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SEZIONE INNOVAZIONE E SVILUPPO

Centro Ittico Sperimentale Valdastico

TRASFERIMENTO DELL’INNOVAZIONE A SUPPORTO DELLA PESCA SPORTIVA A

SALVAGUARDIA DELLA TROTA MARMORATA, TEMOLO ED ALTRE SPECIE

SENSIBILI ALLA SEV E NEI

D.G.R. n. 2570 del 20.12.2013 - Contributo regionale per la realizzazione di iniziative progettuali in materia di conservazione del patrimonio ittico autoctono regionale.

RELAZIONE FINALE Anno 2015

MARIA FABIANA BILO’ 30.10.2015

1

SOMMARIO

PREMESSA ............................................................................................................... 2

FORMAZIONE E DIVULGAZIONE ...................................................................................... 3

GIORNATE INFORMATIVE/FORMATIVE TEORICO-PRATICHE PER LE ASSOCIAZIONI DI PESCA ........... 3

FORMAZIONE PROFESSIONALE PER LA GESTIONE DELLA RIPRODUZIONE DEL TEMOLO E DI ALTRE

SPECIE SENSIBILI ALLA SEV E NEI ................................................................................. 4

CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI RIPRODUTTORI DI TROTA MARMORATA ................................. 7

CRIOCONSERVAZIONE DEL SEME DI TROTA MARMORATA DI ALLEVAMENTO ................................. 35

PROTOCOLLO FECONDAZIONE UOVA DI SALMONIDI .......................................................... 39

PROVE DI FOTOPERIODO ............................................................................................. 44

MARCATURA DI GIOVANILI DI TROTA MARMORATA CON ALIZARINE RED (ROSSO ALIZARINA) ............ 44

MARCATURA DELLE UOVA EMBRIONATE ........................................................................ 45

MARCATURA DEI GIOVANILI DI TROTA .......................................................................... 45

PRODUZIONE DI TROTA FARIO STERILI – TRIPOIDI ............................................................... 49

BIBLIOGRAFIA CITATA ................................................................................................ 53

ALLEGATI ............................................................................................................... 54

2

PREMESSA

L’Azienda Regionale Veneto Agricoltura, facendo perno sui contributi regionali per la realizzazione di

iniziative progettuali in materia di conservazione del patrimonio ittico autoctono regionale, ha avviato

da molti anni un programma di ricerca multidisciplinare per la valorizzazione di una delle più

importanti entità faunistiche presenti nei bacini idrografici del Veneto: la trota marmorata (Salmo

trutta marmoratus) – specie in allegato II della direttiva habitat (92/43/CEE). Purtroppo nell’elenco

delle priorità si aggiunge un altro salmonide da salvaguardare, non meno importante per le nostre

acque, il temolo (Thymallus thymallus) “pinna blu”. Questa specie anche se non citata dalla direttiva

habitat come specie di interesse comunitario in Italia, negli ultimi decenni ha subito la quasi totale

scomparsa dalle acque vocate a salmonidi.

A seguire, gli ambiziosi obiettivi a lungo termine per la tutela delle specie sopraccitate:

� promuovere una corretta gestione delle popolazioni selvatiche a supporto della pesca sportiva;

� contribuire alla conservazione genetica e all'incremento delle specie nelle acque della Regione

Veneto;

� promuovere e sviluppare l’innovazione tecnologica e gestionale nei campi della produzione,

igiene, valorizzazione qualitativa dei prodotti dell’acquacoltura;

� promuovere la cooperazione fra Veneto Agricoltura e gli Incubatoi di valle.

Per corrispondere concretamente a queste finalità le proposte progettuali da implementare sono sia di

tipo sperimentale sia di tipo formativo.

Le azioni formative prevedono:

FORMAZIONE PROFESSIONALE del personale qualificato del Centro Ittico Valdastico con l’obiettivo di

acquisire competenze tecnico-scientifiche e gestionali sulla specie temolo;

GIORNATE INFORMATIVE/FORMATIVE TEORICO-PRATICHE con argomenti proposti dalle Associazioni di pesca

sportive, rivolte al personale addetto alla gestione degli impianti ittiogenici/incubatoi di valle.

Le azione sperimentali prevedono:

CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI RIPRODUTTORI DI TROTA MARMORATA (allevamento e/o selvatici) per il loro

utilizzo nelle pratiche di riproduzione. Applicazione di marcatori microsatellite, dopo la selezione con

l’approccio classico D-Loop/LDH;

CRIOCONSERVAZIONE DEL SEME DI TROTA MARMORATA DI ALLEVAMENTO, di maschi appartenenti a bacini diversi

per preservare al meglio la variabilità genetica dei soggetti allevati;

MARCATURA MEDIANTE COLORANTE A BASE DI ALIZARINA DI TROTA MARMORATA, rilascio e recupero in ambiente

naturale controllato.

PROVE DI FOTOPERIODO per la verifica della sincronizzazione nella maturazione delle gonadi nelle

femmine;

PRODUZIONE DI TROTA FARIO STERILI (TRIPLOIDI) per evitare fenomeni di ibridazione fra la trota fario e la

trota marmorata nelle aree di sovrapposizione.

3

FORMAZIONE E DIVULGAZIONE

La complessità nella corretta gestione del materiale ittico selvatico e di quello prodotto negli impianti

ittiogenici, condotti sia dal Centro Ittico di Valdastico sia dalle diverse Associazioni di Pesca, impone

un continuo aggiornamento ed un ininterrotto sostegno tecnico scientifico.

GIORNATE INFORMATIVE/FORMATIVE TEORICO-PRATICHE PER LE ASSOCIAZIONI DI PESCA

Con il compito di sensibilizzare e coinvolgere le diverse Associazioni di pesca, alla luce della recente

normativa, si sono organizzate giornate informative, rivolte sia alle Associazioni di pescatori sportivi

sia agli operatori delle strutture pubbliche regionali e territoriali, addetti al settore ittico.

Sono state affrontate le principali tematiche legate alla gestione, produzione e igiene dei prodotti

dell’acquacoltura. Il programma è stato proposto in quattro diverse località del territorio veneto

(Corte Benedettina- Legnaro (PD), Cantina dei Colli Berici – Lonigo (VI), Museo Etnografico di

Serravella- Cesiomaggiore (BL) e San’Artemio – Treviso) con l’intento di favorire la massima

partecipazione da parte degli operatori interessati.

Gli argomenti trattati, con i rispettivi relatori, sono stati i seguenti:

� Principali problematiche sanitarie nell’allevamento delle specie ittiche d’acqua dolce-Amedeo

Manfrin - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie;

� Biosicurezza e benessere animale -Andrea Fabris - Veterinario A.P.I.

� Normativa vigente in materia di immissioni nelle acque pubbliche e laghetti di pesca sportiva-

Manuela Dalla Pozza, Chiara Ceolin - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie;

� Ruolo dell’ULSS nel settore della Pesca - Interventi dei Servizi Veterinari Sanità Animale Daniele

Boffo - Ulss 9, Marcello Malacarne - Ulss 2 e Michele Zaghi - Ulss 16;

� Approccio di gestione sostenibile per il mantenimento degli stock ittici autoctoni - Fabio

Borghesan – Ittiologo, Consulente Veneto Agricoltura.

Nel seguito vengono allegate le relazioni dei formatori.

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FORMAZIONE PROFESSIONALE PER LA GESTIONE DELLA RIPRODUZIONE DEL TEMOLO E DI ALTRE SPECIE

SENSIBILI ALLA SEV E NEI

Il temolo (Thymallus thymallus) è una specie ittica diffusa su quasi tutto il continente europeo; a nord

si spinge fino alla Scandinavia settentrionale, fanno invece eccezione le regioni più meridionali. Nelle

acque italiane era in origine presente nel bacino padano-veneto. Negli ultimi decenni, come già

successo con la trota marmorata, la specie ha subito importanti disturbi di tipo antropico, quali

inquinamento delle acque e degrado degli habitat. L’introduzione e la traslocazione di ceppi non

nativi di provenienza danubiana e atlantica a scopi prettamente alieutici, hanno potenzialmente

alterato i pool genici locali della specie. Ciò ha portato ad una situazione in cui le popolazioni che per

definizione potrebbero essere considerate autoctone, presentano invece alti livelli di introgressione

(es. fiume Adige) o addirittura, nel peggiore dei casi, la completa sostituzione delle popolazioni

localmente adattate (es. fiume Brenta).

Dalle ricerche effettuate - Progetto ABaTe - del dott. A. Gandolfi e A. Meraner, del Centro di Ricerca e

Innovazione, Fondazione Mach di Trento, emerge infatti la presenza di gruppi genetici differenti di

Temolo nell’areale di campionamento dell’Adriatico settentrionale. Due gruppi genetici appartengono

al “Temolo adriatico” nativo (il primo gruppo individuato nel Bacino dell’Adige e il secondo nei fiumi

Sesia e Adda e in Friuli), mentre i rimanenti gruppi genetici sono esotici e riferibili alle popolazioni di

Temolo della Drava, del Danubio del Nord, della Sava o del Bacino Atlantico (corsi d’acqua dell’Europa

Centrale o della Scandinavia).

Tracce genetiche esotiche sono state rinvenute in tutti i siti di campionamento investigati, a

testimonianza dell’imponente impatto che le semine hanno avuto sulla componente genetica nativa

delle popolazioni selvatiche.

La proporzione delle componenti genetiche non-native è diversa da sito a sito, da un massimo del 100%

(= estinzione locale del Temolo nativo) a un minimo del 5-7% (a indicare una quasi totale persistenza

delle originarie popolazioni di Temolo).

Elevate proporzioni di componenti genetiche native sono state osservate nei fiumi Sesia (Piemonte),

Adda (Lombardia) e in particolare nei tratti medi del Fiume Adige. A titolo di esempio, la componente

genetica riferibile al Temolo adriatico nativo è pari al 93% nell’Adige in prossimità di Merano e

addirittura pari al 95% tra Bolzano e Ora.

La composizione genetica del Temolo nelle acque del sottobacino dell’Adige orientale (alto Isarco,

Rienza e Aurino) merita una descrizione particolare: mentre i temoli dell’Adige occidentale sono

principalmente caratterizzati da pattern genetici adriatici, gli esemplari campionati nell’Adige

orientale sono geneticamente più simili alle popolazioni della Drava (Alto Adige orientale; tributario

del Danubio).

Complesse analisi dei dati osservati e di dati genetici simulati suggeriscono effettivamente per le

popolazioni di Temolo nelle acque tra Dobbiaco e Bressanone un’origine geografica a partire dalle

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popolazioni della Drava e un’origine temporale databile intorno alla metà del sedicesimo secolo.

