sinteza in karakterizacija nekaterih mikro- in ...imobilizirane holesterol oksidaze smo določili z...

Doktorska disertacija

SINTEZA IN KARAKTERIZACIJA NEKATERIH MIKRO- IN NANONOSILCEV ZA

IMOBILIZACIJO ENCIMOV

September, 2015 Gordana Hojnik Podrepšek

Gordana Hojnik Podrepšek

SINTEZA IN KARAKTERIZACIJA NEKATERIH

MIKRO- IN NANONOSILCEV ZA

IMOBILIZACIJO ENCIMOV


Maribor, 2015

Sinteza in karakterizacija nekaterih mikro- in

nanonosilcev za imobilizacijo encimov


Študent: Gordana Hojnik Podrepšek

Študijski program: doktorski študijski program III. stopnje Kemija

in kemijska tehnika

Študijska smer: Kemijska tehnika

Predvideni znanstveni naslov: doktorica znanosti

Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb

Komentor: red. prof. dr. Željko Knez

Maribor, 2015

Sinteza in karakterizacija nekaterih mikro- in nanonosilcev za imobilizacijo encimov

I

Kazalo

Kazalo ................................................................................................................................... I

Zahvala ............................................................................................................................... IV

Povzetek .............................................................................................................................. V

Abstract.............................................................................................................................. VII

Seznam tabel ...................................................................................................................... IX

Seznam slik ......................................................................................................................... X

Uporabljeni simboli in kratice .............................................................................................. XII

1 Uvod ............................................................................................................................. 1

1.1 Opredelitev problema ............................................................................................. 2

1.2 Pregled stanja znanosti .......................................................................................... 2

1.3 Doktorska teza ....................................................................................................... 3

1.4 Namen in cilji ......................................................................................................... 3

2 Teoretični del ................................................................................................................ 5

2.1 NANOTEHNOLOGIJA ........................................................................................... 5

2.2 NANOMATERIALI KOT NOSILCI BIOKATALIZATORJEV ..................................... 5

2.3 MAGNETNI NANODELCI ...................................................................................... 6

2.4 SINTEZA MAGNETNIH NANODELCEV ................................................................ 7

2.5 POVRŠINSKA STABILIZACIJA IN FUNKCIONALIZACIJA MAGNETNIH

NANODELCEV ......................................................................................................... 8

2.6 HITOZAN ............................................................................................................. 10

2.7 AKTIVACIJA MAGNENTIH NANODELCEV ......................................................... 12

2.8 IMOBILIZACIJA ENCIMOV .................................................................................. 14

2.8.1 CELULAZA ................................................................................................... 15

2.8.2 HOLESTEROL OKSIDAZA ........................................................................... 16

2.9 METODE IMOBILIZACIJE BIOKATALIZATORJA Z NOSILCEM ......................... 18

2.9.1 Imobilizacija s kovalentno vezavo ................................................................. 18

2.9.2 Imobilizacija z adsorpcijo .............................................................................. 19

2.9.3 Imobilizacija z ujetjem ................................................................................... 19

2.10 METODE IMOBILIZACIJE BIOKATALIZATORJA BREZ NOSILCA ..................... 20

2.10.1 Zamreženje encima ...................................................................................... 20

2.11 LASTNOSTI IMOBILIZIRANIH ENCIMOV ........................................................... 21

3 EKSPERIMENTALNI DEL .......................................................................................... 23

3.1 MATERIALI .......................................................................................................... 23

3.1.1 Materiali in reagenti pri imobilizaciji holesterol oksidaze na magnetne mikro- in

nanodelce ..................................................................................................... 23

3.1.2 Materiali in reagenti pri sintezi zamreženih encimskih skupkov iz celulaze ... 23

3.2 ANALIZNE IN MERILNE METODE ...................................................................... 24

3.2.1 PRESEVNA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA (TEM) ................................. 24

3.2.2 VRSTIČNA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA (SEM) .................................. 24

3.2.3 ENERGIJSKO DISPERZIJSKA SPEKTROSKOPIJA (EDS) ......................... 25

3.2.4 TERMIČNA ANALIZA (TGA/DTA) ................................................................. 25

3.2.5 RENGENTSKA PRAŠKOVNA DIFRAKCIJA (XRD) ...................................... 25

3.2.6 MERJENJE VELIKOSTI DELCEV Z DINAMIČNIM SIPANJEM LASERSKE

SVETLOBE (DLS) IN LASERSKIM GRANULOMETROM ............................ 26

3.2.7 MERJENJE SPECIFIČNE MAGNETIZACIJE (VSM) .................................... 26

3.2.8 DOLOČANJE DOSTOPNIH AMINO SKUPIN S POTENCIOMETRIČNO

TITRACIJO ................................................................................................... 27

3.2.9 MERJENJE pH ............................................................................................. 27

3.2.10 FOURIEROVA TRANSFORMACIJSKA INFRARDEČA SPEKTROSKOPIJA

(FTIR) ........................................................................................................... 27


II

3.2.11 TOKSIKOLOŠKO TESTIRANJE HITOZANA IN MAGNETNIH MIKRO- IN

NANODELCEV ............................................................................................. 28

3.2.12 OPTIČNA MIKROSKOPIJA .......................................................................... 28

3.3 EKSPERIMENTALNE METODE .......................................................................... 29

3.3.1 SINTEZA MAGNETNIH NANODELCEV ....................................................... 29

3.3.2 FUNKCIONALIZACIJA MAGNETNIH NANODELCEV S HITOZANOM ........ 31

3.3.3 IMOBILIZACIJA ENCIMA HOLESTEROL OKSIDAZE NA MIKRO- IN

NANODELCE ............................................................................................... 32

3.3.4 SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ CELULAZE................. 33

3.3.5 DOLOČANJE UČINKOVITOSTI IMOBILIZACIJE ......................................... 35

3.3.6 MERJENJE SPECIFIČNE AKTIVNOSTI ENCIMA HOLESTEROL OKSIDAZE

..................................................................................................................... 36

3.3.7 MERJENJE SPECIFIČNE AKTIVNOSTI ENCIMA CELULAZE ..................... 38

4 REZULTATI IN DISKUSIJA ........................................................................................ 39

4.1 IMOBILIZACIJA ENCIMA HOLESTEROL OKSIDAZA NA MAGNETNI NOSILEC 39

4.1.1 SINTEZA MAGNETNIH NANODELCEV ....................................................... 39

4.1.2.1 PRESEVNA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA (TEM) ............................. 40

4.1.2.2 VRSTIČNA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA (SEM) .............................. 43

4.1.2.3 ENERGIJSKO DISPERZIJSKA SPEKTROSKOPIJA (EDS) ...................... 44

4.1.2.4 TERMIČNA STABILNOST ........................................................................ 45

4.1.2.5 RENGENTSKA PRAŠKOVNA DIFRAKCIJA (XRD) .................................. 48

4.1.2.6 MERJENJE VELIKOSTI DELCEV Z DINAMIČNIM SIPANJEM LASERSKE

SVETLOBE (DLS) IN LASERSKIM GRANULOMETROM .......................... 49

4.1.2.7 MERJENJE SPECIFIČNE MAGNETIZACIJE (VSM) ................................. 53

4.1.2.8 DOLOČANJE DOSTOPNIH AMINO SKUPIN S POTENCIOMETRIČNO

TITRACIJO ................................................................................................. 54

4.1.2.9 FOURIEROVA TRANSFORMACIJSKA INFRARDEČA SPEKTROSKOPIJA

(FTIR) ......................................................................................................... 55

4.1.2.10 TOKSIKOLOŠKO TESTIRANJE HITOZANA IN MAGNETNIH MIKRO- IN

NANODELCEV ........................................................................................... 58

4.1.3 IMOBILIZACIJA ENCIMA ............................................................................. 60

4.1.4 VPLIV KONCENTRACIJE GLUTARALDEHIDA ............................................ 61

4.1.5 VPLIV HITROSTI STRESANJA .................................................................... 63

4.1.6 VPLIV VRSTE MREŽNEGA POVEZOVALCA .............................................. 66

4.1.7 VPLIV SPREMEMBE KONCENTRACIJE ENCIMA ...................................... 68

4.1.9 STABILNOST IMOBILIZIRANEGA ENCIMA PRI PONOVNI UPORABI ........ 74

4.2 IMOBILIZACIJA ENCIMA CELULAZE BREZ NOSILCA ...................................... 77

4.2.1 PRIPRAVA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ ENCIMA CELULAZE77

4.2.2 REAKCIJA OBARJANJA .............................................................................. 77

4.2.4 OPTIMIZACIJA KONCENTRACIJE GLUTARALDEHIDA ............................. 81

4.2.5 OPTIČNA MIKROSKOPIJA .......................................................................... 88

4.2.6 FOURIEROVA TRANSFORMACIJSKA INFRARDEČA SPEKTROSKOPIJA

(FTIR) ........................................................................................................... 89

4.2.7 STABILNOST CLEAs IZ CELULAZE PRI PONOVNI UPORABI ................... 91

5 ZAKLJUČKI ................................................................................................................ 93

6 LITERATURA ............................................................................................................. 96

7 PRILOGE .................................................................................................................. 101

7.1 Umeritvena krivulja za določevanje koncentracije proteinov po Bradfordu ......... 101

7.2 Tabele z rezultati ............................................................................................... 102

Izjava doktorskega kandidata ........................................................................................... 109

Bibliografija kandidata ...................................................................................................... 112


III


IV

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem mentorici red. prof.

dr. Maji Leitgeb za vodenje in pomoč v času

podiplomskega študija. Zahvaljujem se tudi

našemu Bioteamu, dekletom, ki so mi stale

ob strani in mi dale velikokrat vzpodbudo in

dobre ideje za delo. Rednemu profesorju

dr. Mihi Drofeniku, dr. Slavku Kralju, dr.

Darku Makovcu, Mateju Bračiču ter Tanji

Fajfar se prav tako zahvaljujem za pomoč

pri analizah in karakterizaciji magnetnih

nanodelcev. Ne nazadnje bi se rada

zahvalila tudi svojim najbližjim, možu Sašu,

hčerki Klari ter staršem za vso podporo in

potrpežljivost v času študija.


V

Povzetek

Doktorska disertacija je razdeljena na dva sklopa, v katerih smo razširili dosedanje

raziskave na področju priprave magnetnih nanodelcev, njihove funkcionalizacije in

imobilizacije encimov na tako pripravljene mikro- in nanonosilce. Osrednji cilj disertacije je

priprava magnetnih nanodelcev z metodo obarjanja ali koprecipitacije železovih (II) in

železovih (III) ionov v alkalnem mediju, funkcionaliziranih s hitozanom po treh različnih

metodah; metodi mikroemulzije, suspenzijske zamreževalne tehnike in kovalentne vezave.

Podrobna karakterizacija tako pripravljenih nosilcev je bila izvedena s pomočjo presevne

elektronske mikroskopije, vrstične elektronske mikroskopije, rentgenske praškovne

difrakcije, z dinamičnim sipanjem laserske svetlobe, laserskim granulometrom in merjenjem

specifične magnetizacije. Tako smo opazovali morfologijo in lastnosti magnetnih nosilcev.

Površinsko funkcionalizacijo s hitozanom za doseganje višje funkcionalnosti smo potrdili s

pomočjo energijskodisperzijske spektroskopije, termične analize, potenciometrične titracije

in s Fourierevo transformacijo. Z mikrobiološkim testiranjem je bil določen vpliv magnetnih

mikro- in nanonosilcev na rast mikrobnih kultur. Nadalje smo magnetne mikro- in

nanodelce, prevlečene s plastjo hitozana, uporabili kot nosilce za imobilizacijo holesterol

oksidaze (EC 1.1.3.6). S spreminjanjem različnih pogojev, kot so koncentracija encima,

koncentracija in vrsta mrežnega povezovalca glutaraldehida ali pentaetilen heksamina ter

hitrost stresanja, smo ugotovili, kako se spreminja učinkovitost imobilizacije encima ter

kolikšen delež aktivnosti se pri tem ohrani v primerjavi s prostim encimom. Aktivnost

imobilizirane holesterol oksidaze smo določili z reakcijo oksidacije holesterola. Optimalni

reakcijski pogoji imobilizacije holesterol oksidaze na magnetne mikro- in nanonosilce so bili

doseženi pri koncentraciji encima 1 mg/mL ob uporabi 0,02 M pentaetilenheksamina kot

mrežnega povezovalca. Aktivnost imobilizirane holesterol oksidaze pri optimalnih

reakcijskih pogojih je bila 79,03 %. Prav tako je bila stabilnost imobilizirane holesterol

oksidaze pri ponovni uporabi dobra.

V drugem sklopu je opisana priprava zamreženih encimskih skupkov iz encima celulaze

(EC 3.2.1.4). Postopek priprave zamreženih encimskih skupkov vključuje dva pomembna

koraka, in sicer obarjanje encima z dodatkom obarjalnega reagenta in zamreženje

encimskih molekul z glutaraldehidom. Optimalni reakcijski pogoji sinteze zamreženih

encimskih skupkov so bili doseženi pri koncentraciji glutaraldehida 0,0625 % (v/v) in uporabi

etanola kot obarjalnega reagenta. Aktivnost imobilizirane celulaze v obliki zamreženih

encimskih skupkov smo določili z reakcijo hidrolize celuloze. Aktivnost imobilizirane

celulaze v obliki zamreženih encimskih skupkov pri optimalnih reakcijskih pogojih je bila

93,95 %. Prav tako je bila stabilnost imobilizirane celulaze pri ponovni uporabi dobra.


VI

Ključne besede: magnetni nanodelci, imobilizacija encimov, hitozan, holesterol oksidaza,

celulaza, zamreženi encimski skupki.

UDK: 543.645.4:577.15(043.3)


VII

Abstract

The PhD thesis is divided in two parts, in which we enhanced existing research in the filed

of preparation of magnetic nanoparticles and their functionalization and enzyme

immobilization on micro- and nanocarriers. The main objective of the thesis is the

preparation of magnetic nanoparticles by precipitation method of iron (II) and iron (III) ions

in an alkaline medium and the functionalization with chitosan by three different methods;

microemulsion, suspension cross-linking technique and covalent binding. Detailed

characterization of these carriers was performed using transmission electron microscopy,

scanning electron microscopy, X-ray powder diffraction, with dynamic laser light scattering,

laser granulometry and the measurement of specific magnetization. Thus, we observe the

morphology and the characteristics of magnetic carriers. Surface functionalization of the

chitosan in order to achieve higher functionality was confirmed by energy dispersive

spectroscopy, thermal analysis, potentiometric titration and Fourier transformation. The

microbiological testing determined the influence of magnetic micro- and nanocarriers on the

growth of microbial cultures. Furthermore, the magnetic nanoparticles coated with chitosan

were used as a carriers for the immobilization of cholesterol oxidase (EC 1.1.3.6). By

changing various conditions such as the enzyme concentration, concentration and type of

cross-linker glutaraldehyde or pentaetylenehexamine and shaking rate, we determined an

immobilization efficiency and retained activity of immobilized enzyme compared to free

enzyme. The activity of the immobilized cholesterol oxidase was determined by reaction of

the cholesterol oxidation. The optimal reaction conditions of cholesterol oxidase

immobilization to the magnetic micro- and nanocarriers were obtained using 1mg/mL of the

enzyme concentration and 0,02 M pentaetilenhexamine, as a cross-linker. Activity of the

immobilized cholesterol oxidase under optimal conditions was 79,03 %. Also, the stability of

immobilized cholesterol oxidase revealed good reusability.

The second part describes the preparation of cross-linked enzyme aggregates of cellulase

(EC 3.2.1.4). The preparation process of cross-linked enzyme aggregates includes two

important steps, such as the precipitation of the enzyme by the addition of the precipitation

reagent and the cross-linking of enzyme molecules with glutaraldehyde. The optimum

reaction conditions of cross-linked enzyme aggregates of cellulase have been achieved at a

0,0625 % concentration of glutaraldehyde (v/v) and using ethanol as a precipitation reagent.

The activity of immoblized cellulase as cross-linked enzyme aggregates was determined by

reaction of hydrolysis of cellulose. Activity of the immobilized cellulase as cross-linked

enzyme aggregates under optimal conditions was 93,95 %. Also, the stability of immobilized

cellulase revealed good reusability.


VIII

Key words: magnetic nanoparticles, enzyme immobilization, chitosan, holesterol oxidase,

cellulase, cross-linked enzyme aggregates.

UDK: 543.645.4:577.15(043.3)


IX

Seznam tabel

Tabela 4-1: Optimalni reakcijski pogoji za večkratno uporabo imobiliziranega encima ....... 73

Tabela 4-2: Primerjava ohranjene aktivnosti imobiliziranega encima ChOx v odvisnosti od

različnih nosilcev pri ponovni uporabi ................................................................................. 76

Tabela 4-3: Kvalitativno preverjanje reakcije obarjanja z različnimi obarjalnimi reagenti .... 78


X

Seznam slik

Slika 2-1: Obnašanje magnetnih nanodelcev pod vplivom magnetnega polja ...................... 6

Slika 2-2: Stabilizacija magnetnih nanodelcev s steričnim oviranjem in elektrostatskim

odbojem ............................................................................................................................... 8

Slika 2-3: Derivati hitozana ................................................................................................ 11

Slika 2-4: Shematski prikaz možne vezave glutaraldehida z encimom ............................... 13

Slika 2-5: Mehanizem reakcije katalizirane s holesterol oksidazo. ChOx oksidira holesterol v

4-holesten-3-on, pri čemer nastane H2O2. .......................................................................... 17

Slika 2-6: Shematski prikaz kovalentne imobilizacije encima, dosežene z reakcijo amino

skupine na površini encima in s primerno aktiviranim nosilcem .......................................... 19

Slika 2-7: Tipična oblika magnetnega nanodelca za bioaplikacije ...................................... 22

Slika 3-1: Prikaz postopka sinteze magnetnih nanodelcev z obarjanjem ............................ 30

Slika 3-2: Shematski prikaz sinteze zamreženih encimskih skupkov iz celulaze ................ 34

Slika 4-1: TEM posnetek maghemitnih mikrodelcev, funkcionaliziranih s hitozanom po

postopku mikroemulzije (MC1) ........................................................................................... 41

Slika 4-2: TEM posnetek maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po

postopku suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2) ......................................................... 42

Slika 4-3: TEM posnetek maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po

postopku kovalentne vezave (MC3) ................................................................................... 43

Slika 4-4: SEM posnetki a) maghemita, b) MC1, c) MC2 in d) MC3 mikro- in nanodelcev .. 44

Slika 4-5: SEM-EDS-elementarna analiza maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih s

hitozanom (MC1) ............................................................................................................... 45

Slika 4-6: TGA-DTA-meritev maghemita in čistega hitozana v zraku.................................. 46

Slika 4-7: TGA-DTA-meritev maghemitnih mikro- in nanodelcev funkcionaliziranih s

hitozanom po treh različnih postopkih (MC1, MC2 in MC3) ................................................ 47

Slika 4-8: Izguba mase hitozana pri vzorcih MC1, MC2 in MC3 ......................................... 48

Slika 4-9: Primerjava difraktograma maghemita in maghemitnih nanonodelcev

funkcionaliziranih s hitozanom (MC2) ................................................................................. 49

Slika 4-10: Grafično prikazana porazdelitev velikosti delcev maghemita ............................ 50

Slika 4-11: Grafično prikazana porazdelitev velikosti delcev maghemita funkcionaliziranega

s hitozanom po postopku kovalentne vezave (MC3) .......................................................... 51

Slika 4-12: Grafično prikazana porazdelitev velikosti delcev maghemita funkcionaliziranega

s hitozanom po postopku mikroemulzije (MC1) in suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2)

.......................................................................................................................................... 52

Slika 4-13: VSM vzorcev maghemita, MC1, MC2 in MC3 ................................................... 53

Slika 4-14: Koncentracija amino skupin na površini hitozana, MC1, MC2 in MC3 določenih s

potenciometrično titracijo ................................................................................................... 55

Slika 4-15: FTIR-spektra vzorcev a) hitozana in b) magnetnih nanodelcev ........................ 56

Slika 4-16: FTIR-spekter magnetnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh

razlčinih postopkih a) MC1, b) MC2 in c) MC3 ................................................................... 57

Slika 4-17: Rezultati toksikološkega testiranja na Escherichia coli ..................................... 59

Slika 4-18: Rezultati toksikološkega testiranja na Sacharomyces cerevisiae...................... 59

Slika 4-19: Učinkovitost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce

funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od spremembe koncentracije

GA ..................................................................................................................................... 61


XI

Slika 4-20: Ohranjena aktivnost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce

funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od spremembe koncentracije

GA ..................................................................................................................................... 62


funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od hitrosti stresanja ............... 64


funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od hitrosti stresanja ............... 65


funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od vrste mrežnega povezovalca

.......................................................................................................................................... 67


funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od vrste mrežnega povezovalca

.......................................................................................................................................... 68


funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah pri uporabi 0,02 M PEHA in koncentraciji

encima 1mg/mL ................................................................................................................. 69


funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah pri uporabi 0,02 M PEHA in koncentraciji

encima 1 mg/mL ................................................................................................................ 70

Slika 4-27: Primerjava učinkovitosti imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce

funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od koncentracije encima ....... 72

Slika 4-28: Primerjava ohranjene aktivnosti imobilizirane ChOx na magnetne mikro- in

nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od koncentracije

encima ............................................................................................................................... 73

Slika 4-29: Stabilnost imobilizirane ChOx pri ponovni uporabi ............................................ 75

Slika 4-30: Obarjanje celulaze z različnimi obarjalnimi reagenti ......................................... 79

Slika 4-31: Relativna aktivnost resuspendiranega encima celulaze po obarjanju z različnimi

obarjalnimi reagenti ............................................................................................................ 80

Slika 4-32: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z različnimi

obarjalnimi reagenti pri uporabi glutaraldehida s koncentracijo 1 % (v/v)............................ 81

Slika 4-33: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z različnimi

obarjalnimi reagenti v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida........................... 83

Slika 4-34: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z etanolom v

odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida ............................................................. 84

Slika 4-35: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z metanolom v

odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida ............................................................. 85

Slika 4-36: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze s propanolom

v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida .......................................................... 86

Slika 4-37: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z amonijevim

sulfatom v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida ............................................ 87

Slika 4-38: Posnetek CLEAs iz encima celulaze v odvisnosti od uporabe različnih obarjalnih

reagentov z optičnim mikroskopom (40x) ........................................................................... 88

Slika 4-39: Primerjava FTIR spektrov CLEAs in proste celulaze ........................................ 90

Slika 4-40: Stabilnost imobilizirane celulaze v odvisnosti od uporabe različnih obarjalnih

reagentov pri ponovni uporabi ............................................................................................ 91


XII

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli

A/A0 relativna aktivnost (%)

A243nm vzorec absorbanca vzorca pri 243 nm (/)

A243nm slepi vzorec absorbanca slepega vzorca pri 243 nm (/)

A340 nm absorbanca vzorca pri 340 nm (/)

ci koncentracija prostega encima (mg/mL)

cs koncentracija encima v supernatantu in spiranjih (mg/mL)

df razredčitveni faktor (/)

mn masa nosilca (magnetnih mikro- in nanodelcev) (g)

treakcija čas reakcije (min)

Vreakcijske zmesi volumen reakcijske zmesi (mL)

Vsupernatanta volumen supernatanta (mL)

Vvzorec volumen vzorca (ml)

Grški simboli

ɛ molarni ekstinkcijski koeficient (M-1cm-1mL)

θ difrakcijski kot (°)

λ valovna dolžina (nm)

ρ učinkovitost imobilizacije (%)

φ koncentracija imobiliziranega encima (mgencim/gnosilec)

Kratice

Au zlato

BSA albumin iz govejega seruma

ChOx holesterol oksidaza

CH hitozan

CLEs zamreženi encimi

CLECs zamreženi encimski kristali

CLEAs zamreženi encimski skupki


XIII

Co kobalt

-COH karboksilna skupina

DLS dinamično sipanje laserske svetlobe

DTA diferenčna termična analiza

EA albumin iz kokošjih jajc

EC komisijska številka encima

EDC etil-(N,N-dimetilamino) propil karbodiimid hidroklorid

EDS energijsko disperzijska spektroskopija

Fe železo

Fe2+ železovi II ioni

Fe3+ železovi III ioni

FeCl3∙6H2O železov klorid heksahidrat

FeCl2∙4H2O železov klorid tetrahidrat

Fe(OH)3 železov hidroksid

Fe3O4 magnetit

γ-Fe2O3 maghemit

γ-Fe2O3/CH maghemitni nanodelci, prevlečeni s hitozanom

FTIR Fourierjeva transformirana infrardeča spektroskopija

GA glutaraldehid (mrežni povezovalec)

HCl klorovodikova kislina

H2O2 vodikov peroksid

KBr kalijev bromid

KOH kalijev hidroksid

MC1 magnetni nanodelci funkcionalizirani s hitozanom po metodi mikroemulzije

MC2 magnetni nanodelci funkcionalizirani s hitozanom po metodi suspenzijske zamreževalne tehnike

MC3 magnetni nanodelci funkcionalizirani s hitozanom po metodi kovalentne vezave

MRI magnetna resonanca

NaBH3CN natrijev cianoborohidrid

NaCl natrijev klorid

NaOH natrijev hidroksid

NH3 amonijak

-NH2 amino funkcionalna skupina

-OH hidroksilna funkcionalna skupina

O2 kisik

PBS fosfatni pufer


XIV

PEG polietilenglikol

PEHA pentaetilen heksamin

PVA polivinil alkohol

SEM vrstična elektronska mikroskopija

-SH sulfidna skupina

TEM transmisijska elektronska mikroskopija

TGA termogravimetrična analiza

VSM magnetometer z vibrajočo glavo

XRD rentgenska praškovna difrakcija


1

1 Uvod

Nanotehnologija je prioritetno raziskovalno področje znanstvenikov in inženirjev v razvitem

svetu. Znanstvena odkritja in tehnološki obeti nanotehnologije so izjemni, še posebej v

proizvodnji materialov, v nanoelektroniki, v medicini in varovanju zdravja, v informatiki, v

zagotavljanju varnosti ter v biotehnologiji. Mnogi drzno napovedujejo, da bo nanotehnologija

povzročila novo industrijsko revolucijo [1]. Znano je, da bo imela nanotehnologija

pomembno vlogo v naših življenjih, zato je pomembno, da se zavedamo bistva in pomena

nanotehnologije v današnjem času. Obstaja na tisoče znanstvenikov in raziskovalcev s

področja nanotehnologije v svetu. Definicija nanotehnologije govori o študiji in manipulaciji

snovi velikosti nekaj nanometrov, z namenom, da bi ustvarili uporabne materiale in naprave

[2].

Kombinacija edinstvenih lastnosti magnetnih nanodelcev omogoča vrsto različnih aplikacij v

biomedicini. Prvič, velikost magnetnih nanodelcev je majhna in primerljiva z velikostjo celic

(10-100 µm), virusi (20-450 nm), proteini (5-50 nm) ali DNK (2 nm široka in 10-100 nm

dolga). Drugič, obstoj magnetnih dipolov omogoča manipulacijo magnetnih nanodelcev z

zunanjim magnetnim poljem in s tem penetracijo v človeška tkiva. Tretjič, površinska

modifikacija površine magnetnih nanodelcev lahko vpliva na funkcionalizacijo in s tem

vezavo različnih učinkovin [3].

Tehnika zamreženih encimskih skupkov je osnovana izključno na medmolekularnem

zamreženju molekul encima in kot takšna predstavlja prednostno obliko imobiliziranega

encima pred ostalimi načini vezave encima. Pri metodi zamreženih encimskih skupkov

uporaba trdnega nosilca za vezavo encima ni potrebna, kar omogoči doseganje višje

aktivnosti imobilizirane oblike encima. V primerjavi z drugimi oblikami imobilizacije encima

je metoda CLEAs neprimerljivo cenejša in enostavnejša, sestavljena izključno iz postopka

obarjanja (ang. precipitation) in zamreženja (ang. cross-linking) encimskih skupkov. Obliko

imobilizacije encimov brez uporabe trdnega nosilca spremljajo številne prednosti, kot so

večja aktivna površina vezanega encima, višja volumetrična produktivnost procesa in

zmanjšani proizvodni stroški. Najbolj pomembno dejstvo pa je, da je metoda zamreženja

sestavljena samo iz čistega encima in majhne količine mrežnega povezovalca. Razvoj

robustnih biokatalizatorjev z neprimerno daljšo operativnostjo in stabilnostjo v širokem pH in

temperaturnem območju ter višjo toleranco na organska topila postaja čedalje večji izziv na

področju encimskih tehnologij [4].


2

1.1 Opredelitev problema

Glavna lastnost nanodelcev je, da imajo veliko večje razmerje med površino in prostornino v

primerjavi z mikrodelci. Manjši kot je delec, večji je relativni delež atomov, ki so na površini

glede na število vseh atomov, ki sestavljajo delec. Fizikalno-kemijske lastnosti, ki so v

nanodelcih drugačne, so spremenjena kemična reaktivnost, električna prevodnost, termična

razteznost, optična prevodnost, trdnost in spreminjanje gibanja v mediju glede na velikost.

Pomembne zahteve, ki jim morajo materiali za bioaplikacije zadostiti, so netoksičnost,

biokompatibilnost in/ali biorazgradljivost, zato je površina magnetnih nanodelcev navadno

prevlečena z makromolekulami (npr. dekstran, hitozan), proteini (npr. albumin) ali

sintetičnimi polimeri (npr. metakrilati in organosilani) [5].

Biokataliza za izvedbo kemijskih pretvorb na organskih spojinah uporablja naravne

katalizatorje, kot so encimi. V ta namen se uporabljajo encimi, ki so delno ali popolnoma

izolirani ali pa se nahajajo v živih celicah. Imobilizirani biokatalizatorji so definirani kot

encimi, ki so fizično omejeni ali lokalizirani tako, da se ohranja njihova katalitična aktivnost.

Imobilizirane encime lahko v procesih uporabljamo večkrat in neprekinjeno. Ločimo

kemijske in fizikalne metode imobilizacije. Med kemijske štejemo kovalentno vezavo encima

na nosilec in zamreženje encima, med fizikalne pa adsorpcijo encima na različne nosilce,

ujetje encima v zamrežen polimer ter mikroinkapsulacijo. Encime lahko imobiliziramo z

uporabo nosilcev ali brez. Najpomembnejša prednost imobilizacije biokatalizatorjev je

enostavno ločevanje biokatalizatorja iz reakcijske zmesi. To prepreči onesnaževanje

biokatalizatorja s produktom in celo zmanjša stroške obratovanja procesa. Omogoča

kontinuirane procese z manjšo porabo biokatalizatorja ter prihranek pri laboratorijskih in

drugih stroških.

