RNA REGOLATORI Oltre ai fattori di regolazione proteici, anche alcuni particolari tipi di RNA possono contribuire alla regolazione dellespressione genica di un mRNA bersaglio, cambiandone la struttura secondaria o agendo sulla sua traduzione e degradazione. Il riboswitch Una prima semplice modalit di regolazione mediata da RNA la presenza nel filamento 5-UTR (regione importante per la modulazione della traduzione) di un elemento denominato riboswitch. Un riboswitch un dominio di RNA con una sequenza in grado di modificare la propria conformazione in base al legame di un elemento segnalatore, come un piccolo metabolita. Questo va a legarsi sulla cosiddetta regione aptamerica1, cambiando lappaiamento delle basi e/o la struttura secondaria e modulando in cis la traduzione e la degradazione del filamento. Un esempio nei batteri la produzione di glucosammina-6-P: lmRNA dellenzima che la sintetizza partendo da Fru-6P e Gln possiede una regione in grado di legare il prodotto enzimatico GlcN6P: il legame con il metabolita la fa diventare un ribozima attivo che catalizza il taglio dello stesso mRNA in cui contenuta, agendo con meccanismo a feedback negativo. I ncRNA Lappaiamento delle basi offre un meccanismo efficace perch un RNA controlli lattivit dellaltro. Questa regolazione avviene grazie ad alcuni tipi di ncRNA, RNA non codificanti che spesso assumono strutture secondarie complesse e sono codificati in regioni sia intra- che extra-geniche. Nel gruppo dei ncRNA possono essere distinte numerose famiglie:

lncRNA miRNA siRNA piRNA rasiRNA sRNA etc. 1 Una sequenza aptamerica una sequenza in grado di legare una molecola o una proteina.

Analizziamo ora alcuni dei meccanismi attraverso cui i ncRNA modulano lespressione genica. I miRNA e lRNA interference Un generico filamento antisenso in grado di bloccare la trascrizione semplicemente appaiandosi al suo filamento bersaglio complementare e impedendo la sintesi proteica. Oltre al semplice meccanismo sterico per, negli organismi si osserva un meccanismo di silenziamento indotto da un filamento antisenso pi complesso, mediato dai miRNA. I microRNA, miRNA (o stRNA, small temporal RNA), sono RNA regolatori a singolo filamento lunghi dalle 19 alle 25 bp; si stima che il genoma umano contenga circa 1000 siti codificanti miRNA. Sono in grado di appaiarsi con un RNA target, agendo da molecole guida nel silenziamento genico in un meccanismo noto come RNA interference.

Biogenesi dei miRNA I miRNA hanno origine da lunghi precursori primari, i pri-miRNA, che vengono trascritti dalla RNApol II; i pri-miRNA possiedono tratti autocomplementari, e assumono spontaneamente una struttura che contiene da una a sei forcine con appaiamenti imperfetti. I miRNA si possono distinguere in base alla localizzazione genomica in: miRNA esonici in trascritti non codificanti; miRNA intronici in trascritti non codificanti; miRNA intronici in trascritti codificanti. Il pri-miRNA deve andare incontro a diversi passaggi di maturazione: Nel Microprocessor Complex nucleare, Drosha, una RNasi III2 , riduce il pri-miRNA in frammenti precursori di circa 70-80 bp, i pre-miRNA3; i pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma dallExportin 5 nucleare; Dicer, unaltra RNasi III, riduce il pre-miRNA ad un solo doppio filamento di ~22 basi con estremit a singolo filamento (miRNA:miRNA*

duplex); infine una subunit di Dicer con attivit elicasica separa i due filamenti, liberando i miRNA. I miRNA maturi si rinvengono sempre come componenti del complesso RISC (RNA-Induced-

Silencing-Complex); secondo una serie di processi non del tutto chiariti, solo uno dei due filamenti del 2 Le RNasi III sono una famiglia di endonucleasi che agiscono su RNA a doppio filamento (dsRNA). 3 i pre-miRNA di origine intronica possono saltare questo passaggio.