Quindi, l’origine delle popolazioni dell’Adige orientale può essere fatta risalire al regno di

Massimiliano I (1486- 1519), già noto, in ambito ittiologico, per avere avviato le prime diffuse

traslocazioni di salmonidi. (Andreas Meraner, 2013)

Sulla scorta di queste ricerche, l’obiettivo ambizioso del Centro Ittico di Valdastico è di riuscire a

provvedere alla riproduzione in ambito artificiale di questa specie di interesse alieutico in Regione

Veneto. Partendo da uova di esemplari possibilmente selvatici, provenienti dal fiume Adige e/o dal

fiume Livenza, si intende ottenere una prima linea di temoli da accrescere fino a farli diventare

riproduttori; con questi dare quindi avvio alla produzione su larga scala a scopo di ripopolamento e

alieutico in Regione Veneto.

Da molti anni, per cercare di arrestare la perdita di esemplari del ceppo autoctono di temolo, i vicini

Sloveni ed i Centri Ittici del Friuli Venezia Giulia hanno avviato nei loro territori progetti di

allevamento in cattività della specie (A. Sabbadini, 2007). Sono state riscontrate grandi difficoltà in

merito, legate all’incapacità degli esemplari selvatici di adattarsi alla cattività, fattore che limita

fortemente la possibilità di ottenere uova. Il problema è stato superato facendo crescere in ambiente

artificiale esemplari giovanili con i quali si è allestito un primo parco riproduttori, ottenendo cosi una

buona quantità di uova fecondate. Grazie anche a queste ricerche è stata individuata una dieta adatta

alla crescita della specie in cattività. Facendo tesoro di tali esperienze, maturate negli anni, è stato

attivato un rapporto di collaborazione con l’Ente Tutela Pesca della Regione Friuli Venezia Giulia,

indirizzato alla formazione professionale del personale del Centro Ittico di Valdastico, volto a favorire

l’acquisizione di competenze tecnico-scientifiche e gestionali sulla specie temolo.

Il tutto è iniziato con l’incontro tenutosi al Centro Ittico Valdastico il 19.02.2014. Per l’occasione è

stato presentato il progetto “Nuove tecniche di crio – conservazione e analisi genetica come strumenti

per implementare e migliorare la conservazione di specie ittiche protette e le performance delle

specie allevate” che ha interessato la specie marmorata.

Nelle diverse visite, effettuate nei mesi da maggio a luglio, nei Centri Ittici friulani, a Maniago e Forni

di Sopra (PN) dell’Ente Tutela Pesca, sotto la direzione tecnica del Sig. Gian Maria Sigalotti e del Dott.

Andrea Fabris, si sono apprese alcune specifiche tecniche operative concernenti le fasi produttive

relative al mantenimento dei riproduttori e all’allevamento e allo svezzamento dei giovanili.

Non è stato possibile partecipare alle fasi di spremitura e di fecondazione delle uova, per mancato

coordinamento dei tecnici friulani.

Le principali difficoltà che ogni anno si evidenziano negli impianti friulani e che complicano

l’allevamento del temolo, soprattutto dopo il raggiungimento del terzo anno di età degli esemplari,

sono le comparse di varie patologie, specialmente della foruncolosi. La somministrazione di antibiotici

per fronteggiare tali malattie diventa a lungo termine inefficace, provocando la quasi totale

scomparsa dei lotti allevati. L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie ha cercato di

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produrre uno specifico vaccino, ma senza risultati apprezzabili. Sono a tutt’oggi in atto diverse

attività sperimentali volte alla risoluzione del problema.

Le ipotesi più probabili alla radice di questo fenomeno sono riconducibili ad un mancato

raggiungimento delle condizioni ideali di alimentazione e di densità degli individui negli Impianti.

Grazie alle informazioni scambiate ed alle nozioni apprese durante gli incontri, è stato possibile

valutare l’idoneità del Centro ittico di Valdastico in ordine alla realizzazione degli obiettivi prefissati.

La prima difficoltà che si evidenzia per la produzione di temoli nel Centro Ittico Valdastico è la bassa

escursione termica dell’acqua utilizzata in Impianto (range fra 9.5°C– 11°C); questa influirebbe

negativamente sulla maturazione delle gonadi dei futuri riproduttori da allevare.

Queste stesse condizioni, invece, sono buone per la schiusa delle uova e per lo svezzamento del

novellame.

Le larve di temolo, sia in cattività sia in natura, cominciano a nutrirsi autonomamente, una volta

riassorbito il sacco vitellino; essi sono in grado di alimentarsi di zooplancton, tanto di quello raccolto

in natura (sia vivo sia congelato) quanto di quello prodotto in avannotteria, fornito dai naupli di

Artemia sp..

In questa fase, il Centro Ittico Valdastico sarebbe in grado di svezzare il materiale prodotto, cosi come

viene fatto attualmente per la trota marmorata.

Le uova dovrebbero essere spremute da esemplari maturi, catturati in natura e/o da riproduttori in

sosta presso un altro impianto, indenne e con acque idonee, per poi provvedere allo spostamento delle

uova fecondate nell’avannotteria del Centro.

Per questa specie - ceppo adriatico – nelle nostre acque gravemente minacciata di estinzione, si

intende valutare la possibilità di coinvolgere altre strutture (Associazioni di Pesca che gestiscono

impianti Ittiogenici e Amministrazioni provinciali) per riuscire a presentare in futuro un progetto

correttamente articolato in tutte le sue fasi, dalla produzione allo svezzamento.

temolo – foto di Emanuele Turato

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Spin off accademico GEN TECH - Tecnologie innovative in biologia animale

Parco Area delle Scienze, 11/a – 43124 PARMA

Telefono: +39- 0521-905643 Fax: +39-0521-905657

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CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI RIPRODUTTORI DI TROTA MARMORATA

INTRODUZIONE

Da alcuni anni la proficua collaborazione tra l’Amministrazione Regionale del Veneto e lo spin off

accademico Gen-Tech dell’Università degli Studi di Parma ha portato alla realizzazione di un progetto

di ricerca dedicato al miglioramento delle metodiche di allevamento della trota marmorata. Tra i vari

endemiti presenti nei corsi d’acqua italiani, la trota marmorata è considerata una delle specie di

maggior valenza biogeografica e naturalistica. Il suo stato di conservazione, classificato ad “elevato

rischio” (Critically Endangered) dalla recente revisione della Lista Rossa IUCN dei vertebrati italiani

(Rondinini et al., 2013), conferma la necessità di rigidi interventi di protezione e salvaguardia delle

popolazioni alpine. Nonostante la specie sia inserita fin dal 1992 nell’allegato II della Direttiva Habitat

(92/43/ CEE), la situazione dei popolamenti italiani è andata via via peggiorando, in relazione

soprattutto alle continue modificazioni di habitat e alla costante antropizzazione dei corsi d’acqua

settentrionali (Meraner et al., 2007; 2008).

Per tale motivo la trota marmorata è oggi tra le specie dell’ittiofauna dulcicola italiana quella che

richiama maggiore attenzione in pratiche di allevamento a fini conservazionistici. La Regione Veneto,

ed in particolare il Centro Ittiogenico di Valdastico (VenetoAgricoltura), ha avviato da anni un progetto

per il recupero della trota marmorata nei maggiori bacini idrografici del Veneto e si è impegnata per

l’applicazione di metodologie innovative per il miglioramento delle pratiche in acquacoltura (Best

practices in aquaculture).

Nello specifico il Centro Ittiogenico di Valdastico nel corso degli anni 2014 e 2015 ha condotto una

tipizzazione molecolare degli stock di riproduttori avvalendosi della collaborazione dello spin off

dell’Università di Parma, implementando inoltre tecniche di riproduzione assistita e allevamento

anche in collaborazione con partner Norvegesi nell’ambito di un progetto finanziato dal Regional

Governement of Norway e coordinato dalla Cryogenetics di Hamar (si allega frontespizio della

partnership di progetto nella figura sottostante).

E’ bene precisare che la selezione genetica dei riproduttori è uno degli aspetti cruciali per il successo

dei piani di salvaguardia e di conservazione della specie, alla luce di ricerche pregresse che hanno

messo in evidenza l’alta percentuale di ibridi (introgressione da geni atlantici) presente nelle

popolazioni naturali.

Nella presente relazione vengono illustrate i principali aspetti tecnici ed i risultati di ricerche condotte

sia presso l’impianto di Valdastico, sia in Laboratorio presso l’Università di Parma. La relazione è

strutturata in due differenti sezioni. Una prima sezione riguardante le attività svolte per la

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tipizzazione genetica dei riproduttori, condotte anche in collaborazione con partner norvegesi ed una

seconda parte riguardante metodologie innovative per l’allevamento di stadi giovanili di trota

marmorata.

Illustrazione della partnership di progetto svolto in collaborazione con enti di ricerca norvegesi.

ATTIVITA’ DI GENETICA MOLECOLARE

MATERIALI E METODI

E’ stato applicato un approccio integrato basato sull’analisi di marcatori mitocondriali, di SNPs

nucleari e di loci microsatellite altamente polimorfici. L’analisi della regione di controllo

mitocondriale D-Loop, associata all’analisi RFLP del gene nucleare LDH-C1 ha consentito

9

l’effettuazione di uno screening di primo livello (Fase 1) degli esemplari da avviare alla tipizzazione

microsatellite (Fase 2). L’approccio intergrato consente di definire con ragionevole certezza il grado di

purezza dei riproduttori e la loro attribuzione a gruppi/popolazioni ben differenziate.

Relativamente all’analisi del DNA mitocondriale (D-Loop), esso consente di definire anche l’origine

fileogeografica degli esemplari sulla base dell’attribuzione alle linee Mediterranea Adriatica,

Atlantica, Danubiana e Marmoratus. Per quanto concerne la determinazione delle frequenze alleliche

dei loci microsatellite sono stati analizzati 11 diversi loci in un primo stock di 96 esemplari allevati

presso il Centro di Valdastico. Di questi 30 erano provenienti dai bacini Piave (catturati anno 2008), 30

dell’Adige (2010) e 36 Brenta (2009). In realtà 6 esemplari del ceppo Brenta, dei 36 analizzati, erano

esemplari selvatici catturati in ambiente naturale nel 2013. I loci analizzati sono stati i seguenti:

BHMS330, BHMS349, BHMS429, Ssa197, Ssa85, SsaD157, SsaD190, SsaD58, SsaD85, STR-2, Tap2B.

Ulteriori 3 loci, STR15, Ssa85 e Ssa197 sono stati analizzati in un secondo stock di 169 campioni di cui

84 appartenenti al ceppo Brenta Cismon e 85 al ceppo Piave portati a Valdastico nel 2014.

