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es

irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.

El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina

putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si

recubrimos la superficie del medio con aceite mineral. La prueba de movilidad nos sirve para determinar

si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. La prueba de indol nos sirve para

determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de de la oxidación del aminoácido

triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos

indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuado por varias enzimas que en

conjunto se denomina “triptofanasa” y el indicador de pH es el púrpura de bromocresol.

Control

Sustancia Control positivo Control negativo

Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae

Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp

Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp

12. DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. (LYSINE IRON AGAR)

En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminación de la lisina que se lleva a cabo en aerobiosis.

La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un

microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La

descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas

específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una

diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa, la

cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido

en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la

alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es

irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.

El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina

cadaverina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si

recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se

deje solidificar en pico de flauta y el fondo, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3

cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, el inicador de pH es el púrpura de

bromocresol.


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Controles:

Aminoácido Control positivo Control negativo

Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae

Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes

DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO

13. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS

La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada

para la identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos

biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.

Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar

nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo -

naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo - -

naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 s de añadir los reactivos y dado que los

reactivos solo detectan nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es

necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn

reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la

presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.

Controles:

Prueba Control positivo Control negativo

Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus

14. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO

DE HUGH Y LEIFSON

Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa por vía fermentativa u oxidativa, los subproductos

de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de

fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son

sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación más sensible,

como el medio OF.

Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:

a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.

b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.

c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.

La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden

neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La

concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción

de ácido. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se

difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es

también apto para determinar la movilidad de un microorganismo.


85

La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden

no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas

pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación

final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se

inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta 0,5 cm

desde el fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el

otro tubo “abierto al aire”, es decir sin aceite o parafina. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o

más, el indicador de pH: Púrpura de bromocresol.

Interpretación.

Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto

Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde

Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo

No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde

Controles

Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico

OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp

15. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO

Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de

potasio.

La respiración es el conjunto de reacciones químicas en las que se libera energía. La transformación de

la energía puede ser aerobia o anaerobia. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación

– reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo

trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor final

de electrones, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la especie

bacteriana y su sistema enzimático. El cianuro de potasio es un inhibidor de la citocromo oxidasa a nivel

del complejo IV de la cadena respiratoria, compite con él O 2 y actúa como aceptor final de electrones,

bloqueando la respiración.

Controles


KCN Klebsiella Escherichia coli

16. PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA

Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena

respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema

citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la

prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son

anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser

enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de

Pseudomonas o Neisseria (positivas).


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**Esta prueba utiliza el reactivo diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de

electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en

presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.

La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:

1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias

aisladas que se han desarrollado en la placa.

2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,

3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.

En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se

recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la

superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.

Controles:


Citocromo oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli

17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA

Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias

y anaerobias facultativas que contiene citocromo. La catalasa es una enzima que se descompone en

peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura

similar a la de la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del

metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de

hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y

oxígeno en agua.

Controles


Catalasa Staphylococcus aureus Streptococcus sp

18 PRUEBA DE LA COAGULASA (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)

Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa.

Un resultado positivo constituye por lo común el criterio de diagnóstico de para la identificación de S.

aureus y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia de la cepa. La estafilocoagulasa, producida

por S. aureus es relativamente estable al calor y resistente hasta 60 °C / 30 min. Esta enzima es una

proteína que es excretada al medio extracelular y se inactiva fácilmente por las enzimas proteolíticas.

19 HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)

La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, pues son la

fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento que permite el desarrollo de una gran

variedad de microorganismos exigentes. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración

final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. El medio

está libre de azucares reductores, ya que estos influirían de forma adversa en reacciones hemolíticas. El

tipo de hemólisis en agar sangre sirve para clasificar al género Streptococcus, la β hemólisis está


87

asociada con una completa lisis de la célula alrededor de la colonia, la hemólisis se asocia con una

hidrólisis parcial y se manifiesta por una coloración verde.

20.- CRECIMIENTO EN NaCl AL 7.5 %

Existen microorganismos que presentan crecimiento a diferentes concentración de sales y se les

denomina halófilos, aunque existen otros que son denominados extremófilos ya que viven en

condiciones extremas y su hábitat natural son los lugares a salinos. En condiciones normales, la sal

hace que la célula se deshidrate debido a la ósmosis, cosa que no ocurre en los halofilicos debido a

diversas adaptaciones fisiológicas que le permiten retener el agua para su metabolismo.

