imobilizacija holesterol oksidaze na maghemitne nanodelce

Sara Tominc

Imobilizacija holesterol oksidaze na maghemitne nanodelce modificirane s hitozanom

Diplomsko delo

Maribor, september 2013

Imobilizacija holesterol oksidaze na maghemitne

nanodelce modificirane s hitozanom

Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa

Študent: Sara Tominc

Študijski program: univerzitetni študijski program Kemijska

tehnologija

Smer: biokemijska tehnika

Predvideni strokovni naslov: univ. dipl. inž. kem. tehn.

Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb

Komentor: doc. dr. Mateja Primožič

Maribor, september 2013


I

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Maribor, september 2013 Sara Tominc


II

ZAHVALA

Zahvaljujem se mentorici red. prof. dr. Maji Leitgeb in

somentorici doc. dr. Mateji Primožič za strokovno

vodenje pri izdelavi diplomskega dela. Zahvaljujem se

tudi mladi raziskovalki Gordani Hojnik Podrepšek za

koristne nasvete in pomoč pri laboratorijskem delu ter

vsem ostalim strokovnim sodelavcem Laboratorija za

separacijske procese in produktno tehniko.

Posebna zahvala gre moji družini, ki me je v času

študija vseskozi spodbujala in mi stala ob strani.

Iskreno se zahvaljujem vsem.


III


Povzetek Namen diplomskega dela je sinteza magnetnih maghemitnih nanodelcev, prevlečenih s

hitozanom po treh različnih postopkih in imobilizacija specifičnega biokatalizatorja,

holesterol oksidaze, na tako pripravljen nosilec. Primerjali smo ohranjeno aktivnost encima

holesterol oksidaze po končanem procesu imobilizacije in učinkovitost imobilizacije

encima na maghemitne nanodelce, prevlečene s hitozanom po treh različnih postopkih. S

spreminjanjem procesnih pogojev smo želeli ugotoviti kateri delci bi bili najprimernejši za

imobilizacijo encima holesterol oksidaze. Spreminjali smo koncentracijo mrežnega

povezovalca glutaraldehida, hitrost stresanja in vrsto stresanja pri imobilizaciji encima,

vrsto mrežnega povezovalca in koncentracijo encima holesterol oksidaze. Zanimala nas je

tudi stabilnost imobiliziranega encima v primerjavi s prostim encimom in vpliv večkratne

uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno aktivnost encima.

Najvišjo ohranjeno aktivnost in učinkovitost smo dosegli pri imobilizaciji encima na

maghemitne nanodelce, prevlečene s hitozanom po tretjem postopku (metoda kovalentne

vezave) in dodatku mrežnega povezovalca PEHA (0,02 M). Najboljše pogoje smo dosegli

pri koncentraciji encima 1 mg/mL, pri hitrosti stresanja 300 rpm in času imobilizacije 24

ur. Tako imobiliziran encim smo lahko ponovno uporabili in z njim smo izvedli deset

ciklov. Po 122 urah pa encim ni bil več aktiven.

Ključne besede: imobilizacija encima, holesterol oksidaza, maghemitni nanodelci,

ohranjena aktivnost encima, učinkovitost imobilizacije

UDK: 577.15:537.622(043.2)


IV

Immobilization of cholesterol oxidase onto maghemite

nanoparticles modified with chitosan

Abstract The purpose of the diploma thesis is the synthesis of magnetic maghemite nanoparticles

coated with chitosan after three different procedures and immobilization of a specific

biocatalyst, cholesterol oxidase, on a ready carrier. We compared the preserved activity of

the enzyme cholesterol oxidase after the immobilization process and the efficiency of

enzyme immobilization on maghemite nanoparticles coated with chitosan after three

different procedures. By varying process conditions, we wanted to determine which

particles would be most suitable for immobilization of the enzyme cholesterol oxidase. We

changed the concentration of a crosslinker glutaraldehyde, the speed of shaking and the

type of shaking at the immobilization of an enzyme, the type of a crosslinker and the

concentration of the enzyme cholesterol oxidase. We were interested in the stability of the

immobilized enzyme in comparison to the free enzyme, and the influence of the multiple

use of an immobilized enzyme on a preserved activity of an enzyme.

We have achieved the highest preserved activity and efficiency at the immobilization of an

enzyme on the maghemite nanoparticles, coated with chitosan, after the third procedure

(the method of covalent bonding) and with the addition of a crosslinker PEHA (0,02 M).

We have achieved the best conditions were at a concentration of an enzyme 1 mg/mL, at a

shaking speed of 300 rpm; and an immobilization for 24 hours. Thus immobilized enzyme

could we re-use for ten cycles. After 122 hours enzyme was no longer active.

Key words: enzyme immobilization, cholesterol oxidase, maghemite nanoparticles,

preserved enzyme activity, immobilization efficiency

UDK: 577.15:537.622(043.2)


V

Kazalo vsebine

1 Uvod ................................................................................................................................... 1

2 Teoretični del ..................................................................................................................... 3

2.1 Nanotehnologija ...................................................................................................... 3

2.1.1 Nanomateriali: uporaba in značilnosti ............................................................. 4

2.1.2 Magnetni nanodelci ......................................................................................... 6

2.1.3 Magnetne tekočine ........................................................................................... 8

2.1.4 Aktivacija magnetnih nanodelcev ................................................................... 9

2.1.4.1 Glutaraldehid (GA) .................................................................................. 9

2.1.4.2 Pentaetilen heksamin (PEHA) ................................................................ 10

2.2 Imobilizacija biokatalizatorja................................................................................ 11

2.2.1 Kovalentna vezava na nosilec........................................................................ 11

2.2.2 Zamreženje encima ........................................................................................ 12

2.2.3 Adsorpcija encima na nosilec ........................................................................ 12

2.2.4 Ujetje encima ................................................................................................. 13

2.2.5 Mikroinkapsulacija ........................................................................................ 13

2.3 Hitozan .................................................................................................................. 15

2.4 Holesterol oksidaza (ChOx) .................................................................................. 17

3 Metode in materiali .......................................................................................................... 18

3.1 Materiali in reagenti .............................................................................................. 18

3.2 Laboratorijska oprema in aparature ...................................................................... 19

3.3 Eksperimentalne metode ....................................................................................... 21

3.3.1 Priprava magnetnih nanodelcev za imobilizacijo biokatalizatorja ................ 21

3.3.2 Priprava magnetnih nanodelcev maghemita .................................................. 21

3.3.3 Priprava magnetne tekočine........................................................................... 23

3.3.4 Postopki priprave hitozanskih maghemitnih nanodelcev .............................. 24

3.3.4.1 Priprava hitozanskih maghemitnih delcev po prvem postopku ............. 24

(postopek mikroemulzije) ........................................................................................ 24

3.3.4.2 Priprava hitozanskih maghemitnih delcev po drugem postopku ........... 25

(metoda zamreženja)................................................................................................ 25


VI

3.3.4.3 Priprava hitozanskih maghemitnih delcev po tretjem postopku ............ 27

(metoda kovalentne vezave) .................................................................................... 27

3.4 Imobilizacija biokatalizatorja na magnetne nanodelce ......................................... 28

3.4.1 Določanje učinkovitosti imobilizacije ........................................................... 28

3.4.1.1 Priprava umeritvene krivulje .................................................................. 29

3.4.1.2 Priprava Bradfordovega reagenta ........................................................... 29

3.4.1.3 Računanje učinkovitosti imobiliziranega encima .................................. 30

3.4.2 Merjenje specifične aktivnosti biokatalizatorja ............................................. 30

3.4.2.1 Priprava reagentov za encimski test ....................................................... 31

3.4.2.2 Encimski test za holesterol oksidazo (ChOx, EC 1.1.3.6) ..................... 31

3.4.2.3 Računanje specifične aktivnosti biokatalizatorja ................................... 32

4 Rezultati in diskusija ........................................................................................................ 34

4.1 Vpliv koncentracije mrežnega povezovalca GA................................................... 34

4.2 Vpliv hitrosti stresanja pri imobilizaciji encima ................................................... 36

4.3 Vpliv mrežnega povezovalca PEHA .................................................................... 38

4.4 Vpliv koncentracije encima .................................................................................. 41

4.5 Vpliv kombinacije različnih mrežnih povezovalcev............................................. 44

4.6 Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno aktivnost encima

...............................................................................................................................45

5 Zaključek .......................................................................................................................... 49

6 Literatura .......................................................................................................................... 50

7 Priloge .............................................................................................................................. 52

7.1 Umeritvena krivulja za določevanje koncentracije proteinov po Bradfordu ........ 52

7.2 Tabele z rezultati ................................................................................................... 53

8 Življenjepis ....................................................................................................................... 58


VII

Seznam tabel

Tabela 4-1: Optimalni reakcijski pogoji za večkratno uporabo imobiliziranega encima .... 46

Tabela 7-1: Vpliv spremembe koncentracije mrežnega povezovalca GA .......................... 53

Tabela 7-2: Vpliv spremembe hitrosti stresanja pri imobilizaciji encima ........................... 53

Tabela 7-3: Vpliv mrežnega povezovalca na imobiliziran encim v primerjavi s prostim ... 54

Tabela 7-4: Vpliv spremembne mrežnega povezovalca pri imobilizaciji encima ............... 54

Tabela 7-5: Vpliv spremembe koncentracije encima pri imobilizaciji encima ................... 55

Tabela 7-6: Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno aktivnost ...... 56


VIII

Seznam diagramov

Diagram 4-1: Učinkovitost imobilizacije encima na hitozanske maghemitne nanodelce,

pripravljene po treh postopkih v odvisnosti od koncentracije mrežnega povezovalca GA . 35

Diagram 4-2: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce,

pripravljene po treh postopkih, v odvisnosti od koncentracije mrežnega povezovalca GA 36


pripravljene po treh postopkih v odvisnosti od hitrosti stresanja pri imobilizaciji encima in

dodatku 1 % GA .................................................................................................................. 37


pripravljene po treh postopkih, v odvisnosti od hitrosti stresanja pri imobilizaciji encima in

dodatku 1 % GA .................................................................................................................. 38

Diagram 4-5: Ohranjena aktivnost imobiliziranega encima z mrežnim povezovalcem 1 %

GA in 0,02 M PEHA v odvisnosti od prostega encima ....................................................... 39


pripravljene po treh postopkih v odvisnosti od mrežnega povezovalca .............................. 40


pripravljene po treh postopkih, v odvisnosti od mrežnega povezovalca ............................. 40

Diagram 4-8: Učinkovitost in ohranjena aktivnost encima, vezanega na hitozanske

maghemitne nanodelce, pripravljene po treh postopkih, pri dodatku 1 mL 0,02 M PEHA in

koncentraciji encima 1 mg/mL ............................................................................................ 42

Diagram 4-9: Učinkovitost imobilizacije encima vezanega na hitozanske maghemitne

nanodelce, pripravljene po treh postopkih, pri različni koncentraciji encima ..................... 43

Diagram 4-10: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na hitozanske maghemitne

nanodelce, pripravljene po treh postopkih, pri različni koncentraciji encima ..................... 43

Diagram 4-11: Učinkovitost in ohranjena aktivnost encima, vezanega na hitozanske

maghemitne nanodelce, pripravljene po treh postopkih, pri dodatku PEHA, pri dodatku 75

% PEHA in 25 % GA ter brez dodatka mrežnega povezovalca in koncentraciji encima 1

mg/ mL ................................................................................................................................ 45


IX

Diagram 4-12: Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na specifično aktivnost v

U/mL encima ....................................................................................................................... 47

Diagram 4-13: Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno aktivnost

encima (%) ........................................................................................................................... 48


X

Seznam slik

Slika 2-1: Maghemit prevlečen z organsko snovjo [7] .......................................................... 7

Slika 2-2: Magnetne tekočine [11] ........................................................................................ 8

Slika 2-3: Struktura glutaraldehida [13] ................................................................................ 9

Slika 2-4: Struktura PEHA [16] .......................................................................................... 10

Slika 2-5: Adsorpcija (a), kovalentna vezava encima na nosilec (b), ujetje encima v

zamrežen polimer (c), inkapsulacija (d) [18]....................................................................... 14

Slika 2-6: Struktura hitina [22] ............................................................................................ 16

Slika 2-7: Struktura hitozana [23] ....................................................................................... 16

Slika 2-8: Kristalna struktrua holesterol oksizade iz b.sterolicum [24] .............................. 17

Slika 3-1: Stresalnik Heidolph Unimax 1010 ...................................................................... 19

Slika 3-2: Magnetno mešalo Rotamix ................................................................................. 20