Nella tabella sottostante è riportate il quadro dei campionamenti con i codici di riferimento associati

ad ogni marmorata, per una migliore identificazione operativa durante le prossime campagne

ittiogeniche. Ogni trota è stata infatti dotata di un Pit Tag (Personal Integrated Trasponder)

intramuscolo.

DOMESTIC - ADIGE 2010

SAMPLE NUMBER SEX BARCODE LENGHT cm WEIGHT kg

1 M 968000004730958 47 1,29

2 M 968000004568954 51 1,605

3 M 968000004746968 40 0,755

4 M 968000004273144 53 2,065

5 M 968000004566595 50,5 1,83

6 M 968000004736315 45 1,03

7 M 968000004735379 48 1,275

8 M 968000004749072 41 870

9 M 968000004567116 47 1,2

10 M 968000004706880 47 1,345

11 M 968000004729696 56 2,395

12 F 968000004568889 43,5 1,14

10

13 F 968000004734204 42,5 1,075

14 F 968000004767131 50,5 1,5

15 F 968000004567143 44 1,095

16 F 968000004756941 51 1,73

17 F 968000004739222 47 1,385

18 M 968000004744913 45 1,045

19 M 968000004565900 49 1,52

20 M 968000004706504 48 1,24

60 M 968000004747805 57,5 1,005

DOMESTIC - BRENTA 2009


21 M 968000004267483 48 1,52

22 M 968000004737468 44 0,91

23 M 968000004569214 47 1,27

24 M 968000004745592 49 1,475

25 M 968000004748237 47,5 1,525

26 M 968000004740155 44 1,055

27 M 968000004735392 38 0,98

28 M 968000004747447 49 1,38

29 M 968000004571902 50,5 1,65

30 M 968000004830738 51 1,675

31 M 968000004762916 46 1,34

32 M 968000004748438 47 1,28

33 F 968000004725604 45 1,375

34 F 968000004705547 47 1,58

35 F 968000004747167 42,5 1,17

36 F 968000004568996 44 1,205

37 F 968000004748093 41 1,06

38 F 968000004729583 44 1,105

39 F 968000004741141 39 0,785

40 F 968000004269688 44 1,275

11

DOMESTIC - PIAVE 2008


41 M 968000004569125 55 1,5

42 F 968000004707174 47 1,23

43 M 968000004729678 49 1,31

44 M 698000004727888 57 1,935

45 M 968000004749944 50 1,58

46 M 968000004728308 49 1,48

47 M 968000004567749 51 1,53

48 M 968000004730384 48 1,205

49 F? 968000004738281 47 1,1

50 F 968000004271145 44 1,15

51 F 968000004748320 41 0,895

52 F 968000004741962 49 1,365

53 F 968000004747405 44 1,1

54 F 968000004727737 44,5 0,955

55 F 968000004570004 48 1,26

56 F 968000004739882 44 0,93

57 F 968000004747664 60 2,61

58 M 968000004572572 47,5 1,445

59 M 968000004567387 52 1,755

WILD – BRENTA 2013

SAMPLE NUMBER SEX BARCODE LENGHT cm WEIGHT kg NOTES

1 F 968000004733525 47 \

2 F 968000004705810 41 \

3 F 968000004735895 31 \

4 F 968000004740595 43 \

5 F 968000004733204 38 \ Hybrid pheno

6 F 968000004725752 48 \ Marble pheno

Per quanto concerne le metodologie molecolari applicate, esse sono già state descritte in modo

dettagliato in relazioni precedenti e sono riconducibili a lavori presenti in letteratura. In particolare

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per quanto concerne l’identificazione di aplotipi mitocondriali si è proceduto all’analisi di SNPs in

multiplexing della regione di controllo mitocondriale utilizzando 5 diversi primer “forward” ed un solo

“reverse” secondo quanto proposto da Apostolidis et al. (2007).

In alcuni campioni selezionati in modo causale l’approccio multiplex è stato confermato da

un’ulteriore analisi basata sull’utilizzo dell’enzima di restrizione AluI, effettuata su ampliconi ottenuti

con primer L19/ H17 (Dovc et al., 2004).

Il gene nucleare LDH- C1* è stato amplificato con primer Ldhxon3F/ Ldhxon4R, con successiva

identificazione dei genotipi mediante endonucleasi BslI e tecnica RFLP secondo quando descritto da

McMeel et al. 2001. In questo caso il pattern di restrizione consente di identificare le diverse

combinazioni alleliche in grado di definire omozigoti Atlantici 90/90, Mediterranei 100/100 o

eterozigoti ibridi 90/100. In particolare, l’allele 100 identifica caratteristiche genetiche Mediterranee

per il gene in questione.

I riproduttori risultati mediterranei all’analisi mitocondriale e LDH sono stati sottoposti ad ulteriore

genotipizzazione dei loci microsatellite, utilizzando specifiche sequenze di primer riportate in

letteratura (Pujolar, et al., 2011). L’analisi degli ampliconi per la definizione delle frequenze alleliche

è stata condotta tramite elettroforesi capillare utilizzando un sistema automatizzato (sequenziatore

automatico) CEQ8000 Beckman Coulter DNA Analysis System.

Il “Population assignment”, ossia l’attribuzione alla cieca alle diverse popolazioni/gruppi sulla base

delle frequenze alleliche dei loci microsatellite, è stata eseguita con software STRUCTURE (v2.3.4.).

Gli esemplari ibridi 5, 13, 19, 56 e il locus SSaD170, caratterizzato da numerosi alleli nulli, sono stati

omessi nella matrice originale. Sono inoltre riportati I seguenti parametri di elaborazione qualora

fossero di interesse tecnico-specialistico: length of Burning Period 5000, numero di MCMC Repetitions

after Burning 10000, Ancestry Model basato su “Admixture Model”, numero iniziale di K (populations)

tra 1 e 10 (Software Structure Harvester Web v 0.6.94).

RISULTATI

I risultati delle analisi combinate degli aplotipi mitocondriali e del gene LDH-C1, effettuate nei 3

gruppi di marmorate “domestiche” (1-20 Adige, 21-40 Brenta, 41-60 Piave), sono illustrati nella

tabella sottostante. Come già evidenziato nel paragrafo precedente, 4 esemplari tra i 60 analizzati

(5,13, 19 e 56) sono stati scartati prima dell’analisi dei loci microsatellite in quanto risultati ibridi

all’analisi LDH. In questo caso l’introgressione è stata apportata da maschi, in quanto il DNA

mitocondriale (di provenienza materna) ha mostrato il 100% di appartenenza all’aplotipo

“marmoratus” (marble).

13

CAMPIONI “DOMESTICI” PRESSO IMPIANTO DI VALDASTICO

SAMPLE mt-Dloop LDH-C1 Diagnosi

1 Marble ME MARBLE

2 Marble ME MARBLE

3 Marble ME MARBLE

4 Marble ME MARBLE

5 Marble Heterozygote Hybrid

6 Marble ME MARBLE

7 Marble ME MARBLE

8 Marble ME MARBLE

9 Marble ME MARBLE

10 Marble ME MARBLE

11 Marble ME MARBLE

12 Marble ME MARBLE


14 Marble ME MARBLE

15 Marble ME MARBLE

16 Marble ME MARBLE

17 Marble ME MARBLE

18 Marble ME MARBLE


20 Marble ME MARBLE

21 Marble ME MARBLE

22 Marble ME MARBLE

23 Marble ME MARBLE

24 Marble ME MARBLE

25 Marble ME MARBLE

26 Marble ME MARBLE

27 Marble ME MARBLE

28 Marble ME MARBLE

29 Marble ME MARBLE

30 Marble ME MARBLE

31 Marble ME MARBLE

32 Marble ME MARBLE

33 Marble ME MARBLE

34 Marble ME MARBLE

35 Marble ME MARBLE

36 Marble ME MARBLE

14

37 Marble ME MARBLE

38 Marble ME MARBLE

39 Marble ME MARBLE

40 Marble ME MARBLE

41 Marble ME MARBLE

42 Marble ME MARBLE

43 Marble ME MARBLE

44 Marble ME MARBLE

45 Marble ME MARBLE

46 Marble ME MARBLE

47 Marble ME MARBLE

48 Marble ME MARBLE

49 Marble ME MARBLE

50 Marble ME MARBLE

51 Marble ME MARBLE

52 Marble ME MARBLE

53 Marble ME MARBLE

54 Marble ME MARBLE

55 Marble ME MARBLE


57 Marble ME MARBLE

58 Marble ME MARBLE

59 Marble ME MARBLE

60 Marble ME MARBLE

Tra i campioni selvatici, 5 esemplari su 6 sono risultati idonei alla successiva genotipizzazione con

microsatelliti. Il solo esemplare n. 5 ha mostrato segni di ibridazione a livello nucleare. Risultati

riportati nella tabella sottostante.

CAMPIONI SELVATICI

Brenta 1 Marble ME MARBLE




Brenta 5 Marble Heterozygote HYBRID


15

I risultati dell’analisi di 11 loci microsatellite polimorfici, precedentemente caratterizzati in Salmo

salar e in Salmo marmoratus, e quindi potenzialmente fruibili per considerazioni di genetica di

popolazione nei gruppi campionati, sono riportati nel prospetto sottostante. In generale i loci

BHMS349, Ssa197, SSaD157, SsaD58, STR-2 hanno mostrato una ”allelic richness” superiore agli altri e

pertanto sono stati considerati tra i più informativi (aspetto da considerare nelle tipizzazioni future).

Per quanto concerne aspetti specifici di variabilità genetica, l’eterozigosità medià entro gruppi,

determinata considerando tutti i loci polimorfici, è risultata scarsa e variabile tra 61,10% Adige, 58,18

% Brenta e 51,81% Piave. Da un punto di vista conservazionistico questo aspetto non è trascurabile,

considerando i livelli di variabilità definiti in altre specie ittiche solitamente in grado di raggiungere

anche valori di eterozigosità variabili tra 70 e 90%. La bassa eterozigosità riscontrata nelle marmorate

di Valdastico è presumibilmente attribuibile a fenomeni di inbreeding (inincrocio), assai comuni in

materiale di allevamento.