Micro-RNA biogenesis1) miRNA vengono trascritti dal DNA da una RNApolimerasi II, come lunghi precursori primari (pri-miRNA)

-La maturazione dei miRNA richiede almenoaltri due passi di processazione:

-2) La ribonucleasi III Drosha taglia gli stem-loops dal pri-miRNA dando luogo a miRNAprecursori (pre-miRNA o stRNA) lunghi circa70-80 nucleotidi

3) Trasporto attraverso la membrana nucleare

4) Nel citoplasma il Dicer unendonucleasi ditipo III escinde il miRNA maturo (circa 22nucleotidi) dal stRNA

5) Helicase

6) RISC

duplex di miRNA verr incorporato in RISC, quello con lappaiamento pi stabile al 5, laltro verr degradato (miRNA*, indicato con lasterisco). Oltre ai miRNA nel complesso RISC si trovano proteine della famiglia Argonauta (Ago), che svolgono le funzioni di taglio/inibizione del complesso RISC. Azione dei miRNA I miRNA esercitano la loro funzione sia a livello trascrizionale (nel nucleo) che post-trascrizionale (nel citoplasma). A livello post-trascrizionale, RISC usa il miRNA come guida per analizzare lmRNA in cerca di piccole regioni di omologia. Sebbene non sia richiesto una totale complementariet, fondamentale il corretto appaiamento di una sequenza denominata miRNA seed, che comprende 7 nucleotidi dellmRNA in posizione 2-8 dallestremit 5 del miRNA. La sequenza di appaiamento sullmRNA target posta sulla 3-UTR4; ad ogni filamento si pu legare pi di un miRNA sia dello stesso tipo sia di tipi diversi con effetto cooperativo, ed ogni miRNA si pu appaiare a pi di un tipo di mRNA. Questo conferisce a questo meccanismo di regolazione una notevole potenzialit combinatoria.

4 Questo vale per gli animali; nelle piante invece in genere nella sequenza codificante.

A seconda che lappaiamento sia perfetto o imperfetto, lRNAi pu procedere in due modi: un appaiamento completo porter al taglio nucleasico del filamento e conseguente digestione, e risulter quindi in una riduzione sia dellmRNA codificante sia del prodotto proteico; un appaiamento incompleto si tradurr in uninibizione del processo di traduzione, con riduzione del prodotto proteico ma normale quantit di mRNA codificante. Sono stati osservati diversi meccanismi con cui RISC pu interferire con la traduzione: Ago omologo a eIF4E, cui pu quindi impedire il legame al filamento di mRNA; ma potrebbe anche ostacolare la circolarizzazione del trascritto, indurre una deadenilazione, sequestrare lmRNA nei P body 5 o impedire lassociazione della subunit ribosomale 60S. Mentre lappaiamento completo spesso riscontrabile nelle piante (che fanno maggior uso dei siRNA), negli animali lappaiamento incompleto pi comune. I miRNA hanno un bassissimo tasso di mutazione. Costituiscono un potente meccanismo di regolazione fine dellespressione genica e si ipotizza che la loro comparsa abbia permesso una notevole innovazione morfologica negli organismi, e di conseguenza la nascita di organi complessi; infatti, rapidi burst evolutivi di innovazione morfologica si associano spesso alla comparsa di nuovi microRNA, che poi rimangono notevolmente conservati lungo i phyla e scompaiono molto raramente.

A livello trascrizionale si osservato che i dsRNA da cui derivano i miRNA possono portare anche allattivazione della trascrizione genica, anche se la repressione della traduzione il risultato pi comune. In un meccanismo definito attivazione genica indotta da miRNA, o RNAa, il dsRNA si lega a promotori dellespressione genica portando a unaumentata attivit di trascrizione o traduzione. I siRNA Un altro meccanismo di regolazione che converge sempre sul complesso RISC quello mediato dai siRNA. I siRNA (Short Interference RNA) sono simili ai miRNA, di lunghezza dai 21 ai 23 nucleotidi e invariabilmente di origine esogena (o trasposonica). Linterferenza mediata da siRNA sempre mediata da un dsRNA che viene trasportato nella cellula. In C. elegans il filamento esogeno viene frammentato da Dicer (DCR1) in una serie di siRNA primari. Questi, complessati con il fattore RDE1 (omologo alla famiglia Ago) in complessi simili ai RISC, potranno andare a riconoscere altre molecole di dsRNA uguali alla prima (autosilencing), legandovisi e permettendo ad una RNA polimerasi RNA dipendente (RpRd) che non necessita di primer di sintetizzare nuovi filamenti complementari. I nuovi dsRNA verranno a loro volta frammentati, generando altri siRNA secondari e amplificando la risposta. I siRNA secondari formano complessi RISC uguali a quelli che mediano lazione dei miRNA. 5 Aggregati riboproteici citoplasmatici coinvolti nel turn-over dellRNA

Questo tipo di RNAi costituisce pertanto un meccanismo di difesa verso elementi potenzialmente pericolosi come virus e trasposoni; in alcuni organismi, come le piante, la risposta non limitata alla sola cellula dove avvenuta linfezione, ma pu propagarsi per via sistemica alla pianta, grazie allamplificazione della risposta dovuta allazione della della RpRd; i siRNA primari e secondari potranno poi migrare fra le cellule tramite i plasmodesmi.

LRNAi nella pratica sperimentale LRNAi costituisce un potente strumento per modulare in laboratorio lespressione genica. In un procedimento chiamato knock-down (lespressione genica viene ridotta, ma non abolita come nel knock-out), doppi filamenti di RNA costruiti a partire da un gene di interesse possono essere introdotti in un organismo, nel quale verranno riconosciute come RNA esogeno e innescheranno la produzione di siRNA. Unorganismo nel quale questa manipolazione ha avuto notevole successo C. elegans, nel quale possibile introdurre i dsRNA in maniera estremamente semplice:

mediante microiniezioni; mettendoli in soluzione nel mezzo di coltura; inserendo la sequenza di interesse in un plasmide con cui posso trasformare batteri che poi vengono dati da mangiare al nematode; ingegnerizzando nematodi transegnici in cui il singolo filamento trascritto di seguito ad una sequenza complementare invertita, in modo che lRNA prodotto si ripieghi a forcina a formare il dsRNA6. Nei mammiferi bisogna tenere in considerazione che lunghi dsRNA innescano la risposta interferonica (una forma dimmunit innata evolutasi come protezione verso agenti virali esogeni); bisogner quindi impiegare dsRNA di lunghezza inferiore a 26bp, che non presentano questo problema.

I lncRNA I long non-coding RNA (lncRNA, o macro ncRNA) sono ncRNA dalla lunghezza superiore ai 200 nt. Originano dai numerosissimi trascritti di RNA (quattro volte gli mRNA codificanti) che vengono normalmente processati con splicing, capping e poliadenilazione, ma non possiedono ORF al loro interno. Nel genoma sono spesso codificati in regioni che si sovrappongono sul filamento senso o antisenso a sequenze codificanti. Sono coinvolti in numerosi processi a ogni livello dellespressione genica7. Ogni trascritto non codificante ha di per se una potenzialit regolativa in cis che esplica rimanendo legato al filamento stampo durante la trascrizione, o appaiandovisi in seguito. E cos in grado di influenzare lespressione dei geni vicini, ad esempio scalzando proteine regolatrici o mantenendo il filamento aperto, oppure legando attivatori e inibitori trasferendoli sulla sequenza di DNA (tether model). 6 Il filamento rispiegato cos prodotto denominato pi propriamente shRNA, short hairpin RNA. 7 vedere A. Pauli, J. L. Rinn, Non-coding RNAs as regulators of embryogenesis.

1. Microinjection 2. Soaking

3. Feeding 4. Transgene

dsRNA delivery methods

Inoltre pu agire anche in trans: come mediatore per laggregazione di complessi proteici (scaffold model) come avviene per il complesso della telomerasi che richiede un TERC per organizzarsi (TElomerase RNA Component); legandosi al filamento in maniera aspecifica per reclutare modificatori della cromatina (guide model). Questo secondo meccanismo sembra essere coinvolto nellinattivazione del cromosoma X; facendo da esca (RNA decoy) per determinati fattori di trascrizione che legherebbero il DNA, inibendone lazione; legando uno o pi miRNA bloccandone cos lazione di silenziamento sugli mRNA codificanti (miRNA sponge).

La capacit regolatoria dei macro ncRNA scaturisce in ciascun esempio dalla capacit di stabilire numerose interazioni con proteine di vario genere, RNA e DNA anche in maniera combinata. Questo suggerisce lipotesi che i lncRNA agiscano da scaffold modulari8, con domini discreti in grado di interagire con elementi regolatori di varia natura (RNA, DNA o proteine) portandoli in prossimit gli uni degli altri e formando un unico complesso funzionale. 8 M. Guttman, J. L. Rinn, Modular regulatory principles of large non-coding RNA.

The cause for this discrepancy is unclear, but there is evidence for both repressive and activating effects of other lncRNAs. For example, a recent study in mamma-lian cells suggests that lncRNAs can have enhancer-like activity and promote expression in cis104. Conversely, a

lncRNA at the dihydrofolate reductase (DHFR) locus binds to and inhibits expression from the DHFR pro-moter105 (FIG. 5Ab). Cis-acting repression might also be induced by short transcriptional start site-associated ncRNAs (TSSa RNAs). Many human TSSa RNAs are

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Figure 5 | RNAs modulate chromatin. A | Models of gene regulation by cis- and trans-acting long non-coding RNAs (lncRNAs). Aa | In cis (left), the process of transcription can displace DNA-bound factors that inhibit (left) or activate (right) transcription of a neighbouring gene (process of transcription). Ab | Alternatively, nascent non-coding transcripts can function as tethers for chromatin-modifying complexes and/or transcriptional regulators, which can have either activating (left) or repressive (right) activities (tether model). Ac | Trans-acting non-coding RNAs (ncRNAs) can serve as platforms for the assembly of protein complexes (scaffold model). In this model, target sites are specified by DNA-binding proteins. Ad | Alternatively, trans-acting ncRNAs can specify target sites by forming hybrids with complementary DNA sequences, and thus recruit chromatin modifiers and transcriptional regulators (guide model). Ae | lncRNAs can also modulate the activity of protein complexes by inducing conformational changes (allosteric model). For simplicity, only repressive activities are shown as examples of trans-acting mechanisms. B | The lncRNA HOX antisense intergenic RNA (HOTAIR) regulates gene expression in trans by providing a scaffold for chromatin-modifying complexes. HOTAIR is expressed from the HOXC cluster and represses multiple target genes elsewhere in the genome. HOTAIR binds to the H3K27-trimethylating Polycomb repressive complex 2 (PRC2) and the H3K4me2/3-demethylating lysine-specific demethylase 1 (LSD1)CoRESTREST complex, which together establish a repressive chromatin state at HOTAIR-associated target genes (OFF, dark blue). Pol II, RNA polymerase II.

REVIEWS

NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 12 | FEBRUARY 2011 | 143

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LRNA sarebbe adatto a questo ruolo, essendo un substrato evolutivamente pi malleabile rispetto alle proteine, e consentendo la selezione di discreti domini di interazione. LRNA pu infatti essere pi facilmente mutato e selezionato senza interferire eccessivamente con la sua funzionalit. Il modello delle interazioni modulari potrebbe trovare un riscontro nellosservazione di una serie di pacchetti altamente conservati inframmezzati da regioni ad alto tasso di mutazione che consentirebbero la nascita di nuovi domini. I piRNA I piRNA, la classe di piccoli ncRNA maggiormente presente negli eucarioti, sono in grado di formare complessi assieme alle proteine piwi (P-element induced wimpy testis); la loro biogenesi non stata ancora interamente chiarita, ma originano da pathway distinti da quelli dei miRNA e dei siRNA. I rasiRNA sono una sottospecie di piRNA. Le proteine piwi associate al piRNA svolgono unazione di silenziamento su svariati trasposoni soprattutto in sede di spermatogenesi; il dominio piwi che ha attivit dsRNasica conservato nelle proteine della famiglia Argonauta. Gli sRNA procariotici I batteri contengono fino a un centinaio di piccoli RNA regolatori, gli sRNA. La loro attivit mediata dalla formazione di un doppio filamento con un mRNA bersaglio, anche se in genere funzionano anche se non sono perfettamente complementare allRNA bersaglio. Lazione degli sRNA appaiati mediata dalla proteina Hfq, in grado di agire sulla traduzione e sulla degradazione degli mRNA. I piccoli RNA batterici sono responsabili anche un sistema di difesa acquisito contro le infezioni virali, mediato da un gruppo di corte ripetizioni palindromiche detto CRISPR (Clusters of Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats). Il trascritto di CRISPR viene usato insieme ad un sistema di processamento costituito da otto proteine Cas. Piccole sequenze di RNA esogeno (spacers) possono essere processate ed integrate in mezzo alle sequenze in tandem di CRISPR. Il trascritto di CRISPR viene quindi espresso e processato in un brevi RNA di ~50 bp, che conterranno gli spacers derivati da precedenti esposizioni ad un RNA esogeno (ad esempio di origine virale) e silenzieranno la replicazione del fago con un meccanismo simile allRNAi eucariotica.