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22/09/2011

1

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Reacciones enzimáticas

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa



�aturaleza Industria química

Síntesis de compuestos orgánicos



La naturaleza de las enzimas

1) La reacción química se lleva a cabo

bajo condiciones suaves

2) Acción específica de acuerdo a la

clase de enzima

3) Tasas de reacción muy rápidas

4) Numerosas enzimas para diferentes

objetivosEnzymes at work (www.novozymes.com)

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2



Clase Enzimas Industriales

1. Oxidoreductasas Peroxidasas, catalasas, glucosa

oxidasas, lacasas

2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosil-

transferasas

3. Hidrolasas Amilasas, celulasas, lipasas,

pectinasas, proteasas, pululanasas

4. Liasas Pectato-liasas, αααα-acetolactato

decarboxilasas

5. Isomerasas Glucosa isomerasa

6. Ligasas �o son usadas actualmente

Enzymes at work (www.novozymes.com)

Enzimas típicas usadas en procesos industriales



Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos



Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos

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3



Enzimas técnicas (Industrias: Detergentes, almidón, textil, curtidos, pulpa y

papel, y cosméticos

Enzimas en la industria alimentaria: láctea, cerveza, vinos y jugos, grasas y

aceites, y panificación.

Enzimas en alimentación animal

Mercado mundial de enzimas industriales($1,500,000 USD en el año 2000)

(McCoy, 2000)

65 %

10 %

25 %





Puntos principales de la aplicación comercial de

un catalizador enzimático

• Velocidad de reacción

(actividad catalítica)

• Extensión de la reacción

(constante de equilibrio)

• Duración de la actividad

(estabilidad)

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Energía de activación



Diseño de biorreactores

reactorroi VvSSF =− )(

ννννr = velocidad de reacción

F, S0

F, Si

donde:

Balance de materia



Leyes fundamentales de la cinética

• Velocidad de la reacción

• Orden de la reacción

---- = v = k

---- = v = k CA CB

Orden uno

Orden cero

Orden dos

v0

[P]

t

[A]0

d[P]

dt

---- = v = k CAd[P]

dt

d[P]

dt

A P

A P

A + B P

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5



Consideraciones al definir el orden de una reacción

• No se puede decir que todas las

reacciones poseen un cierto orden

(Reacciones complejas)

• No se debe intentar deducir el orden de

una reacción de su ecuación

estequiométrica

(Depende del mecanismo de la reacción)



Sitio activo y formación del complejo: enzima-sustrato



Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato

Efecto de proximidad y efecto de orientación

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Modelo de ajuste inducido

Hexoquinasa



ES

k 1

k -1

k cat

E

S

E

P

E + S

k 1

k -1

ES

k cat

E + P

Modelo llave-cerradura

E



Los experimentos cinéticos revelan propiedades

enzimáticas

Cinética química

• Los experimentos examinan la cantidad de producto

(P) formado por unidad de tiempo (∆∆∆∆[P] / ∆∆∆∆t)

• Velocidad (v) – la tasa de una reacción

(varía con la concentración de reactante)

• Constante de la tasa (k) – indica la velocidad o

eficiencia de una reacción

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7



Cinética enzimática

• Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molécula de

substrato (la enzima esta saturada con el substrato)

• Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E],

y la reacción es pseudo-primer orden

• Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado

cuando el substrato específico se enlaza al sitio activo de la

enzima

E + S ES E + P



Velocidad inicial (vo)

• La velocidad al inicio de una reacción catalizada

enzimáticamente es

vo (velocidad inicial)

• k1 y k-1 representan una rápida asociación

/disociación no covalente de substrato del sitio

activo de la enzima

• kcat = constante de la tasa para formación de

producto de ES

E + S ES E + P k1

kcat

k-1



Curva de progreso para una reacción catalizada

enzimáticamente

• La velocidad inicial (vo) es la

pendiente de la porción lineal

inicial de la curva

• La tasa de la reacción se duplica

cuando se usa el doble de

enzima

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Leonor Michaelis

1875-1949

Maud Menten

1879-1960



Consideraciones de equilibrio rápido(Ecuación de Henri-Michaelis-Menten)