1.2 Pregled stanja znanosti

Z razvojem nanotehnologije, v zadnjih nekaj desetletjih, je nanotehnologija navdihnila

raziskovalce s tega področja, saj ponujajo nanomateriali pomembne lastnosti, kot so visoko

razmerje med površino in prostornino, nizek masni pretok in odlično mobilnost delcev med

reakcijo [6]. Prav tako je v teh letih zelo napredoval razvoj encimologije in encimske

tehnologije, ki kot rezultat raziskav ponujajo veliko primerov industrijske uporabe encimov v

prosti ali imobilizirani obliki. Najpogosteje se uporabljajo v živilski industriji, pri obdelavi

materialov, v tekstilstvu, biokemični in kemični industriji, biotehnologiji in farmacevtski

industriji. Priznati moramo, da je uporaba encimov v industrijskem merilu še vedno

omejena, zaradi njihove relativno slabe stabilnosti pri določenih pogojih, ki vključujejo

visoke temperature, izpostavljenost organskim topilom in drugim denaturantom. Vendar pa

lahko na različne načine pripomoremo k zvišanju stabilnosti encimov z dodatkom aditivov, s


3

kemično modifikacijo, proteinskim inžinerstvom in nenazadnje tudi z imobilizacijo encimov

[7]. Imobilizacija encimov se je prvič pojavila leta 1916, ko sta Nelson in Griffin odkrila, da

ima encim invertaza, ki je absorbiran na oglju, sposobnost hidrolize saharoze. Možnost

ponovne uporabe imobiliziranega encima in stabilnost imobiliziranega encima pa sta s

kovalentno vezavo različnih encimov opisala Grubhofer and Schelth [8]. Imobilizacija

encimov na različne materiale je v veliki meri prispevala k uspešnemu pristopu diagnoze in

encimske terapije. Nedavni napredek na področju bioloških znanosti je odkril številne vrste

terapevtskih proteinov, ki lahko uravnavajo različne funkcije celic. Tako je zlasti pri

biomedicinskih aplikacijah pomemben nadzor pri imobilizaciji encimov, moč vezave in

predvsem orientacija vezave. Nenazadnje je uspešna uporaba imobiliziranega encima

predvsem odvisna od razvoja dogodkov na teh raziskovalnih področjih [9].

1.3 Doktorska teza

V okviru imobilizacije biokatalizatorja na nosilec ali brez nosilca so bile postavljene

naslednje teze:

magnetni mikro- in nanodelci so primerni nosilci za imobilizacijo biokatalizatorjev;

pri metodi zamreženih encimskih skupkov uporaba trdnega nosilca ni potrebna, kar

omogoči doseganje višje aktivnosti imobilizirane oblike biokatalizatorja;

stabilnost imobiliziranega biokatalizatorja je dobra in s tem je omogočena njegova

ponovna uporaba.

1.4 Namen in cilji

Namen doktorske disertacije je sinteza magnetnih nanodelcev iz maghemita,

funkcionaliziranih s hitozanom po treh različnih metodah, kot potencialnih mikro- in

nanonosilcev za bioaktivno učinkovino ter njihova neposredna uporaba za imobilizacijo

specifičnega biokatalizatorja. Prav tako želimo izvesti optimizacijo procesa imobilizacije

zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) iz encima celulaze.

V okviru raziskovalnega dela sinteze in priprave visoko funkcionalnih mikro- in nanonosilcev

so bili postavljeni naslednji cilji:

sinteza magnetnih nanodelcev iz maghemita (γ-Fe2O3) z reakcijo obarjanja iz

železovih ionov;

površinska obdelava ali funkcionalizacija sintetiziranih magnetnih nanodelcev;

aktivacija površine magnetnih nanodelcev z mrežnim povezovalcem;

karakterizacija sintetiziranih magnetnih nanodelcev.


4

V okviru raziskovalnega dela s področja imobilizacije biokatalizatorja na površino kemijsko

modificiranih magnetnih nanodelcev so bili postavljeni naslednji cilji:

iskanje optimalnih pogojev za aktivacijo površine visoko funkcionalnih nanodelcev z

mrežnim povezovalcem;

optimizacija koncentracije in vrste mrežnega povezovalca;

optimizacija koncentracije encima holesterol oksidaze;

študija učinkovitosti imobilizacije holesterol oksidaze na površino visoko

funkcionalnih magnetnih mikro- in nanodelcev;

študija aktivnosti in stabilnosti visoko funkcionalnih mikro- in nanodelcev z

imobilizirano holesterol oksidazo.

V okviru raziskovalnega dela s področja imobilizacije biokatalizatorja v zamrežene

encimske skupke brez nosilca (CLEAs) iz encima celulaze so bili postavljeni naslednji cilji:

izbira primernega obarjalnega reagenta;

optimizacija koncentracije biokatalizatorja;

optimizacija koncentracije mrežnega povezovalca – glutaraldehida;

študija učinkovitosti imobilizacije celulaze;

študija aktivnosti in stabilnosti zamreženih encimskih skupkov iz encima celulaze;

študija ponovne uporabe imobilizirane celulaze v obliki zamreženih encimskih

skupkov.


5

2 Teoretični del

2.1 NANOTEHNOLOGIJA

Nanotehnologije so ena najobetavnejših, hitro razvijajočih se disciplin na področju raziskav

in industrijskih inovacij. Nanotehnologija pomeni načrtovanje, sintezo, manipulacijo in

nadzor na nanometrski ravni, kar omogoča izdelavo materialov s povsem novimi in

specifičnimi lastnostmi. Znanstvena odkritja in tehnološki obeti nanotehnologije so izjemni,

še posebej v proizvodnji materialov, v nanoelektroniki, v medicini in varovanju zdravja, v

biotehnologiji, informatiki in zagotavljanju varnosti. Zato je jasno, da bo imela

nanotehnologija močan vpliv tudi na ekonomijo in družbena dogajanja 21. stoletja [1,10].

Izzivi, ki naj bi jih nanotehnologija uresničila, so nešteti, od zgodnje diagnostike in

zdravljenja trenutno neozdravljivih bolezni, detekcije ene same rakave celice in njenega

uničenja, minimizacije elektronskih komponent in izgradnje računalnika, ki bi deloval na

osnovi enega samega elektrona, atoma ali molekule, do izboljšanja površinskih lastnosti

materiala, ki bi postal odporen proti poškodbam in bi morebitne poškodbe znal sam

odpraviti ali pa bi opravljal več funkcij hkrati [1].

2.2 NANOMATERIALI KOT NOSILCI BIOKATALIZATORJEV

Glavna lastnost nanodelcev je, da imajo veliko večje razmerje med površino in prostornino v

primerjavi z mikrodelci. Manjši kot je delec, večji je relativni delež atomov, ki so na površini

glede na število vseh atomov, ki sestavljajo delec. Fizikalno-kemijske lastnosti, ki so v

nanodelcih drugačne, so spremenjena kemična reaktivnost, električna prevodnost, termična

razteznost, optična prevodnost, trdnost in spreminjanje gibanja v mediju glede na velikost.

Pomembne zahteve, ki jim morajo zadostiti materiali za bioaplikacije, so netoksičnost,

biokompatibilnost in/ali biorazgradljivost, zato je površina magnetnih nanodelcev navadno

prevlečena z makromolekulami (npr. dekstran, hitozan), proteini (npr. albumin) ali

sintetičnimi polimeri (npr. metakrilati in organosilani) [5]. Prevlečena površina magnetnih

nanodelcev omogoča nadaljnjo funkcionalizacijo in zagotavlja obstojnost proti aglomeraciji

in oksidaciji [3].

Za uporabo v biotehnologiji je treba na površino nanodelcev vezati različne biološke

učinkovine. Vezavo učinkovin na površino nanodelcev dosežemo prek funkcionalizacijskega

sloja molekul, vezanih na površino delcev. Te molekule zagotavljajo funkcionalne skupine

za kemijsko vezavo različnih bioloških učinkovin, hkrati pa zagotavljajo stabilnost suspenzije

nanodelcev. Izkaže se, da je tako za stabilnost nanodelcev v fiziološkem mediju kot tudi za


6

učinkovitost vezave bioloških učinkovin na nanodelce ključnega pomena jakost vezi med

površino in funkcionalizacijskimi molekulami [11].

2.3 MAGNETNI NANODELCI

Nanodelci so opredeljeni kot trdni koloidni delci v razponu od 10 do 1000 nm. Magnetni

nanodelci so posebna oblika magnetih materialov, katerih prvenstvena odlika so posebne

lastnosti, povezane z njihovo velikostjo. Pri prehodu iz makro- v nanodimenzije preide

magnetni material iz ferimagnetne v superparamagnetno fazo [12]. Ta sprememba je

odvisna od dimenzije magnetnega materiala in je neposreden zgled, kako nanodimenzija

lahko spremeni lastnosti materialov. Zaradi svoje majhnosti se magnetni nanodelci vedejo

kot paramagnetni ioni z zelo velikim magnetnim momentom, ki v magnetnem polju uspešno

prevlada njihovo termično spodbujeno naključno gibanje, in se odzovejo na zunanje

magnetno polje, kar prikazuje slika 2-1.

Slika 2-1: Obnašanje magnetnih nanodelcev pod vplivom magnetnega polja

Superparamagnetni nanodelci so poseben razred magnetnih materialov, ki zunaj

magnetnega polja ne kažejo spontane magnetne polarizacije [13]. Magnetni nanodelci so

konstitutivni del magnetnih tekočin, ki so v zadnjem desetletju pridobile pomen zaradi svojih

posebnih lastnosti, to je, da so tekoče in magnetne ter delujejo kot tekoči magneti. So

stabilne suspenzije, v katerih so enakomerno porazdeljeni delci magnetnega materiala

nanovelikosti in stabilizirani v disperznem mediju z van der Waalsovimi ali elektrostatskimi

silami.


7

Magnetni nanodelci iz železovega oksida, kot sta maghemit in magnetit, postajajo vse bolj

uporabljani v biotehnologiji in biomedicini zaradi velike površine delcev, visoke magnetne in

katalitične aktivnosti [14]. Zaradi tega jih je mogoče izkoriščati v različne terapevtske in

diagnostične namene, kot so separacija in detekcija bioloških materialov (separacija celic),

obnova tkiv, prenos farmacevtskih učinkovin v telesu (kemoterapevtiki), magnetofekcija

(genska terapija), terapevtska magnetna hipertemija, slikanje z magnetno resonanco (MRI)

itd. Pogoji, ki jih morajo izpolnjevati magnetni nanodelci za aplikacije v biotehnologiji in

biomedicini, so netoksičnost, biokompatibilnost ter biorazgradljivost in prav zaradi teh so se

v številnih raziskavah izkazali v vlogi nosilcev za imobilizacijo različnih encimov (celulaza,

lipaza, holesterol oksidaza …) [15–17].

2.4 SINTEZA MAGNETNIH NANODELCEV

Izbira primerne tehnike za sintezo magnetnih nanodelcev je zelo pomembna pri končni

velikosti in obliki delcev, njihovi porazdelitvi velikosti delcev in specifične površine [13].

Najpogosteje uporabljeni magnetni nanodelci so železovi oksidi, predvsem magnetit (Fe3O4)

ter maghemit (γ-Fe2O3), poznamo pa še Co-ferit, Mn-Zn ferit, kovinske nanodelce (Co, Fe).

Sintezne postopke lahko v grobem razdelimo na mehanske, postopke s termično

dekompozicijo prekurzorjev, sonokemične postopke in na postopke kemijskega obarjanja.

Železove okside običajno sintetiziramo s koprecipitacijo ali obarjalno reakcijo vodnih

raztopin Fe2+ in Fe3+ ionov z dodatkom obarjalnega reagenta. Navadno so to baze (NH3,

NaOH), lahko pa uporabimo tudi nekatere močne organske reagente, kot so hidroksidi

primarnih, sekundarnih ali terciarnih aminov (npr. tetrametilamonijev hidroksid). Oborjene

magnetne nanodelce ločimo z magnetnim posedanjem ali s centrifugiranjem. Glede na

termodinamiko reakcije je pričakovano popolno obarjanje magnetita v območju pH med 7,5

in 14, ob razmerju molov Fe2+/Fe3+ 1:2 in v okolju brez kisika. Oblika, velikost ter sestava

nanodelcev je odvisna od vrste uporabljene soli (kloridi, sulfati, nitrati, perklorati …),

razmerja molov Fe2+/Fe3+, temperature reakcije, vrednosti pH ter ionske moči medija [18].

Da bi preprečili možno oksidacijo in agregacijo magnetnih nanodelcev, jih po navadi

prevlečemo z organskimi ali anorganskimi molekulami že med postopkom obarjanja.

Metoda koprecipitacije je enostaven način za sintezo magnetnih nanodelcev, za katero sta

značilna nižja reakcijska temperatura in krajši čas v primerjavi z drugimi metodami, kot sta

termična dekompozicija in hidrotermalna metoda. Prav tako je topilo (voda) prijazno do


8

okolja, reakcija sinteze obarjanja je visoko produktivna in prilagodljiva. Slabost te metode je

v pomanjkljivi kontroli velikosti in morfologiji delcev [19].

2.5 POVRŠINSKA STABILIZACIJA IN FUNKCIONALIZACIJA

MAGNETNIH NANODELCEV

Površinska modifikacija nanodelcev daje spremembo naboja, funkcionalnost in reaktivnost

površine, večjo stabilnost in disperzibilnost koloidnega jedra, prilagajanje lastnosti

(magnetne, optične, katalitične) ter zaščito jedra pred ekstremnimi kemijskimi in fizikalnimi

spremembami (oksidacija/redukcija, korozija) [5]. Zaradi velike specifične površine

nanodelcev in magnetnih interakcij dipola so magnetni nanodelci zelo občutljivi na

oksidacijo in aglomeracijo. V normalnih razmerah pride hitro do oksidacije površine

nanodelcev, ki ustvari tanko oksidno plast in predvsem spremeni lastnosti nanodelcev.

Naravna aglomeracija je drug problem, ki prav tako vpliva na spremembo velikosti in

lastnosti nanodelcev in se ji skušamo izogniti [18].

Stabilnost magnetne tekočine je poleg visoke specifične magnetizacije ena od osnovnih

zahtev za njeno praktično uporabo (slika 2-2). Odvisna je od vrste faktorjev, ki so pogojeni z

velikostjo nanodelcev in naravo njihove površine, naravo nosilne tekočine ter

stabilizacijskim mehanizmom, ki se nanaša na funkcionalizacijo oziroma modifikacijo

površine nanodelcev [5].

Slika 2-2: Stabilizacija magnetnih nanodelcev s steričnim oviranjem in elektrostatskim odbojem

Nanodelce po sintezi ni možno neposredno dispergirati v nepolarnih nosilnih tekočinah. Za

doseganje stabilnosti magnetnih tekočin je zato potrebno zagotoviti zadosten sterični odboj


9

med delci, ki ga je možno doseči z adsorpcijo molekul surfaktanta na površini delcev.

Površinska koncentracija adsorbiranih molekul surfaktanta ne sme biti prevelika, saj

odvečen surfaktant znižuje specifično magnetizacijo magnetnih nanodelcev. Zaradi tega je

potrebno izbrati takšne pogoje prevlečenja nanodelcev, pri katerih dobimo optimalno

površinsko koncentracijo adsorbiranih molekul surfaktanta [19].

Razvitih je veliko postopkov površinske funkcionalizacije magnetnih nanodelcev, in sicer

bodisi z anorganskimi ali organskimi spojinami z ustreznimi funkcionalnimi skupinami, kot

so aldehidne, hidroksi, karboksilne in amino skupine, ki so potrebne za vezavo z aktivnimi

biomolekulami, na primer encimi [20]. Poznamo dva načina funkcionalizacije magnetnih

nanodelcev, in sicer med postopkom sinteze magnetnih nanodelcev, kjer poteče

enostopenjska reakcija v prisotnosti biokompatibilne matrice, kot so polimerni hidrogeli, ali

po sintezi direktno na magnetne nanodelce s kemijskim pripenjanjem (ang. grafting), z

zamenjavo ligandov in površinskim ujetjem preko hidrofobnih ali elektrostatskih interakcij

[14]. Prav tako se lahko surfaktanti ali polimeri kemično vežejo ali fizično adsorbirajo na

površino magnetnih nanodelcev in s tem ustvarijo enojno ali dvojno plast, ki ustvari sterični

odboj med magnetnimi nanodelci. Poleg tega, da bi razširili področje biološke uporabe

magnetnih nanodelcev, je potrebna funkcionalizacija železovega jedra magnetnega

nanodelca, za okrepitev biokompatibilnosti. V zadnjih letih je veliko prizadevanj za

načrtovanje in razvoj kontroliranih nano-materialov, ki prikazujejo določene funkcionalne

lastnosti. Organske spojine, prevlečene na železov oksid ponujajo veliko možnosti uporabe

na različnih področjih. Vloga organske spojine funkcionalizirane na magnetnem železovem

oksidu ima več pomenov, kot so ohraniti magnetne lastnosti nanodelca, ohraniti druge

lastnosti organske molekule, zagotoviti biokompatibilnost in biorazgradljivost.

Glede na predviden način uporabe tipa nanodelcev jih lahko površinsko modificiramo. Med

tipe površinskih modifikacij magnetnih nanodelcev uvrščamo npr. imobilizacijo organskih

polimerov, nepolimerov, anorganskih molekul ter imobilizacijo ligandov tarčnih molekul.

Obstaja veliko različnih materialov primernih za modifikacijo magnetnih nanodelcev, med

katerimi so najbolj pogosto uporabljene organske polimerne molekule (dekstran, hitozan,

polietilen glikol – PEG, polivinil alkohol – PVA) [13,14,21]. Preko površinskih modifikacij pa

lahko na nanodelce vežemo različne biokonjugate, kot na primer encime, protitelesa ali

celice [22].

Naštete površinske modifikacije izboljšujejo biokompatibilnost magnetnih nanodelcev,

zmanjšujejo agregacijo, znižujejo toksičnost nanodelcev ter izboljšujejo specifičnost

interakcij nanodelcev z okoljem [23].


10

2.6 HITOZAN

Hitozan je netoksičen, biokompatibilen, biorazgradljiv, hidrofilen, kationski polisaharid, s

širokim spektrom uporabe. Od ostalih polisaharidov se razlikuje, saj je primeren za

nadaljnjo modifikacijo zaradi prisotnosti obeh, amino in hidroksil funkcionalnih skupin v

njegovi molekulski strukturi. Poleg tega je kationski in ima sposobnost, da oblikuje

polielektrolitske komplekse s kovinami in anionskimi biomolekulami. Kombinacija teh

bioloških in kemijskih lastnosti mu omogoča, da je zelo zaželjen biološki material za vrsto

bioaplikacij. Vrsto let se hitozan in njegovi derivati uporabljajo za polimerne nanodelce,

primerne za prenos zdravilnih učinkovin do tarčnih celic, vendar pa je v zadnjem času

povečano zanimanje za hitozanske polimerne prevleke železovih oksidnih nanodelcev. V

zadnjih letih je kombinacija hitozana prevlečenega na železove oksidne nanodelce ustvarila

veliko odkritij s področja onkološke nanomedicine, med drugim tudi uspešen razvoj takšnih

delcev z možnostjo prenosa preko krvno-možganske pregrade z namenom slikanja

možganov in kot ciljano zdravljenje rakavih celic s kemoterapevtiki [24].

Hitozan je biopolimer sestavljen iz dveh monosaharidnih enot 2-amino-2-deoksi-ß-D-

glukopiranoze (D-glukozamina) in 2-acetamido-2-desoksi-ß-D-glukopiranoze (N-acetil-

glukozamina), ki sta med seboj povezani z ß-1,4 glukozidno vezjo. Je naravno prisoten v

celični steni bakterij, gliv in plesni ter je sestavni del zunanjega ogrodja rakov in žuželk.

Pridobivajo ga z N-deacetilacijo hitina, pri čemer stopnja deacetilacije in molekulska masa

vplivata na fizikalne in kemijske lastnosti, biorazgradljivost in biokompatibilnost,

protimikrobni značaj hitozana ter hidrolizo polisaharida [25]. Večina komercialno

dostopnega hitozana ima stopnjo deacetilacije med 70 % in 90 %, vendar je hitozan težje

dostopen z visoko stopnjo deacetilacije zaradi dolgega procesa izolacije, ki vpliva na

povečano degradacijo polimera. Hitozan ni topen v vodi, vendar pa zaradi prisotnosti amino

skupin postane topen v kislih raztopinah v pH območju pod in do 6,5 [26].

Uporaba hitozana je odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti, od virov pridobivanja (raki,

glive, mehkužci), postopkov ekstrakcije in čiščenja, stopnje deacetilacije, molekulske mase,

termične stabilnosti in stopnje kristaliničnosti hitozana [25].

Hitozan je po svoji kemični strukturi zelo podoben celulozi, vendar za razliko od celuloze

hitozan vsebuje še aminske skupine (-NH2), preko katerih prvenstveno poteka večina

reakcij, tudi imobilizacija encimov. Zaradi svoje slabe topnosti nad pH 6,5 je nastalo veliko

zanimanje za derivate hitozana, ki so topni v kislem in bazičnem vodnem mediju. Iz

hitozana je mogoče s kemijskimi modifikacijami pridobiti širok spekter derivatov, ki so


11

uporabni v najrazličnejše namene. Na sliki 2-3 so prikazane možnosti pridobivanja derivatov

hitozana in možnosti njihove uporabe [27].

Pri nekaterih izmed teh so odkrili biološko pomembne značilnosti, kot so imunsko

specifične, protikoagulacijske, spermicidne, fungistatične, bakteriostatične lastnosti pa tudi

flokulacijske, kar pomeni, da je hitozan uporaben tako na ekološkem (čiščenje odpadnih

voda) kakor tudi na prehrambnem, medicinskem in farmacevtskem področju [28].

Slika 2-3: Derivati hitozana [27]


12

V zadnjem desetletju se je uporaba hitozana razširila na veliko področij, kot so:

- čiščenje odpadnih vod (odstranitev ionov težkih kovin, flokulacija/koagulacija barvil

in proteinov, membranski čistilni procesi);

- živilska industrija (vezava antiholesterola in maščob, konzerviranje, material za

embaliranje, dodatek k živalski krmi);

- kmetijstvo (premazi za semena in gnojila, nadzorovano agrokemično sproščanje

snovi);

- papirna industrija (površinska obdelava, fotografski papir);

- kozmetična industrija (nega las in kože, ustna higiena);

- farmacija (material za ogrodje farmacevtskih oblik, dostavni sistem za vnos

učinkovin, pripravki za znižanje holesterola in zmanjšanje telesne mase);

- medicina (dostavni sistemi za ciljano dostavo, sistemi za sproščanje učinkovin,

celjenje ran, hemodializne membrane, kontaktne leče, tkivno inženirstvo);

- biotehnologija (kromatografske matrike, membrane za membranske separacije,

encimska/celična imobilizacija) [26,29].

Hitozanske kompozite, primerne kot nosilce za imobilizacijo različnih encimov, razdelimo v

štiri skupine: hitozanske biopolimerne mešanice, hitozanske membrane, hitozanski

polielektrolitski kompleks in hitozanski anorganski kompoziti. Anorganski materiali

vključujejo magnetne delce, kovinske okside, kovinske nanodelce, siliko, glino in

anorgansko sol [30]. Do sedaj je razvitih veliko metod imobilizacije encimov (papain [31],

dehidrogenaza [32], lakaza [33], lipaza [34], celulaza [35]) na magnetne nanodelce

modificirane s hitozanom.

2.7 AKTIVACIJA MAGNENTIH NANODELCEV

Aktivacija magnetnih nanodelcev z bifunkcionalnim reagentom, glutaraldehidom, je ena

najbolj pogostih tehnik pri imobilizaciji encimov. Glutaraldehid se uporablja kot mrežni

povezovalec za aktivacijo nosilcev s fizično adsorpcijo in kovalentno vezavo peptidne

verige, saj je zanesljiv, dostopen, varen, cenovno ugoden in visoko reaktiven [27].


13

Pred imobilizacijo encima na magnetne nanodelce je potrebno aktivirati funkcionalne

skupine na modificirani površini delcev. Imobilizacija encimov na predhodno aktivirane

nosilce z uporabo glutaraldehida je enostavna in učinkovita metoda in v nekaterih primerih

tudi omogoča izboljšanje encimske stabilnosti [36]. Reakcija vezave encima z

glutaraldehidom je shematsko prikazana na sliki 2-4. Bifunkcionalni reagent glutaraldehid

hitro reagira z amino skupinami in z aldehidno skupino glutaraldehida tvori Schiffovo bazo

pri blagih pogojih in v približno nevtralnem pH. Pri vezavi encima na glutaraldehid se

aktivnost encima navadno zmanjša, saj se lahko zgodi, da zaradi neustrezne vezave

aktivna mesta niso dostopna substratu. V primerih, kjer glutaraldehid vpliva na deaktivacijo

imobiliziranega encima, se lahko uporabi polialdehid dekstran, vendar pa reakcija postane

omejena s številom amino skupin prisotnih na površini encima, s koncentracijo dekstrana in

časom imobilizacije [27].

Slika 2-4: Shematski prikaz možne vezave glutaraldehida z encimom [27]

Prav tako se za aktivacijo magnetnih nanodelcev lahko uporablja tudi pentaetilenheksamin

(PEHA) s formulo C10H28N6. Je bistra, rumenkasta in viskozna tekočina, ki je topna v vodi,

etanolu, acetonu, etru, toluenu in benzenu, slabo topna v heptanu in netopna v heksanu ter

ima pomembno vlogo v številnih industrijskih panogah. Uporablja se kot trdilno sredstvo z

epoksi smolami kot mrežni povezovalec številnih snovi, uporabljajo ga tudi v proizvodnji

mazalnega olja in kot dodatek pri gorivih, pri proizvodnji kmetijskih preparatov, kot


14

baktericid za zaščito lesa in za površinsko aktivne snovi. PEHA se kot intermediat uporablja

za sintezo izdelkov, kot so premazi, hladilna sredstva, maziva, sredstva proti zamrzovanju,

pri izdelavi plastike, kot dodatek za predelavo in obdelavo nafte, premoga in zemeljskega

plina, kot dodatek pri gradbeni industriji in v farmaciji. Prav tako pa se uporablja za

aktivacijo nosilcev pri imobilizaciji encimov [37]. Ker pa lahko PEHA povzroči dolgotrajne

učinke na vodne ekosisteme, je njegova sprostitev v odpadne vode zaskrbljujoča, saj velja

za okolju nevarno korozivno sredstvo.

2.8 IMOBILIZACIJA ENCIMOV

Encimi imajo zaradi svojih odličnih funkcionalnih lastnosti (aktivnost, selektivnost in

specifičnost) sposobnost katalize najbolj zapletenih kemičnih procesov. Encimi imajo

sposobnost, da katalizirajo reakcije pri blagih pogojih, tako da znižujejo aktivacijsko energijo

in s tem povečujejo hitrost reakcije. Zaradi tega so encimi primerni kot industrijski

katalizatorji na številnih področjih kemijske industrije, kot so proizvodnja papirja, živilska

industrija in agrokemija, kot tudi v medicini za sintezo antibiotikov ter v genskem

inženiringu. Veliko jih uporabljajo tudi v živilski industriji za mehčanje mesa, proizvodnji

vina, sadnih sokov in piva. Vendar pa imajo poleg njihovih odličnih katalitičnih lastnosti tudi

značilnosti, ki niso primerne za industrijsko uporabo, saj so topni katalizatorji in običajno

zelo nestabilni, lahko jih močno zavirajo substrati in produkti, delujejo le na naravnih

podlagah in pri fizioloških pogojih. Zaradi tega morajo biti v večini primerov encimi pred

uporabo v industrijskih procesih izboljšani. Encimski inženiring, od biološke do kemične

industrije, je eden najbolj zanimivih, kompleksnih in interdisciplinarnih ciljev biotehnologije.

Zato priprava encimov za potrebe industrijskih katalizatorjev zahteva multidisciplinarno

uporabo različnih tehnik: (1) ločitev encimov s podobnimi lastnostmi, (2) izboljšanje lastnosti

encimov s tehnikami molekularne biologije, (3) izboljšanje lastnosti encimov z imobilizacijo

in (4) izboljšanje lastnosti encimov preko reakcije in reaktorske tehnike. Takšno izboljšanje

pomeni ključno rešitev za razvoj trajnostne kemične industrije, ki lahko sintetizira zelo

zapletene in uporabne spojine pri blagih pogojih in z nizkimi stroški [36].

Iz tehničnega in ekonomskega vidika je za večino kemičnih procesov, ki jih katalizirajo

encimi, pomembno, da se lahko ponovno uporabijo v šaržnih postopkih v daljšem

časovnem obdobju. V okviru tega je lahko imobilizacija encimov način, kako izboljšati

lastnosti encimov in povečati ekonomijo procesov biokatalize s ponovno uporabo encimov

in izboljšano stabilnostjo encimov. Prav tako imobilizacija omogoča enostavno ločitev

encimskega katalizatorja iz reakcijske zmesi in tako zmanjša stroške procesov. To velja za


15

imobilizirane encime, ki zagotavljajo visoko uravnoteženo zmogljivost, imajo visoke

izkoristke, nizek masni transfer in visoko operativno stabilnost. Kljub dolgi zgodovini in očitni

prednosti imobiliziranih encimov, se ocenjuje, da le v 20 % procesov biokatalize vključuje

imobilizirane encime [38,39].

Poznamo štiri glavne metode za imobilizacijo encimov, kot so imobilizacija s kovalentno

vezavo, adsorpcijo, ujetjem in zamreženjem [40].

2.8.1 CELULAZA

Celulaze, ki spadajo v skupino hidrolitičnih encimov, hidrolizirajo ß-1,4 vezi celuloze, pri

čemer nastanejo kot primarni produkti glukoza, celobioza in celo-oligosaharidi [41].

Sestavljene so iz kompleksnega sistema encimov, ki sestoji iz treh encimskih razredov:

eksoglukanaze (EC 3.2.1.91), ki cepijo celobiozne enote od konca celulozne verige;

endoglukanaze (EC 3.2.1.4), ki cepijo notranje glikozidne vezi; in ß-glukozidaze (EC

3.2.1.21), ki cepijo glukozne enote celo-oligosaharide [42].

Encim celulazo lahko proizvaja več mikroorganizmov. Navadno so to bakterije in glive,

aerobni in anaerobni organizmi, mezofili, termofili in ekstremofili. Aerobne glive in bakterije

splošno proizvajajo ekstracelularne celulaze. Glive proizvajajo celulazo samo ob prisotnosti

celuloze, kar pri proizvodnji celulaz pri bakterijah ni potrebno [43].

Zaradi raznolike uporabe so celulaze sprva raziskovali več desetletij za biološko pretvorbo

biomase, ki je tako osnova za raziskave industrijske uporabe encima v živalski prehrani,

prehrani za ljudi, tekstilu, detergentih in papirni industriji. S pomanjkanjem fosilnih goriv in z

večanjem potreb po najdbi alternativnih obnovljivih virov energije in goriv se pojavi

obnovitev zanimanja za biološko pretvorbo lignocelulozne biomase z uporabo celulaz in

drugih encimov. Na drugih področjih pa so tehnologije in produkti z uporabo celulaz dosegli

stopnjo, kjer ti encimi postanejo nepogrešljivi.