Slika 3-3: Vorteks Micro+Polo ........................................................................................... 20

Slika 3-4: Sprememba barve iz oranžne v črno z dodatkom amonijaka ............................. 22

Slika 3-5: Magnetna tekočina .............................................................................................. 23

Slika 3-6: Priprava hitozanskih maghemitnih delcev po prvem postopku (segrevanje vodne

kopeli na 70 °C) ................................................................................................................... 25

Slika 3-7: priprava hitozanskih maghemitnih delcev po drugem postopku (mešanje pri

sobni temperaturi) ................................................................................................................ 26

Slika 3-8: Maghemitni delci, pripravljeni po tretjem postopku .......................................... 27

Slika 3-9: Potek reakcije oksidacije holesterola s ChOx [29,30] ........................................ 33


XI

Uporabljeni simboli in kratice

A absorbanca (nm)

c množinska koncentracija (mol/l)

ci koncentracija prostega encima (mg/ml)

cs koncentracija encima v spiranjih (mg/ml)

df dilucijski faktor za razredčevanje vzorca (-)

me masa encima v vzorcu (mg)

mn masa nosilca (magnetnih nanodelcev) (mg)

T temperatura (°C)

Vvzorec volumen vzorca (ml)

Grški simboli

ε molski ekstinkcijski koeficient (M-1cm-1)

λ valovna dolžina (nm)

ρ relativna učinkovitost (%)

φ koncentracija imobiliziraanega encima (mgencim/gnosilec)

Kratice

AEAPS 3-(2-aminoetilamino)-propil-dimetoksimetilsilan

CH3COONa·3H2O vodna raztopina natrijevega acetata

ChOx holesterol oksidaza

CoFe2O4 kobaltov ferit

Fe železo

Fe(OH)3 železov hidroksid


XII

Fe2+ železovi II ioni

Fe3+ železovi III ioni

Fe3O4 magnetit

FeCl3·4H2O železov klorid tetrahidrat

FeCl3·6H2O železov klorid heksahidrat

GA mrežni povezovalec glutaraldehid

H2O2 vodikov peroksid

HCl klorovodikova kislina

MC1 magnetni nanodelci, modificirani s hitozanom po postopku

mikroemulzije

MC2 magnetni nanodelci, modificirani s hitozanom po metodi

zamreženja

MC3 magnetni nanodelci, modificirani s hitozanom po metodi

kovalentne vezi

Na2SiO3 natrijev silikat

NaH2PO4·H2O vodna raztopina natrijevega fosfata

NaOH natrijev hidroksid

NH3 amonijak

O2 kisik

PBS fosfatni pufer

PEHA pentaetilen heksamin

γ-Fe2O3 (MGH) maghemit

γ-Fe2O3/ChOx suspenzija imobilizirane holesterol oksidaze na maghemitne

nanodelce

Imobilizacija holesterol oksidaze na maghemitne nanodelce, modificirane s hitozanom

1

1 Uvod

Biokataliza uporablja naravne katalizatorje, kot so encimi, za izvedbo kemijskih pretvorb

na organskih spojinah. V ta namen se uporabljajo encimi, ki so delno ali popolnoma

izolirani, ali pa se nahajajo v živih celicah. Kot prednosti biokatalize velja izpostaviti

encimsko selektivnost, encimsko aktivnost v »milih« pogojih (pH, temperatura, vodni

medij), možnost katalize številnih reakcij, možnost kombiniranja s kemijsko katalizo in

tudi metabolni inženiring [1].

Encimi so beljakovine ali beljakovinski kompleksi, ki katalizirajo v živih ali neživih

celicah biokemične reakcije. Uravnavajo hitrost in smer reakcij, pri čemer se sami ne

porabljajo in se trajno ne spremenijo. Kot katalizatorji so specifični, saj encim deluje le na

nekatere substrate (včasih na le enega) ali pospešuje samo eno reakcijo. Encime

proizvajajo živi organizmi. Na aktivnost encimov vpliva več dejavnikov: količina

substrata, temperatura, kislost okolja oz. pH stopnja in inhibitorji [2].

Imobilizirani biokatalizatorji so definirani kot encimi, ki so fizično omejeni ali lokalizirani

tako, da se ohranja njihova katalitična aktivnost. Imobilizirane encime lahko v procesih

uporabljamo večkrat in neprekinjeno. Ločimo kemijske in fizikalne metode imobilizacije.

Med kemijske štejemo kovalentno vezavo encima na nosilec in zamreženje encima, med

fizikalne pa adsorpcijo encima na različne nosilce, ujetje encima v zamrežen polimer ter

mikroinkapsulacijo. Encime lahko imobiliziramo z uporabo nosilcev ali brez [3].

Najpomembnejša prednost imobilizacije biokatalizatorjev je enostavno ločevanje

biokatalizatorja iz reakcijske zmesi. To prepreči onesnaževanje biokatalizatorja s

produktom in celo zmanjša stroške obratovanja procesa. Omogoča kontinuirane procese z

manjšo porabo biokatalizatorja ter prihranek pri laboratorijskih in drugih stroških [4].

Idealen nosilec je tisti, ki je poceni, inerten, netoksičen, odporen in mehansko stabilen.

Nekateri nosilci imajo praktično lastnost, kot je feromagnetizem (magnetni železovi oksidi


2

omogočajo transport biokatalizatorja v magnetnem polju). Zelo uporabni so zato magnetni

nanodelci, saj se zaradi njihove majhnosti kemijska aktivnost poveča, kar lahko dobro

izkoristimo. Zaradi teh specifičnih lastnosti je njihova uporaba zelo široka, predvsem v

tehniki in medicini [5].

Namen diplomskega dela je bila sinteza magnetnih nanodelcev iz magnetnega materiala

maghemita, prevlečenega s hitozanom in imobilizacija specifičnega biokatalizatorja,

holesterol oksidaze, na magnetne nanodelce. Proučevali smo vpliv različnih parametrov na

ohranjeno aktivnost encima holesterol oksidaze po končanem procesu imobilizacije in

učinkovitost imobilizacije encima na maghemitne nanodelce, prevlečene s hitozanom.

Hitozanski maghemitni nanodelci so bili pripravljeni po treh različnih postopkih. S

spreminjanjem procesnih pogojev smo želeli ugotoviti kateri delci bi bili najprimernejši za

imobilizacijo encima holesterol oksidaze. Zanimala nas je tudi stabilnost imobiliziranega

encima v primerjavi s prostim encimom in vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima

na ohranjeno aktivnost encima.


3

2 Teoretični del

2.1 Nanotehnologija

Nanotehnika je izraz, s katerim označujemo tehnični razvoj na nanolestvici, navadno v

velikostih od 0,1 do 100 nm. Industrijsko uporabo nanotehnike imenujemo

nanotehnologija. To je delo na objektih, ki merijo na nanoskali manj kot desetmilijoninko

metra, a imajo produkti uporabnost v realnem makroskopskem svetu. Izvedeno je s

samourejanjem atomov, molekul ali njihovih skupkov, ali pa so uporabljeni kemijski in

fizikalni procesi, s katerimi načrtujemo in ustvarjamo nanoobjekte ter jih postavljamo v

medsebojne povezave. Nanotehnologija je v obdobju razvijanja in bo v prihodnosti imela

še večji vpliv prav na vsa področja znanosti in tehnologije.

Znanstvena odkritja in tehnološki obeti nanotehnologije so izjemni, še posebej v

proizvodnji materialov, v nanoelektroniki, v medicini in varovanju zdravja, v

biotehnologiji, informatiki in v zagotavljanju varnosti. Zato je že jasno, da bo imela

nanotehnologija močan vpliv tudi na ekonomijo in družbena dogajanja 21. stoletja, ki ga

lahko primerjamo samo s tistim, ki so ga prinesle polprevodniška industrija in s tem

informacijska ter celična in molekularna biologija. Drzne napovedi trdijo, da bo

nanotehnologija povzročila novo industrijsko revolucijo. Prinesla naj bi rešitev mnogih

tehnoloških problemov, izboljšala kvaliteto prodajnih artiklov, kot tudi prinesla bogastvo

najhitrejšim in najbolj zaupanja vrednim za investicijska vlaganja. Tudi velike države, kot

sta Indija in Kitajska, ki v bližnji preteklosti zaradi različnih razlogov niso prednjačile v

znanosti, zdaj z upanjem ustanavljajo centre za nanotehnologijo, da bi združile vse svoje

potenciale in lahko prišle v korak z razvitejšimi tekmicami na svetovnih trgih [5,6].


4

2.1.1 Nanomateriali: uporaba in značilnosti

Nanomateriali so snovi, ki vsebujejo razsežnosti nanostrukture med 1 nm in 100 nm, ali pa

mora biti velikost vsaj ene izmed razsežnosti nanostrukture manjša od 100 nm. To je

razsežnostna meja, pri katerih se značilnosti nanomateriala bistveno razlikujejo od

značilnosti masivnega materiala. Izredno majhne razsežnosti dajejo namreč

nanomaterialom drugačne značilnosti od običajnih materialov. Nanostrukture so lahko

plastovitih oblik: v obliki nanocevk, nanovlaken ter kot trirazsežni nanodelci.

• Nanocevke so drobne, votle cevaste strukture, premera velikosti 1 nm. Nanocevke

bi lahko imeli za v svitke zvite nanoplasti, ki so zgrajene iz atomov. Najbolj znane

so nanocevke, zgradba katerih je iz ogljikovih atomov.

• Značilnost plastovitih nanostruktur je, da je debelina plasti manjša od 100 nm. Sem

spadajo npr. nanofilmi ali nano površinski premazi »nanopremazi«, ki jih tako

imenujemo zaradi vsebnosti nanodelcev v filmu premaza in ne zaradi debeline

plasti.

Materiali, katerih zgradba so cevaste nanostrukture, se odlikujejo po svoji nizki gostoti, ki

je šest krat nižja od gostote jekla ter po izjemni trdnosti, ki je 200 krat višja od trdnosti

jekla. V prihodnosti bodo nanocevke verjetno nadomestile polprevodniške materiale na

osnovi silicija. Nanofilmi ali nano površinski premazi so materiali s visoko hidrofilnostjo,

vodoodbojnostjo, samočistilnimi značilnostmi in odpornostjo proti navzemanju praha

(lotosov efekt), ter dobro odpornostjo proti različnim tekočinam, kot tudi optični fenomeni

(fotokromni, elektrokromni, termokromni, mehanokromni in kemokromni premazi).

Hidrofilnost je ravno nasprotna vodoodbojnosti oziroma hidrofobnosti in je lastnost

materiala, da se nanj veže voda. Omočitveni kot in s tem stopnja hidrofilnosti sta močno

odvisna od ukrivljenosti površine nanodelca, kar pomeni njegove velikosti. Majhni okrogli

nanodelci lahko celo ustvarijo t. i. lotos efekt, kar pomeni da voda sploh ne omoči več

delca in preprosto ostane kot povsem okrogla kapljica na podlagi, prekriti s takimi

nanodelci. Če to podlago nagnemo, se bodo kapljice preprosto odkotalile in to ustvarja


5

osnovo za samočistilne prevleke na oknih, tekstilu ipd. Taki delci praviloma v vodi in

biološki tekočini niso topni, zatorej jih telo težko izloči z razgradnjo, če zaidejo vanj.

Kovinski nanodelci so običajno topni in se počasi raztapljajo v ione, ti pa lahko povzročajo

nezaželene kemijske reakcije za organizem. Kovinski oksidi so kemijsko stabilnejši, a tisti

s prehodnimi kovinami še vedno lahko povzročajo kemijske reakcije zaradi večjega števila

možnih oksidacijskih stanj kovinskega iona.

Nekatere raziskave so pokazale, da imajo določeni nanomateriali povečano toksičnost.

Problematična je velika površina nanodelcev in s tem zvezno povečana reaktivnost

nanosnovi. V človeško telo lahko delci pridejo na tri različne načinov: skozi kožo,

prebavila in predvsem dihala. Na vsak način lahko pridejo v krvni obtok in jih tako raznese

po vsem telesu. Natiranje kože s preparati, ki vsebujejo nanodelce, ali pa vidne in nevidne

poškodbe kože pospešujejo prodiranje delcev v plasti pod povrhnjico, prav tako tudi hoja

po prašnih ali z delci kontaminiranih tleh. Športne aktivnosti v ozračju z velikim številom

delcev kot so prašne poti, izpuhi avtomobilov, mestni smog, zaprti in slabo zračeni prostori

bistveno bolj obremenijo pljuča, ki zaradi pospešenega dihanja filtrirajo večje količine

zraka. Vdihani nanodelci se lahko odložijo na treh delih v človeških dihalih. Večji kot so

delci, bolj zgodaj na dihalni poti se odložijo, veliko tistih, ki pa pridejo v pljuča, se odstrani

z izdihom, a še zdaleč ne vsi. Po raznih izsledkih lahko nanodelci iz krvnega obtoka ali po

živčnih poteh zaidejo tudi v možgane. Organi, ki so najbolj prizadeti zaradi vdora

nanodelcev so jetra, vranica, ledvica in bezgavke, v splošnem pa so delci lahko vzrok vseh

bolezni povezanih s krvožiljem. Najlažje pridejo nanodelci v organizem z dihanjem.