E + Sk 1

k -1ES

k cat E + P

[ ] [ ] [ ]ESEE t +=

[ ]ESkv cat=

[ ][ ]

[ ] [ ]ESE

ESk

E

v cat

t +=

[ ][ ][ ]

[ ] [ ] [ ]EK

SES

ES

SEK

S

S =∴= ,

[ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]EK

SE

EK

Sk

E

v

S

S

cat

t +=

[ ][ ]SK

S

V

v

Smax +=

1. Reacciones involucradas

2. Balance de masa

3. Velocidad limitante

4. Dividir por [E]t

5. Expresión de equilibrio

6. Sustituir en términos de [E]

7. Donde Vmax = kcat

[E]t



JBS HaldaneBriggs

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Consideraciones de estado estacionario(Ecuación de Briggs-Haldane)

E + S

k 1

k -1ES

k catE + P

[ ] [ ] [ ] ( ) [ ]ESkkSEkdt

ESdcat ⋅+−⋅= −11

[ ]0=

dt

ESd

[ ] [ ][ ] M

cat Kk

kk

ES

SE=

+=

⋅ −

1

1

[ ]ESkv cat=

[ ][ ]

[ ] [ ]ESE

ESk

E

v cat

t +=

[ ][ ]SK

S

V

v

M +=

max


2. Balance de masa

3. En estado estacionario

4. Constante de Michaelis

6. Dividir por [E]t

8. Donde Vmax = kcat [E]t


[ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]EK

SE

EK

S

Ek

v

M

M

tcat +=

7. Sustituyendo [ES]



νννν

[S]

Vmax

KM

Vmax

2

νννν = Vmax [S]

KM + [S]

Cinética de Michaelis-Menten



La ecuación de Michaelis-Menten

• La Velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima está

saturada con el substrato (alta [S])

• A altas [S] la tasa de reacción es independiente de [S] (orden

cero con respecto a S)

• A bajas [S] la reacción es de primer orden con respecto a S

• La forma de una curva vo versus [S] es una hipérbola

rectangular, indicando saturación del sitio activo de la enzima

conforme [S] se incrementa

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Gráficas de velocidad inicial (vo) versus [S]

(a) Cada punto vo vs [S] se obtiene

de un experimento cinético

(b) La constante de Michaelis (KM)

iguala la concentración de

substrato necesario para

alcanzar ½ de la velocidad

máxima



El significado de KM

• KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax

• KM ≅ k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociación

enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1

• Entre más bajo sea el valor de KM, más ajustado

será el enlace del substrato

• KM puede ser una medida de la afinidad de E for S



KM y concentraciones de substrato fisiológicas

• Los valores de KM para las

enzimas son típicamente

arriba de [S], tal que las

tasas enzimáticas son

sensibles a pequeños

cambios en [S]

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• La constante catalítica (kcat) – constante de la tasa de orden uno

para la conversión de complejo ES a E + P

• kcat es más fácilmente medible cuando la enzima esta saturada con

S

• La relación kcat /KM , llamada también coeficiente de

especificidad, es una constante de segundo orden para

E + S E + P

a bajas concentraciones de [S]

Las constantes cinéticas indican la actividad

enzimática y la especificidad



Significados de kcat y kcat/KM



Ejemplos de constantes catalíticas

Enzyme kcat(s-1)

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Valores of kcat/KM

• kcat/KM puede aproximar la tasa de

encuentro de dos moléculas no cargadas

en solución (108 to 109 M-1s-1)

• kcat/KM es también una medida de la

especificidad de la enzima por diferentes

substratos (constante de especificidad)

