seente geneetika ii

Seente geneetika II

Heidi Tamm

5. märts 2010

Suguline paljunemine

Seened mudelorganismidena

Tetraadide analüüs

Komplementatsiooni test

S. cerevisiae genoom

Proteoomika


Et saada maksimaalset kasu, peaksid ühinevate rakkude tuumad olema nii erinevad kui võimalik

Tsütoplasmad peaksid olema nii sarnased kui võimalik (et vältida geneetilist saastust)

Vegetatiivne vs. seksuaalne kokkusobivus

Isane või emane?

ei ole võimalik eristada

seened on hermafrodiitsed

Vegetatiivne kokkusobivusHeterokaarüonid tekivad vaid samasse vegetatiivse kokkusobivuse gruppi kuuluvate hüüfide vahelKui hüüfid ei ole kokkusobivad, siis vahetult kontakteeruvad rakud surevad

Vegetatiivne kokkusobivus/sobimatus

Liitumise kokkusobimatus (fusion incompatibility) - kokkusobivussüsteem määrab ära rakkude võime liituda. (hallitusseentel)

Liitumisejärgne kokkusobimatus (post-fusion…) – määrab ära, kas rakud jäävad pärast liitumist ellu; kas koos tsütoplasmaga saavad migreeruda ka tuumad jm. organellid

Ristumissüsteemid

On määratud tuuma geenide poolt, mis takistavad kahe geneetiliselt identse mütseeli ristumist

Heterotallism – süsteem, kus on takistatud ristumine kahe identse gameedi vahel

Homotallism – kui miski ei takista identsete gameetide ristumist

Heterotallism

anastomoos on võimalik ainult kahe erineva talluse vahel

90% kandseentest

Homotallism

suguline paljunemine saab toimuda ilma interaktsioonita kahe talluse vahel

iseviljastumine

primaarne vs. sekundaarne homotallism

Primaarne homotallism

idaneb ühetuumaline eos, moodustub kahetuumaline mütseel

tuumad on ühesugused

moodustuvad viljakehad

Sekundaarne homotallism

kui peale meioosi satub ühte eosesse 2 tuuma

Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne

unifaktoriaalne ehk bipolaarneristumist kontrollib üks lookus kahe alleeligaalleelide lahknemine meioosis tagab, et ühes eoses on vaid üks alleel.

Edukalt ristuvad vaid rakud, millel on ristumistüübi lookuses erinevad alleelid.erinevad alleelid.

Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne

kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 50% juhtudest

kottseened, ikkesseened

rooste- ja nõgiseened

Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne

Kaks omaette ristumistüübi lookust (A ja B).

Bifaktoriaalne e. tetrapolaarne

Edukaks ristumiseks on vaja erinevaid alleele mõlemas lookuses

Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne

Populatsioonis võib olla palju erinevaid alleele kummagi lookuse kohta

55% kandseentel

Kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 25% juhtudest

Ristumisfaktorid: bifaktoriaalne

“A” geen kodeerib homeodomääni valke (transkriptsioonifaktoreid)

“B” geen kodeerib feromone ja nende retseptoreid

kummalgi geenil on alamlookused

S. cerevisiae ristumistüübi faktorid

2 ristumistüüpi: a ja α

Ristumistüüp määratud:peptiidhormoonide (feromonide) poolt (α- ja a-faktorid)

feromonispetsiifiliste retseptorite poolt

Kuidas ristumistüübi faktorid toimivad?

Feromon seostub vastastüüpi raku pinnal oleva retseptoriga. Selle sündmuse tagajärjed:

rakus algab aglutiniini tootmine, nii kleepuvad rakud kokku

mõlema raku kasv peatub G1 faasis

muutub rakuseina struktuur ja raku kuju

a-tüüpi rakkudes produtseeritakse:a-feromoni

α-feromoni retseptorit

ja vastupidi

MAT lookus

Lookuses on 2 geeni (a1 ja a2 või α1 ja α2)

MATa1 represseerib a-feromoni retseptori ja α-feromoni sünteesi

MATa2 funktsioon teadmata

MATα1 aktiveerib a-feromoni retseptori ja α-feromoni sünteesi

MATα2 represseerib α-feromoni retseptori ja a-feromoni sünteesi

Kui tuumad on ühinenud:

Diploidid on alati MAT lookuse suhtes heterosügootsed

a1 ja α2 valgud moodustavad heterodimeeri, mis aktiveerib meioosi ja sporulatsiooni ja represseerib haploidsed funktsioonid

Et asi oleks tõeliselt segane...