Medtem ko se večji delci ustavijo že v nosu, žrelu in bronhijih, najmanjši dosežejo

območje malih sapnic in pljučnih mešičkov. Mobilnost nanodelcev je odvisna tudi od

njihove oblike in stopnje aglomeracije.

Raziskave toksičnosti nanomaterialov niso enostavne. Zaradi neobvladljive stopnje

aglomeracije med testiranjem, velike odvisnosti rezultatov od funkcionalizacije površine

nanodelcev, ki se med testiranjem lahko tudi spreminja, in nenadzorovanega transporta

nanodelcev s telesnimi tekočinami so rezultati lahko zavajajoči, zato sta potrebna veliko

število neodvisnih testiranj in medsebojna koordinacija pri interpretaciji rezultatov. Nastalo

je veliko novih področij: nanotoksikologija, nanovarnost v delovnem okolju, spremljanje


6

ekološkega onesnaženja z nanodelci in opozarjanje nanj, raziskave vpliva na življenjski

krog, razvoj novih detekcijskih metod, učinkovitejši filtri in kondenzacijske metode za

čiščenje zraka, nekatere panoge pa v tem trenutku lahko samo slutimo, a bodo vplivale na

kvaliteto in dolgost življenja predvsem zaradi nanomedicine [5,6].

2.1.2 Magnetni nanodelci

Za magnetne delce nanometrskih velikosti se kaže vedno večje temeljno in tehnološko

zanimanje zaradi njihovih edinstvenih magnetnih lastnosti, med katerimi prevladuje

supermagnetizem. Zaradi edinstvenih lastnosti nanodelcev in odvisnosti od velikosti teh

lastnosti se dovoljujejo številni načini uporabe teh materialov: kot pigmenti, magnetna

sredstva, dodatki mazivom, receptorski delci za mikrovalove kot tudi zaščitne plasti,

vključno z izdelavo magnetnih koloidov ali magnetnih tekočin (ferrofluidi). Številni

magnetni nanomateriali so na voljo v različnih oblikah: suhi praški, površinsko

funkcionalizirani praški ali stabilne disperzije v številnih vodnih in organskih topilih:

• Maghemit (MGH) (ɣ - Fe2O3),

• Magnetit (Fe3O4),

• Kobaltov ferit (CoFe2O4),

Pogosto so funkcionalizirani magnetni nanodelci primerni za širšo uporabo, saj imajo

izboljšane fizikalne in kemijske lastnosti. Magnetni nanodelci so lahko prevlečeni z

nanometrsko tanko plastjo iz različnih organskih (slika 2-1) in anorganskih materialov [7].


7

Maghemit je magnetni material, ki se najpogosteje uporablja v medicini. Uporaben je

predvsem v obliki suspenzij v fiziološkem mediju na vodni osnovi, torej kot magnetna

tekočina. Mehanske, termične, fizikalne in kemijske lastnosti superparamagnetnih

nanodelcev se lahko izkoriščajo za različne terapevtske in diagnostične namene, kot so

separacija in detekcija bioloških materialov, obnova tkiv, prenos farmacevtskih učinkovin

v telesu (kemoterapevtiki), magnetofekcija (genska terapija-trasfekcija celic s

terapevtskimi geni, vezanimi na magnetne nanodelce), terapevtska magnetna hipertermija

(metoda uničevanja celic z neposrednim segrevanjem magnetnih nanodelcev, akumuliranih

na obolelem mestu, z uporabo spremenljivega magnetnega polja) idr.

Magnetni nanodelci morajo izpolnjevati pogoje za aplikacije v biotehnologiji in

biomedicini, kot so netoksičnost, biokompatibilnost ter biorazgradljivost. V številnih

raziskavah so se različni magnetni nanodelci zaradi ugodnih magnetnih lastnosti, velike

površine in njihove relativne inertnosti, izkazali v vlogi nosilcev za imobilizacijo različnih

encimov, kot so holesterol oksidaza, α-amilaza, keratinaza, lipaza ... [8-10].

Slika 2-1: Maghemit prevlečen z organsko snovjo [7]


8

2.1.3 Magnetne tekočine

Magnetna tekočina ( angleško ferrofluids ali FF) je stabilna koloidna suspenzija magnetnih

nanodelcev v nosilnem mediju. Značilna magnetna tekočina vsebuje 5 volumskih deležev

magnetnih delcev velikostnega razreda 10 nm, 10 volumskih deležev dispergirnega

sredstva, ki preprečuje aglomeracijo delcev pod vplivom magnetnega polja ter 85

volumskih deležev nosilne tekočine. Molekule surfaktantov, ki se uporabljajo za

stabilizacijo nanodelcev, so navadno iz hidrofilne glave, ki jo privlači površina nanodelca,

ter hidrofobne verige, ki kaže afiniteto do nepolarne nosilne tekočine (različni

ogljikovodiki, rastlinska in mineralna olja, kerozin ...).V odsotnosti magnetnega polja so

magnetni momenti delcev razporejeni naključno in zato tekočina nima neto magnetizma.

Po vzpostavitvi magnetnega polja se magnetni momenti delcev orientirajo vzdolž silnice

skoraj v trenutku in celotna magnetizacija magnetne tekočine se takoj odzove, kar pomeni,

da je magnetna tekočina lahko natančno nameščena in kontrolirana z zunanjim magnetnim

poljem.

Magnetne tekočine (slika 2-2) se uporabljajo predvsem za bio-medicinske aplikacije.

Magnetna tekočina v kombinaciji z monomeri se uporablja za izdelavo bio - polimerov z

magnetnimi lastnostmi; nanomagnetne delce, oplaščene z različnimi materiali (SiO2), se

uporablja kot nosilce zdravilnih učinkovin (antitelesa, proteini, DNA) ter v molekularni

diagnostiki (celična separacija). Uporabna vrednost se je pokazala tudi v kemijskem

inženirstvu [9,11].

Slika 2-2: Magnetne tekočine [11]


9

2.1.4 Aktivacija magnetnih nanodelcev

Preden dosežemo imobilizacijo encima na magnetne nanodelce, je potrebna aktivacija

funkcionalne skupine na modificirani površini delcev. Za aktivacijo smo uporabili mrežni

povezovalec glutaraldehid (GA), vendar je njegova slabost, da lahko zmanjša aktivnost

encima, zato smo uporabili tudi mrežni povezovalec pentaetilen heksamin (PEHA).

2.1.4.1 Glutaraldehid (GA)

GA je organska spojina s formulo CH2(CH2CHO)2 (slika 2-3). Ima dokaj majhne molekule

z dvema aldehidnima skupinama, ki sta ločeni s fleksibilno verigo 3-metilenskih mostov.

Je ostra brezbarvna oljnata tekočina in hitro reagira z amino skupinami v približno

nevtralnem pH (z encimom se tvorijo močne kovalentne vezi). Pri vezavi encima na GA se

aktivnost encima navadno zmanjša, kar smo tudi dokazali, saj se zaradi neustrezne vezave

lahko zgodi, da aktivna mesta niso dostopna substratu.

GA se uporablja za razkuževanje zdravstvene in zobozdravstvene opreme, za industrijsko

obdelavo vode (industrijske odpadne vode, čiščenje odplak, ...) in kot konzervans.

V glavnem je na voljo kot vodna raztopina, kjer je GA prisoten predvsem kot polimer

različnih velikosti. Prisoten je lahko tudi v različnih formacijah (obstaja jih najmanj 13),

kar pa je odvisno od lastnosti raztopine (pH, koncentracija, temperatura idr.) Proizvaja se

industrijsko z oksidacijo ciklopentena in Diels-Alderjevo reakcijo akroleina in metil vinil

etra, ki ji sledi hidroliza [12-15].

Slika 2-3: Struktura glutaraldehida [13]


10

2.1.4.2 Pentaetilen heksamin (PEHA)

PEHA je rumenkasta tekočina z vonjem amonijaka in formulo C10H28N6 (slika 2-4). Je

topen v vodi in nevtralizira kisline v eksotermni reakciji za tvorbo soli in vode. Pri vezavi

encima na PEHA se aktivnost encima lahko poviša, zato smo uporabili PEHA kot mrežni

povezovalec namesto GA.

PEHA je zdravju nevaren, saj lahko v stiku z očmi povzroči rahle do zmerne opekline.

Povzroči lahko tudi zmerno draženje kože ali alergijsko reakcijo kože s simptomi rdečice,

srbenja, otekanja ali izpuščajev. Hlapi lahko dražijo oči, nos, grlo in dihala. Pri zaužitju

lahko povzroči slabost, bruhanje in bolečine v trebuhu ter opekline v grlu, požiralniku in

želodcu [16].

Slika 2-4: Struktura PEHA [16]


11

2.2 Imobilizacija biokatalizatorja

Imobilizirani biokatalizatorji so definirani kot encimi, ki so pritrjeni na inertni, netopni

material. Imobiliziran encim lahko zagotovi večjo odpornost na spremembe pogojev, kot

sta pH in temperatura, lahko jih uporabljamo večkrat in neprekinjeno. Ločimo kemijske

metode (kovalentna vezava encima na nosilec in zamreženje encima) in fizikalne metode

imobilizacije (adsorpcija encima na nosilec, ujetje encima v zamrežen polimer in

mikroinkapsulacija) [17].

Neimobilizirani encimi so biokatalizatorji, ki se ne porabijo v procesu, pri katerem

sodelujejo. S časom izgubijo aktivnost zaradi pojava denaturacije, zato je potrebna njihova

stabilizacija. Encim delno izgubi aktivnost tudi zaradi kontaminacije ali onesnaženja s

produktom, zato njegovo odstranjevanje zahteva še dodatne stroške čiščenja [18].

Imobilizirani encimi so zelo pomembni za komercialne namene, saj imajo številne koristi.

Preprečijo lahko onesnaževanje biokatalizatorja s produktom in celo zmanjšajo stroške

obratovanja procesa. Imobilizirane encime lahko enostavno odstranimo iz reakcije in imajo

običajno večjo toplotno in operativno stabilnost kot encimi v topni obliki [17].

2.2.1 Kovalentna vezava na nosilec

Pri tej metodi gre za kovalentno povezavo med encimom in nosilcem, kjer nastane vez

med funkcionalno skupino na površini nosilca in funkcionalno skupino aminokislinskih

ostankov na površini encima (slika 2-5). S to metodo vežemo le majhno količino encimov

(približno 0,02 g na gram matrice), v posebnih primerih lahko 0,3 g na 1 gram matrice. Za

vezavo je primernih več aminokislinskih funkcionalnih skupin, kot npr. hidroksilna

skupina –OH, amino skupina –NH, sulfidna skupina –SH in karboksilna skupina –COH.

Za kovalentno vez je primernih več vrst nosilnih materialov, zato moramo upoštevati več

faktorjev, med katerimi je najpomembnejši faktor za ohranjanje encimske aktivnosti na

nosilcu, hidrofilnost. Tako so najprimernejši nosilci polimeri polisaharidov, porozno steklo

in porozni silikati. Preostanki lizina so najbolj uporabne skupine za kovalentno vezavo


12

encimov na netopne nosilce zaradi njihove visoke reaktivnosti, posebno v alkalnih

raztopinah.

Prednost kovalentne vezave je, da se encim ne more sprati s površine. Je tudi močna

vezava. Kot pomanjkljivost pa lahko štejemo, da če je encim ireverzibilno deaktiviran, sta

encim kot tudi nosilec onesposobljena [18-20].

2.2.2 Zamreženje encima

Zamreženje encima je metoda imobilizacije brez nosilca. Pri tej metodi se encimi

združujejo in tvorijo veliko tridimenzionalno kompleksno strukturo. To dosežemo s

fizikalnimi in kemijskimi metodami. Kemijsko zamreženje poteka s tvorbo vezi med

encimom in reagentom (npr. GA), fizikalno pa poteka s flokulacijo, ki se veliko uporablja

v biotehnologiji [18-20].