• Aceleración de la tasa = kcat/KM





Cálculo de KM y Vmax

La gráfica doble-

recíproca

Lineweaver-Burk es

una transformación

lineal de la gráfica de

Michaelis-Menten

(1/vo versus 1/[S])

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[ ]tf EkV 2max = [ ]tEkVb 1max −=

1

12

k

kkK

Sm−+

=2

12

−

−+=

k

kkK

pm

Donde:

Reacciones reversibles

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]PEESSEK

K

K

K

+←

→

←

→+

−− 2

2

1

1

[ ] [ ]

[ ] [ ]PS

P

b

S

f

neta

K

P

K

S

K

PV

K

SV

v

++

−

=1

maxmax

Glucosa Isomerasa

Consideración de estado estacionario



[ ][ ] eq

eq

eq

Sb

PfK

S

P

KV

KV==

max

maxRelación de Haldane0=netav

En el equilibrio

Borges da Silva y col., 2006



Inhibición por substrato(Consideración de equilibrio rápido)

E + S ESk cat

E + P

[ ] [ ] [ ]+[ΕS2]ESEE t+=

[ ]ESkv cat=

[ ][ ]

[ ] [ ]ESE

ESk

E

v cat

t +=

[ ][ ][ ]ES

SEKS= ,

[ ]

[ ][ ]

[ ] [ ]E

EK

Sk

E

v

[ ]EK

S

S

S

cat

t +=

[ ]SK

[ ]SV

v

Smax +=


2. Balance de masa


4. Dividir por [E]t

5. Expresiones de equilibrio

6. Sustituir en términos de [E]

7. Donde Vmax = kcat [E]t

+S

ES2

KS

KI

+ [ES2]

[ ][ ][ ]ES2

SESK I

=

[ ]EK

S

S

+ [ ]2

[ ]2S+KI

KI

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Inhibición por substrato

0.0000

5.0000

10.0000

15.0000

20.0000

25.0000

0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06

[S] nM

V n

mol/l*m

in

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05

1/[S]

1/v

[ ] [ ]SKVVSV

K

v I

M

maxmaxmax

1111++=

-1/KM

1/Vmax

KM/Vmax

1/V

1/[S]

[ ] iM KKS =max

[ ]

[ ] [ ]i

MK

SSK

SVv

2

max

++

=

[ ] maxmax

111

VSV

K

v

M +=

KI se calcula de:

[S]max



Los inhibidores de enzimas son importantes por varias

razones

Inhibición enzimática

1) Pueden ser usados para obtener información acerca de la forma del sitio

activo de la enzima y los residuos de amino ácidos en el sitio activo

2) Pueden ser usados para obtener información acerca del mecanismo químico

3) Pueden ser usados para obtener información acerca de la regulación o control

de una vía metabólica

4) Pueden ser muy importantes en el diseño de medicamentos



Sistemas de inhibición simple

• Inhibición competitiva

• inhibición no competitiva

• Inhibición acompetitiva

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ES

KS k p

E

S

E

P

EI

I

KiE + S

KS

ES

k p

E + P

+

I

Ki

EI

Modelo de inhibición competitiva

[ ][ ] [ ]SK

IK

S

V

v

i

S

max +

+

=

1

Consideración de equilibrio rápido

E



1/[S]

1/v0

-1/KM

1/Vmax

Incremento de

[I]

Inhibición competitiva

[I]-KI

Pend.

KM aumenta

Vmax no cambia



Ki

I

S

E+PES

Ki

KS

KS

E

ESIEI

Modelo de inhibición no competitiva

E + S ES E+PKS

EI + S ESI

KS

+

IKi Ki

+

I[ ]

[ ][ ]SK

S

K

I

V

v

S

i

max +=

+1


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1/[S]

1/v0

-1/KM

Inhibición no competitiva

Incremento de

[I]

1/Vmax

[I]-KI

Inter.

