Laboratorio de Servicios de Fitopatología

Protocolos en Servicios de Micología

. Betty PazFitopatóloga

UN BUEN DIAGNÓSTICO Y CONTROL FITOSANITARIO COMIENZA CON UN ADECUADO MUESTREO EN LA FINCA

Servicios de Micología

• 1- A Quien está dirigidoEste servicio está dirigido a productores,

técnicos, estudiantes, empresas semilleristas, entre otros.

 • 2- Tipo de muestras: Tejido vegetal, suelo y sustrato, en casos

especiales se analiza humus. 

EXTRAER LA MUESTRA CUANDO LA LESIÓN SE ENCUENTRE EN SU FASE INICIAL

TOMA DE MUESTRAS VEGETALES• Elegir una planta en donde se observe el problema• Para cultivos anuales o perennes pequeños sacar

la muestra y/o planta entera• Para cultivos grandes, y síntomas localizados en:

flores, ramas, frutos, raíces, hojas, tomar la muestra con 1 ó 2 órganos afectados completos

• En cuanto a las muestras vegetales deben envolverse por separado en papel, se colocan en bolsa de polietileno limpias y se mantienen al resguardo del calor y la sequedad.

Es importante enviar la muestra al laboratorio a la mayor brevedad posible

Identificación de la muestra

• Nombre de la finca• Ubicación (localidad, mcpio, estado)• Fecha de colección• Nombre del colector y teléfono• Tipo de cultivo• Condiciones del terreno• Riego• Temperatura promedio, humedad y otros

de importancia para el interesado

Muestras de suelo

• Debe ser una muestra compuesta por sub-muestras simples tomando en cuenta la uniformidad del lote.

• La muestra de suelo para su análisis se procede a secarla al ambiente, durante unos 2 a 4 días dependiendo de la humedad que presente.

Representación gráfica de la toma de muestras de suelo

Ingreso de la muestra al laboratorio

• Es importante que el ingreso de las muestras al laboratorio de fitopatología debe realizarse a más tardar 24 horas después de haber sido extraída del campo y así garantizar que los síntomas que se observen en el laboratorio sean los mismos que se observaron en campo.

Procedimientos de Análisis

• Esterilización.En el laboratorio del INIA-Mérida se realiza mediante

el empleo del método físico con calor húmedo; para ello se emplea autoclave el cual debe cumplir con los siguientes parámetros en la esterilización:

15- 20 lb/pulg2 = 120°C Tiempo= 15-20minDebe esterilizarse: cajas petri, papel toalla, papel

filtro, vasos de vidrio, tubos de ensayo, pipetas, agua destilada.

El medio de cultivo que se usa en la mayoría de los casos es el PDA, con adición de ácido láctico para lograr un Ph de 5-6, ideal para la mayoría de los hongos.

Plantas enfermas

Observación de síntomas y dependiendo de ellos se toma la decisión del empleo del método más adecuado o del uso de varios de ellos: realización de cortes, raspados del tejido, Inducción al desarrollo miceliar, inducción a esporulación

Luego se procede a Lavar el material enfermo con agua corriente y secar.

Seleccionar al tejido vegetal afectado procurando que los trocitos queden de 0.3 a 0.5 cm de longitud.

Desinfectar los trocitos.Enjuagar los trocitos en 3 pasos de agua

destilada estéril y secarlos perfectamente, al secar bien, disminuyen las contaminaciones.

Pasar 4 a 5 secciones a una caja de Petri con PDA, sellado de la caja con cinta adhesiva e incubación de 20 a 25 oC.

Cuando ingresan tejidos con manchas foliares, chancros y pudriciones radiculares, tallos se realizan preparaciones microscópicas de las estructuras, con lactofenol

Cámara húmeda

Para tejidos con ausencia de señas de patógenosSe preparan cajas de Petri o cubetas con tapa, con

1 o 2 hojas de papel toalla estéril y humedecerlo con agua destilada estéril (cámara húmeda).

 Se pasa la sección del tejido infectado a la cámara Húmeda.

Después de 24-72 hrs, se observa con el microscopio estereoscópico, e toman las esporas con agujas de disección y se transfiere a una caja de Petri con PDA.