2.2.3 Adsorpcija encima na nosilec

Adsorpcija je najenostavnejša metoda imobilizacije, pri kateri gre za interakcije med

encimom in nosilcem. Sile, ki delujejo, so večinoma elektrostatskega izvora, sodelujejo pa

tudi Van der Waalsove, ionske in vodikove vezi (slika 2-5).

Glavna značilnost adsorpcije je, da ne pride do kemične spremembe na encimu in nosilcu.

Sam postopek je sestavljen iz mešanja bioloških komponent in nosilca pod ustreznimi

adsorpcijskimi pogoji kot sta pH in ionska moč pri določenem inkubacijskem času. Temu

sledi še zbiranje imobiliziranega materiala in temeljito izpiranje, da se odstranijo nevezane

biološke komponente. Primerni adsorbenti so ionsko – izmenjevalne matrice, porozni

karbonati, stekla, polimerne aromatske smole in hidrirani kovinski oksidi.

Prednosti adsorpcijskih tehnik so enostavnost, ločevanje in čiščenje imobiliziranega

biokatalizatorja in da je adsorpcija reverzibilen proces. Slabosti teh tehnik pa so šibke sile

v povezavi, vezno stanje je zelo občutljivo na pH raztopine in temperaturo, kot tudi nizka

koncentracija encima, nanešenega na enoto nosilca [18-20].


13

2.2.4 Ujetje encima

Ujetje encima v gel ali vlakna je primerna metoda za uporabo v procesu s substrati in

produkti z nizko molsko maso. Sam proces je lahko fizikalna metoda ali pa vključuje tudi

kovalentne vezi. Od absorpcije in kovalentne vezave encima na nosilec se razlikuje v tem,

da so molekule encima proste v raztopini, imajo pa zaradi ujetja v rešetasti strukturi gela

omejeno gibanje (slika 2-5). Mreža gela mora biti dovolj tesna, da prepreči uhajanje

encima in hkrati omogoča prost pretok substratov in produktov. Ujetje dosežemo z

mešanjem encima s polioničnimi polimeri in nato z zamreženjem polimera z večvalentnimi

kationi, da se tvori rešetasta struktura, v katero se ujame encim. Ujetje je metoda za vezavo

rastlinskih, živalskih in mikrobnih celic.

Prednost te metode je, da se kemijsko ne modificira, slabost pa možna izguba in

deaktivacija encima med formacijo gela [18-20].

2.2.5 Mikroinkapsulacija

Pri metodi mikroinkapsulacije biokatalizatorje zaobjamemo v različne oblike polprepustne

membrane. Podobno je ujetju, le da so encimi prosti v raztopini, vendar omejeni v

prostoru, kot lahko vidimo na sliki 2-5. Velike beljakovinske molekule ne morejo preiti iz

in v kapsulo, medtem ko majhne molekule substratov in produktov prosto prehajajo skozi

semipermeabilno membrano. Od uporabnosti te membrane je odvisno tudi zadrževanje

encimov na membrani, saj mora ta zadržati encim, medtem ko omogoča prosti prehod za

produkte reakcije in v večini primerov za substrate. Najbolj enostavna metoda je z

namestitvijo encima na eni strani semipermeabilne membrane, medtem ko je tok

reaktantov in produktov prisoten na drugi strani membrane [18-20].


14

Slika 2-5: Adsorpcija (a), kovalentna vezava encima na nosilec (b), ujetje encima v zamrežen polimer (c), inkapsulacija (d) [18]


15

2.3 Hitozan

Hitozan je polisaharidni polimer, ki ga s procesom deacetilacije pridobivamo iz hitina,

celulozi podobnega ogljikovega hidrata. Sestavljen je iz 2-acetamino-2-deoksi-β-D-

glukoznih enot, ki so povezane z β-1,4-vezjo (slika 2-7). Pridobivamo ga iz hrustančnih

lupin morskih živali, predvsem iz hrustanca rakovic in jastogov.

Hitin je dolgoverižen polisaharid, polimer beta-glukoze z empirično formulo (C8H13O5N)n

(slika 2-6). Zgrajen je iz enot N-acetilglukozamina, ki so med seboj povezane z β-1,4

vezmi. Po zgradbi so zelo podobne glukoznim enotam, ki tvorijo celulozo, razlika je le v

tem, da imajo namesto ene hidroksilne skupine acetilamin, kar omogoča tvorjenje

vodikovih vezi med verigami, to pa daje strukturi trdnost.

Molekulska masa, povprečna dolžina makromolekul, čistost in kristalna struktura hitina so

v glavnem odvisne od njegovega izvora. V odvisnosti od izvora in pogojev izolacije hitina

je ta acetiliran do različnih stopenj. Razlika med hitinom in hitozanom je v stopnji

deacetiliranja. Ime hitozan se navadno uporablja za produkte, pri katerih je stopnja

deacetiliranja višja od 70 %. Stopnja deacetiliranja vpliva predvsem na topnost hitozana v

vodnih raztopinah. Hitozan s 40 % stopnjo deacetiliranja je topen v vodnih raztopinah do

pH 9, hitozan s 85 % stopnjo deacetiliranja pa je topen le do pH 6,5. Na viskoznost

raztopin hitozana pa vpliva več dejavnikov kot so: stopnja deacetiliranja polimera,

koncentracija, ionska moč, pH, temperatura in povprečje ter porazdelitev molekulskih mas

[21-23].


16

Slika 2-6: Struktura hitina [22]

Slika 2-7: Struktura hitozana [23]


17

2.4 Holesterol oksidaza (ChOx)

Holesterol oksidaza (ChOx, EC 1.1.3.6) je encim (slika 2-8), ki katalizira kemijsko

reakcijo oksidacije in izomerizacije začetnega substrata holesterola v ustrezen produkt, ob

prisotnosti kisika (O2):

holesterol + O2 holest-4-en-3-on + H2O2

Tako sta substrata tega encima holesterol in kisik (O2), medtem ko sta proizvoda vodikov

peroksid (H2O2) in holest-4-en-3-on.

ChOx se uporablja za določevanje holesterola v hrani in v krvnem serumu ter je

pomembnen biokatalizator na področju klinične medicine in industrije. ChOx kaže velik

potencial kot insekticid in lahko igra ključno vlogo pri zatiranju škodljivcev [24,25].

Slika 2-8: Kristalna struktrua holesterol oksizade iz b.sterolicum [24]


18

3 Metode in materiali

3.1 Materiali in reagenti

Materiali in reagenti, ki smo jih uporabili pri laboratorijskem delu, so visoke čistosti in

komercialno dostopni. Za pripravo materialov in reagentov pri imobilizaciji holesterol

oksidaze na magnetni nanonosilec smo uporabili naslednje kemikalije:

• železov klorid heksahidrat (FeCl3·6H2O)

• železov klorid tetrahidrat (FeCl2·4H2O)

• amonijak (25 %)

• citronsko kislino, ocetno kislino

• natrijev silikat (Na2SiO3)

• natrijev hidroksid (NaOH)

• klorovodikovo kislino (0,1M HCl)

• etanol (100 %)

• glutaraldehid (25 %, nemškega proizvajalca Merck)

• aminoorganosilan AEAPS (3-(2-aminoetilamino)-propil-metildimetoksisilan)

• emulgator Span-80 (proizvajalec Sigma-Aldrich iz Nemčije)

• parafinsko olje (dobavljeno od slovenskega podjetja Pharmachem)

• hitozan (proizvajalec Sigma-Aldrich iz Islandije)

• glicerol (kupljen pri hrvaškem podjetju Kemika)

• encim holesterol oksidaza (ChOx, EC 1.1.3.6; 30.1 U/mg) je bil kupljen od podjetja

Bioezyme Laboratories (Velika Britanija)

• holesterol v prahu z visoko čistostjo (95 % w/w)) je bil kupljen pri Sigmi-Aldrich

(Nemčija)

• barvilo Coomassie Brilliant Blue (Merck)

• orto-fosforno kislino (88 %, Merck)


19

3.2 Laboratorijska oprema in aparature

Pri laboratorijskem delu smo uporabljali naslednjo opremo in aparature:

• trovratni stekleni reaktor

• mikrocentrifugirke (1,5 mL in 2 mL)

• steklene čaše (5000 mL, 1000 mL, 600 mL, 400 mL, 250 mL, 100 mL, 50 mL)

• centrifugirke (50 mL)

• merilne valje (1000 mL, 100 mL, 50 mL)

• pipete (5 mL, 1 mL, 0,1 mL)

• termometer

• ultrazvočno in vodno kopel

• tehtnico (Sartorius, Nemčija)

• pH meter (Hanna Instruments, Madžarska)

• stresalnik (Heidolph Unimax 1010, Nemčija), slika 3-1

• magnetno mešalo (Rotamix, Slovenija), slika 3-2

• vorteks (Mikro+Polo, Slovenija), slika 3-3

• centrifugo (Eppendorf Centrifuge 5804R, Nemčija)

• UV-VIS spektrofotometer (Varian Cary 50 Probe)

Slika 3-1: Stresalnik Heidolph Unimax 1010


20

Slika 3-2: Magnetno mešalo Rotamix

Slika 3-3: Vorteks Micro+Polo


21

3.3 Eksperimentalne metode

3.3.1 Priprava magnetnih nanodelcev za imobilizacijo biokatalizatorja

Delo v laboratoriju je obsegalo imobilizacijo encima holesterol oksidaze (ChOx) na

maghemitne nanodelce, prevlečene s hitozanom. Hitozanske maghemitne nanodelce smo

pripravili na tri načine: pri prvih dveh postopkih smo s hitozanom prevlekli predhodno

pripravljene maghemitne nanodelce, pri tretjem postopku pa smo hitozan vezali na

nanodelce v predhodno pripravljeni magnetni tekočini. Nato smo na pripravljen material

uspešno imobilizirali biokatalizator in ugotavljali vpliv sprememb procesnih pogojev na

uspešnost imobilizacije.

3.3.2 Priprava magnetnih nanodelcev maghemita

Maghemitne nanodelce smo sintetizirali z obarjalno reakcijo ali koprecipitacijo Fe ionov

(c (Fe2+) = 0,027 mol/L , c (Fe3+) = 0,023 mol/L ) s koncentriranim amonijakom (25 %). V

250 mL čašo smo natehtali 2,684 g FeCl3·6H2O in 3,11 g FeCl2·4H2O. Snovi smo ločeni

raztopili v 250 mL miliQ vode in čaši z raztopinama dali na ultrazvočno kopel. Nato smo

obe raztopini vlili v trivratni reaktor, ki smo mu dodali mehansko mešalo [26].

Sledilo je počasno dodajanje amonijakalne raztopine (150 mL miliQ vode in 3 mL 25 %

amonijaka), da smo zvišali pH vrednost raztopine železovih ionov na pH = 3 in jo ob

konstantnem mešanju vzdrževali 30 minut. Pri tem smo opazili spremembo barve iz

oranžne v črno (oboril se je Fe(OH)3 ) (slika 3-4).


22

Po 30 minutah smo hitro dodali 250 mL amonijaka v reaktor in zvišali pH na pH>11 ter

pustili raztopino mešati še 30 minut. Tako je železov hidroksid oksidiral z zračnim kisikom

in nastal je produkt iz maghemita. Reaktor smo postavili na magnet in počakali eno uro, da

so se delci posedli. Preostalo tekočino smo odlili v steklenico z odpadno tekočino,

posedene delce pa smo obdržali z magnetom v reaktorju in vanj dodali amonijakalno

raztopino (150 mL miliQ vode in 3 mL amonijaka) ter premešali, da smo prelili delce iz

reaktorja v čašo. Čašo smo postavili na magnet in po nekaj minutah odlili odpadno

tekočino. Čašo z magnetnimi nanodelci smo stehtali.

Nato smo s spiranjem odstranili nanodelce, ki niso bili namagneteni. Sprane in posušene

magnetne nanodelce smo nato zdrobili v terilnici in jih uporabili za nadaljne postopke.

Slika 3-4: Sprememba barve iz oranžne v črno z dodatkom amonijaka


23

3.3.3 Priprava magnetne tekočine

Magnetne nanodelce smo sintetizirali po prej opisanem postopku (poglavje 3.3.2). Sprane

magnetne nanodelce smo dispergirali v 60 mL miliQ vode ter preprečili aglomeracijo

nanodelcev in omogočili prekritje nanodelcev s surfaktantom. V čašo z magnetnimi delci

in miliQ vodo smo dodali še 2,5 mL vnaprej pripravljene raztopine citronske kisline (2,5 g

citronske kisline raztopljene v 5 mL miliQ vode). Kislina preprečuje aglomeracijo

nanodelcev in pripomore k večji stabilnosti suspenzije. Nato smo s 25 % amonijakom, ki

smo ga dodajali po kapljicah, uravnali vrednost pH na 5,2 ± 0,1, saj je pri tej pH vrednosti

adsorpcija kisline na nanodelce najučinkovitejša. Tako pripravljeno suspenzijo smo segreli

na 75 °C in mešali 90 minut. V tem času se je citronska kislina vezala na površino

nanodelcev.