KM no cambia

Vmax disminuye



Modelo de inhibición acompetitiva

E + S

Ki

E + P

E S ES

ESI

+

I+

KS

ES E + P

ESI

Ki

KS

kcat

kcat

[ ]

[ ]

[ ][ ]S

K

I

K

S

K

I

V

v

i

m

i

max +

+

=

+ 11




1/[S]

1/v0

Incremento de

[I]

-1/KM

1/Vmax

Inhibición acompetitiva

[I]-KI

Inter.

KM disminuye

Vmax disminuye

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Equilibrio rápido en sistemas bi y tri-reactantes

1. La aproximación de equilibrio rápido es útil y válida

para los sistemas de enlace aleatorio

2. La mayoría de las enzimas que catalizan secuencias de reacciones

ordenadas se prefiere la aproximación de estado estacionario

E + A + B EAB E + P

B = Sustrato

A = Cosustrato, coenzima o coactivador

�otas:

donde:

E = Enzima



[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ]BABA

BA

max

KK

BA

K

B

K

A

KK

BA

V

v

⋅⋅

+++

⋅⋅

=

α

α

1

Sistemas bi-reactantes aleatorios

E + B EB

+

A+

A

EA + B EAB E + P

KB

KA

αααα KB

αααα KA

kp




Sistemas bi-reactantes ordenados

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]BAA

BA

max

KK

BA

K

A

KK

BA

V

v

⋅++

⋅

=1

E + A EA + B EAB E + P


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Sistemas tri-reactantes aleatorios

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]CBACBCABACBA

CBA

max

KKK

CBA

KK

CB

KK

CA

KK

BA

K

C

K

B

K

A

KKK

CBA

V

v

⋅⋅⋅⋅⋅

+⋅⋅

+⋅⋅

+⋅⋅

++++

⋅⋅⋅⋅⋅

=

γβααβγ

γβα

1


EABEABC

EAEAC

EB

EEC

E + P + Q + R

+ C

KC

+ C

ββββ KC

+ C

αααα ββββ KC

EBC+ C

αααα KC



Sistemas tri-reactantes ordenados

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]CBABAA

CBA

max

KKK

CBA

KK

BA

K

A

KKK

CBA

V

v

⋅⋅+

⋅++

⋅⋅

=1

(EABC EPQR)kp

KA KB KC

E EA EAB

KP KQ KR

EQR ER E


Sistema Ter Ter ordenado



Multisitios de enlace de sustrato

Sitios de enlace no cooperativos

[ ] [ ]

[ ] n

S

n

SS

max

K

S

K

S

K

S

V

v

+

+

=

−

1

1

1

[ ][ ]SK

S

V

v

Smax +=

Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n moléculas de enzina de un

sitio sencillo de enlace, producen la misma curva de velocidad de una

molécula de n sitios de enlace

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[S]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

v

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Enzimas alostéricas

Comparación de curvas de velocidad.

(a) Respuesta hiperbólica, (b) respuesta sigmoidal

(a)

(b)

Enzima alostérica




Sitios de enlace cooperativos(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)

E + S ES E + P

+

S

+

S

SE + S SES SE + P

ES + P

P + E

KS

αααα KS

KS

kp

kpkp

αααα KS

Ejemplo: Enzima con dos sitios de enlace



[ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ]423

4

32

3

2

2

423

4

32

3

2

2

4641

33

SSSS

SSSS

max

cKba

S

bKa

S

aK

S

K

S

cKba

S

bKa

S

aK

S

K

S

V

v

++++

+++

=


Vmax = 4 kp [E]tdonde:

Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace


Sitios de enlace cooperativos(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)

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[ ][ ]nn

max SK

S

V

v

+=

'

Si la cooperatividad de los sitios en el enlace del sustrato

es muy marcada

Ecuación simplificada para enzimas alostéricas

(Ecuación de Hill)

n = número de sitios de enlace de sustrato por molécula de enzima

K’ = Constante que involucra los factores de interacción y a la constante

de disociación intínseca

Donde:

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