DOMESTIC - ADIGE

LOCI GENOTYPE N° IND %

BHMS330

92/96 1 5,55%

90/90 4 22,22%

90/94 1 5,55%

90/96 10 55,55%

90/110 1 5,55%

90/92 1 5,55%

18 99,97%

BHMS349

123/163 3 16,66%

119/123 3 16,66%

123/129 5 27,77%

123/123 4 22,22%

125/163 1 5,55%

111/123 1 5,55%

123/161 1 5,55%

18 99,96%

BHMS429

195/195 4 22,22%

16

205/205 1 5,55%

195/205 3 16,66%

195/201 8 44,44%

201/205 1 5,55%

191/191 1 5,55%

18 99,97%

Ssa197

177/185 1 5,55%

197/197 3 16,66%

177/193 1 5,55%

157/193 2 11,11%

185/193 3 16,66%

185/185 2 11,11%

193/197 2 11,11%

177/177 1 5,55%

181/185 1 5,55%

193/193 1 5,55%

177/197 1 5,55%

18 99,95%

SSa85

108/108 17 94,44%

108/132 1 5,55%

18 99,99%

SSaD157

311/319 1 5,55%

291/319 1 5,55%

287/299 1 5,55%

287/307 2 11,11%

311/327 2 11,11%

287/291 2 11,11%

275/287 2 11,11%

287/319 2 11,11%

17

299/319 1 5,55%

287/287 2 11,11%

283/303 1 5,55%

307/307 1 5,55%

18 99,96%

SSaD190

132/136 9 50%

132/132 7 38,88%

136/136 2 11,11%

18 100%

SsaD58

279/283 1 5,55%

267/283 2 11,11%

317/317 1 5,55%

287/315 1 5,55%

283/291 1 5,55%

291/291 1 5,55%

279/279 3 16,66%

279/287 2 11,11%

283/303 1 5,55%

287/291 1 5,55%

279/321 1 5,55%

285/291 1 5,55%

265/265 1 5,55%

307/307 1 5,55%

18 99,93%

SSaD85

192/192 2 11,11%

196/226 1 5,55%

196/222 1 5,55%

226/230 1 5,55%

192/222 3 16,66%

18

186/226 1 5,55%

222/230 2 11,11%

214/234 1 5,55%

214/236 1 5,55%

222/232 1 5,55%

192/212 1 5,55%

226/226 1 5,55%

212/234 1 5,55%

204/214 1 5,55%

18 99,93%

STR-2

333/361 1 5,55%

328/352 1 5,55%

331/357 1 5,55%

322/352 2 11,11%

353/357 1 5,55%

361/361 1 5,55%

350/359 1 5,55%

322/354 1 5,55%

359/359 2 11,11%

324/346 1 5,55%

357/357 2 11,11%

332/352 1 5,55%

321/359 2 11,11%

346/361 1 5,55%

18 99,94%

Tap2B

313/313 7 38,88%

321/321 3 16,66%

313/321 8 44,44%

18 99,98%

19

DOMESTIC BRENTA


BHMS330

90/90 15 75%

90/102 4 20%

90/96 1 5%

20 100%

BHMS349

99/151 3 15%

101/151 1 5%

109/151 3 15%

151/165 3 15%

109/165 1 5%

99/109 6 30%

101/117 1 5%

101/109 1 5%

99/145 1 5%

20 100%

BHMS429

195/195 3 15%

195/201 13 65%

201/201 3 15%

195/215 1 5%

20 100%

Ssa197

208/208 1 5%

147/189 1 5%

165/177 3 15%

177/181 1 5%

147/177 4 20%

147/165 2 10%

20

181/181 1 5%

165/181 6 30%

161/181 1 5%

20 100%

SSa85

108/108 19 95%

108/132 1 5%

20 100%

SSaD157

283/311 3 15%

311/315 4 20%

315/315 3 15%

283/283 3 15%

152/283 1 5%

283/299 1 5%

307/311 1 5%

299/311 1 5%

245/283 1 5%

299/311 2 10%

20 100%

SSaD190

132/132 11 55%

128/132 1 5%

132/146 7 35%

142/146 1 5%

20 100%

SsaD58

315/315 4 20%

295/295 4 20%

295/315 9 45%

279/295 2 10%

279/279 1 5%

21

20 100%

SSaD85

208/208 6 30%

226/236 1 5%

186/200 2 10%

200/208 2 10%

208/236 2 10%

236/236 1 5%

200/236 4 20%

190/208 1 5%

186/226 1 5%

20 100%

STR-2

352/352 1 5%

372/372 4 20%

345/352 2 10%

345/372 1 5%

327/339 1 5%

339/372 1 5%

346/346 1 5%

325/345 1 5%

341/344 1 5%

325/352 1 5%

344/352 1 5%

352/359 1 5%

344/344 1 5%

344/361 1 5%

325/344 2 10%

20 100%

Tap2B

321/321 12 60%

201/201 1 5%

22

313/321 7 35%

20 100%

DOMESTIC PIAVE


BHMS330

90/90 15 83,33%

90/92 3 16,66%

18 99,99%

BHMS349

151/153 4 22,22%

99/99 3 16,66%

99/151 4 22,22%

125/151 1 5,55%

99/145 5 27,77%

125/125 1 5,55%

18 99,97%

BHMS429

177/193 1 5,55%

195/195 10 55,55%

195/201 1 5,55%

191/195 5 27,77%

195/211 1 5,55%

18 99,97%

Ssa197

137/177 3 16,66%

177/181 2 11,11%

157/181 1 5,55%

181/181 1 5,55%

157/177 3 16,66%

137/185 2 11,11%

131/177 1 5,55%

23

181/185 2 11,11%

137/181 1 5,55%

177/185 1 5,55%

137/185 1 5,55%

18 99,95%

SSa85

108/108 15 83,33%

108/112 1 5,55%

108/132 2 11,11%

18 99,99%

SSaD157

291/307 1 5,55%

247/303 2 11,11%

291/299 1 5,55%

247/303 2 11,11%

247/299 2 11,11%

299/307 1 5,55%

299/319 3 16,66%

291/319 1 5,55%

247/319 1 5,55%

299/303 1 5,55%

287/299 1 5,55%

299/315 1 5,55%

291/303 1 5,55%

18 99,94%

SSaD190

132/142 7 38,88%

132/132 9 50%

132/136 2 11,11%

18 99,99%

SsaD58

0/0 1 5,55%

24

319/319 6 33,33%

245/285 1 5,55%

245/245 2 11,11%

245/319 2 11,11%

285/311 3 16,66%

287/311 1 5,55%

311/311 2 11,11%

18 99,97%

SSaD85

182/214 5 27,77%

182/182 8 44,44%

182/196 2 11,11%

182/212 3 16,66%

18 99,98%

STR-2

359/359 9 50%

346/359 1 5,55%

333/341 2 11,11%

344/359 1 5,55%

341/359 1 5,55%

344/363 1 5,55%

337/339 1 5,55%

344/344 1 5,55%

350/359 1 5,55%

18 100%

Tap2B

313/313 11 61,11%

313/321 7 38,88%

18 99,99%

Il “Population Assignment” eseguito con Structure Harvester Web ha confermato l’attribuzione di

questo gruppo di campioni ad un numero di popolazioni variabile tra 3 e 4. Vedi immagine sottostante.

25

Il risultato è stato confermato dall’analisi bayesiana con STRUCTURE in grado di differenziare

correttamente gli esemplari già attribuiti in partenza ai ceppi Adige, Brenta e Piave con l’unica

eccezione dell’esemplare n. 60 (Pit tag barcode n. 968000004747805) erroneamente attribuito ai

campioni Adige ma appartenente geneticamente al ceppo Piave. E’ plausibile che l’erronea

attributizione fosse imputabile ad un riproduttore fuggito da una vasca o accidentalmente isnerito

nella vasca non corretta durante precedent pratiche gestionali.

L’immagine sottostante identifica chiaramente tre gruppi nell’ambito delle 56 marmorate inizialmente

selezionate con DNA mitocondriale e LDH (Fase 1) e successivamente tipizzate con microsatelliti a

livello di popolazione (Fase 2).

IMAGE 1

26

Considerando la bassa variabilità genetica evidenziata con l’analisi dei microsatelliti, è stata

effettuata una valutazione della diversità allelica dei singoli esemplari al fine di identificare possibili

accoppiamenti da effettuare nel corso delle prossime campagne ittiogeniche. Nella tabella sottostante

è riportato il numero di alleli determinati nei singoli esemplari (variabili tra 13 e 21); sono evidenziati

quelli a maggior variabilità. In verde gli esemplari a maggior variabilità genetica, in giallo quelli a

variabilità intermedia, in rosso gli ibridi da scartare.

individuo n alleli loci non amplificati

1 19

2 17 1 no

3 19

4 21 1 no

5 16 IBRIDO

6 21

7 17 1 no

8 18 1 no

9 19

10 19 1 no

11 21

12 18 IBRIDO

13 18

14 19

15 18

16 17 1 no

17 18

18 17 IBRIDO

19 20

20 17 1 no

21 13 1 no

22 19

23 17

24 19

25 18 1 no

26 16 1 no

27 15

27

28 18 1 no

29 16

30 19 1 no

31 17

32 19

33 18 1 no

34 19 2 no

35 18

36 19 1 no

37 18

38 18 1 no

39 19 1 no

40 19 1 no

41 16 2 no

42 14 1 no

43 16

44 16 1 no

45 16

46 17

47 17

48 20

49 16

50 19

51 21

52 18 1 no

53 20

54 21

55 16 IBRIDO

56 19 1 no

57 18

58 18

59 22

60 16 1 no

28

Relativamente agli ulteriori 169 esemplari appartenenti ai ceppi Cismon e Piave, le analisi di Fase 1

(mtDNA e LDH-C1) hanno evidenziato una differenza sostanziale tra i due diversi gruppi.

Nel gruppo Cismon, infatti, 25 su 84 esemplari sono risultati eterozigoti al locus LDH-C1, pur in

presenza di mtDNA “marmoratus” (MA) in tutti i pesci analizzati. La presenza negli esemplari ibridi dei

soli genotipi LDH eterozigoti 90/100, in assenza di quelli omozigoti atlantici 90/90, farebbe

propendere per una loro assegnazione ad ibridi di prima generazione (generazione F1) generati

dall’incrocio di femmine marmoratus con maschi atlantici o ibridi. Nella tabella sottostante è riportato

il quadro analitico con evidenziati in giallo gli esemplari da avviare alla carriera riproduttiva.

