sinh hoc te bao

5/13/2018 sinh hoc te bao - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/sinh-hoc-te-bao 1/44

ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 1

MỤC LỤC

MỤC LỤC ............................................................................................................. 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 2

I. CƠ SỞ NGHIÊN CỨU TẾ BÀO GỐC ........................................................... 31.1. Lịch sử nghiên cứu ................................................................................... 31.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc da hiện nay............................................ 31.3. Các phương pháp điều trị bỏng hiện nay .................................................. 3

II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ ................................................................................ 52.1.Đại cươ ng về da ........................................................................................ 52.1.1. Giới thiệu .............................................................................................. 52.1.2. Lớp biểu bì ............................................................................................ 62.1.3. Lớp trung bì.........................................................................................152.1.4. Màng cơ bản ........................................................................................152.1.5. Sự phân bố mạch và thần kinh ..............................................................152.1.6. C ấu trúc phụ tr ên da.............................................................................162.2. Tế bào gốc...............................................................................................182.2.1.Khái niệm ..............................................................................................182.2.2. Phân loại tế bào gốc theo khả năng biệt hóa ........................................192.2.3. Phân loại tế bào gốc dựa vào vị trí thu nhận tế bào gốc .......................202.3. Biệt hóa tế bào .........................................................................................212.3. Cơ chế biệt hóa của tế bào gốc biểu b ì .....................................................232.3.1. C ơ chế biệt hóa của tế bào gốc biểu bì .................................................23

2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng ...........................................................................24III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ TRIỂN VỌNG ........................................283.1. Tình hình nghiên cứu tr ên thế giới...........................................................283.1.1. Việc nuôi cấy nguyên bào sợi, nguyên bào sừng biểu bì.......................283.1.2. Công nghệ sử dụng tế bào gốc..............................................................303.1.3. Theo nghiên cứu mớ i nhất của các nhà khoa học .................................313.1.4. Phươ ng pháp tr ị liệu tế bào gốc ...........................................................313.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.............................................................313.2.1. Công nghệ nuôi cấy tế bào da hiện nay ................................................323.2.2. Công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi trong điều trị bỏng .......................333.2.3. Công nghệ nuôi cấy tế bào sừng da tự thân trong điều trị bỏng ...........373.2.4. Sử dụng tế bào gốc trong công nghệ nuôi cấy tế bào ............................393.3.Triển vọng ứng dụng của tế bào gốc .........................................................39

KẾT LUẬN ..........................................................................................................41 PHỤ LỤC .............................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................44





MỞ ĐẦU

Nhiều năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy tế bào gốc đã có nhiều bước phát

triển mạnh mẽ và mang lại kết quả to lớn trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong y

sinh học. Một trong những thành tựu đó phải nói đến các ứng dụng của nuôi cấy tế

bào da và tế bào gốc để điều trị bỏng. Hiện nay, trên thế giới có nhiều công tr ình

nghiên cứu khoa học tìm kiếm các nguồn tế bào gốc tối ưu và khả năng ứng dụng

của tế bào gốc trong cuộc sống. Một trong các ứng dụng lớn trong điều trị bỏng làtạo ra các vật liệu sinh học để làm lớ p màng che phủ tạm thời hay tạo các màng

biểu b ì nhân tạo. Các nghiên cứu mới đã góp phần điều trị các tổn thương do bỏng,

như trị sẹo cho người bị bỏng, nuôi cấy và cấy ghép tế bào gốc da cho người bị

bỏng... Nhờ thành tựu của công nghệ mới, nhiều bệnh nhân đã được cứu sống và

góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân bị bỏng.





I. CƠ SỞ NGHIÊN CỨ U TẾ BÀO GỐC

1.1. Lịch sử nghiên cứu Năm 1800: phát hiện rằng một số tế bào có thể tạo ra các tế bào khác

Năm 1956: các nhà khoa học tr ên thế giới đã có những thành công đầu tiêntrong nghiên cứu cấy truyền các tế bào xương.

Năm 1968: Marvin Karasek thực hiện nuôi và biệt hóa tế bào của da thỏ thành

công.

Năm 1978, Marvin Karasek đã tìm thấy sự liên quan giữa tế bào sừng và

nguyên bào sợi trong quá tr ình nuôi cấy.

Năm 1980, Marvin Karasek đã thành công khi cấy 1cm

2

dây rốn, sau một thờigian nuôi cấy đã đạt 3m2 biểu b ì. Với những cống hiến của m ình và bằng sự kiện

trên, ông được xem là ông tổ của kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng.

Tháng 11/2007: James Thomson và Junying Yu thuộc đại học Wusconsin –

Madison (Mỹ) đã công bố kết quả nghiên cứu tái tạo tế bào da thành tế bào gốc.

Từ đó đến nay, tế bào gốc ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong y học nhất

là cấy ghép tế bào gốc da để chữa bỏng.

1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc da hiện nay Trên thế giới đang phát triển công nghệ tạo tế bào mầm từ các tế bào trưởng

thành để phục vụ cho nhiều mục đích.

Ở Việt Nam hiện đang có 3 ứng dụng lớn của tế bào gốc trong điều trị bỏng

và các vết thương mãn tính; trong thẩm mỹ; trong chỉnh h ình,…

1.3. Các phương pháp điều trị bỏng hiện nay Các bác sỹ lấy phần da lành của người bỏng để ghép lên nơi bị bỏng, phương

pháp này gọi là ghép da tự thân.

Dùng da đồng loại như da của người thân bệnh nhân hoặc da dị loại như ếch,

trung bì da heo để ghép lên.





Hiện nay, Viện Bỏng đang áp dụng phương pháp nuôi cấy nguyên bào sợi,

loại tế bào có tác dụng tái tạo da, để điều trị cho các bệnh nhân bị bỏng nặng.





II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ

2.1.Đại cương về da

2.1.1. Giới thiệu

Da là một trong các cơ quan lớn nhất và hoạt động nhiều nhất ở cơ thể người.

Gồm ba lớp cấu trúc chính là: lớp biểu b ì, lớp trung b ì, lớp hạ b ì, ở da còn có các tổ

chức (tuyến tiết, lông, móng, các thụ quan).

Đối với người Việt trưởng thành thì diện tích bề mặt da trung b ình chiếm

khoảng 15 - 17% trọng lượng toàn cơ thể. Da có chiều dày khoảng 0,07 - 2,5mm,

dày nhất ở vùng tay, bàn chân là từ 3 - 4 mm và mỏng nhất ở vùng mi mắt 0,3 mm,

môi. Da dày mỏng khác nhau được giải thích bởi các tác động của các yếu tố khácnhau của môi trường vào từng vùng riêng rẽ trên cơ thể.

Da là cơ quan của hệ bài tiết, được bao bọc quanh cơ thể, che chở cơ thể khỏi

các tác nhân không có lợi của môi trường bên ngoài đối với cơ thể, giữ nhiệt độ cơ

thể không đổi. Da có chức năng chính trong điều hòa trao đổi chất, cảm nhận nhiệt

độ, chức năng cảm giác, tổng hợp vitamin B, D và có vai trò làm đẹp.





2.1.2. Lớp biểu bì

Biểu b ì là lớp ngoài cùng của da, tiếp xúc trực tiếp với môi trường ngoài. Và

là hàng rào đầu tiên bảo vệ cơ thể, mỏng và chia thành năm lớp nhỏ: lớp đáy, lớp

sợi, lớp hạt, lớp bóng, lớp sừng. Trong biểu b ì không có các mạch máu và mạch

bạch huyết điển h ình. Biểu b ì được nuôi dưỡng nhờ cơ chế khuếch tán các chất

dinh dưỡng từ mô liên kết qua màng đáy.