Pärmi haploidsed rakud saavad oma ristumistüüpi muuta

Kontrollib geen HO (endonukleaas)

Dominantse alleeli korral toimub see peale igat raku jagunemist

HML MAT HMR

(kott)seened mudelorganismidena

Saccharomyces cerevisiae

Aspergillus nidulans

Schizosaccharomyces pombe

Neurospora crassa

Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganismEukarüootLihtne kasvatadaVäike genoom kergesti manipuleeritavKasvab kiirestiMutantide isoleerimise lihtsusHästidefineeritud geneetiline süsteemRekombinatsioon kõrge sagedusega

Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism

Mitmekülgne DNA transformatsiooni süsteemNii haploidne kui ka diploidne faas stabiilneMittepatogeenneMetaboolsed ja regulatoorsed mehhanismid kõrgelt konserveerunudInimeste haigustega seotud geenide ortoloogid...

Pärm: milliseid protsesse uuritakse?

Geeniregulatsioonraku koostisosade biosüntees

mRNA translatsioon

valkude post-translatsiooniline modifitseerimine

valkude sekreteerimine

mitokondri biogenees

võõrgeenide ekspressioon

Pärm: mida uuritakse?

Rakutsükli regulatsioon

Signaaliülekande mehhanismid

Kromosoomi struktuur

DNA replikatsioon

Genoomika

Neurospora ja Aspergillus

Haploidne vegetatiivne faas ja haploidsed koniidid -

seeneniidistiku fenotüübi järgi saame teha järeldused genotüübi kohta

Neurospora

Aspergillus

Neurospora ja Aspergillus

Iga eoskott sisaldab 8 eostpeale meioosi toimub mitoos

2n tuuma iga üksik DNA ahel läheb ühe eose tuuma

võimaldab algse DNA detailset analüüsi

isegi heterodupleksi erinevused tulevad välja (osaline erinevus kaksikheeliksi ahelates)

Magnaporthe grisea

Riisi närbumistõve tekitaja (rice blast fungus)

Genoomi suurus 40.3 Mb

7 kromosoomi

10% genoomist kordusjärjestused (> 200 bp)

retrotransposoonid

sagedane rekombinatsioon

Magnaporthe grisea

apressorkoniid

Magnaporthe grisea

rekombinatsioonide tõttu genoom muutlik

looduses paljuneb mittesuguliselt

genoomi muutlikkus on seenele kasulik:peremehespetsiifilisuse muutumine

kui kaotsi lähvad geenid, mis põhjustavad potentsiaalses peremehes kaitsereaktsioone

Seente transformatsioon

Katsetatud paljudel seentel

Head protokollid olemas üksikute jaoks:Saccharomyces

Aspergillus

Neurospora

Ustilago

Võimalused transformatsiooniks

Protoplast

Terve raku töötlemine Ca2+ ja Li+ ioonidega

Elektroporatsioon

Geenipüss (gene gun, particle bombardment)

Mida on vaja transformatsiooni läbiviimiseks?

Vektor, milles meid huvitaval geenil on sobiv promootor ja terminaator

Seenerakud peavad olema kompetentsed

Selektsioonisüsteem

(Protoplastidest tuleb regenereerida mütseel)

N. crassa – tetraadide analüüs

Eoskotid kui korrastatud tetraadid - alleelide kombinatsioon eostes vastab meioosi I ja II jagunemisele

meioos I - kahe (homoloogilise) kromosoomi lahknemine

meioos II - kahe tütarkromatiidi lahknemine


Saab jälgida rekombinatsiooni toimumist ja kindlaks teha aheldatuse gruppe Kottseened sobivad geenide meiootiliseks kaardistamiseks Pärmil on eoskotis 4 eost, mis on ühe meioosi tulemusMitme alleeliga geenide aheldusLookuse asukoht tsentromeeri suhtes

Tetraadide analüüs tänapäeval

Et kindlaks teha mutatsiooni, mis vastab konkreetse lookuse muutmisele

Et konstrueerida uusi tüvesid

Et kindlaks teha geenide interaktsioone

Erinevad tetraaditüübid. Ristati AB × ab

Eri tüüpide osakaal näitab, kas A ja B on aheldunud

Auksotroofid

Auksotroofsed mutandid, kes pole ühe geeni muteerumise tõttu võimelised kasvama teatud söötmel

Kasv taastub, kui söötmele lisada vajalik komponent

Esineb spetsiifiline sõltuvus konkreetse geeni produkti ja metaboolse sammu vahel.