SAMPLE

NUMBER CODE LENGHT cm WEIGHT kg D-LOOP LDH-C1* SSa85 SSa197 STR15

1 1910251 37 0,675 MA ME 105 187/191 219/227

2 1971917 37 0,525 MA ETER

3 2036581 45 1,11 MA ME 105/113 138/150 219/227

4 1936462 42 0,775 MA ME 105 165/178 219

5 1841077 35 0,675 MA ME 105 200/232 219

6 2019401 46 1,195 MA ME 105 189 219

7 1866632 43 0,855 MA ME 105 146/179 219

8 1819445 45 1,025 MA ME 105/113 166/179 219

9 1937888 34 0,38 MA ETER

10 1948881 34 0,36 MA ETER

11 1990803 36 0,52 MA ETER

12 1959111 44 1,05 MA ETER

13 1947234 42 1,055 MA ETER

14 1725244 32 0,395 MA ME 105/113 rifare 219/227

15 1900413 40 0,84 MA ETER

16 1825241 41 0,685 MA ME 105 165/182 219

17 1924464 42 0,935 MA ME 105 146 219

18 1949263 42 0,9 MA ME rifare 165/186 219

19 1752922 43 0,985 MA ETER

20 1991222 40 0,695 MA ME 105 178/190 219

21 2038294 42 0,89 MA ME 105 165/186 219

22 1974549 46 1,235 MA ETER

29

23 1967632 40 0,765 MA ME 105 165/190 219

24 1944455 40 0,7 MA ME 105/113 138/165 219

25 1945699 45 0,96 MA ME 105 190/198 219

26 1910354 34 0,555 MA ME 105/113 165/206 219/227

27 1931664 56 2,5 MA ME 105 185/189 219

28 1954799 47 1,235 MA ME 105 177/189 219

29 2017761 40 0,705 MA /

30 2037733 41 0,8 MA ME 105 189/189 219

31 19522688 40 0,71 MA ME 105 146/198 219

32 1992492 35 0,6 MA ME 105/113 189/206

? 219/227

33 1720248 39 0,69 MA ME 105/113

? O 115 149/181 219

34 1797981 45 1,5 MA ETER

35 2038335 50 1,325 MA ME 105 146/177 219

36 2016794 44 0,97 MA ME 105 189/206 171/219

37 1913666 41 0,905 MA ETER

38 1976178 35 0,53 MA ETER

39 1951130 35 0,535 MA ME 105 rifare 171/219

40 1945926 43 0,875 MA ME 105 138/189 171/219

41 1810615 34 0,445 MA ETER

42 1757262 43 0,875 MA ME 105 164/176 171/219

43 1960089 41 0,84 MA ME 105 164/176 171/219

44 2011792 46 1,41 MA ME 105 136/164 171/219

45 2616146 40 0,725 MA ME 105 145/185 171/219

46 1888482 53 1,825 MA ME 100 145 171/219

47 1967202 40 0,52 MA ME 105 181/189 171/219

48 1908757 39 0,775 MA ETER

49 1819454 34 0,455 MA ETER

50 1905158 40 ? MA ME 105 145/189 171/219

51 1443702 45 1,025 MA ME 105/113 148/176 171/219

52 1757852 47 1,1 MA ME 105 DA FARE

30

53 2015119 39 0,7 MA ETER

54 1815207 36 0,49 MA /

55 1807966 52 1,56 MA ME 105 rifare 171/219

56 1951741 56 2,27 MA ME 105 145 171/219

57 1955550 49 1,335 MA ME 105 145 171/219

58 1805424 45 1,04 MA ME 105 149/205

? 171/219

59 1952870 42 0,87 MA ETER

171/219

60 1757076 45 1,035 MA ME 105 145/189 171/219

61 1820708 44 0,97 MA ETER

62 2017644 36 0,525 MA ME 105 164/189

? 171/219

63 1954308 34 0,445 MA ME 105 189/197 171/219

64 1935300 36 0,54 MA /

65 1876275 51 1,6 MA ME 105 181/189 171/219

66 1936050 43 0,825 MA ME 100/108 189/205 171/219

67 1828071 45 1,235 MA ETER

68 1889656 45 1,07 MA ME 105 189/213 171/219

69 1912164 42 0,905 MA ETER

70 2014442 46 0,96 MA ETER

71 1955563 35 0,49 MA /

72 1909081 39 0,595 MA ETER

73 1948803 41 0,785 MA ME 105 181/189 171/219

74 1931470 33 0,49 MA ETER

75 1778271 33 0,46 MA ETER

76 1910226 48 1,175 MA ME 105 189 171/219

77 1930561 41 0,895 MA ME 105 189/213 171/219

78 1851063 43 0,84 MA ME 105 164/180 171/219

79 1821695 37 0,73 MA ME 105 177/189 219

80 1781363 33 0,405 MA ME 105/113 189/197 219/227

81 1916523 39 0,818 MA ETER

82 1766616 33 0,39 MA ME 105 177/189 219

31

83 1935257 38 0,66 MA ME 105 164/180 219

84 2015624 36 0,565 MA ME 105 164/180 219

Lo stesso approccio è stato eseguito su 85 esemplari appartenenti al ceppo Piave. In questo caso la

percentuale di marmorate pure ai marcatori D-Loop ed LDH è risultata dell’87%. Settantaquattro

esemplari su un totale di 85 analizzati sono utilizzabili in pratiche ittiogeniche. Gli esemplari da

avviare alla carriera riproduttiva sono evidenziati in giallo nella tabella sottostante.

SAMPLE

NUMBER CODE LENGHT cm WEIGHT kg D-LOOP LDH-C1* SSa85 SSa197 STR15

85 1825414 57 0,625 MA ME 105/113 144/180 219

86 1955725 43 0,795 MA ME 105 144/180 219

87 1945756 48 1,34 MA ME 105 180/184 219/229

88 1950078 54 1,8 MA ME 105 144/184 219/229

89 1950910 39 0,66 MA ME 105/113 144/180 219/227

90 2037561 55 1,88 MA ME 100/108 156/180 219

91 1915335 47 1,41 MA ME 105 144/184 219/229

92 1916583 48 1,395 MA ME 105 180/184 220?

93 1908492 47 1,1 MA ME 105/113 180/184 220?

94 1889766 50 1,445 MA ME 105/113 144/184 220?

95 1907291 38 0,665 MA ME 105/113 176/180 228/230?

96 1825868 42 0,85 MA ME 105 180/184 219/227

97 1908492 44 0,955 MA ME 105 144/180 220/230

98 1811447 48 1,59 MA ME 105 156/180 rifare

99 1990801 47 1,21 MA ME 105 184/188 219/227

100 1843876 51 1,575 MA ME 105 156/180 219

101 1816235 53 1,79 MA ETER

102 1913269 44 0,9 MA ATL

103 1888815 37 0,72 MA ME 105 176/180 219/227

104 1971694 52 1,83 MA ME 105 180 219

105 1889295 50 1,56 MA ME 105 132/176 219

106 1946858 47 1,31 MA ME 105/111 180 219

107 1867477 50 1,428 MA ME 105/113 176/180 219

32

108 1977368 48 1,425 MA ME 105 180/184 219

109 1907036 53 1,63 MA ME 105/113 144 219

110 1951134 47 1,29 MA ME 105/113 180 219

111 1890678 41 0,55 MA ME 110/112 144 219

112 1890484 45 1,085 MA ATL

113 1888431 52 1,625 MA ME 105/113 144/184 219/229

114 2013281 37 0,555 MA ME 105 180/184 171/219

115 1811683 51 1,555 MA ME 105 144/184 171/219

116 1975730 54 1,32 MA ME 105 144/184 171/219

117 1972028 59 2,285 MA ME 105/113 144 171/219

118 1991478 46 1,115 MA ME 105 144/176 171/219

119 1950102 48 1,64 MA ME 105 180 171/219

120 1992057 43 1,01 MA ME 105 192/200 171/219

121 2038133 46 1,08 MA ME 105 176/184 171/219

122 1971105 45 1,145 MA ME 105 176/180 219/229

123 1922674 44 1 MA ME 105 144/176 219/229

124 1857300 49 1,395 MA ME 105/113 144/180 171/219

125 1971603 44 1,035 MA ME 105/113 180/184 171/219

126 1825763 46 1,295 MA ME 105 144/176 171/219

127 1826384 44 1,143 MA ME 105 144 171/219

128 2016077 52 1,47 MA ME 105/113 144 171/219

129 1856077 53 1,7 MA ME 105/113 144 171/219

130 1912067 48 1,395 MA ME 105/113 176/180 171/219

131 1868099 44 0,935 MA ETER

132 1911249 51 1,815 MA ME 105 176/180 219

133 1974237 41 1 MA ME 105/113 180 219/227

134 1929996 47 1,8 MA ME 105/113 181/184 219/227

135 1953878 45 1,14 MA ME 105 182/186 219

136 1953197 52 1,795 MA ETER

137 1757775 50 1,71 MA ETER

138 1968444 44 1,01 MA ETER

139 1932780 46 1,09 MA ME 105 140/176 219/227

33

140 1934735 47 1,295 MA ETER

141 1961311 44 0,985 MA ME 105/113 176/180 219/229

142 1919466 47 1,39 MA ME 105/113 rifare 219

143 1966315 51 1,755 MA ETER

144 1959843 51 1 MA ETER

145 1818898 41 0,777 MA ETER

146 1889618 52 1,13 MA ME 105 rifare 219

147 1973898 47 1,2 MA ME 105 144/180 219/227

148 1961954 43 1,075 MA ME 105/113 90/94 227/229

149 1990392 52 1,79 MA ME 105/113 180 219

150 1959449 50 1,?50 MA ME 105/113 144/180 171/219

151 2015056 52 1,65 MA ME 105/113 144/176 171/219

152 1908064 49 1,37 MA ME 105/113 144 171/219

153 1909610 50 1,52 MA ME 105 180/184 171/219

154 1961717 52 1,83 MA ME 105/113 144/176 171/219

155 1888174 45 1,19 MA ME 105/113 144/176 171/219

156 1973055 56 2,9 MA ME 105 144/184 171/219

157 1768571 44 1,09 MA ME rifare 176/180 171/219

158 2038205 45 1,1 MA ME 105 144/184 219/229

159 1812568 51 1,87 MA ME 105/113 144/184 219/229

160 1889801 43 0,95 MA ME 105/113 180/184 219/229

161 1888785 43 0,835 MA ME 113 180/184 219/229

162 1955741 39 0,735 MA ME 105 176/180 171/219

163 1976864 47 1,28 MA ME 105 144/184 171/219

164 1962136 40 0,965 MA ME 105 184 171/219

165 2018053 48 1,33 MA ME 105 176/180 171/219

166 1848122 47 1,485 MA ME 105 144/180 219/229

167 1810431 48 1,33 MA ME 105/113 144/184 171/219

168 1960518 46 1,34 MA ME 113 144/180 171/219

169 1968843 40 0,76 MA ME 105/113 180/184 171/219

Per quanto concerne i marcatori microsatellite è bene precisare che su questo lotto il numero di

marcatori analizzato non consente, al momento attuale, valutazioni conclusive sui livelli di variabilità

34

genetica. Su questo lotto è infatti in corso un’ulteriore fase sperimentale, non prevista inizialmente,

di messa a punto di ulteriori loci microsatellite al fine di aumentare il potere di risoluzione analitica

da associare alle pratiche di crioconservazione già in atto presso l’impianto di Valdastico.

