1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị

máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; ngoài máu và các chế phẩm

máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết thanh như:

gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D

globulin, antivenom [141],[147],[152]...trong đó, huyết thanh kháng nọc rắn

(antivenom) là loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn

đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae.

Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biển

dài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển.

Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông nghiệp, rừng núi,

hải đảo...nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn

thất nhân mạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy

hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để cứu tính

mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lít

máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174].

Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải

sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên

cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8]. Đến

nay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngàn

bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]...

Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm

trọng nhiều loại HTKNR; hầu như ta chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn

hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc

rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc

gia mình (khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu,

2

điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR;

đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong

các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc

họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây

tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều trị kịp thời) [14].

Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy:

nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu là rắn cạp nia nam

(Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Đây là hai

loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất

khó phân biệt. Hai loài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm

sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụng

chéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15].

Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm

nói trên là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp

nia cắn trong cả nước. Để tăng tính an toàn của chế phẩm, dạng F(ab’)2 là tối

ưu, đồng thời phải áp dụng các giải pháp kỹ thuật và kiểm soát chất lượng

toàn diện để chế phẩm có thể đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về HTKNR dùng cho

người, theo Dược điển Việt Nam [9].

Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá

F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng

thí nghiệm” được thực hiện, nhằm các mục tiêu sau:

1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa,

đạt Tiêu chuẩn Quốc gia.

2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.

3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. MỘT SỐ ĐIỂM CẦN CHÚ Ý VỀ MÁU VÀ HUYẾT TƯƠNG

1.1.1. Máu:

Máu là mô lỏng màu đỏ lưu thông trong hệ thống tuần hoàn; tạo thành từ

các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu

và phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước....Máu chiếm 1/13

trọng lượng cơ thể (60-70 ml/kg); thể tích ở nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít;

tỷ trọng: 1.055-1.063, pH 7,33-7,43 [31].

Máu động vật có vú cũng gồm HC, BC, TC, huyết tương,.. với chức năng

cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ cơ thể,...tương tự ở người.

1.1.2. Huyết tương:

Là phần dịch lỏng thu được sau ly tâm hoặc để lắng tự nhiên máu đã

chống đông. Thành phần chủ yếu của huyết tương là nước (92%), các protein

hòa tan (albumin, globulin, fibrinogen...), đường, các yếu tố đông máu, các

chất điện giải, vitamin, hormon, carbon dioxide... [31],[167].

Protein huyết tương gồm: globulin miễn dịch, bổ thể, các yếu tố đông

máu, các yếu tố enzyme, các protein liên kết với lipid, các protein vận

chuyển...các thành phần này thay đổi trong bệnh lý.

Điện di protein, điện di miễn dịch sẽ tách được các thành phần protein.

Mỗi protein huyết tương đều có điểm đẳng điện tương ứng với pH.

Tính hòa tan của protein chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và tính tan trong

dung dịch muối.

Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hòa tan cũng thay đổi, tính chất sinh học

có thể mất đi; các yếu tố gây biến tính protein là: nhiệt độ, acid, base, tia cực

tím (làm đứt gãy liên kết peptid), sóng siêu âm (gây oxy hóa) [31],[163].

4

1.2. CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG

1.2.1. Máu toàn phần:

Máu toàn phần là máu lấy từ mạch máu người cho (hoặc động vật cho

máu), bảo quản trong túi (hoặc chai, bình chuyên dụng) có chất chống đông

và bảo quản máu (thông thường là CPDA gồm citrate, phosphat, đường

dextrose, adenin). Mỗi đơn vị máu người cho khỏe mạnh (250 ml) có 30 - 40

gam hemoglobin [31],[170]. Bảo quản máu toàn phần ở nhiệt độ 2 - 6oC, thời

gian bảo quản tối đa 42 ngày với dung dịch CPDA. Máu toàn phần lưu trữ

chứa thành phần chính là hồng cầu, máu mới thu nhận còn có tiểu cầu và một

số yếu tố đông máu; bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ và giải phóng ra các

chất trung gian; ngoài ra máu toàn phần còn chứa các bạch cầu lympho và các

yếu tố huyết tương.

1.2.2. Khối hồng cầu [31],[170]:

Khối hồng cầu là máu toàn phần đã được ly tâm và tách phần huyết tương

ở trên; tuỳ cách sản xuất mà có 5 loại khối hồng cầu sau:

+ Khối hồng cầu đậm đặc: là khối hồng cầu có hematocrit (Hct) khoảng 75%,

gồm có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một ít huyết tương; bảo quản ở nhiệt độ

2 - 6°C; là chế phẩm có tính đậm đặc nên phải truyền chậm.

+ Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: là khối hồng cầu sau khi tách huyết

tương được trả lại dung dịch bảo quản; thành phần gồm có hồng cầu và dung

dịch bảo quản, một ít bạch cầu, lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần;

bảo quản ở nhiệt độ 2 - 6°C, thời gian tối đa 42 ngày.

+ Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: là chế phẩm máu được sản xuất từ máu

toàn phần tách huyết tương và phần buffy coast; thành phần gồm có hồng cầu

và khoảng 10% bạch cầu so với khối hồng cầu thông thường; có ưu điểm làm

5

giảm các phản ứng do bạch cầu, giảm các nguy cơ lây bệnh do tác nhân cư trú

trong bạch cầu.

+ Khối hồng cầu rửa: là máu toàn phần hoặc khối hồng cầu được ly tâm bỏ

hết huyết tương, sau đó thay thế bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9% trộn đều,

ly tâm tiếp để rửa ba lần; thành phần gồm có: hồng cầu + nước muối sinh lý;

bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 6°C dưới 24 giờ, ở nhiệt độ 22°C dưới 6 giờ.

+ Khối hồng cầu lọc bạch cầu và khối hồng cầu chiếu xạ: là khối hồng cầu đã

được dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hoặc cả hai, bảo quản ở 2 - 6°C dưới

hai tuần từ khi chiếu xạ. Nếu dùng màng lọc rời thì sau lọc không để quá 24

giờ. Thành phần chủ yếu là hồng cầu, còn rất ít bạch cầu, bạch cầu bị bất

hoạt.

Như vậy: sau khi tách huyết tương, tùy điều kiện và nhu cầu truyền trả

khối hồng cầu cho ngựa sớm hay muộn để quyết định sử dụng chống đông,

dung dịch nuôi dưỡng hồng cầu và phương pháp bảo quản, vận chuyển trên

đường đến nơi truyền trả khối hồng cầu ngựa. Nếu lấy máu ngựa vào các túi

đôi, túi ba, dung tích 450ml, việc tách huyết tương và truyền trả khối hồng

cầu ngựa sẽ đơn giản hơn lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít).

1.2.3. Khối tiểu cầu:

Tuỳ cách sản xuất, có hai loại khối tiểu cầu sau:

+ Khối tiểu cầu pool: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng cách ly tâm các túi

máu toàn phần, gạn lấy lớp buffy coast rồi ly tâm tách lấy tiểu cầu; thông

thường từ 3 - 4 đơn vị máu toàn phần cùng nhóm ABO có thể sản xuất được

một đơn vị pool tiểu cầu; khối tiểu cầu nếu chưa pool, được bảo quản ở 22°C,

lắc liên tục, thời gian từ 3 - 5 ngày; nếu đã pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 giờ;

số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011.

6

+ Khối tiểu cầu máy: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng máy tách tế bào lấy

tiểu cầu từ một người cho, thành phần có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/đơn vị, có ít

bạch cầu; bảo quản ở 22°C trong máy lắc liên tục, tối đa được 5 ngày.

1.2.4. Huyết tương tươi đông lạnh:

Huyết tương tươi đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần trong

6 giờ kể từ lúc lấy máu, bảo quản đông lạnh; thành phần có albumin, globulin

miễn dịch, các yếu tố đông máu bền vững và yếu tố VIII còn khoảng 70%;

lượng huyết tương tách từ một đơn vị máu (250 ml) thường ≈ 125 - 150 ml.

Thường pool lượng huyết tương tươi của hai đơn vị máu toàn phần cùng

nhóm, dung tích khoảng 250 - 300ml. Bảo quản ở nhiệt độ - 25°C/năm, bảo

quản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170].

Khi sản xuất HTKNR, phải bảo quản huyết tương của nhiều đợt, được

lấy trong nhiều thời điểm khác nhau, bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 25°C để tránh

các biến tính của protein theo thời gian do nhiều yếu tố tác động bất lợi.

1.2.5. Tủa VIII (cryo):

Để huyết tương tươi đông lạnh ở 4°C, huyết tương tan ra có một phần

tủa, ly tâm thu nhận các tủa này đó là tủa lạnh yếu tố VIII (cryo); thành phần:

cryo có khoảng 2 - 3 đơn vị yếu tố VIII /ml và yếu tố V, fibrinogen; trọng

lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn hơn trọng lượng phân tử

IgG (150 kD) [16] và được tách ta trong phương pháp tủa Cohn ở Fraction I,

loại bỏ phần này khi tách γ-globulin vì không cần thiết sử dụng.

1.2.6. Huyết tương tươi đã tách tủa:

Huyết tương tươi đã tách tủa là phần huyết tương tách ra sau khi lấy tủa

ở huyết tương tươi đông lạnh, bảo quản ở - 25°C; thành phần gồm có:

albumin, globulin, một số yếu tố đông máu. Nếu sản xuất HTKNR theo

7

phương pháp Cohn, đây là phần cần thiết giữ lại để sản xuất do có γ -globulin.

Sản phẩm này cần bảo quản như huyết tương tươi đông lạnh: ở nhiệt độ -

25°C / năm, bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170].

1.2.7. Huyết tương đông lạnh:

Huyết tương đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần sau 6 giờ

kể từ khi lấy máu; thành phần gồm các yếu tố huyết tương,...các yếu tố đông

máu không bền vững còn lại ít; bảo quản ở nhiệt độ - 25°C, như huyết tương

tươi đông lạnh. Huyết tương để sản xuất HTKNR được sản xuất, tách chiết

theo dạng chế phẩm này.

1.2.8. Khối bạch cầu hạt:

Là chế phẩm huyết tương tách từ phần buffy-coast và pool của nhiều

người cho máu; thành phần chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu và một số tế

bào lympho và các chất do bạch cầu giải phóng; do sản xuất theo phương

pháp pool từ nhiều người cho nên nguy cơ nhiễm virus rất cao. Bảo quản: ở

nhiệt độ 22°C ≤ 24 giờ. Trong sản xuất HTKNR, chỉ cần tách huyết tương, vì

vậy cần để lại phần bạch cầu và tiểu cầu cùng với khối hồng cầu; cần truyền

lại máu ngựa sớm để ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục.

1.2.9. Albumin:

Albumin là protein hình cầu, tính hòa tan cao, trọng lượng phân tử

66.500 Da, chiếm nhiều nhất trong huyết thanh; chức năng chính là duy trì 70

– 80% áp lực keo trong huyết tương và liên kết vận chuyển các chất có phân

tử nhỏ như bilirubin, hormon, steroid, acid béo, các phân tử thuốc.

Dung dịch albumin được điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 -

20% protein toàn phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa

5% protein [163]; do trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩm

này theo phương pháp tủa Cohn sẽ thu được albumin ở Fraction V, phần tủa

8

Cohn cuối cùng; khi sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ; theo

tiêu chuẩn tinh sạch protein của dược điển Việt Nam III-2002, albumin chỉ

được phép còn dạng vết, phát hiện được bằng điện di miễn dịch [7].

1.2.10. Gamma globulin:

Hình 1.1. Các thành phần protein khi điện di protein huyết thanh [176].

Gamma globulin (-globulin) là các lớp globulin xác định được khi điện

di protein huyết thanh; với 5 lớp -globulin là IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; trong

đó chiếm tỷ lệ nhiều nhất là IgG, sau đó là IgM; IgD, IgA, IgE chiếm rất ít.

Năm 1940, -globulin đã được tách chiết lần đầu tiên trên thế giới.

Không lâu sau đó, globulin miễn dịch tiêm bắp (IGIM) được đưa vào sử dụng,

tạo miễn dịch thụ động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô -

globulin huyết (1950). Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IGIV) được

sản xuất và đưa vào sử dụng năm 1970, ít đau, tác dụng nhanh hơn IGIM.

Năm 1981, Gamimune do Mile phân lập, là IGIV đầu tiên được đăng

ký ở Mỹ. Sandoglobulin của hãng Sandoz có ở thị trường năm 1984.

Gamimune được chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986; sản phẩm này

được đổi tên thành Gamimuner N. Sau đó, một số IGIV khác được đăng ký ở

Mỹ như: Gammagard do Hyland, Polygam bởi hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam

9

bởi Immuno, Venoglobulin - I bởi Alpha Therapeutic, Gammar-IV bởi Armor

và GammaRaas của tập đoàn RAAS (Mỹ) [167].

Năm 1991, IGIV sản phẩm dạng bột hoà tan lần đầu tiên được chấp

nhận (Venoglobulin-S). Năm 1994, sau một vụ dịch viêm gan C liên quan đến

Gammagard, sản phẩm điều chế dạng bột không hoà tan Gammagard và

Polygam bị đình chỉ.

Năm 1980, bệnh nhân dùng IGIV điều trị giảm -globulin huyết, xuất

huyết giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy đa số gây tăng số lượng tiểu cầu. Tiếp

theo phát hiện ngẫu nhiên này, việc sử dụng IGIV cho ITP được nghiên cứu

và hiện nay nó chính thức được dùng cho chỉ định này. Kể từ khi IGIV có

hiệu quả đối với ITP, chúng tiếp tục được đánh giá trong điều trị những bệnh

khác với giả định cơ chế tự miễn. Hầu hết sử dụng IGIV đối với bệnh tự miễn

đều có hiệu quả; ví dụ bệnh Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷ

myelin viêm mạn tính, hội chứng Guillain-Barre...

Các chỉ định -globulin được thừa nhận hiện nay gồm: suy giảm miễn

dịch tiên phát, xuất huyết do giảm tiểu cầu tự phát, bệnh Kawasaki, ngăn

ngừa nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực hiện ghép tuỷ xương.

Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IGIV) là chế phẩm có trên 95% IgG từ

huyết tương người hiến máu được tinh chế. IGIM chứa 15 - 18% protein,

trong đó IgG chiếm trên 90%. IGIM là dung dịch trong suốt hoặc hơi đục, có

thể có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt. Cả hai loại đều là dung dịch vô khuẩn,

không chứa chất gây sốt, gồm các -globulin chứa nhiều loại kháng thể có

mặt trong máu người bình thường.

Sau khi tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết thanh đạt đỉnh trong hai

ngày, được phân bổ nhanh và ngang nhau giữa các khu vực trong và ngoài

mạch máu. Ở những người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian bán hủy

của IgG khoảng 23 ngày. Khi liều tiêm IGIM lớn hơn 10 ml thì phải chia ra

10

thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhau nhằm làm

giảm đau tại chỗ và bớt khó chịu. Tổng liều một lần tiêm bắp thịt không được

vượt quá 20 ml - ngay cả đối với người lớn. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 8oC và

không được để đông băng. Thời hạn dùng của IGIM không được quá 3 năm

kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) của nhà sản xuất [31],[123].

Bảng 1.1. Các thành phần của protein huyết tương [31],[167],[176]

Globulins

α-globulins

α1-antitrypsin, α2-antiplasmin, antithrombin α1- transcortin, α2-ceruloplasmin, retinol binding protein, orosomucoid, α2-macroglobulin, haptoglobin

β-globulinshormone, binding globulin, transferrin angiostatin, hemopexin, β-2 microglobulin, factor H, plasminogen, properdin

-globulin Immunoglobulins (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE)

Loại khác Fibronectin, macroglobulin/microglobulin, Transcobalamin

Albumins

Lòng trắng trứng

Conalbumin, ovalbumin, avidin

Serum albumin Human serum albumin, bovine serum albumin, prealbumin

Loại khác C-reactive protein, α-lactalbumin, parvalbumin, ricin

1.2.11. Kháng huyết thanh:

Kháng huyết thanh (KHT) là sinh phẩm chứa -globulin miễn dịch có

khả năng trung hòa kháng nguyên đặc hiệu, thu được từ huyết tương động vật

hoặc huyết tương người đã được mẫn cảm với kháng nguyên trước đó, được

tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết theo quy định và loại bỏ các

protein không cần thiết [7],[9]. Một số KHT đã được nghiên cứu, sử dụng

trong chuyên ngành Huyết học và Truyền máu:

11

- Anti-HBs globulin: dùng cho con của những bà mẹ có HBV (+), sản xuất từ

huyết tương người cho máu giàu anti-HBs globulin [30],[41],[173].

- Anti-T lymphocyte globulin: điều trị suy tủy xương, điều trị bệnh tự miễn

(sản xuất từ huyết tương thỏ gây miễn dịch) [75],[86],[97],[109].

- Anti-hairy cell serum: điều trị leucemie tế bào tóc (sản xuất từ huyết tương

thỏ gây mẫn cảm) [132].

- Anti-D globulin: điều trị huyết tán do bất đồng nhóm máu mẹ con hệ Rh,

dùng cho người mẹ Rh (-) sau khi sinh con Rh (+) [57],[74],[138],[139] và

điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) [119].

- Anti-γG globulin: điều trị đái huyết sắc tố kịch phát lạnh PNH (Paroxysmal

nocturnal hemoglobinuria) [99].

- Anti-neutrophil serum (ANS): gây giảm bạch cầu đoạn trung tính (sản xuất

từ huyết tương thỏ) [127].

- Anti-thymocyte globulin: sản xuất từ huyết thanh thỏ [111].

- Antivenom (SAV): điều trị các rối loạn đông máu, DIC, tan máu,... do rắn

độc họ Viperidae cắn [33] (sản xuất từ huyết tương ngựa, dê, bò, cừu,...).

- Antiglobulin người sử dụng trong chẩn đoán (Coombs test), sản xuất từ

huyết tương thỏ, ngựa...[22].

Hiện nay lượng KHT rất thiếu hụt ở các nước nghèo do các nhà sản xuất

chỉ sản xuất KHT từ huyết tương người hoặc từ động vật tinh chế hai

bước,...giá thành tăng lên gấp nhiều lần, kèm theo là nguy cơ phải đóng cửa

các trang trại nuôi ngựa sản xuất KHT vì không đem lại lợi nhuận, do giá đắt,

do thị trường eo hẹp, do những đạo luật bảo vệ động vật không cho lấy máu,...

đã khiến việc sản xuất KHT càng trở lên kém hấp dẫn; kết quả là sự khan

hiếm về số lượng và chủng loại trên thị trường, hậu quả tất cả đổ lên người

bệnh. Để duy trì sản xuất KHT phục vụ đa số như hiện nay, chính phủ một số

nước miễn thuế cho sản xuất KHT [77], tăng cường hỗ trợ sản xuất KHT

miễn phí cho người nghèo (Thái Lan) [96],[104],[119],[160],[148], tăng

12

cường hỗ trợ ngân sách từ các tổ chức quốc tế, các tổ chức từ thiện để duy trì

số lượng, chất lượng các sản phẩm [153],[67],[63],[68],[149].

1.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG:

1.3.1. Phương pháp tủa lạnh bằng Ethanol:

+ Phương pháp tủa Cohn:

Là phương pháp tách các thành phần máu và huyết tương bằng thay đổi

nồng độ ethanol, pH, nhiệt độ, lực ion...quy trình này còn được gọi là: quy

trình tách "tủa protein" đã biết ra khỏi các protein chưa biết trong huyết

tương; được phát minh lần đầu tiên bởi Edwin Joseph Cohn (1892-1953),

người Mỹ [169]; phát minh lúc đó đã góp phần cứu sống hàng vạn người

trong Chiến tranh thế giới thứ II; đến nay vẫn là phương pháp cơ bản trong

tách chiết các chế phẩm máu và huyết tương tại các Trung tâm Huyết học -

Truyền máu trên thế giới [31].

Phân đoạn huyết tương theo phương pháp Cohn thu được albumin

huyết thanh, -globulin, fibrinogen, thrombin và một số yếu tố đông máu.

Fibrinogen và các phần phân đoạn của thrombin được nghiên cứu sâu hơn,

chế tạo thành các sản phẩm fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin.