““Üks geen - üks valk” hüpoteesÜks geen - üks valk” hüpotees

Auksotroofne organism sisaldab mutatsiooni, mis muudab organismi toitumisvajadusi

Prototroof – metsiktüüpi organism muutmata toitumisvajadustega

Pärmi auksotroofsed markerid

AminohappedLeu

His

Trp

NukleotiididUratsiil

AdeniinSelektsioonivahe

nd molek. geneetiliste

katsete puhul

Mis on komplementatsioon?Kahe auksotroofi ristamisel saadud diploid on prototroof, kui defektid on erinevates lookustesAlleel, mis ühes haploidis on mutantne (retsessiivne), on teises haploidis funktsionaalne (dominantne)Mõlema haploidi wt alleelid kompenseerivad teise haploidi defektse alleeli

Mis on komplementatsioon?

Kui defektid on samades lookustes, siis kahe auksotroofi ristamisel tekkiv diploid on auksotroof

Retsessiivne homosügoot

Ka eri liikidelt pärit geenid võivad üksteist täiendada


Haploidsete auksotroofide genotüüpide kindlakstegemiseks

Tundmatu genotüübiga haploid ristatakse teadaolevate genotüüpidega haploididega

peavad olema erineva ristumistüübiga

Komplementatsioonigrupid

Kui defektsete tüvede ristamisel ei toimu komplementatsiooni, kuuluvad nad samasse gruppiIga grupp esindab ühte ensüümi biokeemilises rajasSuuremahulised projektid võimaldavad identifitseerida kõik kompl. grupid => kõik geenid metaboolses rajas

Geeni defineerimine toime järgi

Alati pole kõik nii ilus…

Kahe lookuse suhtes heterosügootne diploid võib fenotüübilt olla ikkagi defektne

Alleelne ehk geenisisene komplementatsioon – mutatsioonid on mõlemas tüves samas lookuses

Geenisisene komplementatsioon

Kui ensüüm koosneb kahest või rohkemast identsest subühikust

Kaks erinevalt defektset valku kompenseerivad teineteise vead

Kui ensüüm koosneb erinevatest domäänidest, mis täidavad erinevaid katalüütilisi funktsioonePärmis on tavaline

Kas siis ikkagi 1 või 2 lookust?


Rekombinatsiooni sagedusväga madal => mutatsioonid samas lookuses

kuni 25% => mutatsioonid erinevates lookustes

S. cerevisiae genoom sekveneeriti 1996Goffeau et al. 1996. Science 274: 546

esimene täielikult sekveneeritud eukarüootne genoom

Sekveneeritud seenedAscomycota

Saccharomyces cerevisiaestrain S288C 12

Saccharomyces cerevisiaestrain RM11-1a 12

Saccharomyces pastorianus 26Candida guilliermondii 12Candida lusitaniae 16Candida tropicalis 30Candida glabrata 12Ashbya gossypii 9Debaryomyces hansenii 10Kluyveromyces lactis 11Pichia stipitis 15Yarrowia lipolytica 21Schizosaccharomyces pombe 14Aspergillus nidulans 31Aspergillus fumigatus 32Aspergillus oryzae 37Aspergillus niger 37Chaetomium globosum 36Coccidioides immitis 29Nectria haematococca 52Fusarium graminearum 40Fusarium verticillioides 46

Magnaporthe grisea 40Neurospora crassa 43Stagonospora nodorum 37Trichoderma reesei 33Epichloë festucae 35

Basidiomycota

Coprinus cinereus 38Cryptococcus neoformans 20Ustilago maydis 20Phanerochaete chrysosporium 35

Zygomycota

Rhizopus oryzae 40 Microsporidia

Encephalitozoon cuniculi 2.5 Dictyosteliomycota (Protozoa)

Dictyostelium discoideum 34

Oomycota (Chromista)Phytophthora ramorum 65Phytophthora sojae 95

Mbp

Schizosaccharomyces pombe

Genoomi suurus 13.8 Mb

3 kromosoomi

Pooldub, mitte ei pungu

Kasutatakse raku kasvamise ja jagunemise uurimiseks


12 Mb (~200 korda väiksem inimese genoomist, ~ 4 korda suurem E. coli genoomist)

16 kromosoomi

Kromosoomide suurused 250-2500 kb

~ 6000 ORF-i


Valke kodeerivad alad moodustavad 70% genoomist

3.8% ORF-e sisaldab introneid

Järjestikku ~ 120 rRNA geenide komplekti kordust (XII kromosoomis)

http://www.yeastgenome.org/cache/genomeSnapshot.htmlGenome Inventory http://www.yeastgenome.org/cache/genomeSnapshot.html

Nuclear genome

(April 2005) 2006 2007 2008 2009 2010

mt genome

Total ORFs 6591 6563 +12 +1 +7 -8 28Verified ORFs 4292 4275 +93 +149 +143 +79 +92 17