Prof. Francesco Nonnis Marzano

Spin Off Accademico Gen Tech e Università Parma

Parma, Ottobre 2015

35

CRIOCONSERVAZIONE DEL SEME DI TROTA MARMORATA DI ALLEVAMENTO

L'attività principale effettuata in collaborazione con la Gen Tech srl, spin off, è stata quella di fornire

i campioni di sperma e tessuto alla Cryogenetics, coordinare i processi di fecondazione con il

materiale crioconservato e valutare la sopravvivenza del materiale prodotto.

Tutto il lavoro è stato eseguito presso il Centro Ittico Sperimentale Valdastico.

Date Attività

11 novembre 2013

La raccolta di campioni genetici di trota marmorata

per la crioconservazione e la pianificazione degli

incroci per ottenere la massima variabilità genetica.

27 novembre 2013 Controllo della maturità dei maschi per la raccolta

dello sperma.

9 dicembre 2013 Raccolta dello sperma dai maschi di trota di

marmorata e spedizione in Norvegia a Cryogenetics.

20 dicembre 2013

Recupero del serbatoio criogenico all'Università di

Parma con lo sperma congelato trota marmorata,

provenienti dalla Norvegia - Cryogenetics.

20 dicembre 2013 Trasporto del serbatoio criogenico al Centro Ittico

Valdastico.

23 dicembre 2013 Fecondazione delle uova di trota marmorata.

30 dicembre 2013 Processo e controllo di fecondazione delle uova di

trota marmorata

7 gennaio 2014 Processo e controllo di fecondazione delle uova di

trota marmorata


trota marmorata.


trota marmorata.

04 gennaio 2014 Controllo di fecondazione delle uova di trota

marmorata.

Processo di fecondazione delle uova di trote marmorata è stato eseguito come indicato dal specifico

protocollo fornito dalla Cryogenetics. La maggior parte delle femmine utilizzate (raccolta di tessuto

in data 11.11.2013) sono state studiate analizzando una decina di loci polimorfici che consente una

diagnosi più particolareggiata, caratterizzata da un maggiore potere di risoluzione per

l’identificazione di ibridi.

36

Raccolta dello sperma dai maschi maturi

Attività durante le prove di fecondazione. In primo piano il serbatoio criogenico con lo sperma

congelato.

In seguito vengono riportati i dati relativi ai campioni di sperma raccolti di ogni maschio di trota

marmorata per pianificare la conservazione a lungo termine e successivo utilizzo nelle fecondazioni.

Le uova fecondate con lo sperma crioconservato sono state incubate in embrionatori separati per la

corretta tracciabilità dei lotti e successivo controllo del tasso di fecondazione.

37

Il tasso di fertilizzazione con lo sperma

crioconservato, è stato stimato immergendo in acido

acetico le uova per qualche minuto, permettendo cosi

di sottolineare gli embrioni in via di sviluppo dopo

7/10 giorni dalla fecondazione e contare il numero di

embrioni in via di sviluppo.

Le uova sono state raccolte a random dei diversi incubatori in un numero di 30/50 uova ogni volta.

Nella fotografia si evidenziano nelle uova immerse in

acido acetico gli embrioni di colore bianco; il tasso di

fecondazione risulta elevato.

Nella fotografia si evidenziano uova immerse in

acido acetico con pochissimi embrioni; il tasso di

fecondazione risulta molto basso.

In totale, un numero di 16.500 uova sono stati utilizzati durante le prove di fecondazione con lo

sperma crioconservato. I risultati finali sono buoni dati relativi tasso di fecondazione relative a diversi

maschi e femmine, sono in seguito elencati

38

Per il calcolo della percentuale di fecondazione non sono state considerate le uova che evidenziavano

qualche alterazione. Le uova dei lotti con tasso di fecondazione pari al 0% sono state eliminate.

Una piccola quantità di uova è stata fecondata utilizzando sperma fresco di trota marmorata, come

gruppo di controllo. La percentuale di fecondazione con sperma fresco è risultata tra il 40 e l'70%.

Il materiale prodotto rimane in accrescimento in impianto con l’obiettivo di poter utilizzarli come

futuri riproduttori.

Lo sperma congelato restante rimarrà fino a dicembre 2015 in Norvegia - Cryogenetics; verrà

utilizzato se continuerà l’nel periodo di fecondazione 2015/2016.

Questo primo processo di fecondazione, eseguita durante 2013/2014, utilizzando sperma

crioconservato è stato uno strumento innovativo, utile a migliorare il protocollo di allevamento e

conservazione della variabilità genetica di questa specie endemica italiana.

Le nuove pratiche impegnate in Impianto prevedono che

lo sperma fresco venga raccolto in mattina conservandolo

a 4°C. Questo comporta meno stress per i maschi che

tornano immediatamente nelle vasche.

Lo sperma fresco può essere stoccato e conservato fino a

14 giorni con l’utilizzo di specifiche sostanze chimiche

per l'uso durante giorni successivi.

Il fotometro ci permette di controllare la concentrazione

di spermatozoi - n. di cellule*109/ml di liquido seminale -

di ogni maschio che viene adoperato; ci permette di

scartare i maschi poco fertili e individuare il rapporto

spermatozoi/uovo più idoneo da impiegare durante la

fecondazione.

In seguito si allega il protocollo da noi sviluppato per una

corretta fecondazione delle uova di salmonidi sia con

sperma fresco sia crioconservato. L’impiego di questa metodica si verifica:

A - corretto rapporto spermatozoi/uovo (senza competizione spermatica)

B - Tutti spermatozoi viene attivato allo stesso tempo

C - Possibilità di decidere allevamento selezionato di due pesci – FAMIGLIE

D - Molto meno stress per i pesci (meno gestione)

PROTOCOLLO FECONDAZIONE UOVA DI SALMONIDI

E’ stato stabilito un protocollo operativo per procedere correttamente con la fecondazione delle uova

come di seguito specificato:

Pescare gli animali, leggere il codice del microchip, metterli in un mastello con acqua pulita ed

anestetico;

Spremere un maschio alla volta

e conservare il seme in una o più

flask, che andranno tenute in

frigo poste nell’oscillatore, al

fine di mantenere ossigenate

tutte le cellule;

Accendere il fotometro

40

e tararlo premendo ZERO

Dal totale del liquido spermatico di ogni maschio prelevare uno o più campioni per effettuare le conte

cellulari con il fotometro

Preparare il dosatore di fisiologica fissato su quasi 4,00 ml

Aspirare dal contenitore di sperma con la micropipetta da 01 µl, premuta fino alla tacca

gialla.

- Scaricare il contenuto nella microprovetta, facendo scivolare il liquido lungo la

parete, in modo da non causare salti, e premendo fino in fondo, in modo da scaricare tutto il contenuto.

41

Riempire la microprovetta con fisiologica prelevandola dal dosatore

Agitare dolcemente la microprovetta ed inserirla nell’apposito alloggiamento;

Premere RESULT, comparirà un valore relativo al n. di cellule*109/ml di liquido seminale.

Se inferiore a 5, significa che il maschio non è tanto fertile per cui non sarebbe consigliabile il suo

utilizzo.

Lo sperma si può conservare in frigorifero per alcuni giorni ponendolo in un oscillatore, che mantiene

sempre aerate le cellule, e dopo averlo diluito con AQUABOOST EXTENDER.

42

DILUIZIONE:

- Calcolare il volume di AQUABOOST DILUTOR richiesto utilizzando il foglio di calcolo ‘Dilutor

Calculation’;

- L’acqua distillata da usare per la preparazione del DILUTOR deve essere pre-raffreddata a 4-5 °C;

- Preparare il DILUTOR: una busta/litro di acqua distillata

- Misurare la concentrazione dello sperma da usare nel Fotometro;

- Per ciascun maschio inserire la concentrazione e il volume dello sperma nel foglio di calcolo;

- Aggiungere il volume di DILUTOR allo sperma come determinato dal foglio di calcolo (1g=1ml).

FERTILIZZAZIONE:

- Pescare le femmine, leggere il codice del microchip, metterli in un mastello con acqua pulita ed

anestetico;

-Prendere una femmina alla volta e spremerla delicatamente

- Raccogliere le uova di ogni femmina in un contenitore forato,

risciacquandole con soluzione salina al 9‰ per un minuto, per allontanare il liquido ovarico;

- E’ necessario aggiungere alle uova risciacquate

una piccola quantità di soluzione fisiologica al fine

di evitare la loro disidratazione;

43

- Eseguire la fecondazione aggiungendo lo sperma diluito alle uova, poi, mescolare delicatamente. In

alternativa si può aggiungere lo sperma crioconservato;

- Dopo 30 secondi attivare lo sperma aggiungendo acqua fresca o una soluzione attivante, si raccomanda

l’uso di Aquaboost ACTIVATOR per ottimizzare le condizioni di fecondazione;

- Preparare la soluzione ACTIVATOR come già descritto per AQUABOOST DILUTOR, 1 busta per 1 litro di

acqua distillata;

- Quando si usa la soluzione ACTIVATOR, ricoprire completamente le uova con essa.

- Attendere 3 minuti prima di risciacquare le uova con soluzione salina al 9‰ per un minuto;

- Disinfettare le uova con soluzione iodata (100 ppm di iodio attivo/litro) per 15-30 minuti.

- Trasferire le uova fecondate in schiuditoio

44

PROVE DI FOTOPERIODO

Nella proposta progettuale iniziale erano previste prove di fecondazione per la verifica del miglior

rapporto tra numero di spermatozoi e uova da fecondate; inoltre l’esame dei livelli di GHHI e GTHII

associati alla maturazione delle gonadi. Per problemi operativi, non è stato possibile, quest’anno,

effettuare nessuna delle due prove proposte.

Dal 01/10/2014 al 21/01/2015, in sostituzione dell’esame ormonale è stata effettuata una prova di

fotoperiodo, con l’obiettivo di sincronizzare l’emissione delle uova dei riproduttori e ottimizzare cosi la

gestione dei lotti e degli spazi in Impianto.

Per le prove di fotoperiodo sono stati impiegati 19 riproduttori, 13 femmine e 6 maschi; la temperatura

dell' acqua è rimasta su valori costanti di 10-11°C, mentre le condizioni di fotoperiodo prevedevano

specifiche ore di luce e di buio al giorno.

Purtroppo la mortalità degli esemplari utilizzati è stata altissima, coinvolgendo 17 esemplari sui 19 totali,

compromettendo così i risultati attesi.