Celulaze so že desetletje tretja večja skupina encimov, ki se uporablja v industriji. Celulaze

uporabljajo za staranje oblačil iz džinsa, saj proizvajajo mehkobo in zbledel videz oblačil in s

tem nadomestijo uporabo plovnih kamnov, ki se tradicionalno uporabljajo v industriji.

Uporabljajo se tudi za odstranitev koncev vlaken iz tkanine in izboljšanje končnega izdelka,

za mehčanje tkanin, razvlaknjevanje in zagotavljanje gostote barve in vlaken [41].


16

Celulaze se pogosto uporabljajo v detergentih za čiščenje tekstila. Celulaze, predvsem iz

vrst Humicola (H. insolens in H. grisea), ki so aktivne pri blagih alkalnih pogojih in povišani

temperaturi, se pogosto dodajajo pralnim praškom in detergentom [41].

V prehranski industriji se celulaze uporabljajo pri ekstrakciji in bistrenju sadnih in

zelenjavnih sokov in pri ekstrakciji oljčnega olja. Glukanaze dodajajo za izboljšanje

ječmenovega sladu v proizvodnji piva in v vinarstvu. Celulaze, hemicelulaze in pektinaze

omogočajo v postopku pridelave vina boljšo maceracijo, s tem pa tudi boljšo ekstrakcijo

barve iz celične stene grozdne jagode, predvsem pri proizvodnji rdečih vin [44]. Celulaze

uporabljajo v ekstrakciji karotenoidov v proizvodnji živilskih barvil. Encimske pripravke, ki

vsebujejo poleg celulaze še hemicelulaze in pektinaze, uporabljajo za izboljšanje hranilne

vrednosti krme, kar izboljšuje prebavljivost pri živalih.

V proizvodnji celuloze in papirja se celulaze in hemicelulaze uporabljajo za mehansko

odstranitev ostankov lesa in izboljšanje kakovosti papirja, odstranjevanje tiskarske barve

recikliranih vlaken. Celulaze uporabljajo za odstranjevanje tiskarske barve, premazov in

tonerjev iz papirja, pri biokarakterizaciji celuloznih vlaken, izdelavi preprosto biološko

razgradljivega kartona ter pri proizvodnji mehkega papirja (papirne brisače in toaletni papir).

Morda je ena pomembnejših uporab, ki jih trenutno aktivno raziskujejo, uporaba

lignoceluloznih odpadkov za proizvodnjo biogoriv. Lignocelulozni ostanki predstavljajo bogat

obnovljiv vir, vendar je njihova uporaba omejena zaradi pomanjkanja dragih, vendar

učinkovitih tehnologij. Celulaze se lahko uporabljajo za pretvorbo celuloznega materiala v

glukozo in ostale fermentacijske sladkorje, ki se lahko uporabljajo kot mikrobne podlage za

proizvodnjo posameznih celičnih proteinov ali različnih fermentacijskih produktov, kot je

etanol. Proizvodnja bioetanola iz lignoceluloznih ostankov je večstopenjski proces, ki

vključuje predobdelavo ostankov za odstranjevanje lignina in hemiceluloznih frakcij. Z

obdelavo celulaze pri 50 °C, hidrolizo celuloznih ostankov pridobimo fermentacijske

sladkorje. Zadnja faza je uporaba fermentacijskih mikroorganizmov za proizvodnjo alkohola

iz hidroliziranega celuloznega materiala. Uporaba čistih encimov pri pretvorbi biomase v

etanol ali v fermentacijske produkte je trenutno neekonomska zaradi visokih komercialnih

stroškov [44].

2.8.2 HOLESTEROL OKSIDAZA

Holesterol oksidaza (ChOx, EC 1.1.3.6), natančneje 3ß-hidroksilsterol oksidaza, je encim

bakterijskega izvora, za katerega velja, da je zelo uporaben v biotehnoloških aplikacijah


17

povezanih z detekcijo (in pretvorbo) holesterola [45]. Spada v družino oksidoreduktaz,

posebej tistih, ki vplivajo na CH-OH skupino donorja s kisikom kot akceptorjem. Holesterol

oksidaza vsebuje flavin adenin dinukleotid (FAD), katerega funkcija je prenos elektronov pri

oksidacijsko-redukcijskih reakcijah.

Holesterol oksidaza katalizira oksidacijo C3-OH skupine holesterola, pri čemer dobimo ob

prisotnosti kisika (O2) 4-holesten-3-on in vodikov peroksid (H2O2) kot stranski produkt.

Mehanizem reakcije katalizirane s holesterol oksidazo prikazuje slika 2-5.

Slika 2-5: Mehanizem reakcije katalizirane s holesterol oksidazo. ChOx oksidira holesterol v 4-holesten-3-on, pri čemer nastane H2O2.

Encim holesterol oksidaza je industrijsko in komercialno zelo pomemben biokatalizator, saj

se uporablja za določanje holesterola v hrani in v krvnem serumu. Prav tako ima

pomembno funkcijo pri proizvodnji potencialnih insekticidov za zatiranje škodljivcev [46].

Holestenon se uporablja kot prekurzor za sintezo hormonov in številnih vmesnih steroidnih

spojin, kot sta androstadienedion in androstenedion, ki se uporabljata pri proizvodnji

anaboličnih zdravil in kontracepciji. Ta ketosteroid vpliva na zmanjšanje debelosti in ga

uporabljajo kot dodatek za živila ali kot zdravilo za preprečevanje bolezni povezanih z

debelostjo. Holestenon se običajno proizvaja z biotransformacijo s pomočjo mikrobnih celic

kot katalizatorjev in tudi z encimsko kataliziranimi reakcijami [47].

Karakteristične značilnosti encima holesterol oksidaze so dobra stabilnost pri ekstremnih

pogojih, kot so visoka temperatura in precej kislo in bazično pH območje. Temperaturna


18

stabilnost je ena od prednosti za uporabo v klinične namene [48]. Tuji avtorji opisujejo

imobilizacijo holesterol oksidaze na hitozanske nosilce. Raziskovalci so imobilizirali ChOx s

kovalentno vezavo na hitozanske kroglice [47], z namenom uporabe pri reakciji

biotransformacije proizvodnje farmacevtsko pomembnega holestenona, v zamrežen sistem

hitozana in alginske kisline [49], na stekleno ogljikovo elektrodo, funkcionalizirano s hitozan-

grafen nanokompoziti [50] in na NiFe2O4/CuO/FeO-hitozanski nanokompozit [51].

2.9 METODE IMOBILIZACIJE BIOKATALIZATORJA Z NOSILCEM

Metode imobilizacije z nosilcem delimo na dva razreda: kemijske metode, kjer nastanejo

kovalentne in ionske vezi z encimom, ter fizikalne metode, kjer se pojavijo šibke interakcije

[52].

2.9.1 Imobilizacija s kovalentno vezavo

Najpogosteje se uporablja imobilizacija encimov z metodo, ki temelji na tvorbi kovalentne

vezave. Prednost te metode je nastanek stabilne vezi med encimom in nosilcem, hkrati pa

se encim ob uporabi zaradi močne kovalentne vezi ne more sprati s površine nosilca.

Vendar pa se, da bi zagotovili visoko aktivnost, aminokislinski ostanki, ki so bistvenega

pomena za dosego katalitične aktivnosti, ne smejo vključiti v samo kovalentno vezavo na

nosilec. Imobilizacija s kovalentno vezavo se uporablja, kadar v produktu ne sme biti

prisotnega encima. Metodo v splošnem razdelimo v dve podenoti. V prvem delu se

funkcionalna skupina na nosilcu aktivira s specifičnim reagentom, v drugem pa se doda

encim za tvorbo kovalentne vezi [53]. Primernih za vezavo je več funkcionalnih skupin npr.

amino skupina –NH, karboksilna skupina –COOH, aldehidna –CHO, hidroksilna skupina -

OH in sulfidna skupina –SH [40]. Obstaja veliko različnih nosilcev za imobilizacijo s

kovalentno vezavo. Pri izbiri nosilca je pomembno upoštevati nekatere lastnosti katalizatorja

in predvideno uporabo [53]. Na sliki 2-6 je prikazana imobilizacija encima s tvorbo

kovalentne vezi. Reakcija poteče preko amino skupine na površini encima, ki reagira z

aldehidi in tako tvori imine [54]. Glutaraldehid z aldehidno skupino reagira z amino skupino

encima in s tem tvori Schiffovo bazo. Slaba lastnost Schiffove baze je reverzibilnost v

vodnem mediju, posebno pri nizkem pH. To preprečimo z redukcijo imidne vezi z uporabo

natrijevega cianoborohidrida, da dobimo stabilno sekundarno amidno vez [27].


19

Slika 2-6: Shematski prikaz kovalentne imobilizacije encima, dosežene z reakcijo amino skupine na površini encima in s primerno aktiviranim nosilcem

2.9.2 Imobilizacija z adsorpcijo

Adsorpcija encima na netopno matrico je zelo enostavna metoda imobilizacije s široko

uporabnostjo. Preprosto mešanje encima z ujemajočim adsorbentom v okviru primernih

pogojev (pH in ionske moči), ki mu sledi dovolj dolga inkubacija s spiranjem slabo vezanega

in nevezanega encima, omogoča enostavno proizvodnjo imobiliziranega encima v uporabni

obliki [55]. Vezava vključuje reverzibilne površinske šibke interakcije med encimom in

nosilcem, ki po navadi ohrani katalitsko aktivnost encima [53]. Sile, ki sodelujejo, so

večinoma elektrostatične, kot so van der Waalsove sile, hidrofobne sile in vodikove vezne

interakcije. Proces imobilizacije z adsorpcijo je lahko reverzibilen s spremembo pogojev, ki

vplivajo na moč vezave (npr. pH, ionska moč, temperatura, polarnost topila). Kljub temu da

je takšna metoda z ekonomskega vidika uspešna, pa je osnovna slabost te priročne

imobilizacije šibka vezava in uhajanje encima. Vendar pa za mnoge namene počasno

uhajanje encima ne predstavlja prevelike ovire [56].

2.9.3 Imobilizacija z ujetjem

Imobilizacija encimov z ujetjem temelji na omejitvi encima v polimerni matrici, kjer ne pride

do kovalentne vezave med nosilcem in encimom. Molekule encima v raztopini so proste,

vendar pa imajo omejeno gibanje prav zaradi ujetja v strukturo nosilca. Prednosti te metode

so prepustnost matric, ki omogočajo transport spojin z nizko molekulsko maso brez

uhajanja ujetega encima, regulacija poroznosti materiala, ki omogoča imobilizacijo encimov

različnih velikosti in možnost kemične spremembe matrice [36, 38]. Očitna prednost te

metode je tudi ko-imobilizacija encimov, ki nudi imobilizacijo v željeni kombinaciji in ustreza

točno določeni aplikaciji. Poznamo različne pristope ujetja encimov, kot so gel, vlakna in


20

mikrokapsule. Mikrokapsule z imobiliziranim encimom se proizvedejo z reakcijo

polimerizacije na površini encimskih kapljic v vodni raztopini, ki so razpršene v organskem

topilu s pomočjo surfaktantov [57]. Praktična uporaba teh metod je omejena s prenosom

mase skozi membrane ali gele [36].

2.10 METODE IMOBILIZACIJE BIOKATALIZATORJA BREZ NOSILCA

2.10.1 Zamreženje encima

Zamreženje encima je tip imobilizacije brez uporabe nosilca, pri kateri gre za združevanje

encimov v tridimenzionalno strukturo, kar se lahko doseže s kemičnimi in fizikalnimi

metodami. Tehnika zamreženja encima z reakcijo glutaraldehida in reaktivnimi (-NH2)

aminskimi skupinami na površini encima je bila razvita leta 1960. Vendar je imel postopek

CLEs (ang. Cross-linked enzymes) več pomanjkljivosti, kot so nizka katalitska aktivnost,

slaba ponovljivost, nizka mehanska stabilnost in težave pri rokovanju z želatinasto CLEs.

Kasneje se je razvila metoda CLECs (ang. Cross-linked enzyme crystals), pri kateri gre za

zamrežene encimske kristale. Njihova operativna stabilnost, kontrolirana velikost kristalov,

možnost ponovne uporabe, skupaj z njihovo katalizno in volumetrično produktivnostjo so

lastnosti primerne metode za uporabo v industrijski biokatalizi. Vendar pa je pomanjkljivost

te metode zahteven in drag postopek, saj zahteva encim visoke čistosti [58]. Primerljive

rezultate so dobili z obarjanjem encima in zamreženjem encimskih agregatov, iz katerih se

je razvila nova oblika encimske imobilizacije CLEAs (ang. Cross-linked enzyme

aggregates). Takšni agregati so supramolekularne strukture, povezane z nekovalentnimi

vezmi in dispergirane v vodnem mediju. Značilno je, da se encimska katalitska aktivnost

ohrani [59]. CLEAs so manj amorfni, pomenijo lažje rokovanje in kažejo visoko stabilnost pri

visokih temperaturah ter v prisotnosti organskih topil. Prav tako se lahko ponovno uporabijo,

kar predstavlja visoko operativno stabilnost [60].


21

2.11 LASTNOSTI IMOBILIZIRANIH ENCIMOV

Z vidika bioprocesov je namen imobilizacije encimov povečati njihovo stabilnost in

omogočiti dolgotrajno uporabo bodisi v neprekinjenih ali v sekvenčno šaržnih procesih.

Imobilizacija se lahko uporablja tudi za druge zelo pomembne namene, kot so spremembe

encimskih kinetičnih parametrov. Nadzorovana in usmerjena interakcija med trdno površino

nosilca in encimom je pomembna za povečanje aktivnosti in selektivnosti za uporabo v

nekonvencionalnih medijih [57].

Prednosti imobiliziranih encimov so naslednje:

- zlahka jih ločimo iz reakcijske zmesi, ki vsebuje preostale reaktante, in jih ponovno

uporabimo;

- imobilizirani encimi imajo višjo stabilnost v širokem razponu pH vrednosti in

temperature;

- imobilizirani encimi niso prisotni v odpadu;

- lahko jih uporabljamo v kontinuiranih procesih;

- znižanje stroškov proizvodnje;

- večji nadzor katalitskega učinka;

- višja enostavnost uporabe v industrijske in medicinske namene in

- dovoljujejo uporabo nekaterih encimov iz organizmov, ki jih običajno označujemo kot

nevarne (ang. non-GRAS) [61].

Ti učinki so bili dokazani in se v manjši meri uporabljajo za številne encimske reakcije. Ena

glavnih težav povezanih z uporabo imobiliziranih encimov je izguba katalitske aktivnosti,

zlasti kadar gre za encime imobilizirane na makromolekularnih substratih. Zaradi

omejenega dostopa substrata do aktivnega mesta encima se lahko aktivnost zmanjša na

samo dostopne skupine na površini encima. Obstaja več strategij, da bi se izognili tem

steričnim problemom, kot so izbira nosilca, izbira encimskih ostankov vključenih v

imobilizacijo in uporaba hidrofilne distančne ročice med nosilcem in encimom [53]. Primer

tipične oblike magnetnega nanodelca primernega za imobilizacijo encimov je prikazan na

sliki 2-7.


22

Slika 2-7: Tipična oblika magnetnega nanodelca za bioaplikacije


23

3 EKSPERIMENTALNI DEL

3.1 MATERIALI

3.1.1 Materiali in reagenti pri imobilizaciji holesterol oksidaze na

magnetne mikro- in nanodelce

Vse kemikalije in reagenti so bili uporabljeni v preparativne namene. Kemikalije, vključujoč

amonijak (25 % (w/w)), natrijev silikat (Na2SiO3), hitozan (75-85 % deacetiliran),

glutaraldehid (25 %) in Span-80 in glicerol (87 %) so bili kupljeni pri proizvajalcu Sigma –

Aldrich (Nemčija). Železov klorid tetrahidrat (FeCl2·4H2O) in železov klorid heksahidrat

(FeCl3·6H2O) sta bila kupljena pri Merck (Nemčija), parafinsko olje pa pri Kreiger. Encim

holesterol oksidaza (ChOx, EC 1.1.3.6; 19.8 U/mg) je bil kupljen pri podjetju Bioenzyme

Laboratories (Velika Britanija). Dušikova (65 % (w/w)) in mravljična (98-100 %, brezvodna)

kislina sta bili kupljeni pri Kemiki (Hrvaška). Bazična reagenta, kalijev (KOH) in natrijev

(NaOH) hidroksid sta bila nabavljena pri podjetju Merck (Nemčija), puferska raztopina

Buffer solution for HPCE (pH 11) je bila kupljena pri Biochemica – Fluka (Nemčija). Za

pripravo Bradfordovega reagenta smo uporabili barvilo Coomasie Brilliant Blue in orto-

fosforno kislino (88 %), ki smo jih kupili pri podjetju Merck (Nemčija). Za merjenje aktivnosti

encima celulaze smo uporabili celulozo, ki smo jo kupili pri Sigma – Aldrich (Nemčija). Vse

raztopine reagentov so bile dnevno pripravljene z deionizirano miliQ vodo.

3.1.2 Materiali in reagenti pri sintezi zamreženih encimskih skupkov iz

celulaze

Vse kemikelije in reagenti so bili uporabljeni v preparativne namene. Kemikalije, vključujoč

albumin iz kokošjih jajc (EA), glutaraldehid (25 % (v/v)) in natrijev cianoborohidrid

(NaBH3CN), so bile kupljene pri Sigma – Aldrich (Nemčija). Pentaetilen heksamin (PEHA),

dikalijev hidrogen fosfat (K2HPO4), kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) so bili nabavljeni pri

Acros Organics (Nemčija). Encim celulaza (Cellusoft) (EC 3.2.1.4) je podaril Novozymes

A/S (Danska). Topila, amonijev slufat, propanol in tetrahidrofuran so bili nabavljeni pri

podjetju Fluka (Nemčija), etanol (99,8 %) pri Kefo (Slovenija), aceton pri Chem-Lab

(Nemčija), metanol pri Merck (Nemčija) in 2-propanol pri Kemika (Hrvaška). Vse raztopine

reagentov so bile dnevno pripravljene z deionizirano miliQ vodo.


24

3.2 ANALIZNE IN MERILNE METODE

Za karakterizacijo magnetnih nanodelcev, površinsko funkcionaliziranih s hitozanom, po

treh različnih postopkih smo uporabili naslednje analizne metode.

3.2.1 PRESEVNA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA (TEM)

Z elektronskim mikroskopom preučujemo delce, ki jih z optičnim mikroskopom zaradi

njihove velikost ne moremo. Poznamo dva tipa elektronskega mikroskopa: presevni ali

transmisijski elektronski mikroskop (TEM) in vrstični ali ˝scanning˝ elektronski mikroskop

(SEM). Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM) se uporablja predvsem za določanje

morfologije in velikosti sintetiziranih nanodelcev. Poleg tega nam statistična analiza TEM

posnetkov daje tudi podatke o morfologiji in porazdelitvi mikro- in nanodelcev v vzorcu. Na

podlagi posnetkov HR-TEM pa je zaradi višje resolucije moč pridobiti tudi podatke o

razporejenosti atomov v kristalni strukturi [18].

S transmisijsko elektronsko mikroskopijo (HRTEM, JEOL 2010 F) smo preučevali

morfologijo (določitev razpona velikosti delcev, prisotnost in debelino plašča hitozana)

sintetiziranih magnetnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh različnih

postopkih.

3.2.2 VRSTIČNA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA (SEM)

S presevno elektronsko mikroskopijo (SEM) smo preučevali morfologijo sintetiziranih

magnetnih nanodelcev maghemita in magnetnih mikro- in nanodelcev funkcionaliziranih s

hitozanom po treh različnih metodah, na napravi FE SEM SIRION, 400 NC, FEI. Vzorce

smo pripravili v obliki nanosa prahu magnetnih mikro- in nanodelcev na ogljikovo pasto,

pritrjeno na kovinski nosilec. Nanose magnetnega prahu smo napršili z zlatom (Au).

Vrstična elektronska mikroskopija je bila uporabljena za določanje velikosti in oblike

magnetnih mikro- in nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh različnih postopkih.


25

3.2.3 ENERGIJSKO DISPERZIJSKA SPEKTROSKOPIJA (EDS)

Za določitev kemijske sestave in kvalitativno določitev kemijskih elementov v izbranem

območju magnetnih nanodelcev prevlečenih s funkcionalno plastjo hitozana smo uporabili

energijsko disperzijsko spektroskopijo rentgenskih žarkov (EDS). EDS analizo lahko

izvajamo tako v vrstičnem (SEM) kot tudi v presevnem elektronskem mikroskopu (TEM). S

to metodo lahko zanesljivo ugotovimo, ali je katerega elementa veliko (masni delež > 10 %),

ali je prisoten v manjših količinah (1 – 10 %) ali v sledovih (< 1 %) [62]. EDS analizo smo

izvedli na napravi FE SEM SIRION, 400 NC, FEI.

3.2.4 TERMIČNA ANALIZA (TGA/DTA)

Termična analiza je metoda, s katero merimo fizikalne spremembe snovi v odvisnosti od

temperature, medtem ko je snov izpostavljena določenemu temperaturnemu programu. Za

karakterizacijo materialov sta pomembni predvsem termogravimetrična analiza (TGA) in

diferenčna termična analiza (DTA), ki smo jo izvedli na TGA/DSC1 Mettler Toledo

termogravimetričnem analizatorju/diferenčnem dinamičnem kalorimetru. S TGA se

kontinuirano meri spremembe mase vzorca v kontrolirani atmosferi v odvisnosti od

temperature, ki ji je vzorec izpostavljen. Pri tem se temperatura običajno spreminja linearno

s časom. Rezutat TGA je termogravimetrična krivulja oz. termogram, s katerim je prikazana

sprememba mase vzorca na y-osi v odvisnosti od temperature ali časa na x-osi. Rezultate

lahko podajamo v miligramih ali v % izgube mase v odvisnosti od časa in temperature

segrevanja. Na obliko termograma vplivajo sestava in tip preiskovanega materiala, termična

stabilnost materiala ter vsebnost vlage v vzorcu, hitrost segrevanja (K/min) in uporabljena

atmosfera. Merjenje je potekalo v aluminijastem lončku pri atmosferskem tlaku s hitrostjo

segrevanja 10 °/min v temperaturnem območju 30-600 °C.

3.2.5 RENGENTSKA PRAŠKOVNA DIFRAKCIJA (XRD)

Rentgenska difrakcija (XRD) je direktna metoda za kvalitativno in kvantitativno fazno

analizo trdnih kristaliničnih vzorcev, ki se uporablja za določanje vrste in fazne sestave

materiala, določanje strukture in velikosti, pri čemer je pomembno dejstvo, da ima vsaka

kristalinična snov specifično difrakcijo [63].

Rentgenska praškovna difrakcijska analiza je bila uporabljena za karakterizacijo

sintetiziranih magnetnih nanodelcev maghemita. Vzorci so bili analizirani na D4 Endeavor


26

difraktometru (XRD, AXS, Bruker, D5005) z Ni filtriranim CuKa (λ = 1.5418 Å) sevanjem pri

30 kV in 15 mA. Snemanje vzorcev je potekalo 10 min v območju 2θ = 20 – 70 ° s korakom

0.02 °/min.

3.2.6 MERJENJE VELIKOSTI DELCEV Z DINAMIČNIM SIPANJEM

LASERSKE SVETLOBE (DLS) IN LASERSKIM GRANULOMETROM

Dinamično sipanje laserske svetlobe je ena izmed najbolj priljubljenih metod za določevanje

velikosti delcev s pomočjo Brownovega gibanja v suspenziji. Za merjenje velikosti

magnetnih nanodelcev smo uporabili ZetaSizer Nanoseries. Laser delce osvetli, nato sledi

analiza intenzivnosti gibanja v razpršeni svetlobi. Suspendirani delci v tekočini se ves čas

konstantno gibajo, kar se izraža kot Brownovo gibanje. Pomembna značilnost Brownovega

gibanja za DLS je, da se majhni delci gibajo hitreje v primerjavi z večjimi delci, ki se gibajo

počasneje [64]. Kadar je vir svetlobe laser in je svetloba monokromatska, lahko z

avtokorelacijsko funkcijo določimo ponavljajoče se vzorce in s tem sledimo gibanju delcev,

kar nas pripelje do difuzijskega koeficienta, iz katerega lahko na podlagi poznavanja

lastnosti disperzije sklepamo o velikosti delcev [65].

Velikost in porazdelitev velikosti magnetnih mikrodelcev, funkcionaliziranih s postopkom

mikroemulzije in zamreženja hitozana na magnetni nosilec in dispergiranih v tekočini (vodi),

smo določili z laserskim granulometrom Fritsch analysette 22, Compact II, ki deluje po

principu laserske difrakcijske spektroskopije.

3.2.7 MERJENJE SPECIFIČNE MAGNETIZACIJE (VSM)

Merilnik namagnetenosti s tresočim vzorcem (ang. Vibrating sample magnetometer - VSM)

se uporablja za merjenje magnetizacije materiala v odvisnosti od zunanjega magnetnega

polja, ki ga je pri tovrstnih magnetometrih moč spreminjati od -3 pa do 3 T. Rezultat analize

VSM je histerezna krivulja, iz katere lahko razberemo koercitivnost, nasičeno magnetizacijo

in energijo sproščeno v procesu ene magnetizacije in ponovne demagnetizacije materiala.

Na podlagi histerezne krivulje lahko sklepamo tudi na morebitno superparamagnetnost

našega vzorca [18].

Magnetne meritve so bile opravljene na Inštitutu »Jožef Štefan« v Ljubljani, na

magnetometru Lake Shore 7307 VSM pri sobni temperaturi.


27

3.2.8 DOLOČANJE DOSTOPNIH AMINO SKUPIN S POTENCIOMETRIČNO

TITRACIJO

Natančna kvalitativna in kvantitativna analiza množine amino skupin je pomembna za

poznavanje strukturnih lastnosti hitozana in njegovih možnosti uporabe v industriji [66]. Pri

potenciometrični titraciji uporabljamo stekleno elektrodo, ki je idealen potenciometrični

senzor za spremljanje spremembe koncentracije oksonijevih ionov med titracijo, kar lahko

zasledujemo s spremembo pH vrednosti. Amino skupine hitozana v kislem mediju

protonirajo v NH3+ skupine. Protoniranje amino skupin je ključnega pomena, saj pri

nevtralizaciji sproščen vodikov atom vpliva na spremembo potenciala raztopine, ki jo

titriramo. Tako lahko posredno ovrednotimo množino amino skupin v raztopini, ki so

pomembne za nadaljnjo imobilizacijo encimov. Določitev števila dostopnih amino skupin

hitozana, prevlečenega na magnetnih nanodelcih po treh različnih metodah, je bila

izvedena z metodo potenciometrične titracije v vodnem mediju, kjer smo titrirali vodno

raztopino kisline z bazo in obratno.

3.2.9 MERJENJE pH

Kislost/bazičnost pripravljenih raztopin smo preverjali s pH metrom (Hanna instruments), ki

smo ga pred vsakim merjenjem ustrezno umerili s standardnimi pH raztopinami, pH 4, 7 in

10.

3.2.10 FOURIEROVA TRANSFORMACIJSKA INFRARDEČA

SPEKTROSKOPIJA (FTIR)

Kemijsko sestavo in vezavo funkcionalnih skupin hitozana na magnetne nosilce smo

proučevali s Fourierovo transformacijsko infrardečo spektroskopijo. Analizna tehnika temelji

na tem, da kemijske vezi in molekule vibrirajo na karakterističnih frekvencah. Suhe vzorce

magnetnih nanodelcev in magnetnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh

postopkih smo pomešali s suhim KBr (v razmerju 1:10) in stisnili v preši, da smo dobili

tabletko. Tabletko smo vstavili v ustrezno ohišje in izmerili IR spekter. Predhodno smo

posneli ozadje, da smo lahko spekter ozadja odšteli od merjenega vzorca in s tem zmanjšali

motnje okolice. IR spektri so bili merjeni pri valovni dolžini 4000–400 cm-1 na

spektrofotometru Shimadzu IRAffinity-1. Dobljene spektre smo nato obdelali s priloženim

programom IR-solution in določili karakteristične vrhove.


28

3.2.11 TOKSIKOLOŠKO TESTIRANJE HITOZANA IN MAGNETNIH

MIKRO- IN NANODELCEV

Raziskave kažejo, da so nanodelci železovih oksidov netoksični in imajo minimalni vpliv na

preživelost celic in njihovo delovanje. Preučevali smo vpliv hitozana in magnetnih mikro- in

nanodelcev prevlečenih s funkcionalno plastjo hitozana na rast mikrobioloških kultur

Escherichia coli in Sacharomyces cerevisiae.

Bakterijsko kulturo E. coli smo gojili na hranilnem agarju: 5g mesnega peptona, 3 g

mesnega ekstrakta, 0,5 g NaCl, 5 g D(+)-glukoze in 18 g agarja na 1 L vode. Glivno kulturo

S. cerevisiae smo hranili na krompirjevem agarju: 39 g krompirjevega agarja na 1 L vode.

Na trden specifičen medij za gojenje kultur smo inokulirali glivno oziroma bakterijsko

kulturo, ki smo jo predhodno prenesli v fiziološko raztopino. Sveže pripravljeno suspenzijo

mikrobiološke kulture smo inokulirali na površino hranilnega agarja in jo enakomerno

razmazali po celotni površini agarja. Na razmaz smo nanesli magnetne mikro- in nanodelce

prevlečene s hitozanom po treh različnih metodah ter hitozanski prah. Gojišča smo

inkubirali pri določeni temperaturi (E. coli pri 37 °C in S. cerevisiae pri 28 °C) ter po dveh

dneh ugotavljali vpliv magnetnih mikro- in nanodelcev prevlečenih s hitozanom in čistega

hitozana na rast posamezne kulture.

3.2.12 OPTIČNA MIKROSKOPIJA

Velikost in obliko zamreženih encimskih skupkov smo opazovali z optičnim mikroskopom

Novex (Nizozemska). Optične posnetke smo naredili s kamero Euromex DC5000 pritrjeno

na mikroskop pri povečavi 400x in s pomočjo programa Image Focus 2.6 obdelali in določili

velikost zamreženih encimskih skupkov.


29

3.3 EKSPERIMENTALNE METODE

3.3.1 SINTEZA MAGNETNIH NANODELCEV

Maghemitne nanodelce smo sintetizirali s koprecipitacijo ali obarjalno reakcijo Fe2+ (0,027

mol/L) in Fe3+ (0,023 mol/L) ionov z raztopino amonijaka (25 % (v/v)). Zatehtali smo 2,684 g

FeCl3∙6H2O in 3,11 g FeCl2∙4H2O ter ju ločeno raztopili v 250 mL miliQ vode in čaši z

raztopinama za eno uro izpostavili ultrazvočni kopeli. Nato smo obe raztopini nalili v stekleni

reaktor s tremi pokončnimi vratovi in reaktor opremili z mehanskim mešalom.