Xen giữ các lớp tế bào biểu mô có

các đầu mút tận cùng thần kinh trần,

không có vỏ bao quanh. Chúng chia

nhánh nhỏ chia nhỏ chạy luồn trong các

khoảng gian bào và tiếp xúc với các tế

bào biểu b ì. Một số đấu mút thần kinh

cảm giác này khi tiếp xúc với tế bào biệt

hóa thành tế bào cảm giác phụ đống vai

trò như một thụ thể tiếp xúc cảm giác của

da.





a. Lớp đáy

Lớp đáy được tại bởi một tế bào khối vuông hay trụ thấp, nằm trên đáy

màng, có khả năng phân chia liên tục và di chuyền ra bề mặt để thay thế dần cho

các tế bào già bên trong bong ra, đó là các tế bào sừng. Chủ yếu lớp đáy có chứa khoảng 10% là tế bào sừng, 50% các tế bào khác

đang ở thời điểm giao thời của sinh trưởng, 40% còn lại là các tế bào ở hậu kỳ của

giảm phân. Những tế bào của lớp đáy đó được gắn kết trên màng cơ bản nhờ các

phân tử dính fibronectindo nguyên bào sợi của trung kỳ tiết ra. Ngoài ra nằm rải

rác trong lớp đáy còn có một số loại tế bào khác: hắc tố bào, tế bào Langerhans và

Merkel.





b. Lớp sợi

Lớp sợi ở tr ên lớp đáy, đó là tập hợp của 5 - 20 tầng tế bào đa diện liên kết

chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối liên bào phân nhánh, chặt chẽ. Các tế bào này

tương đối đặc trưng bởi h ình đa diện và nhân hình cầu.c. Lớp hạt

Lớp hạt bao gồm từ 3 - 5 lớp tế bào đa diện dẹp, ở tr ên lớp sợi. Các tế bào này

chứa nhiều hạt sắc tố và nhân, chúng tự chết theo chu tr ình để sẵn sàng chuyển

thành dạng tế bào sừng hóa.

Lớp hạt gồm các tế bào hình thoi, trong tế bào thường có chứa rất nhiều các

hạt keratohyalin bắt màu bazơ khá đậm.d. Lớp bóng

Lớp bóng nằm phía trên lớp hạt là một lớp mỏng và đã có sự biến đổi sâu sắc

về bản chất của các tế bào của lớp. Tế bào trở nên dài hơn, dẹt hơn, nhân và tất cả

các bào quan biến mất dần do bị phân giải. Nói chung, chúng đã thoái hóa không

còn hình dạng tế bào.

e. Lớp sừng

Ở tr ên bề mặt biểu b ì, tế bào biến thành những lá sừng mỏng, trong bào tương

chứa rất nhiều sừng nhằm ngăn cản sự thoát hơi nước, cách nhiệt và những nhân tố

bất lợi khác từ ngoài môi trường xâm nhập vào cơ thể. Sự đổi mới hoàn toàn của

lớp biểu b ì tính từ khi sản sinh ra một tế bào gốc mới đến khi rụng thành vảy vào

khoảng 45 - 75 ngày. Tuy nhiên quá trình này còn phụ thuộc vào môi trường nội

tại của mô có thuận lợi hay không bao gồm các tín hiệu tiếp xúc để tế bào sao chép

và di chuyển cùng những nhân tố hóa học của các nhân tố tăng trưởng.





f. Các tế bào thuộc lớp biểu b ì

T ế b ào sừng

Là những tế bào có nguồn gốc từ ngoại phôi b ì và phân bố khắp biểu b ì

(chiếm 95% tổng số tế bào của lớp biểu b ì) và cũng có hoạt động phân bào. Trongquá trình biệt hóa những tế bào này di chuyển lên phía trên thay cho các tế bào

phía trên bị bong ra, nhờ đó lớp biểu b ì luôn được thay mới. Quá trình di chuyển

lên trên của các tế bào thường xảy ra khoảng 25 - 50 ngày.

T ế b ào melanin

Là các tế bào dạng đuôi gai chứa các sắc tố melanin có màu nâu đen được t ìm

thấy trong da, mắt, tóc. Phân tử melanin được h ình thành khi acid amin bị oxy hóa.

Chiếm tỷ lệ nhỏ khoảng 2% số tế bào của lớp biểu b ì. Tế bào melanin giúp hình

thành nên màu sắc da, hấp thu năng lượng UV và bảo vệ da tránh tác hại của tia

UV.

T ế b ào Langerhans





Có nguồn gốc từ tủy xương, theo máu xâm nhập vào da. Chúng chiếm tỷ lệ 2

- 8% các tế bào biểu b ì. Những tế bào này liên quan đến hệ thống miễn dịch của

biểu b ì. Chúng phát hiện và xử lý, tr ình diện kháng nguyên lạ xâm nhập vào biểu

bì, kích thích gây nên đáp ứng nhu cầu miễn dịch. T ế b ào Merkel

Là những tế bào thần kinh nội tiết, chiếm một lượng nhỏ khoảng 1% trong lớp

đáy biểu b ì, liên kết với nhau bằng cầu nối gian bào. Chúng tiếp xúc với đầu cuối

dây thần kinh và có chức năng như một thể cảm thụ cơ học. Ngoài ra, còn một số

tế bào khác trong biểu b ì như: tế bào bạch cầu trung tính, tế bào bạch cầu ưa acid,

hồng cầu,… Là những loại sẽ xuất hiện và tăng lên trong trường hợp bệnh lý. g. Hình thái điển h ình của các tế bào biểu b ì

Biểu b ì có cấu trúc lát tầng được tạo bởi nhiều lớp tế bào, lớp tr ên cùng có

hình dẹt đa diện, đây có thể coi là loại biểu mô bảo vệ điển h ình.





Biểu mô trụ tầng có lớp tế bào trên cùng trên hình trụ, loại mô này có ít.

Loại biểu mô vuông tầng có lớp tế bào nằm tr ên cùng có hình vuông, các tế

bào này chứa rất nhiều sắc tố.

h. Một số cấu trúc đặc biệt của các tế bào biểu b ì

Do đặc điểm tiếp xúc với bề mặt ngoài, luôn có một mặt tự do, tế bào biểu b ì

nói chung và tế bào da có một số cấu trúc liên kết đặc biệt, v ì thế khi quan sát dướikính hiển vi quang học, màng của các tế bào nằm sát nhau, không chứa các khoảng

gian bào.

Những khoảng gian bào đó (có khi rộng tới 20 - 30mm) thường được lấp đầy

bởi glycocalyx có bản chất glycoprotein tạo thành cấu trúc lớp dải bịt. Lớp này có





vai trò rất quan trọng trong việc gắn kết các tế bào biểu mô với nhau, ngăn chặn sự

ngấm của các chất dịch không cần thiết, nhưng lại rất linh động trong quá tr ình âm

bào và miễn dịch tự nhiên cũng như việc lưu chuyển các chất mà cơ thể hay tế bào

cần. Vùng dính nằm sát bên dưới dải bịt do lớp bào tương của tế bào tiếp giáp với

lớp trong trở nên đặc, kết hợp với các sợi nhỏ tạo thành một vành liên tục quanh tế

bào.

Thể liên kết dưới kính hiển vi, quan sát thấy chúng được tạo thành hai mảnh

đặc biệt đối diện của hai mảng bào tương thuộc hai tế bào nằm cạnh nhau. Tại đó

khoảng gian bào rộng ra và chứa một chất có mật độ điện tử thấp. Từ vị trí thể liênkết, các sợi sừng tỏa đều ra các vùng bào tương xung quanh.





Khe liên kết còn gặp ở nhiều loại tế bào khác: cơ trơn, cơ tim, mô thần kinh,...

Khoảng gian bào hẹp lại chỉ khoảng 2mm, có những đơn vị kết nối h ình ống nối

xuyên ngang hai màng tế bào cạnh nhau. Lòng ống cho phép các ion, phân tử có

kích thước nhỏ (dưới 1000 Da) di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác. Đây chính

là synap điện, cơ sở cấu trúc truyền thông tin giữa hai tế bào biểu b ì.

Khe liên kết

Thể liên kết





Sự phân cực của tế bào được biểu hiện rất r õ ở các tế bào biểu mô: phần bào

tương phía trên hoàn toàn khác với phần phía dưới nhân. Sự phân cực này có liên

quan mật thiết tới các chức năng của tế bào biểu b ì.