L’attività sarà riprogrammata e verrà dettagliata in tutti i suoi particolari insieme con i risultati delle

prove di fecondazione che potranno essere svolte nella stagione riproduttiva 2015/2016. Gli esiti ottenuti

formeranno parte di una relazione integrativa specifica.

MARCATURA DI GIOVANILI DI TROTA MARMORATA CON ALIZARINE RED (ROSSO ALIZARINA)

La marcatura con alizarina, si presenta come un sistema molto valido per verificare il tasso riproduttivo in

ambiente naturale e controllare se i soggetti presenti sono conseguenza del solo ripopolamento (quindi

senza popolazioni riproduttive in natura).

Il rosso Alizarina è comunemente utilizzato per identificare la presenza di calcio nei tessuti. Questa

molecola, infatti, si lega agli ioni di calcio, con il quale, grazie ad un processo di chelazione crea un

complesso stabile. Questo complesso è rifrangente e ne permette quindi la sua facile identificazione,

lasciando quindi una marcatura perenne (rossa) all’interno del tessuto osseo.

Otoliti marcati con alizarina (destra)

dove si osserva la linea rossa più

evidente, rispetto ad uno non

marcato (sinistra).

Il prodotto è già stato autorizzato e

certificato dalla Biological Stain

Commission

(www.biologicalstaincommission.org)

per l’impiego come colorante in

campo biologico e quindi è permesso

per la marcatura dei giovani

salmonidi.

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Esistono diversi protocolli, per il suo impiego, per la marcatura sia delle uova embrionate che degli stadi

giovanili.

MARCATURA DELLE UOVA EMBRIONATE

Questa tecnica permette di marcare uova embrionate di salmonidi, alla comparsa degli occhi, grazie alla

capacità dell’alizarina di fissarsi al calcio degli otoliti, in sviluppo durante questa fase. La marcatura è

possibile quando le uova hanno uno sviluppo compreso tra il 65 % ed il 90 %. La soluzione per la marcatura

è realizzata sciogliendo 20 gr di Alizarina in 1 litro di soluzione. Il ph deve essere mantenuto prossimo a

7, la temperatura inferiore a 10 °C, e la concentrazione di ossigeno compreso tra 80 – 100 % della

saturazione.

Il bagno deve avere una durata di 6 ore per una adeguata marcatura. Una volta terminato il bagno, le

uova presentano un intenso colore rosso.

Uova marcate con alizarina.

Questa metodica permette

quindi di marcare tutti i pesci

prima di essere rilasciati in

ambiente naturale, anche se

liberati allo stadio di

avannotto a sacco vitellino

parzialmente riassorbito. E’

quindi possibile verificare la

riuscita del ripopolamento o

la percentuale di soggetti

selvatici o immessi, in base

alla presenza della

colorazione con alizarina,

anche a distanza di molto tempo.

Purtroppo non è stato possibile testare, almeno per il 2014, testare questa metodica con le uova di trota

marmorata, ma si spera di poterlo eseguire nel corso della stagione riproduttiva 2014/2015.

MARCATURA DEI GIOVANILI DI TROTA

Questo metodica è quella adottata per la marcatura di giovanili di salmonidi e prevede il seguente

protocollo:

1 – Bagno di circa 3 ore degli avannotti, ormai in fase di alimentazione (almeno 800 ° giorno) alla

concentrazione di 150 ppm di alizarina e alla densità massima simile a quella delle vasche di

allevamento. 2 dosi da 3 gr di alizarina permettono di realizzare 20 litri di soluzione per la marcatura.

46

2 – Durante il bagno l’acqua deve essere mantenuta ben ossigenata (100 – 150 %), con un ph superiore a

6,8 e temperatura inferiore a 12 °C.

3 – Una volta terminata la prova, il bagno sarà lasciato evaporare per poi essere eliminato come normale

rifiuto.

Dopo il bagno, i pesci saranno fatti crescere in una vasca separata per altri 30 giorni, in modo tale da

permettere il completo fissaggio dell’alizarina a livello del tessuto osseo e, in particolare, degli otoliti ed

eventualmente delle scaglie. Il rosso Alizarina permette di lasciare un “segno” perenne nel tessuto osseo

e quindi permette di identificare anche a distanza di molti anni un esemplare marcato.

Questa metodica è stata già provata con gli avannotti di trota marmorata in una prima fase nel corso del

2012 e poi nuovamente nel 2014. Nel 2012 è stato possibile verificare che gli esemplari presentavano

anche le scaglie marcate. Questo sarebbe un grande vantaggio perché eviterebbe la soppressione

dell’esemplare per la rimozione degli otoliti. Sarebbe però opportuno ripetere questa prova anche con

soggetti rilasciati in ambiente naturale, perché si potrebbe verificare la scomparsa della marcatura.

La mortalità durante il bagno colorante è stata comunque minima ed inferiore al 10 %.

Nel corso del 2014 è stata condotta una seconda prova di marcatura con alizarina con giovanili di trota

marmorata del peso medio di 1 gr per un totale di 8.000 esemplari.

Sono stati impiegati 25 g di alizarina per ottenere 170 litri di soluzione colorante, divisa in due grosse

vasche (70 l ciascuna) ed una piccola (30 l totale) con la funzione per vasca di accumulo per il piccolo

sistema a ricircolo.

Confezione di alizarina in polvere da 25 g (costo totale approssimativo 70 Euro).

La prova è stata condotta in data 7 maggio 2014, ed in una sola fase sono state

marcate 8000 trotelle di marmorata. Si tratta infatti, di un sistema veloce (ed

economico) perché in sole tre ore è stato marcato tutto il lotto indicato.

Di seguito, le diverse fasi dell’operazione:

1 – Vasche allestite prima della marcatura. Si nota la

presenza della bombola di ossigeno e degli ossigenatori.

47

2 – Vasche con le trotelle, prima di aggiungere il

colorante.

3 – Fase di marcatura con alizarina. Si nota

l’intensa aereazione/ossigenazione all’interno

delle vasche.

4 – Fase finale del processo di marcatura, con

l’aggiunta di acqua fresca e la diluizione

dell’alizarina.

Il procedimento è stato condotto dalle ore 13 alle ore 16 per tre ore, durante le quali è stato monitorato

costantemente il pH, la temperatura e la concentrazione di ossigeno disciolto (vedi dati)

ORARIO TEMPERATURA OSSIGENO % PH MORTALITÀ

13.00 12,8 °C 84 % 7,70 nessuna

14.00 13,1 °C 82 % 7,80 nessuna

15.00 13,4 °C 82 % 7,90 nessuna

16.00 13,7 °C 82 % 7,98 nessuna

Valori di riferimento nell’acqua di allevamento: temperatura 12,2 °C, Ossigeno 84 %, ph: 7,98.

La mortalità osservata è stata inferiore alle 0,5 %.

48

Dopo un’ulteriore fase di accrescimento di circa 45 giorni per permettere il completo fissaggio

dell’alizarina, i soggetti marcati sono stati rilasciati in ambiente. Solo un piccolo lotto di circa 50

esemplari è stato mantenuto in allevamento per la verifica dell’avvenuta marcatura e come campione di

riferimento.

I soggetti rilasciati il 17 giugno 2014 dovevano essere ricatturati nel corso del 2015 per verificare sia la

presenza della marcatura sia il loro adattamento e colonizzazione dell’ambiente naturale.

Purtroppo in data 21 luglio si sono verificati nelle zone di semina eventi meteorologici avversi che ha

provocato danni notevoli sul territorio, coinvolgendo, tra l’altro, la troticoltura “La Peschiera di Velo

d’Astico. Questo evento non ci ha permesso il recupero nei posti di semina e dintorni degli esemplari

marcati.

Dott. Armando Piccinini

Spin Off Accademico Gen Tech – Parma

Parma, Ottobre 2015

49

PRODUZIONE DI TROTA FARIO STERILI – TRIPOIDI

Attività presso il Centro Ittico di Valdastico

E’ stata richiesta e fornita assistenza tecnica per eseguire prove sperimentali di produzione di trote fario

sterili (triploidi) con trattamento pressorio di uova fecondate a mezzo della nuova macchina pressoria

presente presso il centro per verificare la fattibilità e l’efficienza di tale attrezzo, e redatto un protocollo

tecnico applicativo per una produzione massiva di trote fario triploidi presentanti condizioni di sterilità.

Cenni del metodo di produzione di fario sterile

Per chiarire il principio per cui con il metodo dello shock pressorio su uova fecondate di salmonidi si

possono ottenere soggetti triploidi (con condizione di sterilità), è bene ricordare brevemente cosa

avviene nell’uovo al momento della fecondazione: si ha l’incontro tra uno spermatozoo,

con corredo aploide (n) di cromosomi monocromatidici, ed un uovo bloccato alla metafase della seconda

divisione meiotica (ovocita secondario), recanteun corredo aploide (n) di cromosomi dicromatidici. Con

l’ingresso del nucleo spermatico nell’ovocita, si ha la ripresa della meiosi ovocitaria, con disgiunzione dei

cromatidi fratelli, e la segregazione dei cromosomi monocromatidici nel pronucleo della cellula uovo e nel

secondo globulo polare. Dopo l’espulsione di quest’ultimo, avviene la fusione tra i pronuclei femminile e

maschile con formazione dello zigote diploide (2n), dotato di un doppio corredo di cromosomi

monocromatidici. Prende, quindi, l’avvio la prima segmentazione che, come una normale mitosi, segrega

un’identica copia del corredo cromosomico dello zigote nei due primi blastomeri i quali, a loro volta, si

moltiplicheranno per dar origine al futuro individuo (2n).

L’applicazione dello shock pressorio prevede di impedire la 2° meiosi che segue la fecondazione,

provocando la mancata espulsione del globulo polare (n) e la sua conseguente inglobazione nel nucleo,

generando un soggetto triploide. La condizione di triploidia nei salmonidi induce una sterilità di tipo

gonadico, per disgenesia ovarica nelle femmine (mancato/ridotto sviluppo dell’ovario), e per

spermatogenesi abortiva nei maschi (mancata maturazione degli spermatozoi).