Nadaljnji postopek je potekal v dveh stopnjah. Najprej smo s počasnim dodajanjem

amonijakalne raztopine (150 mL miliQ vode in 3 mL 25 % amonijaka) dvignili pH raztopine

železovih ionov na pH = 3 in jo ob konstantnem mešanju vzdrževali 30 minut. Pri tem se

obori železov hidroksid ali Fe(OH)3, kar lahko opazimo kot spremembo barve na sliki 3-1.

V drugi stopnji smo s hitrim dodatkom 250 mL amonijaka zvišali pH>11 in raztopino mešali

še 30 minut. Tako je železov hidroksid oksidiral z zračnim kisikom in nastal je produkt iz

maghemita. Reaktor smo nato postavili na magnet in pustili eno uro, da so se delci posedli.

Preostalo tekočino smo odlili v odpadno steklenico, posedene delce pa smo sprali z

amonijakalno raztopino s pH>10,5. Pri tem pH imajo delci visok negativni naboj, kar se kaže

kot visok zeta-potencial, ki preprečuje njihovo močno agregacijo [62].

Površinsko neobdelane magnetne nanodelce iz maghemita smo nato prevlekli s površinsko

aktivno snovjo ali surfaktantom in s tem preprečili aglomeracijo delcev. Aglomeracijo delcev

smo preprečili z vezavo citronske kisline na površino delca. Sprane magnetne nanodelce

smo dispergirali v 60 mL miliQ vode. Mešanici smo dodali 2,5 mL raztopine citronske kisline

(2,5 g citronske kisline raztopljene v 5 mL miliQ vode). Kislina preprečuje aglomeracijo

nanodelcev ter tako pripomore k večji stabilnosti suspenzije. S 25 % amonijakom, ki smo ga

dodajali po kapljicah, smo uravnali pH na 5,2±0,1. Pri tem pH je adsorpcija kisline na

nanodelce najučinkovitejša, posledično pa masni delež maghemitnih delcev v magnetni

tekočini največji. Pri pH>5,2 bi bil na površini delcev premajhen pozitiven naboj, pri pH>7 pa

celo negativen, kar bi onemogočalo vezavo citronske kisline na površino delcev. Pri pH<5,2

pa bi se povečala topnost oksidnih delcev v raztopini citronske kisline [11].


30

Slika 3-1: Prikaz postopka sinteze magnetnih nanodelcev z obarjanjem

Z namenom da bi pripravili disperzijo nanodelcev v polarnem topilu posebno v vodi, smo

površino že sintetiziranih nanodelcev prevlekli s citronsko kislino. Proces je potekal pri

povišani temperaturi v organskem polarnem topilu ob močnem prebitku citronske kisline.

Vezava citronske kisline na površino nanodelcev povzroči njihovo hidrofilnost, hkrati pa

zagotovi močan, negativen površinski naboj na nanodelcih, kar omogoča koloidno stabilnost

suspenzije – vodne magnetne tekočine. Pripravljeno suspenzijo smo segreli na 75 °C in

mešali 90 minut. V tem času se je citronska kislina vezala na površino nanodelcev. Čašo s

suspenzijo smo prekrili s folijo, da bi preprečili prevelike izgube.

Po končanem mešanju smo mešanico šibko aglomeriranih delcev ohladili na sobno

temperaturo in ponovno uravnali pH na 10,1±0,1. Pri tem pH se količina nanodelcev, ki

preide v stabilno suspenzijo, močno poveča. Neaglomerirani delci v suspenziji so tako

dolgoročno stabilni [11]. S pomočjo centrifugiranja na 5000 rpm za 5 minut, smo iz tekočine

odstranili nestabilne in aglomerirane delce. Magnetno tekočino smo nato uporabili za

sintezo hitozanskih maghemitnih mikro- in nanodelcev.


31

3.3.2 FUNKCIONALIZACIJA MAGNETNIH NANODELCEV S HITOZANOM

Funkcionalizacija površine magnetnih nanodelcev s hitozanom je potekala po treh različnih

metodah: postopek mikroemulzije (MC1), postopek suspenzijske zamreževalne tehnike

(MC2) in postopek kovalentne vezave hitozana (MC3). Pri prvih dveh postopkih smo s

hitozanom prevlekli predhodno pripravljene maghemitne nanodelce, pri tretjem pa smo

hitozan vezali na nanodelce v stabilni magnetni tekočini.

3.3.2.1 Postopek mikroemulzije

V 2 % raztopini ocetne kisline (20 mL) smo raztopili 0,5 g hitozana. Hitozan tvori z ocetno

kislino koloidno raztopino. Vanjo smo nato dodali maghemitne nanodelce (0,05 g).

Mešanico smo za 30 minut izpostavili ultrazvočni kopeli ter jo vmes večkrat premešali.

Pripravili smo vodno kopel pri 40 °C z mehanskim mešalom. V mešanico smo dodali 80 mL

parafinskega olja ter 4 mL emulgatorja (Span-80). Ob dodatku parafinskega olja sta se

ustvarili dve fazi, ki smo ju z dodatkom emulgatorja združili v eno.

Nazadnje smo počasi po kapljicah dodali še 2 mL glutaraldehida (25 % (v/v)) in zmes 60

minut intenzivno mešali pri 40 °C. Opazili smo lahko, da so se nanodelci enakomerno

dispergirali v gosti beli mešanici. S pH-metrom smo nato uravnali pH mešanice na 9-10 (z

1M NaOH) in segreli vodno kopel na 70 °C. Po 60 minutah je bilo potrebno nanodelce

prevlečene s hitozanom ločiti iz viskozne zmesi s pomočjo magneta ter spiranj. Spirali smo

jih z etanolom in destilirano vodo. Produkt rjave barve smo posušili v sušilniku pri 60 °C

[67].

3.3.2.2 Postopek suspenzijske zamreževalne tehnike

Maghemitne nanodelce (0,2 g) smo dispergirali v mešanico 30 mL parafinskega olja ter 0,5

mL emulgatorja (Span-80). Posebej smo raztopili hitozan (0,2 g) v 5 % ocetni kislini (15

mL). Nato smo obe substanci zmešali in mešanico izpostavili ultrazvočni kopeli za 30 minut.

Po dodatku 3 mL glutaraldehida (25 % (v/v)) smo snov s pomočjo mehanskega mešala

mešali pri sobni temperaturi 4 ure. Sledilo je spiranje, enako kot pri prvem postopku, in

sušenje delcev [32].


32

3.3.2.3 Postopek kovalentne vezave

V večjo čašo smo nalili 3,5 L miliQ vode in dodali raztopino hitozana (0,035 g smo raztopili v

3 mL miliQ vode) ter 7 g predhodno pripravljene magnetne tekočine. Opazili smo lahko

spremembo barve v motno rjavo. Z 1 M HCl smo znižali pH mešanice na 3,7 in jo za 60

minut izpostavili ultrazvočni kopeli. Vodno kopel smo segreli na 60 °C in vanjo postavili

posodo z mešanico. Posodo smo opremili z mehanskim mešalom in mešali 12 ur, v tem

času se je na magnetne nanodelce kovalentno vezal hitozan. Po končanem mešanju smo

čašo za 24 ur postavili na magnet in počakali, da so se hitozanski maghemitni nanodelci

posedli. Tekočino smo zavrgli, delce pa sprali z miliQ vodo in jih posušili na zraku.

Posušenih delcev ne zdrobimo v terilnici, saj lahko s tem ločimo hitozansko plast od

površine nanodelcev [68].

3.3.3 IMOBILIZACIJA ENCIMA HOLESTEROL OKSIDAZE NA MIKRO- IN

NANODELCE

Pred imobilizacijo biokatalizatorja holesterol oksidaze smo površino magnetnih nanodelcev

aktivirali. Za aktivacijo funkcionalnih skupin smo uporabili mrežna povezovalca glutaraldehid

(GA) in pentaetilenheksamin (PEHA). V mikrocentrifugirke smo zatehtali 5 mg predhodno

pripravljenih hitozanskih maghemitnih nanodelcev (po treh različnih postopkih) ter dodali 1

mL pufra s pH = 7,3 in določeno preračunano količino GA oziroma 1 mL 0,02 M PEHA.

Zmes smo dobro zvorteksirali in jo stresali pri sobni temperaturi za določen čas. Po

končanem stresanju smo mikrocentrifugirke postavili na magnet, da so se delci posedli na

dno in odpipetirali supernatant ter ga zavrgli.

Aktivirane mikro- in nanodelce, prevlečene s funkcionalnim slojem hitozana po treh različnih

postopkih, smo suspendirali v 0,9 mL pufra PBS (10 mM, pH 7,3) in 0,1 mL določene

koncentracije encima ter zmes zvorteksirali. Sledila je 24-urna imobilizacija encima

holesterol oksidaze na magnetne mikro- in nanodelce pri sobni temperaturi in različnem

stresanju.


33

3.3.4 SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ CELULAZE

Postopek priprave zamreženih encimskih skupkov iz encima celulaze je potekal v dveh

stopnjah:

obarjanje začetne raztopine encima in

zamreženje encimskih skupkov.

Pri obarjanju smo uporabili 90 % volumski delež obarjalnega reagenta in 10 % volumski

delež raztopljenega encima celulaze. Celoten volumen reakcijske zmesi je bil 1 mL,

sestavljen iz topila ali obarjalnega reagenta (900 µL) in raztopine encima celulaze (100 µL).

Vzorce z uspešno oborjenim encimom celulazo smo centrifugirali 10 min pri 3000 rpm. V

frakciji supernatanta smo določili aktivnost encima in koncentracijo proteinov po Bradfordu.

Hkrati smo izmerili še aktivnost prostega encima in jo primerjali z aktivnostjo

resuspendiranega encima po zaključeni reakciji obarjanja.

Obarjalne reagente z najvišjimi vrednostmi aktivnosti encima smo uporabili za naslednji

korak pri pripravi zamreženih encimskih skupkov, to je reakcijo zamreženja. Pri reakciji

zamreženja smo kot mrežni povezovalec uporabili glutaraldehid (GA). Zamreženje je

potekalo 3 ure in je bilo izvedeno z različnimi volumskimi koncentracijami glutaraldehida.

Potrebno količino glutaraldehida smo izračunali po enačbi:

𝑤 (𝐺𝐴) =0.25∗𝑉𝐺𝐴

𝑉𝐺𝐴+1.3 𝑚𝐿 [3.1]

Molekule encima v obliki zamreženih encimskih skupkov so povezane s kovalentnimi

medmolekularnimi vezmi. Reakcijo zamreženja smo vedno izvajali v prisotnosti

pentaetilenheksamina (PEHA; 100 mM, pH = 6,4), s katerim smo povečali število prostih

amino skupin ter ogrodnega proteina jajčnega albumina (EA) z namenom stabilizacije

encima. Postopek obarjanja je potekal z različnimi obarjalnimi reagenti. V naslednjem

koraku smo ob mešanju dodali mrežni povezovalec glutaraldehid (25 % (v/v)) in po

končanem zamreženju dodali še natrijev cianoborohidrid (NaBH3CN; 100 µL) ter suspenzijo

mešali 40 minut na magnetnem mešalu. Dodatek natrijevega cianoborohidrida je potreben

za dodatno utrditev intramolekularnih kovalentnih vezi med molekulami encima. Po

zaključeni sintezi CLEAs smo zamrežene encimske skupke iz encima celulaze centrifugirali

10 min pri hitrosti 3000 rpm. Frakcijo supernatanta smo odpipetirali, medtem ko smo

oborino zamreženih encimskih skupkov suspendirali v 1 mL vodne raztopine pufra (PBS, 10

mM, pH 7,3) in to suspenzijo mešali 10 min. Dobljeno suspenzijo zamreženih encimskih

skupkov smo ponovno centrifugirali 10 min. Odpipetirali smo tekočo fazo po prvem izpiranju


34

in postopek še dvakrat ponovili. Oborino zamreženih encimskih skupkov smo po izpiranjih

ponovno suspendirali v 1 mL vodne raztopine pufra (PBS, 10 mM, pH 7,3) in jo uporabili za

nadaljnje raziskave. Shematski prikaz sinteze zamreženih encimskih skupkov je prikazan

na sliki 3-2.

Preostalo koncentracijo proteinov smo po Bradfordovi metodi določili v vseh tekočih

frakcijah (supernatantu in izpiranjih). Prav tako smo določili tudi encimsko aktivnost v vseh

ločenih frakcijah, encimsko aktivnost prostega encima in zamreženih encimskih skupkov iz

encima celulaze.

Slika 3-2: Shematski prikaz sinteze zamreženih encimskih skupkov iz celulaze


35

3.3.5 DOLOČANJE UČINKOVITOSTI IMOBILIZACIJE

Določanje učinkovitosti imobilizacije smo izvedli z določanjem koncentracije proteinov v

vzorcu z Bradfordovo metodo.

3.3.5.1 Priprava Bradfordovega reagenta

Bradfordov reagent smo pripravili tako, da smo raztopili 100 mg Coomassie Brilliant Blue v

50 mL etanola (95 % (v/v)) in v 100 mL fosforne kisline (85 % (v/v)) ter razredčili z miliQ

vodo do oznake 1L. Reagent smo dobro premešali na magnetnem mešalu ter ga shranili v

hladilniku [69].

3.3.5.2 Določanje koncentracije proteinov v vzorcu z Bradfordovo

metodo

Bradfordova metoda spada med splošne metode za kvantitativno določanje koncentracije

proteinov v neznanem vzorcu in temelji na spektrofotometričnem določanju proteinov.

Izmerjena absorbanca v vzrocu je linerano sorazmerna s koncentracijo proteinov v

neznanem vzorcu. V našem primeru smo koncentracijo proteinov v neznanem vzorcu

določili s pomočjo umeritvene krivulje (Priloge). Pri pripravi umeritvene krivulje smo za

standardni protein uporabili protein albumin iz govejega seruma (Bovine Serum Albumin ali

BSA) v koncentracijskem območju od 0 do 1 mg/mL. Iz umeritvene premice smo določili

naklon, ki smo ga uporabili pri izračunu neznane koncentracije proteinov v vzorcu. Pred

pričetkom merjenja absorbance smo proteinskemu vzorcu dodali Bradfordov reagent (1mL

Bradfordovega reagenta in 20 µL proteinskega vzorca) in spektrofotometrično izmerili

absorbanco v reakcijski zmesi pri valovni dolžini λ = 595 nm na UV-VIS spektrofotometru, s

programom Advanced reads. Za umeritev slepega vzorca smo uporabili 20 µL pufra pH =

7,3.

3.3.5.3 Izračun učinkovitosti imobilizacije

Učinkovitost imobilizacije nam pove, koliko encima se je vezalo na površino magnetnih

nanodelcev v postopku imobilizacije. Izračunamo jo po enačbi:

𝜑 =(𝑐𝑖−𝑐𝑠)∗𝑉𝑣𝑧𝑜𝑟𝑒𝑐

𝑚𝑛 [3.2]


36

kjer so:

φ - koncentracija imobiliziranega encima [mgencim/gnosilec],

ci - koncentracija prostega encima [mg/mL],

cs - koncentracija encima v supernatantu in v spiranjih [mg/mL],

Vvzorec - volumen vzorca [mL] in

mn - masa nosilca (magnetnih mikro- in nanodelcev) [g].

Relativno učinkovitost ρ [%] določimo po naslednji enačbi:

𝜌 =(𝑐𝑖−𝑐𝑠)∗100

𝑐𝑖 [3.3]

kjer so:

ρ - učinkovitost imobilizacije [%],

ci - koncentracija prostega encima [mg/mL],

cs - koncentracija encima v supernatantu in v spiranjih [mg/mL].

3.3.6 MERJENJE SPECIFIČNE AKTIVNOSTI ENCIMA HOLESTEROL

OKSIDAZE

Aktivnost proste in imobilizirane ChOx smo določili v reakcijski zmesi, ki je vsebovala 400

μL vodne raztopine natrijevega acetata (100 mM, pH 5) in 100 μL raztopine holesterola (0,5

% (w/v)) kot substrata za biokatalizator ChOx. Reakcijsko zmes smo dali na stresalnik in

segreli na temperaturo 37 °C. Nato smo dodali 500 μL suspenzije imobiliziranega

biokatalizatorja na magnetnem nanonosilcu (γ-Fe2O3-CH/ChOx) neposredno v reakcijsko

zmes. V slepi vzorec smo dodali 500 μL raztopine natrijevega fosfata (10 mM, pH 7,3). Pri

temperaturi 37 °C smo nastalo zmes stresali na stresalniku 30 minut.

Med reakcijo oksidacije holesterola se sprosti produkt 4-holesten-3-on, zato smo morali v

reakcijsko zmes dodati po 30 minutah še 3 mL 99,8 % etanola za zaustavitev reakcije.

Suspenzijo smo nato centrifugirali 2 minuti pri 10000 rpm in tekočo fazo supernatantna (1


37

mL) uporabili za določitev koncentracije produkta pri valovni dolžini λ = 243 nm na UV-VIS

spektrofotometru.

Aktivnost imobiliziranega biokatalizatorja je bila podana v obliki relativne aktivnosti, izražena

v odstotkih [%] in določena na osnovi primerjave aktivnosti prostega encima ChOx.

3.3.6.1 Računanje specifične aktivnosti encima holesterol oksidaze

Ena encimska enota (U/mLencim) je definirana kot količina biokatalizatorja (v našem primeru

ChOx), ki pretvori med katalitsko reakcijo 1 μmol holesterola v ketonski produkt 4-holesten-

3-on pri vrednosti pH = 5 in temperaturi 37 °C v času 30 minut.

Specifična aktivnost proste in imobilizirane ChOx je bila izračunana po naslednji enačbi:

𝑈/𝑚𝐿𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 =𝐴243 𝑛𝑚 𝑣𝑧𝑜𝑟𝑒𝑐−𝐴243 𝑛𝑚 𝑠𝑙𝑒𝑝𝑖 𝑣𝑧𝑜𝑟𝑒𝑐∗𝑉𝑟𝑒𝑎𝑘𝑐𝑖𝑗𝑠𝑘𝑒 𝑧𝑚𝑒𝑠𝑖∗df

𝑡𝑟𝑒𝑎𝑘𝑐𝑖𝑗𝑒∗𝜀∗𝑉𝑣𝑧𝑜𝑟𝑐𝑎 [3.4]

kjer so:

A243nm vzorec - absorbanca vzorca pri 243 nm [/]

A243nm slepi vzorec - absorbanca slepega vzorca pri 243 nm [/]

Vreakcijske zmesi - volumen reakcijske zmesi [mL]

df - razredčitveni faktor [/]

treakcija - čas reakcije [min]

ɛ - molarni ekstinkcijski koeficient [M-1cm-1mL]

Vvzorca - volumen dodanega vzorca (prostega ali imobiliziranega encima)

[mL]

Relativno aktivnost encima ChOx smo izračunali po naslednji enačbi:

(𝐴

𝐴0, %) =

𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖č𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑖𝑟𝑎𝑛𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎

𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖č𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎∗ 100 % [3.5]


38

3.3.7 MERJENJE SPECIFIČNE AKTIVNOSTI ENCIMA CELULAZE

Aktivnost prostega in imobiliziranega encima celulaze v obliki zamreženih encimskih

skupkov smo določili spektrofotometrično z merjenjem absorbance na UV-VIS

spektrofotometru s programom Kinetics pri valovni dolžini λ = 340 nm. K reakcijski zmesi

reagenta B (Sigmacell cellulose, 4 mL) smo dodali 1 mL encimskega vzorca prostega

encima ali encimskega vzorca zamreženih encimskih skupkov oziroma pufer (PBS, 10 mM,

pH 7,3), ki je služil kot slepi vzorec. Reakcijsko zmes smo postavili v stresalnik, ki smo ga

predhodno termostatirali na 37 °C, za določen čas, 2 uri. Po končanem stresanju smo

testne centrifugirke z reakcijsko zmesjo postavili v ledeno kopel in centrifugirali dvakrat po

2 minuti pri 11000 obratih. Supernatant smo uporabili za merjenje absorbance na UV-VIS

spektrofotometru, tako da smo mu dodali 750 µL reagenta D-glukoza in izmerili absorbanco

pri valovni dolžini λ = 340 nm pri času 2,5 min.

3.3.7.1 Računanje specifične aktivnosti encima celulaze

Specifično aktivnost encima celulaze smo izračunali po enačbi:

𝑈/𝑚𝐿𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 =𝐴340 𝑛𝑚∗𝑉𝑟𝑒𝑎𝑘𝑐𝑖𝑗𝑠𝑘𝑒 𝑧𝑚𝑒𝑠𝑖∗df

ε∗2∗𝑉𝑣𝑧𝑜𝑟𝑐𝑎∗𝑉𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑛𝑎𝑡𝑎𝑛𝑡𝑎 [3.6]

kjer so:

A340 nm - absorbanca vzorca pri 340 nm [/]

Vreak.zmesi - volumen reakcijske zmesi [mL]

df - razredčitveni faktor [/]

ɛ - milimolarni ekstinkcijski koeficient ß-NADH pri 340nm

2 - faktor pretvorbe iz 2 ur na 1 uro na enoto/mL encima

Vvzorca - volumen vzorca na začetku reakcije [mL]

Vsupernatanta - volumen supernatanta [mL]

Relativno aktivnost encima celulaze smo izračunali po enačbi:

(𝐴

𝐴0, %) =

𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖č𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝐶𝐿𝐸𝐴𝑠

𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖č𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎∗ 100 % [3.7]


39

4 REZULTATI IN DISKUSIJA

4.1 IMOBILIZACIJA ENCIMA HOLESTEROL OKSIDAZA NA

MAGNETNI NOSILEC

4.1.1 SINTEZA MAGNETNIH NANODELCEV

Za sintezo superparamagnetnih nanodelcev obstaja širok nabor metod, kot so:

koprecipitacija, koprecipitacija v reverznih mikro emulzijah, hidrotermalna sinteza, sol-gel,

citratni prekurzor, mehansko mletje in sonokemijska sinteza. V okviru doktorske disertacije

smo sintetizirali superparamagnetne nanodelce iz maghemita z metodo koprecipitacije

železovih ionov, ki smo jih nato modificirali s slojem hitozana. Funkcionalizacija magnetnih

nanodelcev s hitozanom je potekala po treh različnih metodah: postopku mikroemulzije

(MC1), postopku suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2) in postopku kovalentne vezave

hitozana (MC3). Z namenom stabilizacije magnetnih nanodelcev, smo te prevlekli s slojem

hitozana. Zanj smo se odločili zaradi edinstvenih bioloških in fizikalno-kemijskih lastnosti, ki

so ključne pri sintezi primernega nosilca za imobilizacijo encimov. Ena izmed najbolj

zaželenih lastnosti je njegova biorazgradljivost in prisotnost reaktivnih kemijskih skupin, kot

sta –OH in NH2 [24]. Zaradi tega so hitozan in njegovi derivati vsesplošno uporabni na

področju farmacije in biotehnologije [70]. Prvotno se je hitozan kot biomaterial uporabljal za

tkivno inženirstvo kot ogrodje za regeneracijo tkiv. Iz hitozana je mogoče s kemičnimi

modifikacijami pridobiti širok spekter derivatov, ki so uporabni za najrazličnejše namene.

Med drugim je hitozan znan kot dober nosilec za imobilizacijo encimov zaradi njegovih

lastnosti, kot so hidrofilnost, biokompatibilnost, biorazgradljivost in proti bakterijske lastnosti

[71].

Rezultat doktorske disertacije je bila uspešna sinteza magnetnih nanodelcev iz maghemita

modificiranih s slojem hitozana in uspešna imobilizacija encima holesterol oksidaze na

magnetne nanodelce. Z optimiranjem procesnih pogojev, kot so koncentracija encima,

koncentracija in sprememba vrste mrežnega povezovalca, sprememba hitrosti stresanja pri

imobilizaciji, smo želeli ugotoviti, kateri nosilci so pri določenih pogojih optimalni za uspešno

imobilizacijo encimov.

4.1.2 KARAKTERIZACIJA MAGNETNIH NANODELCEV

V študiji smo uporabili magnetne nanodelce maghemita, funkcionalizirane s slojem

hitozana. Velik pomen pri taki študiji pripisujemo lastnosti nosilcev, zato smo uporabili


40

številne analizne metode za ovrednotenje magnetnih in strukturnih lastnosti nosilcev

primernih za imobilizacijo encimov. V ta namen smo uporabili naslednje metode:

4.1.2.1 PRESEVNA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA (TEM)

Strukturo in velikost maghemitnih mikro- in nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom smo

opazovali s pomočjo transmisijske elektronske mikroskopije.

Vzorca maghemitnih nanodelcev prevlečenih s hitozanom po postopku mikroemulzije

(MC1) ni bilo mogoče pripraviti na TEM-mrežico, saj so se tako veliki aglomerati takoj

odstranili z mrežice, ki je relativno hidrofobna. Tako smo vzorec pripravili v mešanici

etanol/voda=1/1, kjer so bili delci 10x razredčeni. Z analizo TEM je bilo pri mikrodelcih MC1

težavno ovrednotiti tanke organske prevleke na površinah anorganskih nanodelcev. Slika 4-

1 prikazuje TEM-posnetek maghemitnih mikrodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po

postopku mikroemulzije (MC1). Organske prevleke iz lahkih atomov (C, O, N, H) so

praktično neopazne in pri analizi EDS nezaznavne. Vzorec MC1 se je pod snopom

elektronov vidno spreminjal, kar je posledica prisotnosti večjih količin organskega materiala,

ki se pod snopom cvre. V vzorcu lahko opazimo večje strukture (tudi mikronske in še večje),

ki so večinoma okroglih oblik in verjetno predstavljajo hitozan. Na tem področju analiza EDS

ni pokazala prisotnosti železa. Večinoma na robovih tega organskega materiala pa lahko

opazimo manjša temnejša področja, ki predstavljajo magnetne delce. Analiza EDS je na

tem področju pokazala prisotnost železa. Velikost teh anorganskih struktur (skupkov

magnetnih nanodelcev) je različna in večinoma znaša med 100 in 500 nm.


41

Slika 4-1: TEM posnetek maghemitnih mikrodelcev, funkcionaliziranih s hitozanom po postopku mikroemulzije (MC1)

Vzorec maghemitnih nanodelcev prevlečenih s hitozanom po postopku suspenzijske

zamreževalne tehnike (MC2) smo pripravili v mešanici etanol/voda=1/1, kjer so bili delci

10x razredčeni. Nanodelci so na mrežici TEM ležali večinoma na plasti ogljika in le redko na

luknjicah. Nanodelci so lepo kristalinični, podobno kot v vzorcu MC3. Pri manjši povečavi

lahko opazimo večja amorfna področja, v katerih so ujeti magnetni nanodelci. Hkrati pa

najdemo področja, kjer večjih amorfnih struktur ni opaziti (slika 4-2a). Na slikah pri večji

povečavi, kjer so nanodelci na luknjici (slika 4-2b), lahko opazimo tanke amorfne plasti

hitozana, ki najverjetneje zaobjamejo več nanodelcev v skupek.


42

Slika 4-2: TEM posnetek maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po postopku suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2)

Priprava vzorca maghemitnih nanodelcev prevlečenih s hitozanom po postopku kovalentne

vezave (MC3) in analiza sta potekala brez težav. Z analizo TEM je težavno ovrednotiti

organske prevleke na površinah anorganskih nanodelcev. Prevleke iz lahkih atomov (C, O,

N, H), so praktično neopazne in pri analizi EDS nezaznavne. Z vzorcem MC3 smo tako

dobili vse možne informacije o nanodelcih maghemita, kot hkrati tudi informacijo o izgledu s

hitozanom prevlečenih nanodelcev. Med sušenjem suspenzije nanodelcev (brez površinske

sterične stabilizacije) na TEM-mrežici se ti navadno precej aglomerirajo (velja večinoma za

vodne suspenzije). Pri vzorcu MC3 so nanodelci relativno dobro ločeni, kar nakazuje na

prisotnost prevlek hitozana, ki zagotavljajo delcem sterično stabilizacijo.

Rezultati analize EDS so pokazali atomske odstotke (Fe in O)=(40 % in 60 %), kar je

primerljivo s podatki o maghemitu. Analiza EDS je bila posneta na področju označenim z

modrim kvadratom na sliki 4-3a.

Na sliki 4-3b je posneta difrakcija, ki kaže kristaliničnost nanodelcev. Posneta je bila na

področju označenim z modrim kvadratom na sliki 4-3a.

Na sliki 4-3c lahko opazimo mrežne slike kristaliničnih nanodelcev, poleg tega pa tudi

amorfne plasti hitozana (označeno s puščico), ki obdajajo magnetne nanodelce.

Na sliki 4-3d je prikazan histogram porazdelitve velikosti nanodelcev iz posnetkov TEM, kjer

gre za ekvivalentne premere nanodelcev (predpostavka, da so delci okrogli). Ekvivalentni

premer nanodelcev znaša 9,1 ± 2,2 nm (N= 152) za MC3.


43

Slika 4-3: TEM posnetek maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po postopku kovalentne vezave (MC3)

4.1.2.2 VRSTIČNA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA (SEM)

Morfologijo vzorcev smo opazovali s pomočjo elektronskega vrstičnega mikroskopa (SEM).

Vzorce za vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) sestavljene iz posušenih maghemitnih

nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh postopkih smo postavili na bakreno

mrežico in jih posuli z zlatom. Z vrstičnim elektronskim mikroskopom smo pregledali vzorce

maghemita, MC1, MC2 in MC3 pri od 400- do 120.000-kratnih povečavah ter pri napetosti

od 5,0 do 15,0 kV na naključno izbranih mestih.

Iz posnetkov SEM na sliki 4-4 je razvidno, da imajo magnetni mikro- in nanodelci značilno

sferično obliko in so dobro kristalizirani. Razpon velikosti mikro- in nanodelcev smo s SEM

analizo določili za MC1 med 40-350 µm, za MC2 10-50 µm ter za MC3 50-100 nm.

Opazimo lahko, da je bila z nanosom hitozana zagotovljena stabilizacija magnetnih

nanodelcev in učinkovita preprečitev aglomeracije nanodelcev ter nadaljnja rast teh.

Prevlečene nanodelce lahko dispergiramo v organskih topilih, kar še poveča njihovo

uporabnost [13].


44

Pri funkcionalizaciji po metodi mikroemulzije in suspenzijske zamreževalne tehnike so delci

večji, saj uporabimo pri sintezi večjo koncentracijo hitozana. Koncentracija hitozana je torej

zelo pomemben dejavnik, ki vpliva na stopnjo spremembe površinske morfologije in na

velikost γ-Fe2O3-CH, ki je posledično odvisna od debeline sloja hitozana in od vrste

postopka funkcionalizacije hitozana.