Mặt tự do của các tế bào biểu b ì thường tạo các khía (giống như bàn chải) đểtăng diện tích tiếp xúc và giữa các khía là những xơ actin.

2.1.3. Lớp trung bì

Trung bì là mô liên kết vững chắc bao gồm các chất nền, các tế bào liên kết,

các sợi đàn hồi, nang lông, mạch máu sợi thần kinh và các thụ quan. Bề dày của

lớp trung b ì phát triển tùy từng vùng, nơi dày nhất có thể lên tới 2mm.

Trung bì được chia làm hai lớp tuy nhiên ranh giới không r õ ràng.

2.1.4 . Màng cơ bản

Là ranh giới chỗ nối giữa trung b ì và biểu b ì, nếu các tế bào biểu b ì bên trên

và trung bì bên dưới. Nó có cấu trúc mô xơ liên kết, có chức năng ngăn cản sự

thoát các phân tử có trọng lượng phân tử lớn hơn 40 KDa nhưng vẫn cho phép tế

bào Langerhans, tế bào Merkel, các tế bào lympho và các hắc tố bào đi qua chúng.

Màng cơ bản gồm bốn lớp là: lớp nền của tế bào gốc, lớp lá trong suốt, lớp ládày và lớp lá dưới.

Thành phần của màng cơ bản gồm các chất: kháng nguyên Bullous

pemphigoid (là một glyprotein 200.000 Da), Laminin (glyprotein 1x10 Da),

Collagen IV và VII.

2.1.5. Sự phân bố mạch v à thần kinh

Những tiêu động mạch dinh dưỡng cho da đến từ hai đám rối mạch, một khutrí giữa lớp nhú và lớp lưới, đám rối còn lại nằm giữa trung b ì và hạ b ì.

Sự phân bố thần kinh ở da rất đa dạng nhằm tiếp nhận các kích thích của môi

trường. Ước tính, mỗi cm da chứa tới 70 cm mạch máu, 55 cm dây thần kinh, 100

tuyến mồ hôi, 15 tuyến nhờn, 230 thụ quan cảm giác và một số tuyến dịch.





Ngoài ra trong lớp da, các đầu mút thần kinh trên đến tiếp xúc với các tế bào

biểu mô cũng như các tuyến phụ thuộc da, quanh các nang lông.

2.1.6. C ấu trúc phụ tr ên da

Lông

Lông phủ tr ên toàn bộ cơ thể, chúng có tác dụng như một giác quan phụ, bảo

vệ điều hòa thân nhiệt, giúp dể thoát mồ hôi. Lông được phát triển từ các tế bào bị

sừng hóa và chiều dài tự nhiên biến động từ vài mm tới hàng mét (tóc), tiết diện từ

0,005 - 0,6 mm tùy theo từng vùng.

Cấu tạo chung, lông gồm rễ lông nằm dưới da và được bao bởi bao chân lông.

Tại đây, lông phình ra gọi là hành lông, nơi có cơ trơn vận lông bám vào. Phần tr ênlà thân lông và ngọn lông.

Trên tiết diện cắt ngang, phần ngoài cùng mỏng bao bọc gọi là màng lông,

tiếp ngay đến là vỏ lông, nơi chứa các phân tử sắc tố melanin, trong cùng là tủy

lông bị sừng hóa dần từ hành lông tới ngọn lông.

Móng

Đây là cấu trúc đã hóa sừng của phần thượng b ì nằm ở mặt mu của các ngóntay, ngón chân. Chức năng chủ yếu của móng là để bảo vệ ngón.

Móng có phần thân lộ ra ngoài và phần rễ ăn sâu trong lớp da. Giữa da và rễ

móng có một phần r ãnh được gọi là lớp sừng tr ên móng và một vùng da bị sừng

hóa được gọi là lớp sừng dưới móng. Hai bên gờ của móng là lớp sừng quanh

móng tiếp xúc với ít da hơn.

Quan sát phía trước của lớp sừng tr ên móng có hình bán nguyệt màu trắng

đục, đó là nơi đang trong giai đoạn sừng hóa. Các chấm trắng lốm đốm là sự sừng

hóa chưa hoàn toàn.

Các tuyến của da

Có ba tuyến:





- Tuyến nhờn: gọi là tuyến bã đổ vào nang tuyến (trừ các khu vực không có

lông thì đổ trực tiếp ra da), sản phẩm của tuyến này giúp da luôn có độ ẩm, mềm

mại và chống thấm nước nhưng lại thoát hơi nước.

- Tuyến mồ hôi: có cấu trúc ống, phần dưới cuộn lại thành búi nằm rất sâudưới da, phần tr ên nối ra bề mặt da. Tr ên toàn bộ diện tích da có khoảng 200 triệu

tuyến, mật độ cao nhất ở các lòng bàn tay, bàn chân và hốc nách. Ở phần da môi

không có tuyến mồ hôi. Tuyến mồ hôi còn là nơi cư trú chủ yếu của các vi sinh vật

sống cộng sinh.

Việc tiết mồ hôi liên quan đến điều hòa thân nhiệt. B ình thường mồ hôi tiết

liên tục nhưng ít, trung b ình một ngày khoảng nửa lít. Khi môi trường nóng bức,hoạt động mạnh, bệnh lý... lượng mồ hôi tiết tăng lên một lượng lớn theo nghiên

cứu khoảng 5 - 6 lít một ngày.

- Tuyến sữa gồm một đôi tuyến trước ngực, chúng có nguồn gốc biệt hóa từ

tuyến mồ hôi. Tuyến này có liên quan mật thiết tới các hoạt động sinh dục của con

người. Nó có thể được coi như một bộ phận sinh dục ngoài của cơ thể.





Cơ thể con người được cấu tạo từ tế bào, trong cơ thể có khoảng 100.000 tỷ tế

bào với tr ên 200 loại tế bào khác nhau. Cơ thể con người có khả năng kỳ diệu đó làsự tái tạo, tái sinh của nhiều loại tế bào, mô dạng. Đặc trưng cho khả năng tr ên là tế

bào gốc.

2.2. Tế bào gốc

2.2.1.Khái niệm

Tế bào gốc là những tế bào không chuyên biệt hoặc chưa phân hóa trong mô

sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng sinhlý. Tế bào gốc có khả năng tự làm mới, phân chia không giới hạn, tự khuếch đại và

khả năng biệt hóa.





Chúng cấu tạo nên 5 nhóm mô chính trong cơ thể con người, gồm: biểu mô,

mô liên kết, máu, mô thần kinh, cơ. Dựa trên góc độ phân chia tế bào (cell

division), có 3 nhóm tế bào biệt hoá (types of differentiated cells):

- Nhóm một gồm: tế bào lăng kính mắt, tế bào thần kinh, tế bào cơ tim.

- Nhóm hai gồm: nguyên bào sợi của da, tế bào cơ trơn, tế bào nội mạc thuộc

hệ mạch máu, tế bào biểu mô của đa số các nội tạng như gan, tụy, thận, phổi, tuyến

tiền liệt, tuyến vú.

- Nhóm ba gồm: các tế bào biểu b ì, các tế bào biểu mô ống tiêu hóa.

2.2.2. Phân loại tế b ào gốc theo khả năng biệt hóa

Tế bào gốc đa năng (totipotent) là: tế bào gốc có khả năng phát triển và phân

hóa thành mọi loại tế bào khác, phụ thuộc vào điều kiện phát triển của tế bào và

ảnh hưởng của điều kiện môi trường.

Tế bào gốc toàn năng gồm: các hợp tử sau khi thụ tinh, một số tế bào phôi

sớm ở động vật và nhiều loại tế bào thực vật. Tế bào gốc toàn năng có thể phát

triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.