Các -globulin tìm thấy trong Fraction Cohn II, III được chứng minh có

tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh sởi, bệnh bại liệt, điều chỉnh và ngăn ngừa

bệnh viêm gan truyền nhiễm cho những người lính trong chiến tranh thế giới

thứ hai. Fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin đã được sử dụng điều trị

nạn nhân bỏng, trong đó có một số nạn nhân từ cuộc tấn công tại Trân Châu

Cảng, giúp tỷ lệ ghép da thành công tăng cao. Fibrinogen keo lỏng rất hữu ích

trong kết nối dây thần kinh bị cắt đứt. Fibrin bọt và thrombin được sử dụng để

kiểm soát chảy máu, đặc biệt là trong tổn thương gan và khối u, giảm thiểu

chảy máu từ tĩnh mạch lớn cũng như đối phó với dị tật mạch máu trong não.

13

Màng fibrin được sử dụng để cầm máu trong các ứng dụng phẫu thuật khác

nhau, bao gồm cả phẫu thuật thần kinh, tuy nhiên, không hữu ích trong việc

kiểm soát chảy máu động mạch.

Sau này Martin MacPhee (Hội chữ thập đỏ Mỹ) trong đầu những năm

90, đã thử nghiệm thành công sản phẩm "Băng keo fibrin” trong quân y Mỹ;

đây là loại fibrinogen có khả năng ngăn chặn xuất huyết động mạch.

+ Phương pháp Cohn cải tiến [31]:

Để sản xuất một lượng lớn albumin, -globulin miễn dịch; nhiều nơi sử

dụng phương pháp Cohn có bổ xung điều kiện pH, nhiệt độ, lực ion, nồng độ

ethanol của môi trường tủa cho phù hợp với từng thành phần của huyết tương,

như: các cải tiến của tác giả Gerlough (1955), Hink (1957), Van Aken (1996),

Mulford , Kistler và Nitschmann, William N. Drohan....

- Phương pháp Van Aken (1996):

Fraction I (F1): sử dụng ethanol 8%, pH 7,2, - 3oC, lực ion 0,14.

Thu được F-VIII, Von - Willebrand, fibrinogen (5,1% protein).

Fraction II (F2): xử lý nước mặt bước 1, ethanol 25%,- 5oC, pH 6,9.

Thu được F-II, V, VII, IX, X và IgG, IgA, ít IgM (3% protein)

Fraction III (F3): xử lý nước mặt bước 2 bằng ethanol 18%, pH 5,2.

Thu được AT-III, bổ thể, IgM, protease inhibitor.

Fraction IV (F4): xử lý nước mặt bước 3 (IV- 1) bằng ethanol 40%, pH 5,8.

Thu được tủa IV- 2 có haptoglobin transferrin, -globulin.

Fraction V (F5): xử lý nước mặt bước 4 (IV- 2) bằng ethanol 40%, pH 5,8.

Thu được tủa V chứa albumin và -globulin (1% protein).

Nước mặt V được tủa ethanol 40%, - 3oC, pH 5,2 thu được albumin sạch.

Quy trình này cho 5 sản phẩm (Fraction I, II + III, IV- 1; IV- 2, V) trong

đó, mỗi bước lại chiết tách các sản phẩm tinh khiết hơn.

Như vậy, Gamma globulin miễn dịch có mặt trong F-II.

14

Sản phẩm này có thể sử dụng với dung dịch lỏng tiêm bắp cơ IGIM; để

đảm bảo an toàn và hiệu quả cao, cần sản xuất dạng tiêm tĩnh mạch IGIV. Có

nhiều phương pháp sản xuất IGIV, nhưng phương pháp sử dụng F-II Cohn

loại bỏ Fc của IgG được nhiều nước sử dụng có kết quả. Có thể tóm tắt

phương pháp này như sau: F-II thu được bằng phương pháp Cohn cho tác

dụng với pepsin ở pH 5; sản phẩm thu được đem thẩm tích loại bỏ Fc và

pepsin, cho sản phẩm an toàn hơn, giảm phản ứng phụ, có thể tiêm tĩnh mạch.

- Phương pháp Gerlough (1955): sử dụng ethanol 20% thay vì 40%

trong Fraction II và III, làm giảm tiêu thụ ethanol; ngoài ra, tác giả kết hợp

hai Fraction IV vào một bước, giảm số fraction yêu cầu.

- Phương pháp Hink (1957): phương pháp này năng suất cao hơn do tái sử

dụng một số các protein huyết tương bị loại bỏ trong các Fraction IV.

- Phương pháp kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol của William N. Drohan:

Phương pháp này kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol, tách được ba thành phần

huyết tương có giá trị: tủa lạnh yếu tố VIII, fibrinogen, yếu tố Von-

Willebrand; IgG (F-II); albumin. Phương pháp này được Mỹ, Đức, Pháp, Italy

và nhiều nước đang phát triển sử dụng có hiệu quả, trang bị đơn giản, các sản

phẩm đạt độ tinh khiết tốt, nhất là albumin đạt trên 85%, giảm được dịch tủa

ethanol.

- Phương pháp Mulford: sử dụng Fraction II và III là bước cuối trước khi

xử lý nhiệt, kết hợp Fraction IV và V (hạn chế là albumin không tinh khiết).

- Phương pháp Kistler và Nitschmann: cung cấp albumin tinh khiết hơn,

tương tự như phương pháp Gerlough, Fraction II, III thực hiện ở nồng độ

ethanol thấp hơn 19%, pH 5,8. Fraction IV được kết tủa ở điều kiện ethanol

40%, pH 5.8 và nhiệt độ - 8oC; albumin, bị thu hồi trong Fraction V, được

tinh chế bằng cách chiết xuất ở ethanol 10%, pH 4,6 và nhiệt độ - 3oC.

15

Sau phát minh của Cohn, việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm máu,

chế phẩm huyết tương và truyền máu từng phần đã phát triển nhanh ở các

nước tiên tiến. Tới nay, một số nước đã tách được trên 20 sản phẩm, tập trung

vào các nhóm sản phẩm có hiệu quả cao trong điều trị như albumin, globulin

miễn dịch, các yếu tố đông máu.

1.3.2. Phương pháp tủa bằng muối:

Phương pháp này dùng trong tinh chế IgG, mảnh kháng thể Fab, F(ab’)2.

Để thu được một thành phần protein, cần phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh

phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein các dung môi hoặc các

hoá chất có ái lực với nước mạnh hơn để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein

đó, giúp cho protein kết tủa. Thường sử dụng dung môi (acetone, ethanol)

hoặc muối trung tính để kết tủa protein. Sự kết tủa có tính chọn lọc: các

protein khác nhau kết tủa ở nồng độ dung môi và muối khác nhau.

Để kết tủa protein huyết tương, thường dùng nhất là ammonium

sulphate (NH4)2SO4, do muối này có mức độ hoà tan rất cao trong nước, ít

làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme; ưu

điểm nữa là khả năng kết tủa chọn lọc protein, loại bỏ được nhiều protein

không mong muốn trong huyết tương. Lưu ý, khi sử dụng, phải bổ sung vào

huyết tương một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá

nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm

chí có thể làm biến tính một số protein kém bền. Hạn chế của phương pháp là

mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulphate cao, tỷ trọng của dung

môi lớn, để kết tủa được các protein, phải ly tâm tốc độ cao và nhiệt độ thấp,

sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo.

Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường dùng biện

pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng

cách lọc qua gel sephadex.

16

Muối (NH4)2SO4 rẻ và phổ biến, độ hòa tan lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở

25oC); thường được sử dụng ở dạng bột rắn, cho vào huyết tương tới nồng độ

bão hoà 40-50%, ủ ở nhiệt độ, pH nhất định, trong thời gian thích hợp tùy loại

huyết tương của người hay động vật để đạt kết quả cao nhất. Thu IgG qua ly

tâm hoặc lọc thu tủa, hòa lại kết tủa bằng một lượng đệm tối thiểu; thẩm tích

đối với đệm trước khi dùng.

Để loại bỏ những thành phần protein không cần thiết, có thể gây biến

tính chọn lọc bằng nhiệt độ, pH. Phương pháp này thích hợp với protein chịu

acid và bền nhiệt: đưa nhiệt độ của dung dịch protein lên 50 - 70oC và pH ≤ 5;

những protein không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính, được

loại bỏ bằng ly tâm hoặc lọc.

Khi thu hoạch các mảnh kháng thể F(ab), F(ab’)2, phải cắt Fc bằng các

enzyme pepsin hoặc papain. Đây là các protease thủy phân protein, xúc tác

cho quá trình thủy phân liên kết peptid của phân tử protein. Nhiệt độ có tác

dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme đến tốc độ cực đại chừng nào

enzyme chưa bị biến tính; khi nhiệt độ tăng đến 60 - 70oC, enzyme mất hẳn

hoạt tính. Các bước tinh sạch protein thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp

dưới 40oC, để hạn chế sự biến tính enzyme. Để loại bỏ các protein tạp và các

tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường kết hợp nhiều biện pháp khác

nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của

môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các

dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi

ion), điện di, phương pháp lọc gel.

1.3.3. Phương pháp sắc ký (chromatography):

Dựa trên nguyên lý trao đổi ion dùng DEAE (Diethyl amino ethyl), CM

(Carboxyl methyl), hoặc lọc qua gel sử dụng Sephacryl S - 200,...bằng

phương pháp này, độ tinh khiết của sản phẩm đạt 99%. Tuy nhiên giá rất cao,

17

sử dụng một khối lượng lớn dung dịch đệm (buffer), trong khi so với phương

pháp Cohn chất lượng cũng không tốt hơn là bao. Mất mát trong quá trình sắc

ký nhiều hơn, hiệu suất thấp, làm số lượng lớn sẽ khó khăn, cho nên nhiều

nước kết hợp các phương pháp tủa lạnh ethanol với sắc ký. Theo phương

pháp này, sau ly tâm huyết tương tươi đông lạnh có ba nhóm nguyên liệu cần

tinh khiết và chiết tách bằng phương pháp sắc ký.

+ Nhóm 1 (tủa lạnh sau ly tâm): nếu sắc ký ta thu được bốn thành phần: F-

VIII, fibrinnogen, F.Von Willebrand, fibronectin.

+ Nhóm 2 (nước mặt sau ly tâm): Nếu sắc ký sẽ thu được sáu thành phần: F-

VII, IX, XI, AT III, pascal, protease inhibitor, IgG.

+ Nhóm 3: nhóm này có hàm lượng lớn nhất được tủa bằng ethanol 40%, pH

5,8 nhiệt độ 5oC sẽ thu được albumin và -globulin, có thể tủa thêm lần hai,

với ethanol 40%, pH 4,8. Phương pháp sắc ký tuy thu được các sản phẩm khá

tinh khiết, nhưng mất mát qua các bước của quy trình cũng khá nhiều.

1.3.4. Phương pháp miễn dịch hấp thụ:

Sử dụng kháng thể đơn dòng, đặc hiệu kéo các sản phẩm cần thu hoạch

ra khỏi hỗn hợp chung. Tuy nhiên chi phí cho phương pháp này quá cao nên

chỉ dùng trong phòng thí nghiệm.

1.3.5. Phương pháp lọc qua màng ma trận với các vật rắn:

Gần tương tự như phương pháp sắc ký trao đổi ion. Phương pháp này

sản xuất được lượng nhưng giá trị lọc không cao, nên vấn đề chất lượng, giá

thành đầu ra là một vấn đề cần bàn tới.

Tóm lại: sản xuất - globulin miễn dịch đặc hiệu chống nọc rắn từ

huyết tương người không khó đối với các cơ sở sản xuất chế phẩm máu của

ngành Huyết học - Truyền máu, vấn đề là người cho huyết tương chứa KT

18

chống nọc rắn không đủ số lượng máu để cung cấp cho sản xuất với số

lượng lớn, hiệu giá KT thấp và nhiều phiền phức khác. Vậy nên, chỉ có thể

tạo nguồn huyết tương từ ngựa theo phương pháp miễn dịch chủ động.

1.4. HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN:

1.4.1. Khái niệm:

HTKNR là sinh phẩm chứa các γ-globulin miễn dịch kháng nọc rắn có

khả năng trung hòa đặc hiệu nọc rắn tương ứng, thu được từ động vật hoặc từ

người đã được miễn dịch, được tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết

theo quy định và để loại bỏ các protein không cần thiết [7],[9].

Thuật ngữ “antivenin” xuất phát từ tiếng Pháp “venin”, nghĩa là nọc, từ

gốc chữ Latinh “venenum”, nghĩa là chất độc “poison”. Năm 1895, thuật ngữ

antivenin bắt đầu được sử dụng, đến nay đã phổ biến khắp toàn cầu. Từ 2003,

thuật ngữ “antivenin” tiếng Pháp đã được WHO chuyển thành tiếng Anh:

“antivenom”, cả hai danh pháp đều được công nhận và sử dụng như nhau.

1.4.2. Lịch sử phát minh:

Năm 1894, Calmette, Phisalix và Bertrand báo cáo tại hội nghị khoa

học tại Paris về kết quả xác định đặc tính kháng nọc rắn hổ của huyết thanh

thỏ. Năm 1895, Albert Calmette và Le’Pinay đã chế tạo thành công HTKNR

rắn hổ đất Việt Nam từ huyết tương ngựa và sử dụng HTKNR chế tạo điều trị

cứu sống nạn nhân, lần đầu tiên trên thế giới, HTKNR được sử dụng hiệu quả

trên người (Barbara J. Hawgood, 1999)[43]. Việc gây miễn dịch cho động

vật, lấy huyết thanh trị bệnh cứu người - kiểu miễn dịch thụ động (passive

immunity), do Emil Adolf Von Behring và Shibasaburo Kitasato phát minh

năm 1890 đã được A. Calmette ứng dụng trong thực tiễn, sản xuất thành công

HTKNR [64]. Nghiên cứu, chế tạo thành công HTKNR đã mở ra một thời kỳ

19

mới trong điều trị tai nạn rắn độc trên trái đất. Từ đó, các nghiên cứu về

HTKNR ngày càng phát triển, ứng dụng điều trị ngày càng hiệu quả, an toàn.

HTKNR có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược hầu hết các triệu chứng nhiễm độc

nọc rắn và đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu tử vong và tàn

phế (Chippaux J.P., Goiffon M., 1992 [54], Isbister G.K., 2010) [79]. Hàng

nhiều thập kỷ trôi qua, qua tác dụng thực tiễn của HTKNR, WHO đã khẳng

định: “HTKNR là thuốc đặc trị rắn độc cắn duy nhất phổ biến khắp toàn cầu,

giải quyết một trong những vấn đề y tế còn tồn tại của thế giới”[6].

1.4.3. Cơ sở miễn dịch học:

1.4.3.1. Kháng nguyên nọc rắn:

Các độc tố nọc rắn sau khi đã được khử độc tính, bảo đảm an toàn cho

động vật gây mẫn cảm mà vẫn giữ được tính sinh miễn dịch, tính kháng

nguyên gọi là KN nọc rắn. Nọc rắn trở thành kháng nguyên do có đủ các đặc

điểm của chất sinh miễn dịch đó là tính lạ, kích thước phân tử đủ lớn, có

thành phần và tính không thuần nhất về phương diện hoá học, có khả năng

giáng hoá. Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể thì mức độ sinh miễn dịch

phụ thuộc vào mức độ lạ. Khác biệt về di truyền càng lớn, khác biệt về kháng

nguyên giữa hai cơ thể càng nhiều. Do đó, các độc tố nọc rắn có đặc điểm thứ

nhất là hoàn toàn “lạ” với cơ thể động vật gây mẫn cảm. Các kháng nguyên

có tính sinh miễn dịch tốt thường có trọng lượng phân tử trên 100 kDa.

Những phân tử có trọng lượng phân tử thấp từ 0,5-10 kDa, có tính sinh miễn

dịch yếu. Một số trường hợp có trọng lượng phân tử < 1 kDa có tính sinh

miễn dịch rất yếu [16],[34]. Độc tố nọc rắn họ Elapidae chủ yếu là dạng

neurotoxins, là các polypeptide có kích thước nhỏ, lan truyền, hấp thụ trong

cơ thể nạn nhân rất nhanh, nhưng khi chế tạo kháng nguyên lại khó khăn do

có tính sinh miễn dịch yếu. Các phân tử không hoà tan có tính sinh miễn dịch

lớn hơn các phân tử nhỏ và hoà tan do dễ bị đại thực bào nuốt và xử lý. Vì

20

vậy, có thể gây ngưng tập các toxins dạng polypeptid trọng lượng phân tử nhỏ

bằng nhiệt, làm tăng tính không hoà tan của các đại phân tử, tạo thuận lợi cho

đại thực bào nuốt chúng và làm tăng tính sinh miễn dịch.

Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên mạnh hay yếu còn phụ thuộc tính

chất của hệ thống sinh học mà nó xâm nhập, kiểu hình di truyền của túc chủ

và cách gây mẫn cảm (liều lượng, đường vào của kháng nguyên, sử dụng các

tá chất miễn dịch hay không) [16],[19],[28]. Cấu trúc di truyền của túc chủ

ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh miễn dịch cũng như cường độ của đáp ứng.

Việc sử dụng động vật gây mẫn cảm cho hiệu quả cao cần phải lựa chọn.

Ngay cả chế độ ăn cũng cần phải đảm bảo, giúp cho sinh kháng thể tốt nhất.

Ngoài ra, bất kỳ kháng nguyên nào cũng cần sự kết hợp giữa liều lượng tối

ưu, đường vào của kháng nguyên và qui trình gây mẫn cảm, nhằm đạt đáp

ứng miễn dịch với cường độ cao nhất. Liều kháng nguyên quá thấp và liều

quá lớn kháng nguyên cũng không kích thích được đáp ứng miễn dịch vì

chúng làm cho các tế bào lympho rơi vào trạng thái không đáp ứng. Đưa

kháng nguyên vào cơ thể một lần, chỉ kích thích sinh miễn dịch với cường độ

thấp. Nếu kháng nguyên vào cơ thể lặp lại nhiều lần trong vòng thời gian vài

tuần sẽ gây đáp ứng miễn dịch với cường độ cao [16],[25].

Tá dược (adjuvant): là những chất khi được trộn với kháng nguyên, tiêm

gây mẫn cảm sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên. Sử dụng tá

dược làm tăng đáp ứng miễn dịch khi kháng nguyên có tính sinh miễn dịch

thấp hoặc khi chỉ có được một lượng nhỏ kháng nguyên. Tá dược kéo dài sự

tồn tại của kháng nguyên trong cơ thể túc chủ gây mẫn cảm. Khi tiêm kháng

nguyên + tá dược, kháng nguyên được giải phóng chậm hơn từ nơi tiêm vào

cơ thể túc chủ, thời gian tiếp xúc với kháng nguyên sẽ tăng lên [1],[2],[16].

Sự tăng kích thước của tá chất + kháng nguyên làm tăng hiệu quả đáp ứng

miễn dịch vì các đại phân tử dễ được đại thực bào nuốt hơn. Tá dược Freund

21

là một tá dược hay được sử dụng. Tá dược Freund hoàn toàn (Freund’s

complete adjuvant) có thêm Mycobarterium chết, hoà trong nhũ tương dầu, có

hiệu lực cao hơn tá dược Freund không hoàn toàn (Freund’s incomplete

adjuvant). Các dipeptide của Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào, làm

tăng hoạt động thực bào, tăng biểu lộ các phân tử MHC lớp II trên màng tế

bào, đồng thời tăng tiết các cytokine như IL-1, cytokine do đại thực bào tiết

ra, là đồng kích thích tố hoạt hoá các tế bào lympho TH. Cả hoạt động trình

diện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào lympho TH đều tăng

lên khi có tá chất. Một số tá dược kích thích phản ứng viêm tại chỗ và mạn

tính, thu hút các tế bào làm nhiệm vụ thực bào và lympho đến nơi có kháng

nguyên. Sự thâm nhiễm các tế bào này tại nơi tiêm tá chất dẫn đến hình thành

các u hạt. Đại thực bào tại u hạt là đại thực bào hoạt hoá, làm tăng hoạt hoá

lympho TH. Tùy từng trường hợp, khi gây mẫn cảm cho túc chủ, kháng

nguyên nọc rắn được phối hợp với các tá dược khác nhau, theo nhiều phương

pháp khác nhau, theo từng tác giả,... miễn sao hiệu quả nhất [16],[25].

1.4.3.2. Kháng thể chống nọc rắn:

Bản chất kháng thể chống nọc rắn là gamma globulin miễn dịch IgG,

đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, lưu hành trong máu và bạch huyết, hoạt

động đáp ứng miễn dịch bằng cách trung hoà, loại bỏ các kháng nguyên nọc,

được tạo ra sau khi gây mẫn cảm cho động vật với kháng nguyên nọc rắn

tương ứng, đặc hiệu.