Po končanem mešanju smo suspenzijo ohladili na sobno temperaturo in z amonijakom

uravnali pH na 10,1± 0,1. Pri pH = 10,1 se količina nanodelcev, ki preidejo v stabilno

suspenzijo, močno poveča. Neaglomerirani delci v suspenziji so tako dolgoročno stabilni.

Nato smo centrifugirali 5 minut na 5000 r/min in tako iz tekočine odstranili aglomerirane

in nestabilne delce. Magnetno tekočino smo nadalje uporabili za sintezo hitozanskih

maghemitnih nanodelcev (slika 3-5) [27].

Slika 3-5: Magnetna tekočina


24

3.3.4 Postopki priprave hitozanskih maghemitnih nanodelcev

Maghemitne nanodelce, prevlečene s hitozanom smo pripravili po treh različnih postopkih,

z namenom, da bi ugotovili, kateri so najprimerneši za imobilizacijo encima ChOx. Pri

prvih dveh postopkih smo s hitozanom prevlekli predhodno pripravljene maghemitne

nanodelce, pri tretjem postopku pa smo hitozan vezali na nanodelce v predhodno

pripravljeni stabilni magnetni tekočini.

3.3.4.1 Priprava hitozanskih maghemitnih delcev po prvem postopku

(postopek mikroemulzije)

Najprej smo zatehtali 0,5 g hitozana, ki smo ga raztopili v 20 mL 2 % ocetne kisline. V

koloidno raztopino, ki jo tvori hitozan z ocetno kislino, smo dodali 0,05 g maghemitnih

nanodelcev. Mešanico smo dali za 30 minut na ultrazvočno kopel in vzmes večkrat

premešali. Nato smo si pripravili vodno kopel in jo segreli na 40 °C. Ob mehanskem

mešanju smo dodali 80 mL parafinskega olja (ustvarili sta se dve fazi) in 4 mL

emulgatorja Span80 (fazi sta se združili v eno).

Po kapljicah smo počasi dodali še 2 mL 25 % GA in zmes pustili na mešanju eno uro.

Nato smo z 1 M NaOH uravnali pH mešanice na 9-10 in segreli vodno kopel na 70 °C

(slika 3-6).

Po eni uri smo morali nanodelce, prevlečene s hitozanom, ločiti iz viskozne zmesi s

pomočjo magneta in spiranj. Spirali smo jih z etanolom in nato sprane delce posušili in

dobili produkt rjave barve.


25

3.3.4.2 Priprava hitozanskih maghemitnih delcev po drugem postopku

(metoda zamreženja)

0,2 g maghemitnih nanodelcev smo dispergirali v mešanico 30 mL parafinskega olja in 0,5

mL emulgatorja Span80. Posebaj smo raztopili 0,2 g hitozana v 15 mL 5 % ocetne kisline.

Nato smo obe substanci zmešali in mešanico dali na ultrazvočno kopel za 30 minut.

Po 30 minutah smo dodali 3 mL 25 % GA in pri sobni temperaturi s pomočjo mehanskega

mešala mešali 4 ure (slika 3-7). Sledilo je še spiranje (enako kot pri prvem postopku) in

sušenje delcev.

Slika 3-6: Priprava hitozanskih maghemitnih delcev po prvem postopku (segrevanje vodne kopeli na 70 °C)


26

Slika 3-7: priprava hitozanskih maghemitnih delcev po drugem postopku

(mešanje pri sobni temperaturi)


27

3.3.4.3 Priprava hitozanskih maghemitnih delcev po tretjem postopku

(metoda kovalentne vezave)

V 5 L čašo smo nalili 3,5 L miliQ vode in dodali raztopino hitozana (0,0175 g hitozana

raztopimo v 7 mL miliQ vode) ter 3,5 g predhodno pripravljene magnetne tekočine. Z 1M

HCl smo znižali pH mešanice na 3,7 in jo pustili eno uro na ultrazvočni kopeli. Medtem

smo si pripravili vodno kopel, ki smo jo segreli na 60 °C in po eni uri vanjo postavili čašo

z mešanico. S pomočjo mehanskega mešala smo pustili mešati 12 ur, da se je v tem času na

magnetne nanodelce vezal hitozan. Po končanem mešanju smo čašo postavili na magnet in

počakali 24 ur, da so se hitozanski maghemitni nanodelci posedli. Odpadno tekočino smo

odlili, delce sprali z miliQ vodo, jih posušili na zraku ter shranili v stekleničko (slika 3-8).

Slika 3-8: Maghemitni delci, pripravljeni po tretjem postopku


28

3.4 Imobilizacija biokatalizatorja na magnetne nanodelce

Pred imobilizacijo biokatalizatorja ChOx smo površino magnetnih nanodelcev aktivirali.

Za aktivacijo funkcionalnih skupin smo uporabili mrežna povezovalca GA in PEHA. V

mikrocentrifugirke smo zatehtali 5 mg predhodno pripravljenih hitozanskih maghemitnih

nanodelcev (po treh različnih postopkih) ter dodali 1 mL pufra s pH = 7,3 in določeno

količino GA oziroma 1 mL 0,02 M PEHA. Zmes smo dobro zvorteksirali in jo stresali pri

sobni temperaturi določen čas. Po končanem stresanju smo mikrocentrifugirke postavili na

magnet, da so se delci posedli na dno in odpipetirali supernatant ter ga zavrgli.

K aktiviranim delcem smo dodali 0,9 mL pufra PBS (10 mM, pH 7,3) in 0,1 mL določene

koncentracije encima ter zvorteksirali. Sledila je 24-urna imobilizacija encima ChOx na

magnetne nanodelce pri sobni temperaturi in različnih hitrostih stresanja.

Za določanje učinkovitosti imobilizacije biokatalizatorja smo uporabili kolorimetrično

metodo po Bradfordu, za določanje specifične aktivnosti bioakatalizatorja pa specifičen

encimski test za ChOx.

3.4.1 Določanje učinkovitosti imobilizacije

Koncentracija imobiliziranega biokatalizatorja je bila določena s kolorimetrično metodo po

Bradfordu, ki uporablja barvni reagent Coomassie Brilliant Blue za detekcijo proteinov v

vzorcu. Bradfordova metoda temelji na dejstvu, da se barvilo Coomassie Brilliant Blue

G-250 specifično veže na protein. Rdeča barva barvila se spremeni v modro, s tem pa se

spremeni absorpcijski maksimum barvila iz 465 nm na 595 nm.

Koncentracijo proteinov smo merili pri valovni dolžini λ=595 nm na UV-VIS

spektrofotometru, s programom Advanced reads. Vzorec, ki smo mu izmerili absorbanco je

vseboval 1 mL Bradfordovega reagenta in 20 µL encimskega vzorca. Za umeritev slepega

vzorca smo vedno uporabili 20 µL pufra pH 7,3. Pripravljene raztopine smo dobro

zvorteksirali in po petih minutah izmerili absorbanco.


29

Učinkovitost imobilizacije je bila določena na osnovi merjenja koncentracije nevezanih

proteinov (mg/mL) v supernatantu po končanem postopku imobilizacije in v posameznih

odpadnih tekočih fazah po postopku izpiranja imobiliziranega biokatalizatorja.

3.4.1.1 Priprava umeritvene krivulje

Za konstrukcijo umeritvene krivulje, ki je služila za izračunavanje koncentracije proteinov

v vzorcu, smo uporabili standardni protein albumin iz govejega seruma (Bovin Serum

Albumin ali BSA). Zatehtali smo 10 mg albumina iz govejega seruma in ga razredčili z 1

mL miliQ vode. V 6 mikrocentrifugirk smo si pripravili naslednje vzorce:

1. 1000 µL vode

2. 980 µL vode + 20 µL albumina





V vsako mikrocentrifugirko smo dodali 1 mL termostatiranega Bradfordovega reagenta in

20 µL vzorca. Vzorce smo dobro zvorteksirali, po 5 minutah izmerili absorbanco ter

naredili umeritveno krivuljo (priloga 7.1).

3.4.1.2 Priprava Bradfordovega reagenta

Bradfordov reagent smo pripravili tako, da smo raztopili 100 mg barvnega reagenta

Coomassie Brilliant Blue v 100 mL fosforne kisline (85 % (v/v)) in v 50 mL etanola

(95 % (v/v)) ter celotno zmes razredčili z miliQ vodo na volumen 1 L.


30

3.4.1.3 Računanje učinkovitosti imobiliziranega encima

Učinkovitost imobilizacije nam pove, koliko encima se je uspelo vezati na površino

magnetnih nanodelcev. Izračunamo jo po enačbi [28]:

φ=(ci -cs )·Vvzorec

mn (3.1)

kjer so: φ...............koncentracija imobiliziranega encima [mgencim/ gnosilec]

ci ..............koncentracija prostega encima [mg·mL-1]

cs ..............koncentracija encima v spiranjih [mg·mL-1]

Vvzorec .......volumen vzorca [mL]

mn ............masa nosilca (magnetnih nanodelcev) [g]

Relativno učinkovitost ρ [%] pa določimo po enačbi:

ρ=(ci-cs)·100

ci (3.2)

3.4.2 Merjenje specifične aktivnosti biokatalizatorja

Za merjenje specifične aktivnosti biokatalizatorja, tako prostega kot imobiliziranega, smo

uporabili UV-VIS spektrofotometer, na katerem smo pri valovni dolžini λ=243 nm merili

spremembo absorbance med potekom specifične encimske reakcije za biokatalizator

ChOx. Aktivnostni test za ChOx smo izvajali v 1,5 mL mikrocentrifugirkah.

Pred vsakim merjenjem smo spektrofotometer dobro sprali z destilirano vodo in umerili s

slepim vzorcem.


31

3.4.2.1 Priprava reagentov za encimski test

Reagent A (raztopina substrata holesterola): v 10 mL bučko smo zatehtali 50 mg

holesterola (95 %) in dopolnili do oznake z reagentom B.

Reagent B: etilni alkohol (100 %)

Reagent C (vodna raztopina natrijevega acetata): v čašo smo zatehtali CH3COONa·3H2O,

dodali miliQ vodo, magnetno mešalo in segreli na T = 37 °C. Nato smo izmerili pH in s 0,1

M HCl znižali pH na 5. Prelili smo v 100 mL bučko in dopolnili do oznake z miliQ vodo.

Reagent D (raztopina natrijevega fosfata): v čašo smo zatehtali NaH2PO4·H2O in dodali

miliQ vodo, magnetno mešalo in segreli na T = 37 °C. Izmerili smo pH in z NaOH

uravnali pH na 7,3. Prelili smo v 250 mL bučko in dopolnili do oznake z miliQ vodo.

Reagent E: raztopina proste ali imobilizirane holesterol oksidaze.

3.4.2.2 Encimski test za holesterol oksidazo (ChOx, EC 1.1.3.6)

Aktivnost proste ali imobilizirane ChOx smo določevali v reakcijski zmesi, ki je vsebovala

400 µL vodne raztopine natrijevega acetata - reagenta C (100 mM, pH 5) in 100 µL

raztopine holesterola (0,5 % (w/v)) kot substrata za biokatalizator ChOx. Reakcijsko zmes

smo dali na stresalnik in segreli na temperaturo 37 °C. Nato smo dodali 500 µL suspenzije

imobiliziranega biokatalizatorja na magnetnem nanonosilcu (γ-Fe2O3/ChOx) neposredno v

reakcijsko zmes. V slepi vzorec smo dodali 500 µL raztopine natrijevega fosfata - reagenta

D (10 mM, pH 7,3). Pri temperaturi T= 37 °C smo nastalo zmes stresali na stresalniku 30

minut.


32

Med reakcijo oksidacije holesterola se sprosti produkt 4-holesten-3-on, zato smo morali v

reakcijsko zmes dodati po 30 minutah še 3 mL 100 % etanola za zaustavitev reakcije.

Suspenzijo smo nato centrifugirali 2 minuti pri 10000 rpm in tekočo fazo supernatantna

(1 mL) uporabili za določitev koncentracije produkta pri valovni dolžini λ= 243 nm na

UV-VIS spektrofotometru.