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1. EQUIPO

Incubadora a 35 ° C

Microscopio

Autoclave

Horno

3.2. MATERIAL

Portaobjetos

Pipetas Pasteur

Gradilla metálica

Asas bacteriológicas

Colorantes para tinción de

esporas

Colorantes para tinción de Gram

3.3. MEDIOS DE CULTIVO:

Pruebas de cada uno para Gram positivos

Tinción de esporas

Hidrólisis de almidón

Hemólisis en agar sangre

Resistencia a polimixina de 300

Prueba de TSI

Prueba de SIM

Prueba de MIO

Licuefacción de la gelatina a 22 °C

Utilización del citrato

Prueba de oxidación –fermentación

Prueba de Voges Proskauer

Prueba de ureasa

Fermentación de glucosa

Fermentación de manitol

Fermentación de arabinosa

Fermentación de Xilosa

Pruebas de cada uno para Gram negativos

Hidrólisis de almidón.

Crecimiento en MacConkey.

Prueba de TSI.

Prueba de LIA

Prueba de citrato.

Prueba de MIO

Prueba de SIM.

Licuefacción de la gelatina

Prueba de oxidación-

fermentación.

Prueba de ureasa.

Prueba de reducción de nitratos.

Fermentación de glucosa.

Fermentación de lactosa.

Fermentación de sacarosa

Fermentación de manitol.


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Fermentación de lactosa

Crecimiento en NaCl al 6.5 %

Prueba de reducción de nitratos

Prueba de catalasa

Prueba de oxidasa

Prueba de coagulasa

Fermentación Xilosa.

Rojo de metilo.

Prueba de Vogues Proakauer

Crecimiento en caldo KCN.

Prueba de malonato.

Prueba de catalasa y catalasa

3.4. REACTIVOS:

Solución de rojo de metilo

Solución de alfa-naftol

Solución de KOH

Reactivo de Kovac o Erlich

Solución de ácido sulfanílico

Solución de alfa naftilamina

Plasma de conejo

Tween 80 estéril

Plasma de conejo

Aceite mineral

Solución de peroxido de hidrogeno al 1 %

N,N,N,N-tetrametil-p-

fenilendiamina

Reactivos para tinción de Gram

Reactivos para tinción de esporas

Oxidasa

Catalasa

Jeringas de 10 ml

3.5. BACTERIAS:

Escherichia coli

Salmonella typhi

Proteus mirabilis

Pseudomonas aeruginosa

Shigella sp

Micrococcus luteus

Staphylococcus aureus

Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis

Corynebacterium glutamicum

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

A. Preparación del inoculo

a) Tomar un inoculo del cultivo para realizar una tinción de Gram y esporas si fuera necesario, anotar la

morfología microscópica y determinar si esta puro, si es así continuar con la identificación, si no lo está

es necesario re-aislar.

b) En un tubo de ensaye que contenga 5 ml de solución salina estéril, colocar una asada del cultivo y

homogenizar perfectamente para obtener una suspensión microbiana.

c) Dependiendo el Gram, solicitar las pruebas bioquímicas indicadas para Gram (+) o Gram (-)

d) Ordenar los tubos por la forma de inoculación y sembrar primero aquellos que no tienen inhibidores

Estría simple ( Citrato, placa con agar almidón, agar sangre)

Picadura y estría (TSI, LIA)

Picadura ( SIM, MIO, gelatina, OF )


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Caldos (Fermentación de carbohidratos, RM, VP, NaCl, Urea, CM, reducción de NO3 ,KCN..)

e) De la suspensión microbiana sembrar los tubos y en el caso de los caldos se puede hacer con el asa

o con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de la suspensión para que se estandarice un poco la cantidad

de inoculo.

f) Colocar una batería de bioquímicas como testigo

g) Incubar los tubos 24 horas y leer

h) La placa con agar almidón y agar sangre dividirla en cuatro partes, cada cuadrante corresponde para

un alumno y el cuarto cuadrante queda como testigo.

B LECTURA DE PRUEBAS

PRUEBA LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS RESULTADO

FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

Hidrólisis de almidón Agregar lugol sobre la estría

+ Positiva: Si se forma un halo claro alrededor de la estría.

- Negativa: No se forma un halo claro alrededor de la estría.

Fermentación de manitol

+Positiva: El medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas

- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de lactosa

+ Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas

- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de TSI Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa con producción de H2S

Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo.

Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla

Lactosa positiva: Color amarillo en el pico de flauta, Producción de H2S positivo: Coloración negra en el medio.

Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio.

Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo.

Producción de H2S ( - ): sin coloración.

Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.

Prueba de rojo de metilo

Agregar 2 gotas de rojo de metilo

+ Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetil-metil-carbinol).

-Negativa: No hay cambio en el color

Prueba de Voges-Proskauer

agregar 6 gotas de naftol y 2 gotas de KOH

+Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.

- Negativa: El cultivo no cambia de color


90


UTILIZACIÓN DE SALES INORGÁNICAS

Utilización de citrato de sodio

+ Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul

- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.

Utilización de malonato de sodio

Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).

Negativa: No hay desarrollo (medio de

Hidrólisis de urea Producción de ureasa

+ Positiva: Color rosa fucsia en el medio.

- Negativa: Sin cambio de color en el medio

HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS

Licuefacción de la gelatina

Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío durante cinco minutos.

+ Positivo: licuefacción de la gelatina.

- Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar, descartar la prueba negativa hasta los 14 días.

MIO (movilidad, indol y ornitina)

Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.

Descarboxilación de la ornitina:

+ Positiva: Color púrpura del medio.

- Negativa: Color amarillo del medio.

Después de leer las dos pruebas se agregan 3 gotas de reactivo de kovacs (p-dimetilaminobenzaldehído) y se observa:

- Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo.

- Negativo: No se forma el anillo.

SIM (producción de H2S, indol y movilidad)

Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tubo

Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s. (p-dimetilaminobenzaldehído)

Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.

Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido

sulfhídrico el medio se torna completamente negro.

LIA (Desaminación y descarboxilación de aminoácidos)

Desaminación de aminoácidos:

+ Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.

- Negativa: La superficie no tiene cambios.

Descarboxilación de aminoácidos

+ Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura.

- Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.


91


METABOLISMO OXIDATIVO – FERMENTATIVO

Reducción de nitratos a nitritos

Agregar 3 gotas de naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico.

+ Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos

- Negativa: Sin cambio de color.

Prueba del cianuro de potasio

+ Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez)

- Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)

Prueba de citocromo oxidasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).

+ Positiva: aparición de un color azul violeta.

- Negativa: No hay cambio de color.

Determinación de metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa (OF)

TUBO SIN SELLO DE ACEITE

Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.

TUBO CON SELLO DE ACEITE

Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.

Prueba de la catalasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar.

+ Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno.

- Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno.

Crecimiento en NaCl

AL 7.5 %

Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h, después de este tiempo registrar

la turbidez.

Positiva: Turbidez del medio.

Negativa: Sin cambio de color en el medio.

Hemólisis en agar

sangre (solo para

cocos Gram

positivos)

a) -En una placa con agar sangre estriar con la cepa presuntiva de

Streptococcus sp, al final de la estría enterrar el asa en el medio,

para crear un ambiente de microaerofilia.

b) Incubar durante 24 horas a 35 °C y determinar el tipo de hemólisis

que presenta.

Positiva: Hemólisis β transparente alrededor de la colonia.

Positiva: Hemólisis color verde tenue alrededor de la colonia.

Negativa: Sin cambio de color en el medio.


92


Prueba de la

coagulasa (Solo

para cocos Gram

positivos)

a) -Sembrar una colonia del Staphylococcus sp en un tubo con 0.5 ml

de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºC durante 24 h.

b) Inocular en la misma forma cepas conocidas de S. aureus y S.

epidermidis como testigos positivo y negativo.

c) -En un tubo de ensaye colocar 0,2 ml del cultivo anterior, 0.2 ml de

plasma de conejo diluido volumen a volumen con solución salina

estéril.

d) -Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a

intervalos de 1 h; si no hay formación de coágulo, observar a las 24

h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo.

e) Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade

una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma reconstituido

empleado, formándose un coágulo en 10-15 s.

f) En caso de utilizar plasma de humano citratado o heparina.

Positiva: Coagulación del plasma.

Negativa: El plasma esta líquido.

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las

pruebas de hidrólisis del almidón.

5.2. Explicar porqué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se

emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su intervalo de sensibilidad.

5.3. ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares?

5.4. ¿Cuál es el indicador de pH que se emplea en las pruebas de utilización de sales orgánicas y cuál

es su intervalo de sensibilidad?

5.5. Explicar cuál es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos

microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos?

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Discutir la importancia de la morfología microscópica y colonial, el aislamiento de los microorganismos,

la adecuada selección de pruebas bioquímicas a realizar y el uso de las claves para la identificación de

los microorganismos.