Kháng thể chống nọc rắn nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một

kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên. Trong phản ứng chống

độc tố nọc rắn (toxins), kháng thể chống nọc rắn gắn với độc tố, trung hòa,

làm giảm mất độc tính của độc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các độc tố trên

lên các thụ thể tế bào, giúp các tế bào của cơ thể tránh được các rối loạn do

các độc tố đó gây ra. Một cơ chế khác là hoạt hóa bổ thể. Khi hệ thống bổ thể

22

được hoạt hóa bởi kháng thể chống nọc rắn IgG, hiện tượng thực bào, thanh

lọc phức hợp miễn dịch và phóng thích các phân tử hóa hướng động được

diễn ra. Sau khi gắn vào kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có

thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc). Các tế bào NK có

thể thực hiện chức năng độc tế bào và ly giải các độc tố bị opsonine hóa bởi

các kháng thể. Tiếp xúc lặp đi lặp lại với cùng một kháng nguyên, sẽ dẫn đến

việc tạo ra kháng thể có ái lực cao hơn với kháng nguyên (thuần thục ái lực),

tạo ra các kháng thể có khả năng bám và trung hoà độc tố hiệu quả hơn [16],

[25]. Khi lượng IgG được tạo ra đã đạt số lượng cần thiết, các tế bào

lymphocyte B sử dụng một cơ chế đặc biệt gọi là phản hồi kháng thể

(antibody feedback), dập tắt các đáp ứng miễn dịch dịch thể. Tế bào plasma

chế tiết kháng thể sẽ di chuyển đến tuỷ xương, tại đây chúng tiếp tục sản sinh

ra các kháng thể ngay cả khi kháng nguyên đã được loại bỏ. Các tế bào

lymphocyte B mang trí nhớ miễn dịch không chế tiết kháng thể nhưng lưu

hành trong máu, tồn tại hàng tháng hoặc hàng năm, khi kháng nguyên tái xuất

hiện thì chúng sẽ nhanh chóng đáp ứng. Kháng thể chống nọc rắn cạp nia đa

giá là tập hợp nhiều kháng thể đặc hiệu chống rất nhiều thành phần độc tố

khác nhau; hiện nay không thể sản xuất HTKNR theo dạng sản xuất kháng

thể đơn dòng (Jose’ Maria Gutierrez, Guillermo Leon, 2003) [82],[125],[32].

1.4.4. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR:

1.4.4.1. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn:

Mục đích nhằm khử độc tính nọc, đảm bảo an toàn cho ngựa gây mẫn

cảm, kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh. Để chế tạo được kháng

nguyên, phải có nọc rắn chuẩn, chất lượng tốt, đại diện cho quần thể rắn độc

cần sản xuất HTKNR. Phải tuyển chọn chính xác, nhận diện đúng, phân loại

đúng loài rắn cần nghiên cứu. Tuyển chọn rắn không đại diện, HTKNR sẽ

23

không có tác dụng. Nọc để tạo HTKNR phụ thuộc theo mùa, vùng địa lý, đặc

tính di truyền từng loài rắn. Một số cơ sở sản xuất HTKNR dùng nọc rắn thu

được từ các quốc gia khác nhau để sản xuất HTKNR, kết quả không cao. Thí

dụ, Viện Nghiên cứu y học Nam Phi dùng nọc rắn Đông Phi chế tạo HTKNR

cho Tây Phi, kết quả hiệu lực kháng nọc rất hạn chế (Daltry J.C, Wuster W.,

Thorpe R.S, 1996) [20],[60]. Tuyển chọn rắn khỏe, tiến hành nuôi dưỡng cẩn

thận, giúp cho việc lấy nọc nhiều lần. Nọc rắn thu được phải sạch, không lẫn

máu, làm khô tự nhiên sau đó đông khô và bảo quản ở - 20oC. Chế tạo kháng

nguyên có nhiều phương pháp, hiện nay nhiều cơ sở thường dùng phương

pháp của Theakston RDG, sử dụng glutaraldehyde để bất hoạt độc tính nọc.

Khử độc bằng chiếu xạ hoặc nhiệt độ... có thể gây hủy hoại hoàn toàn những

kháng nguyên quan trọng, thậm chí phá vỡ cả cấu trúc protein nọc, tạo ra

những kháng thể không cần thiết, làm ra các HTKNR hiệu lực thấp.

Sau khi chế tạo được kháng nguyên, phải kiểm tra tính an toàn cho động

vật trước khi sử dụng)[13]: kiểm tra tính an toàn trên chuột lang (Safety test),

kiểm tra chí nhiệt tố trên thỏ (Pyrogen test), cấy khuẩn để xác định kháng

nguyên vô khuẩn (Sterility test). Để đánh giá được tính sinh miễn dịch,

thường phải sau hai, ba lần gây mẫn cảm. Có thể kiểm tra bằng gây mẫn cảm

trên thỏ trước khi làm chính thức.

Theo dõi đáp ứng miễn dịch sau mẫn cảm bằng thử nghiệm Ouchterlony,

ELISA, điện di miễn dịch huyết thanh đã có kháng thể và hiệu giá kháng thể

[12],[15],[22],[26][73].

1.4.4.2. Gây mẫn cảm, tạo nguồn huyết tương giàu kháng thể:

- Lựa chọn động vật: có thể chọn ngựa, lừa, dê, thỏ, chó, phôi trứng gà [126],

[129]...Dùng ngựa gây mẫn cảm, cung cấp huyết thanh đã có từ thế kỷ trước,

nhưng đến nay, nhiều trung tâm sản xuất HTKNR vẫn chọn ngựa, do ngựa

cho số lượng lớn huyết tương với giá rẻ và dễ làm, máu được lấy đều đặn một

24

khối lượng lớn mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của ngựa, mang đến hiệu

quả kinh doanh cho nhà sản xuất, nhất là đối với các nước đang phát triển,

nạn nhân rắn độc nhiều, khả năng chi trả của bệnh nhân thấp. Thường dùng

ngựa đực trưởng thành, từ 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 - 350 kg.

Cứ một lít máu ngựa có thể cho 100 ml HTKNR, một con ngựa cho khai thác

huyết tương khoảng sáu năm (Lê Văn Hiệp, 2010) [159]. Cừu có đáp ứng

miễn dịch khác với ngựa, không gây phản ứng tại chỗ như ở ngựa khi dùng tá

dược Freund’s (Karlson-Stiber C., Persson H., Heath A. et al., 1997) [84].

Tuy gây mẫn cảm chỉ cần một lượng nhỏ nọc đã đạt mức kháng thể đặc hiệu

tối đa, nhưng số máu lấy chỉ được 500ml/lần với cừu lớn trưởng thành.

- Gây mẫn cảm: hiệu lực của HTKNR phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể, tính

đặc hiệu và mức cô đặc. Vì vậy, huyết tương sản xuất cần có hiệu giá kháng

thể cao, đây là một yêu cầu quan trọng và là một vấn đề thường xuyên đặt ra

cho tất cả các nhà sản xuất. Thông thường, phải miễn dịch ngựa theo lịch

trình tăng dần lượng nọc tiêm vào cơ thể ngựa, hiệu giá kháng thể sẽ tăng

theo mỗi lần miễn dịch. Liều kháng nguyên và khoảng cách thời gian giữa các

lần tiêm kháng nguyên được xác định trước khi gây mẫn cảm, thường từ 2-4

tuần. Tùy theo mức độ độc của nọc rắn (LD50) và kỹ thuật chế tạo kháng

nguyên để qui định liều kháng nguyên mỗi lần gây mẫn cảm cho phù hợp. Tá

dược tạo sự thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa tế bào macrophages và tế bào

lympho, hỗ trợ hiệu quả quá trình sinh kháng thể. Huyền dịch kháng nguyên

nọc rắn trong tá dược Freund’s cũng làm giảm độc tính nọc vì nọc được giải

phóng từ từ vào cơ thể động vật mẫn cảm (Christensen, Latifi, Sawai, 1972)

[20].

- Theo dõi hình thành kháng thể: trong suốt lịch trình gây mẫn cảm, theo dõi

sự hình thành kháng thể đặc hiệu, sử dụng kỹ thuật Ouchteclony, khuếch tán

hai chiều trong gel agarose1%, nếu xuất hiện các đường vòng cung tủa KN -

25

KT đặc hiệu, cho thấy đã hình thành kháng thể trong máu ngựa. Điện di miễn

dịch huyết thanh ngựa sau khi gây mẫn cảm với kháng nguyên nọc rắn để xác

định tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên.

1.4.4.3. Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể:

Sau khi ngựa đã có kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn với hiệu giá cao sẽ

lấy máu, thu huyết tương hoặc huyết thanh để sản xuất HTKNR. Theo Warrell

D.A, Theakston R.D.G (1971) tuy một số nhà sản xuất vẫn dùng huyết thanh

để sản xuất, song ngày nay đa số nhà sản xuất dùng huyết tương thu được từ

máu chống đông [20].

Dùng huyết tương có lợi điểm sớm hoàn trả được khối hồng cầu cho

ngựa, đảm bảo sức khỏe ngựa hồi phục sớm, giúp cho đáp ứng sinh kháng thể

chống nọc rắn được mạnh hơn. Ly tâm hoặc để lắng, tách khối hồng cầu để

truyền trả cho ngựa càng sớm càng tốt. Thường lấy máu vào bình thủy tinh

hoặc bình nhựa vô khuẩn chuyên dùng với thể tích lớn trên 10 lít. Hệ thống

lấy máu được thiết kế theo vòng kín để đảm bảo vô trùng, dễ khử khuẩn. Máu

lấy không được để vỡ hồng cầu, ảnh hưởng đến chất lượng huyết thanh.

Lượng máu lấy cần tính toán cân nhắc trước, tùy theo trọng lượng, sức khỏe

ngựa. Theo Lê Văn Hiệp (2010) thường lấy số lượng máu không quá 1,5%

trọng lượng cơ thể ngựa, trung bình một tháng/lần; cứ 1 lít máu ngựa cho

được ≈ 100ml HTKNR [159].

Cần chú ý an toàn cho người lấy máu khi làm việc với ngựa. Phải có các

dụng cụ chuyên dùng cố định thân mình và cổ ngựa, vừa dễ lấy máu, an toàn

cho người lấy máu.

1.4.4.4. Tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn:

Đến nay, việc tinh chế HTKNR có thể thực hiện theo một trong ba kỹ

26

thuật chế tạo là IgG, F(ab’)2 và Fab [136]. Tùy điều kiện và kinh nghiệm của

nhà sản xuất, nhu cầu điều trị của từng quốc gia, từng địa phương và từng loại

nọc rắn; có thể sản xuất HTKNR ở một trong ba dạng sản phẩm trên, sau đó

tinh chế loại bỏ các thành phần khác, chỉ để lại phần đặc hiệu tác dụng với

độc tố nọc rắn là phần IgG, F(ab’)2 hoặc Fab, với mức độ cô đặc cao nhất. Để

giảm thiểu phản ứng quá mẫn khi sử dụng HTKNR, dùng pepsin cắt bỏ phần

Fc của γ-globulin miễn dịch, tạo ra mảnh F(ab’)2 (Latifi, 1978) [20], sau đó

tinh chế, cô đặc mảnh F(ab’)2. Phần Fc là nơi có nhiều thụ thể kết dính tế bào,

là trung gian của các phản ứng quá mẫn được loại bỏ. Mảnh F(ab’)2 vẫn còn

khả năng kết hợp hai kháng nguyên được giữ lại.

Một phương pháp khác tinh chế HTKNR là dùng papain cắt Fc của IgG,

thu hồi hai mảnh Fab, mỗi mảnh có một vị trí kết hợp kháng nguyên. Trọng

lượng Fab khoảng 50.000.

Hình 1.2. Vị trí tác động của pepsin và papain.

27

Mảnh Fab có ưu điểm: chỉ có một vị trí kết hợp kháng nguyên, Fab

không hình thành phức hợp miễn dịch, không gây phản ứng quá mẫn type -

III [11]; phần Fc đã mất nên không kết hợp bổ thể, hoặc macrophages, loại bỏ

quá trình giải phóng amin hoạt mạch; mảnh Fab không gây shock phản vệ

hoặc phản ứng dạng phản vệ; do kích thước nhỏ, Fab thấm vào khoang nội

bào nhanh hơn. Tuy nhiên, do thời gian bán hủy F(ab’)2 là 36 giờ, dài hơn bán

hủy F(ab) (khoảng 4 giờ), dẫn đến hiệu quả điều trị thấp. (Dart R.C, McNally

J., 2001) [61].

Tại Hội nghị độc học thế giới tại Mexico lần thứ 12 (1997), các nhà khoa

học đã thống nhất quan điểm cho rằng hiệu quả điều trị của HTKNR F(ab’)2

phù hợp hơn F(ab). Hàng chục năm nay, ba vấn đề lớn của sản xuất HTKNR

từ ngựa vẫn là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu là: hiệu lực chưa đủ

mạnh, phản ứng không mong muốn còn cao và giá thành đắt.

1.4.4.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm:

Bất kỳ nhà sản xuất HTKNR nào cũng đều có hệ thống kiểm tra chất

lượng của mình, bao trùm tất cả quy trình sản xuất, quản lý chất lượng toàn

diện (Total quality management - TQM) [18]. Kiểm soát, làm chủ được quy

trình sản xuất thể hiện ở chất lượng sản phẩm có đạt Tiêu chuẩn Quốc gia và

Quốc tế hay không. Trong từng giai đoạn sản xuất, công tác kiểm tra, giám

sát và đánh giá chất lượng được thực hiện thường xuyên, chặt chẽ. Giai đoạn

nào cũng hoàn thành mục tiêu, yêu cầu chất lượng của giai đoạn đó, đây là

nền tảng thành công của sản phẩm cuối cùng. Không hoàn thành tốt kết quả

giai đoạn trước sẽ làm hỏng toàn bộ công việc của giai đoạn sau.

Sau khi HTKNR ra đời, sản phẩm sẽ được đánh giá chất lượng với hai

bước độc lập với nhau là Kiểm định cơ sở và Kiểm định Quốc gia [7],[9].

Kiểm định cơ sở thực hiện tại cơ sở sản xuất HTKNR, với những thử

nghiệm cơ bản: an toàn chung, vô khuẩn, không có chí nhiệt tố và hiệu lực;

28

nếu đạt, sẽ được tiếp tục kiểm tra tiếp bước sau, đó là kiểm định Quốc gia tại

Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế. Cơ quan này có

trách nhiệm đánh giá, kiểm định chất lượng độc lập, khách quan, khoa học

cho các sinh phẩm y tế đã được nhà sản xuất đánh giá chất lượng. Tiêu chuẩn

chất lượng của huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) được quy định thống

nhất trong Dược điển Việt Nam, có tính chất pháp lý và trọng tài, có giá trị

tiêu chuẩn hóa chất lượng, giúp quản lý và nâng cao chất lượng dược phẩm

sản xuất và lưu hành trong nước.

Tóm lại: quy trình sản xuất HTKNR cho thấy, bản chất HTKNR là

các IgG chống nọc rắn đặc hiệu, do đó các cơ sở Huyết học - Truyền máu

có điều kiện tách chiết và tinh chế được gamma globulin, đều có thể sản

xuất được chế phẩm HTKNR.

1.5. TAI NẠN DO RẮN CẠP NIA VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN

XUẤT HTKN-RCN TẠI VIỆT NAM

1.5.1. Tình hình tai nạn do rắn cạp nia tại Việt Nam:

Việt Nam có địa hình và khí hậu rất thuận lợi cho rắn độc phát triển,

trong đó có các loài rắn cạp nia. Cho đến nay, Việt Nam được biết là nơi cư

ngụ của 193 loài rắn thuộc 69 giống, 8 họ; trong đó ghi nhận tổng số 53 loài

rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ Rắn hổ Elapidae và 18 loài (8 giống)

thuộc họ Rắn lục Viperidae. Bên cạnh đó, sự phân bố theo vùng địa lý của các

loài rắn độc cũng khác nhau: 12 loài chỉ ghi nhận ở miền Bắc, 19 loài chỉ ghi

nhận ở miền Nam và 22 loài ghi nhận ở cả hai miền đất nước.

Với hệ thống kênh rạch chằng chịt và mùa nước nổi hàng năm, cùng

thời tiết ấm áp phù hợp với sự phát triển của rắn, số nạn nhân rắn độc hàng

năm ở miền Nam nhiều hơn miền Bắc.

29

Các loài rắn nguy hiểm nhất ở miền Nam là rắn cạp nia nam (Bungarus

candidus), rắn choàm quạp (Agkistrodon rhodostoma), rắn hổ mèo (Naja naja

siamensis). Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) gây tử vong tại bệnh viện

tới > 80% (Trịnh Xuân Kiếm, 2010) [6],[89]; trong khi tỷ lệ tử vong do rắn

choàm quạp (Agkistrodon rhodostoma) khoảng 22% (WHO, 1999) [147], tử

vong do rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) xấp xỉ 40% (Lê Khắc Quyến,

2010) [6],[33]...

Ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung, thường gặp nhất là rắn cạp nia bắc

(Bungarus multicinctus), rắn hổ mang phì (Naja naja atra), rắn hổ mang chúa

(Ophiophagus hannah) và một số loài rắn lục, trong đó nhiều nhất và nguy

hiểm hàng đầu là rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) [71],[72].

Như vậy, rắn cạp nia bắc và cạp nia nam là hai loài rắn nguy hiểm nhất

Việt Nam, độc tính nọc rắn ức chế rất mạnh cả màng trước và màng sau sinap

thần kinh-cơ, gây liệt cơ vân, trong đó có cơ hô hấp, gây tử vong nhanh nếu

không được cấp cứu kịp thời. Khi điều trị không đặc hiệu - không có HTKNR

- bệnh nhân phải thở máy dài ngày, trung bình 4 - 6 tuần, rất vất vả, tốn kém,

nhiều biến chứng và vẫn có thể tử vong.

Đến nay, chúng ta vẫn chưa có số liệu đầy đủ về tình hình và ước tính

số lượng nạn nhân do rắn cạp nia cắn trong cả nước. Theo Trịnh Xuân Kiếm

(2001), tại bệnh viện Chợ Rẫy, từ năm 1990 đến tháng 4/1996, có 23 trường

hợp nhập viện, chiếm 2,6% tổng số nạn nhân rắn độc cắn vào viện Chợ Rẫy

điều trị [6], tỷ lệ tử vong của nhóm bệnh nhân này tại viện lên tới trên 80%.

Cũng theo tác giả và cộng sự (2010), từ 1998 đến 2007, bệnh viện Chợ Rẫy

tiếp nhận 42 trường hợp rắn cạp nia nam cắn, chiếm 2,1% [88]. Theo Phạm

Ngọc Thảo (2010) [35], trung bình mỗi năm bệnh viện Chợ Rẫy tiếp nhận

2500 trường hợp nhập viện, trong đó do rắn độc chiếm 34,7%, xấp xỉ hàng

ngàn người mỗi năm. Như vậy, số nạn nhân rắn cạp nia ước chừng hơn 20

30

người/năm, bằng khoảng 1/3 so với bệnh viện Bạch Mai. Theo Nguyễn Thị

Dụ, Hà Trần Hưng (2010), tại ICU - Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch

Mai, có 81 bệnh nhân bị rắn cạp nia bắc cắn trong ba năm 2004 - 2006, trong

đó 27 trường hợp nhập viện trong năm 2006. Tỷ lệ tử vong tại viện dù được

cấp cứu với đầy đủ điều kiện tốt nhất vẫn tới ≈ 7%.[72]. Trong thực tế, tai nạn

do rắn cạp nia tại Việt Nam hiện chưa được thống kê đầy đủ và có hệ thống

ngoài một số nghiên cứu đề cập trên đây. Đây là thực tế không chỉ diễn ra tại

Việt Nam và đã được Tổ chức y tế Thế giới khuyến cáo toàn cầu: “Tai nạn do

rắn độc là một vấn đề y tế bị lãng quên”[147].