Tế bào gốc đa năng (pluripotent, multipotential): thế hệ kế tiếp được tạo thành

từ tế bào gốc toàn năng. Tế bào gốc đa năng có thể biệt hóa và phát triển thành

nhiều loại tế bào khác ngoài tế bào toàn năng (totipotent). Tế bào gốc đa năng là

những tế bào gốc biệt hóa thành hầu hết các mô trong cơ thể, các tế bào gốc đanăng thu nhận từ phôi sớm, gọi là tế bào gốc pluripoten. Tế bào gốc đa năng thu

nhận từ tế bào trưởng thành được gọi là tế bào gốc multipotent.

Tế bào gốc đơn năng đơn hướng (unipotent): đây là những tế bào gốc có thể

sinh ra một loại tế bào. Tế gốc biệt hóa h ình thành hai hay nhiều loại tế bào cùng

nhóm gọi là tế bào gốc đơn năng đa hướng (oligopotent) như: tế bào gốc biểu mô

biệt hóa h ình thành vài loại tế bào biểu mô khác nhau.

2.2.3. Phân loại tế b ào gốc dựa v ào v ị trí thu nhận tế b ào gốc

Dựa vào vị trí thu nhận tế bào gốc từ các mô, cơ quan của cơ thể có thể chia

thành nhiều loại tế bào gốc khác nhau như:

Tế bào gốc phôi thu nhận từ các nút phôi ở giai đoạn đầu phát triển phôi.

Tế bào gốc trưởng thành được thu nhận từ các mô hoặc cơ quan trong cơ thể

trưởng thành. Tế bào gốc trưởng thành có thể tự đổi mới hoặc biệt hóa thành cácloại tế bào khác. Tế bào gốc da có thể thu nhận từ tế bào gốc trưởng thành.





2.3. Biệt hóa tế bàoBiệt hóa tế bào gốc: là quá trình biến đổi từ tế bào gốc không có chức năng

chuyên biệt thành tế bào chuyên hóa. Khả năng biệt hóa của các loại tế bào gốc

phụ thuộc vào bản chất của tế bào gốc, tác động của các yếu tố thông tin đến tế bào

và điều kiện phát triển của tế bào.





SomaMầm phôi

Tế bào gốc người

Thai nhi Trẻ sơ sinh Phôi thai Người lớn

Ruột Tuyến tụMắt Thần kinh Gan Biểu b ìHemopoietic Trung mô





2.3. Cơ chế biệt hóa của tế bào gốc biểu b ìDa là hàng rào chắc chắn đầu tiên bảo vệ cơ thể khỏi mất nước, ngăn chặn các

tổn thương và sự xâm nhiễm. Để đáp ứng những yêu cầu này, da đã có một quá

trình biệt hóa khá phức tạp, làm cho da trở lên dai chắc, không thấm nước và luôntự đổi mới.

Tế bào sừng đóng một vai tr ò khá quan trọng trong quá tr ình này.Và biệt hóa

là quá trình đóng vai tr ò chủ chốt trong quá tr ình tự đổi mới của da. Ở lớp đáy các

tế bào sừng gốc đi vào một chu tr ình biệt hóa được gọi là chu trình biệt hóa cuối

cùng để tạo thành các tế bào chết hóa sừng, h ình thành một lớp màng sừng bảo vệ

cơ thể.

2.3.1. Cơ chế biệt hóa của tế b ào gốc biểu bì





Vị trí của các tế bào sừng trong quá tr ình biệt hóa ở biểu b ì:

Như đã biết ở tr ên, biểu b ì gồm 5 lớp. Các tế bào gốc và các tế bào sừng có

khả năng tăng sinh rất mạnh chỉ có trong lớp sâu nhất của biểu b ì (là lớp đáy). Các

tế bào gốc bám chặt vào màng nền. Cho đến khi các tế bào ở lớp đáy nhiều lên,một số tế bào bắt đầu di chuyển khỏi lớp này lên bề mặt da. Và chúng mất một

khoảng thời gian là 25 - 50 ngày. Sự thay đổi đầu tiên là các tế bào ở lớp đáy

ngừng sản xuất chất sừng 5 - 14 ngày sau khi tách khỏi màng nền.

Sự chuyển đổi trong biểu hiện gen xuất hiện khi tế bào sừng từ lớp hạt đi lên

lớp sợi và chúng bắt đầu tổng hợp protein filaggrin và loicrin. Các tế bào sừng khi

ở trong lớp sợi cuối cùng suy yếu đi và hoạt hóa gen transglutaminase ở biểu b ì,chúng xúc tác các liên kết chéo của protein màng cho tới khi các tế bào sừng ở lớp

sợi chết đi, th ì các vảy hay bộ xương tế bào chứa đầy chất sừng do chúng để lại và

protein liên kết. Xác của các tế bào chết tạo thành một mảng bảo vệ ở lớp sừng, sau

đó màng tạo thành các lớp vảy và dễ bị tróc ra.

2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng

a. Ảnh hưởng của môi trường đến biệt hóa tế bàoCác chất dinh dưỡng , chất độc, áp suất, nhiệt độ,... ảnh hưởng r õ rệt đến biệt

hóa tế bào động vật. Ví dụ, nuôi cấy các tế bào gốc phôi (ES) chuột ở các môi

trường có chất dinh dưỡng, nồng độ CO2, và nhiệt độ khác nhau, có thể tạo nên

các loại tế bào khác nhau.

Trong nuôi cấy mô thực vật,điều kiện chất dinh dưỡng và môi trường quyết

định quá trinh tạo calus…

Khả năng biệt hóa và tái sinh của da, phụ thuộc vào nồng độ một loại protein

đặc hiệu.

b.Tác động của tín hiệu tế bào đến quá tr ình biệt hóa





Biệt hóa tế bào có vai trò quan trọng trong quá tr ình hình thành và phát triển

của mọi sinh vật, từ hợp tử đến cơ thể trưởng thành. Trong quá trình biệt hóa h ình

thành các mô và hệ cơ quan của cơ thể, mỗi lớp tế bào của phôi sớm có các quá

trình biệt hóa khác nhau, chịu ảnh hưởng của nhiều loại tác nhân môi trường.

Mọi tế bào có khả năng tiếp nhận và xử lý nhiều loại thông tin từ môi trường

như hàm lượng các chất dinh dưỡng, hàm lượng oxy, nhiệt độ, áp suất… Trong

quá trình biệt hóa của nhiều loại tế bào khác nhau, tín hiệu tế bào giữ vai tr ò vô

cùng quan trọng. Từ một loại tế bào gốc đa năng h ình thành nên nhiều loại tế bàogốc khác nhau nhờ tác động của các loại tín hiệu tế bào (signal) khác nhau. Tế bào

trả lời tín hiệu bằng nhiều con đường khác nhau như ức chế hay hoạt hóa gen, thay

đổi bề mặt tế bào, thay đổi hoạt hóa enzyme,... Mỗi loại tế bào đều có cơ chế tiếp

nhận tín hiệu, truyền tín hiệu và trả lời tín hiệu khác nhau, làm cho từ một loại tế

bào gốc có thể biệt hóa các loại tế bào khác nhau.





Quá trình biệt hóa của tế bào gốc tạo da phụ thuộc vào sự tác động và điều

chỉnh của hàng loạt tín hiệu tế bào. Các tín hiệu tế bào khác nhau tác động vào tếbào gốc tạo da dẫn đến các quá tr ình biệt hóa khác nhau, hình thành các loại tế bào

khác nhau.

c. Vai trò của gen trong quá tr ình biệt hóa

Biệt hóa tế bào là quá trình tất yếu trong quá tr ình phát sinh và phát triển của

mỗi cơ thể sống. Biệt hóa tế bào giúp một hợp tử sau thụ tinh phân hóa thành nhiều

lớp tế bào phôi, từ đó biệt hóa thành nhiều loại mô, cơ quan trong mỗi cơ thể.