Slika 4-4: SEM posnetki a) maghemita, b) MC1, c) MC2 in d) MC3 mikro- in nanodelcev

4.1.2.3 ENERGIJSKO DISPERZIJSKA SPEKTROSKOPIJA (EDS)

Za ugotavljanje natančne elementarne analize maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih s

hitozanom po metodi mikroemulzije smo uporabili SEM-EDS-analizo. Slika 4-5 prikazuje

rezultate SEM-EDS-analize. S SEM-EDS-analizo smo preverili prisotnost dvo- in tri-

valentnega železa in kisik, ki so gradniki železovega oksida, maghemita ter ogljik in dušik, ki

gradita funkcionalni sloj iz hitozana. Na SEM-EDS-spektru so dobro vidni vrhovi vseh


45

iskanih elementov, ki smo jih želeli dokazati v vzorcu MC1. Vrh ogljika je visoko izražen, kar

nakazuje na homogeno prevleko maghemitnih nanodelcev s hitozanom.

Slika 4-5: SEM-EDS-elementarna analiza maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom (MC1)

4.1.2.4 TERMIČNA STABILNOST

Slika 4-6 prikazuje segrevalne krivulje termogravimetrične (TGA) in diferenčne termične

(DTA) analize, izmerjene za posušene maghemitne nanodelce, čisti hitozan, slika 4-7 pa

krivulje TGA in DTA-analize za maghemitne mikro- in nanodelce, funkcionalizirane s

hitozanom po treh različnih metodah (MC1, MC2 in MC3). V primeru čistega hitozana lahko

opazimo manjšo izgubo teže do temperature 300 °C. Ko nadalje povečamo temperaturo, se

pojavi večja izguba mase in opazimo lahko tudi eksotermne vrhove na DTA-krivulji, kar je

posledica oksidacije –CH3 skupin hitozana. Za maghemit je značilna visoka termična

stabilnost, kar je razvidno iz termične analize na sliki 4-6.


46

Slika 4-6: TGA-DTA-meritev maghemita in čistega hitozana v zraku

Maghemitni nanodelci funkcionalizirani s hitozanom po postopku mikroemulzije (MC1),

suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2) in kovalentne vezave (MC3) so dokaj stabilni do

temperature 250 °C. Nadaljnjemu segrevanju preko teh temperatur pa sledi večja izguba

mase (TGA-krivulja), kar pomeni termično razgradnjo hitozana. V primerjavi z MC2 in MC3

se pojavi pri delcih MC1 večji razpad, kar je posledica večje količine hitozana in s tem

vezana večja prisotnost organskih funkcionalnih skupin.


47

Slika 4-7: TGA-DTA-meritev maghemitnih mikro- in nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh različnih postopkih (MC1, MC2 in MC3)

S termogravimetrično analizo maghemitnih delcev, funkcionaliziranih s hitozanom, smo

določili izgubo mase (slika 4-8), ki je za vzorec MC1 znašala 60,6 %, za vzorec MC2 28,8 %

in za vzorec MC3 le 22,2 %. Približno 9 % je bila izguba fizikalno adsorbirane vode, ostanek

pa je bila razgradnja hitozana vezanega na maghemitne nanodelce po treh različnih

postopkih.


48

Slika 4-8: Izguba mase hitozana pri vzorcih MC1, MC2 in MC3

4.1.2.5 RENGENTSKA PRAŠKOVNA DIFRAKCIJA (XRD)

Maghemitne nanodelce in maghemitne nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po

postopku suspenzijske zamreževalne tehnike smo okarakterizirali z rentgensko praškovno

difrakcijo (XRD). Difraktogram na sliki 4-9 prikazuje šest temeljnih pikov (220), (311), (400),

(422), (511) in (440), ki so značilni za maghemit (γ-Fe2O3), saj je ujemanje uklonskih

maksimumov skladno z maksimumi maghemita iz podatkovne baze. V primerjavi z

difraktogramom maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po postopku

suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2) lahko opazimo zmanjšanje intenzitete pikov

zaradi prisotnosti hitozanske funkcionalne prevleke.


49

Slika 4-9: Primerjava difraktograma maghemita in maghemitnih nanonodelcev funkcionaliziranih s hitozanom (MC2)

4.1.2.6 MERJENJE VELIKOSTI DELCEV Z DINAMIČNIM SIPANJEM

LASERSKE SVETLOBE (DLS) IN LASERSKIM

GRANULOMETROM

V disperzijah imamo navadno delce različnih velikosti, zato jim določamo povprečne

velikosti in analiziramo krivulje porazdelitve velikosti delcev. Zaradi velikega razpona v

velikosti mikro- in nanodelcev smo uporabili dve različni metodi za merjenje velikosti delcev

in porazdelitev velikosti.

S pomočjo dinamičnega sipanja laserske svetlobe (DLS) smo določili porazdelitev velikosti

sintetiziranih nanodelcev s pomočjo Brownovega gibanja v suspenzijah. Metodo

dinamičnega sipanja laserske svetlobe smo uporabili za določitev velikosti magnetnih

maghemitnih nanodelcev ter za magnetne maghemitne nanodelce funkcionalizirane s

hitozanom z metodo kovalentne vezave (MC3).


50

Slika 4-10: Grafično prikazana porazdelitev velikosti delcev maghemita

Na sliki 4-10 je predstavljen histogram porazdelitve velikosti magnetnih maghemitnih

nanodelcev. Kot lahko vidimo iz grafičnega prikaza na sliki 4-10, smo sintetizirali magnetne

maghemitne nanodelce z ozko porazdelitvijo delcev in povprečno velikostjo 22,78 nm.


51

Slika 4-11: Grafično prikazana porazdelitev velikosti delcev maghemita funkcionaliziranega s hitozanom po postopku kovalentne vezave (MC3)

Velikost magnetnih nanodelcev maghemita funkcionaliziranih s hitozanom po postopku

kovalentne vezave (MC3) smo določili tako, da smo jih dispergirali v deionizirani vodi ter s

pomočjo metode dinamičnega sipanja laserske svetlobe (DLS) izmerili povprečno velikost

nanodelcev. Iz rezultatov na sliki 4-11 lahko ugotovimo, da imajo nanodelci maghemita

funkcionaliziranih s hitozanom (MC3) ozko porazdelitev velikosti s povprečno vrednostjo

velikosti 58,77 nm. V primerjavi z maghemitnimi nanodelci lahko ugotovimo, da je razlika v

velikosti magnetnih nanodelcev, funkcionaliziranih s hitozanom, posledica nanosa hitozana

na magnetni nosilec, kar privede do večje povprečne velikosti MC3 nanodelcev.

Ugotavljamo, da koncentracija hitozana vpliva na velikost magnetnih mikro in nano-delcev

funkcionaliziranih s hitozanom. Sklepamo, da pride prav tako pri magnetnih nanodelcih,

funkcionaliziranih s hitozanom po postopku mikroemulzije (MC1) do večslojnega nanosa

hitozana, kar vpliva na povečano velikost mikrodelcev.


52

Slika 4-12: Grafično prikazana porazdelitev velikosti delcev maghemita funkcionaliziranega s hitozanom po postopku mikroemulzije (MC1) in suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2)

Velikost magnetnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po postopku mikroemulzije

(MC1) in suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2) ter njihovo porazdelitev velikosti smo

izmerili s pomočjo laserskega granulometra, ki deluje po principu laserske difrakcijske

spektroskopije na osnovi mokre metode, v velikostnem območju od 0,3 do 300 µm. S slike

4-12, ki prikazuje grafični prikaz porazdelitve velikosti MC1 in MC2 delcev, lahko ugotovimo,

da je povprečna velikost delcev MC1 v območju 40-350 µm s povprečnim premerom 68,53

µm s široko porazdelitvijo velikosti delcev. Prav tako lahko s slike 4-12 ugotovimo, da imajo

delci MC2 široko porazdelitev velikosti v razponu 10-50 µm s povprečnim premerom 44,21

µm. Meritve velikosti delcev, izmerjenih z metodo DLS in laserskim granulometrom, so v

skladu z meritvami analize SEM.


53

4.1.2.7 MERJENJE SPECIFIČNE MAGNETIZACIJE (VSM)

Magnetne meritve, ki so prikazane na sliki 4-13, smo merili s pomočjo vibracijskega

magnetometra (VSM). Magnetizacijske krivulje maghemita, maghemitnih nanodelcev,

funkcionaliziranih s hitozanom po postopku mikroemulzije (MC1), suspenzijske

zamreževalne tehnike (MC2) in kovalentne vezave (MC3), so tipične za

superparamagnetne nanodelce, saj sta remanenca in koercitivnost nič in ni histerezne

zanke. Hkrati pa proces magnetenja in razmagnetenja delcev opisuje isto krivuljo. Vrednosti

nasičene magnetizacije vzorcev se gibljejo od 4 do 67,5 emu/g. Nasičena magnetizacija

maghemitnih nanodelcev znaša 67,5 emu/g, magnetnih mikrodelcev prevlečenih s

hitozanom po postopku suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2) 44,1 emu/g, magnetnih

nanodelcev prevlečenih s hitozanom po postopku kovalentne vezave (MC3) 14,2 emu/g in

magnetnih mikrodelcev prevlečenih s hitozanom po postopku mikroemulzije (MC1) le 4,0

emu/g.

Slika 4-13: VSM vzorcev maghemita, MC1, MC2 in MC3


54

Magnetne nanodelce smo z namenom stabilizacije in funkcionalizacije prevlekli s slojem

hitozana. Iz rezultatov je razvidno, da ima površinska modifikacija magnetnih nanodelcev s

hitozanom velik vpliv na magnetne lastnosti nosilcev maghemita [72]. Koncentracija

hitozana, s katerim smo izvedli funkcionalizacijo magnetnih nanodelcev, vpliva na nasičeno

magnetizacijo funkcionaliziranih magnetnih nanodelcev in jo z višanjem koncentracije

hitozana znižuje. Tako lahko ugotovimo, da večji kot so delci, debelejši je sloj hitozana, in s

tem se tudi zmanjša nasičena magnetizacija magnetnih nanodelcev funkcionaliziranih s

hitozanom. Nasičena magnetizacija za prevlečene magnetne nanodelce s hitozanom je

veliko manjša, še posebno pri vzorcu MC1 in je močno upadla zaradi nemagnetne narave

hitozana in debeline sloja hitozanske prevleke. Magnetni nanodelci, funkcionalizirani s

hitozanom MC1, so zaradi nizkih magnetizacij nanodelcev manj uporabni, zato lahko

trdimo, da bodo za nadaljnjo uporabo primernejši mikro- in nanodelci MC2, z najvišjo

stopnjo magnetizacije in MC3.

4.1.2.8 DOLOČANJE DOSTOPNIH AMINO SKUPIN S

POTENCIOMETRIČNO TITRACIJO

Na sliki 4-14 je podana množina amino skupin na površini hitozana in s hitozanom

prevlečenih magnetnih nanodelcev po treh različnih metodah: metodi mikroemulzije (MC1),

metodi suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2) in metodi kovalentne vezave (MC3);

določenih s potenciometrično titracijo. Iz slike 4-14 je razvidno, da ima najvišjo vsebnost

dostopnih amino skupin hitozan, in sicer 4,22 mmol/g hitozana. Po funkcionalizaciji

magnetnih nanodelcev s hitozanom se vsebnost amino skupin zmanjša. Najvišjo

koncentracijo dostopnih amino skupin dobimo pri magnetnih nanodelcih funkcionaliziranih s

hitozanom z metodo kovalentne vezave (MC3), ki znaša 2,48 mmol/g. Pri magnetnih

nanodelcih funkcionaliziranih s hitozanom z metodo mikroemulzije (MC1) znaša 1,18

mmol/g in pri magnetnih nanodelcih funkcionaliziranih s hitozanom z metodo suspenzijske

zamreževalne tehnike le 0,02 mmol/g. Pozitiven naboj na površini magnetnih nanodelcev je

posledica adsorpcije hitozana na magnetne nanodelce in dostopnosti njegovih aminskih

skupin. Tako je mogoče sklepati, da ima hitozan najvišjo afiniteto vezave na magnetne

nanodelce prevlečene s hitozanom z metodo kovalentne vezave (MC3), najmanjšo pa na

magnetne nanodelce prevlečene s hitozanom z metodo suspenzijske zamreževalne tehnike

(MC2). Razloge je moč iskati v fizikalno-kemijskih parametrih, predvsem pa v strukturnih

lastnostih nosilca in v metodah funkcionalizacije hitozana na površino magnetnih

nanodelcev. Fizikalne interakcije zajemajo elektrostatične, hidrofobne in afinitetne


55

interakcije in so še posebej uporabne pri vezavi molekul na nosilce nano velikosti.

Koncentracija prostih amino skupin hitozana na površini magnetnih nanodelcev je odvisna

od načina vezave hitozana na magnetni nosilec in orientacije molekule hitozana [73,74].

Slika 4-14: Koncentracija amino skupin na površini hitozana, MC1, MC2 in MC3 določenih s potenciometrično titracijo

4.1.2.9 FOURIEROVA TRANSFORMACIJSKA INFRARDEČA


Tipične funkcionalne skupine, prisotne na hitozanu in magnetnih nanodelcih ter na

magnetnih mikro- in nanodelcih, funkcionaliziranih s hitozanom po treh metodah (MC1,

MC2 in MC3) smo želeli dokazati s pomočjo FTIR-spektroskopije.

Slika 4-15 prikazuje primerjavo IR spektrov med hitozanskim prahom (a) in magnetnimi

nanodelci maghemita (b). Signali na področju valovnih dolžin med 3200-3500 cm-1 (3410

cm-1) so značilni za natezne vibracije hidroksilnih skupin –OH hitozanske skupine, pri 1654

cm-1 pa C=O-NH-CH3 amidne I vezi. Absorpcija pri 1377 cm-1 je povezana z nateznimi

vibracijami C-H metilne skupine (C-CH3). Absorpcija pri valovnem številu 1032 cm-1


56

prikazuje aminske C-O-C natezne vibracije ß(1-4) glikozidne vezi ter natezne vibracije C-H

metilne skupine (-CH2) pri 2877 cm-1.

IR spekter magnetnih nanodelcev maghemita prikazuje slika 4-15b, kjer karakteristični vrh

pri 570 cm-1 in 628 cm-1 nakazuje prisotnost Fe-O vezi. Signal pri 2368 cm-1 kaže prisotnost

ogljikovega dioksida v zraku [75].

Slika 4-15: FTIR-spektra vzorcev a) hitozana in b) magnetnih nanodelcev

Določitev prisotnosti vezanega hitozana na magnetne nanodelce je razvidna s slike 4-16,

kjer so vidni spektri magnetnih nanodelcev, funkcionaliziranih s hitozanom po treh različnih

metodah: metodi mikroemulzije (MC1), suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2) in

kovalntne vezave (MC3).

Vezavo hitozana na magnetne nanodelce smo potrdili s FTIR-tehniko. IR-spekter

magnetnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom kaže podoben vzorec signalov, kot se

je pojavil pri IR-spektru hitozana in maghemita. Absorpcijski vrh, ki je značilen za natezne

vibracije hidroksilnih skupin –OH hitozanske skupine, se je z vezavo hitozana na magnetne

nanodelce iz 3410 cm-1 premaknil na 2924 cm-1. Signal med 2362 - 2366 cm-1 kaže

prisotnost ogljikovega dioksida v zraku. Če primerjamo vse tri spektre med seboj, opazimo,


57

da absorpcijski vrh pri 1653 cm-1 nakazuje prisotnost hitozana vezanega na magnetne

nanodelce, saj je značilen za natezne vibracije C=O-NH-CH3 amidne I vezi [73]. Prav tako

se je signal pri vezavi hitozana na magnetne nanodelce iz 1377 cm-1, povezan z nateznimi

vibracijami C-H metilne skupine (C-CH3), premaknil na 1386 cm-1 pri MC3 nanodelcih in na

1458 cm-1 in 1456 cm-1 pri MC2 in MC1 mikro- in nanodelcih. Absorpcijski vrhovi pri MC1,

MC2 in MC3 spektrih med 567-669 cm-1 dokazujejo prisotnost Fe-O vezi magnetnih

nanodelcev. Če primerjamo spektre MC1, MC2 in MC3 med seboj, opazimo zmanjšanje

intenzitete določenih pikov, predvsem pri prisotnosti Fe-O vezi, kar lahko pripišemo debelini

sloja hitozana. Debelina sloja hitozana je pri MC1 mikrodelcih največja, zato je absorpcijski

vrh, ki dokazuje prisotnost maghemita, nižji kot pri ostali dveh spektrih MC2 in MC3.

Slika 4-16: FTIR-spekter magnetnih nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh razlčinih postopkih a) MC1, b) MC2 in c) MC3


58

4.1.2.10 TOKSIKOLOŠKO TESTIRANJE HITOZANA IN MAGNETNIH

MIKRO- IN NANODELCEV

S toksikološkim testiranjem hitozana, magnetnih nanodelcev in magnetnih mikro- in

nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh postopkih smo želeli proučiti vpliv

magnetnih mikro- in nanodelcev, prevlečenih s funkcionalno plastjo hitozana na rast

mikrobioloških kultur Escherichia coli (slika 4-17) in Sacharomyces cerevisiae (slika 4-18).

Antimikrobno delovanje smo preverjali z inhibicijo rasti bakterijske in glivne kulture na

hranilnem agarju z dodanim hitozanom, maghemitom in magnetnimi mikro- in nanodelci,

funkcionaliziranimi s hitozanom po treh različnih metodah (MC1, MC2 in MC3), kjer smo

spremljali rast bakterije oz. glive in to primerjali z rastjo bakterije oz. glive na delu hranilnega

agarja, ki vzorcev ni vseboval in je služil kot kontrola.

Z namenom, da bi ugotovili kako vpliva količina nanešenega vzorca hitozana, maghemita in

maghemitnih nanodelcev funkcionaliziranih po treh različnih postopkih na rast

mikrobioloških kultur, smo na hranilni agar premazan z mikrobiološko kulturo, nanesli večjo

in manjšo količino vzorca. Ugotovili smo, da količina hitozana, maghemita in maghemitnih

nanodelcev funkcionaliziranih s plastjo hitozana po treh različnih postopkih MC1, MC2 in

MC3, ne vpliva na rast mikrobioloških kultur E. coli in S. cerevisiae, kar je razvidno iz slik 4-

17 in 4-18.

S toksikološkim testiranjem smo dokazali, da hitozan, maghemit in magnetni mikro- in

nanodelci ne inhibirajo rasti kvasovke Sacharomyces cerevisiae in Gram negativne

bakterije Escherichie coli, kar pomeni, da bi se lahko magnetni nanodelci prevlečeni s

funkcionalno plastjo hitozana uporabili za biološke aplikacije. Iz rezultatov lahko ugotovimo,

da magnetni nanodelci, magnetni nanodelci prevlečeni s funkcionalno plastjo hitozana po

treh različnih metodah ter hitozanski prah nimajo toksikološkega vpliva na izbrane

mikrokulture. Velikost delcev in njihova oblika sta pomembna dejavnika biokompatibilnosti.

Prav tako lahko tudi površinske prevleke omejijo citotoksičnost [76].

Obstaja nekaj študij o toksičnosti nanodelcev hitozana brez magnetnega nosilca, ki

poročajo o bioloških interakcijah med človeškimi jetrnimi celicami ter hitozanom in so jih v

splošnem označili kot biokompatibilne [77]. Študije toksičnih učinkov, ki določajo toksičnost

magnetnih nanodelcev prevlečenih s hitozanom, so bile izvedene na mišjih embrionalnih

fibroblastih celične linije z uporabo metode MTT – test za določanje preživetja celičnih linij

[78].


59

Slika 4-17: Rezultati toksikološkega testiranja na Escherichia coli

Slika 4-18: Rezultati toksikološkega testiranja na Sacharomyces cerevisiae


60

4.1.3 IMOBILIZACIJA ENCIMA

Holesterol oksidaza (ChOx, E.C.1.1.3.6) je flavoprotein, ki katalizira reakcijo oksidacije

holesterola v holestenon s sočasnim zmanjšanjem molekularnega kisika do vodikovega

peroksida. Pogosto se uporablja pri ugotavljanju holesterola v kliničnih in bioloških vzorcih,

pri biotransformacijah sterolov, optični ločljivosti alilnih alkoholov, biosintezi antimikotičnih

antibiotikov in pri zatiranju škodljivcev [79].

Številne študije pričajo o imobilizaciji različnih encimov na magnetne nanodelce,

funkcionalizirane s hitozanom. Avtorji Ahmad in Goswami (2014), Yapar, Kayahan, Bozkurt

in Toppare (2009), Li, Xie, Wang, Meng in Zhang (2015), Singh, Srivastava, Kalita in

Malhotra (2012) opisujejo imobilizacijo ChOx na hitozanske nosilce. Tako so imobilizirali

ChOx s kovalentno vezavo na hitozanske kroglice [47], z namenom uporabe pri reakciji

biotransformacije proizvodnje farmacevtsko pomembnega holestenona, v zamrežen sistem

hitozana in alginske kisline [49], na stekleno ogljikovo elektrodo, funkcionalizirano s hitozan-

grafen nanokompoziti [50] in na NiFe2O4/CuO/FeO-hitozanski nanokompozit [51].

Encimi se za reakcije biotransformacije običajno uporabljajo v imobilizirani obliki zaradi

njihovih prednosti v primerjavi s prosto obliko encima, kot sta: lažje rokovanje in ponovna

uporaba, ki je ključnega pomena z ekonomskega vidika [53]. ChOx je bila imobilizirana na

številne podporne materiale, vendar pa je poudarek na biokompatibilnih, biorazgradljivih in

nizkocenovnih materialih, kot je hitozan, ki se lahko uporablja v industrijske namene [49,80].

V okviru raziskovalnega dela imobilizacije ChOx na magnetne nanodelce prevlečene s

funkcionalno plastjo hitozana po treh metodah smo s spreminjanjem procesnih pogojev, kot

so koncentracija encima, koncentracija in vrsta mrežnega povezovalca glutaraldehida ali

pentaetilen heksamina ter hitrost stresanja, želeli ugotoviti, kako se spreminja učinkovitost

imobilizacije encima ter kolikšen delež njegove aktivnosti se pri tem ohrani v primerjavi s

prostim encimom. Imobilizacijo ChOx smo izvedli na magnetne nanodelce prevlečene s

funkcionalno plastjo hitozana po treh različnih metodah: po metodi mikroemulzije,

suspenzijske zamreževalne tehnike in kovalentne vezave. Hkrati smo želeli preveriti, kako

na učinkovitost imobilizacije vpliva modifikacija površine nanodelcev in določiti

najprimernejši mikro- ali nanonosilec za tovrstne aplikacije. Stabilnost imobiliziranega

encima smo določili s poskusi večkratne uporabe imobiliziranega encima v primerjavi s

prostim encimom.


61

4.1.4 VPLIV KONCENTRACIJE GLUTARALDEHIDA

Za določitev vpliva koncentracije mrežnega povezovalca GA na učinkovitost imobilizacije in

ohranjeno aktivnost encima ChOx smo uporabili GA v koncentracijskem območju 1-3 %

(v/v). Čas imobilizacije je bil 24 ur pri stresanju 300 rpm na stresalniku Heidolph Unimax

1010. Koncentracija encima je bila 0,1 mg/mL.

Slika 4-19: Učinkovitost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od spremembe koncentracije GA

Na magnetne mikro- in nanodelce smo imobilizirali encim ChOx, pri čemer smo uporabili

različne koncentracije mrežnega povezovalca glutaraldehida. Najvišjo učinkovitost

imobilizacije smo dosegli z uporabo GA s koncentracijo 1 % (v/v), pri magnetnih nanodelcih

funkcionaliziranih s hitozanom po postopku suspenzijske zamreževalne tehnike (MC2), in

sicer 68,19 %, najnižjo pa pri magnetnih nanodelcih funkcionaliziranih s hitozanom po

metodi mikroemulzije (MC1) z vrednostjo 46,38 %. Nižjo učinkovitost imobilizacije ChOx

smo dosegli pri MC1, hkrati pa predvidevamo, da so se nanodelci združili v večje

aglomerate in se je tako zmanjšala površina, ki je bila razpoložljiva za vezavo encima [81].

Pri nanodelcih pripravljenih po 3. postopku (MC3) smo dobili nekoliko nižjo učinkovitost

imobilizacije, in sicer 64,18 %.


62

Pri uporabi GA s koncentracijo 2 % (v/v) je bila učinkovitost imobilizacije najnižja, pri MC1

25,38 %, pri dodatku GA s koncentracijo 3 % (v/v) pa 33,75 %. Pri imobilizaciji ChOx na

MC2 je ob uporabi GA s koncentracijo 2 % (v/v) učinkovitost imobilizacije znašala 20,29 %,

medtem ko se je učinkovitost imobilizacije pri dodatku GA s koncentracijo 3 % (v/v) zvišala

na 48,90 %. Pri MC3 se je pri dodatku GA s koncentracijo 2 % (v/v) učinkovitost

imobilizacije zmanjšala za 15,91 %, pri dodatku GA s koncentracijo 3 % (v/v) pa za 44,48 %

(slika 4-19).

Slika 4-20: Ohranjena aktivnost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od spremembe koncentracije GA

Ohranjene aktivnosti imobiliziranega encima ChOx so bile nizke pri uporabi GA s

koncentracijo 1,2 in 3% (v/v), iz česar lahko sklepamo, da je potrebna nadaljnja optimizacija

postopka imobilizacije. Aktivnost se je tako najbolje ohranila v primeru vezave encima na

maghemitne nanodelce funkcionalizirane s hitozanom s suspenzijsko zamreževalno tehniko

(MC2) pri koncentraciji GA 1% (v/v). Najvišja ohranjena aktivnost encima, vezanega na

MC1 je bila 4,70 %, za MC2 23,76 % in za MC3 9,07 %. Pri ostalih koncentracijah GA smo

dobili nižje vrednosti ohranjene aktivnosti, kar prikazuje slika 4-20.


63

Aktivacijo magnetnih mikro- in nanodelcev funkcionaliziranih s hitozanom po treh postopkih

smo izvedli pred postopkom imobilizacije encima ChOx z različnimi koncentracijami GA (1,

2 in 3 %) (v/v), saj smo tako zmanjšali vpliv spremembe kemijske strukture encima.

Pri nižji koncentraciji GA je hitrost reakcije zamreženja površine nosilca z GA nižja, pri višjih

uporabljenih koncentracijah mrežnega povezovalca pa je prišlo do denaturacije encima,

zato je bila imobilizacija encima na nosilec neučinkovita [82]. S povišanjem koncentracije

GA aktiviramo večjo površino nosilca, kamor se s kovalentno vezavo veže encim, vendar pa

lahko previsoka koncentracija GA pomeni nižjo učinkovitost imobilizacije. Zato smo za

nadaljnje raziskave uporabljali GA s koncentracijo 1 % (v/v).

Ugotavljamo, da se pojavi pri višjih koncentracijah mrežnega povezovalca znižanje

ohranjene aktivnosti imobiliziranega encima. Deaktivacija oz. znižanje ohranjene aktivnosti

imobiliziranega encima se pojavi zaradi prisotnosti glutaraldehida in hkrati večslojnega

prekrivanja molekul glutaraldehida, ki omejujejo prosta aktivna mesta imobiliziranega

encima in vodi do znižanja ohranjene aktivnosti imobiliziranega encima.

4.1.5 VPLIV HITROSTI STRESANJA

Za določanje vpliva hitrosti stresanja na učinkovitost imobilizacije in aktivnost

imobiliziranega encima ChOx smo stresanje na stresalniku prilagodili na 300, 500 in 1400

rpm. Čas imobilizacije je bil 24 ur in koncentracija mrežnega povezovalca GA 1 % (v/v), saj

smo predhodno dokazali, da smo pri tej koncentraciji dobili najvišjo učinkovitost imobilizacije

encima in najvišjo ohranjeno aktivnost vezanega encima. Hkrati smo imobilizacijo encima

izvedli tudi brez dodatka GA [83], da bi ugotovili, ali je vezava encima možna direktno na

proste amino skupine hitozana. Koncentracija encima je bila 0,1 mg/mL.


64

Slika 4-21: Učinkovitost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od hitrosti stresanja

Pri teh pogojih smo najvišjo učinkovitost imobilizacije dosegli za MC1 in MC2 s hitrostjo

stresanja 1400 rpm. Pri MC3 smo dobili najvišjo učinkovitost imobilizacije pri hitrosti

stresanja 300 rpm. Pri MC1 in MC2 smo dobili 100 % učinkovitost imobilizacije, saj so bile

izmerjene koncentracije proteinov v posameznih odpadnih tekočih fazah po postopku

izpiranja imobiliziranega encima enake 0. Nižjo učinkovitost imobilizacije smo dobili pri

MC3, in sicer 64,18 %.

Iz rezultatov na sliki 4-21 lahko ugotovimo, da ni velike razlike pri učinkovitosti imobilizacije

encima holesterol oksidaze pri nosilcih, kjer uporabimo GA, v primerjavi z nosilci, kjer GA

ne uporabimo. Iz tega lahko sklepamo, da je uporaba GA nepotrebna oz. jo je za doseganje

boljših rezultatov potrebno nadomestiti z drugim mrežnim povezovalcem, npr. pentaetilen

heksaminom.


65

Slika 4-22: Ohranjena aktivnost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od hitrosti stresanja

Aktivnost imobiliziranega in prostega encima ChOx smo določili z reakcijo oksidacije

holesterola. Aktivnost imobilizirane ChOx se je najbolje ohranila pri hitrosti stresanja 300

rpm pri vseh treh nosilcih MC1, MC2 in MC3. Kljub nižji učinkovitosti imobilizacije je pri tej

hitrosti stresanja ohranjena aktivnost najvišja, 24,31 % za MC2 in 23,76 % za MC2-GA. V

primeru MC2 in MC3 je vrednost ohranjene aktivnosti celo višja brez uporabe

glutaraldehida. Dodatno povečanje hitrosti stresanja zniža ohranjeno aktivnost

imobiliziranega encima, verjetno zaradi slabih interakcij med nosilcem in encimom [84].

Pri hitrosti stresanja 1400 rpm je bila ohranjena aktivnost encima vezanega na nanodelce

izredno nizka kljub visoki učinkovitosti imobilizacije. Najvišjo ohranjeno aktivnost smo dobili

pri MC1 z vrednostjo 15,24 %, kar je prikazano na sliki 4-22.


66

4.1.6 VPLIV VRSTE MREŽNEGA POVEZOVALCA

Pri imobilizaciji ChOx z uporabo glutaraldehida smo ugotovili, da je njegova uporaba

nepotrebna, saj z dodatkom GA nismo dosegli višje učinkovitosti imobilizacije in aktivnosti

imobiliziranega encima. Zato smo pri nadaljnji optimizaciji procesa imobilizacije uporabili

mrežni povezovalec pentaetilen heksamin (PEHA) s koncentracijo 0,02 M. Metoda z

uporabo PEHA temelji na nastanku vezave med nosilcem in PEHA preko epoksi skupine. Z

namenom, da bi izvedli kovalentno imobilizacijo encima pod blagimi pogoji na osnovi

polisaharidnega nosilca, je potrebna aktivacija nosilca. Številne oblike aktivacije se že

uporabljajo za vezavo proteina preko amino, tiolnih, aldehidnih ali karboksilnih skupin.

