ESTEFANÍA OROZCO BETANCUR

DANIELA JARAMILLO LONDOÑO

Cancer Cancer is a heterogeneous disease

affecting all age groups, nationalities, and

socioeconomic classes

Cancer is a disease in which cells have

altered genetic processes as a result of

mutations. Mutations lead to gain or loss

of genetic functions that permit abnormal

proliferation, failure to undergo apoptosis

leading to cellular accumulation, or both.

OVARIAN CANCER

Malignant ovarian tumors are the leading cause of death from reproductive

tract cancer. The wide range of types and patterns of ovarian tumors is due

to the complexity of ovarian embryology and differences in tissues of origin.

Signs and Symptoms

Asymptomatic or experience only mild nonspecific gastrointestinal

symptoms or pelvic pressure.

Women with advanced malignant disease may experience abdominal

pain and bloating, and a palpable abdominal mass with ascites.

1. PIK3CA The protein encoded by this gene

represents the catalytic subunit, which

uses ATP to phosphorylate

PtdIns(Phosphatidylinositol), PtdIns4P

and PtdIns(4,5)P2. This gene has been

found to be oncogenic and has been

implicated in cervical cancers.

GENES

2. PI3K Phosphoinositide 3-kinases play an important role in a variety of

fundamental cellular processes and can be divided into three main classes,

defined by their substrate specificity and domain architecture.

Signaling pathway is critical in many aspects:

growth and cell survival

Metabolism

Protein synthesis

Transcription

3. PARP Nuclear enzyme poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)

It is part of the family of enzymes involved in various activities in response

to DNA damage in response to environmental stress

PARP inhibitors show response in BRCA1/2 mutation carriers in 30-45%

Ovarian cancer

Caused by

mutations

in DNA symptoms

Abdominal pain

Bloated

abdomen

Diagnosis

Internal

examination

CA125 blood test

Ultrasound

CT scan

Treatments

Surgery

Chemotheraoy

Gene therapy

Radiotherapy

• Epithelial

tumors ( *)

• Germ cell

tumors

• Stromal

tumors

Benign

Malignant

Types of

tumors

ObjectiveCombined inhibition of PI3K and PARP has been shown to be effective in

the treatment of preclinical models of breast cancer and prostate cancer

independent of BRCA or PIK3CA mutational status. However, the knowledge

about this combination treatment in ovarian cancer is limited. The aim of this

study was to evaluate the therapeutic effect of PI3K inhibitor BKM120 and

PARP inhibitor Olaparib on ovarian cancer cell lines bearing wild-type

PIK3CA genes.

Métodos 1. Cultivo celular

Se utilizaron diferentes líneas celulares

OVCAR8 tiene BRCA1metilado

OVCAR5 tiene wild-type BRCA1/2

OVCA433 tiene mutación deletérea de BRCA2

Se mantuvieron en medios estables.

2. Ensayo clono génico

Evaluar los efectos de las drogas sobre la proliferación de células

cancerígenas

Evaluar si una célula es capaz de dividirse y formar una colonia luego de

haber sido expuesta a un tratamiento.

3. Ensayo inhibidor del crecimiento y análisis de combinación de drogas

Evaluar viabilidad celular mediante un kit de conteo celular, se expresa

como la fracción entre la inhibición del crecimiento celular por acción de la

droga y las células tratadas durante el procedimiento.

4. Inmunoblot y aislamiento de proteínas

Las proteínas procedentes de extractos celulares son separadas por

electroforesis en gel según su tamaño, por medio de la técnica SDS-PAGE

poliacrilamida gel electroforesis. Tras la electroforesis las proteínas se

transfieren a un filtro, que se incuba con anticuerpos que reaccionan con la

proteína de interés. El anticuerpo es identificado por varios métodos y por

consecuente la proteína se ubica.

5. Análisis de apoptosis

Análisis de la cantidad de apoptosis producida en las células cancerígenas

ováricas utilizando tripsina, una coloración y yoduro de propidio (indicador

de células muertas), luego se hace análisis por citometría de flujo que

permite conocer la información simultánea de varios parámetros de cada

una de las células analizadas.

6. Ensayo cometa

Usada para medir el daño en el ADN de las células.

Se demuestra que el uso de una solución de lisis con proteinasa K durante

3 h y 10 min de corrido electroforético, permite obtener cometas

cuantificables de oocitos bovinos madurados in vitro que pueden ser

utilizados en estudios genotóxicos en este sistema celular.

7. Inmunofluorescencia

Usado para la determinación de proteínas, drogas y hormonas por la unión

del anticuerpo a una molécula de fluorocromo

Isotiocianato de Fluoresceína

Rodamina

Cianina

Cumarina

Se trata de sustancias que absorben la luz a una longitud de onda mayor

de 200 a 400nm y emiten una luz de onda de 400 a 700 nm

8. Transcripción reversa cuantitativa de la cadena de la polimerasa

Es una técnica de amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA o

indirecta de un RNA, presentes en mezclas de muy diversas fuentes.

Se basa en:

1. La desnaturalización del DNA para dar hebras sencillas,

2. hibridación especifica de la hebra sencilla con oligonucleótido(Primer) y

3. la replicación de la hebra sencilla por una DNA polimerasa a partir del

oligonucleótido anterior como cebador.

9. Información del paciente, preparación de tejido y cultivo ex vivo del tejido

con tumor del paciente

1. presentación del caso de una paciente (Ca 1rio de grado severo)

2. Ovarectomía bilateral

3. Obtención del tejido con tumor para el aislamiento del total de RNAs y

su uso como plantillas para la reacción de la transcripción reversa

usando un kit para generar cDNAs

4. Cultivo ex vivo

10. Histología e inmunohistoquímica

Es la identificación de un tejido(in situ) por medio de una interacción

especifica entre un antígeno y un anticuerpo donde el anticuerpo ha sido

visiblemente marcado, la célula se colorea para demostrar la presencia y

localización celular de una molécula de interés.

Fundamento:

Se hizo con la finalidad de saber el impacto

del tratamiento en la habilidad para reparar

las rupturas del DNA por parte de las

células cancerígenas de ovario

RESULTADOS

Células tratadas con BKM120

por 48 horas, análisis western

blot en las proteínas pAKT y

pS6RP. Vinculina como control

Células cancerígenas

fueron tratadas con los

inhibidores por 10 días

Efectos del BKM120 y Olaparib como agentes

individuales y en combinación en la

supervivencia de las células del cáncer de

ovario.

Análisis Western Blot.

El tratamiento

generó

incremento de

Cleaved PARP

que es un

marcador de

apoptosis activa

La (+) de ERK está relacionado con la regulación

a la baja de BRCA1/2 y BKM120 no tuvo efecto

y en el OVCAR8 no se expresó porque está

metilado

BKM120 (solo y en

combinación) redujo la

expresión de pS6RP

También redujo la

pAKT en OVCAR5 Y 8

Efectos del BKM120 y el Olaparib como

agentes individuales y en combinación en

la respuesta al DNA dañado en las células

cancerígenas

Ensayo cometa: intensidad para identificar

DNA dañado

Inmunofluorescencia

Integridad

Apoptosis

DISCUSSION

AUTHOR WHAT THEY SAID YES OR NO

C.K. Sun, F. Zhang, t. Xiang, Q. Chen,

T.K. Pandita, Y. Huang, et al

“It has been shown recently that

phosphorylation of S6RP confers PARP

inhibitor resistence in BRCA- deficient

cancer”

A. Juvekar, L.N Burga, H. Hu, E.P

Lunsford, Y.H Ibrahim, J. Balmana, et al

“ERK- dependent BRCA 1/2

downregulation has been shown to

account for sensitivity to PARP inhibition

in BRCA proficient triple negative breast

cáncer”

D. Wang et al “Recent study with PIK3CA mutant

ovarian cancer cells and PIK3CA mutant

ovarian cancer cells revealed that

irrespective of BRCA or PIK3CA

mutational status, ovarian cancer cells

with downreg of phosphorylated S6RP

following BKM120 or mTOR inhibitor

RAD001 exhibited impaired DNA damage

response and compromised homologous

recombination repair and were responsive

to PARP inhibition”

AUTHOR WHAT THEY SAID YES OR NO

Y.H Ibrahim et al, A. Juvekar et

al

“ Combined inhibition of PI3K

and PARP effectively blocked

cell proliferation and survival in

three in vitro ovarian cancer cell

line models and one patient-

derived ex vivo culture model of

ovarian cancer with wild type

PIK3CA genes. In accordance

with previous findings from

preclinical studies of breast

cancer”

Conlusions Combined therapy is promising for diverse types of cancers due to the posible

synergistic effect, therefore investigation can make a big impact on which cancerpathways may be suppresed in a better way than others.

The study of more combinations of many inhibitors of the cancer signalingpathway may lead to diverse posibbilities in cáncer treatment according to theactivation or inhibition of certain genes implicated in cancer effect wich may be different in every patient.

The use of predictive biomarkers such as phosphorylated S6RP can be promising to determine cell response to the cáncer treatments, therefore usedas a complement to determine the efficacy of the correspondant treatment.

This therapy may benefit not only ovarian cáncer but also other cáncer

associated genetic alterations, not limited to those with BRCA or PI3K

alterations.