Tuy nhiên, qua báo chí hàng năm, liên tiếp nhiều nơi trong cả nước có

thông tin về việc cấp cứu điều trị bệnh nhân bị rắn cạp nia cắn, đa số là rất

nặng, điều trị vất vả do thở máy dài ngày và biến chứng; điều này cho thấy sự

phổ biến của tai nạn do rắn cạp nia trong cộng đồng, mức độ nguy hiểm trong

thực tế do loài rắn này gây ra, cũng như tình hình cấp cứu ở các tuyến cơ sở

và tuyến bệnh viện cho loại mặt bệnh này. Thí dụ: Ngày 29/7/2007: “Bệnh

nhân “ôm” máy thở… bác sĩ đứng canh”, nói về tình trạng vất vả của bệnh

nhân, người nhà bệnh nhân và các bác sĩ, nhân viên y tế tại Trung tâm chống

độc bệnh viện Bạch Mai do không có HTKN-RCN [165]; Ngày 27/6/2008:

“Chữa ngộ độc rắn cắn: vất vả do thiếu huyết thanh” [166], phản ánh tình

trạng bức xúc trong cứu chữa rắn độc cắn mà không có HTKNR hiện nay;

Ngày 22/5/2013 [172]: “Đi thể dục, thiếu nữ suýt tử vong vì rắn cắn”; Ngày

22/5/2013: “Đầu hè, trúng độc do rắn độc tăng đột biến”[176]; Ngày

23/8/2013 [171]: “Xin về chờ chết vì không có tiền chữa rắn cắn”,...

Như vậy, đây là mặt bệnh có tỷ lệ tử vong cao, gây nhiều khó khăn cho

công tác cấp cứu điều trị; bệnh nhân phải thở máy dài ngày, rất vất vả cho gia

đình và nhân viên y tế, nhiều biến chứng do thở máy và nằm lâu, như viêm

phổi, viêm đường tiết niệu, suy kiệt...., ngoài ra còn gây tổn thất rất lớn về

31

kinh tế. Các vấn đề này có thể được giải quyết dễ dàng hơn rất nhiều nếu có

HTKN-RCN đa giá đặc hiệu. Trong khi, về kỹ thuật, chúng ta có đủ điều kiện

nhân lực và cơ sở vật chất để sản xuất được loại HTKNR này.

1.5.2. Chi “rắn cạp nia” Việt Nam:

- Việt Nam có 5 loài rắn độc thuộc chi Rắn cạp nia (chi Bungarus), trong đó

ba loài có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” là dễ nhầm với nhau nhất.

+ Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus):

Tên khác: rắn mai gầm, rắn mai gầm bạc.

Phân bố: miền Bắc Việt Nam, Thái Lan; Đài Loan, Trung Quốc, Mianma, bắc

và trung Lào.

Hình 1.3. Khu vực cư trú của rắn cạp nia bắc (B. multicinctus) [156].

Loài này có thể tìm thấy ở độ cao tới 1.300 m, sinh sống chủ yếu ở các

khu vực thấp, trong các bụi cây, rừng, bờ ruộng, ao hồ, đầm và rừng ngập

mặn. Rắn hoạt động về ban đêm, ban ngày ẩn trong các hang, hốc. Xuất hiện

32

nhiều từ cuối mùa xuân và ngủ đông trong tháng mười một. Thức ăn là các

loài rắn khác, lươn, chạch, ếch nhái, chột và thỉnh thoảng ăn cả thằn lằn. Rắn

đẻ 3 - 15 trứng, nở thành con sau một tháng rưỡi, thường vào tháng 6,7 trong

năm. Loài rắn này nhút nhát dưới ánh sáng ban ngày nhưng rất hoạt động vào

ban đêm. Dễ bị chúng cắn nếu bị khiêu khích hoặc bị đụng phải. Lượng nọc

độc trung bình khoảng 4,6 mg -18,4 mg mỗi vết cắn. Nọc rắn cạp nia bắc có

LD50 khoảng 0,15µg/g (Steven D., Aird Glen C., et al., 1999) [131].

+ Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus):

Tên khác: Malayan kraid, Common krait, Blue krait, Javan krait.

Phân bố: Việt Nam, Campuchia, Indonexia, Lào, Malaysia [136],

Myanmar, Singapore, Thái Lan [157],[24]. Đây là loài rắn phổ biến nhất đồng

bằng và trung du Việt Nam.

Hình 1.4. Khu vực cư trú của rắn cạp nia nam (B.candidus) [155].

33

Về hình thái, loài này thoáng nhìn giống hệt rắn cạp nia bắc. Rắn cạp nia

nam chỉ có tối đa 32 khoang đen trên toàn bộ cơ thể. Khoang trắng rộng hơn

khoang đen, bao toàn bộ mặt bụng liên tiếp đến mặt bên thân rắn.

Rắn cạp nia nam sống chủ yếu ở đồng bằng, đồi, rừng,... đôi khi gặp ở độ

cao tới 1600 mét. Đặc tính loài giống rắn cạp nia bắc: thích sống gần nước,

bên bờ ruộng, ao hồ, đầm; hoạt động về đêm, thích ăn lươn, chạch... Rắn cạp

nia nam thường gặp nhiều nhất ở miền đông Nam Bộ đến Trung Bộ. Đây là

loài rắn độc vào loại nhất Việt Nam và là một loài rắn độc nhất thế giới, với

LD50 ≈ 0,1 µg/g (Tan N.H. et al., 2004) [135], tỷ lệ gây tử vong rất cao [117].

+ Rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) [10],[24]:

Loài rắn này có 24 - 27 khoang đen, khoang vàng xen kẽ nhau, khoang

đen bao quanh thân rắn. Rắn có ở khắp mọi miền ba nước Đông Dương. Ở

Việt Nam, loài rắn này thường gặp ở vùng đồng bằng và trung du. Rắn hay ở

bờ ruộng, bờ đê, bụi tre, gò đống... Hoạt động về đêm. Thức ăn là các loại rắn

khác, ếch, rắn mối, chuột, thậm chí cả cá. Nọc rắn cạp nong có độc tính mạnh

(Pe T., Myint T., et al., 1997)[113]. Loài rắn này chậm chạp, ít cắn người.

+ Rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus flaviceps) [24],[39]:

Đầu và phần chót đuôi rắn có mầu đỏ. Loài rắn này hiếm gặp. Ở Việt

Nam đến nay mới chỉ phát hiện thấy ở Núi Dinh, tỉnh Đồng Nai, với độ cao

trên 914 mét so với mực nước biển. Tại các nước như Thái Lan, Malaysia

cũng chỉ tìm thầy loài rắn này ở vùng núi cao. Rắn cạp nong đầu đỏ là loài rắn

độc họ rắn hổ, cùng chi rắn cạp nia (Bungarus) nhưng khá hiếm gặp. Nọc độc

loài này chủ yếu tác động màng trước sinapse và có khả năng gây rối loạn

đông máu (Ang Swe Siang, et al., (2010)[42].

+ Rắn khoang sông Hồng (RKSH) - Bungarus slowinskii:

34

RKSH (Red River Krait), mang tên nhà sinh học Mỹ chuyên nghiên cứu

về bò sát Joseph Bruno Slowinskii (1965 - 2001), người đã chết do bị rắn cạp

nia bắc cắn, khi đang nghiên cứu về loài rắn này tại Mianma [158]. Năm

2005, Kuch, Kizirian, Lawson, Donnelly, Nguyễn Quang Trường và Mebs, đã

phát hiện loài rắn này tại tỉnh Yên Bái, huyện Văn Yên, Na Hầu và lưu vực

sông Hồng. Sau đó còn phát hiện thấy loài rắn này tại Quảng Nam, Quảng

Trị, Thừa Thiên – Huế và Lào [93]. Đây cũng là loài rắn khúc đen, khúc trắng

như rắn cạp nia bắc, cạp nia nam. Loài rắn này có khoang đen rộng, khoanh

trắng rất hẹp. Đây là loài rắn độc mới phát hiện trên thế giới, thuộc chi rắn

cạp nia (Bungarus), và là một trong 5 loài rắn đặc hữu có ở Việt Nam [39].

Các hiểu biết về độc tố nọc loài rắn này chưa nhiều.

1.5.3. Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh:

- Thành phần: nọc rắn khô có trên 90% là protein, trong đó 25-70% là enzym,

còn lại là các độc tố polypeptide không enzyme, polypeptide không phải độc

tố và một số chất vô cơ.

+ Các enzym: thường gặp nhất là phospholipase A2, hyaluronidase,

phosphoesterases, peptidase [48],[50],[66],[78],[90],[124],[133]....tác dụng

phá hủy các tế bào máu, các dây thần kinh ngoại vi, cơ vân, nội mạc mạch

máu, tác động vào hoạt động màng trước synapse.

+ Độc tố polypeptide: gồm 2 loại

α-Neurotoxins: độc tố tác động màng sau synapse (Postsynaptic active

toxin), liên kết đặc biệt với các thụ thể acetylcholine, ngăn chặn dẫn truyền

xung động thần kinh-cơ [5],[62],[85],[92],[94],[100],[106],[144].

β,γ-Neurotoxins: hoạt tính màng trước synapse, gây ức chế giải phóng

acetylcholine, ngăn cản tái hấp thu choline để tổng hợp achetylcholine, thay

đổi điện thế màng sinapse do thay đổi hấp thu ion K+, Na+, gây ngưng trệ dẫn

truyền thần kinh-cơ, dẫn đến liệt cơ không hồi phục [48],[49],[91],[110].

35

Theo Middlebrook J.L., Kaiser II (1989) [102]; Manjunatha Kini (2003)

[98], thành phần nọc của rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus ) và rắn cạp

nia nam (Bungarus candidus) đều chứa hai loại độc tố thần kinh là α-

neurotoxin và β,γ-neurotoxins nhưng số lượng, thành phần khác nhau [59].

Theo Khow O., et al., (2003) [87], Inn-Ho Tsai et al., (2002) [78], trọng

lượng phân tử độc tố nọc hai loài rắn này này từ 25-25,5 kDa, cấu tạo bởi các

polypeptide 16-16,5 kDa và 7-8,5 kDa, nhỏ hơn nhiều loài rắn khác [44],[50].

Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của độc tố nọc rắn cạp nia [6].

- Bệnh cảnh lâm sàng của bệnh nhân rắn cạp nia nam cắn thường nặng nề

hơn cạp nia bắc do khác biệt về thành phần nọc và vị trí tác động tại synapse

thần kinh-cơ của hai loài rắn độc khác nhau. Cũng chính vì vậy, HTKN-RCN

đơn đặc hiệu của từng loài rắn cạp nia không có tác dụng trung hòa chéo nhau

hoặc tác dụng rất hạn chế (Warell D.A. và cs, 1983) [146].

Hướng dẫn truyền thần

kinh

Màng trước sinapse

Màng sau sinapse

36

- Nọc rắn cạp nia là loại độc tố thần kinh có trọng lượng phân tử thấp, hấp

thu và lan tỏa rất nhanh trong cơ thể, tác động cả màng trước và sau sinapse,

ức chế rất mạnh dẫn truyền thần kinh-cơ. Các dấu hiệu nhiễm độc tại chỗ rắn

cắn thường mờ nhạt, nạn nhân thường không đau, không chảy máu, khiến

phát hiện không kịp thời hoặc chủ quan coi thường. Khi triệu chứng yếu, bại,

liệt cơ xuất hiện, nạn nhân trở tay không kịp, tử vong.

1.5.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất HTKN rắn cạp nia:

1.3.1. Trên thế giới:

- Năm 1983, David Warrell khi thông báo kết quả nghiên cứu về các tai nạn

do Bungarus candidus (Malayan kraid) gây ra tại miền đông Thái Lan và tây

bắc Malaysia, tác giả đã dẫn nghiên cứu của Kuo T.P., Wu C.S. trên tạp chí

The Snake (1972) về 925 trường hợp bị rắn Bungarus multicinctus cắn tại Đài

Loan với tỷ lệ tử vong tới 23%. Đây là những cảnh báo đầu tiên về sự nguy

hiểm do rắn cạp nia gây ra [146].

- Năm 1995, Chan J.C., Cockram C.S., Buckley T. (Hongkong) [47], thông

báo về hai trường hợp bị rắn cạp nia bắc cắn (Bungarus multicinctus), với đầy

đủ triệu chứng nhiễm độc nọc rắn cạp nia, có liệt cơ hô hấp, sụp mi,...sau khi

được điều trị với HTKNR đơn giá chống nọc Bungarus fasciatus và thở máy

hỗ trợ, đã hồi phục sau tám ngày. Thời điểm này chưa có nước nào sản xuất

được HTKN-RCN cho hai loài rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) và rắn cạp nia

nam (B.candidus).

- Năm 1999, Chanhome L., Wongtongkam et al., 1999 (Thái Lan) dùng

HTKN rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) trung hòa nọc rắn cạp nia nam

(Bungarus candidus) trong in - vivo, thấy có hiệu quả tương tự như với nọc

rắn Bungarus flavicep [51], tuy nhiên nghiên cứu không nói rõ mức độ thành

công đến đâu. Như vậy, tới thời gian này Thái Lan chưa sản xuất được

37

HTKN-RCN, trong khi ở Việt Nam, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã chế tạo

thành công HTKN rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) tại Đơn vị nghiên

cứu huyết thanh kháng nọc, bệnh viện Chợ Rẫy [88].

- Năm 2002, với nghiên cứu dùng nọc rắn cạp nia nam không khử độc để gây

miễn dịch cho thỏ, các tác giả Thái Lan cho biết, thỏ nghiên cứu đã chịu được

liều tiêm dưới da với nồng độ nọc 150 – 200 µg/kg ở lần gây mẫn cảm thứ 5,

trong vòng 6 tháng nghiên cứu. Khi tăng liều trên mức này ở các lần miễn

dịch sau, thỏ đều tử vong (Chanhome L. et al., 2002) [52]. Đây là nghiên cứu

tạo nền tảng cho sản xuất HTKN rắn cạp nia nam ở Thái Lan sau này.

- Năm 2004, Trịnh Xuân Kiếm, Nguyễn Thị Dụ, Hà Trần Hưng và cộng sự

sản xuất và thử lâm sàng thành công HTKN-RCN bắc trên 27 bệnh nhân bị

Bungarus multicinctus cắn, hiệu quả rất cao [71].

- Năm 2007, Leeprasert W., Kaojarern S., (Thái Lan) [95] đã sử dụng

HTKNR của Viện QSMI, sản xuất 2004, điều trị cho ba bệnh nhân nhiễm độc

nọc rắn cạp nia nam, vào viện và được dùng HTKNR đặc hiệu rất sớm. Kết

quả có so sánh với một trường hợp vào viện cùng thời điểm, không được điều

trị bằng B.candidus antivenom. Các tác giả cho biết, ở cả ba bệnh nhân,

HTKNR đều có hiệu lực, triệu chứng liệt được cải thiện trong vòng 40 giờ sau

khi dùng thuốc. Tuy nhiên, lượng antivenom được sử dụng quá nhiều: 80, 88,

87 lọ trong thời gian 90 giờ. Điều này cho thấy, công hiệu của HTKNR

Bungarus candidus của họ không cao, nhiều nguy cơ bệnh huyết thanh sau

điều trị. Các bệnh nhân này nhiễm độc nặng (khó thở, khó nói, sụp mi mắt

trong 30 – 60 phút; được đặt nội khí quản trong 2 - 3 giờ sau khi bị rắn cắn).

Như vậy, sau Việt Nam 5 năm, Thái Lan đã sản xuất thành công B.candidus

antivenom [160], nhưng chất lượng còn phải bàn.

- Năm 2009, theo Chieh-Fan C. et al., (Đài Loan) [53], Trung tâm Vacxin và

Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Đài Loan - đã sản xuất được nhiều loại

38

HTKNR phục vụ cho cứu chữa sáu loài rắn độc nguy hiểm thường gặp nhất

Đài Loan, trong đó có loài rắn cạp nia bắc Bungarus multicinctus, loài rắn độc

gây tử vong cao nhất Đài Loan hiện nay: khi các loài rắn độc khác chỉ gây tử

vong 2,4% thì loài rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) vẫn gây tử vong

đến 24%. Hiện nay Đài Loan đã sản xuất được bốn loại HTKNR, trong đó có

HTKNR đa giá cho hai loài: rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) và rắn

hổ mang phì (Naja atra) (Chi - Wen Juan, 2012) [56].

- Malaysia là một nước ASEAN hiện đang phát triển rất mạnh các nghiên cứu

về nọc độc của rắn cũng như sản xuất các loại HTKNR ứng dụng điều trị các

loài rắn của Malaysia, trong đó có rắn cạp nia nam. Năm 2012, Tan N.H.,

Leon P.K., Phung S.Y. (Malaysia) [137], đã thí nghiệm đánh giá tác dụng

trung hòa độc tính nọc của rắn cạp nia nam Bungarus candidus (Malayan

kraid) bằng hai loại HTKN rắn hổ đa giá thường dùng nhất ở Ấn Độ là Vins

polyvalent antivenom (VPAV) và Bharat polyvalent antivenom (BPAV), kết

quả: các loại HTKNR này đều không có tác dụng. Như vậy, cho đến nay, với

nhiều thành công trong nghiên cứu, Malaysia vẫn chưa sản xuất được loại

HTKN rắn cạp nia nào, đây quả là một vấn đề không đơn giản.

- Trung Quốc cũng là nước đang phát triển mạnh các cơ sở nghiên cứu sản

xuất HTKNR, việc ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào sản xuất HTKNR

diễn ra rất nhanh chóng, làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do tai nạn rắn độc trong

những năm gần đây. Hiện nay, Trung Quốc đã sản xuất được HTKNR đa giá

cho rắn hổ mang (Naja atra) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Tuy

nhiên, ít có thông báo của các tác giả Trung Quốc về vấn đề này.

- Theo Warrell D.A. (2010), chuyên gia hàng đầu của WHO về rắn độc [147],

hiện nay thế giới mới chỉ có hai loại sản phẩm HTKN-RCN trên thị trường là:

“Bungarus candidus antivenom”, “Malayan Krait antivenin” do Viện Queen

Saovabha Memorial Institute, Thái Lan sản xuất, liều dùng 50 ml (10ml/ống),

39

trung hòa được 0.4 mg/ml nọc rắn cạp nia nam; và “Bungarus multicinctus

and Naja atra antivenom”do Chinese Shanghai Vaccine & Serum Institute

sản xuất, “Taipei Naja-Bungarus antivenin” do Đài Loan sản xuất [147].

1.3.2. Tại Việt Nam:

- Trước 1990, chúng ta vẫn chưa có một loại HTKNR nào. Việc điều trị rắn

độc cắn chỉ duy nhất bằng các phương pháp không đặc hiệu. Rất nhiều bệnh

nhân tử vong, tàn phế [6].

- Năm 1991, Đơn vị nghiên cứu chế tạo HTKN được thành lập tại bệnh viện

Chợ Rẫy, đơn vị đã nghiên cứu chế tạo được HTKNR hổ đất (Naja kaothia

antivenom) ứng dụng lâm sàng hiệu quả, làm giảm tỷ lệ tử vong từ 19,5% còn

3,1% [5],[6].

- Từ đó đến nay, việc nghiên cứu về nọc rắn và sản xuất HTKNR ở Việt Nam

đã có nhiều tiến bộ. Đã thử nghiệm thành công nhiều loại HTKNR, đáp ứng

một phần nhu cầu của bệnh nhân bị rắn độc cắn, như: HTKN rắn hổ chúa

(King cobra antivenom)[21], HTKNR choàm quoạp (Agkistrodon rhodostoma

antivenom), HTKNR lục tre (Trimeresurus albolabris antivenom), HTKNR

hổ đất (Naja kaothia antivenom), HTKNR hổ mang (Naja atra) [6],[23].

- Năm 1999, Trịnh Xuân Kiếm đã nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn

cạp nia nam (Bungarus candidus antivenom), trước Thái Lan 5 năm [88].

- Năm 2004, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã nghiên cứu, chế tạo thành công

HTKN rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), kết quả đã được Hà Trần

Hưng, Höjer J., Nguyễn Thị Dụ, Trịnh Xuân Kiếm đăng trên J. Med Toxicol,

Dec, 6, pp. 393-7 [71],[72].

40

- Với các thành công trên, Việt Nam là nước nghiên cứu, chế tạo thành công

HTKN rắn cạp nia đơn giá của hai loài rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam tương

đối sớm hơn so với các nước khác trong khu vực. Tuy nhiên, do nhiều nguyên

nhân, cho đến nay, trong khi Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc đã cho ra thị

trường sản phẩm thương mại, chúng ta vẫn chưa có HTKN rắn cạp nia đơn

giá (Monospecific) trên thị trường.

- Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, nhập khẩu

antivenom để điều trị, lâu dài không phải là biện pháp tốt, trong khi đất nước

còn ngèo, ta có tiềm lực khoa học công nghệ, đầu tư không cần nhiều. Nhu

cầu HTKNR cho bệnh nhân điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam là đòi hỏi cấp

thiết, trước mắt cũng như lâu dài. Cần chủ động tìm một giải pháp cho vấn đề

này một cách căn cơ, bài bản: đó là sản xuất HTKNR có chất lượng tốt, an

toàn, hiệu lực cao, giá thành hợp lý, sẵn sàng cứu chữa nạn nhân.

- Để cứu chữa nạn nhân rắn cạp nia cắn, cần cả antivenom monospecific và

polyspecific. Trong nhiều trường hợp không xác định được loài rắn cắn, điều

trị với HTKNR polyspecific hay hơn monospecific.

- Trên cơ sở những thành công trong nghiên cứu, sản xuất HTKN rắn cạp nia

nam và HTKN rắn cạp nia bắc, việc nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá

F(ab’)2 cho cả hai loài Bungarus candidus và Bungarus multicinctus là giải

pháp tốt, đáp ứng kịp thời nhu cầu cấp cứu điều trị nạn nhân rắn cạp nia cắn

hiện nay, nhất là khi chưa có VDK (Venom detection kits) đặc hiệu [15],[83].

41

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU:

2.1.1. Động vật thí nghiệm:

Ngựa (horse): ngựa đực 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 và 320 kg;

chăm sóc, nuôi dưỡng trong trang trại riêng biệt, đảm bảo các điều kiện

môi trường và dinh dưỡng, đủ thức ăn thô và tinh, cỏ không phun thuốc

bảo vệ thực vật, nước uống sạch: 2 con.

Thỏ (rabbit): khỏe, trọng lượng 2,5 - 3,0 kg/con, nuôi trong môi trường ổn

định nhiệt độ, chưa từng được sử dụng vào thí nghiệm khác, 6 con.

Chuột lang (Cobaye), khỏe, nuôi dưỡng đầy đủ, chưa từng được sử dụng

vào thí nghiệm khác, trọng lượng 250 - 300 gam/con, 6 con.

Chuột nhắt trắng (Swiss), 3 tuần tuổi, khỏe, trọng lượng 18 - 20 gam/con,

nuôi dưỡng tốt, chưa từng được sử dụng vào thí nghiệm khác, 100 con.

Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), rắn cạp nia nam (Bungarus

candidus): khỏe, đủ các độ tuổi, tuyển chọn ngẫu nhiên ở các vùng miền

khác nhau (đồng bằng, miền núi, ven sông...), số lượng > 100 con.

2.1.2. Vật liệu nghiên cứu:

42

Nọc rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), nọc rắn cạp nia nam

(Bungarus candidus) đông khô, bảo quản đông lạnh: 3,1 gam.

2.1.3. Hóa chất, sinh phẩm:

Tá dược Freund hoàn toàn (CFA), không hoàn toàn (IFA): hãng Sigma

và tự chế. Glutaraldehyde, pepsin, ammonium sulphate, acid clohydric, acid

sulfuric, NaOH, toluen, merthiolat: hãng Merk, Đức. Dung dịch đệm PBS: tự

chế. NaCl 0,9%: Dược phẩm TW2. Chống đông CPDA1, Heparin.

Môi trường Sabouraud, Thioglycolate, thạch agarose.

2.1.4. Dụng cụ, phương tiện, trang bị:

Laboratory của Đơn vị nghiên cứu HTKN, Trung tâm chống độc Bệnh

viện Bạch Mai, có các điều kiện trang bị kỹ thuật như sau:

- Phòng thí nghiệm thường xuyên ổn định nhiệt độ (lạnh) và vô trùng.

- Hốt lạnh vô trùng Telstar (Tây Ban Nha).

- Cân điện 0,01 mg của Heiligenstadt (Đức).

- Máy ly tâm lạnh, tủ lạnh bảo quản sinh phẩm, huyết tương.

- pH - Meth của hãng Hana (Italia).

- Nhiệt kế chính xác (Anh).

- Máy lọc Seiz + đĩa lọc Cellulose 0,2 - 0,45µm(Mỹ),

- Màng cellulose acetate thẩm tích (Đài Loan).

- Cốc đong, que khuấy thủy tinh, pipet thủy tinh, ống nghiệm,...,

- Tủ ấm, tủ sấy, bình cách thủy Bain - marie (Mỹ).

- Hệ thống cung cấp nước cất, điều chỉnh nhiệt độ nước.

- Hệ thống lọc vô trùng theo từng công đoạn kỹ thuật.

- Hệ thống sấy hấp và khử trùng dụng cụ.

- Hệ thống đóng lọ.

Dụng cụ bắt rắn, lấy nọc, bảo quản nọc chuyên dùng (Mỹ).

43

Dụng cụ gây mẫn cảm ngựa (Đài Loan).

Dụng cụ lấy máu, truyền máu ngựa chuyên dùng (Đài Loan).

Dụng cụ tách huyết tương, sản xuất khối hồng cầu ngựa.

Dụng cụ kiểm tra chất lượng KN và kiểm định cơ sở.

Máy điện di protein tự động Geni – 0 (Italia)

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu labo + thực nghiệm trên động vật.

2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm cần đạt:

Bảng 2.1. Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9][36]:

TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt của HTKN-RCN đa giá

1 An toàn chung Đạt an toàn chung

2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm

3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt

4 Hiệu giá KT/lọ Đạt > 100 LD50/lọ 5ml theo đề cương NC

5 pH 6 - 7

6 Merthiolat ≤ 0,01%

7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%

8 Nitơ toàn phần ≤ 15 %

Bảng 2.2. Tiêu chuẩn cần đạt, theo WHO guidelines, 2008 [151]:

TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt (Tham khảo)

1 An toàn chung Đạt

2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm

3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt

4 Hiệu giá KT/lọ Đạt đăng ký của nhà sản xuất

44

5 pH 6 - 7

6 Lượng chất bảo quản Phenol < 2,5 g/l, Cresols < 3,5 g/l

7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%

8 Nitơ toàn phần ≤ 100 g/l

9 Albumin ≤ 1 %

10 Globulin > 90%

2.2.3. Nội dung nghiên cứu:

2.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.

- Chế tạo kháng nguyên nọc RCN đa giá, giảm độc lực, an toàn, hiệu lực.

- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành kháng thể đặc hiệu.

- Lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu.

- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định độ tinh sạch của sản phẩm.

2.2.3.2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.

- Kiểm định cơ sở, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của HTKNR đa giá.

- Kiểm định Quốc gia tại Viện kiểm định Quốc gia VX&SPYT, Bộ y tế.

- Sơ bộ tính giá thành sản xuất, đánh giá hiệu quả kinh tế, xã hội.

2.2.4. Các phương pháp kỹ thuật nghiên cứu:

2.2.4.1. Tuyển chọn rắn, lấy nọc, bảo quản nọc:

- Chọn rắn cạp nia bắc, nam; lấy nọc, bảo quản nọc theo phương pháp của

Trần Kiên, Trịnh Xuân Kiếm và David Warell [21],[23],[24]:

+ Chọn rắn: xác định loài rắn theo hình thái và nanh độc. Rắn cạp nia bắc

(Bungarus multicinctus) có thân mình khúc đen, khúc trắng xen kẽ, khoang

trắng hẹp, số lượng khoang nhiều (trên 40 khoang). Rắn cạp nia nam

(Bungarus candidus): thân rắn “khúc đen, khúc trắng”, có ít khoang (tối đa 32

45

khoang) màu đen nhánh không khép kín, bao quanh lưng đến sát mặt bụng,

xen kẽ là các khoang trắng rộng hơn khoang đen. Rắn Bungarus slowinskii:

cũng có hình dạng “khúc đen, khúc trắng”, nhưng khúc trắng hẹp, khoang đen

rộng, thân và đầu rắn có khoang trắng hình chữ V. Nanh độc nhỏ, ngắn, sắc

nhọn và có rãnh, dễ gãy.

+ Nuôi rắn và lấy nọc rắn: cách ly, kiểm tra loại bỏ rắn ốm, tiến hành lấy nọc.

Khi lấy, ép hai bên đầu rắn, cho rắn há miệng để lộ răng độc, đưa ống capile

vào hứng nọc, lấy xong nọc từng con, bơm nọc vào lọ vô khuẩn, để khô, giữ ở

nhiệt độ 2 - 4oC, tránh ánh sáng, đông khô nọc, bảo quản - 20oC.

A B C

Hình 2.1. Ba loại rắn “khúc đen, khúc trắng” có thể gặp tại Việt Nam.

A: Rắn cạp nia bắc. B: Rắn cạp nia nam. C: Rắn khoang sông Hồng.

2.2.4.2. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực:

- Chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực: theo phương

pháp của Trịnh Xuân Kiếm và khuyến cáo của WHO, 2008 [151]:

+ Trộn lẫn hai loại nọc rắn cạp nia bắc và nam, mỗi loại 1500 mg. Pha nọc

đông khô trong dung dịch đệm BPS thành dung dịch nọc rắn cạp nia đa giá,

nồng độ 1%. Trộn dung dịch glutaraldehyde 0,25% với dung dịch nọc theo tỷ

lệ quy định, ủ ở 37oC/72 giờ/pH 7,3. Ủ tiếp ở 56oC/24 giờ.

46

+ Ly tâm lấy dịch nổi, lọc vô trùng dung dịch nọc, thu được kháng nguyên đa

giá giảm độc lực. Đóng lọ, dán nhãn, ghi ngày sản xuất, khối lượng nọc, thể

tích kháng nguyên, bảo quản ở 2 - 4oC.

- Kiểm tra chất lượng kháng nguyên theo Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9].

+ Thử an toàn chung, xác định độc tố bất thường: thực hiện trên chuột lang

Cobaye. Tiêm phúc mạc kháng nguyên với liều 1 ml/100g cho ba chuột, chuột

thứ tư không tiêm (Dược điển Việt Nam IV, 2009, chuyên luận 15, liều cho

phép < 5 ml)[9]. Theo dõi bảy ngày liên tiếp về hình thái (xù lông), giảm

trọng lượng, giảm vận động, chết. Nếu có trên một chuột bị ốm (rụng lông,

giảm trọng lượng...) hoặc chết là kháng nguyên không đạt an toàn.

+ Kiểm tra chất gây sốt trên thỏ: đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước khi thí

nghiệm; tiêm tĩnh mạch tai thỏ liều 1ml/kg cân nặng (Dược điển Việt Nam IV,

2009, chuyên luận 15, liều cho phép 1 ml/kg) [9]. Theo dõi nhiệt độ thỏ ba

giờ liên tiếp, mỗi giờ một lần. Nếu trong ba giờ, nhiệt độ mỗi thỏ thay đổi

dưới 1oC là đạt tiêu chuẩn kháng nguyên không có chất gây sốt.

+ Cấy khuẩn, cấy nấm: cấy 1ml kháng nguyên trong môi trường

Thioglycolate, để ở nhiệt độ 30 - 35oC/72 giờ, cấy 1ml kháng nguyên vào môi

trường Sabouraud, để ở nhiệt độ 20 - 25oC, theo dõi trong bảy ngày. Nếu

không mọc vi khuẩn, vi nấm là kháng nguyên đạt vô khuẩn, không có nấm.

+ Đánh giá hiệu lực sinh kháng thể bằng thử nghiệm Ouchterlony [26],[29]:

Sau khi gây mẫn cảm, lấy máu tĩnh mạch cổ ngựa, tách huyết thanh, đun

sôi và trải gel agarose 1,5% lên phiến kính + đĩa petri trong suốt, đục một lỗ

trung tâm và sáu lỗ đường kính 4 mm ở xung quanh. Nhỏ 10 µl kháng nguyên

vào ô trung tâm, 10 µl huyết thanh ngựa vào mỗi ô với tất cả sáu ô xung

quanh, ghi chép, đánh dấu vị trí kháng nguyên và huyết thanh, để vào hộp ẩm

ở nhiệt độ 37oC và nhiệt độ lạnh 2 - 6oC, sau 6, 12, 24 giờ: xem kết quả. Nếu

47

có đường tủa KN - KT, nhuộm đĩa và lam thạch agarose 1,5% với dung dịch

coomasie blue, tẩy màu bằng dung dịch tẩy màu (Methanol, acetic acid, nước

cất với tỷ lệ 4:1:5), rửa nước cất, để khô. Nếu có tủa giữa ô trung tâm và các ô

xung quanh là huyết thanh ngựa có kháng thể chống nọc rắn cạp nia, kháng

nguyên đạt yêu cầu về tính sinh miễn dịch.

+ Xác định tính đặc hiệu của kháng thể kháng nọc rắn cạp nia bằng điện di

miễn dịch HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 và kháng nguyên nọc rắn.

2.2.4.3. Gây mẫn cảm cho ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu:

- Gây mẫn cảm cho ngựa theo khuyến cáo của WHO [151] với lịch trình miễn

dịch 1 tháng/lần x 9 tháng. Tiêm kháng nguyên trộn lẫn tá dược Fruend hoàn

toàn (FCA) hoặc không hoàn toàn (FIA), với tỷ lệ 1:1. Thể tích kháng nguyên

mỗi lần tiêm là: 0,1- 0,3 - 0,5 - 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 ml. Trong đó, 1 ml kháng

nguyên có chứa ≈ 11 mg nọc rắn cạp nia đa giá của cả hai loài. Khi tiêm, cố

định thân ngựa vào khung cố định, sát trùng vùng tiêm, xác định liều lượng

cho mỗi vị trí tiêm, trộn kháng nguyên và tá dược, lắc trộn kỹ, tiêm dưới da.

Chia nhỏ lượng kháng nguyên và tá dược thành nhiều mũi, tiêm ở các vị trí

theo quy định (hình 2.2). Ngựa được ăn đầy đủ thức ăn thô và thức ăn tinh.

Lượng thức ăn tinh (ngô, cám) ≈ 6 - 8 kg/ngày. Ngựa được ăn đầy đủ loại cỏ

tươi, cỏ khô, cây ngô, cây đậu...và được chăn thả tự nhiên trong khu vực riêng

biệt, có nước uống sạch sẽ, chuồng trại đảm bảo vệ sinh.

48

Hình 2.2. Vị trí tiêm kháng nguyên nọc để gây mẫn cảm cho ngựa.

Nguồn: “WHO- Guidelines for the production, control and regulation

of antivenom immunoglobulines”, 2008 [151].

- Theo dõi sức khỏe ngựa sau tiêm KN và tá dược: theo dõi, thống kê các rối

loạn về vận động, hô hấp, tiêu hóa, tổn thương tại chỗ sau mỗi lần gây mẫn

cảm. Biểu hiện tại chỗ được theo dõi, thống kê, ghi chép (bảng 2.3).

Bảng 2.3. Phân loại mức độ ảnh hưởng sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm.

Cơ quan Mức độ ảnh hưởng

Nhẹ Vừa Nặng

Vận động Mệt mỏi, uể oải Yếu, bại Liệt

Hô hấp Thở nhanh Khó thở Rối loạn hô hấp

Tiêu hóa Ăn ít Bỏ ăn chướng bụng

Tại chỗ tiêm viêm Loét nhỏ Loét lớn

- Theo dõi hình thành KT đặc hiệu bằng thử nghiệm Ouchternoly: sau mỗi lần

49

gây mẫn cảm cho ngựa, lấy 10 ml máu ngựa, để đông, ly tâm, tách huyết

thanh, pha loãng huyết thanh với các độ pha loãng khác nhau, theo dõi mức

độ, khả năng hình thành kháng thể đặc hiệu sau mỗi lần gây mẫn cảm.

2.2.4.4. Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể:

Thu hoạch huyết tương bằng phương pháp Plasmaferesis.

- Lấy máu ngựa: cắt bờm gọn, vệ sinh sạch, cho ăn nhẹ. Khử khuẩn buồng lấy

máu, chuẩn bị các dụng cụ lấy máu vô trùng có sẵn chất chống đông, bơm

kim tiêm 10, 20 ml, kẹp cố định, đèn cồn, dây garo...). Tiến hành: cố định

ngựa, cạo lông cổ ngựa vùng lấy máu, sát trùng iod và cồn ethanol 70o, garo

tĩnh mạch cổ ngựa, lấy máu với kim lấy máu chuyên dùng có chống đông, cố

định kim. Lắc máu nhẹ nhàng tránh vỡ hồng cầu và tắc kim. Kết thúc: rút

kim, kẹp mạch máu, thả dây cố định ngựa, cho ngựa ăn cháo ấm và cỏ non.

Khi lấy máu, chú ý khối lượng máu lấy, phát hiện bất thường: thở nhanh, toát

mồ hôi, hí ầm ĩ, giãy giụa... để kịp xử trí. Vận chuyển nhẹ nhàng, tránh vỡ

hồng cầu. Bảo quản ở nhiệt độ 18 - 20oC.

- Tách huyết tương: ly tâm túi máu, tách huyết tương, bảo quản ở 2 - 4oC.

Khối hồng cầu được bù dung dịch bảo quản, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 4oC.

- Truyền trả khối hồng cầu: cố định ngựa, garos tĩnh mạch cổ ngựa, sát trùng,

chọc kim luồn sâu 5 - 7cm trong tĩnh mạch cổ ngựa, truyền trả khối hồng cầu

cho ngựa. Tốc độ truyền tùy theo sức chịu đựng mỗi ngựa.

2.2.4.5. Kỹ thuật tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab')2 :

- Tinh chế HTKNR theo phương pháp F(ab’)2 của WHO [151], gồm 6 bước:

Bước 1. Cắt Fc của phân tử kháng thể bằng pepsin: huyết tương ngựa giàu

kháng thể, trộn đều với pepsin 1%, duy trì pH 3,2 ở nhiệt độ 20oC/60 phút.

Bước 2. Tủa các thành phần không phải kháng thể: hòa tan ammonium

sulphate vào huyết tương tới tỷ lệ 14%, nâng nhiệt độ lên 56oC/60 phút. Lọc

50

bỏ tủa chứa Fc, albumin và một số thành phần khác bằng giấy lọc Whatman,

thu dịch lọc có F(ab’)2 đặc hiệu.

Bước 3. Thu tủa F(ab’)2 đặc hiệu với kháng nguyên nọc RCN đa giá: thêm

vào dịch lọc ammonium sulphate, cho tới 36% (thêm 22%). Ủ hỗn dịch trên ở

20oC, pH: 6,8 trong 60 phút. Lọc thu tủa chứa γ-globulin miễn dịch và F(ab’)2

đặc hiệu gắn với ammonium sulphate, để khô tủa.

Bước 4. Thẩm tích loại bỏ ammonium sulphate: thẩm tích bằng màng

cellulose acetate với nước cất,Thu hồi dịch thẩm tích, lọc vô trùng với máy

lọc Seiz với đĩa lọc đường kính 0,45 µm và 0,2µm, được HTKNR F(ab')2.

Bước 5. Đóng lọ vô trùng, bảo quản.

Bước 6. Xác định độ tinh sạch của HTKNR: định lượng protein, albumin,

globulin, A/G , IgG, IgG, IgM và điện di protein huyết tương ngựa sản xuất,

và điện di HTKNR-RCN đa giá F(ab’)2.

2.2.4.6. Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm:

Bước 1: sau khi tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, sản phẩm thô được đóng

chai vô khuẩn 450 - 500 ml và lấy mẫu ngẫu nhiên 30 - 50 ml dùng cho các

thí nghiệm kiểm định cơ sở gồm: an toàn chung, chí nhiệt tố, vô khuẩn, công

hiệu (hiệu giá) theo quy định của Dược điển Việt Nam III, 2002 [7], Dược

điển Việt Nam IV, 2009 [9].

Bước 2: sau khi đạt yêu cầu kiểm định cơ sở, đóng lọ vô khuẩn 5 ml/lọ, thành

một lô; tiếp theo, yêu cầu Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế

(Bộ y tế) tiến hành kiểm định chất lượng. Mẫu kiểm định được lấy ngẫu

nhiên, các thử nghiệm đánh giá chất lượng được thực hiện hoàn toàn độc lập,

khách quan với cơ sở sản xuất. Kiểm định ở Viện KĐQGVX&SPYT gồm các

thử nghiệm đánh giá an toàn và công hiệu, các thử nghiệm lý hóa để đánh giá

chất lượng HTKNR.

51

Sau khi có kết quả kiểm định quốc gia, xác định các vấn đề tồn tại, quyết

định việc xử lý tiếp đối với lô HTKNR đã sản xuất.

Kiểm định cơ sở:

- Thử nghiệm an toàn chung (Safety test):

+ Nhằm xác định sự có mặt của các độc tính bất thường trong HTKNR.