Odločitev o načinu aktivacije nosilcev temelji na dostopnih funkcionalnih skupinah na

površini nosilca in encima. Z aktiviranim nosilcem se lahko nato ustvari kovalentna

povezava med encimom in nosilcem, kar vodi do encimske imobilizacije [37].

Iz rezultatov optimiranja procesnih pogojev pri hitrosti stresanja 300 rpm smo ugotovili, da je

ohranjena aktivnost imobiliziranega encima in učinkovitost imobilizacije ChOx najvišja. Zato

smo se odločili, da nadaljujemo optimizacijo procesnih parametrov tako, da spremenimo

vrsto mrežnega povezovalca in namesto glutaraldehida (GA) uporabimo pentaetilen

heksamin (PEHA).

Čas imobilizacije je bil 24 ur, uporabljena koncentracija encima pa 0,1 mg/mL.


67

Slika 4-23: Učinkovitost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od vrste mrežnega povezovalca

Slika 4-23 prikazuje primerjavo učinkovitosti imobilizacije encima z uporabo GA in PEHA kot

mrežnega povezovalca. Ugotovili smo, da najvišjo učinkovitost imobilizacije dosežemo z

dodatkom 0,02 M PEHA, in sicer na MC3 100 %, najmanj pa na MC2. Predvidevamo, da je

razlog za nižjo učinkovitost imobilizacije na MC1 (76,03 %) in MC2 (50,56 %) v tem, da so

se nanodelci združili v večje aglomerate in se je tako zmanjšala površina, ki je bila

razpoložljiva za vezavo encima [46].

Pri nanodelcih, pripravljenih po postopku kovalentne vezave hitozana (MC3), smo dobili

najvišjo učinkovitost imobilizacije, hkrati pa je bila tudi ohranjena aktivnost ChOx najvišja, in

sicer 35,85 %. Na osnovi dobljenih rezultatov (slika 4-24) lahko sklepamo, da imata

pomembni vlogi pri imobilizaciji encimov tudi oblika in struktura nosilcev, pri čemer je zelo

pomembno, da pravilno izberemo vrsto mrežnega povezovalca.


68

Slika 4-24: Ohranjena aktivnost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od vrste mrežnega povezovalca

4.1.7 VPLIV SPREMEMBE KONCENTRACIJE ENCIMA

Za doseganje višje ohranjene aktivnosti imobilizirane ChOx smo v ta namen uporabili višjo

koncentracijo encima. Koncentracijo ChOx smo povečali iz 0,1 mg/mL na 1 mg/mL. Čas

imobilizacije je bil 24 ur. Imobilizacijo encima ChOx smo izvedli na mikro- in nanodelcih,

modificiranih s hitozanom po treh metodah tako, da smo dodali 1 mL 0,02 M mrežnega

povezovalca PEHA. Hkrati smo izvedli imobilizacijo encima tudi brez dodatka PEHA na

podoben način kot pri uporabi GA. S tem smo želeli preveriti, ali je uporaba PEHA smiselna

in potrebna.

Ugotovili smo, da se je uporaba PEHA izkazala kot zelo uspešno, saj smo tako dosegli

najvišjo učinkovitost imobilizacije encima ChOx na magnetne mikro- in nanodelce

modificirane s hitozanom. Pri vseh treh različnih nosilcih MC1, MC2 in MC3 smo dobili višje

učinkovitosti imobilizacije kot v primeru, kjer PEHA nismo uporabili.

Iz rezultatov na sliki 4-25 lahko ugotovimo, da smo najboljšo učinkovitost imobilizacije

dosegli pri MC1 z dodatkom mrežnega povezovalca PEHA, in sicer 47,47 %, nekoliko nižjo,


69

35,01 %, pri MC2 ter 37,17 % pri MC3, prav tako z dodatkom PEHA v obeh primerih. Pri

imobilizaciji encima ChOx brez uporabe PEHA je pri MC3 učinkovitost imobilizacije znašala

17,64 %, kar je 19,53 % manj kot pri MC3 z dodatkom PEHA. Pri MC1 brez uporabe PEHA

je bila učinkovitost 21,93 % encima, kar je 25,54 % manj kot pri MC1 z dodatkom PEHA. Pri

MC2, ki mu nismo dodali mrežnega povezovalca, se je vezalo le 29,67 %, kar je 5,34 %

manj kot pri MC2 z dodatkom PEHA.

Slika 4-25: Učinkovitost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah pri uporabi 0,02 M PEHA in koncentraciji encima 1mg/mL

Aktivnost se je najbolje ohranila v vseh treh postopkih imobilizacije encima na magnetne

mikro- in nanodelce, modificirane s hitozanom, z dodatkom mrežnega povezovalca PEHA.

Najvišje vrednosti ohranjene aktivnosti imobiliziranega encima holesterol oksidaze smo

dobili pri MC2 z vrednostjo 79,03 % ob dodatku PEHA. Na sliki 4-26 je razvidno, da je

ohranjena aktivnost imobiliziranega encima na MC2 brez mrežnega povezovalca 41,94 %,

pri MC1 pa celo najnižja, in sicer le 16,13 %.


70

Slika 4-26: Ohranjena aktivnost imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah pri uporabi 0,02 M PEHA in koncentraciji encima 1 mg/mL

Slika 4-27 prikazuje primerjavo vpliva koncentracije encima na učinkovitost imobilizacije pri

magnetnih nanodelcih funkcionaliziranih s hitozanom po treh različnih metodah z dodatkom

PEHA in brez PEHA. Pri imobilizaciji smo uporabili koncentraciji encima 0,1 in 1 mg/mL.

Čas imobilizacije je bil 24 ur, hitrost stresanja pa 300 rpm.

Ugotovili smo, da je učinkovitost imobilizacije mnogo višja pri uporabi koncentracije encima

0,1 mg/ml, vendar je ohranjena aktivnost, kot je razvidno iz slike 4-28, mnogo nižja pri tej

koncentraciji encima.

4.1.8 KEMIJSKI MEHANIZEM IMOBILIZACIJE

Mehanizem pritrditve biomolekule na površino nosilca lahko vpliva na konformacijo

imobiliziranega proteina in prav tako na njegovo ohranjeno aktivnost. Kemizem vezave je

lahko specifičen, kjer je vezava direktna na točno določenem mestu proteina, ali

nespecifičen, kjer vezava molekul poteče preko funkcionalne skupine na nosilcu. Primer


71

nespecifične tehnike je zamreženje molekule tarčne funkcionalne skupine nosilca

(karboksilna kislina, primarni amin, hidroksi) z reaktivno skupino proteina (karboksilne

kisline, amino, sulfhidridno, hidroksi). Zamreženje poteka z zamrežitvenimi reagenti, kot so:

glutaraldehid, karbodiimidni/N-hidroksisuksinimidil ester, epoksidi, karbonildimidizol in foto-

reaktivni reagenti. Reakcijo običajno izvedemo v eni ali dveh stopnjah, pri kateri faza

pritrditve proteina poteka v vodnem pufru, specifičnem za določen protein, saj tako omejimo

denaturacijo med vezavo. Vendar pa pri vezavi preko nespecifične metode nimamo

nadzora za orientacijo proteina, saj je lahko na voljo več funkcionalnih skupin na površini

encima, ki vodijo do različnih usmeritev ob imobilizaciji. Topna zamrežitvena reagenta kot

sta EDC in GA vplivata na katalitsko sposobnost encima s tem, ko reagirata z

aminokislinskimi ostanki proteina. Metoda nespecifične vezave ni primerna, kadar aktivno

mesto proteina ni poravnano s smeri substrata. Namen tehnike specifične imobilizacije

encima je v točno določenem mestu na molekuli in/ali materialu. Tako lahko ostanek

funkcionalne amino kisline uporabimo kot mesto konjugacije na površini nosilca [85].

Mehanizem reakcije, ki je potekla med funkcionalnimi skupinami molekul v postopku

priprave nosilca, je zelo pomemben dejavnik pri procesu imobilizacije, saj so proste

funkcionalne skupine pomembne za imobilizacijo encima. Z namenom da bi pripravili

disperzijo nanodelcev v polarnem topilu, posebno v vodi, smo površino že sintetiziranih

nanodelcev prevlekli s citronsko kislino. Reakcija s hitozanom in karboksilno skupino

citronske kisline na površini magnetnih nanodelcev lahko poteče na dva načina. Ker ima

hitozan v svoji molekulski strukturi prosto -NH2 in -OH skupino, lahko na dva načina reagira

s karboksilno skupino citronske kisline. V primeru da reakcija poteče med -OH skupino

hitozana, nastane ester, ki lahko nadalje zreagira z amino skupino pentaetilen heksamina,

ki smo ga dodali za aktivacijo magnetnih nanodelcev pred postopkom imobilizacije.

Prav tako je možna reakcija med karboksilno skupino citronske kisline na površini

magnetnih nanodelcev in –NH2 skupino hitozana. Pri tem nastane amid, ki lahko nadalje

zreagira z amino skupino pentaetilen heksamina in aldehidno skupino glutaraldehida.

Vrsta reakcije med funkcionalnimi skupinami je odvisna od sinteznega postopka MC1, MC2

in MC3, kar pa je v povezavi z dobljenimi rezultati. S potenciometrično titracijo smo določili,

da imajo mikrodelci MC2 najnižjo koncentracijo prostih amino skupin. Iz rezultatov na sliki 2-

26 pa lahko vidimo, da smo z uporabo mikrodelcev MC2 dobili najvišjo ohranjeno aktivnost

imobiliziranega encima ChOx. Predvidevamo, da je hitozan ob vezavi na magnetne

nanodelce po postopku zamreženja zreagiral z -NH2 skupino. Zasedenost prostih amino

skupin na površini hitozana se sklada z rezultati iz analize potenciometrične titracije in hkrati

nakazuje na to, da je preko proste –OH skupine hitozana zreagiral pentaetilen heksamin, ki


72

je služil kot aktivator za nadaljnjo imobilizacijo encima ChOx. Iz tega lahko sklepamo, da je

najvišja ohranjena aktivnost imobiliziranega encima ChOx odvisna od priprave nosilca in

prostih funkcionalnih skupin na površini nosilca [85].

Prav tako je pomembno omeniti, da na ohranjeno aktivnost imobiliziranega encima ChOx

vpliva tudi večslojna protein-protein vezava, ki zavira prilagodljivo raztezanje encimske

konformacije, kar lahko povzroči sterično omejitev in s tem inaktivacijo encima. V zadnjem

času je več avtorjev [86–88] raziskovalo učinek encimskega nalaganja na imobilizacijo.

Iz primerjave slik 4-27 in 4-28 lahko ugotovimo, da z visoko učinkovitostjo imobilizacije z

uporabo koncentracije encima 0,1 mg/mL dobimo nižjo ohranjeno aktivnost imobiliziranega

encima ChOx. Prav tako je z nižjo učinkovitostjo imobilizacije encima ChOx ohranjena

aktivnost imobiliziranega encima ChOx višja. Na splošno velja, da ima količina

imobiliziranega encima na nosilec oz. v našem primeru učinkovitost imobilizacije encima

očiten vpliv na ohranjeno aktivnost imobiliziranega encima ChOx, saj prevelika količina

imobiliziranega encima privede do medmolekulske sterične omejitve, kar znižuje aktivnost

imobiliziranega encima [87].

Slika 4-27: Primerjava učinkovitosti imobilizacije ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od koncentracije encima


73

Slika 4-28: Primerjava ohranjene aktivnosti imobilizirane ChOx na magnetne mikro- in nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh metodah v odvisnosti od koncentracije encima

Tabela 4-1: Optimalni reakcijski pogoji za večkratno uporabo imobiliziranega encima

Optimalni reakcijski pogoji

Mrežni povezovalec PEHA

Koncentracija mrežnega

povezovalca

0,02 M

Volumen mrežnega povezovalca 1 mL

Koncentracija encima 1 mg/mL

Masa magnetnih nanodelcev 5 mg

Hitrost stresanja 300 rpm

Čas imobilizacije 24 ur


74

Koncentracija encima ChOx 1 mg/mL je optimalna koncentracija encima ChOx, pri kateri

smo dobili najvišjo ohranjeno aktivnost imobiliziranega encima ChOx na magnetne mikro- in

nanodelce funkcionalizirane s hitozanom po treh različnih metodah. Prav tako smo kot

mrežni povezovalec uporabili PEHA s koncentracijo 0,02 mol/L. Optimalni reakcijski pogoji

za imobilizacijo encima ChOx so prikazani v tabeli 4-1 in smo jih upoštevali pri nadaljnjih

eksperimentih za določitev stabilnosti imobiliziranega encima pri ponovni uporabi [89].

Imobilizacija encima na magnetne nanodelce je ponavadi odvisna od različnih fizikalno-

kemijskih parametrov, kot so čas imobilizacije, količina in vrsta nosilca, temperature pri

procesu imobilizacije, puferne raztopine itd. V tej študiji smo določili optimalne pogoje za

sintezo imobiliziranega encima ChOx. Pri najvišji ohranjeni aktivnosti imobiliziranega

encima smo testirali stabilnost pri ponovni uporabi, saj je to eden ključnih podatkov

pomembnih pri industrijskih aplikacijah imobiliziranega encima.

4.1.9 STABILNOST IMOBILIZIRANEGA ENCIMA PRI PONOVNI UPORABI

S praktičnega vidika uporabe imobiliziranih encimov je stabilnost encimskega preparata pri

ponovni uporabi pomembna lastnost pri načrtovanju različnih nosilcev za imobilizacijo

encimov za točno določene namene. Postopna deaktivacija in uhajanje encima iz sistema

sta najpogostejša problema, ki krepko spodbujata načrtovanje prav imobiliziranih encimov

za njihovo ponovno uporabo v procesu [62].

Stabilnost imobilizirane ChOx na magnetne nanodelce, modificirane s hitozanom po treh

različnih metodah z uporabo PEHA in brez nje, je prikazana na sliki 4-29.

Stabilnost imobilizirane ChOx smo določevali tako, da smo magnetne mikro- in nanodelce z

imobiliziranim encimom ChOx večkrat ponovno uporabili v reakciji oksidacije holesterola. Po

prvem ciklu smo magnetne mikro- in nanodelce z imobiliziranim encimom ChOx odstranili z

magnetom iz reakcijske zmesi, jih temeljito sprali in jih ponovno uporabili v reakciji

oksidacije holesterola, dokler se ni aktivnost imobiliziranega encima ChOx znižala ali se

približala vrednosti 0. Vsak cikel je trajal eno uro.

Kot je razvidno iz grafa v sliki 4-29, je ohranjena aktivnost imobiliziranega encima ChOx pri

vseh treh primerih, kjer nismo uporabili PEHA kot mrežni povezovalec, hitro upadla. Pri

MC1 je ohranjena aktivnost imobiliziranega encima ChOx že po drugem reciklu upadla na

vrednost 0, pri MC2 je ohranjena aktivnost imobiliziranega encima ChOx dosegla vrednosti

0 po tretjem reciklu in prav tako pri MC3. Veliko boljše rezultate smo dosegli, če smo pri


75

imobilizaciji ChOx uporabili PEHA kot mrežni povezovalec, in sicer je pri vseh treh vzorcih

MC1-PEHA, MC2-PEHA in MC3-PEHA, ohranjena aktivnost encima počasi upadala do

petega recikla oz. še dlje. Ugotovili smo, da uporaba PEHA vpliva na stabilnost

imobiliziranega encima, saj se aktivnost imobiliziranega encima ohrani dlje časa.

Ohranjena aktivnost imobiliziranega encima vidno upada z naraščanjem števila reciklov.

Ugotovili smo, da je najbolj stabilna oblika imobilizirane ChOx na magnetne nanodelce,

funkcionalizirane s hitozanom po postopku kovalentne vezave z uporabo PEHA kot

mrežnega povezovalca (MC3-PEHA), saj je bila ohranjena aktivnost nad vrednostjo 0 do

devetega recikla, vendar pa je bila razpolovna doba encimskega preparata dosežena že po

četrtem reciklu.

Slika 4-29: Stabilnost imobilizirane ChOx pri ponovni uporabi

Tabela 4-2 prikazuje vpliv večkratne uporabe imobilizirane ChOx na ohranjeno aktivnost v

% pri ponovni uporabi. Iz tabele je razvidno, da je bila največkrat uporabljena imobilizirana

ChOx na nosilec MC3 z uporabo PEHA, pri čemer smo dokazali, da je dokaj stabilna, saj je


76

bila ohranjena aktivnost MC3 z uporabo PEHA po drugem ciklu še izredno visoka, in sicer

97,26 %, medtem ko se je močno znižala šele po devetem ciklu (2,05 %).

Tabela 4-2: Primerjava ohranjene aktivnosti imobiliziranega encima ChOx v odvisnosti od različnih nosilcev pri ponovni uporabi

Vzorec

Število

ciklov

1 2 3 4 5 6 7 8 9

MC1 100.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

Ohranjena

aktivnost

[%]

MC1-

PEHA

100.00 59.89 40.11 18.64 14.12 0.00 0.00 0.00 0.00

MC2 100.00 19.23 6.92 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

MC2-

PEHA 100.00 37.96 10.61 6.12 2.45 0.00 0.00 0.00 0.00

MC3 100.00 21.84 9.20 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

MC3-

PEHA 100.00 97.26 80.14 54.79 44.52 17.81 13.01 3.08 2.05

Stabilnost imobiliziranih encimov je odvisna od temperature in časa. Pri imobiliziranem

encimu z dobro stabilnostjo se aktivnost encima obdrži skozi serijo ciklov ponovne uporabe.

Zaradi imobilizacije se spremenijo tudi lastnosti encimov, predvsem katalitična aktivnost, ki

je odvisna tudi od izbire nosilca. Na znižanje katalitične aktivnosti pri imobiliziranem encimu

vpliva tudi sprememba v tridimenzionalno konformacijo proteina ob vezavi na nosilec.

Vsekakor pa imobilizacija encima izboljšuje operativno stabilnost in je rezultat tvorbe

mnogih vezi med encimom in nosilcem [8].


77

4.2 IMOBILIZACIJA ENCIMA CELULAZE BREZ NOSILCA

4.2.1 PRIPRAVA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ ENCIMA

CELULAZE

Encim celulaza katalizira reakcijo hidrolize celuloze. Ker je priprava CLEAs enostaven način

imobilizacije, pri katerem je velika prednost ta, da se encim zamreži s pomočjo

zamrežitvenega reagenta, ki je ponavadi glutaraldehid (GA), in s tem obdrži originalno

obliko encima v primerjavi z imobilizacijo na nosilec. Zaradi svoje netopnosti se lahko

uporablja v številnih reakcijskih medijih, hkrati pa lahko spremeni enantioselektivnost

encima in omogoča boljšo stabilnost imobiliziranega encima [90]. Pri imobilizaciji encima v

obliki CLEAs ponavadi dosežemo višje aktivnosti imobiliziranega encima v primerjavi s

kovalentno imobilizacijo na nosilec [91].

Postopek za pripravo zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) vključuje dva pomembna

koraka: reakcijo obarjanja, kjer encim z dodatkom obarjalnega reagenta izoborimo iz vodne

raztopine, in reakcijo zamreženja encimskih molekul s primernim mrežnim povezovalcem,

GA. Priprava zamreženih encimskih skupkov iz encima celulaze je bila izvedena v

prisotnosti stabilizacijskega proteina EA in PEHA, ki služi kot donor prostih amino skupin.

Po fazi zamreženja je bila dodana raztopina reducenta, cianoborohidrida. Aktivnost CLEAs

in učinkovitost imobilizacije celulaze smo določili spektrofotometrično. Obliko in velikost

posameznih zamreženih encimskih skupkov z različnimi obarjalnimi reagenti smo opazovali

z optično mikroskopijo.

4.2.2 REAKCIJA OBARJANJA

Narava obarjalnega reagenta ima pomembno vlogo pri končni ohranjeni aktivnosti

zamreženih encimskih skupkov. Zato smo najprej izvedli testiranje različnih obarjalnih

reagentov z namenom, da bi ugotovili, kateri obarjalni reagent uspešno izobori encim

celulazo in z uporabo katerega obarjalnega reagenta dobimo najvišje aktivnosti

izoborjenega encima.

V tabeli 4-3 so predstavljeni kvalitativni rezultati obarjanja encima celulaze, ki smo jih dobili

tako, da smo 100 µL začetne raztopine encima celulaze oborili z 90-% volumskim deležem

obarjalnega reagenta. Na osnovi kvalitativne ocene smo se prepričali, v katerem topilu se je

celulaza izoborila. Obarjanje smo ocenili za uspešno in neuspešno. Uspešno obarjanje

pomeni, da smo dobili motno suspenzijo, v kateri so rahlo vidni skupki izoborjenega encima,


78

kar smo zasledili pri acetonu, metanolu, etanolu, propanolu, 2-propanolu in amonijevem

sulfatu. Neuspešno obarjanje pomeni tudi, da se encim izobori v energetsko manj ugodno

konformacijo, ki povzroči izgubo encimske aktivnosti. V tem primeru pravimo, da encim

koagulira ali zakrkne.

Tabela 4-3: Kvalitativno preverjanje reakcije obarjanja z različnimi obarjalnimi reagenti

OBARJALNI REAGENT KVALITATIVNA OCENA REAKCIJE OBARJANJA

Aceton Uspešno

Metanol Uspešno

Etanol Uspešno

Propanol Uspešno

2-propanol Uspešno

Amonijev sulfat Uspešno

Butanol Neuspešno

DMSO Neuspešno

PEG 1500 Neuspešno

PEG 6000 Neuspešno

PEG 20000 Neuspešno

Kloroform Neuspešno

n-heptan Neuspešno

Heksan Neuspešno

Dekanol Neuspešno

Dimetileter Neuspešno

Acetonitril Neuspešno

Tetrahidrofuran Neuspešno

DMF Neuspešno

Legenda: Uspešno obarjanje pomeni nastanek motne suspenzije. Neuspešno obarjanje predstavlja dvofazni sistem sestavljen iz dveh tekočih faz, iz raztopljenega encima in topila ali zakrknjen encim v topilu.


79

Slika 4-30: Obarjanje celulaze z različnimi obarjalnimi reagenti

Na sliki 4-30 je prikazana intenzivnost obarjanja encima celulaze ob dodatku različnih

obarjalnih reagentov.

Aktivnost uspešno izoborjenega encima smo določili v supernatantu z namenom, da bi

ugotovili, ali se je encim v celoti oboril in kako vpliva posamezna izbira obarjalnega

reagenta na aktivnost izoborjenega encima. Hkrati smo določili aktivnost prostega encima

celulaze in jo primerjali z aktivnostjo encima v supernatantu po zaključeni reakciji obarjanja.

Aktivnost izoborjenega encima smo preračunali iz aktivnosti prostega encima, ki smo ga

dodali pred reakcijo obarjanja in aktivnostjo neizoborjenega encima. Iz grafa na sliki 4-31 je

razvidno, da so relativne aktivnosti izoborjenega encima z različnimi obarjalnimi reagenti

zelo visoke (76,7–84,3 %), zato smo se odločili, da za nadaljnje delo uporabimo več vrst

obarjalnih reagentov in tako ugotovimo, kateri obarjalni reagent je optimalna izbira za

sintezo zamreženih encimskih skupkov iz encima celulaze.


80

Slika 4-31: Relativna aktivnost resuspendiranega encima celulaze po obarjanju z različnimi obarjalnimi reagenti

4.2.3 REAKCIJA ZAMREŽENJA

Reakcijo zamreženja smo izvedli z 90-% volumskim deležem obarjalnega reagenta in z 10-

% volumskim deležem začetne raztopine encima celulaze. Pri reakciji zamreženja smo

uporabili različne obarjalne reagente: etanol, aceton, metanol, 2-propanol, propanol in

amonijev sulfat, v prisotnosti pentaetilenheksamina (PEHA; 100 mM), ogrodnega proteina

EA in s koncentracijo GA 1 % (v/v). Dodatek EA smo uporabili za pridobivanje CLEAs iz

encima celulaze. V primeru, kjer je koncentracija proteina v encimskem pripravku nizka

in/ali encimska aktivnost občutljiva na visoke koncentracije GA, potrebnega za nastanek

agregatov, dodamo EA kot dodatek proteinov [4], saj hkrati tudi zviša koncentracijo prostih

amino skupin [92]. Z uporabo GA se preko njegove aldehidne skupine tvori Schiffova baza,

ki temelji na reakciji z amino skupino proteina. Vendar je slabost nastanka Schiffove baze v

nestabilnosti pri kislih pogojih, saj lahko pride do razgradnje na aldehid in amin. Natrijev

cianoborohidrid smo uporabili za redukcijo Schiffove baze in s tem kovalentno stabilizacijo

CLEAs iz celulaze [93].


81

Slika 4-32: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z različnimi obarjalnimi reagenti pri uporabi glutaraldehida s koncentracijo 1 % (v/v).

Iz rezultatov na sliki 4-32 lahko ugotovimo, da so vrednosti učinkovitosti imobilizacije

encima visoke, razen pri uporabi amonijevega sulfata kot obarjalnega reagenta, kjer je

učinkovitost imobilizacije le 36,5 %. Najvišjo učinkovitost imobilizacije smo dobili z uporabo

etanola, in sicer 80,9 %. Relativna aktivnost CLEAs je bila nizka z uporabo acetona, le 2,2

%, in 2-propanola, le 8,97 %, vendar smo najvišjo aktivnost CLEAs dosegli z uporabo

propanola, in sicer 62,26 %. Za dosego višjih aktivnosti CLEAs smo se odločili, da določimo

optimalno koncentracijo glutaraldehida. Z dodatkom GA se enakomerno porazdeljeni

proteini zamrežijo, s čimer se stabilizira njihova struktura [92].

4.2.4 OPTIMIZACIJA KONCENTRACIJE GLUTARALDEHIDA

Glutaraldehid je univerzalni bifunkcionalni mrežni povezovalec, vendar lahko povzroči

deaktivacijo encima, zato je optimizacija koncentracije glutaraldehida nujno potrebna. V

primeru prenizke koncentracije glutaraldehida je zamreženje nepopolno. Reakcija

zamreženja je potekala 3 ure pri sobni temperaturi. Proučevanje vpliva koncentracije

glutaraldehida v vlogi mrežnega povezovalca na končno učinkovitost imobilizacije in

aktivnost CLEAs iz celulaze smo izvedli z naslednjimi koncentracijami glutaraldehida: 0,5


82

%, 1 % in 2 % (v/v) ob prisotnosti etanola, metanola, propanola in amonijevega sulfata v

vlogi obarjalnih reagentov. Ker je molekulska masa GA, ki ga uporabimo kot zamrežitveni

reagent, zelo nizka v primerjavi z molekulsko maso encima, izhajamo iz tega, da je v obliki

CLEAs zamrežen le aktiven encim [94]. Slaba lastnost GA je povzročitev deaktivacije

encima s previsoko koncentracijo GA. Zato je potrebna optimizacija koncentracije GA z

namenom, da ne pride do deaktivacije encima [83,91].

Iz grafov na sliki 4-33 lahko ugotovimo, da koncentracija glutaraldehida ne vpliva na

učinkovitost imobilizacije celulaze v obliki zamreženih encimskih skupkov, saj so v vseh

štirih primerih zelo podobne v odvisnosti od uporabljenega obarjalnega reagenta. Hkrati pa

lahko ugotovimo, da je relativna aktivnost zelo odvisna od koncentracije glutaraldehida, saj

prevelika koncentracija GA povzroči deaktivacijo encima in s tem znižanje relativne

aktivnosti CLEAs. Nepričakovano se je pri uporabi amonijevega sulfata kot obarjalnega

reagenta pokazalo, da je višja koncentracija GA ugodno vplivala na aktivnost CLEAs, saj

smo z uporabo GA s koncentracijo 2 % (v/v) dosegli najvišjo relativno aktivnost CLEAs, in

sicer 50,97 %. Koncentracija mrežnega povezovalca ima pomemben vpliv na aktivnost

CLEAs. Kot je prikazano na sliki 4-33 se je aktivnost CLEAs z uporabo amonijevega sulfata

kot obarjalnega reagenta zviševala z večanjem koncentracije GA. Pri uporabi GA s

koncentracijo 2,5 % (v/v) se skoraj ves topen encim pretvori v aktivno obliko encima CLEAs.

Prav tako se lahko pri višjih koncentracijah GA pojavi hiperaktivacija [95].

Ugotovili smo, da je za optimizacijo koncentracije glutaraldehida kot mrežnega povezovalca

njuno potrebna še natančnejša optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs, pri kateri

smo uporabili koncentracije GA, s katerimi bi dosegli optimalno koncentracijo GA in najvišjo

relativno aktivnost CLEAs.


83

Slika 4-33: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z različnimi obarjalnimi reagenti v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida

Slika 4-34 prikazuje učinkovitost imobilizacije in relativno aktivnost CLEAs iz celulaze z

etanolom kot obarjalnim reagentom v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida.

Razlike v učinkovitosti imobilizacije v odvisnosti od koncentracije GA so nizke, in so v

območju 63,2–86,8 %. Relativna aktivnost CLEAs je naraščala do koncentracije GA 0,0625

% (v/v), kjer smo dobili najvišjo aktivnost CLEAs, in sicer je ta znašala 93,95 %. Pri

nadaljnjem povišanju koncentracije GA smo opazili deaktivacijo encima, saj je relativna

aktivnost začela upadati.


84

Slika 4-34: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z etanolom v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida


metanolom kot obarjalnim reagentom v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida.




nadaljnjem povišanju koncentracije GA smo opazili deaktivacijo encima, kar se je izražalo v

znižanju njegove relativne aktivnosti.


85

Slika 4-35: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z metanolom v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida

Slika 4-36 prikazuje učinkovitost imobilizacije in relativno aktivnost CLEAs iz celulaze s

propanolom kot obarjalnim reagentom v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida.




nadaljnjem povišanju koncentracije GA smo opazili deaktivacijo encima, kar se je izražalo v

znižanju njegove relativne aktivnosti.


86

Slika 4-36: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze s propanolom v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida


amonijevim sulfatom kot obarjalnim reagentom v odvisnosti od različnih koncentracij

glutaraldehida. Razlike v učinkovitosti imobilizacije v odvisnosti od koncentracije GA so

nizke, in so v območju 53,2–60,7 %. Relativna aktivnost CLEAs je naraščala do

koncentracije GA 2,5 % (v/v), kjer smo dobili najvišjo aktivnost CLEAs, in sicer je ta znašala

54,9 %. Pri nadaljnjem povišanju koncentracije GA smo opazili deaktivacijo encima, kar se

je izražalo v znižanju njegove relativne aktivnosti.