7. CONCLUSIONES

7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la

bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.

7.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas.

8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica

Panamericana. 2001. México. 1432 p.

8.2 Mac Faddin. Pruebas Bioquímicas, Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición.

Médica panamericana. Buenos Aires. 850 p.


93

Llenar los siguientes cuadros y con la ayuda de la bibliografía y a la información obtenida durante el

desarrollo de la practica menciona el género y si es posible la especie del microorganismo.

Nombre del microorganismo: ______________________________________________________

Resultados obtenidos para bacterias:

Gram positivas Resultado Gram negativas Resultado

Tinción de esporas Hidrólisis de almidón.

Hidrólisis de almidón Crecimiento en MacConkey.

Hemólisis en agar sangre Fermentación de glucosa. / gas

Fermentación de glucosa / gas Fermentación de sacarosa / gas

Fermentación de manitol / gas Fermentación de manitol / gas

Fermentación de arabinosa /gas Fermentación Xilosa / gas

Fermentación de Xilosa / gas Prueba de Vogues Proakauer

Fermentación de lactosa / gas Fermentación de lactosa / gas

Rojo de metilo. Rojo de metilo.

Prueba de Voges Proskauer Prueba de Voges Proskauer

Prueba de OF Prueba de OF

Prueba de TSI Prueba de TSI.

Glucosa positiva: Glucosa positiva:

Glucosa negativa: Glucosa negativa:

Sacarosa y lactosa positiva: Sacarosa y lactosa positiva:

Sacarosa y lactosa negativas: Sacarosa y lactosa negativas:

Lactosa positivo: Lactosa positivo:

Lactosa negativo: Lactosa negativo:

Producción de H2S: Producción de H2S:

Prueba de SIM Prueba de SIM

Movilidad Movilidad

Producción de H2S Producción de H2S

Producción de Indol Producción de Indol

Prueba de coagulasa Crecimiento en caldo KCN.

Prueba de MIO Prueba de MIO

Movilidad Movilidad

Descarboxilación Descarboxilación

Producción de Indol Producción de Indol

Licuefacción de la gelatina a 22 °C Prueba de reducción de nitratos.

Utilización del citrato Prueba de citrato

Crecimiento en NaCl al 6.5 % Prueba de ureasa.

Prueba de reducción de nitratos Prueba de malonato.

Prueba de oxidasa Prueba de catalasa

Prueba de ureasa Prueba de oxidasa

Prueba de catalasa Prueba de LIA

Resistencia a polimixina de 300


94

Tablas de Cowan para la identificación de microorganismos

Tabla No. 1 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram positivas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Forma S S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R

Acido resistencia - - - - - - - - - - - - - - - - - - - w +

Esporas - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - -

Movilidad - - - - + - - + - - + - - - - - D D - - -

Crecimiento aerobio + + + + + + - + + + + + + - - - - + + + +

Crecimiento anaerobio - + w w + + + - + + + + - + + + + D - - x

Catalasa + + w - - - - + + + + - + + - - - + + + +

Oxidasa - - - - - - - - - - - - x x x x x d - - -

Glucosa (prod. acido) D + + + + + +/- - - + + + + + + - D D + + +

O / F O/- F F F F F F/- - - F F F F F F - F/- F/O/- O O O/NT

Micrococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Staphylococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Aerococcus + + · · · · · · · · · · · · · · ·

Streptococcus · · · + + · · · · · · · · · · · · · · ·

Pediococcus · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·

Gemella · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·

Cocos anaeróbicos* · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · ·

Kurthia · · · · · · · + · · · · · · · · · ·

Corynebacterium · · · · · · · + + · · · · · · · · · ·

Listeria · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Erysipelothrix · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Lactobacillus · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Arachnia · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Rothia · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Propionibacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Actinomyces · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Bifidobacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Eubacterium · · · · · · · · · · · + + · · · ·

Clostridium · · · · · · · · · · · · · · <> <> + · · · ·

Bacillus · · · · · · · · <> <> <> · <> · · · · + · · ·

Nocardia · · · · · · · · · · · · · · · · · · + +

Mycobacterium · · · · · · · · · · · · · · · · · · +


95

Tabla No. 2 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram negativas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Forma R S S S S/R R R R R R R R R R R R R R

Movilidad - - - - - - + + - + - - + D - - + -

Crecimiento aerobio - - + + + + + + + + + + + + + -* - +

Crecimiento anaerobio + + - - - - - - - + + + + + + + - +

Catalasa d D + + + + + + + + + - + + D - D -

Oxidasa - x + + - + + + + + + + + - - + + -

Glucosa (prod. acido) D - + - + - + - + + + + + + D - - +

Carbohidratos [f/o/-] F/- - O - O - O - O O F F F F NT - - F

Bacteroides + · · · · · · · · · · · · · · · ·

Veillonella + · · · · · · · · · · · · ·

Neisseria · + · · · · · · · · · · · · ·

Branhamella · + · · · · · · · · · · · · ·

Acinobacter · + · · · · · · · · · · · ·

Moraxella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Brucella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Bortedella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Chromobacterium lividum · · · · · · + · · · · · · · · ·

Alvaligenes · · · · · · + · · · · · · · · ·

Flavobacterium · · · · · · + · · · · · · · · ·

Pseudomona · · · · · · · · · + · · · · · · · ·

Actinibacillus · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Pasteurella · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Necromonas · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Cardiobacterium · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Chromobacterium violaceum · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Benecktea · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Vibrio · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Plesiomonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Aeromonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Enterobacterias · · · · · · · · · · · · · + · · · ·

Haemophilus · · · · · · · · · · · · · · +

Eikenella · · · · · · · · · · · · · · +

Campylobacter · · · · · · · · · · · · · · +

Streptobacillus‡ · · · · · · · · · · · · · · +

Mycoplasmas · · · · · · · · · · · · · · +


96

Tabla No. 3. Equivalencias de los símbolos utilizados en las Tablas 1 y 2.

Significado Símbolo

Tabla No. 1

* Peptococcus, Peptostreptococcus (también Leuconostoc)

También Actinomyces odontolyticus

D Reacciones diferentes en distintas especies del género

d Reacciones diferentes en distintas cepas

F Fermentación

O Oxidación

w Reacción débil

x No se conoce

<> Variantes no esporágenas

Formas típicas

Presentan algunas características comunes

S Cocos

R Bacilos

NT No probada

Tabla No. 2

* Crecimiento en aire + CO2

Crecimiento en oxígeno 5-6%

‡ También Shigela dysenteriae

Forma típica

x No se conoce

Presentan algunas características comunes

NT No probada por métodos comunes

Para ambas tablas

+ Del 85-100% de las cepas son positivas (generalmente todas o la mayor parte)

d Del 16-84% de las cepas son positivas (muchas , algunas)

- Del 0-15% de las cepas son positivas (ninguna, pocas ó algunas)

( ) Reacción tardía en la prueba o crecimiento tardío

(d) Reacciones positivas tardías en diferentes cepas

(w) Reacción débil y tardía

w/- Reacciones débiles y crecimiento escaso en diferentes cepas

D Reacciones diferentes en distintos grupos (géneros, especies y variedades)

· No se conoce Tablas tomadas de: Cowan, S. T. Manual for identification of medical bacteria2 nd Cambridge University 1974. pp167.


97

MÉTODOS RÁPIDOS UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA

Recientes avances biotecnológicos son usados para la identificación de microorganismos por medio de pruebas de

identificación bioquímica de manera miniaturizada y automatizada haciéndose la identificación más rápida y

económica.

Los microorganismos deben ser aislados y después identificados, una vez aislados podemos medir

específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, para ello se han

desarrollado diversos métodos debido a la necesidad de detectar a los microorganismos como el sistema API

El APHI 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificación de enterobacterias y otros bacilos Gram

negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioquímicas mimiaturizadas.

Principio: La galería del sistema APHI 20 E se compone de 20 microtubos que contiene los sustratos

deshidratados. Loa microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana

Reactivos complementarios: API OF

Es un método de identificación que emplea reacciones bioquímicas y el que vamos a utilizar es el API 20 E y el

API STAPH.

INSTRUCCIONES

1) Primero tenemos que aislar al microorganismo en medios selectivos, posteriormente colocarla en un caldo

nutritivo o en una placa de agar de soya y tripticaseína, de tal forma que el cultivo sea de 18 h.

2) Sacar la tira API (galería) que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S, URE, TDA,

IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA.

3) Preparación de la galería: Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5 ml

de agua destilada en los alveolos para crqar una atmosfera humeda. Etiquetar en la lengüeta lateral.

4) Sacar la galería de su envase y colocarla en la cámara de incubación

5) Preparación del inoculo Preparar la suspensión microbiana en 5 ml de solución salina fisiológica y a una

turbidez del nefelómetro de Mac Farland de 2.