+ Tiến hành: dùng 3 chuột lang khỏe, trọng lượng từ 300 - 350 gam, nuôi

trong điều kiện ổn định một tuần trước khi thí nghiệm. Tiêm phúc mạc chuột

HTKNR, liều 1ml/100 gam trọng lượng [9]. Theo dõi sự thay đổi trọng lượng,

hình thái, sự vận động của chuột trong ba tuần. Nếu chuột vẫn phát triển bình

thường, tăng cân là đạt an toàn trên động vật thí nghiệm. Nếu có chuột ốm

hoặc chết là không đạt.

- Thử nghiệm chất gây sốt (Pyrogen test):

+ Nhằm tìm chất gây sốt có trong HTKNR nghiên cứu sản xuất.

+ Tiến hành: chọn ba thỏ khỏe, trọng lượng 2,5 - 3,0 kg; chưa từng sử dụng

vào thí nghiệm nào, nuôi một tuần trong điều kiện ổn định nhiệt độ từ 20 -

25oC. Đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước khi tiêm.

+ Tiêm tĩnh mạch rìa tai thỏ với liều lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2

1ml/kg trọng lượng [9]. Đo nhiệt độ hậu môn thỏ sau tiêm 1, 2, 3 giờ. Xác

định chênh lệch nhiệt độ ở từng con và giữa ba con với nhau trước và sau

tiêm.

+ Bình thường chênh lệnh nhiệt độ cao nhất và thấp nhất với một thỏ dưới

0,7oC; cả ba thỏ có nhiệt độ chênh lệch cộng dồn dưới 1,3oC. Nếu kết quả thử

nghiệm có giá trị cao hơn quy định là thử nghiệm không đạt.

- Thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test):

+ Cấy nấm: dùng môi trường Sabouraud /37oC.

52

+ Cấy khuẩn: dùng môi trường thạch máu /20 - 25oC.

+ Theo dõi mọc vi khuẩn trong 7 ngày, vi nấm trong 14 ngày. Nếu không mọc

vi khuẩn, vi nấm là đạt.

- Thử nghiệm công hiệu (Potency test):

+ Xác định LD50 theo phương pháp Karber [27]: cân nọc RCN hai loài cạp

nia bắc và cạp nia nam có trọng lượng như nhau, hòa tan nọc trong NaCl

0,9% để có dung dịch nồng độ 1000 g/ml. Từ dung dịch này pha loãng tiếp

để có nồng độ 500 g/ml. Tiến hành pha loãng tiếp, cách nhau 1,5 lần thành

năm độ pha loãng liên tiếp, sao cho sau khi tiêm nọc rắn có độ pha loãng thấp

nhất chuột phải chết 100% và tiêm nọc rắn có độ pha loãng cao nhất chuột

phải sống 100% (sau khi pha xong lắc đều và để ở 37oC /30 phút, tránh ánh

sáng). Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột với liều 0,2 ml/con. Mỗi độ pha tiêm 8

chuột. Theo dõi số chuột sống, chết 24 giờ với mỗi độ pha loãng.

Tính LD50 theo công thức Karber [27]:

LD50 = LD100 – ∑ Z . d/n

Trong đó: Z: số trung bình tử vong của 2 nhóm kế cận.

d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.

n: số động vật thử nghiệm trong từng nhóm.

+ Xác định ED50 của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2: pha loãng HTKN-RCN

đa giá F(ab’)2 với NaCl 0,9% để có nồng độ tăng dần từ 60 µl/ml - 80 µl/ml.

Nọc rắn cạp nia đa giá pha trong dung dịch NaCl 0,9% để có nồng độ 40 LD50

/ml. Lấy 1 ml nọc rắn cạp nia đa giá 40 LD50 /ml cho vào mỗi ống nghiệm vô

khuẩn, trộn đều với 1 ml dung dịch NaCl 0,9% + nọc rắn cạp nia đa giá ở

từng độ pha loãng. Ủ hỗn dịch trên ở 37oC/1 giờ. Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột

hỗn dịch trên với liều 0,2 ml/chuột. Số chuột thí nghiệm mỗi lượt tám

con.Theo dõi 24 giờ, ghi số chuột sống chết, tính ED50 theo quy tắc tam suất.

53

Kiểm định Quốc gia:

Lấy mẫu kiểm định, thực hiện thí nghiệm theo quy trình riêng của Viện

kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế, gồm các thử nghiệm

an toàn, công hiệu và các thử nghiệm lý hóa.

- Thử nghiệm an toàn chung (Safety test):

+ Tiến hành trên chuột lang. Theo dõi các triệu chứng nhiễm độc như: thay

đổi diện mạo bên ngoài (xù lông), trạng thái bất thường, giảm hoạt động,

giảm cân, chết do nhiễm độc.

+ Dùng hai chuột lang, 250 – 350 gam, chưa dùng cho thí nghiệm nào trước

đó, khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường trong thời gian cách ly 3 - 7 ngày.

+ Tiêm phúc mạc mỗi chuột một liều tiêm cho người ≤ 5 ml.

+ Đánh giá: thử nghiệm đạt yêu cầu nếu toàn bộ chuột thí nghiệm khoẻ mạnh

tăng trọng hoặc giảm cân không có ý nghĩa thống kê. Nếu có nhiều hơn một

chuột chết thì thử nghiệm không đạt yêu cầu. Nếu có một chuột chết hoặc chỉ

ra dấu hiệu ốm do nhiễm độc trong lần thử đầu tiên, cần làm lại thử nghiệm

với số lượng chuột gấp đôi. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu lần thử thứ hai

không có chuột chết hoặc ốm.

- Thử nghiệm chất gây sốt (Pyrogen test):

+ Dùng thỏ khỏe, trưởng thành, đực hoặc cái (nhưng không được mang thai),

cân nặng trên 1,5 kg, nuôi dưỡng bằng thức ăn không có kháng sinh. Thử

nghiệm tiến hành trong phòng yên tĩnh, tránh tiếng động và ánh sáng, nhiệt độ

phòng chênh lệch dưới 3oC so với nơi ở cũ. Trước ngày tiêm, để thỏ nhịn ăn

qua đêm (được uống nước) cho đến khi thí nghiệm kết thúc. Không cho uống

trong thời gian thí nghiệm.

+ Khi đo nhiệt độ, nhiệt kế phải đặt sâu trong trực tràng thỏ ít nhất 5 cm, để

tối thiểu năm phút. Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, kim tiêm: tất cả phải được

rửa sạch bằng nước và sấy khô 250oC/30 phút hoặc 200oC/60 phút, nếu dùng

54

đồ nhựa phải không chứa chất gây sốt và phải vô trùng. Lồng thỏ chuyên

dụng: trước khi bắt đầu, đặt thỏ trong lồng chuyên dụng trong tư thế thỏa mái

trên một giờ và duy trì ở đó suốt thời gian thí nghiệm.

+ Tiến hành: đo nhiệt độ thỏ hai lần, cách nhau 30 phút. Nhiệt độ ban đầu của

thỏ là giá trị trung bình của các lần đo này. Đưa vào thí nghiệm là những thỏ

có nhiệt độ chênh lệch giữa các lần đo dưới 0,2oC và nhiệt độ ban đầu trong

khoảng 38 - 39,8oC.

+ Tiêm tĩnh mạch tai thỏ HTKNR thử nghiệm trong bốn phút.

+ Thể tích: tiêm 1 ml/kg cân nặng. Làm ấm dung dịch đến 38,5oC trước tiêm.

+ Đo nhiệt độ thỏ 1giờ/lần trong ba giờ.

+ Mẫu được coi là đạt yêu cầu về tiêu chuẩn chất gây sốt nếu nhiệt độ chênh

lệch của mỗi thỏ ≤ 0,6oC và tổng nhiệt độ chênh lệch của ba thỏ ≤ 1,3oC.

- Thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test) [9]:

+ Dùng môi trường Thioglycolat để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí.

+ Dùng môi trường SCD để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm.

Mỗi mẫu lấy 10 ml, cấy vào hai loại môi trường, mỗi ống môi trường 1ml cho

đến hết. Cấy xong, các ống môi trường thioglycolat được chia ra để ủ ở hai nhiệt

độ 30 - 35oC và 20 - 25oC, các ống SCD ủ ở 20 - 25oC trong 14 ngày. Các ống

môi trường được theo dõi hàng ngày trong vòng 14 ngày. Sản phẩm được coi là

vô khuẩn khi không có ống môi trường nào bị nhiễm. Trường hợp bị ô nhiễm,

phải làm đồ phiến nhuộm Gram soi kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn hoặc

nấm và nhắc lại thử nghiệm với mẫu lưu. Nếu không bị nhiễm ở lần kiểm tra

thứ hai thì sản phẩm được coi là vô khuẩn. Nếu bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ

hai, dù chỉ một ống có cùng loại vi sinh vật như lần thứ nhất thì loạt sản phẩm

đó không đạt yêu cầu về vô khuẩn, lô thử nghiệm phải huỷ bỏ. Nếu không có

vi khuẩn hoặc vi nấm mọc trên môi trường thích hợp sau 14 ngày là đạt.

- Thử nghiệm xác định hiệu giá (Potency test) [9]:

55

+ Xác định LD50 nọc rắn cạp nia: pha dung dịch nọc rắn gốc bằng cách

cân một lượng nọc rắn, hoà tan nọc bằng NaCl 0,9% để có dung dịch 1000

µg/ml, bảo quản ở 2 - 4oC. Từ dung dịch nọc rắn gốc, pha trong NaCl 0,9% để

có dung dịch nồng độ 250 hoặc 500 µg/ml. Từ dung dịch nọc rắn thử nghiệm

này, pha loãng cách nhau 1,2 hoặc 1,4 lần thành 5 độ liên tiếp, sao cho sau khi

tiêm độ pha loãng thấp nhất chuột phải chết 100% và độ pha loãng cao nhất

chuột phải sống 100%. Pha xong, lắc đều để ở 37oC/30 phút, tránh ánh sáng.

Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột với liều 0,5 ml/con. Mỗi độ pha tiêm 6 chuột. Đọc

kết quả sau 24 - 48 giờ, theo dõi số chuột sống chết trong mỗi độ pha.

Tính kết quả theo công thức Spearman – Karber [9]:

Log LD50 = X0 + d/2 – d x (∑ri/n)

Trong đó:

X0 là Log của độ pha loãng nọc rắn cao nhất, làm chuột chết 100%.

d: Log của bậc pha loãng.

ri: số chuột chết của mỗi độ pha loãng.

n: số chuột được tiêm của mỗi độ pha loãng.

+ Xác định hiệu giá HTKNR: chuẩn bị dung dịch nọc rắn chứa 20 LD50/ml:

từ dung dịch nọc rắn gốc chứa 1000 µg/ml, bảo quản 4oC, pha bằng NaCl

0,9% để có dung dịch 20 LD50/ml. HTKNR thử nghiệm được lựa chọn tối

thiểu 5 mức pha loãng khác nhau, cách nhau liên tiếp 1,2 hoặc 1,4 lần sao cho

sau khi trung hòa với một lượng nọc rắn cố định thì mức pha loãng cao nhất

bảo vệ được 100% số chuột được tiêm và mức thấp nhất sẽ gây chết 100% số

chuột được tiêm. Trung hòa: trong dãy ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống:

2,5 ml dung dịch nọc rắn chứa 20 LD50/ml; một thể tích thay đổi đã lựa chọn

của HTKNR thử nghiệm; một lượng NaCl 0,9% để vừa đủ 5,0 ml mỗi ống.

Lắc nhẹ các ống, trung hòa ở 37oC trong 30 phút, tránh ánh sáng. Tiêm 0,5 ml

vào tĩnh mạch đuôi của mỗi chuột, dùng sáu chuột cho mỗi độ pha. Theo dõi

56

và ghi số chuột chết trong vòng 48 giờ.

Tính liều bảo vệ (ED50) theo công thức Spearman – Karber [9]:

Log ED50 = X0 + d/2 – d x (∑ri/n)

Trong đó:

X0: Log của thể tích huyết thanh ít nhất, bảo vệ được 100% chuột.

d: Log của bậc chênh lệch của các mức thể tích khác nhau.

ri: số chuột chết của mỗi dung dịch trung hòa.

n: số chuột được tiêm dung dịch trung hòa.

Xác định số LD50 trung hòa (nhóm chứng): từ dung dịch nọc rắn chứa

20 LD50/ml pha loãng 1/20; 1/14; 1/10; 1/7; 1/5 bằng NaCl 0,9%. Lắc nhẹ các

ống, trung hòa ở 37oC trong 30 phút, tránh ánh sáng. Tiêm 0,5 ml vào tĩnh

mạch đuôi của mỗi chuột, dùng sáu chuột cho mỗi độ pha. Theo dõi và ghi số

chuột chết trong vòng 48 giờ. Tính số LD50 trung hòa (tính T) như tính LD50

của nọc rắn ở trên.

Xác định hiệu giá theo công thức Spearman – Karber [9]:

Hiệu giá = (T – 1) / ED50

T là số LD50 dùng trung hoà trong một liều tiêm, ED50 là liều bảo vệ 50%.

o Xác định tính chất lý hóa của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2: theo quy trình

của Viện kiểm định quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế.

- Xác định pH.

- Xác định nồng độ NaCl.

- Xác định hàm lượng chất bảo quản merthiolate.

- Định lượng protein toàn phần.

2.2.5. Thời gian, địa điểm nghiên cứu:

57

- Từ 6/2008 đến 11/9/2008: Xây dựng và bảo vệ đề cương nghiên cứu tại

trường Đại học y Hà Nội. Quyết định phê duyệt đề cương số: 997 QĐ/YHN.

- Từ 1/2009 đến 5/2009: Tuyển chọn, lấy nọc rắn cạp nia nam (B.candidus) tại

cơ sở Núi Chúa Kito, Vũng Tàu. Tuyển chọn và lấy nọc rắn cạp nia bắc

(B.multicinctus) tại Lệ Mật, Gia Lâm, Hà Nội. Chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa

giá (bắc + nam) tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai.

- Từ 6/2009 - 4/20010: Nuôi ngựa, miễn dịch, lấy máu ngựa theo dõi sinh

kháng thể đặc hiệu, thực hiện tại xã Thư Phú, huyện Thường Tín, Hà Nội và

Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm dã ngoại Học viện Quân y. Theo dõi hình

thành và hiệu giá kháng thể tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai,

khoa Huyết học – Truyền máu Bệnh viện 103. Lấy máu, truyền trả khối hồng

cầu ngựa tại Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm dã ngoại Học viện Quân y.

- Từ 15/5/2010 - 15/7/2010: Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2. Kiểm định

cơ sở HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tại Đơn vị nghiên cứu huyết thanh kháng

nọc Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai.

- Từ 21/7/2010 - 11/2011: Kiểm định Quốc gia HTKN-RCN đa giá F(ab’)2

thực hiện tại viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế. Định lượng

protein, albumin, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, điện di protein huyết thanh ngựa

nghiên cứu và HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tại Phòng xét nghiệm Miễn dịch,

Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương.

Điện di miễn dịch HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tại viện IMVS, Australia.

Cấy nấm tại khoa Ký sinh trùng và Nấm y học, HVQY.

Cấy khuẩn tại khoa Vi sinh y học Bệnh viện 103 và bệnh viện Bạch Mai.

- 12/2011: Bảo vệ luận án cấp cơ sở.

2.2.6. Xử lý số liệu: theo các thuật toán thống kê.

2.2.7. Sơ đồ nghiên cứu: (trang tiếp theo)

58

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH KHÁNG NỌC

RẮN CẠP NIA ĐA GIÁ F(ab’)2 TỪ HUYẾT TƯƠNG NGỰA

Chế tạo KN (đa giá, giảm độc lực)

an toàn, hiệu lực

Gây mẫn cảm cho ngựa Theo dõi hình thành KT đặc hiệu

Thu huyết tương Truyền trả khối hồng cầu

Tinh chế HTKNR Đánh giá mức độ tinh sạch

59

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN

CẠP NIA ĐA GIÁ F(ab’)2 ĐÁP ỨNG TIÊU CHUẨN VIỆT NAM:

3.1.1. Kết quả chế tạo KN, đánh giá chất lượng KN:

3.1.1.1. Kết quả tuyển chọn và lấy nọc rắn cạp nia:

Bảng 3.1. Kết quả tuyển chọn và lấy nọc rắn cạp nia (bắc + nam).

Lần lấy nọc rắn

B.multicinctus B. candidus Số rắn mỗi lần lấy nọc

Rắn(con)

Nọc(gam)

SLNTB (mg/con)

Rắn(con)

Nọc(gam)

SLNTB (mg/con)

Lần 1 84 0,5 5,9 30 0,3 10 114

Lần 2 130 0,6 4,6 55 0,5 9,0 185

Lần 3 62 0,5 8,0 60 0,7 11,6 122

Cộng 276 1,6 5,79 145 1,5 10,3 421

* Chú thích: SLNTB: số lượng nọc trung bình của một con rắn/lần lấy nọc.

Kiểm định cơ sởXác định mức độ an toàn & hiệu lực

Kiểm định Quốc giaKết luận về mức độ an toàn & hiệu lực của

HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu

Bảo quản, sử dụng

60

- Tổng số rắn lấy nọc cả ba đợt là 421 con, với 276 rắn cạp nia bắc và 145 cạp

nia nam. Đợt thứ nhất lấy nọc 114 con, thu được 0,8 gam nọc. Đợt hai lấy nọc

185 con thu được 1,1 gam nọc. Đợt ba lấy nọc 122 con được 1,2 gam nọc.

- Ba đợt lấy nọc tại Vũng Tàu thu được 1,5 gam nọc rắn cạp nia nam (145 lần

lấy nọc). Nọc rắn cạp nia bắc thu được qua ba đợt lấy nọc tại Lệ Mật (Gia

Lâm, Hà Nội) là 1,6 gam (276 lần lấy).

- Lượng nọc rắn thu được trung bình trong một lần lấy ở một con rắn cạp nia

bắc thấp nhất là 4,6mg, nhiều nhất là 8 mg, trung bình là 5,79 mg/con.

- Lượng nọc trung bình trong một lần lấy ở một con rắn cạp nia nam thấp nhất

là 9 mg, nhiều nhất là 11,6 mg, trung bình là 10,3 mg/con.

3.1.1.2. Khảo sát mức độ thường gặp của các loài rắn độc trong chi rắn cạp

nia (Bungarus) ở Việt Nam:

Bảng 3.2. Đánh giá sơ bộ về mức độ thường gặp của chi RCN ở Việt Nam

Loài rắn

Nơi gặp

Rắn cạp nong

Bungarusfasciatus

Cạp nia nam

Bungaruscandidus

Cạp nia bắcBungarusmulticinctus

RKSHBungarusslowinskii

Cạp nong đầu đỏ

Bungarus flaviceps

Bắc bộ, Trung bộ

(++) (-) (+++) (+) (-)

Nam bộ, nam Trung

bộ

(++) (+++) (-) (-) (-)

* Chú thích: Không gặp: (-). Gặp nhưng số lượng rất ít: (+) .

Thường gặp, số lượng ít: (++). Thường gặp, số lượng nhiều: (+++)

- Khảo sát sơ bộ về mức thường gặp của các loài rắn độc thuộc chi Rắn cạp

nia (Bungarus) tại một số địa phương ở miền Bắc, miền Trung: Lệ Mật (Gia

Lâm, Hà Nội), Phụng Thượng (Phúc Thọ, Hà Nội), Vĩnh Sơn (Vĩnh Tường,

61

Vĩnh Phúc), Cẩm Thủy (Thanh Hóa), Thanh Chương (Nghệ An), Hương Khê

(Hà Tĩnh), Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng,... không gặp Rắn khoang sông Hồng

Bungarus slowinskii, Rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus flaviceps), Rắn cạp nia

nam (Bungarus candidus); chỉ gặp Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus)

và Rắn cạp nong (khúc đen khúc vàng - Bungarus fasciatus).

- Khảo sát tại miền Tây-Nam bộ và Nam Trung-Bộ: Nha Trang (Khánh Hòa),

Trại rắn Đồng Tâm & Bảo tàng rắn Việt Nam (Tiền Giang), Cần Thơ, Bến Tre

và Miền Đông Nam bộ: Bình Phước, Bình Dương, Tây Ninh, Bà Rịa-Vũng

Tàu,...chúng tôi không gặp Rắn cạp nia bắc, Rắn khoang sông Hồng, Rắn cạp

nong đầu đỏ; chỉ gặp Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) và Rắn cạp nong

(Bungarus fasciatus).