Trong quá trình biệt hóa của mỗi loại tế bào, vai trò của các gen biệt hóa có ý

ngh ĩa quyết định. Cơ chế tác động của từng loại gen đến quá tr ình biệt hóa của

nhiều loại tế bào khác nhau còn chưa được nghiên cứu đầy đủ.

d. Cơ chế biệt hóa tế bào còn chịu một số ảnh hưởng của Hormone, các

yếu tố tăng trưởng và vai trò của ion Ca2+

- Khi tế bào sừng được nuôi cấy tên môi trường không có huyết thanh được

bổ sung Hormone như insulin và protein EGF. EGF là protein được sản xuất từ tá

tràng và tuyến nước bọt, DGF có thể thúc đẩy sự tăng sinh tế bào và kích thích sự

tăng trưởng mới ở da cũng như ở bề mặt ruột và màng sừng. Trên màng của tế bào

sừng người chứa receptor của insulin, trong suốt sự phát triển của tế bào receptor





làm tăng khả năng tăng sinh của tế bào. Hydrocorticone và các hormon khác cũng

ảnh hưởng đến kích thước quần thể tế bào, nếu thiếu kích thước của quần thể bị

ảnh hưởng.

- Ion canxi (Ca2+) ảnh hưởng tới sự biệt hóa và tăng trưởng của thế bào sừng,muốn điều chỉnh quá tr ình tăng sinh và phân tầng của tế bào sừng ta có thể thay

đổi nồng độ ion Ca2+ ngoại bào trong nuôi cấy mô invitro. Đây có thể coi là sự điều

chỉnh sinh lý b ình thường như trong cấu trúc biểu b ì, có sự chênh lệch nồng độ ion

Ca2+ rõ ràng giữa những tế bào của lớp đáy so với những tế bào ở lớp tr ên. Nồng

độ ion Ca2+ thấp thúc đẩy sự tăng sinh, nồng độ cao làm giảm sự biệt hóa của tế

bào sừng.

Trong nuôi cấy invitro, lượng tế bào tăng nhanh khi nồng độ Ca2+ khoảng

0,03 – 0,1mM. Trong môi trường DMEM, lượng tế bào tăng khi nồng độ Ca2+

khoảng 0,03 – 0,1mM.





III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨ U VÀ TRIỂN VỌNGHiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc rất phổ biến trong nhiều lĩnh

vực, đặc biệt là y sinh học đã điều trị được rất nhiều bệnh nguy hiểm (ví dụ như

chữa trị các bệnh liên quan đến tim mạch, thần kinh, ung thư, bỏng,…).

3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hàng loạt kỹ thuật tiên tiến trong điều trị bỏng như ghép da (ghép da sớm,

ghép da đồng loại, ghép da mảnh siêu nhỏ,…), siêu lọc máu liên tục, kỹ thuật nano,

nuôi cấy nguyên bào sợi, nuôi cấy nguyên bào sừng, nuôi cấy tế bào gốc, sử dụng

vạt da siêu mỏng có nối mạch vi phẫu,...

3.1.1. Việc nuôi cấy nguyên bào sợi, nguyên bào sừng biểu bì được thực hiện từ năm đầu thế kỷ XX, với việc sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau.

Dưới đây là một số môi trường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào sừng

- Môi trường có huyết thanh:

Huyết thanh động vật thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy như một

nguồn dinh dưỡng cho tế bào phát triển. Trong môi trường nuôi cấy, huyết thanh

hoạt động như một chất đệm pH; cung cấp hormon và các nhân tố tăng trưởng;

protein; chất dinh dưỡng; chất ức chế các protease;…cần cho sự tăng trưởng và

duy trì chức năng cho tế bào sau này.

Nồng độ huyết thanh thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào

sừng là 5%, 10%, 20%.

Tuy nhiên, huyết thanh không không phải là nguyên liệu tốt nhất để tạo nên

một môi trườ ng tối ưu cho sự tăng trưởng và biểu hiện chức năng của tế bào. Do ta

không thể xác định được nguồn gốc tự nhiên của huyết thanh; huyết thanh lại rất

dễ bị biến đổi thành phần và dễ bị nhiễm các tác nhân vi nấm, virus,…; một vài

nhân tố trong huyết thanh (như HDL, LDL,…) không bền khi bảo quản lâu dài ở

nhiệt độ thấp. Mặt khác huyết thanh còn kích thích sự biệt hóa của những tế bào





tiến tới trạng thái không phân bào nguyên nhiễm làm cho những tế bào này không

duy trì như một dòng tế bào bất tử [25].

- Feeder nguyên bào sợi:

Phương pháp này đầu tiên được mô tả bởi Rheinwald và Green (1975), dựatrên sự nuôi cấy đồng thời tế bào sừng với nguyên bào bị chiếu xạ. Nguyên bào sợi

chuột của dòng tế bào 3T3 lấy từ khối u của chuột nhắt bị chiếu xạ liều cao.

Nguyên bào sợi chuột được nuôi trong môi trường D’MEM (Dulbecco’s

Modified Eagle’s medium) có nồng độ glucose cao, bổ sung 10% FBS, Penicillin -

Streptomycin (100 UI/ml – 100 µg/ml), dung dịch đệm Bicarbonate sodium 1N với

một lượng phù hợp tế bào được chiếu xạ (mục đích để các tế bào này không tăngsinh nhưng vẫn tiết ra một số chất giúp cho sự tăng trưởng của tế bào sừng). Khi

những tế bào này tạo được 50% mật độ trong đĩa nuôi cấy th ì được sử dụng như

một giá thể trực tiếp cho cho việc nuôi cấy tế bào sừng.

Môi trường nuôi cấy tế bào sừng là hỗn hợp giữa môi trường D’MEM (có

nồng độ glucose cao) và môi trường Ham’s F12 (có bổ sung 10% FBS) với tỷ lệ là

3:1.

Với tiến bộ kỹ thuật mô hiện nay, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều loại màng

nhân tạo, bán nhân tạo bằng collagen, polymer,…để sử dụng như một lớp nâng đỡ,

tạo điều kiện tốt cho sự tăng trưởng cho tế bào sừng[18].

- Môi trường không huyết thanh:

Môi trường nuôi cấy không sử dụng huyết thanh và các lớp nâng đỡ đã khắc

phục được một số hạn chế của việc nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường có huyết

thanh hay lớp nâng đỡ.

Mặt khác, do sự thay đổi về cả chất lượng lẫn số lượng các thành phần cơ bản

(như các acid amin, vitamin, nguyên tố đa và vi lượng,…) nên cần phải bổ sung

vào môi trường các thành phần khác (như EGF, insulin, transferrin,

hydrocortisone, dịch trích tuyến yên bò BFE).





Tuy nhiên môi trường nuôi cấy này có những hạn chế như: số lượng lần cấy

chuyển sau khi nuôi sơ cấp trong môi trường này ít hơn so với môi trường có bổ

sung huyết thanh, việc bổ sung các chất cần cho sự tăng sinh của tế bào (như

BPE,…) cũng gặp khó khăn (như nguồn cung cấp hiếm, dễ bị nhiễm khuẩn, giáthành cao và đặt biệt là không xác định được nguồn gốc ).

Hiện nay tr ên thị trường có nhiều môi trường nuôi cấy chuyên biệt tế bào

sừng không bổ sung huyết thanh như môi trường MCDB 151, MCDB 153, MCDB

154, Epilife,… Trong đó, môi trường Epilife là môi trường cơ bản để nuôi cấy tế

bào sừng và những tế bào biểu b ì khác.

Trong môi trường Epilife, tế bào sừng tăng sinh mạnh, khoảng thời gian sốngdài và có thể tạo được 45 – 60 thế hệ [19].

3.1.2. Công nghệ sử dụng tế b ào gốc

Hiện nay, các sản phẩm thay thế da có chứa tế bào gốc không chỉ tạm thời

ngăn chặn sự mất nước của cơ thể và nhiễm trùng do vi khuẩn, mà còn đạt được

hiệu quả sửa chữa đạt yêu cầu. Giúp tối ưu quá trình chữa lành vết thương do bỏng

cũng như các yêu cầu. Trị liệu tế bào gốc có thể nâng cao chất lượng chữa lành vếtthương bỏng, làm giảm sự h ình thành các vết sẹo và thiết lập lại chức năng bình

thường của da và phần phụ của nó.