Aktivnost imobiliziranega biokatalizatorja je bila podana v obliki ohranjene aktivnosti,

izražena v odstotkih (%), in določena na osnovi primerjave aktivnosti prostega encima

ChOx.

3.4.2.3 Računanje specifične aktivnosti biokatalizatorja

Ena encimska enota (U/mLencim) je definirana kot količina biokatalizatorja (v našem

primeru ChOx), ki pretvori med katalitsko reakcijo 1 µmol holesterola v ketonski produkt

4-holesten-3-on pri pH vrednosti 5 in temperaturi 37 °C ter času stresanja 30 minut

(slika 3-9).

Specifična aktivnost proste in imobilizirane holesterol oksidaze je bila izračunana po

naslednji enačbi:

U/mLencim=A243 nm vzorec-A243 nm slepi vzorec·4·df

30·18·0,5 (3.3)

kjer so: 4............ volumen reakcijske zmesi [mL]

df...........dilucijski faktor, ki smo ga uporabili za razredčevanje vzorca [/]

30...........čas reakcije [min]

18...........milimolarni ekstinkcijski koeficient za produkt 4-holesten-3-on

[M-1cm-1]

0,5..........volumen dodanega vzorca (prostega ali imobiliziranega encima) [mL]


33

+ O2 Holesterol oksidaza + H2O2

HOLESTEROL 4-HOLESTEN-3-ON

Slika 3-9: Potek reakcije oksidacije holesterola s ChOx [29,30]


34

4 Rezultati in diskusija

Rezultat diplomskega dela je bila uspešna sinteza magnetnih nanodelcev iz maghemita,

prevlečenih s hitozanom in uspešna imobilizacija specifičnega biokatalizatorja, holesterol

oksidaze, na magnetne nanodelce. Hitozanski maghemitni nanodelci so bili pripravljeni po

treh različnih postopkih. S spreminjanjem procesnih pogojev, kot so koncentracija encima,

koncentracija GA, sprememba mrežnega povezovalca in sprememba hitrosti stresanja pri

imobilizaciji, smo želeli ugotoviti kateri delci bi bili najprimernejši kot nosilci za

imobilizacijo encima ChOx ter kako se spreminja učinkovitost in ohranjena aktivnost

imobiliziranega encima.

Zanimala nas je tudi stabilnost imobiliziranega encima v primerjavi s prostim encimom in

vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno aktivnost encima.

4.1 Vpliv koncentracije mrežnega povezovalca GA

Zanimalo nas je kakšen vpliv ima koncentracija mrežnega povezovalca na učinkovitost

imobilizacije in ohranjeno aktivnost encima. Čas imobilizacije je bil 24 ur pri stresanju 300

rpm na stresalniku Heidolph Unimax 1010. Koncentracija encima je bila 0,1 mg/mL.

Ugotovili smo, da dosežemo najvišjo učinkovitost imobilizacije z dodatkom 1 % GA.

Najuspešnejšo vezavo encima smo dosegli na nanodelcih, pripravljenih po 2. postopku

(MC2) in sicer 68,19 %, najslabšo pa na nanodelcih, pripravljenih po 1. postopku - MC1

(46,38 %). Razlog za nižjo učinkovitost MC1 je bilo združevanje nanodelcev v večje

aglomerate in zmanjšanje površine, ki je bila razpoložljiva za vezavo encima. Pri

nanodelcih, pripravljenih po 3. postopku (MC3) smo dobili nekoliko nižjo učinkovitost

(64,18 %), saj so bili MC3 od vseh nanodelcev najbolj namagneteni in se je hitozan na

predhodno pripravljene maghemitne nanodelce vezal manj uspešno.


35

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

MC1 MC2 MC3

uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

(%

)

Postopek priprave hitozanskih maghemitnih nanodelcev

učinkovitost po dodatku 1%

GA (%)


GA (%)


GA (%)

Pri MC1 se nam je pri dodatku 2 % GA učinkovitost zmanjšala za 21 %, pri dodatku 3 %

GA pa za 12,63 %. Pri MC2 se nam je pri dodatku 2 % GA učinkovitost zmanjšala za kar

47,9 %, medtem ko pri dodatku 3 % GA za 19,29 %. Pri MC3 se nam je pri dodatku 2 %

GA učinkovitost zmanjšala za 48,27 %, pri dodatku 3 % GA pa za 19,7 % (diagram 4-1).

S povišanjem koncentracije GA aktiviramo večjo površino nosilca, kamor se s kovalentno

vezavo veže encim, vendar pa previsoka koncentracija GA lahko pomeni nižjo

učinkovitost, zato smo za nadaljne raziskave uporabljali 1 % GA.

Aktivnost se je prav tako najbolje ohranila v primeru vezave encima na hitozanske

maghemitne nanodelce pri koncentraciji GA 1 %. Ohranjena aktivnost encima, vezanega

na MC1 je bila 4,7 %, za MC2 23,76 % in za MC3 9,07 %. Pri ostalih koncentracijah GA

smo dobili nižje vrednosti ohranjene aktivnosti, kar lahko razberemo iz diagrama 4-2.

Diagram 4-1: Učinkovitost imobilizacije encima na hitozanske maghemitne nanodelce, pripravljene po treh

postopkih v odvisnosti od koncentracije mrežnega povezovalca GA


36

Diagram 4-2: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce, pripravljene po treh

postopkih, v odvisnosti od koncentracije mrežnega povezovalca GA

4.2 Vpliv hitrosti stresanja pri imobilizaciji encima

Želeli smo ugotoviti, kakšen vpliv ima hitrost stresanja na učinkovitost imobilizacije

encima in na ohranjeno aktivnost vezanega encima. Čas imobilizacije je bil 24 ur in

koncentracija mrežnega povezovalca GA 1%, saj smo predhodno dokazali, da smo pri tej

koncentraciji dobili najvišje vrednosti učinkovitosti imobilizacije encima in ohranjene

aktivnosti vezanega encima. Koncentracija encima je bila 0,1 mg/mL.

Pri teh pogojih smo najvišjo učinkovitost imobilizacije dosegli pri hitozanskih

maghemitnih nanodelcih, pripravljenih po 1. in 2. postopku in hitrosti stresanja 1400 rpm.

Pri hitozanskih maghemitnih nanodelcih, pripravljenih po 3. postopku, smo dobili najvišjo

vrednost učinkovitosti pri hitrosti stresanja 300 rpm. Pri MC1 in MC2 smo dobili 100 %

učinkovitost imobilizacije, saj so bile izmerjene koncentracije proteinov v posameznih

0

5

10

15

20

25

30

MC1 MC2 MC3

oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

(%

)


aktivnost po dodatku 1% GA

(%)


(%)


(%)


37

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

MC1 MC2 MC3

uči

nko

vito

st Ii

mo

bili

zaci

je (

%)

Priprava hitozanskih maghemitnih nanodelcev

stresanje pri 300 rpm

stresanju pri 1400 rpm

stresanje na 1

odpadnih tekočih fazah po postopku izpiranja imobiliziranega encima enake 0. Nižjo

učinkovitost imobilizacije smo dobili pri MC3 in sicer 59,94 %. Opravili smo še poskus na

posebni napravi, na kateri je imobilizacija potekala na hitrosti stresanja 1 (možni hitrosti

stresanja na stikalu sta bili 1 in 2). Pri tej hitrosti smo dobili najnižje učinkovitosti

imobilizacije pri hitozanskih maghemitnih nanodelcih, pripravljenih po vseh treh postopkih

(diagram 4-3).

Pri hitrosti stresanja 300 rpm se je vezalo manj encima na nanodelce, zato je bila

učinkovitost imobilizacije nižja, vendar pa se je v primeru vseh treh vezav encima na

hitozanske maghemitne nanodelce aktivnost pri tej hitrosti stresanja najbolje ohranila

(diagrama 4-3 in 4-4). Pri hitrosti stresanja 1400 rpm je bila ohranjena aktivnost encima,

vezanega na nanodelce izredno nizka (diagram 4-4), kljub visoki učinkovitosti

imobilizacije (diagram 4-3).


postopkih v odvisnosti od hitrosti stresanja pri imobilizaciji encima in dodatku 1 % GA


38

0

5

10

15

20

25

30

MC1 MC2 MC3

oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

(%

)




stresanje na 1

4.3 Vpliv mrežnega povezovalca PEHA

Preverili smo, kakšen vpliv ima na učinkovitost imobilizacije in na ohranitev aktivnosti

encima ChOx, vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce, mrežni povezovalec PEHA

s koncentracijo 0,02 M. Ker smo v primeru vpliva spremembe hitrosti stresanja pri

imobilizaciji dobili najboljše rezultate pri hitrosti 300 rpm, smo pri tej hitrosti stresanja

uporabili PEHA kot mrežni povezovalec. Namesto 1 % GA smo dodali 0,02 M PEHA. Čas

imobilizacije je ostal 24 ur, prav tako koncentracija encima 0,1 mg/mL.

Po diagramu 4-5 sodeč smo dobili najvišjo ohranjeno aktivnost encima pri imobiliziranem

encimu, ki smo mu dodali mrežni povezovalec PEHA. V primerjavi s prostim encimom, ki

ga nismo imobilizirali in smo predpostavili kot 100 %, je bila ohranjena aktivnost

imobiliziranega encima s PEHA za 2,82 % višja kot pri prostem encimu, medtem ko je

bila ohranjena aktivnost imobiliziranega encima z 1 % GA za kar 64,79 % nižja kot pri

prostem encimu.

Diagram 4-4: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce, pripravljene

po treh postopkih, v odvisnosti od hitrosti stresanja pri imobilizaciji encima in dodatku 1 % GA


39

0

20

40

60

80

100

120

encim z 1% GA (24 h) encim s PEHA (24 h) prosti encim

oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

(%

)

vzorec

Ugotovili smo, da dosežemo najvišjo učinkovitost imobilizacije z dodatkom 0,02 M

PEHA. Največ encima se je vezalo na nanodelce, pripravljene po 3. postopku (MC3) in

sicer 100 %, najmanj pa na nanodelce, pripravljene po 2. postopku – MC2. Razlog za nižjo

učinkovitost MC1 (76,03 %) in MC2 (50,56 %) je najverjetneje, da so se nanodelci združili

v večje aglomerate in se je tako zmanjšala površina, ki je bila razpoložljiva za vezavo

encima. Pri nanodelcih, pripravljenih po 3. postopku (MC3), smo dobili 100 %

učinkovitost imobilizacije, saj so bili MC3 od vseh nanodelcev najbolj namagneteni in se

je hitozan na predhodno pripravljene maghemitne nanodelce uspešno vezal (diagram 4-6).

Aktivnost se je prav tako najbolje ohranila (35,85 %) v primeru vezave encima na MC3 z

mrežnim povezovalcem 0,02 M PEHA, ki je bila v primerjavi z ohranjeno aktivnostjo

encima, vezanega na MC3 z mrežnim povezovalcem GA nižja za kar 26,78 %

(diagram 4-7). Ohranjena aktivnost encima, vezanega na MC1 in MC2 z mrežnim

povezovalcem PEHA je bila nekoliko nižja zaradi nižje učinkovitosti in nastanka

aglomeratov.

Diagram 4-5: Ohranjena aktivnost imobiliziranega encima z mrežnim povezovalcem 1 %

GA in 0,02 M PEHA v odvisnosti od prostega encima


40


postopkih v odvisnosti od mrežnega povezovalca


postopkih, v odvisnosti od mrežnega povezovalca

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

MC1 MC2 MC3

uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

(%

)


dodatek 1 % GA

dodatek 0,02 M PEHA

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

MC1 MC2 MC3

oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

(%

)


dodatek 1 % GA

dodatek 0,02 M PEHA


41

4.4 Vpliv koncentracije encima

Dosedanje rezultate smo poskusili izboljšati s povečanjem koncentracije encima. Namesto

koncentracije encima 0,1 mg/mL, ki smo jo uporabljali v vseh dosedanjih meritvah, smo

povečali koncentracijo za desetkrat (1 mg/mL). Čas imobilizacije je ostal 24 ur in hitrost

stresanja 300 rpm. Nanodelcem, modificiranih s hitozanom po treh postopkih, smo dodali

1 mL 0,02 M mrežnega povezovalca PEHA; hkrati smo izvedli imobilizacijo encima na

nanodelce, modificirane po treh postopkih brez dodatka PEHA.

Ugotovili smo, da najvišjo učinkovitost imobilizacije dosežemo z dodatkom mrežnega

povezovalca PEHA. Pri hitozanskih maghemitnih nanodelcih, pripravljenih po treh

različnih postopkih, se nam je v dveh primerih vezalo več encima z dodatkom mrežnega

povezovalca PEHA.