3.1.1.3. Kết quả chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực:

Bảng 3.3. Thể tích KN và lượng nọc tương ứng được khử độc.

Loại lọ

KN

Thể tích KN & lượng nọc được khử độc

0,1 ml

0,3 ml

0,5 ml

1 ml

2 ml

3 ml

4 ml

5 ml

6 ml

Số mg nọc/lọ ≈ 1,1 3,3 5,5 11 22 33 44 55 66

Số lọ KN 12 12 12 22 12 12 12 12 12

Thể tích (ml)

∑ = 272,8 ml1,2 3,6 6 22 24 36 48 60 72

- Thể tích kháng nguyên sau khi lọc vô trùng là 272,8 ml.

- Số nọc rắn cạp nia (bắc và nam) đã dùng chế tạo kháng nguyên là ba gam

62

(3000 mg), như vậy: trong 1 ml kháng nguyên có 3000 mg: 272,8 = 10,997

mg nọc (≈ 11mg/ml).

- Đã đóng lọ kháng nguyên với chín loại thể tích, ba loại lọ thể tích từ 0,1 đến

0,3 ml/lọ và sáu loại lọ thể tích từ 1 đến 6 ml/lọ, tương đương 12 liều kháng

nguyên.

- Liều tiêm thấp nhất đã dùng là 0,1 ml chứa 1,1 mg (1100 µg) nọc rắn cạp nia

đa giá. Đã dùng tiêm cho ngựa 320 kg, tức là 1100 µg : 320 kg = ~ 3,4 µg

nọc/kg trọng lượng ngựa.

- Đã tiêm liều cao nhất với lọ 6 ml, chứa lượng kháng nguyên bằng 60 lần liều

thấp nhất (0,1 ml), với lượng nọc rắn cạp nia đa giá là: 60 x 3,4 = 204 µg

nọc/kg trọng lượng ngựa (= 11,3 µg/gam).

3.1.1.4. Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên:

Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm an toàn chung với kháng nguyên.

ChuộtTN

Trọng lượng(gam)

Số ml KN

đã sử dụng

Số mg nọc

trong KN

Thay đổi của chuột NC Trọng lượng tăng thêm (gam)

Vận động

Hình thái

Trọng lượng (gam)

1 230 2,3 25,3 Bt Bt 240 10

2 235 2,35 25,8 Bt Bt 250 15

3 250 2,5 27.5 Bt Bt 260 10

4 245 0,0 0 Bt Bt 255 10

* Chú thích: Bt = bình thường.

- Trọng lượng chuột lang từ 230 gam đến 245 gam.

63

- Đã tiêm liều lượng 1 ml kháng nguyên /100 gam cân nặng cho chột lang, với

tổng liều tiêm chuột số 1: 2,3 ml; chuột lang số 2: 2,35 ml; chuột lang số 3:

2,5 ml; chuột lang số 4 là chuột chứng nên không tiêm.

- Theo bảng 3.3, 1 ml kháng nguyên có 11 mg nọc; vậy số lượng nọc rắn được

khử độc khi tiêm kháng nguyên với chuột lang số 1 là 11 x 2,3 = 25,3 mg; với

chuột số 2 là 11 x 2,35 = 25,8 mg; với chuột số 3 là 11 x 2,5 = 27,5 mg.

- Cả ba chuột lang số 1,2,3 đều sống và hoạt động bình thường, không thay

đổi hình thái, không bị rụng lông, tăng trọng từ 10 đến 15 gam giống như

chuột chứng (chuột số 4).

Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm chí nhiệt tố với kháng nguyên.

ThỏTN

Trọng lượng(kg)

KN(ml)

Số lượng nọc(mg)

Nhiệt độ trước/sau tiêm KN(oC)Thay đổinhiệt độcao nhấtKhởi

đầuSau

1 giờSau

2 giờSau

3 giờ

1 2,1 2,1 23,1 38,5 38,9 39,0 38,5 0,5oC

2 2, 3 2,3 25,3 39,1 39,8 39,2 39,1 0,7 oC

3 2,2 2,2 24,2 39,3 39,5 39,8 39,3 0,5 oC

- Trọng lượng thỏ thí nghiệm từ 2,1 đến 2,3 kg. Tiêm liều 1 ml/kg, vậy số

lượng kháng nguyên tiêm cho thỏ số 1 là 2,1 ml; thỏ số 2 là 2,3 ml; thỏ số 3 là

2,2 ml. Theo bảng 3.3, 1 ml kháng nguyên có 11 mg nọc; vậy số lượng nọc

rắn cạp nia đa giá tương ứng số lượng kháng nguyên dùng cho thỏ thứ nhất là:

64

11 x 2,1 = 23,1 mg; thỏ thứ hai là 11 x 2,3 = 25,3 mg; thỏ thứ ba là 11 x 2,2 =

24,2 mg.

- Trong 01 ml kháng nguyên có 11 mg (11.000 µg) nọc rắn cạp nia đa giá

(bảng 3.3), tức là 11 µg nọc/gam trọng lượng thỏ (11.000 µg/1000 gam).

- Nhiệt độ ban đầu khi chưa tiêm kháng nguyên ở thỏ số 1 là 38,5oC ; thỏ số 2

là 39,1oC; thỏ số 3 là 39,3 oC: chênh nhau dưới 1oC.

- Sau tiêm KN 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ: ở cả ba thỏ thí nghiệm nhiệt độ thay đổi

dưới 1oC (từ 0,5 – 0,7oC). Thay đổi nhiệt độ ở thỏ số 1 là 0,5oC; thỏ số 2 là

0,7oC; thỏ số 3 là 0,5 oC. Cả ba thỏ nghiên cứu không bị ốm, bị chết.

Bảng 3.6. Kết quả cấy khuẩn, cấy nấm với kháng nguyên.

Môi trường Sabouraud (37oC) Môi trường Thioglycolate (20-25oC)

Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính

- Dùng dung dịch kháng nguyên cấy vào môi trường Sabouraud, điều kiện

nhiệt độ tối ưu (37oC); quan sát tại các thời điểm: ngày thứ 3, ngày thứ 7,

ngày thứ 14: không thấy mọc vi nấm.

- Dùng dung dịch kháng nguyên cấy vào môi trường Thioglycolate, nhiệt độ

20 - 25oC, quan sát sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày: không thấy mọc vi khuẩn.

- Kết quả cấy khuẩn cấy nấm với kháng nguyên nọc rắn nghiên cứu chế tạo,

thấy không mọc vi khuẩn, vi nấm.

65

Ảnh 3.1: Nọc rắn cạp nia đông khô.

3.1.2. Kết quả gây mẫn cảm ngựa và theo dõi đáp ứng miễn dịch:

3.1.2.1. Liều lượng kháng nguyên, tá dược gây mẫn cảm ngựa:

Bảng 3.7. Liều lượng KN nọc rắn cạp nia đa giá và tá dược đã sử dụng.

Lần mẫn cảm

Liều lượng

Lần

1

Lần

2

Lần

3

Lần

4

Lần

5

Lần

6

Lần

7

Lần

8

Lần

9

Kháng nguyên (ml)

∑ = 21,9 ml0,1 0,3 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0

Nọc rắn (mg)

∑ = 232 mg1,1 3,3 5,5 11 22 33 44 55 66

66

Tá dược CFA (ml)

∑ = 0,9 ml0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 0

Tá dược IFA (ml)

∑ = 21 ml0 0 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0

KN + tá dược (ml)

∑ = 33,8 ml0,2 0,6 1 2 4 6 8 10 12

Số vị trí tiêm

∑ = 51 1 3 5 2 4 6 8 10 12

- Số lần gây mẫn cảm là chín lần, cách nhau một tháng/lần.

- Tổng cộng số lượng kháng nguyên dùng gây mẫn cảm cho ngựa chín lần là

21,9 ml.

- Số lượng nọc rắn cạp nia đa giá dùng gây mẫn cảm chín lần là 232 mg.

- Lượng tá dược Freund’s hoàn toàn (CFA) đã sử dụng là 0,9 ml với ba lần sử

dụng, mỗi lần cách nhau một tháng.

- Lượng tá dược Freund’s không hoàn toàn (IFA) đã dùng là 21 ml, với sáu

lần sử dụng, mỗi lần cách nhau một tháng.

- Tổng số kháng nguyên và tá dược đã dùng là 33,8 ml; tỷ lệ kháng nguyên /tá

dược là 50/50.

- Tổng số mũi tiêm đã gây mẫn cảm là 51 mũi; lần tiêm gây mẫn cảm ít nhất

là 01 mũi; lần tiêm nhiều nhất là 12 mũi.

- Theo bảng 3.3, 1 ml kháng nguyên có 11 mg nọc; vậy liều kháng nguyên tối

thiểu (0,1 ml) chứa 1,1 mg nọc rắn cạp nia đa giá và liều kháng nguyên tối đa

(6 ml) chứa: 11 x 6 = 66 mg.

67

Ảnh 3.2: Kháng nguyên.

3.1.2.2. Kết quả theo dõi sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm:

Bảng 3.8. Các thay đổi về sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm.

Lầ

ngâ

y

mẫn

cảm

Ngựa 1 Ngựa 2

Toàn thân

Tại

chỗ

Toàn thân

Tại

chỗVận

động

Hô

hấpTiêu hóa

Vận

động

Hô

hấp

Tiêu

hóa

1Yếu,

bạibt

Bỏ ăn,

ăn kémbt

Yếu,

bạibt

Bỏ ăn,

ăn kémbt

2 Yếu,

bạibt Bỏ ăn,

ăn kém

Loét

da

Yếu,

bạibt Bỏ ăn,

ăn kém

Loét

da

68

3Yếu,

bạibt

Bỏ ăn,

ăn kém

Loét

da

Yếu,

bạibt

Bỏ ăn,

ăn kém

Loét

da

4 bt bt bt bt bt bt bt bt

5 bt bt bt bt bt bt bt bt

6 bt bt bt bt bt bt bt bt

7 bt bt bt bt bt bt bt bt

8 bt bt bt bt bt bt bt bt

9 bt bt bt bt bt bt bt bt

* Chú thích: bt = bình thường.

- Ba lần đầu với liều khởi động hệ miễn dịch, cả hai ngựa xuất hiện yếu bại,

hạn chế vận động, ngựa mệt mỏi, bỏ ăn hoặc ăn kém vài ba ngày, loét da xuất

hiện tại chỗ tiêm.

69

Ảnh 3.3: Sẹo và vết loét sau tiêm KN+tá dược CFA.

- Sau tiêm kháng nguyên và tá dược tá dược Freund’s hoàn toàn (CFA) gây

mẫn cảm lần thứ nhất (một điểm tiêm): tại chỗ tiêm tấy đỏ, sau đó hình thành

một vết loét đường kính khoảng 2 - 4 cm.

- Gây mẫn cảm lần thứ hai (tiêm ba vị trí) và lần thứ ba (tiêm năm vị trí): tại

chỗ tiêm sưng tấy đỏ, hình thành các vết loét lớn có đường kính khoảng 5 - 10

cm, chảy dịch, tạo mủ viêm.

- Gây mẫn cảm lần thứ bốn đến lần thứ chín với kháng nguyên + tá dược

Freund’s không hoàn toàn (IFA), sức khỏe ngựa bình thường; toàn thân và tại

chỗ không có biểu hiện giống như khi tiêm kháng nguyên và tá dược Freund’s

hoàn toàn (CFA).

70

3.1.2.3. Hiệu giá kháng thể kháng nọc RCN sau mỗi lần gây mẫn cảm:

Bảng 3.9. Kết quả hiệu giá KT đặc hiệu kháng nọc RCN sau gây mẫn cảm.

Ngựa NC

Hiệu giá kháng thể sau mỗi lần gây mẫn cảm

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

Lần 6

Lần 7

Lần 8

Lần 9

Ngựa

số 11/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/2048 1/2048

Ngựa

số 2 1/8 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/2048

- Sau gây mẫn cảm tháng đầu tiên, xuất hiện kháng thể đặc hiệu kháng nọc

rắn cạp nia đa giá ở cả hai ngựa thí nghiệm, với hiệu giá là 1/8.

- Sau tháng thứ hai, ngựa số 2 có hiệu giá kháng thể 1/32 và ngựa số 1 là 1/16.

- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ ba ở ngựa số 1 là 1/32; ở ngựa

số 2 là 1/64.

- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ tư ở ngựa số 1 là 1/64; ở ngựa

số 2 là 1/128.

- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ năm ở ngựa số 1 là 1/128; ở

ngựa số 2 là 1/256.

- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ sáu ở ngựa số 1 là 1/256; ở

ngựa số 2 là 1/512.

- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ bảy ở ngựa số 1 là 1/512; ở

ngựa số 2 là 1/1024.

71

- Sau gây mẫn cảm lần thứ tám và lần thứ chín: hiệu giá kháng thể ở cả hai

ngựa nghiên cứu đạt mức cao nhất, ổn định, với hiệu giá 1/2048.

Lần 1Lần 2

Lần 3Lần 4

Lần 5Lần 6

Lần 7Lần 8

Lần 90

500

1000

1500

2000

2500

8 16 32 64128

256

512

2048 2048

Ngựa 1 Ngựa 2

Biểu đồ 3.1. Đáp ứng miễn dịch ở ngựa trong quá trình gây mẫn cảm.

3.1.2.4. Xác định kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên nọc RCN đa giá:

- Xác định sự hình thành kháng thể kháng nọc rắn cạp nia bằng thử nghiệm

Ouchterlony. Sử dụng kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá gây mẫn cảm cho

ngựa và huyết thanh ngựa sau gây mẫn cảm để thử nghiệm.

- Kết quả cho thấy: xuất hiện các vết tủa trên thạch agarose 1,5% giữa vị trí

trung tâm có kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá và các vị trí xung quanh có

huyết thanh ngựa (hình 3.2).

72

Ảnh 3.4: Vết tủa KN-KT trên thạch agarose 1,5% (Ouchterlony test).

- Kết quả điện di miễn dịch huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia nghiên cứu

với nọc Rắn cạp nia Bungarus candidus, thấy các vạch tủa KN - KT xuất hiện

rất rõ (hình 3.3).

Ảnh 3.5: Xác định KT đặc hiệu với KN nọc RCN bằng điện di miễn dịch.

73

3.1.3. Kết quả lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối hồng cầu:

Bảng 3.10. Khối lượng máu, huyết tương và khối hồng cầu thu được.

Số lượng

Ngựa NC Máu ngựa

(lít)Huyết tương

(lít)Khối hồng cầu

(lít)

Ngựa 1Lần 1 3,6 2,2 1,4

Lần 2 5,1 3,1 2,0

Ngựa 2Lần 1 2,3 1,4 0,9

Lần 2 5,5 3,3 2,2

Cộng cả 2 lần 16,5 10,0 6,5

-Mỗi ngựa nghiên cứu đã được lấy máu hai lần: ngựa số 1 lấy được 8,7 lít.

ngựa số 2 lấy được 7,8 lít.

-Cả hai ngựa với tổng cộng bốn lần lấy máu thu được 16,5 lít máu.

-Từ số máu trên tách được 10 lít huyết tương và 6,5 lít khối hồng cầu.

-Lần lấy máu đợt một ở cả hai ngựa nghiên cứu đã thu được 5,9 lít máu. Lần

lấy máu đợt hai thu được 10,6 lít.

-Số lượng huyết tương thu được ở cả hai ngựa trong lần lấy máu thứ nhất là

3,6 lít và lần lấy máu thứ hai là 6,4 lít.

-Số lượng huyết tương thu được của ngựa thứ nhất là 5,3 lít với hai lần lấy

máu; số lượng huyết tương thu được của ngựa thứ hai là 4,7 lít.

-Số lượng khối hồng cầu đã truyền trả lại cho ngựa sau bốn lần lấy máu là 6,5

lít. Ngựa số 1 đã truyền trả lại 3,4 lít; ngựa số 2 đã truyền trả lại 7,8 lít.

Bảng 3.11. Lượng máu lấy và phản ứng của ngựa trong khi lấy máu.

74

Số lượng máu lấy (lít)Biểu hiện của ngựa

Bình thường Choáng nhẹ Shock

Ngựa 1Lần 1 3,6 X X

Lần 2 5,1 X X

Ngựa 2Lần 1 2,3 X

Lần 2 5,5 X X X

* Chú thích:- Bình thường: không có biểu hiện bất thường khi lấy máu.

- Choáng nhẹ: ngựa thở nhanh, bồn chồn, đứng không yên, hí, lắc đầu dữ dội.

- Shock mất máu: ngựa thở dồn, dãy dụa, mồ hôi chảy ròng ròng, mắt trợn

ngược, đái ỉa tự động, chân khuỵu xuống.

- Lấy máu bốn lần ở hai ngựa.

- Ngựa số 1:

+ Lấy lần thứ nhất 3,6 lít, ngựa an toàn, có biểu hiện choáng nhẹ khi lấy máu.

+ Lấy lần thứ hai 5,1 lít máu: ngựa an toàn, có biểu hiện choáng nhẹ.

- Ngựa số 2:

+ Lấy máu lần thứ nhất: 2,3 lít, ngựa hoàn toàn bình thường.

+ Lấy máu lần thứ hai: 5,5 lít, ngựa choáng, sốc mất máu.

- Khi khối lượng máu lấy đến 3,5 lít, ngựa không có biểu hiện gì.

Khi lấy lượng máu từ 3,6 --> 5,4 lít: cả ba lần hai ngựa đều có biểu hiện

choáng nhẹ: thở nhanh, bồn chồn, đứng không yên, hí, lắc đầu...

Khi lấy > 5,5 lít đã xảy ra shock mất máu. Do xử trí không kịp thời, ngựa số 2

đã tử vong.

3.1.4. Kết quả tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2:

75

3.1.4.1. Cắt Fc bằng pepsin, tủa protein không phải KT bằng ammonium

sulphate 14%; lọc bỏ tủa bằng giấy lọc Whatman, thu dịch lọc có F(ab’)2:

Bảng 3.12. Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 thu được.

Chỉ số NC

Lô NC

Huyết tương đưa

vào sản xuất (ml)

Dịch lọc

thu được

có KT (ml)

Tỷ lệ dịch lọc thu

được/huyết tương sx

(%)

Lô 1 3600 2900 80,6%

Lô 2 6400 5140 80,3%

Cộng : 10.000 8040 80,4%

Lô 1 Lô 2 Cộng0

2000

4000

6000

8000

10000

3600

6400

10000

2900

5140

8040

HT đưa vào sản xuất Dịch lọc thu được có KT

Biểu đồ 3.2. Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 trong 2 lần tinh chế.

- Lần tinh chế thứ nhất (lô 1): lấy máu lần đầu ở hai ngựa nghiên cứu tách từ

76

5,9 lít máu ngựa (bảng 3.11) được 3,6 lít huyết tương.

- Lần tinh chế thứ hai (lô 2): lấy máu lần hai ở hai ngựa thu được 10,6 lít máu

(bảng 3.11), tách được 6,4 lít huyết tương.

- Tổng lượng huyết tương đưa vào sản xuất là 10 lít, khi cắt Fc, tủa

ammonium sulphate 14%; lọc bỏ tủa bằng giấy lọc Whatman, thu dịch lọc có

F(ab’)2: số dịch lọc cả thu được là 8,04 lit (lô thứ nhất thu được 2,9 lít; lô thứ

hai thu được 5,140 lít).

- Tỷ lệ thu lại dịch lọc chứa kháng thể kháng nọc RCN đa giá ở lô thứ nhất là

80,6%; ở lô thứ hai là 80,3%; cả hai lô là 80,4%.

3.1.4.2. Tủa F(ab’)2 với ammonium sulphate 22%, lọc thu tủa bằng giấy lọc

Whatman, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2.

Bảng 3.13. Lượng tủa có F(ab’)2 thu được.

Chỉ số NC

Lô NC

Dịch lọc có chứa F(ab’)2

(ml)

Lượng tủa có F(ab’)2

thu được (gam)

Lô 1 2900 210

Lô 2 5140 395

Cộng 2 lần tinh chế 8040 605

- Lần tinh chế thứ nhất (Lô 1): 2900 ml dịch lọc sau khi tủa phân đoạn với

ammonium sulphate 22%, lọc thu tủa chứa F(ab’)2 đặc hiệu chống nọc RCN ở

nhiệt độ 20oC, pH 6,8/60’; thu được 210g tủa lẫn muối ammonium sulphate.

- Lần tinh chế thứ hai (Lô 2): 5140 ml dịch lọc sau tủa phân đoạn như lần

đầu, thu được 395g tủa.