Uncharacterized ORFs 1481 1479 - 85 -142 -136 -82 -92 2Dubious ORFs 818 809 +4 -6 -3 -2 9

Long_terminal_repeat 382 382 +1 0tRNA 299 275 24

Transposable_element_genes 89 89 0ARS 82 82 +3 +181 +8 +63 0

snoRNA 68 68 +7 +1 +1 0Retrotransposon 50 50 0

Telomere 32 32 0X_element_core_sequence 32 32 0

Telomeric_repeat 31 31 0

X_element_combinatorial_repeats 28 28 0rRNA 27 25 2

Pseudogenes 21 21 0Y'_element 19 19 0Centromere 16 16 0

ncRNA 10 9 -1 +1 -1 +6 1snRNA 6 6 0

Feature Type

Total (April 2005)

S. cerevisiae valke kodeerivad geenid

S. cerevisiae geeniproduktide jaotus vastavalt bioloogilistele protsessidele

S. cerevisiae kromosomaalsete geenide nomenklatuur

Gene symbol DefinitionARG+ All wild-type alleles controlling arginine

requirementARG2 A locus or dominant allelearg2 A locus or recessive allele confering an arginine

requirementarg2– Any arg2 allele confering an arginine

requirementARG2+ The wild-type allelearg2-9 A specific allele or mutationArg+ A strain not requiring arginineArg– A strain requiring arginineArg2p The protein encoded by ARG2

S. cerevisiae mitokonder

Mitokondris leiab aset suur hulk biokeemilisi reaktsiooneOksüdatiivse fosforüleerimise teel produtseeritakse ATP ja NAD+

Pärmid on fakultatiivsed anaeroobidfakultatiivsed anaeroobid, mis tähendab, et nad saavad hakkama ka ilma molekulaarse hapnikuta => võivad elada võivad elada ilma funktsionaalse hingamisahelatailma funktsionaalse hingamisahelata

Pärmi elu ilma hingamata

Eeldab sobivat süsinikuallikat (suhkrud)

ATP süntees glükolüüsi ja kääritamise käigus

Rakud kasvavad aeglaselt, kolooniad on väikesed

Kääritataval söötmel kasvab ka siis, kui mtDNA on mutantne või puudub üldse

Pärmi mitokondriaalne genoom

Suurus ~ 80 kb (inimesel 16.5 kb)

Lineaarne!

Ühes haploidses pärmirakus ~ 50 mtDNA koopiat

Kodeerib hingamisahela ensüüme

Ülejäänud valgud kodeerib tuuma genoom

Tsütoplasmaatiline pärilikkus

Pärmi mitokondriaalne genoom ehk ρ faktor

Metsiktüüpi pärmirakud (‘grande’), mis hingavad normaalselt ja moodustavad suuri kolooniaid, on ρ+

‘Petite’ mutandid ei ole võimelised hingama ja nad moodustavad fermenteeritaval söötmel väikesi kolooniaid

ρ0 rakkudel puudub mtDNA üldseρ- rakkudel esineb mtDNA, mis on moodustunud wt mitokondriaalse genoomi üksikutest fragmentidest, mis esinevad paljude kordustena

‘petite’ - mutandid

Saab eristada, ristates neid wt rakkudegaρ0 rakud annavad wt (‘grande’) järglased

keskmiselt supressiivsete ρ- rakkude järglased on pooled ‘grande’ ja pooled ‘petite’

hüpersupressiivsete ρ- (HS) rakkude järglased on peaaegu kõik ‘petite’

ρ- mtDNA

Sisaldab wt mtDNA üksikuid fragmente, mis esinevad paljude kordustena

HS ρ- mutantidel on selliseks fragmendiks arvatavasti replikatsiooni alguskoht (ori)

Pärm ja genoomiuuringud

DNA kiipide kasutamine transkriptoomi uurimiseksGeeni funktsioonide analüüs geeni väljalülitamise teelValkude lokalisatsiooni analüüs2D protein mapsEnsümaatilise aktiivsuse analüüsValk-valk interaktsioonide analüüs

Pärmid ja proteoomika

Geenijärjestuste analüüs vs. valkude analüüs

Valgud ei tegutse tavaliselt üksinda

Valgukomplekside analüüs

Pärmi proteoomi 2D-kaart

Kuidas analüüsida valk-valk interaktsioone?

Pärmi kaksikhübriidsüsteem

mRNA sünekspressioon

Geneetilised interaktsioonid ehk sünteetiline letaalsus

In silico meetodid

Valgukomplekside afiinsuspuhastamine + mass-spektromeetria


Seened mudelorganismidena




Proteoomika

seente geneetika ii

Documents