Največ encima se je vezalo na nanodelce, pripravljene po 1. postopku (MC1) z dodatkom

mrežnega povezovalca PEHA in sicer 47,47 %, manj pa na nanodelce, pripravljene po

2. postopku (35,01 %) in po 3. postopku (37,17 %). Pri MC3, ki mu nismo dodali

mrežnega povezovalca se je vezalo 17,64 % encima, kar je 19,53 % manj kot pri MC3 z

dodatkom PEHA. Pri MC1 brez dodatka mrežnega povezovalca se je vezalo 21,93 %

encima, kar je 25,54 % manj kot pri MC1 z dodatkom PEHA. Pri MC2, ki mu nismo

dodali mrežnega povezovalca se je vezalo le 29,67 %, kar je za 5,34 % manj kot pri MC2 z

dodatkom PEHA (diagram 4-8).

Aktivnost se je bolje ohranila v primeru vseh treh vezav encima na hitozanske maghemitne

nanodelce pri dodatku mrežnega povezovalca PEHA. Najbolje se je aktivnost ohranila v

primeru vezave encima na MC2 (79,03 %) z mrežnim povezovalcem PEHA. Ohranjena

aktivnost encima, vezanega na MC2 brez mrežnega povezovalca (41,94 %) je bila nižja za

37,09 % (diagram 4-8) zaradi nižje učinkovitosti imobilizacije in nastanka aglomeratov.


42

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

(%

)

uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

(%

)


aktivnost (%)

učinkovitost (%)

Dobljene rezultate smo primerjali z rezultati, ki smo jih dobili pri koncentraciji encima 0,1

mg/mL in dodatku 1 mL 0,02 M mrežnega povezovalca PEHA ter brez dodatka mrežnega

povezovalca. Čas imobilizacije je bil 24 ur, hitrost stresanja 300 rpm.

Kot lahko vidimo na diagramu 4-9 je učinkovitost imobilizacije encima znatno višja pri

koncentraciji encima 0,1 mg/mL, vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce,

pripravljene po treh postopkih, kot pri koncentraciji encima 1 mg/mL. Diagram 4-10 pa

prikazuje, da se je aktivnost bolje ohranila pri koncentraciji encima 1 mg/mL.

Z naraščajočo količino (koncentracijo) dodanega encima narašča ohranjena aktivnost

encima, zato smo za nadaljne raziskave uporabljali koncentracijo encima 1 mg/mL.

Diagram 4-8: Učinkovitost in ohranjena aktivnost encima, vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce,

pripravljene po treh postopkih, pri dodatku 1 mL 0,02 M PEHA in koncentraciji encima 1 mg/mL


43

Diagram 4-9: Učinkovitost imobilizacije encima vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce, pripravljene po

treh postopkih, pri različni koncentraciji encima


postopkih, pri različni koncentraciji encima

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100u

čin

kovi

tost

imo

bili

zaci

je (

%)


koncentracija encima 0,1 mg/mL

koncentracija encima 1 mg/mL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

(%

)


koncentracija encima 0,1 mg/mL

koncentracija encima 1 mg/mL


44

4.5 Vpliv kombinacije različnih mrežnih povezovalcev

Zanimalo nas je tudi kako na učinkovitost imobilizacije in ohranjeno aktivnost encima,

vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce, pripravljene po treh postopkih vpliva

kombinacija dveh mrežnih povezovalcev in kakšni so rezultati pri dodatku 0,02 M PEHA

in brez dodatka mrežnega povezovalca. Uporabili smo 75% PEHA in 25% GA. Čas

imobilizacije je ostal 24 ur, prav tako koncentracija encima 1 mg/mL.

Ugotovili smo, da najvišje učinkovitosti imobilizacije dobimo pri dodatku 0,02 M PEHA.

Pri kombinaciji dveh mrežnih povezovalcev se je največ encima vezalo na nanodelce,

pripravljene po 1. postopku (MC1) in sicer 24,9 %, nekoliko manj pa na nanodelce,

pripravljene po 2. postopku (22,37 %) in po 3. postopku (19,08 %). Pri nanodelcih, katerim

nismo dodali mrežnega povezovalca, pa se je vezalo še manj encima: pri MC1 14,06 %, pri

MC2 16,67 % in pri MC3 16,21 % (diagram 4-11).

Aktivnost se je najbolje ohranila pri hitozanskih maghemitnih nanodelcih, pripravljenih po

treh postopkih, ki smo jim dodali 0,02 M PEHA. Razlog za boljšo ohranjeno aktivnost

lahko iščemo v tem, da mrežni povezovalec GA znižuje ohranjeno aktivnost encima. Tako

smo dobili ohranjeno aktivnost encima, vezanega na MC2 z dodatkom 0,02 M PEHA kar

79,03 %, medtem ko pri dodatku kombinacije mrežnih povezovalcev GA in PEHA le

9,34 % (diagram 4-11).


45

Diagram 4-11: Učinkovitost in ohranjena aktivnost encima, vezanega na hitozanske maghemitne nanodelce,

pripravljene po treh postopkih, pri dodatku PEHA, pri dodatku 75 % PEHA in 25 % GA ter brez dodatka

mrežnega povezovalca in koncentraciji encima 1 mg/ mL

4.6 Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno aktivnost

encima

Rezultati so pokazali, da je ohranjena aktivnost encima višja pri večji koncentraciji, zato

smo nadalje uporabljali koncentracijo encima 1 mg/mL. Optimalne reakcijske pogoje za

večkratno uporabo imobiliziranega encima smo prikazali v tabeli 4-1.

Da bi ugotovili, koliko dejansko vpliva na ohranjeno aktivnost večkrat uporabljenega

imobiliziranega encima dodatek mrežnega povezovalca, smo hitozanskim maghemitnim

nanodelcem, pripravljenih po treh postopkih, dodali 0,02 M PEHA. Zanimala nas je tudi

ohranjena aktivnost hitozanskih maghemitnih nanodelcev, pripravljenih po treh postopkih,

ki jim nismo dodali mrežnega povezovalca.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

(%

)

uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

(%

)


ohranjena aktivnost (%)

učinkovitost imobilizacije (%)


46

Tabela 4-1: Optimalni reakcijski pogoji za večkratno uporabo imobiliziranega encima

Reakcijski parametri

Mrežni povezovalec PEHA

Koncentracija mrežnega povezovalca 0,02 M

Volumen mrežnega povezovalca 1 mL

Koncentracija encima 1 mg/mL

Masa magnetnih nanodelcev 5 mg

Hitrost stresanja 300 rpm

Čas imobilizacije 24 h

Diagram 4-12 prikazuje vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na specifično

aktivnost v U/mL encima. Kot je razvidno iz diagrama, je specifična aktivnost MC1 brez

dodatka mrežnega povezovalca PEHA padla na 0 že po drugem ciklu, medtem ko je bila

specifična aktivnost MC1 z dodatkom PEHA 0,0106 U/mL encima in je padla na 0 šele po

97 urah in šestem ciklu. Najboljše rezultate smo dosegli pri MC3 z dodatkom PEHA, kjer

smo ohranili aktivnost še po devetih ciklih in je padla vrednost na 0 šele po 122 urah. Vsak

cikel je trajal eno uro, medtem ko je bil časovni razmik med 5. in 6. ciklom 90 ur, med 7.

in 8. ciklom pa 22 ur (MC3 smo hranili v hladilniku).

Diagram 4-13 pa prikazuje vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno

aktivnost encima v %. Iz diagrama je razvidno, da je bila ohranjena aktivnost MC3 z

dodatkom PEHA po 2. ciklu še izredno visoka in sicer 97,26 %, medtem ko se je

konkretno zmanjšala šele po 9. ciklu (2,05 %). Po 10. ciklu pa ni bilo več ohranjene

aktivnosti.


47

Ker je v aktivnostnem testu prisoten etanol, ki povzroča zaustavitev reakcije, prostega

encima ni mogoče ločiti od substrata in tako ni možna večkratna uporaba. Tako smo si

morali prosti encim pripraviti za vsak aktivnostni test posebaj.

Diagram 4-12: Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na specifično aktivnost v U/mL encima

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

1 (1 h) 2 (2,5 h) 3 (4 h) 4 (5,5 h) 5 (7 h) 6 (97 h) 7 (98 h) 8 (120 h) 9 (121 h) 10 (122

h)

Spe

cifi

čna

akti

vno

st (

U/m

l en

cim

a)

Število ciklov

MC1

MC1-PEHA

MC2

MC2-PEHA

MC3

MC3-PEHA


48

Diagram 4-13: Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno aktivnost encima (%)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100O

hra

nje

na

akti

vno

st (

%)


ohranjena aktivnost -1. cikel (%)

ohranjena aktivnost- 2. cikel (%)


ohranjena aktivnost- 4.cikel (%)


ohranjena aktivnost- 6.cikel (%)






49

5 Zaključek

Iz naših rezultatov lahko sklepamo, da so nanodelci, ki smo jih pripravili po treh različnih

postopkih, ustrezni za imobilizacijo encima ChOx. Dokazali smo, da lahko dosežemo

večkratno uporabo imobiliziranega encima, medtem ko prostega encima nismo mogli

večkrat uporabiti, saj ga ni bilo mogoče ločiti od substrata.

V naših raziskavah smo se osredotočili na optimizacijo procesnih parametrov, ki vplivajo

na proces imobilizacije, in sicer optimalno koncentracijo encima ChOx, optimalno vrsto in

koncentracijo mrežnega povezovalca ter optimalno hitrost in način stresanja. Najvišjo

ohranjeno aktivnost smo dosegli po aktivaciji magnetnih nanodelcev, pripravljenih po

metodi kovalentne vezave, s 0,02 M PEHA, s koncentracijo encima 1 mg/mL, hitrosti

stresanja 300 rpm in 24-urno imobilizacijo. V tem primeru se je aktivnost ohranila 121 ur,

po desetem ciklu pa encim ni bil več aktiven. Ugotovili smo tudi, da je za sam proces

imobilizacije pomembna izbira mrežnega povezovalca, v našem primeru PEHA, saj se je

pri vezavi encima na GA aktivnost encima zmanjšala. Razlog za to smo iskali v neustrezni

vezavi encima na GA in posledično, da aktivna mesta niso bila dostopna substratu.

Pri metodi imobilizacije biokatalizatorja na magnetni nosilec je možno uporabiti zelo nizke

koncentracije encima, vendar se je v našem primeru izkazalo, da je imobilizacija

uspešnejša pri koncentraciji 1 mg/mL kot pri desetkrat manjši koncentraciji.

Za sam proces imobilizacije biokatalizatorja bi bile potrebne še natančnejše raziskave, s

katerimi bi lahko dobili še višje ohranjene aktivnosti in učinkovitosti, saj je načrtovanje

optimalnih procesnih parametrov za imobilizacijo ChOx na magnetni nosilec dolgotrajno

in zahtevno delo.