Các nguồn chính của các tế bào gốc có thể được sử dụng để sửa chữa và tái

sinh cho các tế bào da bị tổn thương là những tế bào gốc phôi (ESCs) và các tế bào

gốc trưởng thành.

Trong năm 2007, Yamanaka và các đồng nghiệp sản xuất thành công tế bào

gốc toàn năng từ nguyên bào sợi da người lớn, các tế bào soma của người khác và

có những đặc điểm tương tự như ESCs. Khuyến khích việc sử dụng tế bào gốc

trưởng thành, các tế bào gốc trung mô đặc biệt (MSC) đang được hiện thực hóa

trong điều trị bỏng. MSC có thể được phân lập từ tủy xương và các mô khác, chẳng





hạn như mô mỡ, máu dây rốn và tế bào da. Các tế bào gốc từ máu dây rốn có thể

biệt hóa thành keratinocytes, tế bào gốc-mỡ (ADSCs) có thể thúc đẩy sự phát triển

nguyên bào sợi da và tái biểu mô của vết thương da[1].

Hiện nay, có một số phương pháp để sử dụng tế bào gốc, bao gồm cả tiêmtreo tế bào (http://www.latimes.com), tấm di động hoặc da mô thiết kế.

3.1.3. Theo nghiên cứu mới nhất của các nh à khoa học thuộc Trung tâm điều trị bỏng, Đại học quốc gia Uta h (M ỹ) vừa ho àn thành thí nghiệm liệu pháp điều trị phun tế b ào gốc v ào v ị trí vết thương cục bộ của bệnh nhân.

Liệu pháp điều trị trên được tạo ra bằng cách kết hợp giữa tiểu cầu không có

khả năng làm đông máu ở bệnh nhân bỏng với tế bào gốc chứa canxi và thrombin.

Thí nghiệm cho thấy ngoài việc điều trị vết bỏng cục bộ, liệu pháp tr ên còn có

thể giúp cải thiện quá tr ình làm lành da được cấy ghép.

Liệu pháp điều trị phun tế bào gốc vào vết bỏng cục bộ của bệnh nhân không

những điều trị hiệu quả vết bỏng cục bộ, mà còn có ý ngh ĩa quan trọng ứng dụng

trong các loại h ình phẫu thuật cấy ghép khác[2].

3.1.4. Phương pháp trị liệu tế b ào gốc có l à một phương pháp tối ưu trong điều tr ị bỏng hay không ?

Mặt khác, sự bất ổn định trong điều kiện và môi trường nuôi cấy dẫn đến sự

suy thoái về cấu trúc và các mô. Cơ chế điều khiển quá tr ình lão hóa tế bào gốc vẫn

là một bí ẩn lớn đối với các nhà khoa học. Hiện nay còn rất nhiều vấn đề cần phải

giải quyết trước khi tế bào gốc được áp dụng rộng r ãi trong thực tế.

3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong việc điều trị bỏng diện rộng phổ biến hiện nay đang được áp dụng ở nhiều bệnh viện trong cả nước là kỹ thuật sử dụng nguồn da ghép tự thân nhưng rất

hạn chế, th ì phương pháp trị liệu tế bào là một giải pháp khả thi. Ở một vài bệnh

viện chuyên khoa bỏng đang áp dụng kỹ thuật tiên tiến như nuôi và cấy ghép





nguyên bào sợi, tế bào sừng,… trong điều trị tổn thương do bỏng (Viện bỏng Quốc

gia Việt Nam).

3.2.1. Công nghệ nuôi cấy tế b ào da hiện nay

Các tế bào da (tế bào sừng, nguyên bào sợi …) sau khi được tách từ mẫu da sẽ

được đưa vào môi trường nuôi cấy trên các đĩa nuôi cấy, sau một thời gian (khác

nhau tùy từng loại tế bào) từ một số tế bào ban đầu, các tế bào sẽ phát triển, nhân

lên và liên kết với nhau để tạo nên các “màng” tế bào nuôi cấy. Do sự liên kết giữa

các tế bào rất mong manh, dễ vỡ, dễ đứt rách, hơn nữa việc đưa các màng tế bào

này để ghép lên nền vết bỏng rất khó khăn, nên tỉ lệ thành công khi ghép các màng

nuôi cấy trên lâm sàng thường không cao. Các màng này rất dễ bị tiêu hủy donhiễm khuẩn và chất lượng liền sẹo cũng hạn chế. Mặt khác việc phối hợp giữa

nuôi cấy và lâm sàng cũng nhiều bất cập (ví dụ khi tế bào da có thể ghép được th ì

vết thương lại chưa đủ điều kiện để ghép, và ngược lại khi vết thương đủ điều kiện

để ghép th ì các tế bào chưa đủ tuổi hay mật độ cần thiết hoặc đã quá già để ghép).

Để khắc phục những nhược điểm tr ên hiện nay đã có những thay đổi lớn trong

công nghệ nuôi cấy tế bào da, đó là việc t ìm ra các giá đỡ để cho tế bào phát triển,nhân lên trên đó trong quá tr ình nuôi cấy. Thay v ì chỉ nuôi cấy các tế bào trong

môi trường nuôi cấy, trên đĩa nuôi cấy đơn thuần th ì người ta cấy các tế bào trên

một loại màng nền như một giá đỡ cho tế bào. Các giá đỡ này phải đảm bảo là có

thể sử dụng để đắp lên vết thương và cho phép các tế bào phát triển b ình thường

trên đó. Khi mật độ và tuổi của tế bào phù hợp ghép, người ta đưa cả tấm giá đỡ

này cùng với các tế bào trên đó để ghép lên vết thương, vết bỏng. Nhờ phát minh

này cùng với việc sử dụng các màng sinh học, các vật liệu che phủ vết thương tạm

thời để chuẩn bị nền ghép mà tỉ lệ thành công và giá thành điều trị đã có những

bước đột phá. Các giá đỡ được sử dụng là các màng collagen, một số màng tổng

hợp, bán tổng hợp sử dụng trong điều trị vết thương…





Các nhà khoa học đã thành công trong công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi da

đồng loại để điều trị vết thương, vết bỏng. Bằng việc sử dụng tấm TegadermR (một

loại điều trị vết thương thông thường) để làm giá đỡ cho tế bào đã tạo ra các tấm

nguyên bào sợi nuôi cấy có chất lượng tương đương sản phẩm tương tự của cáctrung tâm trên thế giới nhưng giá thành chỉ thấp bằng 1/4.

Một bước tiến trong công nghệ nuôi cấy, đó là công nghệ nuôi cấy tế bào

sừng da tự thân để điều trị bỏng nặng và các trường hợp chấn thương mất da lớn.

Không chỉ có các bước tiến trong công nghệ nuôi cấy, việc sử dụng các sản phẩm

nuôi cấy cũng có nhiều thay đổi. Thay v ì sử dụng đơn thuần các màng nguyên bào

sợi, tế bào sừng nuôi cấy ghép lên vết thương th ì ngày nay người ta đã kết hợp việcnuôi cấy tế bào sừng để tạo lớp biểu b ì lên chất nền trung b ì là lớp nguyên bào sợi

nuôi cấy – đó là công nghệ da nhân tạo do kết hợp lớp biểu b ì nuôi cấy với một

màng collagen, màng silicon hay một loại màng tổng hợp khác.

3.2.2. Công nghệ nuôi cấy nguyên bào sợi trong điều trị bỏng

Nguyên bào sợi được phóng

đại 400 lần.