87

Slika 4-37: Učinkovitost imobilizacije in relativna aktivnost CLEAs iz celulaze z amonijevim sulfatom v odvisnosti od različnih koncentracij glutaraldehida

Na osnovi dobljenih rezultatov lahko ugotovimo, da je najboljši obarjalni reagent za pripravo

zamreženih encimskih skupkov iz celulaze etanol, saj smo dobili najvišjo vrednost relativne

aktivnosti, ki je znašala 93,95 %.


88

4.2.5 OPTIČNA MIKROSKOPIJA

Oblika agregatov in njihova velikost sta pomembni lastnosti heterogenih biokatalizatorjev in

so za CLEAs še relativno neraziskani. Vsekakor število molekul encima in način, kako se te

molekule združijo v agregate, odločilno vpliva na aktivnost končnega produkta. Te lastnosti

so največkrat odvisne od vrste obarjalnega reagenta. Primerjava posnetkov CLEAs iz

encima celulaze, pripravljenih z različnimi obarjalnimi reagenti, je prikazana na sliki 4-38.

Slika 4-38: Posnetek CLEAs iz encima celulaze v odvisnosti od uporabe različnih obarjalnih reagentov z optičnim mikroskopom (40x)


89

Na posnetkih na sliki 4-38 lahko primerjamo strukturo CLEAs in velikost zamreženih

encimskih skupkov iz celulaze, ki se spreminja v odvisnosti od uporabe obarjalnega

reagenta. Najmanjše skupke smo izmerili v primeru, ko smo za obarjanje encima celulaze

pri sintezi CLEAs uporabili propanol, in sicer povprečna vrednost izmerjenih skupkov znaša

26 µm, ob uporabi etanola 43 µm, acetona 46 µm in tetrahidrofurana 67 µm. Z uporabo

metanola in 2-propanola kot obarjalna reagenta lahko opazimo, da imajo skupki velik

razpon v velikosti, povprečna velikost skupkov, oborjenih z metanolom je 87 µm, z 2-

propanolom pa 161 µm. Ugotovili smo, da je velikost CLEAs odvisna od uporabe

obarjalnega reagenta in njegovih lastnosti, predvsem polarnosti topila. Z nižanjem

polarnosti obarjalnih reagentov se povečuje velikost skupkov, torej bodo ob uporabi

obarjalnega topila z nižjo polarnostjo nastali večji agregati CLEAs, z višjo polarnostjo pa

manjši agregati CLEAs.

4.2.6 FOURIEROVA TRANSFORMACIJSKA INFRARDEČA


Slika 4-39 prikazuje primerjavo FTIR-spektrov CLEAs in prostega encima celulaze. Iz IR

spektrov so razvidne male razlike v odstopanju absorpcijskih vrhov v primerjavi IR spektrov

CLEAs in proste celulaze, kar je bilo pričakovano, saj gre pri metodi CLEAs za zamreženje

encima z dodatkom mrežnega povezovalca glutaraldehida, in s tem encim obdrži njegovo

originalno obliko.

Absorpcijska vrhova pri 3278 cm-1 in 3286 cm-1 sta značilna za natezne vibracije hidroksilnih

skupin –OH. Signal na področju valovne dolžine 1631 cm-1 je povezan z nateznimi

vibracijami C=O vezi in je prav tako prisoten pri obeh spektrih. Karakteristični vrh, značilen

za C-OH vez pri 1078 cm-1 na spektru prostega encima celulaze, se je z zamreženjem

prestavil na 1064 cm-1 [15].

Če primerjamo IR spekter zamreženih encimskih skupkov iz celulaze, opazimo zmanjšanje

intenzitete določenih pikov v primerjavi s prostim encimom, kar lahko pripišemo oviranju

zaradi zamreženja z glutaraldehidom.


90

Slika 4-39: Primerjava FTIR spektrov CLEAs in proste celulaze


91

4.2.7 STABILNOST CLEAs IZ CELULAZE PRI PONOVNI UPORABI

Razpolovna doba imobiliziranih encimov je eden od pomembnejših vidikov industrijske

uporabe. V primerjavi s prostim encimom ima imobiliziran encim višjo stabilnost in hkrati

možnost ponovne uporabe. Proučevali smo preostalo aktivnost CLEAs v odvisnosti od

ponovne uporabe CLEAs.

Slika 4-40: Stabilnost imobilizirane celulaze v odvisnosti od uporabe različnih obarjalnih reagentov pri ponovni uporabi

Stabilnost imobilizirane celulaze v obliki zamreženih encimskih skupkov v odvisnosti od

uporabe različnih obarjalnih reagentov je prikazana na sliki 4-40. Preostalo aktivnost CLEAs

po večkratni uporabi smo izračunali tako, da smo izmerjeno aktivnost CLEAs po prvem ciklu

uporabili kot 100 % vrednost nadaljnjih merjenj aktivnosti po večkratni uporabi.

Iz grafa na sliki 4-40 smo ugotovili, da je preostala aktivnost CLEAs počasi upadala z

naraščajočim številom reciklov. Ugotovili smo, da so vse štiri oblike CLEAs stabilne, saj je

bila tudi po 319 urah oziroma 10 reciklu ponovne uporabe preostala aktivnost še vedno

dovolj visoka. Najvišjo začetno aktivnost je imela CLEAs pripravljena s propanolom, vendar

se je njena aktivnost hitreje zniževala v primerjavi s CLEAs oborjena z etanolom,


92

metanolom in amonijevim sulfatom. V primerjavi s prostim encimom, opazovana razpolovna

doba (t1/2) dokazuje, da se stabilnost encima celulaza z nastankom CLEAs občutno poveča.

Ta izboljšava stabilnosti se pojavi zaradi inter- in intramolekularnih kovalentno zamreženih

povezav, ki preprečujejo konformacijske spremembe in s tem deaktivacijo biokatalizatorja

[92].

Glavna prednost zamreženih encimskih skupkov je možnost ponovne uporabe tako

imobiliziranega encima. Ponovna uporaba je ključni dejavnik iz ekonomskega vidika pri

industrijski uporabi. CLEAs je mogoče ponovno uporabiti s filtracijo ali centrifugiranjem [96].

Avtorji poročajo o sintezi CLEAs iz amilaze, pri kateri so razpolovno dobo pri ponovni

uporabi dosegli že po četrtem ciklu ponovne uporabe [96] in po petem ciklu ponovne

uporabe pri CLEAs iz lakaze [97]. Če primerjamo CLEAs iz encima celulaze z drugimi

avtorji, ugotovimo, da smo še izboljšali že objavljene rezultate, saj so avtorji pred nami

CLEAs iz celulaze ponovno uporabili le do 5-krat [91] do dosega razpolovne dobe. Iz naše

študije lahko ugotovimo, da je CLEAs stabilnejša, saj smo razpolovno dobo dosegli pri

CLEAs z uporabo etanola in metanola kot obarjalnima reagentoma z 9. ciklom ponovne

uporabe, CLEAs z uporabo propanola kot obarjalnega reagenta z 8. ciklom ponovne

uporabe in CLEAs z uporabo amonijevega sulfata kot obarjalnega reagenta s 7. ciklom

ponovne uporabe.


93

5 ZAKLJUČKI

Imobilizirani encimi so že ali pa v bližnji prihodnosti še bodo vključeni v številne tehnologije.

Sposobnost encimov, da katalizirajo reakcije, jih je postavila kot nepogrešljive za znanost

že desetletja in prav imobilizacija se je izkazala za posebno koristno, saj se je s tem pojavila

možnost večkratne ponovne uporabe encima, kar je ključnega pomena za ekonomski vidik.

Imobilizirane encime lahko ponovno uporabimo, imajo daljšo razpolovno dobo in manjšo

degradacijo in prav tako se z imobilizacijo encimov zagotovijo enostavne metode

nadzorovanja hitrosti reakcije, prepreči onesnaženje substrata z encimom, kar posledično

zmanjša stroške čiščenja. Te prednosti imobiliziranih enicmov potrjujejo, da so imobilizirani

encimi zelo primerni za vrsto razvijajočih vej biotehnologije [9].

Obstaja več načinov sinteze magnetnih nanodelcev, vendar je najenostavnejša in

najprimernejša sinteza s koprecipitacijo ali obarjalno reakcijo železovih ionov. Prav zaradi

tega smo sintetizirali magnetne nanodelce železovega oksida, ki smo jih stabilizirali s

citronsko kislino in nadalje funkcionalizirali s hitozanom po treh različnih postopkih: metodi

mikroemulzije, suspenzijske zamreževalne tehnike in kovalentne vezave.

Funkcionalizirane magnetne mikro- in nanodelce smo okarakterizirali z vidika naboja

(določitve aminskih skupin – potenciometrična titracija), atomske in elementarne površinske

sestave (FTIR, XRD), morfoloških značilnosti (TEM, SEM), kakor tudi iz mikrobiološkega

vidika. Iz analiz karakterizacije magnetnih mikro- in nanonosilcev funkcionaliziranih s

hitozanom lahko ugotovimo, da so bili sintetizirani magnetni nanodelci maghemita velikosti

22,78 nm, magnetni mikrodelci funkcionalizirani s hitozanom po metodi mikroemulzije

(MC1) 68,53 µm, magnetni mikrodelci funkcionalizirani s hitozanom po metodi suspenzijske

zamreževalne tehnike (MC2) 44,21 µm ter magnetni nanodelci funkcionalizirani s hitozanom

po metodi kovalentne vezave (MC3) 58,77 nm.

Iz rezultatov lahko sklepamo, da so magnetni mikro- in nanodelci, ki smo jih funkcionalizirali

s hitozanom po treh različnih metodah; metodi mikroemulzije, suspenzijske zamreževalne

tehnike in kovalentne vezave, ustrezni za imobilizacijo encima holesterol oksidaze. Dokazali

smo, da lahko dosežemo večkratno uporabo imobiliziranega encima na magnetne mikro- in

nanodelce. Zaradi magnetnih lastnosti nosilca lahko imobiliziran encim holesterol oksidazo

enostavno odstranimo iz produkta s pomočjo magneta.

V naših raziskavah smo se osredotočili na optimizacijo procesnih parametrov, ki vplivajo na

proces imobilizacije, in sicer optimalno koncentracijo encima holesterol oksidaze, optimalno

vrsto in koncentracijo mrežnega povezovalca ter optimalno hitrost stresanja. Najvišjo


94

ohranjeno aktivnost smo dosegli po aktivaciji magnetnih nanodelcev, funkcionaliziranih s

hitozanom po metodi kovalentne vezave, s 0,02 M PEHA in koncentracijo encima 1 mg/mL,

s hitrostjo stresanja 300 rpm in 24-urno imobilizacijo. Aktivnost imobilizirane holesterol

oksidaze smo določili z reakcijo oksidacije holesterola. Končna aktivnost imobilizirane

holesterol oksidaze pri optimalnih reakcijskih pogojih je bila 79,03 % v primerjavi s prostim

encimom in je pokazala tudi dobro stabilnost. V tem primeru se je aktivnost ohranila po

devetih zaporednih reakcijah oksidacije holesterola. Ugotovili smo tudi, da je za proces

imobilizacije pomembna izbira mrežnega povezovalca, v našem primeru

pentaetilenheksamina, saj se je pri vezavi encima na predhodno aktivirane magnetne

mikro- in nanodelce z glutaraldehidom aktivnost encima zmanjšala.

Zaključimo lahko, da bi bila tovrstna funkcionalizacija magnetnih nanodelcev s hitozanom

primerna za bioaplikativne namene, vendar bi za proces imobilizacije biokatalizatorja bile

potrebne še natančnejše raziskave, s katerimi bi lahko dobili še višje ohranjene aktivnosti in

učinkovitosti, saj je načrtovanje optimalnih procesnih parametrov za imobilizacijo holesterol

oksidaze na magnetni nosilec dolgotrajno in zahtevno delo.

Glede na to, da lahko pri kovalentni vezavi encimov na različne nosilce dosežemo visoko

učinkovitost imobilizacije encima in s tem izboljšamo encimsko aktivnost ter stabilnost, pa je

maksimalna možnost vezave encima omejena z enojno plastjo kovalentno imobiliziranih

molekul encima. Zato je pomembno dejstvo, da lahko imobilizacija encimov v obliki

zamreženih encimskih skupkov izboljša učinkovitost vezave encima, s čimer se povečuje

splošna kakovost encima.

Za imobilizacijo celulaze smo izbrali metodo zamreženih encimskih skupkov, kot obliko

imobiliziranega encima, pri kateri ni potrebna uporaba trdnega nosilca. S spreminjanjem

različnih pogojev, kot so uporaba primernega obarjalnega reagenta v prvem koraku sinteze

CLEAs in koncentracije mrežnega povezovalca glutaraldehida, v drugem koraku, smo

uspešno sintetizirali CLEAs iz celulaze. Reakcija obarjanja encima celulaze je bila uspešno

izvedena z vrsto različnih obarjalnih reagentov, kot so etanol, aceton, metanol, 2-propanol,

propanol, tetrahidrofuran, amonijev sulfat in visokimi vrednostmi relativne aktivnosti

izoborjenega encima. Pri optimalnih reakcijskih pogojih sinteze zamreženih encimskih

skupkov iz celulaze, ki so bili doseženi pri koncentraciji glutaraldehida 0,0625 % (v/v) in

etanolu je bila končna aktivnost imobilizirane celulaze najvišja, in sicer 93,95 %. Stabilnost

zamreženih encimskih skupkov je bila raziskana pri ponovni uporabi v primeru etanola,

metanola, propanola in amonijevega sulfata kot obarjalnih reagentov. Najvišja stabilnost in

najdaljša razpolovna doba je bila dosežena pri CLEAs z metanolom kot obarjalnim

reagentom.


95

V okviru nadaljnjih raziskav bi bilo potrebno raziskati še možnosti izboljšanja stabilnosti

imobiliziranega encima celulaze. Vsekakor bi bilo smiselno združiti oba dela raziskave in

poskusiti izvesti vezavo CLEAs na magnetni nosilec. S tem bi pridobili možnost lažje

odstranitve imobiliziranega encima iz reakcijske zmesi s pomočjo magnetnega polja,

izboljšano stabilnost in možnost ponovne uporabe v kontinuiranem bioseparacijskem

sistemu, predvsem pa boljši nadzor katalitskega procesa.


96

6 LITERATURA

[1] Maja Remškar, Nanodelci in nanovarnost, Ministrstvo za zdravje/Urad Republike Slovenije za kemikalije, Ljubljana, 2009.

[2] Chris Binns, Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, Wiley, 2010. [3] G. Krylova, M.I. Bodnarchuk, U.I. Tromsdorf, E.V. Shevchenko, D.V. Talapin, H.

Weller, Synthesis, properties and applications of magnetic nanoparticles, Nanoparticles Theory Appl., Second, Wiley-vch, Weinheim, 2010, 239–311.

[4] S. Shah, A. Sharma, M.N. Gupta, Preparation of cross-linked enzyme aggregates by using bovine serum albumin as a proteic feeder, Anal. Biochem. 351, 2006, 207–213.

[5] J. Navodnik, Slovenija je ustvarjena za nanotehnologije: izdelki in tehnologije prihodnosti, Navodnik, 2007.

[6] W. Liu, L. Wang, R. Jiang, Specific Enzyme Immobilization Approaches and Their Application with Nanomaterials, Top. Catal. 55, 2012, 1146–1156.

[7] S.A. Costa, H.S. Azevedo, R.L. Reis, Enzyme immobilization in biodegradable polymers for biomedical applications, 2005, 301-323.

[8] Nisha S., Arun Karthick S., Gobi N., A review on methods, applications and properties of immobilized enzyme, Chem. Sci. Rev. Lett. 2012, 148–155.

[9] C. Spahn, S.D. Minteer, Enzyme immobilization in biotechnology, Recent Pat. Eng. 2, 2008, 195–200.

[10] Meta Filipič, Nanotehnologije in nanoživila, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2012.

[11] Stanislav Čampelj, Darko Makovec, Marjan Bele, Miha Drofenik, Janko Jamnik, Sinteza magnetnih nanodelcev, funkcionaliziranih s tanko plastjo silike, Mater. Tehnol. 41, 2007, 103–107.

[12] C.G.C.M. Netto, H.E. Toma, L.H. Andrade, Superparamagnetic nanoparticles as versatile carriers and supporting materials for enzymes, J. Mol. Catal. B Enzym. 2013, 71–92.

[13] B.H. Ong, N.K. Devaraj, Superparamagnetic Nanoparticles, Carbon Oxide Nanostructures, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, 2010, 375–393.

[14] S. Andreescu, M. Ornatska, J.S. Erlichman, A. Estevez, J.C. Leiter, Biomedical Applications of Metal Oxide Nanoparticles, E. Matijević (Ed.), Fine Part. Med. Pharm., Springer US, Boston, MA, 2012, 57–100.

[15] K. Khoshnevisan, A.-K. Bordbar, D. Zare, D. Davoodi, M. Noruzi, M. Barkhi, Immobilization of cellulase enzyme on superparamagnetic nanoparticles and determination of its activity and stability, Chem. Eng. J. 171, 2011, 669–673.

[16] W. Xie, N. Ma, Immobilized Lipase on Fe3O4 Nanoparticles as Biocatalyst for Biodiesel Production, Energy Fuels. 23, 2009, 1347–1353.

[17] F. Šulek, Ž. Knez, M. Habulin, Immobilization of cholesterol oxidase to finely dispersed silica-coated maghemite nanoparticles based magnetic fluid, Appl. Surf. Sci. 256, 2010, 4596–4600.

[18] M. Faraji, Y. Yamini, M. Rezaee, Magnetic Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Functionalization, Characterization, and applications, J. Iran. Chem. Soc., 2010, 1–37.

[19] A. Košak, D. Makovec, A. Žnidaršič, M. Drofenik, Priprava magnetnih tekočin, Mater. Tehnol., 2005, 37–41.

[20] W. Wu, Q. He, C. Jiang, Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis and Surface Functionalization Strategies, Nanoscale Res. Lett. 3, 2008, 397–415.

[21] J. Chomoucka, J. Drbohlavova, D. Huska, V. Adam, R. Kizek, J. Hubalek, Magnetic nanoparticles and targeted drug delivering, Pharmacol. Res. 62, 2010, 144–149.

[22] P. Phanapavudhikul, S. Shen, W. Kiong Ng, and R.B.H. Tan, Formulation of Fe3O4/Acrylate Co-Polymer Nanocomposites as Potential Drug Carriers, Drug Deliv. 2008, 177–183.

[23] A.D. Bucak S., Yavuztürk B., Demir Sezer A., Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems, InTech, 2012.


97

[24] H. Arami, Z. Stephen, O. Veiseh, M. Zhang, Chitosan-Coated Iron Oxide Nanoparticles for Molecular Imaging and Drug Delivery, R. Jayakumar, M. Prabaharan, R.A.A. Muzzarelli, Chitosan Biomater. I, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, 2011, 163–184.

[25] T.C. Montenegro Stamford, T. Montenegro, H.M. de Medeiros Cavalcante, R. Oliveira, G.M. de Campos-Takaki, Microbiological Chitosan: Potential Application as Anticariogenic Agent, A. Andrade, Pract. Appl. Biomed. Eng., InTech, 2013.

[26] B. Krajewska, Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review, Enzyme Microb. Technol. 35, 2004, 126–139.

[27] S.D. Minteer, ed., Enzyme Stabilization and Immobilization, Humana Press, Totowa, NJ, 2011.

[28] S. Strnad, O. Šauperl, L. Fras, A. Jazbec, Hitozan–vsestransko uporaben biopolimer, Tekstilec. 50, 2007.

[29] H. Honarkar, M. Barikani, Applications of biopolymers I: chitosan, Monatshefte Für Chem. - Chem. Mon. 140, 2009, 1403–1420.

[30] K. Yao, J. Li, F. Yao, Y. Yin, Chitosan-Based Hydrogels: Functions and Applications, CRC Press, 2011.

[31] Y.-Y. Liang, L.-M. Zhang, Bioconjugation of papain on superparamagnetic nanoparticles decorated with carboxymethylated chitosan, Biomacromolecules. 8, 2007, 1480–1486.

[32] G.-Y. Li, Y.-R. Jiang, K.-L. Huang, P. Ding, L.-L. Yao, Kinetics of adsorption of Saccharomyces cerevisiae mandelated dehydrogenase on magnetic Fe3O4–chitosan nanoparticles, Colloids Surf. Physicochem. Eng. Asp. 320, 2008, 11–18.

[33] D.-S. Jiang, S.-Y. Long, J. Huang, H.-Y. Xiao, J.-Y. Zhou, Immobilization of Pycnoporus sanguineus laccase on magnetic chitosan microspheres, Biochem. Eng. J. 25, 2005, 15–23.

[34] C.-H. Kuo, Y.-C. Liu, C.-M.J. Chang, J.-H. Chen, C. Chang, C.-J. Shieh, Optimum conditions for lipase immobilization on chitosan-coated Fe3O4 nanoparticles, Carbohydr. Polym. 87, 2012, 2538–2545.

[35] T. Feng, Y. Du, J. Yang, J. Li, X. Shi, Immobilization of a nonspecific chitosan hydrolytic enzyme for application in preparation of water-soluble low-molecular-weight chitosan, J. Appl. Polym. Sci. 101, 2006, 1334–1339.

[36] J.M. Guisan, Immobilization of enzymes and cells, Humana Press, Totowa, N.J., 2006. [37] J.B. Jolita Aniulyte, J. Liesiene, Activation of cellulose-based carriers with

pentaethylenehexamine, in: Proc. Est. Acad. Sci. Chem., Estonian Academy Publishers, 2006, 61–69.

[38] D. Brady, J. Jordaan, Advances in enzyme immobilisation, Biotechnol. Lett. 31, 2009, 1639–1650.

[39] W. Tischer, F. Wedekind, Immobilized enzymes: methods and applications, in: Biocatal.- Discov. Appl., Springer, 1999, 95–126.

[40] G.F. Bickerstaff, Immobilization of Enzymes and Cells, Humana Press, New Jersey,1997.

[41] R.K. Sukumaran, R.R. Singhania, A. Pandey, Microbial Cellulases - production, applications and challenges, J. Sci. Ind. Res., 2005, 832–844.

[42] M.K. Bhat, Cellulases and related enzymes in biotechnology, Biotechnol. Adv. 18, 2000, 355–383.

[43] H.A. Murad, H.H. Azzaz, Cellulase and dairy animal feeding, 2010, 238–256. [44] A.E. Golan, Cellulase types and action, mechanism, and uses, Nova Science

Publishers, New York, N.Y., 2011. [45] L. Pollegioni, L. Piubelli, G. Molla, Cholesterol oxidase: biotechnological applications,

FEBS J. 276, 2009, 6857–6870. [46] G.K. Kouassi, J. Irudayaraj, G. McCarty, Examination of cholesterol oxidase

attachment to magnetic nanoparticles, J Nanobiotechnol. 3, 2005, 1–9.


98

[47] S. Ahmad, P. Goswami, Application of chitosan beads immobilized Rhodococcus sp. NCIM 2891 cholesterol oxidase for cholestenone production, Process Biochem. 49, 2014, 2149–2157.

[48] L. Kumari, Cholesterol Oxidase and Its Applications, Adv. Microbiol. 02, 2012, 49–65. [49] E. Yapar, S.K. Kayahan, A. Bozkurt, L. Toppare, Immobilizing cholesterol oxidase in

chitosan–alginic acid network, Carbohydr. Polym. 76, 2009, 430–436. [50] Z. Li, C. Xie, J. Wang, A. Meng, F. Zhang, Direct electrochemistry of cholesterol

oxidase immobilized on chitosan–graphene and cholesterol sensing, Sens. Actuators B Chem. 208, 2015, 505–511.

[51] J. Singh, M. Srivastava, P. Kalita, B.D. Malhotra, A novel ternary NiFe2O4/CuO/FeO-chitosan nanocomposite as a cholesterol biosensor, Process Biochem. 47, 2012, 2189–2198.

[52] S. Datta, L.R. Christena, Y.R.S. Rajaram, Enzyme immobilization: an overview on techniques and support materials, 3 Biotech. 3, 2013, 1–9.

[53] B.M. Brena, F. Batista-Viera, Immobilization of enzymes, Immobil. Enzym. Cells, Springer, 2006, 15–30.

[54] U. Hanefeld, Immobilisation of hydroxynitrile lyases, Chem. Soc. Rev. 42, 2013, 6308-6321.

[55] Natalija Čurič, Imobilizacija encima a-amilaze v zamrežene encimske skupke (CLEA), 2010.

[56] D.M. Glick, Methods of biochemical analysis, Interscience, New York; J. Wiley & Sons, 1963.

[57] A. Illanes, Enzyme biocatalysis principles and applications, Springer, Dordrecht, 2008. [58] R.A. Sheldon, Cross-Linked Enzyme Aggregates as Industrial Biocatalysts, Org.

Process Res. Dev. 15, 2011, 213–223. [59] R. Schoevaart, M.W. Wolbers, M. Golubovic, M. Ottens, A.P.G. Kieboom, F. van

Rantwijk, et al., Preparation, optimization, and structures of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs), Biotechnol. Bioeng. 87, 2004, 754–762.

[60] M.N. Gupta, S. Raghava, Enzyme Stabilization via Cross-Linked Enzyme Aggregates, in: S.D. Minteer, Enzyme Stab. Immobil., Humana Press, Totowa, NJ, 2011, 133–145.

[61] N. Okafor, Modern industrial microbiology and biotechnology, Science Publishers, Enfield, 2007.

[62] Franja Šulek, Nanostrukturirani materiali za imobilizacijo biokataliztatorja, 2011. [63] R.M. Cornell, U. Schwertmann, The iron oxides: structure, properties, reactions,

occurrences, and uses, 2nd, completely rev. and extended ed, Wiley-VCH, Weinheim, 2003.

[64] Olivija Plohl, Priprava in karakterizacija CuNi nanodelcev s silikatno prevleko, 2012. [65] Manja Kurečič, Sinteza nanokompozitnih hidrogelov v porah pp membrane, 2011. [66] L. Raymond, F.G. Morin, R.H. Marchessault, Degree of deacetylation of chitosan using

conductometric titration and solid-state NMR, Carbohydr. Res. 246, 1993, 331–336. [67] H.-Y. Zhu, R. Jiang, L. Xiao, W. Li, A novel magnetically separable γ-

Fe2O3/crosslinked chitosan adsorbent: Preparation, characterization and adsorption application for removal of hazardous azo dye, J. Hazard. Mater. 179, 2010, 251–257.

[68] D. Bhattacharya, S.K. Sahu, I. Banerjee, M. Das, D. Mishra, T.K. Maiti, et al., Synthesis, characterization, and in vitro biological evaluation of highly stable diversely functionalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles, J. Nanoparticle Res. 13, 2011, 4173–4188.

[69] Bradford MM, A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding, Anal. Biochem., 1976, 248–254.

[70] S. Mohammadi-Samani, R. Miri, M. Salmanpour ,N. Khalighian, S. Sotoudeh , N. Erfani, Preparation and assessment of chitosan-coated superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles for controlled delivery of methotrexate, Res. Pharm. Sci. 2013, 25–33.


99

[71] R.-S. Juang, F.-C. Wu, R.-L. Tseng, Solute adsorption and enzyme immobilization on chitosan beads prepared from shrimp shell wastes, Bioresour. Technol. 80, 2001, 187–193.

[72] A.S. Teja, P.-Y. Koh, Synthesis, properties, and applications of magnetic iron oxide nanoparticles, Prog. Cryst. Growth Charact. Mater. 55, 2009, 22–45.

[73] R. López, M. Pineda, G. Hurtado, R. León, S. Fernández, H. Saade, et al., Chitosan-Coated Magnetic Nanoparticles Prepared in One Step by Reverse Microemulsion Precipitation, Int. J. Mol. Sci. 14, 2013, 19636–19650.

[74] M.K. Yu, J. Park, S. Jon, Targeting Strategies for Multifunctional Nanoparticles in Cancer Imaging and Therapy, Theranostics. 2, 2012, 3–44.

[75] P.E.G. Casillas, C.A.R. Gonzalez, C.A.M. Pérez, Infrared Spectroscopy of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Infrared Spectrosc.-Mater. Sci. Eng. Technol. Publ. InTech., 2012, 405-420.

[76] J.-H. Park, K.-H. Im, S.-H. Lee, D.-H. Kim, D.-Y. Lee, Y.-K. Lee, et al., Preparation and characterization of magnetic chitosan particles for hyperthermia application, J. Magn. Magn. Mater. 293, 2005, 328–333.

[77] J.W. Loh, G. Yeoh, M. Saunders, L.-Y. Lim, Uptake and cytotoxicity of chitosan nanoparticles in human liver cells, Toxicol. Appl. Pharmacol. 249, 2010, 148–157.

[78] J.-P. Chen, P.-C. Yang, Y.-H. Ma, T. Wu, Characterization of chitosan magnetic nanoparticles for in situ delivery of tissue plasminogen activator, Carbohydr. Polym. 84, 2011, 364–372.

[79] H.L. Yang, Y. Xin, Y.R. Zhang, Chemically Modified Sepharose as Support for the Immobilization of Cholesterol Oxidase, J. Microbiol. Biotechnol. 23, 2013, 1212–1220.

[80] M.P.C. Marques, P. Fernandes, J.M.S. Cabral, P. Žnidaršič-Plazl, I. Plazl, Continuous steroid biotransformations in microchannel reactors, New Biotechnol. 29, 2012, 227–234.

[81] D. Dorniani, M. Hussein, A. Kura, S. Fakurazi, A. Shaari, Z. Ahmad, Sustained Release of Prindopril Erbumine from Its Chitosan-Coated Magnetic Nanoparticles for Biomedical Applications, Int. J. Mol. Sci. 14, 2013, 23639–23653.

[82] E. Mirzaei B., A. Ramazani S. A., M. Shafiee, M. Danaei, Studies on Glutaraldehyde Crosslinked Chitosan Hydrogel Properties for Drug Delivery Systems, Int. J. Polym. Mater. 62, 2013, 605–611.

[83] H.C. Costa, B.B. Romão, E.J. Ribeiro, M.M. Resende, Glutaraldehyde Effect in the Immobilization Process of Alpha-Galactosidase from Aspergillus niger in the Ion Exchange Resin Duolite A-568, Chem. Eng. 32, 2013, 1105-1110.

[84] R. Yadav, S. Wanjari, C. Prabhu, V. Kumar, N. Labhsetwar, T. Satyanarayanan, et al., Immobilized Carbonic Anhydrase for the Biomimetic Carbonation Reaction, Energy Fuels. 24, 2010, 6198–6207.

[85] J.N. Talbert, J.M. Goddard, Enzymes on material surfaces, Colloids Surf. B Biointerfaces. 93, 2012, 8–19.

[86] Lei Z, Jiang Q., Synthesis and properties of immobilized pectinase onto the macroporous polyacrylamide microspheres, J. Agric. Food Chem., 2011, 2592–2599.

[87] D.-H. Zhang, L.-X. Yuwen, L.-J. Peng, Parameters Affecting the Performance of Immobilized Enzyme, J. Chem. 2013, 1–7.