Processo di fecondazione e sviluppo normale

50

Attuazione della triploidizzazione mediante shock pressorio

L’applicazione dello shock pressorio deve tener conto fondamentalmente per una buona riuscita

dell’induzione della triploidia delle seguenti principali variabili:

1) Qualità delle uova

2) Quantità delle uova trattate simultaneamente

3) Temperatura dell’acqua

4) Intervallo di tempo intercorrente fra fecondazione e applicazione dello shock

5) Valore di pressione applicato per lo shock

6) Tempo di durata dello shock

7) Capacità gestionali degli operatori

La diagnosi della triploidia può essere eseguita con varie metodiche, ma quella che sintetizza

maggiormente precisione, accuratezza, oggettività, automazione, numerosità del campione e costo, è

rappresentata dalla citofluorimetria a flusso; nei salmonidi tale analisi può essere eseguita sia su una

porzione di pinna caudale (minima lunghezza trotella 5 cm ), sia sugli avannotti in toto fra il ca 5 e 12

gg dalla schiusa (a ca 10°CT) prima di una eccessiva pigmentazione, sia sul plasma per singolo soggetto

(minima lunghezza ca 8 cm). E’ consigliato per avere una rappresentatività statistica della popolazione

eseguire la diagnosi su almeno 30 soggetti, mentre 150 soggetti rappresentano il massimo numero

rappresentativo.

Il disegno sperimentale applicato nel contesto per effettuare le prove di triploidizzazione ha previsto le

seguenti fasi :

a) La metodica è recente ed ancora poco diffusa nel contesto nazionale e europeo, le aziende di

produzione sono reticenti a fornire dati applicativi, ci sono variabili sito-specifiche che possono

modulare i risultati, perciò si è provveduto a fare una ricognizione della bibliografia tecnica

dell’argomento ed a estrapolare i valori maggiormente attendibili per pianificare un disegno

sperimentale dei parametri di progetto.

b) Sono stati individuati due allevamenti fornitori di uova di trota fario per eseguire le prove, non

essendo disponibili presso il centro, il Centro Ittico di Bolzano Bellunese (BL) dell’Amministrazione

51

Provinciale di Belluno e gestito dalla Coop Il Parco, e la Troticoltura Valsugana di Grigno (TN).

Ambedue sono riconosciute indenni da SEV e NEI.

c) In due giorni diversi, nelle due aziende, sono state eseguite le operazioni di raccolta dei gameti,

uova e sperma, (mezzo di normale spremitura dei pesci), e in giornata avveniva il loro trasporto

(uova in soluzione acquosa salina 0,9 %; sperma in capsule petri refrigerate) presso il Centro Ittico

di Valdastico.

d) All’arrivo al centro le uova venivano conteggiate e divise nei gruppi sperimentali, quindi fecondate

e successivamente trattate con lo shock pressorio secondo lo schema sperimentale prefissato

e) I gruppi sperimentali sono stati incubati e allevati separati presso il Centro Ittico di Valdastico,

fino alla taglia idonea per l’analisi della triploidia, eseguita sul plasma a mezzo di prelievo

individuale dalla vena caudale (metodo consigliato, nel contesto, dal laboratorio di analisi) .

f) I campioni di plasma (da 24 a 30 pesci per gruppo) sono stati analizzati presso il laboratorio dell’

UO Patologia Clinica ed Ematologia dell’IZS delle Venezie (Legnaro,PD), a mezzo della metodica di

Citofluorimetria a Flusso (ref. Dr.ssa Stefani Annalisa)

Schema sperimentale e risultati

gruppo provenienza n°

uova

T°C

acqua

Intertempo*

minuti

tempo

shock

minuti

valore

shock

pressione

Bar

%

sopravvivenza

a sacco riassorbito

n° pesci

analizzati plasma

%

Tri

ploidia assoluta relativa al

controllo

1 Bolzano BL 9000 9,5 30 5 690 32,34 70,30 30 100

2 Bolzano BL 9000 9,5 30 5 690 25,63 55,71 30 100

3 Bolzano BL 9000 9,5 38 5 690 11,00 23,91 30 100

4 Bolzano BL 6000 9,5 40 5 650 21,00 45,65 30 100

5 Bolzano BL 6000 9,5 30 5 650 2,00 4,34 30 73

6 Bolzano BL 6000 9,5 30 5 650 1,00 2,17 nd* ___

7 Controllo

Bolzano BL 50000 9,5 ____ ___ ____ 46,00 ____ ___ ___

8 Troticoltura

Valsugana 3400 10 20 5 690 1,00 2,12 25 80,00

9 Troticoltura

Valsugana 3400 10 20 5 725 4,4 9,56 30 79,30

10 Troticoltura

Valsugana 3400 10 30 5 725 6 13,04 31 83,87

11 Troticoltura

Valsugana 3400 10 45 5 725 1,00 2,12 24 95,83

12

Controllo

Troticoltura

Valsugana

3400 10 ___ ___ ____ 47 _____ ____ __

Intertempo*= intervallo di tempo decorrente fra l’atto di fecondazione e l’inizio dell’applicazione dello shock; nd =

materiale non disponibile

52

Le prove sono state effettuate in due giorni diversi con una differenza di ca 20 gg (1° giorno per gruppi 1-7

e 2° giorno per 8-12 ). Le uova per i gruppi da 1 a 7 erano di diametro di ca 4 -4,5mm, per i gruppi 8-12

erano di diametro ca 3 mm

Analisi dei risultati

Dai risultati ottenuti si può evidenziare che :

• Il valore di sopravvivenza dei controlli (46% Bolzano Bellunese e 47% Troticoltura Valsugana), è

inferiore all’atteso, se confrontato con la media standard che di norma si collocano fra il 70 e

90%. La spiegazione più probabile sembra essere legata al fattore trasporto/tempo di trasporto

che per quanto sia stato eseguito seguendo un idoneo protocollo, ha probabilmente influito sulla

qualità finale dell’uovo diminuendo la resa alla fecondazione. Si noti che a distanza di ca 20gg fra

le due prove, e con una provenienza diversa la sopravvivenza dei controlli sono quasi uguali; ciò

sembra confermare l’ipotesi sopracitata

• La macchina pressoria è effettiva nell’indurre la condizione triploide in percentuale elevata,

seppur con valori differenti (da ca 73% a 100% ) in funzione sia delle diverse prove effettuate sia

di variabili aziendali (qualità gameti, numero di riproduttori utilizzati, manipolazione ecc…),

come da descrizione in bibliografia, sebbene nella trota fario i dati non sono numerosi come nella

iridea. Nelle produzioni massive commerciali di trota iridea triploide in Francia, viene riportato

come valore medio massimo ca il 98%.

Dalla tabella si nota come la prova effettuata con le uova della Troticoltura Valsugana, non ha

prodotto nessun valore del 100% di triploidia, sebbene alcuni valori di pressione e intertempo

testati erano riportati come effettivi da alcuni autori. E’ probabile che ciò sia dipeso dalla qualità

dei gameti, in particolare dalla sincronizzazione temporale non ottimale nella maturazione degli

ovociti (e quindi dalla variabilità individuale dei riproduttori), e questo avviene soprattutto

quando si utilizza per il trattamento un lotto con uova provenienti da molti riproduttori.

• L’induzione della triploidia provoca sempre (come riportato in bibliografia) una minore

percentuale di sopravvivenza rispetto al controllo, sebbene con una variabilità che può essere

ampia in funzione di diversi parametri non ben controllabili (qualità gameti, età dei riproduttori

manipolazioni pre e post trattamento ecc…). Nel contesto il valore percentuale di sopravvivenza

sebbene appaia basso in assoluto, deve essere confrontato con il rispettivo valore relativo al

controllo; i migliori valori relativi ottenuti (con il 100% di triploidia) di ca 72 e 55 corrispondono al

valore di pressione di 690 bar con 30 minuti di intertempo a 10°C, che rientrano nell’intervallo

considerato ottimale in bibliografia.

Sebbene alcuni Autori hanno ottenuto valori di sopravvivenza relativa maggiori (fino a 90%), si

deve tener conto dell’effetto trasporto dei gameti effettuato, che ha sicuramente influito in modo

significativo. La minor sopravvivenza ottenuta nelle prove eseguite il materiale della Troticoltura

Valsugana, potrebbe correlarsi, oltre che con i trattamenti, anche con la significativa minor

dimensione delle uova (diametro ca 3 mm), le quali possono essere risultate maggiormente

sensibili alle manipolazioni.

53

• Il sangue è un tessuto idoneo su cui fare la diagnosi di ploidia, ha il vantaggio di non far

sopprimere gli animali (in base alla capacità dell’operatore), e di facilitare i tempi di diagnosi (ca

1-2 gg per 100 cp). Per contro, si deve attendere che il pesce raggiunga la taglia idonea al

prelievo, ed il prelievo deve essere eseguito da personale specializzato .

Conclusioni

• Le prove effettuate danno indicazioni che la macchina pressoria è efficiente nell’indurre la

poliploidia (la triploidia nel contesto).

• I migliori valori da applicare per ottenere la triploidia in relazione alla sopravvivenza ed alle

condizioni testate sono i seguenti:

intertempo (dalla fecondazione all’inizio dello shock , T°C 9,5-10°): 30 minuti

valore di pressione applicato: 690 bar

tempo di shock : 5 minuti

• La percentuale di triploidia è maggiore, quanto minore è il numero di femmine utilizzato per

produrre il lotto di uova da sottoporre al trattamento.

• Per ottenere le massime percentuali di sopravvivenza dovrebbe essere eseguita la spremitura dei

riproduttori e la fecondazione in loco, ove avviene il trattamento pressorio.

Borghesan Dr.Fabio

BIBLIOGRAFIA CITATA

A. Sabbadini, M. S. (2007). Il Progetto temolo in Friuli Venezia Giulia. Quaderni ETP .

Andreas Meraner, A. G. (2013). Genetica di conservazione dell'ittiofauna d'acqua dolce con particolare

attenzione ai Salmonidi del Nord - Adriatico . Quaderni ETP - Journal of Freschwater Biology .

54

ALLEGATI

GIORNATE INFORMATIVE/FORMATIVE TEORICO-PRATICHE PER LE ASSOCIAZIONI DI PESCA

Principali problematiche sanitarie nell’allevamento delle specie ittiche d’acqua dolce

Amedeo Manfrin - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie

Biosicurezza e benessere animale

Andrea Fabris - Veterinario A.P.I.

Normativa vigente in materia di immissioni nelle acque pubbliche e laghetti di pesca sportiva

Manuela Dalla Pozza, Chiara Ceolin - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie;

Ruolo dell’ULSS nel settore della Pesca –

Interventi dei Servizi Veterinari Sanità Animale

Daniele Boffo - Ulss 9, Marcello Malacarne - Ulss 2 e Michele Zaghi - Ulss 16;

Approccio di gestione sostenibile per il mantenimento degli stock ittici autoctoni

Fabio Borghesan – Ittiologo, Consulente Veneto Agricoltura.

sezione innovazione e sviluppo - veneto agricoltura finale_dgr2570.pdf · 2 premessa l’azienda...

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