Nguyên bào sợi là loại tế bào của trung b ì được sử dụng rộng r ãi nhất trong

nuôi cấy điều trị vết thương, vết bỏng. V ì tính sinh miễn dịch thải ghép thấp cho

nên có thể sử dụng nguyên bào sợi da đồng loại. Tác dụng của nguyên bào sợi nuôi

cấy là thúc đẩy thời gian liền vết thương bỏng nông (do nó cung cấp một số yếu tố

tăng trưởng như TGF-b, PDGF, KGF). Trên vết bỏng sâu, nó có tác dụng làm liền





vết bỏng hẹp, cải thiện chất lượng nền ghép cho việc ghép da hay ghép tế bào sừng

nuôi cấy, cải thiện chất lượng liền sẹo,…(do nguyên bào sợi tạo ra các thành phần

đệm gian bào làm nền cho quá tr ình biểu mô hóa và cung cấp các sợi laminin,

elastin, fibronetin để tế bào biểu mô bám và trượt trên đó giúp tăng nhanh quá tr ìnhbiểu mô hóa che phủ vết thương)

Kỹ thuật nuôi cấy nguyên bào sợi gồm các bước chính sau:

Bước 1: Chọn, sàng lọc người cho mẫu da

Mẫu da được lấy ở những người t ình nguyện, mạnh khỏe không mắc các bệnh

lây nhiễm qua đường máu và các bệnh mạn tính khác. Người càng trẻ càng tốt.

Những người cho mẫu da đều được xét nghiệm toàn bộ để loại trừ các bệnh lý nóitrên.

Bước 2: Lấy mẫu da và bảo quản mẫu da

Vùng dự kiến lấy mẫu da được vệ sinh sạch sẽ, sát trùng trước khi lấy. Mẫu

da lấy có toàn lớp biểu b ì, trung bì, hạ b ì, kích thước khoảng 1 - 1,5cm2, thường lấy

ở trong đùi sát nếp bẹn. Sau khi lấy mẫu da được bảo quản trong ống nghiệm chứa

5ml dung dịch DMEM (Dulbecos Modiffied Eage Media) chứa 1% kháng sinh,

bảo quản ở 40C trong vòng 8h, sau đó chuyển mẫu da về labô nuôi cấy.

Bước 3: X ử lý mẫu da

Các mẫu da được cắt lọc hết mỡ sau đó ngâm vào cồn 70% thể tích trong

vòng 30 giây, lấy ra rửa sạch 3 lần bằng PBS rồi cắt nhỏ thành các mẩu da kích

thước 0,1mm.

Bước 4: C ấy mẫu da

Các mẫu da được cấy trong chai nuôi cấy với mật độ một mẩu da 0,1mm cho

diện tích 2,5cm2. Cho môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi vào chai rồi đặt vào tủ

ấm 370C với 95% thể tích khí trời và 5% thể tích CO2. Tiến hành bổ sung môi

trường nuôi cấy sau 24h và sau 48h tiếp theo. Thay môi trường sau 4 ngày, theo





dõi tế bào mọc và di cư ra khỏi mẫu da. Khi nguyên bào sợi phát triển và nhân

lên đạt > 50% diện tích che phủ đáy chai nuôi cấy th ì tiến hành tách tế bào.

Bước 5: Tách nguyên bào sợi

Lấy bỏ mẫu da và rửa tế bào PBS (phosphate Buffered Salines), thêm dungdịch có 0,05% trypsin và 0,35mM EDTA trong PBS rồi đặt chai nuôi cấy vào tủ

ấm 370 trong 5 phút. Sau đó kiểm tra mức độ tế bào tách khỏi đáy chai, khi các tế

bào co tròn thì cho thêm môi trường nuôi cấy vào và lấy hỗn dịch nuôi cấy đó tiến

hành ly tâm với tốc độ 1200v/phút, sau đó bỏ dịch nổi và thu lấy tế bào. Các tế bào

này được đưa vào chai nuôi cấy với mật độ 5 × 103 tế bào/cm2.

Bước 6: Nhân r ộng nguyên bào sợi Sau một thời gian các tế bào nhân lên trong đĩa nuôi cấy sẽ được cấy chuyển

sang các chai khác với mật độ 5000 tế bào/cm2, quy trình cấy chuyển cần theo dõi

chặt chẽ t ình trạng ô nhiễm, mật độ tế bào, pH môi trường. Các tế bào nuôi cấy và

nhân rộng trong môi trường nuôi cấy và đặt trong tủ ấm CO2, cần thay môi trường

nuôi cấy cho tế bào sau 3 - 4 ngày.

Bước 7: Thu hoạch nguyên bào sợi

Lựa chọn thế hệ tế bào từ P5-P10, các tế bào đó phải sống và phát triển b ình

thường. Kiểm tra vi khuẩn và nấm trước khi thu hoạch. Tiến hành thu tế bào từ

chai nuôi cấy bằng cách dùng trypsin và ly tâm.

Bước 8: Chuẩn bị giá đỡ tế bào

Giá đỡ tế bào có thể là collagen, các màng sinh học hay tổng hợp. Tại viện

bỏng sử dụng tấm vật liệu điều trị vết thương là TegadermR. Giá đỡ được cắt tr òn

có diện tích đĩa nuôi cấy (75cm2) khử trùng giá đỡ và đặt vào đĩa nuôi cấy, sau đó

cho môi trường nuôi cấy vào sao cho láng ngập đều giá đỡ.

Bước 9: C ấy tế bào lên giá đỡ





Đếm tế bào và tính mật độ tế bào rồi dàn đều hỗn dịch tế bào vừa thu được

lên giá đỡ đã chuẩn bị. Đặt đĩa nuôi cấy có giá đỡ và tế bào vào tủ nuôi cấy 370C

có 5% CO2 trong khoảng 1h rồi bổ sung môi trường nuôi cấy cho đủ 5ml.

Bước 10: Theo dõi và đánh giá tấm tế bào nuôi cấy

Các nguyên bào sợi sẽ nhân lên và phát triển trên giá đỡ trong môi trường

nuôi cấy. Theo dõi mật độ tế bào đủ lớn và không có tình trạng nhiễm khuẩn,

nhiễm nấm th ì tiến hành ghép tấm tế bào nuôi cấy đó lên vết thương, vết bỏng đã

được chuẩn bị.

Thông thường thời gian từ khi lấy mẫu da đến khi có thể ghép tấm nguyên

bào sợi nuôi cấy lên vết bỏng khoảng 2 tuần[7].





3.2.3. Công nghệ nuôi cấy tế b ào sừng da tự thân trong điều trị bỏng Tế bào sừng cũng là loại tế bào được sử dụng nhiều trong điều trị vết thương,

vết bỏng sâu diện rộng (do thiếu nguồn da ghép tự thân) và phục vụ nhiều nghiên

cứu khác. Tế bào sừng là tế bào thuộc biểu b ì có tính sinh miễn dịch thải ghép chonên phải sử dụng tế bào của da tự thân.

Hiện nay, có thể thu nhận tế bào sừng từ nhiều nguồn tế bào khác nhau (ví dụ

từ mảnh da, vùng tế bào ở chân lông, vùng phồng của nang lông,…).

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào sừng biểu b ì (một số bước có thể thay đổi tùy thuộc

vào phương pháp và môi trường nuôi tế bào sừng):

Bước 1: Chọn, sàng lọc người cho mẫu da

Bước 2: Lấy mẫu da và bảo quản mẫu da

Bước 3: Xử lý mẫu da

Bước 4: Tách biểu b ì đơn

Một một bệnh nhân được điều trị bằng ghép tế bào sừng tự thân nuôi cấy.





Một số phương pháp phổ biến tách biểu b ì ra khỏi trung b ì và thu tế bào biểu

bì đơn:

+ Mẫu sinh thiết da khoảng 5cm2 rửa trong dung dịch muối và ủ bằng Dispase

ở 370C trong 30 – 40 phút, sau đó chuyển biểu b ì vào dung dịch Trypsin và ủ ở 370C trong 10 phút [9].

+ Mẫu da đặt trong dung dịch Dipase, ủ ở 2 – 80C trong 18h. Tách biểu b ì ra

khỏi trung b ì cho vào ống ly tâm chứa 2 ml Trypsin-EDTA (0,25% - 0,02 mM) ủ

ở 370C trong 10 - 12 phút.

+ Ủ mẫu da trong dung dịch Trypsin – EDTA (0,25% - 0,02%) tỷ lệ 1:4 ở

4

0

C trong khoảng 16 – 20h [10].Bước 5: Nhân rộng tế bào sừng biểu b ì.