6) Inoculación de la galería. Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con la ayuda de una

pipeta, evitando la formación de burbujas en el fondo de los tubos.

7) Para las pruebas: llenar el tubo y la cúpula

8) Para las pruebas: ADH LCD ODC H2S y URE crear una atmosfera anaerobia llenando la cúpula con aceite de

parafina.

9) Cerrar la cámara de incubación

10) Incubar 36 h ± 2 °C durante 18-24h.+

Lectura de interpretación:

11) Prueba de TDA, agregar una gota de reactivo TDA. Un color marrón rojizo indica una reacción (+)

12) Prueba de IND: agregar una dota del reactivo JAMES. Un color rosado que se disemina en toda la cúpula

indica una reacción (+)

13) Prueba de VP2 esperar un minuto de 10 minutos un color rosa o rojo indica una reacción (+), una débil

coloración rosa que aparece después de 10 minutos en (-).

14) Interpretación: Determinar el perfil numérico, donde las pruebas están separadas en grupos de 3, como la

galería API 20 E se compone de 20 ensayos sumar al interior de cada grupo los valores que corresponden a las

reacciones positivas y se obtiene el bionúmero de 7 cifras.

15) Identificación: se realiza a partir de la base de datos y se obtiene con el software de identificación.


98

16) En algunas ocasiones es necesario la realización de pruebas adicionales como la reducción de Nitratos a

nitritos, para ello añadir una gota de los reactivos NIT 1 y Nit 2 en el tubo de GLU, esperar de 2 a 5 minutos y una

coloración roja indica una reacción (+)

17) Control de calidad 1 Proteus mirabilis 2.- E. coli

ONPG ADH LCD ODC

H2s URE TDA IND

GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA NO2 N2

- - - + v + + + - - v + - - - - v - - - + -

+ - + + - - - - + - - + + - + + - + - + + -

Tabla de lectura

Prueba Componerntes activos Cantidad Reacciones-enzimas Resultados

Negativo positivo

ONPG 2 nitro fenilβD-galactopiranosido

0.223 Β galactyosidasa (Orto Nitrofenil βD galactopiranosido

Incoloro Amarillo (1)

ADH L-arginina 1.9 Arginina DiHidrolasa Amarillo Anaranjado(2)

LCD L- lisina 1.9 Lisina Descarboxilasa Amarillo Anaranjado

ODC L- ornitina 1.9 Ornitina DesCarboxilasa Amarillo Anaranjado (2)

CIT Citrato de sodio 0.756 Utilización del CITrato Verde palido- amarillo Azul-verde azu (3)l

H2S Tiosulfato de sodio 0.075 Producción de H2S Incoloro grisáceo Depósito negro

URE urea 0.76 UREasa Amarillo Rojo anaranjado(2)

TDA L- triptófano 0.38 Triptofano DesAminasa amarillo Marrón rojizo

IND L-triptófano 0.19 Producción de InDol Verde pálido amarillo rosa

VP Piruvato de sodio 1.9 Producción de acetoina Rosa pálido Rosa –rojo(5)

GEL Gelatina bovina 0.6 GELatinasa No difusión Difusión del pigmento negro

GLU D- glucosa 1,9 GLUcosa Oxidación- fermentación

Azul-azul verdoso Amarillo/amarillo

MAN D-manitol 1.9 MANitol Fermentación-Oxidación

Azul-azul verdoso amarillo

INO Inositol 1.9 Fermentación-Oxidación INOsitol


SOR D-sorbitol 1.9 Fermentación-Oxidación SORbitol


RHA L-rammnosa 1.9 Fermentación Oxidación RHAmnosa


SAC D-sacarosa 1.9 Fermentación-Oxidación SACarosa


MEL D-Melobiosa 1.9 Ferm,entación-oxidación MELobiosa


AMY Amigdalina 0.57 AMYgdalina Fermentación –Oxidación


ARA L-arabinosa 1.9 ARAbinosa Fermentación Oxidación


1.- La aparición de un color amarillo ligero implica un resultado +

2.- La aparición de un color naranja tras 36 h de incubación debe considerarse negativa

3.- Lectura en la cúpula (zona aerobia)

4.- La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidación empieza en la cúpula

5.- Una ligera coloración rosa, que aparece tras 10 minutos debe ser leída como negativa

prÁctica no. 8 producciÓn de Ácido lÁctico … didactico... · deshidrogenasa (ldh) ......

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