Cámara húmeda

Purificación de cepas

Es raro que al hacer una siembra o aislamiento, se obtenga solo al hongo deseado, normalmente también crecen microorganismos contaminantes de los cuales es necesario apartar al organismo de interés. Este proceso se denomina purificación y normal mente consiste en cortar puntas de micelio del borde de la colonia en crecimiento, mediante aguja de disección flameada. Esta pequeña porción del hongo y agar se deposita en otras cajas con medio de cultivo estéril y de esta forma se obtienen cultivos puros.

Purificación de cultivos

Desinfección

Los tejidos enfermos contienen normalmente diversidad de organismos que invaden los tejidos muertos por el patógeno. Estos contaminantes dificultan el aislamiento, por lo que generalmente es necesaria una desinfección previa a la siembra.

Desinfectantes más usados

Hipoclorito de sodio. El desinfectante más usado es el blanqueador de uso domestico (cloralex), basta mezclar una parte de esta sustancia en cinco partes de agua destilada para obtener el producto deseado ya que el blanqueador viene al 5-6%, es decir que normalmente se usa hipoclorito al 1-2%, el tiempo de exposición varía de 30 a 90 segundos; el material viejo o muy contaminado se puede tratar por 2 a 3 minutos siempre que no se elimine el patógeno.

Alcohol etílico. Se usa generalmente al 70% por periodos de 30 segundos.

Para su observación al microscopio compuesto, los hongos requieren ser preparados y montados en portaobjetos. En estudios preliminares o de rutina se hacen preparaciones temporales desechables

MONTAJE MEDIANTE CINTA ADHESIVAColocar una gota de agua u otro medio de montaje

en el centro de un portaobjetos.Cortar un trozo de cinta, 1 o 2 cm más grande que

la longitud del portaobjetos. Se Toma la cinta por los extremos con dos de los dedos, se deposita suavemente la parte engomada sobre la superficie del hospedante o crecimiento del hongo en medio de cultivo, sin presionar demasiado, para evitar tomar material en exceso u otras estructuras de las plantas, diferentes a lo que queremos muestrear y se procede a observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x.

CORTES DE CUERPOS FRUCTIFEROS

Se coloca el material enfermo bajo el microscopio de disección, se separa una porción superficial del tejido enfermo mediante un corte longitudinal procurando no dañar los cuerpos fungosos, esto facilitara los cortes de los cuerpos ya que solo manejaremos una pequeña porción de tejido, el tamaño de la muestra puede variar, pero se trata de dejar tiras de +/- 1 a 3 cm de largo por +/- 1 a 3 mm de ancho, con un grosor de +/- 0.5 a 2 mm; esto depende de muchos factores tales como el tamaño de los cuerpos a cortar, consistencia del tejido etc.

MEDIOS DE MONTAJE

Agua destilada. Útil para montajes temporales.

Lactofenol. Aunque existen otros medios, este es uno de los más usados por su fácil preparación y alta eficiencia.

•  

Procedimiento de lavado y desinfección de tejidos

Desinfección de tejidos con alcohol al 70% o con NAcl 1% por 2 min

Cortar con bisturí flameado en alcohol al 70%, sobre toalla de papel

Lavado con agua destilada estéril y escurrir

Sembrar en placa con medio bacteriostático

E. French

Cortes de tejidos

Muestras de suelo

En muestra seca:Se toman 10 gr de sueloSe colocan en 70 ml de agua destilada estérilSe lleva a agitaci{on por 2 horasSe toma el suelo con espátula y se siembra en medio de cultivo PDAIncubación Aislamiento con aguja de disección de las colonias que crecen del sueloObservación al microscopio compuestoIdentificación de géneros con las claves (Barnett y Hunter)

Metodología para determinación de Esclerocios

-Secar las muestras 3-4 días.- Pasar el suelo por un tamiz N° 10 (2mm) y almacenar 1/2

Kg.- Tomar 3 vasos de precipitado.- - Pesar 10 gr de suelo.- Agregar 60 ml de agua destilada,

agitar con varilla de vidrio durante 90 segundos.- Agregar 10 ml de cloro al 10% , agitar 15 segundos y

dejar reposar por 45 segundos.- - Pasar el sobrenadante por tamiz N° 30, lavar bien con

agua destilada recolectando las partículas más finas en el tamiz 80 y descartando el restante.- Recuperar las partículas del tamiz 80 mediante un lavado con agua destilada dejando caer estas partículas en un beaker con capacidad de 60 ml y papel filtro N° 1.

- - Dejar secar por 24 horas.

POR SU AMABLE ATENCIÓN