Bằng cách nuôi tế bào sừng trong môi trường. Ban đầu môi trường được sử

dụng để nuôi cấy sơ cấp và thứ cấp tế bào sừng tr ên lớp nâng đỡ nguyên bào sợi có

bổ sung huyết thanh động vật. Trong hệ thống này, tế bào sừng có thể được cấy

chuyển cho đến khi chúng được 20 - 50 thế hệ [4].

Tuy nhiên, hiện nay đã có những cải tiến để khắc phục một số hạn chế của các

môi trường nuôi cấy đã sử dụng trước đó, như sử dụng môi trường nuôi cấy không

huyết thanh hoặc có bổ sung nhân tố từ thực vật.

Ngoài ra có thể còn một số bước khác tùy thuộc vào môi trường nuôi tế bào

sừng, như: chuẩn bị lớp nâng đỡ nguyên bào sợi, cấy tế bào lên lớp nâng đỡ (hay

giá đỡ), theo dõi và đánh giá tấm tế bào nuôi cấy.

Công nghệ nuôi cấy tế bào sừng khá phức tạp, một trong những ứng dụng

quan trọng của nó là góp phần điều trị để cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện

tích lớn thiếu nguồn da ghép tự thân.

Tuy nhiên, trước đây các tế bào biểu mô được nuôi cấy trong môi trường có

huyết thanh, cần có chi phí rất cao, quy tr ình nuôi cấy phức tạp. V ì thế, các bác sĩ

Viện bỏng Quốc gia đã thử nghiệm phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào sừng





trong môi trường không huyết thanh với mục tiêu tạo tấm tế bào sừng tự thân nuôi

cấy để điều trị bỏng. Đây là biện pháp đơn giản, rẻ tiền hơn rất nhiều so với

phương pháp khác.

3.2.4. Sử dụng tế b ào gốc trong công nghệ nuôi cấy tế b ào ứng dụng trong điều tr ị bỏng

Tế bào gốc (stem cell) đã được nhắc đến nhiều trong những năm gần đây.

Công nghệ tế bào gốc ngày càng có nhiều ứng dụng trong y học, như tạo ra được

các vật liệu che phủ, vật liệu thay thế da khi da bị tổn thương lớn. Việc sử dụng tế

bào gốc từ dây rốn trẻ sơ sinh (bản quyền của PGS.TS. Phan Toàn Thắng và cộng

sự - Đại học quốc gia Singapore, là người đầu tiên trên thế giới t ìm ra công nghệtách tế bào gốc từ cuống dây rốn) đã mở ra một triển vọng to lớn về ứng dụng của

công nghệ nuôi cấy tế bào. Khác với các tế bào đã nói ở tr ên là những tế bào đã

biệt hóa cao, tế bào gốc (mầm) dây rốn trẻ sơ sinh là những tế bào biệt hóa thấp,

khả năng sinh sản phát triển mạnh, thời gian nuôi cấy nhanh, có thể chủ động trong

việc thu nhận sản phẩm ở nhiều giai đoạn, nhiều thời kỳ khác nhau. Do đó khả

năng thành công sẽ cao hơn khi áp dụng tr ên lâm sàng. Từ các tế bào gốc dây rốn

trẻ sơ sinh người ta có thể tạo ra các sản phẩm để điều trị vết bỏng (tế bào sừng,

nguyên bào sợi),… Hiện nay, Viện bỏng quốc gia đang hợp tác với PGS.TS

Nguyễn Toàn Thắng và các đồng nghiệp Singapore để triển khai kỹ thuật này.

3.3. Triển vọng ứng dụng của tế bào gốc Hiện nay trên thế giới đang có nhiều công trình nghiên cứu về tìm kiếm, tạo

ra tế bào gốc từ các nguồn tế bào tối ưu và khả năng ứng dụng của tế bào gốc trong

điều trị và thẩm mỹ. Liệu pháp điều trị tế bào gốc là một công cụ hấp dẫn trị liệu

để điều trị nhiều bệnh nan y trong tương lai.

Ở Việt Nam, hiện đã có 4 ngân hàng tế bào gốc được thành lập thuộc các đơn

vị: Bệnh viện Quân y 103, Công ty cổ phần Mekophar, Công ty cổ phần Ngọc





Tâm, Bệnh viện Truyền máu và Huyết học TP. Hồ Chí Minh. Ngân hàng tế bào

gốc MekoStem mới được thành lập và là ngân hàng đầu tiên trên thế giới lưu trữ

hai loại tế bào gốc cùng một lúc, đó là tế bào gốc từ máu và màng dây rốn. Ngân

hàng cung cấp các dịch vụ về thu thập, phân tích, xử lý tách tế b ào, bảo quản cácloại tế bào gốc từ máu và màng dây rốn cho cộng đồng và cá nhân.

Tiềm năng phát triển công nghệ tế bào gốc rất lớn. Hy vọng trong những năm

sắp tới công nghệ tế bào gốc được ứng dụng phổ biến hơn nữa.





KẾT LUẬN

Thu nhận được nguyên bảo sợi, tế bào sừng, tế bào gốc da từ tế bào da.Việc ứng dụng công nghệ tế bào gốc trong điều trị bỏng cho tỷ lệ thành công

cao.





PHỤ LỤC

[1] http://www.medscape.com/

[2] http://www.thaythuocvietnam.vn/

[3] Hồ Thị Thanh Hồng (2005), Tách và nuôi biểu b ì da quy đầu người, Khóa

luận tốt nghiệp – Đại học Khoa học Tự nhiên.

[4] Nguyễn Phan Xuân Lý (2006), Thiết lập quy tr ình nuôi nguyên bào sợi từ

da quy đầu người, Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

[5] Phan Kim Ngọc (2002), Giáo tr ình thực tập cơ sở Công nghệ sinh học

động vật. NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

[6] Đỗ Lưu Hoài Niệm (2003), Thiết lập quy tr ình tách và nuôi cấy tế bào dangười, Khóa luận cử nhân khoa học – Đại học Khoa học Tự nhiên.

[9] Abd el-A iz Hanafy A.Ahmad, M.D., Mostafa Hemieda, M.D.; Hassan A

Badran, M.D.; F.R.C.S and Ikram I.Seif, MD – Culture allogenic keratinocyte

grafts in the treatment of burn: Preliminary Report – The Department of Plastic and

Reconstructive surgery, Faculty of medicine, Ain Shams University.

[10] Bruce Wilson – DDW – Epidermal Grow Facture Enemas for Left –Side Ulcerative Colitis – ATLANTA, GA – May 21, 2001.

[11] Alfredo Gragnani; Jeffrey R. Morgan; Lydia Masako Ferreira (2001)

Experimental model of culture kerratinocyte – Animals of Burns and Fire Disaster

– vol.XIV – n.2 – USA and Brazil.

[18] Mr Jerry G Johnson – Essentials of human anatomy and physiology,

Chapter 6 – Skin and the integmentary.

[19] Taylor JR, Lockwood AP, Taylor AJ – The prepuce: specialized mucosa

of the penis and its loss to circumcision – British Journal of Urology (1996), 77,

291 – 295.

[20] National Organization of Circumcision – Information Resource Centers.





[25] Hume WJ. Keratinocyte proliferative hierarchies confer protective

mechanisms in surface epithelia. Br J Dermatol. 1985; 112 : 493 – 502. [PubMed]

[31] Morris RJ, Fischer SM, Slaga TJ. Evidence that a slowly cycling

subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res.1986; 46 : 3061 – 3066. [PubMed].





TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. PGS.TS. Khuất Hữu Thanh. 2008. Sinh học tế bào. Nhà xuất bản khoa

học kỹ thuật.

2. Tạp chí hoạt động khoa học

M ột số trang web:

http://fbm.com.vn/ http://www.medscape.com/

http://tailieu.vn/

http://www.thaythuocvietnam.vn /

http://thuviensinhhoc.com/

http://sinhhocvietnam.com/

http://vietbao.vn/ http://vi.wikipedia.org/wiki/Da /

sinh hoc te bao

Documents