50

6 Literatura

1. http://www.scribd.com/doc/23626374/Biokat-in-sek-metab-osnove-FB-2009-Berlec,

dostopno 9.4.2013

2. http://sl.wikipedia.org/wiki/Encim, dostopno 9.4.2013

3. Worsfold P.J., Classification and chemical characteristics of immobilized enzymes,

Tehnical report, Pure and Applied Chemistry, 67(4), 1995, 597-600

4. http://bio.ijs.si/~brigita/encimska_tehnologija/P04_UE_IMOBILIZIRANI%20ENCIM

I1.pdf, dostopno 9.4.2013

5. Remškar M., Nanodelci in nanovarnost, 2009, dostopno na internetnem naslovu:

http://www.kemijskovaren.si/files/nano_knjiga.pdf, dostopno 9.4.2013

6. http://sl.wikipedia.org/wiki/Nanotehnologija, dostopno 9.4.2013

7. http://www.kolektornano.com/nanomateriali/magnetni-materiali, dostopno 10.5.2013

8. Gupta A.K., Gupta M., synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles

for biomedical applicators, Biomaterials 26, 2005, 3995-4021

9. Schereh C., Figueiredo Neto A.M., Ferrofluids: Properties and applications, Brazilian

journal of Physics, 35, 2005, 718-727

10. Shakeel A. A.i, Qayyum H., Potential applications od enzymes immobilized on/in

nano materials: A review, Biotechnology Advances, 30, 2012, 512-523

11. http://www.kolektornano.com/produkti/magnetne-tekocine/ferrofluids,dostopno

10.5.2013

12. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14356007.a01_321.pub2/full,dostopno

5.6.2013

13. http://en.wikipedia.org/wiki/Glutaraldehyde, dostopno 5.6.2013

14. http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm, dostopno 5.6.2013

15. Migneault I., Dartiguenave C., Bertrand J. M., Waldron C. K., Glutaraldehyde:

behavior in aqueus solution, reaction with proteins, and application to enzyme

crosslinking, BioTechniques, 37, 2004, 790-802


51

16. http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB1783025_EN.htm,

dostopno 5.6.2013

17. http://en.wikipedia.org/wiki/Immobilized_enzyme, dostopno 10.6.2013

18. http://www.lsbu.ac.uk/water/enztech/immethod.html, dostopno dne 10.6.2013

19. Guisan, Jose M., Immobilzation of enzymes and cells, 2nd ed, Totowa N.J: Humana

Press, 2006

20. Bailey J.E., Ollis D.F., Biochemical engineering fundaments, 2nd ed, New York: Mc

Graw-Hill, 1986

21. http://www.nutrilab.si/hitozan-04-08-2010.html, dostopno 5.4.2013

22. Strnad S., Šauperl O., Fras L., Jazbec A., Hitozan – vsestransko uporaben biopolimer,

Testilec, 2007, vol.50

23. http://sl.wikipedia.org/wiki/Hitin, dostopno 20.6.2013

24. http://en.wikipedia.org/wiki/Cholesterol_oxidase, dostopno 9.4.2013

25. http://www.thefreelibrary.com/Identification+of+novel+cholesterol+oxidase+from+rh

odococcus...-a0215925304, dostopno 15.4.2013

26. Košak A., Makovec D., Žnidaršič A., Drofenik M., Priprava magnetnih tekočin,

Materials and technology, 39, 2005, 37-41

27. Čampelj S., Makovec D., Bele M., Drofenik M., Jamnik J., Sinteza magnetnih

nanodelcev, funkcionaliziranih s tanko plastjo silike, Material and technology, 41,

2007, 103-107

28. Šulek F., Drofenik M., Habulin M., Knez Ž., Surface functionalization of silicacoated

magnetic nanoparticles for covalent attachment of cholesterol oxidase, Journal of

Magnetism and magnetic materials, 322, 2010, 179-185

29. http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB3222827_EN.htm,

dostopno 9.4.2013

30. http://en.wikipedia.org/wiki/Cholesterol, dostopno 9.4.2013


52

y = 0,8355x

R² = 0,9895

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Ab

sorb

anca

59

5n

m

Koncentracija (mg/mL)

UMERITVENA KRIVULJA- BRADFORD

7 Priloge

7.1 Umeritvena krivulja za določevanje koncentracije proteinov po Bradfordu


53

7.2 Tabele z rezultati

Tabela 7-1: Vpliv spremembe koncentracije mrežnega povezovalca GA

Material ω GA

(%, (v/v))

c ChOx

(mg mL-1)

ν

(rpm)

t imob.

(h)

A (243 nm) Enote

/mL

encima

ρ (%) φ (%)

ChOx

prosta

/ 0,1 / / 0,2443

(10x redčenje)

0,0362 100 /

MC1

1 0,1 300 24 0,1168 0,0017 4,70 46,38

2 0,1 300 24 0,0085 0,00013 0,33 25,38

3 0,1 300 24 0,0808 0,0012 3,09 33,75

MC2

1 0,1 300 24 0,5821 0,0086 23,76 68,19

2 0,1 300 24 0,1445 0,0021 5,55 20,29

3 0,1 300 24 0,1850 0,0027 6,94 48,90

MC3

1 0,1 300 24 0,2380 0,0035 9,07 64,18

2 0,1 300 24 0,0919 0,0014 3,87 15,91

3 0,1 300 24 0,1662 0,0025 6,43 44,48

Tabela 7-2: Vpliv spremembe hitrosti stresanja pri imobilizaciji encima

Material ν

(rpm)

ω GA

(%, (v/v))

c ChOx

(mg mL-1)

t imob.

(h)

A (243 nm) Enote /mL

encima

ρ (%) φ (%)

ChOx

prosta

300 / 0,1 / 0,2443

(10x redč.)

0,0362 100 /

1400 / 0,1 / 0,2522

(10x redč.)

0,0374 100 /

1* / 0,1 / 0,3120

(10 x redč.)

0,0462 100 /

MC1

300 1 0,1 24 0,1168 0,0017 4,70 46,38

1400 1 0,1 24 0,0118 0,0002 0,54 100


54

1* 1 0,1 24 0,0126 0,0002 0,51 44,17

MC2

300 1 0,1 24 0,5821 0,0086 23,76 68,19

1400 1 0,1 24 0,0431 0,0006 1,6 100

1* 1 0,1 24 0 0 0 48,96

MC3

300 1 0,1 24 0,2380 0,0035 9,07 64,18

1400 1 0,1 24 0 0 0 59,94

1* 1 0,1 24 0,0135 0,0002 0,51 60,63

Opomba: * stresanje na 1

Tabela 7-3: Vpliv mrežnega povezovalca na imobiliziran encim v primerjavi s prostim

Material ω GA

(%,

(v/v))

c PEHA

(mol/ L)

c ChOx

(mg mL-1)

ν

(rpm)

t imob.

(h)

A (243 nm) Enote

/mL

encima

ρ (%)

ChOx prosta / / 0,1 / / 0,2397

(10x redč.)

0,0355 100

ChOx GA 1 0,02 0,1 300 24 0,8466 0,0125 35,21

ChOx PEHA / / 0,1 300 24 0,2461

(10x redč.)

0,0365 102,82

Tabela 7-4: Vpliv spremembne mrežnega povezovalca pri imobilizaciji encima

Material ω GA

(%,

(v/v))

c PEHA

(mol/ L)

c ChOx

(mg mL-1)

ν

(rpm)

t imob.

(h)

A

(243 nm)

Enote /mL

encima

ρ (%) φ (%)

ChOx

prosta

/ / 0,1 / / 0,2506

(10x

redč.)

0,0371 100 /

1 / 0,1 300 24 0,1168 0,0017 4,70 46,38


55

MC1 / 0,02 0,1 300 24 0,0495 0,0007 1,89 76,03

MC2

1 / 0,1 300 24 0,5821 0,0086 23,76 68,19

/ 0,02 0,1 300 24 0,1119 0,0017 4,58 50,56

MC3

1 / 0,1 300 24 0,2380 0,0035 9,07 64,18

/ 0,02 0,1 300 24 0,8967 0,0133 35,85 100

Tabela 7-5: Vpliv spremembe koncentracije encima pri imobilizaciji encima

Material c ChOx

(mg mL-1 )

c PEHA

(mol/ L)

ν

(rpm)

t imob.

(h)

A (243 nm) Enote

/mL

encima

ρ (%) φ (%)

ChOx

prosta

0,1 / / / 0,2506

(10x redč.)

0,0371 100 /

1 / / / 0,2095

(10x redč.)

0,0310 100 /

MC1

0,1 / 300 24 0,0279 0,0004 1,08 100

0,1 0,02 300 24 0,0495 0,0007 1,89 76,03

1 / 300 24 0,0337 0,005 16,13 21,93

1 0,02 300 24 0,1193 0,0177 57,02 47,47

MC2

0,1 / 300 24 0,1318 0,0020 5,39 91,01

0,1 0,02 300 24 0,1119 0,0017 4,58 50,56

1 / 300 24 0,0877 0,0130 41,94 29,67

1 0,02 300 24 0,1656 0,0245 79,03 35,01

MC3

0,1 / 300 24 0,3090 0,0046 12,4 82,02

0,1 0,02 300 24 0,8967 0,0133 35,85 100

1 / 300 24 0,1176 0,0174 56,13 17,64

1 0,02 300 24 0,0986 0,0146 47,1 37,17


56

Tabela 7-6: Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na ohranjeno aktivnost

Material

Št.

ciklov

Čas od

začetka

merjenja

A (h)

c ChOx

(mg mL-1 )

c PEHA

(mol/ L)

ν

(rpm)

t imob.

(h)

A

(243 nm)

Enote

/mL

encima

*ρ

(%)

ChOx

prosta

1 / 1 / / / 0,2095

(10x

redč.)

0,0310 100

MC1

1 1 1 / 300 24 0,0337 0,0050 100

2 2,5 1 / 300 24 0 0 0

1 1 1 0,02 300 24 0,1103 0,0177 100

2 2,5 1 0,02 300 24 0,7131 0,0106 59,89

3 4 1 0,02 300 24 0,4711 0,0071 40,11

4 5,5 1 0,02 300 24 0,2255 0,0033 18,64

5 7 1 0,02 300 24 0,1695 0,0025 14,12

6 97 1 0,02 300 24 0 0 0

MC2

1 1 1 / 300 24 0,0877 0,0130 100

2 2,5 1 / 300 24 0,1665 0,0025 19,23

3 4 1 / 300 24 0,0607 0,0009 6,92

4 5,5 1 / 300 24 0 0 0

1 1 1 0,02 300 24 0,1656 0,0245 100

2 2,5 1 0,02 300 24 0,6252 0,0093 37,96

3 4 1 0,02 300 24 0,1725 0,0026 10,61

4 5,5 1 0,02 300 24 0,1015 0,0015 6,12

5 7 1 0,02 300 24 0,0403 0,0006 2,45

6 97 1 0,02 300 24 0 0 0

MC3

1 1 1 / 300 24 0,1174 0,0174 100

2 2,5 1 / 300 24 0,2540 0,0038 21,84

3 4 1 / 300 24 0,1049 0,0016 9,2

4 5,5 1 / 300 24 0 0 0

1 1 1 0,02 300 24 0,0986 0,0146 100

2 2,5 1 0,02 300 24 0,9577 0,0142 97,26

3 4 1 0,02 300 24 0,7914 0,0117 80,14


57

* Opomba: Ohranjena aktivnost je preračunana glede na prvotno aktivnost, ki jo vzamemo kot 100 %.

4 5,5 1 0,02 300 24 0,5427 0,0080 54,79

5 7 1 0,02 300 24 0,4356 0,0065 44,52

6 97 1 0,02 300 24 0,1724 0,0026 17,82

7 98 1 0,02 300 24 0,1250 0,0019 13,01

8 120 1 0,02 300 24 0,0301 0,0005 3,08

9 121 1 0,02 300 24 0,0232 0,0003 2,05

10 122 1 0,02 300 24 0 0 0


58

8 Življenjepis

Curriculum vitae

OSEBNI PODATKI Sara Tominc

Savinsko 38 B, 2322 Majšperk, Slovenija

00386 40492521

[email protected]

Spol ženski

Datum rojstva 28/04/1989

Državljanstvo slovensko

DELOVNE IZKUŠNJE

2012 (oktober, november)

2013 (januar-september)

Opravljanje dvomesečne strokovne prakse

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Smetanova

ulica 17, 2000 Maribor

Delo v laboratoriju: določanje aktivnosti in učinkovitosti encimov z UV-VIS

spektrofotometrom, delo z visokotlačnim šaržnim reaktorjem in superkritičnim

CO2,

Opravljanje praktičnega dela v okviru diplomske naloge

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Smetanova

ulica 17, 2000 Maribor

Delo v laboratoriju: priprava magnetne tekočine, priprava modificiranih

magnetnih nanodelcev, imobilizacija encimov na nanodelce, določanje aktivnosti

in učinkovitosti encimov z UV-VIS spektrofotometrom


59

IZOBRAŽEVANJE IN

USPOSABLJANJE

KOMPETENCE

2008-2013

2004-2008

1996-2004

Univerzitetni diplomirani inženir kemijske tehnologije

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Slovenija

▪ Pridobljeno znanje na področju encimskih tehnologij, mikrobiologije, analizne

kemije. Osvojeno znanje anorganske, organske, fizikalne kemije, biokemije,

termodifuzijskih separacijskih procesov, farmacevtskih učinkovin. Pridobljene

veščine dela v laboratoriju.

Gimnazijski maturant

Prva gimnazija Maribor

Osnovna šola Borisa Kidriča, Maribor

Materni jezik Slovenski jezik

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno

razumevanje

Bralno

razumevanje

Govorno

sporazumevanje

Govorno

sporočanje

angleški B2 B2 B2 B2 B2

nemški A2 A2 A2 A2 A2

Komunikacijske kompetence

Izkušnje z javnim nastopanjem, posredovanje znanja drugim (inštrukcije)

Računalniške kompetence

Poznavanje programov Microsoft PowerPoint™ , Microsoft Word™, Microsoft

Excel™, osnove programiranja (FORTRAN, ASPEN)

imobilizacija holesterol oksidaze na maghemitne nanodelce

Documents