[88] Z. Lei, S. Bi, Preparation and properties of immobilized pectinase onto the amphiphilic PS-b-PAA diblock copolymers, J. Biotechnol. 128, 2007, 112–119.

[89] Sara Tominc, Imobilizacija holesterol oksidaze na maghemitne nanodelce modificirane s hitozanom, 2013.

[90] P.V. Iyer, L. Ananthanarayan, Enzyme stability and stabilization—Aqueous and non-aqueous environment, Process Biochem. 43, 2008, 1019–1032.

[91] L.T. Nguyen, K.-L. Yang, Uniform cross-linked cellulase aggregates prepared in millifluidic reactors, J. Colloid Interface Sci. 428, 2014, 146–151.

[92] B.S. Aytar, U. Bakir, Preparation of cross-linked tyrosinase aggregates, Process Biochem. 43, 2008, 125–131.


100

[93] F. Kartal, A. Kilinc, Crosslinked aggregates of Rhizopus oryzae lipase as industrial biocatalysts: Preparation, optimization, characterization, and application for enantioselective resolution reactions, Biotechnol. Prog. 28, 2012, 937–945.

[94] Roger A. Sheldon, Rob Schoevaart, and Luuk M. van Langen, Cross-Linked Enzyme Aggregates, in: Immobil. Enzym. Cells, Humana Press Inc., 2006, 31–46.

[95] S. Talekar, V. Ghodake, A. Kate, N. Samant, C. Kumar, S. Gadagkar, Preparation and characterization of cross-linked enzyme aggregates of Saccharomyces cerevisiae invertase, Aust J Basic Appl Sci. 4, 2010, 4760–4765.

[96] S. Talekar, S. Waingade, V. Gaikwad, S. Patil, N. Nagavekar, Preparation and characterization of cross linked enzyme aggregates (CLEAs) of Bacillus amyloliquefaciens alpha amylase, J. Biochem. Technol. 3, 2012, 349–353.

[97] Z.A. Sinirlioglu, D. Sinirlioglu, F. Akbas, Preparation and characterization of stable cross-linked enzyme aggregates of novel laccase enzyme from Shewanella putrefaciens and using malachite green decolorization, Bioresour. Technol. 146, 2013, 807–811.


101

7 PRILOGE

7.1 Umeritvena krivulja za določevanje koncentracije proteinov po

Bradfordu

y = 0,7091x

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Koncentracija BSA [mg/mL]

Ab

sorb

anca

59

5 n

m

Umeritvena krivulja - Bradford


102

7.2 Tabele z rezultati

Imobilizacija holesterol oksidaze na magnetni nosilec

Vpliv koncentracije glutaraldehida

Material ω GA

(%, (v/v))

c ChOx

(mg mL-1

)

ν (rpm) t imob.

(h)

A (243 nm) Enote

/mL

encima

ρ (%) φ (%)

ChOx

prosta

/ 0,1 / / 0,2443

(10x redčenje)

0,0362 100 /

MC1

1 0,1 300 24 0,1168 0,0017 4,70 46,38

2 0,1 300 24 0,0085 0,00013 0,33 25,38

3 0,1 300 24 0,0808 0,0012 3,09 33,75

MC2

1 0,1 300 24 0,5821 0,0086 23,76 68,19

2 0,1 300 24 0,1445 0,0021 5,55 20,29

3 0,1 300 24 0,1850 0,0027 6,94 48,90

MC3

1 0,1 300 24 0,2380 0,0035 9,07 64,18

2 0,1 300 24 0,0919 0,0014 3,87 15,91

3 0,1 300 24 0,1662 0,0025 6,43 44,48

Vpliv hitrosti stresanja

Material ν

(rpm)

ω GA

(%,

(v/v))

c ChOx

(mg mL-1

)

t imob.

(h)

A

(243 nm)

Enote

/mL

encima

ρ (%) φ (%)

ChOx

prosta

300 / 0,1 / 0,2443

(10x redč.)

0,0362 100 /

500 / 0,1 / 0,239

(10 x redč.)

0,0355 100 /

1400 / 0,1 / 0,2522

(10x redč.)

0,0374 100 /

MC1

300 1 0,1 24 0,0407 0,0006 1,66 47,83

500 1 0,1 24 0,0000 0,0000 0,00 41,31

1400 1 0,1 24 0,3867 0,0057 15,24 95,27

MC1-GA

300 1 0,1 24 0,1168 0,0017 4,70 46,38

500 1 0,1 24 0,0141 0,0002 0,56 45,95

1400 1 0,1 24 0,0118 0,0002 0,54 100,00


103

Material ω GA

(%,

(v/v))

c PEHA

(mol/ L)

c ChOx

(mg mL-1

)

ν

(rpm)

t imob. (h) A

(243 nm)

Enote

/mL

encima

ρ (%)

MC2

300 1 0,1 24 0,5943 0,0088 24,31 25,88

500 1 0,1 24 0,0449 0,0007 1,97 29,54

1400 1 0,1 24 0,2250 0,0033 8,82 100,00

MC2-GA

300 1 0,1 24 0,5821 0,0086 23,76 20,29

500 1 0,1 24 0,0014 0,00002 0,06 27,03

1400 1 0,1 24 0,0431 0,0006 1,60 100,00

MC3

300 1 0,1 24 0,2568 0,0038 10,5 34,58

500 1 0,1 24 0,0930 0,0014 3,94 50,77

1400 1 0,1 24 0,0675 0,0010 2,67 100,00

MC3-GA

300 1 0,1 24 0,0919 0,0014 3,87 64,18

500 1 0,1 24 0,0018 0,00003 0,08 44,59

1400 1 0,1 24 0,0000 0,0000 0,00 59,94

Vpliv spremembe mrežnega povezovalca

Material ω GA

(%,

(v/v))

c PEHA

(mol/

L)

c ChOx

(mg mL-

1)

ν

(rpm)

t imob.

(h)

A

(243

nm)

Enote

/mL

encima

ρ (%) φ (%)

ChOx

prosta

/ / 0,1 / / 0,2506

(10x

redč.)

0,0371 100 /

MC1

1 / 0,1 300 24 0,1168 0,0017 4,70 46,38

/ 0,02 0,1 300 24 0,0495 0,0007 1,89 76,03

MC2

1 / 0,1 300 24 0,5821 0,0086 23,76 68,19

/ 0,02 0,1 300 24 0,1119 0,0017 4,58 50,56

MC3

1 / 0,1 300 24 0,2380 0,0035 9,07 64,18

/ 0,02 0,1 300 24 0,8967 0,0133 35,85 100,00


104

Vpliv spremembe koncentracije encima

Material c ChOx

(mg/mL)

c PEHA

(mol/L)

ν

(rpm)

t imob.

(h)

A (243 nm) Enote

/mL

encima

ρ (%) φ (%)

ChOx

prosta

0,1 / / / 0,2506

(10x redč.)

0,0371 100 /

1 / / / 0,2095

(10x redč.)

0,0310 100 /

MC1

0,1 / 300 24 0,0279 0,0004 1,08 100,00

0,1 0,02 300 24 0,0495 0,0007 1,89 76,03

1 / 300 24 0,0337 0,0050 16,13 21,93

1 0,02 300 24 0,1193 0,0177 57,02 47,47

MC2

0,1 / 300 24 0,1318 0,0020 5,39 91,01

0,1 0,02 300 24 0,1119 0,0017 4,58 50,56

1 / 300 24 0,0877 0,0130 41,94 29,67

1 0,02 300 24 0,1656 0,0245 79,03 35,01

MC3

0,1 / 300 24 0,3090 0,0046 12,40 82,02

0,1 0,02 300 24 0,8967 0,0133 35,85 100,00

1 / 300 24 0,1176 0,0174 56,13 17,64

1 0,02 300 24 0,0986 0,0146 47,10 37,17


105

Stabilnost imobiliziranega encima pri ponovni uporabi

Material

Št.

ciklov

Čas od

začetka

merjenja

A (h)

c ChOx

(mg/mL)

c PEHA

(mol/L)

ν

(rpm)

t

imob.

(h)

A

(243

nm)

Enote

/mL

encima

*ρ (%)

ChOx

prosta

1 / 1 / / / 0,2095

(10x

redč.)

0,0310 100

MC1

1 1,0 1 / 300 24 0,0337 0,0050 100,00

2 2,5 1 / 300 24 0,0000 0,0000 0,00

1 1,0 1 0,02 300 24 0,1103 0,0177 100,00

2 2,5 1 0,02 300 24 0,7131 0,0106 59,89

3 4,0 1 0,02 300 24 0,4711 0,0071 40,11

4 5,5 1 0,02 300 24 0,2255 0,0033 18,64

5 7,0 1 0,02 300 24 0,1695 0,0025 14,12

6 97,0 1 0,02 300 24 0,0000 0,0000 0,00

MC2

1 1,0 1 / 300 24 0,0877 0,0130 100,00

2 2,5 1 / 300 24 0,1665 0,0025 19,23

3 4,0 1 / 300 24 0,0607 0,0009 6,92

4 5,5 1 / 300 24 0,0000 0,0000 0,00

1 1,0 1 0,02 300 24 0,1656 0,0245 100,00

2 2,5 1 0,02 300 24 0,6252 0,0093 37,96

3 4,0 1 0,02 300 24 0,1725 0,0026 10,61

4 5,5 1 0,02 300 24 0,1015 0,0015 6,12

5 7,0 1 0,02 300 24 0,0403 0,0006 2,45

6 97,0 1 0,02 300 24 0,0000 0,0000 0,00

MC3

1 1,0 1 / 300 24 0,1174 0,0174 100,00

2 2,5 1 / 300 24 0,2540 0,0038 21,84

3 4,0 1 / 300 24 0,1049 0,0016 9,20

4 5,5 1 / 300 24 0,0000 0,0000 0,00

1 1,0 1 0,02 300 24 0,0986 0,0146 100

2 2,5 1 0,02 300 24 0,9577 0,0142 97,26

3 4,0 1 0,02 300 24 0,7914 0,0117 80,14

4 5,5 1 0,02 300 24 0,5427 0,0080 54,79

5 7,0 1 0,02 300 24 0,4356 0,0065 44,52

6 97,0 1 0,02 300 24 0,1724 0,0026 17,82

7 98,0 1 0,02 300 24 0,1250 0,0019 13,01

8 120,0 1 0,02 300 24 0,0301 0,0005 3,08


106

Material

Št.

ciklov

Čas od

začetka

merjenja

A (h)

c ChOx

(mg/mL)

c PEHA

(mol/L)

ν

(rpm)

t

imob.

(h)

A

(243

nm)

Enote

/mL

encima

*ρ (%)

9 121,0 1 0,02 300 24 0,0232 0,0003 2,05

10 122,0 1 0,02 300 24 0,0000 0,0000 0,00

Imobilizacija celulaze v obliki zamreženih encimskih skupkov

Reakcija obarjanja

Obarjalni reagent A (340 nm, 2,5min) U/mL encima Preostala aktivnost

[%] Prosti encim 0,9530 11,874 100,00

Etanol 0,7980 9,943 83,74

Aceton 0,7943 9,897 83,35

Metanol 0,7500 9,345 78,78

2-propanol 0,7880 9,818 82,68

Propanol 0,8030 10,005 84,26

Amonijev sulfat 0,7550 9,410 79,25

Reakcija zamreženja

Obarjalni reagent

A (595 nm)

ccelulaze [mg/mL]

Učinkovitost [%]

A (340 nm,

2,5min) U/mL

encima

Preostala aktivnost

[%]

Etanol

supernatant 0,7336 4,1959 80,90 0,2380 2,965 24,95

spiranje 1 0,0715

spiranje 2 0,0228

Aceton

supernatant 0,8891 3,8602 74,43 0,0210 0,021 2,20

spiranje 1 0,1855

spiranje 2 0,0338

Metanol

supernatant 1,0313 3,8015 73,30 0,2482 3,093 26,02

spiranje 1 0,1159

spiranje 2 0,0101

2-propanol

supernatant 0,6553 4,0355 77,80 0,0856 1,067 8,97

spiranje 1 0,2481

spiranje 2 0,0584

Propanol

supernatant 0,7331 3,4196 65,83 0,5940 7,401 62,26

spiranje 1 0,1562

spiranje 2 0,5871

Amonijev sulfat

supernatant 0,619 1,8928 36,50 0,1839 2,291 19,28

spiranje 1 1,5861

spiranje 2 0,5471

Prosti encim 0,4334 5,1867 100,00 0,794 9,893 100,00


107

Stabilnost CLEAs pri ponovni uporabi

Material

Št.

ciklov

Čas od

začetka

merjenja A

(h)

cGA

(%)

tzamreženja

(h)

A

(340nm)

Enote

/mL

encima

*ρ (%)

Prosta

celulaza 1 2 / / 100,0

CLEAs

etanol

1 2 1 3 0,224 2,795 100,0

2 4 1 3 0,219 2,726 97,5

3 6 1 3 0,211 2,629 94,1

4 8 1 3 0,205 2,548 91,2

5 10 1 3 0,157 1,960 70,1

6 26 1 3 0,145 1,800 64,4

7 28 1 3 0,168 2,098 75,1

8 147 1 3 0,135 1,683 60,2

9 317 1 3 0,083 1,032 36,9

10 319 1 3 0,096 1,190 42,6

CLEAs

metanol

1 2 1 3 0,127 1,586 100,0

2 4 1 3 0,105 1,308 82,5

3 6 1 3 0,096 1,198 75,5

4 8 1 3 0,100 1,249 78,7

5 10 1 3 0,083 1,028 64,8

6 26 1 3 0,070 0,870 54,9

7 28 1 3 0,088 1,009 63,6

8 147 1 3 0,067 0,834 52,6

9 317 1 3 0,062 0,773 48,7

10 319 1 3 0,054 0,677 42,7

CLEAs

propanol

1 2 1 3 0,374 4,663 100,0

2 4 1 3 0,356 4,436 95,1

3 6 1 3 0,333 4,143 88,8

4 8 1 3 0,318 3,957 84,9

5 10 1 3 0,257 3,202 68,7

6 26 1 3 0,209 2,610 55,9

7 28 1 3 0,223 2,772 59,4

8 147 1 3 0,179 2,234 47,9

9 317 1 3 0,162 2,020 43,3

10 319 1 3 0,110 1,367 29,3

CLEAs 1 2 1 3 0,213 2,650 100,0


108

Material

Št.

ciklov

Čas od

začetka

merjenja A

(h)

cGA

(%)

tzamreženja

(h)

A

(340nm)

Enote

/mL

encima

*ρ (%)

amonijev

sulfat

2 4 1 3 0,182 2,268 85,6

3 6 1 3 0,158 1,966 74,2

4 8 1 3 0,134 1,669 62,9

5 10 1 3 0,108 1,341 50,6

6 26 1 3 0,119 1,480 55,8

7 28 1 3 0,100 1,248 47,1

8 147 1 3 0,090 1,121 42,3

9 317 1 3 0,054 0,673 25,4

10 319 1 3 0,059 0,731 27,6


109

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

Izjava doktorskega kandidata

Podpisana Gordana Hojnik Podrepšek, vpisna številka K3000250,

izjavljam,

da je doktorska disertacija z naslovom Sinteza in karakterizacija mikro- in nanonosilcev za imobilizacijo encimov

rezultat lastnega raziskovalnega dela,

da predložena disertacija v celoti ali v delih ni bila predložena za pridobitev kakršnekoli izobrazbe po študijskih programih drugih fakultet ali univerz,

da so rezultati korektno navedeni in

da nisem kršila avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih.

Podpis doktorskega kandidata


110

Življenjepis

OSEBNI PODATKI Hojnik Podrepšek Gordana

Župančičeva ulica 6, 2000 Maribor (Slovenija)

00386 40 887 598

[email protected]

DELOVNE IZKUŠNJE

IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE

KOMPETENCE

7.11. 2010–v teku Mlada raziskovalka

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Maribor (Slovenija)

- opravljanje raziskovalnega dela v laboratoriju,

- izvajanje kvantitativnih in kvalitativnih analiz (UV-spektrofotometer, FTIR, HPLC, DLS, TGA/DSC, laserski granulometer, SEM,...),

- projektno delo (načrtovanje, priprava dokumentacije, raziskava, priprava poročil),

- pomoč študentom pri eksperimentalnem delu diplomske naloge,

- objava stokovnih člankov in prispevkov na konferencah,...

1.10. 2009–1.12. 2009 Študent demonstrator

Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Maribor

- pomoč študentom pri laboratorijskih vajah,

- priprava preparatov,

- pomoč pri mikroskopiranju.

1.6. 2009–19.6. 2009 Profesor biologije in kemije

OŠ Franca Rozmana-Staneta, Maribor

- izvajanje pouka kemije, biologije in naravoslovja na 3. triadi.

1992–2000 Končana osnovna šola

OŠ Franca Rozmana-Staneta, Maribor (Slovenija)

2000–2004 Gimnazijska maturantka

Prva gimnazija Maribor, Maribor (Slovenija)

2004–2.7. 2010 Univerzitetna diplomirana profesorica biologije in kemije

Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Maribor (Slovenija)

7.10. 2010–v teku Doktor znanosti s področja kemijske tehnike

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Maribor (Slovenija)

Materni jezik slovenščina


111

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno

sporazumevanje Govorno sporočanje

angleščina C1 C1 B2 B2 B2

nemščina A2 A2 A1 A1 A1

hrvaščina B2 B1 B1 B2 B1

španščina B1 B1 A2 A2 A1

Stopnja: A1 in A2: Osnovni uporabnik - B1 in B2: Samostojni uporabnik - C1 in C2: Usposobljeni uporabnik Skupni evropski jezikovni okvir

Komunikacijske kompetence ▪ Sposobnosti delovanja v timu,

▪ sposobnost komunikacije,

▪ sposobnost opazovanja,

▪ sposobnost koncentracije.

Organizacijske/vodstvene kompetence

▪ Občutljivost za potrebe in želje drugih,

▪ odgovornost sprejemanja posledic,

▪ vzdržljivost ob naporu,

▪ sodelovalnost,

▪ veščina učinkovitega organiziranja svojega dela.

Strokovne kompetence ▪ Sposobnost prebiranja strokovne literature,

▪ sposobnost pisanja strokovnih člankov in prispevkov za mednarodne konference,

▪ pedagoške sposobnosti,

▪ študiranje in razvijanje novih metod in inovativnih produktov.

Računalniške kompetence ▪ Dobro poznavanje orodij Microsoft Office (Word, Excell, PowerPoint), Zotero, ChemSketch,

▪ dobro poznavanje uporabe svetovnega spleta.

http://europass.cedefop.europa.eu/sl/resources/european-language-levels-cefr


112

Bibliografija kandidata v neposredni zvezi z doktorsko disertacijo

Gordana Hojnik Podrepšek

Osebna bibliografija za obdobje 2000-2015

ČLANKI IN DRUGI SESTAVNI DELI

1.01 Izvirni znanstveni članek

1. LEITGEB, Maja, HERŽIČ, Katja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, HOJSKI, Aljaž, CRNJAC, Anton, KNEZ, Željko. Toxicity of magnetic chitosan micro and nanoparticles as carriers for biologically active substances. Acta chimica slovenica, ISSN 1318-0207. [Tiskana izd.], 2014, vol. 61, no. 1, str. 145-152, ilustr. http://acta.chem-soc.si/61/61-1-145.pdf. [COBISS.SI-ID 4955199]

2. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Synthesis comparison and characterization of chitosan-coated magnetic nanoparticles prepared with different methods = Primerjava postopkov in karakterizacija magnetnih nanodelcev, prevlečenih s hitozanom. Materiali in tehnologije, ISSN 1580-2949. [Tiskana izd.], 2014, let. 48, št. 5, str. 689-692, ilustr. [COBISS.SI-ID 18207766]

3. ŠALIĆ, Anita, PINDRIĆ, Katarina, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, LEITGEB, Maja, ZELIĆ, Bruno. NADH oxidation in a microreactor catalyzed by ADH immobilized on /gamma-Fe_2O_3 nanoparticles. V: ŽNIDARŠIČ PLAZL, Polona (ur.). The 2nd international conference Implementation of microreactor technology in biotechnology (IMTB 2013), May 5-8, 2013, Cavtat, Croatia, (Green Processing and Synthesis, ISSN 2191-9550, vol. 2, Iss. 6, 2013). [S. l.: s. n.], 2013, vol. 2, iss. 6, str. 569-578, doi: 10.1515/gps-2013-0084. [COBISS.SI-ID 17312022]

tipologija 1.08 -> 1.01

4. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Different preparation methods and characterization of magnetic maghemite coated with chitosan. Journal of nanoparticle research, ISSN 1388-0764, 2013, issue 6, art. no. 1751, str. 1-12, doi: 10.1007/s11051-013-1751-x. [COBISS.SI-ID 16941078]

5. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, PRIMOŽIČ, Mateja, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Immobilization of cellulase for industrial production. V: 3nd International Conference on Industrial biotechnology, 24-27 June, 2012 Palermo, Italy. BARDONE, Enrico (ur.). IBIC2012, (Chemical Engineering transactions, ISSN 1974-9791, Vol. 27, 2012). Milano: AIDIC, cop. 2012, str. 235-240, doi: 10.3303/CET1227040. [COBISS.SI-ID 16121110]

tipologija 1.08 -> 1.01


113

1.06 Objavljeni znanstveni prispevek na konferenci (vabljeno predavanje)

6. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Vpliv SC CO2 na aktivnost imobilizirane hrenove peroksidaze v zamreženih encimskih skupkih. V: KRAVANJA, Zdravko (ur.), BRODNJAK-VONČINA, Darinka (ur.), BOGATAJ, Miloš (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2012, Portorož, 12.-14. september 2012 = Slovenian Chemical Days 2012, Portorož, September 12-14, 2012. Maribor: FKKT, 2012, str. 1-6. [COBISS.SI-ID 16284950]

1.08 Objavljeni znanstveni prispevek na konferenci

7. LEITGEB, Maja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko. Stability determination of cross-linked cellulase aggregates in supercritical carbon dioxide. V: SKALA, Dejan (ur.), DEKANSKI, Aleksandar (ur.). Proceedings. Belgrade: Association of Chemical Engineers of Serbia, 2013, str. 218-222. [COBISS.SI-ID 17199126]

8. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Imobilizacija holesterol oksidaze na magnetne nanodelce modificirane s hitozanom. V: KRAVANJA, Zdravko (ur.), BRODNJAK-VONČINA, Darinka (ur.), BOGATAJ, Miloš (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2013, Maribor, 10.-12. september 2013. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2013, str. 1-5. [COBISS.SI-ID 17147926]

9. PRIMOŽIČ, Mateja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, PAVLOVIČ, Irena, ŠKERGET, Mojca, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Imobilizacija encima na biooglje pridobljeno s postopkom hidrotermične karbonizacije biomase. V: KRAVANJA, Zdravko (ur.), BRODNJAK-VONČINA, Darinka (ur.), BOGATAJ, Miloš (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2013, Maribor, 10.-12. september 2013. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2013, str. 1-7. [COBISS.SI-ID 17149206]

10. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, PRIMOŽIČ, Mateja, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Preparation and characterization of chitosan coated maghemite nanoparticles for enzyme immobilization. V: 20th International Congress of Chemical and Process Engineering [and] 15th Conference PRES, 25 - 29 August 2012, Prague, Czech Republic. CD-ROM of full texts. Prague: [s. n.], cop. 2012, str. 1-7. [COBISS.SI-ID 16257814]

11. HERŽIČ, Katja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Priprava magnetnih hitozanskih nanodelcev za vezavo biološko aktivnih substanc ter njihov toksikološki vpliv. V: KRAVANJA, Zdravko (ur.), BRODNJAK-VONČINA, Darinka (ur.), BOGATAJ, Miloš (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2012, Portorož, 12.-14. september 2012 = Slovenian Chemical Days 2012, Portorož, September 12-14, 2012. Maribor: FKKT, 2012, str. 1-6. [COBISS.SI-ID 16285462]

12. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, SUDAR, Martina, FINDRIK, Zvjezdana, VASIĆ-RAČKI, Đurđa, PRIMOŽIČ, Mateja, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja.


114

Immobilization of enzyme on superparamagnetic nanoparticles coated with chitosan. V: 2nd Conference on Applied Biocatalysis and 7th Meeting of Students and University Professors from Maribor and Zagreb, November 7th and 8th 2011, Maribor, Slovenia. LEITGEB, Maja (ur.), PRIMOŽIČ, Mateja (ur.). 2nd Conference on "Applied Biocatalysis" and 7th Meeting of Students and University Professors from Maribor and Zagreb, November 7th and 8th 2011, Maribor, Slovenia. Maribor: Faculty of Chemistry and Chemical Engineering; Zagreb: Faculty of Chemical Engineering and Technology, 2011, 4 str. [COBISS.SI-ID 15716630]

13. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Priprava in karakterizacija magnetnih hitozanskih nanodelcev za imobilizacijo encimov = Preparation and characterization of magnetic chitosan nanoparticles for enzyme immobilization. V: KRAVANJA, Zdravko (ur.), BRODNJAK-VONČINA, Darinka (ur.), BOGATAJ, Miloš (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2011, Portorož, 14-16 september 2011. Maribor: FKKT, 2011, 4 str. [COBISS.SI-ID 15335190]

1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci

14. HERŽIČ, Katja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, LEITGEB, Maja, KNEZ, Željko. Chitosan-based magnetic micro and nanoparticles as carriers for bioactive substances and their toxicity. V: 21st International Congress of Chemical and Process Engineering CHISA 2014 [and] 17th Conference PRES 2014, 23 - 27 August 2014, Praha, Czech Republic. Praha: [s. n.], 2014, 1 str. [COBISS.SI-ID 18096150]

15. LEITGEB, Maja, HERŽIČ, Katja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, HOJSKI, Aljaž, CRNJAC, Anton, KNEZ, Željko. Toxicity of magnetic chitosan micro and nanoparticles as carriers for biologically active substances. V: Book of abstracts. Dresden: [s. n.], 2014, str. 108. [COBISS.SI-ID 17911574]

16. ŠALIĆ, Anita, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, LEITGEB, Maja, ZELIĆ, Bruno. Coenzyme regeneration in microreactor catalyzed by alcohol dehydrogenase immobilized on Fe[sub]2O[sub]3 nanoparticles. V: International Conference Implementation of Microreactor Technology in Biotechnology, Cavtat, 5-8 May, 2013. CVJETKO, M. (ur.), et al. IMTB 2013 : CD of extended abstracts. Cavtat: Faculty of Chemical Engineering and Technology, 2013, str. 29-30. [COBISS.SI-ID 16887830]

17. LEITGEB, Maja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko. Synthesis comparison and characterization of chitosan coated magnetic nanoparticles prepared by different methods. V: 21. Mednarodna konferenca o materialih in tehnologijah, 13.-15. november 2013, Portorož = 21st International Conference on Materials and Technology, 13-15 November 2013, Portorož, Slovenia. GODEC, Matjaž (ur.), et al. Program in knjiga povzetkov = Program and book of abstracts. Ljubljana: Inštitut za kovinske materiale in tehnologije, 2013, str. 119. http://icmt21.imt.si/fileadmin/dokumenti/21._konferenca/Book_of_Abstracts_21_ICM_T.pdf. [COBISS.SI-ID 17326358]


115

18. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, PRIMOŽIČ, Mateja, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Maghemite chitosan nanoparticles for biomedical applications. V: IX. susret mladih kemijskih inženjera, Zagreb, 16. i 17. veljače 2012. Knjiga sažetaka = Book of abstracts. Zagreb: Hrvatsko društvo kemijskih inženjera i tehnologa, 2012, str. 135. [COBISS.SI-ID 15808022]

19. AMBROŽIČ-DOLINŠEK, Jana, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, ŠORGO, Andrej. Knowledge and attitudes of students about gene therapy - preliminary study. V: GÓMEZ CHOVA, Louis (ur.), CANDEL TORRES, I. (ur.), LÓPEZ MARTÍNEZ, A. (ur.). INTED 2011 : International Technology, Education and Development Conference, 5th edition, Valencia (Spain), 7th-9th March, 2011 : conference proceedings cd. [Compact disc ed.]. Valencia: International Association of Technology, Education and Development (IATED), 2011, str. 5937. [COBISS.SI-ID 18236168]

1.16 Samostojni znanstveni sestavek ali poglavje v monografski publikaciji

20. LEITGEB, Maja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko. Magnetic nanocarriers for targeted drug delivery. V: SABBAS, Nora P. (ur.). Magnetic nanoparticles : synthesis, physicochemical properties and role in biomedicine, (Nanotechnology science and technology). New York: Nova Science Publishers, 2014, str. 201-230, ilustr. [COBISS.SI-ID 17988374]

MONOGRAFIJE IN DRUGA ZAKLJUČENA DELA

2.11 Diplomsko delo

21. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana. Izolacija proteinov in encimov iz rastlin in njihova uporaba : diplomska seminarska naloga. Maribor: [G. Hojnik], 2010. 42 f., ilustr., graf. prikazi. [COBISS.SI-ID 17582600]

22. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana. Poznavanje in stališča dijakov in študentov do genetskega zdravljenja : diplomsko delo. Maribor: [G. Hojnik], 2010. VIII, 68 f. http://dkum.uni-mb.si/Dokument.php?id=15662. [COBISS.SI-ID 17748744]

IZVEDENA DELA (DOGODKI)

3.15 Prispevek na konferenci brez natisa

23. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Immobilization of horseradish peroxidase on maghemite nanoparticles functionalized with chitosan : lecture presented at the European congress of chemical engineering and applied biotechnology ECCE9 - ECAB2, World Forum, The Haag, The Netherlands, 21-25 April, 2013. 2013. [COBISS.SI-ID 16878102]


116

24. HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. The activity of cross-linked horseradish peroxidase aggregates (CLEAs) after exposure to supercritical CO2 : lecture presented at Applied Biocatalysis - 8th meeting of student and university profesors, September 19th, 2012, University of Zagreb, Faculty of Chemical Engineering and Technology, Croatia. 2012. [COBISS.SI-ID 16331542]

25. HERŽIČ, Katja, HOJNIK PODREPŠEK, Gordana, KNEZ, Željko, LEITGEB, Maja. Toxic effects of magnetic chitosan nanoparticles as carriers for biologically active substances : lecture presented at Applied Biocatalysis - 8th meeting of student and university profesors, September 19th, 2012, University of Zagreb, Faculty of Chemical Engineering and Technology, Croatia. 2012. [COBISS.SI-ID 16331798]

Izpis bibliografskih enot: vse bibliografske enote

Izbrani format bibliografske enote: ISO 690

Razvrščanje bibliografskih enot: tipologija, leto - padajoče, naslov

Vir bibliografskih zapisov: Vzajemna baza podatkov COBISS.SI/COBIB.SI, 16. 4. 2015

sinteza in karakterizacija nekaterih mikro- in ...imobilizirane holesterol oksidaze smo določili z...

Documents