- Tổng cộng cả hai lần tủa 8040 ml dịch lọc chứa kháng thể đặc hiệu kháng

nọc rắn cạp nia đa giá, thu được 605 gam tủa kháng thể dạng F(ab’)2 lẫn muối

77

ammonium sulphate.

Bảng 3.14. Lượng dịch thẩm tích và HTKN-RCN đa giá bán thành phẩm.

Chỉ số N/CLô N/C

Dịch thẩm tích (ml)

HTKN-RCN bán thành phẩm (ml)

Lượng dịch thẩm tích bị hao hụt (ml)

Lô 1 190 165 25 (13,1%)

Lô 2 510 485 25 (5,2%)

∑ 2 lần tinh chế 700 650 50 (7,7%)

Lô 1 Lô 2 Tổng 2 lần0

200

400

600

800

190

510

700

165

485

650

Dịch thẩm tích HTKN-RCN bán thành phẩm

Biểu đồ 3.3. Lượng dịch thẩm tích và HTKNR đa giá F(ab’)2 thu được.

- Sau khi làm khô tủa chứa F(ab’)2 đặc hiệu gắn với ammonium sulphate;

thẩm tích với nước cất cho đến khi sạch muối ammonium sulphate, lô thứ

78

nhất thu được 190 ml, lô thứ hai thu được 510 ml dịch thẩm tích chứa mảnh

F(ab’)2, cả hai lô là 700 ml HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 dạng bán thành phẩm.

- Lọc vô trùng dịch thẩm tích đã sạch ammonium sulphate bằng máy lọc

Seitz, màng cellulose acetate, đường kính lỗ lọc 0,45 µm và 0,2 µm; lô thứ

nhất thu được 165 ml; lô thứ hai thu được 485ml.

- Hao hụt sau lọc của hai đợt tinh chế là 25 ml, chiếm 7,7% lượng HTKN-

RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất.

Bảng 3.15. Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất.

Tên sản phẩm Đơn vị Thể tích (ml)

Số lượng (lọ)

HTKN-RCN bán thành phẩm Chai 500 ml 650 2

HTKN-RCN F(ab’)2 Lọ 5 ml 650 130

- Tổng số 650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 bán thành phẩm chưa qua kiểm định

chất lượng ở cơ sở sản xuất được đóng vào hai chai vô khuẩn có thể tích 500

ml (chai lô 1: 165 ml và chai lô 2 là 485 ml), bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8oC. Sau

khi trộn lẫn HTKN-RCN bán thành phẩm của hai lần tinh chế, lấy mẫu

HTKNR bán thành phẩm thử nghiệm kiểm định chất lượng cơ sở.

- Số lượng lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất, chưa kiểm định chất

lượng là 130 lọ, thể tích 5 ml/lọ. Sau kiểm định cơ sở có kết quả, đạt yêu cầu,

tiến hành lấy mẫu trong số 130 lọ HTKN-RCN này, gửi kiểm định tại Viện

Kiểm định quốc gia Vắc xin và sinh phẩm y tế, Bộ y tế để đánh giá chất lượng

sản phẩm cấp độ quốc gia.

Bảng 3.16. Nguyên liệu, hóa chất đã sử dụng tinh chế HTKN-RCN đa giá.

79

Tên nguyên liệu, hóa chất Lô I Lô II Cả 2 lần tinh chế

Huyết tương sản xuất (lít) 3,6 6,4 10,0

Pepsin đã sử dụng (gam) 3,6 6,4 100

Ammoni sulfate 14% (gam) 504 896 1400

Ammoni sulfate 22% (gam) 638 1130,8 1768

Lượng tủa có F(ab')2 (gam) 210 495 605

Dịch thẩm tích chứa F(ab’)2 (ml) 190 510 700

HTKN F(ab')2 (ml) 165 485 650

Merthiolat 1% (gam) 36 64 100

- Tinh chế hai đợt, tổng cộng 10 lít huyết tương, thu được 8,04 lít dịch lọc

chứa F(ab')2 kháng nọc RCN đặc hiệu; tủa phân đoạn thu được 605 gam tủa

F(ab')2 lẫn ammonium sulphate, thẩm tích với nước cất, thu được 700 ml dịch

thẩm tích chứa F(ab’)2 đặc hiệu với nọc RCN; lọc vô trùng, thu được HTKN-

RCN đa giá bán thành phẩm dạng F(ab’)2.

- Lượng pepsin dùng tinh chế là 100 gam.

- Lượng ammonium sulphate sử dụng là 3168 gam, bao gồm tất cả quá trình

tinh chế, tủa phân đoạn với ammonium sulphate 14% là 1400 gam và

ammonium sulphate 22% là 1768 gam.

- Lượng chất bảo quản merthiolat (1%) cho vào huyết tương từ đầu giai đoạn

tinh chế của cả hai đợt là 100 gam.

3.1.4.3. Mức độ tinh sạch của sản phẩm:

80

Bảng 3.17. Định lượng protein, albumin, globulin, IgG, IgG, IgM, tỷ lệ A/G.

Xét nghiệmHuyết thanh

ngựa

HTKN-RCN F(ab’)2

Số lượng Tỷ lệ

Protein (g/l) 87,1 49,8 100 %

Albumin (g/l) 28,7 1,4 2,8 %

Globulin (g/l) 58,4 48,4

100% 97,2 %IgG (mg/dl) 865 203

2,141 g/l

≈ 4,4%

IgM (mg/dl) 67,8 8,6

IgA (mg/dl) 6,3 2,5

Tỷ lệ A/G 0,49 0,03

- HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 có lượng protein là 49,8 g/l gồm hai thành phần:

albumin có 1,4 g/l, chiếm 2,8% và globulin là 48,4 g/l (chiếm 97,2%),

globulin là thành phần chủ yếu trong HTKN-RCN đa giá nghiên cứu sản xuất

(48,4/49,8g/l = 97,2%).

- Tỷ lệ A/G = 0,03 cho thấy độ tinh sạch cao của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.

Trước đó, điện di protein huyết thanh ngựa, tỷ lệ A/G = 0,49.

- Trong số 48,4 g/l globulin, định lượng cả IgG, IgA và IgM tổng cộng chỉ có

2,14g/l, chiếm ≈ 4,4%; như vậy phần còn lại là F(ab’)2 chiếm tới 95,6% phần

globulin của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 có số lượng 46,26 gam/lít (48,4 g/l –

2,14 g/l = 46,26 g/l). Nếu tính trên tổng số protein của HTKN-RCN đa giá

nghiên cứu, lượng mảnh F(ab’)2 chiếm tới ≈ 93% (46,26/49,8 = 92,89%).

81

1 2

Ảnh 3.6. So sánh hình ảnh điện di protein huyết thanh ngựa (1) và

HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 (2) trên máy tự động Geni – 0 (Italia) cho thấy:

Hình hai đỉnh rõ rệt của albumin, globulin đã không còn trên điện di HTKN-RCN, chỉ

còn lại hình ảnh thuần nhất một đỉnh tương ứng với dải phân bố albumin - trong khi định

lượng albumin chỉ còn một lượng nhỏ 2,8% - Điều này cho thấy F(ab’)2 chiếm tỷ lệ cao

gần như tuyệt đối.

- Kết quả điện di protein huyết thanh ngựa thấy rất rõ hai đỉnh tương ứng hai

dải phân bố của albumin và globulin huyết thanh. Kết quả điện di protein

HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 chỉ thấy còn một đỉnh thuần nhất, tương ứng với

dải phân bố của albumin huyết thanh (100%).

- Kết quả định lượng protein đã cho biết albumin chỉ có 1,4g (2,8%); lượng

IgM, IgG, IgA là 2,141 g/l (4,3%). Như vậy, phần có trọng lượng phân tử thấp

mà điện di chỉ ra trong khu vực điện di của albumin chính là phần của F(ab’)2.

- Kết quả định lượng albumin, globulin, IgM, IgG, IgA phù hợp với hình ảnh

điện di protein. Đối chiếu với hình ảnh điện di protein huyết thanh ngựa cho

thấy HTKN-RCN F(ab’)2 được tinh chế có độ tinh khiết cao (≈ 93%).

82

Ảnh 3.7: Huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2 nghiên cứu sản xuất.

3.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2:

3.2.1. Kết quả kiểm định cơ sở:

3.2.1.1. Thử nghiệm an toàn (Safety test):

Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm an toàn chung HTKN-RCN trên chuột lang.

TT

Trọng

lượng

(gam)

HTKN

(ml)

Theo dõi chuột thí nghiệm Tăng

trọng

(gam)Hình

thái

Vận

động

Trọng lượng

Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3

1 310 3,1 bt bt 320 325 340 +30

2 330 3,3 bt bt 343 350 355 +25

3 350 3,5 bt bt 358 363 370 +20

( bt: bình thường).

83

- Chuột thứ nhất nặng 310 gam, chuột thứ hai nặng 330 gam, chuột thứ ba

nặng 350 gam.

- Lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã dùng cho tứng chuột thí nghiệm lần

lượt là 3,1 ml; 3,3 ml; 3,5 ml.

- Cả ba chuột đều bình thường về hình thái, vận động sau khi được tiêm

HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu.

- Tăng trọng chuột thứ nhất trong ba tuần là 30 gam; chuột thứ hai là 25 gam,

chuột thứ ba là 20 gam: cả ba chuột nghiên cứu đều tăng trọng, phát triển bình

thường; không có chuột bị ốm, chết.

- Kết quả cho thấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu đạt chỉ tiêu an toàn

chung, không có độc tố bất thường.

3.2.1.2. Kết quả thử nghiệm chí nhiệt tố (Pyrogen test):

Bảng 3.19. Xác định chất gây sốt trong HTKN-RCN đa giá bán thành phẩm.

TT

Trọng

lượng

(kg)

Thể tích

HTKNR

(ml)

Nhiệt độ thỏ trước/sau khi tiêm

HTKN-RCN (oC)Nhiệt độ

chênh lệch

(oC)Trước

tiêm

Sau

1 giờ

Sau

2 giờ

Sau

3 giờ

1 2,8 2,8 39,3 39,6 39,8 39,3 + 0,5

2 2,8 2,8 39,4 39,7 39,8 39,4 + 0,4

3 3,0 3,0 39,6 39,8 39,9 39,6 + 0,3

- Thỏ thứ nhất và thỏ thứ hai nặng 2,8 kg; thỏ thứ ba nặng 3,0 kg.

- Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tiêm cho thỏ thứ nhất là 2,8 ml.

- Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tiêm cho thỏ thứ hai là 2,8 ml.

84

- Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tiêm cho thỏ thứ ba là 3 ml.

- Nhiệt độ hậu môn thỏ thứ nhất trước tiêm HTKN-RCN đa giá là 39,3 oC; thỏ

thứ hai là 39,4 oC; thỏ thứ ba là 39,6 oC.

- Sau tiêm, thay đổi nhiệt độ trong ba giờ liên tiếp ở thỏ thứ nhất là 0,5 oC.

- Sau tiêm, thay đổi nhiệt độ trong ba giờ liên tiếp ở thỏ thứ hai là 0,4 oC.

- Sau tiêm, thay đổi nhiệt độ trong ba giờ liên tiếp ở thỏ thứ ba là 0,3oC.

- Cộng dồn nhiệt độ thay đổi của cả 3 thỏ = 1,2 oC.

- Thay đổi nhiệt độ ba thỏ dưới 1,4oC; điều đó cho thấy HTKN-RCN đa giá

F(ab’)2 đạt tiêu chuẩn không có chất gây sốt.

3.2.1.3. Kết quả thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test):

Bảng 3.20. Kết quả thử nghiệm vô khuẩn của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.

Môi trường Sabouraud (37oC)Môi trường thạch Chocolate,

thạch máu (20oC – 25oC)

Lô HTKN- RCN

Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7

Lô IÂm

tính

Âm

tínhÂm tính

Âm

tính

Âm

tínhÂm tính

Lô IIÂm

tính

Âm

tínhÂm tính

Âm

tính

Âm

tínhÂm tính

- Cấy khuẩn: cấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 trong môi trường thạch

chocolate và môi trường thạch máu sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày đều không thấy

mọc vi khuẩn.

- Cấy nấm: cấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 trong môi trường Sabouraud sau 3

ngày, 7 ngày, 14 ngày thấy không mọc vi nấm.

85

3.2.1.1. Kết quả thử nghiệm xác định công hiệu (Potency test):

3.2.1.1.a. Xác định LD50 của nọc RCN đa giá :

Bảng 3.21. Xác định LD50 của nọc rắn cạp nia đa giá (bắc + nam).

Lô

Nồng độ

nọc

(µg/ml)

Số nọc/

chuột

(µg)

Theo dõi chuột thí nghiệm Tỷ lệ

chuột chết

(%)Chết Sống Tổng số

1 22,50 4,5 8 0 8 100,00

2 15,00 3,00 7 1 8 87,50

3 10,00 2,00 4 4 8 50,00

4 6,66 1,33 1 7 8 12,50

5 4,44 0,88 0 8 8 0,00

6 0 0 0 8 8 0,00

- Pha loãng nọc rắn cạp nia trong NaCl 0,9% với bậc pha loãng = 1,5.

- Số chuột thí nghiệm = 8.

- Thể tích dịch nọc tiêm chuột = 0,2 ml/chuột.

- Nồng độ nọc RCN đa giá pha loãng cao nhất gây chết 100% số chuột thí

nghiệm là 22,5 µg/ml hay 4,5 µg/chuột.

- Nồng độ nọc pha loãng thấp nhất không gây chết chuột nào là 4,44 µg/ml

hay 0,48 µg/chuột.

- Dựa trên kết quả ở bảng 3.21, tính LD50 theo công thức của Karber [27]:

LD50 = LD100 – ∑ Z.d/n

Trong đó:

Z: số trung bình tử vong của 2 nhóm kế cận.

d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.

n: số động vật thử nghiệm trong từng nhóm.

86

Thay số ở bảng 3.21 vào công thức Karber ở trên để tính toán, ta có:

Liều lượng nọc 4,5 3 2 1,33 0,88

Số tử vong 8 7 4 1 0

Z 7,5 5,5 2,5 0,5

d 1,5 1,0 0,67 0,45

d.Z 11,25 5,5 1,675 0,225

∑ d.Z = 18,65 n = 8

LD50 = LD100 – ∑ Z.d/n

= 4,5 – 18,65/8 = 2,17

Ảnh 3.8: Xác định LD50 của nọc rắn cạp nia đa giá (lô 2).

87

3.2.1.1.b. Xác định ED50 của HTKN-RCN đa giá:

Bảng 3.22. Kết quả xác định hiệu giá của HTKNR đa giá F(ab’)2

Loạt TN

HTKN-RCN

(ml)

NaCl 0,9%

(ml)

Nọc RCN 40 LD50

(ml)

Số LD50/ 1 chuột

Tình trạng chuột

Chết Sống Cộng

1 0.000 2.000 0.000 0 0 8 8

2 0.000 1.000 1.000 4 8 0 8

3 0.060 0.940 1.000 4 6 2 8

4 0.070 0.930 1.000 4 4 4 8

5 0.080 0.920 1.000 4 0 8 8

- Khi trộn 1 ml dung dịch nọc RCN đa giá 40 LD50/ml với 1 ml dung dịch

HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 để trung hòa nọc độc, trong 1 ml này đã có lần

lượt là 60, 70, 80 µl HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 pha trong NaCl 0,9% để làm

đủ 1 ml; nồng độ nọc rắn cạp nia đa giá đã bị pha loãng giảm còn một nửa (20

LD50); như vậy: trong thử nghiệm đã dùng liều tiêm tĩnh mạch đuôi chuột 0,2

ml/chuột, liều này tương ứng với hàm lượng nọc là 4 LD50.

- Với liều nọc rắn cạp nia 4 LD50 với chuột nhắt trắng 18 - 20g và không có

HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 bảo vệ, đã gây chết 100% số chuột thí nghiệm.

- Với liều nọc 4 LD50, sau khi được trung hòa bởi 60 µl HTKN-RCN đa giá

F(ab’)2, chỉ có 6 chuột thí nghiệm trong tổng số 8 con bị chết. Như vậy, liều

HTKN rắn cạp nia đã bảo vệ được 2 chuột thí nghiệm.

- Cũng với liều nọc độc 4 LD50 như trên, sau khi được trung hòa bởi 80 µl

HTKN rắn cạp nia đa giá F(ab’)2, tất cả số chuột thí nghiệm 8 con đều sống.

- Cũng với liều nọc 4 LD50 như trên, sau khi được trung hòa bởi 70 µl HTKN-

88

RCN đa giá F(ab’)2 (lượng HTKNR thấp hơn 10 µl), 50% số chuột thí

nghiệm được bảo vệ.

- Sử dụng 1ml HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 điều trị có thể trung hòa được

57,14 LD50 nọc độc (tức 124 µg nọc). Khi sử dụng một lọ HTKN-RCN 5ml,

sẽ trung hòa được 285,7 LD50 nọc độc hay trung hòa được 620 µg nọc RCN.

- Kết quả kiểm định cơ sở cho thấy: hiệu giá KT của HTKN-RCN đa giá

F(ab’)2 nghiên cứu là: 285,7 LD50 /lọ, trung hòa được 620 µg nọc rắn cạp nia.

3.2.2. Kiểm định Quốc gia về chất lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2:

Bảng 3.23. Kết quả kiểm định Quốc gia về chất lượng chế phẩm nghiên cứu.

TT Tên thử nghiệm Kết quả

1 An toàn chung Đạt

2 Chất gây sốt Đạt

3 Vô khuẩn Đạt

4 Hiệu giá 267,5 LD50/lọ (5ml)

5 NaCl 0,87%

6 pH 7.012

7 Nồng độ Protein 7,43 mg/ml

8 Nồng độ Merthiolate 0 g%

- Kiểm định quốc gia của Viện kiểm đinh quốc gia Vắc xin và sinh phẩm y tế

của Bộ y tế đã đánh giá dựa trên 8 chỉ tiêu về chất lượng HTKN-RCN nghiên

89

cứu sản xuất gồm: an toàn chung, chí nhiệt tố, vô khuẩn, hiệu giá, nồng độ

chất bảo quản merthiolat, nồng độ NaCl, pH, nồng độ protein.

- Kết quả cho thấy: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đạt an toàn chung ở động vật

thí nghiệm, đạt vô khuẩn, không có chí nhiệt tố, có hiệu giá 267,5 LD50/lọ 5

ml; nồng độ NaCl 0,87%; nồng độ chất bảo quản merthiolat là 0 gam%; pH là

7.012; nồng độ protein là 7,43 mg/ml.

3.2.3. Tính khái quát giá thành chế phẩm:

Bảng 3.24. Chi phí cơ bản sản xuất một lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.

Chi phí Số tiền (VN đồng)

Ngựa 20.000.000,00

Công nuôi + thức ăn (10 tháng) 25.000.000,00

Nọc rắn (RCN Nam, RCN Bắc) 20.000.000,00

Hóa chất 20.000.000,00

Điện nước, trang bị 20.000.000,00

Lấy máu + truyền trả khối hồng cầu 4.000.000,00

Tinh chế 01 lô 2.000.000,00

Kiểm định tại cơ sở 4.000.000,00

Kiểm định Quốc gia 10.000.000,00

Xe cộ, chi phí đi lại, vận chuyển ngựa... 20.000.000,00

Công miễn dịch ngựa + lấy máu XN 20.000.000,00

90

Chuồng trại, thú y 10.000.000,00

Cộng 175.000.000,00

- Sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 trong 18 tháng: tuyển chọn rắn và chế

tạo kháng nguyên: 3 tháng; miễn dịch ngựa, theo dõi hình thành kháng thể: 10

tháng, lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu và tinh chế HTKN-

RCN: 2 tháng, kiểm định cơ sở và kiểm định quốc gia: 3 tháng.

- Chi phí cơ bản 175 triệu đồng, thu được 650 ml HTKN-RCN đa giá F(ab’)2,

tương đương 269.000/ml. Đóng lọ 5 ml, giá thành của một lọ HTKN- RCN đa

giá F(ab’)2 khoảng 1.346.000 VNĐ/lọ (chỉ tính nhân công thời vụ).

- Những lần sản xuất sau có giá thành rẻ hơn do các chi phí trước không phải

tính đến (chi mua ngựa, chuồng trại, dụng cụ,..từ trước).

Chương 4

BÀN LUẬN

91

4.1. SẢN XUẤT HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 ĐÁP ỨNG TIÊU CHUẨN

VIