cinética enzimática e inhibición - dipa.unison.mx · cinética enzimática e inhibición dr....

82
Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Upload: buixuyen

Post on 18-Nov-2018

272 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Cinética Enzimática e Inhibición

Dr. José Luis Cárdenas LópezEnzimas de Productos Marinos

Semestre 2014-1

Page 2: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

¿Qué medimos en una rx enzimática?

E + S ES E+P

enzimática?

Page 3: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

[Producto] vs tiempo

Page 4: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

O… desaparición de reactante

Page 5: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

El steady state (eq. dinámico)E + S ES E+P

Page 6: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Equilibrio dinámico

0][][ =−=

dt

ESd

dt

ESd

Page 7: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

En términos de tiempo…

Page 8: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Usando el enfoque de steady state

][][ ESdESd

E+ S ES E+Pk1

k-1

k2

0][][ =−=

dt

ESd

dt

ESd

0=[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)

Page 9: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Requisitos:

1) Cantidades catalíticas de E ( [S]>>[E] )

2) Solo la velocidad inicial (t casi 0), por lo

que P es casi nulo, k-2 es despreciable

3) Steady state (equilibrio dinámico)

Page 10: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

0 =[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)

ET= [E]+[ES]

[E]=ET-[ES]

0 =[ET-[ES]][S]k1 -[ES](k-1+k2)

[ET-[ES]][S]k1 =[ES](k-1+k2)

Page 11: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

ET [S]k1 -[ES][S]k1 =[ES](k-1+k2)

ET [S]k1 =[ES](k-1+k2)+ [ES][S]k1

E [S]k =[ES](k +k +[S]k )ET [S]k1 =[ES](k-1+k2+[S]k1)

ET [S]k1 =[ES]

(k-1+k2+k1[S])

Page 12: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

])[(

][][

121

1

Skkk

kSEES T

++=

][][

21 kk

SEES T

++

=− ][)(

1

21 Sk

kk+

+−

][)(

][][

1

21

22

Sk

kk

SEkESk T

++

=−

Page 13: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

][)(

][][

1

21

22

Sk

kk

SEkESk T

++

=−

k2 ET= Vmax

k [ES]= vk2[ES]= v

][

]max[

SKm

SVv

+=

1

21

k

kkKm

+= −

Page 14: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

][

]max[

SKm

SVv

+=

ecuación Henri -Michaelis- Menten

1][

max

+=

S

Km

Vv

1][

1

max +=

S

KmV

v

Page 15: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Victor Henri , francés de padres rusos(6 Junio 1872 – 21 Junio 1940)

1903

Page 16: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Leonor Michaelis , alemán(Enero 16, 1875 – Octubre 8, 1949)

Maud Leonora Menten , canadiense (Marzo 20, 1879 – Julio 26, 1960)

Biochemische Zeitschrift (1913;49:333–369)

Page 17: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1
Page 18: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1
Page 19: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Michaelis-MentenV

eloc

idad

(mm

ol/m

l/seg

)

60

80

100 Velocidad maxima (Vmax)

[Substrato] mmol/ml

0 50 100 150 200 250

Vel

ocid

ad(m

mol

/ml/s

eg)

0

20

40

Km=1/2 Vmax

Page 20: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Transformación de Lineweaver Burk

][

]max[

SKm

SVv

+=

Invirtiendo:Invirtiendo:

max

1

][

1*

max

1

VSV

Km

v+=

Page 21: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Lineweaver-Burk

1/V

eloc

idad

(m

mol

/ml/s

ec)

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

1/Vmax

1/[Substrato] mmol/ml

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

1/V

eloc

idad

(m

mol

/ml/s

ec)

0.1

0.2

-1/Km

1/Vmax

Page 22: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Gráfica Eddie Hoffste

][

]max[

SKm

SVv

+=

]max[])[( SVvSKm =+ ]max[])[( SVvSKm =+

][max

]max[][

S

vKmVv

KmvSVSv

−=

−=

Page 23: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Vmax1

Vmax2-Km1

2 enzimas?

Vo/[S]o

Vo-Km2

Page 24: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Parámetros importantes

• Vmax= velocidad máxima• Km= Constante de Michaelis Menten

(afinidad con el sustrato)• Vmax/Km=eficiencia fisiológica• Vmax/Km=eficiencia fisiológica• Turnover number (o kcat)= “numero de

recambio” es la cantidad en mol de sustrato (S) que seran convertidos a producto (P) por segundo

• Velocidad = conc de enzima (inicio de la rx)

Page 25: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Molecularidad

• Cúantas moléculas hay en ambos lados de la reacción

• A� P 1 reactante, 1 producto (UNI-UNI)• A+B� P BI-UNI• A+B� P BI-UNI• A+B+C� P+Q TRI-BI • Etc.

Page 26: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Velocidad (Tasa)

• Cantidad (en concentración en un momento dado)

• A+B � 2P

dt

Bd

dt

Adv

][][ −≅−≅

dt

Pdv

][≅

Desaparición de reactivo

aparición de producto

En: concentración/tiempo = M seg -1

Page 27: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Orden de la reacciónMichaelis-Menten

Vel

ocid

ad(m

mol

/ml/s

eg)

60

80

100 Orden “cero”

[Substrato] mmol/ml

0 50 100 150 200 250

Vel

ocid

ad(m

mol

/ml/s

eg)

0

20

40

60

1er orden

Orden mixto

Page 28: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Orden de la reacción

• Relación entre velocidad y concentración• A+B� P

nAv ][∝ nAv ][∝mBv ][∝

mn BAv ][][∝mn BAkv ][][= k= constante de la tasa (rate constant)

Representa la proporcionalidad

Page 29: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Orden de la reacción

• Indican la relación de la velocidad de aparición de producto o desaparición de reactantes y las concentraciones de reactantes a un tiempo determinadoreactantes a un tiempo determinado

• Integrando ecuaciones diferenciales se llega a ecuaciones que nos pueden decir la relación a cualquier tiempo de la reacción

Page 30: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Orden 0

• La aparición de producto o desaparición de reactantes (según se mida la actividad) es independiente de la [reactantes]

dPdAPA

k

→dt

dPk

dt

dA ==−

Page 31: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Gráficamente

[pro

du

cto

] (M

)

Tiempo (seg)

Pendiente = k = 0.22 M seg-1

Page 32: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

1 er Orden

• La aparición de producto o desaparición de reactantes (según se mida la actividad) depende de la [reactantes]

PAk

→dt

dPkA

dt

dA ==−

Integrando: ktPA

A =− )()(

)(log3.2

0

0

Donde Ao es la concentración inicial de reactante y P es la concentración de producto a tiempo t

Page 33: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Para calcular kTiempo (seg) So-P = S (mM) P (mM) So/S ln So/S

0 9.00 0 -

300 8.55 0.45 1.052 0.0506600 8.12 0.88 1.108 0.1025900 7.71 1.29 1.167 0.1544900 7.71 1.29 1.167 0.1544

1200 7.32 1.68 1.229 0.20621500 6.95 2.05 1.294 0.25771800 6.60 2.40 1.363 0.3096

Page 34: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Gráficamente

Ln (

So/

S) 0.10

0.12

0.14

0.16

Tiempo (seg)

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Ln (

So/

S)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

Pendiente = k= 1.7 x 10-4 seg-1

OJO: Unidades

Page 35: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Reacciones multisustrato

• Nomenclatura Cleland (U Wisconsin)

E + S ES E+P

E

S P

EES EP

Page 36: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

2 sustratos 2 productosE+A+B E+P+Q

VARIAS POSIBILIDADES

1)primera

E

A P

EEAB EPQ

Q

EA EQ

B

Dos entran, dos salen, 2 sustratos, 2 productos (Bi-Bi)A entra primero, P sale primero “BI-BI ORDENADO”

Page 37: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

E

A

EEAB EPQ

EA

B

EB

P

EQ

Q

EP

2)

B A Q P

El orden de entrar salir es aleatorioBI-BI ALEATORIO

Page 38: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

E

A P

EFP F FB

Q

EA EQ

B

3) Tercera posibilidad

E EFP F FBEA EQ

La Enzima se convierte (F) durante la rxLos sustratos no se unen al mismo tiempo, un producto sale antes de que el segundo entreBI-BI PING-PONG

Page 39: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

¿Cómo distinguirlas?

• Union secuencial – Ordenada– Aleatoria– Ping-Pong– Ping-Pong

• Graficar 1/v vs 1/A a varios niveles de B

Page 40: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Secuenciales

1/vB

1/[A]

Page 41: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

1/v B

Ping-Pong

1/[A]

Page 42: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición

• Irreversible• Reversible

– Competitiva– No competitiva– No competitiva– Acompetitiva– Parcial

• Competitiva• No competitiva

– Mezclada• 3 Tipos (β=0, β=0 y α=β)

Page 43: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición Competitiva

Et = E+ES+EI

Page 44: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

)][

1(´

Ki

I

Km

Km +=

max

1

][

1*)

][1(

max

1

VSKi

I

V

Km

v++=

Page 45: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1
Page 46: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición no competitiva

Et = E+ES+EI+EIS

Page 47: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

)][

1(_

_

Ki

I

opendiente

inhpendiente +=

Grafica Dixon

)][

1(max

1

][

1*)

][1(

max

1

Ki

I

VSKi

I

V

Km

v+++=

Grafica Dixon

Page 48: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición acompetitiva

E + S ES E+P

+ I

Et = E+ES+ESI

ESI

Page 49: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1
Page 50: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1
Page 51: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

1/Vo

control

[I]1

[I]2

>[I]1/Vmax (1+[I]/Ki)

1/[S]

1/Vmax

-1/Km

)][

1(max

1

][

1*

max

1

Ki

I

VSV

Km

v++=

Page 52: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición parcial

• Competitiva

E + S ES E+P

+ I+ I

Ks][

]][[

ES

SEKs =

]][[ IEKi =

Et=E+EI+ES+ESI

ESI

+ I+ I

EI +S EI+PαKs

Ki αKi

][

]][[

ESI

SEIKs =α

][

]][[

ESI

IESKi =α

][

]][[

EI

IEKi =

Page 53: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Parcial competitiva

• El sustrato y el inhibidor se unen en diferentes sitios activos, ES, EI y ESI

• El sustrato se une mejor a la enzima sola que a la EIque a la EI

• Tanto ES como ESI van a producto…

Page 54: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Gráfica diagnóstica

1/vI

[I]=∞ pendiente α Ks/Vmax

[I]=Ki

1/[S]

[I]=0 pendiente Ks/Vmax

[I]=Ki

-1/Ks

-1/αKs

Page 55: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Ki

I

Ks

SKsKi

IS

Ks

S

V

v

][][1

]][[][

max ++

+= α

][

][

max I

S

V

v =

][

)][

1(

)][

1(max

S

Ki

IKi

I

Ks

V

++

+=

α][

][

max SKs

S

V

v

aparente +=

Page 56: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición parcial

• No Competitiva

E + S ES E+P

+ I+ I

Ks

Et=E+EI+ES+ESI

kp

ESI

+ I+ I

EI +S EI+PKs

Ki Ki

βkp

Page 57: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Parcial no competitiva

• El sustrato y el inhibidor se unen en diferentes sitios activos, ES, EI y ESI

• El ESI va a producto pero no tan efectivamente como ESefectivamente como ES

Page 58: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Gráfica diagnóstica

1/vI

[I]=∞ pendiente Ks/βVmax

[I]=Ki

1/[S]

[I]=0 pendiente Ks/Vmax

[I]=Ki

-1/Ks

Page 59: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

)][

1(

)][

1(

][

)][

1(

)][

1(

][

max

Ki

IKi

I

S

Ki

IKi

I

Ks

S

V

v

ββ +

++

+

+=

KiKi

][

][

max SKs

S

V

v

+=

Page 60: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

El resto

• No es tan complicado…como parece…• Consultar capítulo 4 del libro

– Enzyme Kinetics. Segel, I (1975) Wiley Int.

• Si alguien gusta consultarla, yo tengo una • Si alguien gusta consultarla, yo tengo una copia del libro, o buscarla en la biblioteca

Page 61: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición irreversible

Page 62: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición irreversible

• No específicos– Modificación química, son importantes para detectar

los grupos que están presentes en el sitio activo:– Lys DNFB (dinitrofluorobenceno), Cys iodoacetato,

bromo, MMTS (sulfonato de metilmetanotiol)• Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos • Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos

al sitio activo– Reactivos que tienen afinidad por el sitio activo– TPCK, glicidolfosfato, FSBA (benzoil-adenosina de

fluorosulfonilo)

Page 63: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

• Etiquetadores de fotoafinidad (activados con UV)– 8 azida ATP, 5 azida UTP

• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)– Anhidrido isatoico, ciclopropil benzilamina– También se les llama “basados en el mecanismo”

Page 64: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Algunos ejemplos de modificaciones químicas

Clase/grupo Rx reactivo Propósito

nucleófilonucleófilo

Lys –NH2 Sustitución nucleofílica

O-metilsoureaDinitrofluorobenceno(DTNB)

Bloquear -NH2

(DTNB)

Cys-SH alquilación IodoacetatoIodoacetamidabromo

No específicas para Cys, sino para nuc:

His imidazol acilación dietilpirocarbonato Lys, Tyr

Arg guanidino Adición a carbonilos 2,3 butano diona

electrófiloelectrófilo

Asp, Glu Formación de amida Amina + carbodiimida

aromáticos Yodinación I2, I3-, ICl His, SH,

Page 65: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Algunos ejemplos de etiquetas de afinidad

Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada

Tosilfenilalaninaclorocetona(TPCK)

Serinaproteasas

Serina del sitio activo

Glicidol fosfato Triosafosfatoisomerasa,

Etiqueta nucleófilos o bases generales en el sitio activoisomerasa,

enolasagenerales en el sitio activo

Fluorosulfonilboenzoiladenosina(FSBA)

deshidrogenasas

NAD(P)H del sitio activo

Page 66: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Algunos ejemplos de etiquetas de foto-afinidad

Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada

8 azido ATP recA proteina tirosina

8 azido cAMP Ribonucleasa A pancreática bovina

treonina

bovina

5 azido UTP UTP glucosa pirofosforilasa

Page 67: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Algunos ejemplos de reactivos suicidas

Reactivo suicida Enzima Cadena lateral modificada

Anhidrido isatoico quimiotripsina Serina del sitio activo

Ciclopropil benzilamina Monoamina oxidasa flavina

Adenosina 2,3, riboepóxido5 trifosfato

β galactosidasa metionina

Page 68: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Cooperatividad y alosterismo

Page 69: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Alostería

Bajo [S] Alto [S]Cambio de conformación

Se presenta en enzimas multisubunidades los sitios activos se comunicanLas enzimas cambian de forma, cambian su reactividad

Alo (otro) Steria (forma)

Kd1Kd2

Kd1 > Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen mejorpor lo que sera cooperatividad positiva

Kd1 < Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen peorpor lo que será cooperatividad negativa

Page 70: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1
Page 71: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

¿Como medirla?

max1.0_][

max9.0_][

VVaqueproduzcS

VVaqueproduzcSRs

===

Rs = Factor de cooperatividad

max1.0_][ VVaqueproduzcS =

Cooperatividad positiva Rs < 81Cooperatividad negativa Rs > 81Comportamiento MMenten Rs 81

Demostrar esto

Ejercicio:

Page 72: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Michaelis Menten

][

][9.0

max

max9.0

SKm

S

V

v

Vv

=++

==

=

][1.0][1.0

][

][1.0

max

max1.0

SKmS

SKm

S

V

v

Vv

=++

==

=

][9

][1.09.0

][9.0][9.0

SKm

SKm

SKmS

==

=+

][9

1

][9.01.0

][1.0][1.0

SKm

SKm

SKmS

=

==+

81

9

1

9 ==Km

KmRs

Page 73: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Otra forma de determinar el Ki

• El Ki es sumamente importante• Es análogo al Km, concentración de

inhibidor tal que da la mitad de la inhibición (mitad de la velocidad máxima)inhibición (mitad de la velocidad máxima)

• Si es una droga nueva ¿qué se buscará con respecto al Ki?

• Ki>Km…?• Dixon buscó maneras gráficas de

determinarla

Page 74: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición competitivaVariar la [I], manteniendo fijas las [S] (en varios niveles)

Page 75: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición no competitiva

Page 76: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

IC50

• El IC50 es una medida muy usada en diseño de drogas

• Corresponde a capacidad inhibitoria al 50% (mide potencia del inhibidor)50% (mide potencia del inhibidor)

• que tanta cantidad del inhibidor es necesaria para reducir a la mitad el proceso (Rx enzimática, aunque es más amplia su aplicación)

• Tiene relación con el Ki

Page 77: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Para los diferentes casos de inhibición

competitiva

No competitiva

acompetitiva

Page 78: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

pIC50

• A veces se usa un valor p análogo al pH o al pKa, es:

• pIC50 = -log10 (IC50)• Se usa para expresar la potencia de la • Se usa para expresar la potencia de la

droga en valores exponenciales y generalmente es en M (molar)

Page 79: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Inhibición por sustrato

• A [S] altas se inhibe la rx enzimática• La gráfica de HMM, no da una hipérbola

sino una campana• La gráfica de LB por lo tanto no da una • La gráfica de LB por lo tanto no da una

recta

v

[S]

1/v

1/[S]

Page 80: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Explicaciones posibles

1. La Enzima puede tener 2 sitios de unión para el mismo S– El sitio catalítico y el sitio de inhibición

2. Hay dos configuraciones reversibles 2. Hay dos configuraciones reversibles entre sí– Activa (Ea) e Inactiva (Ei)

Page 81: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

Mecanismo

Ea Ei+ +

< S > S

EaS EiS XEa + P

Page 82: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1

ejemplo

Glucosa 6 fosfato +ADP Glucosa +ATPhexoquinasa

Si la G6P está en alta concentración, se inhibe la rx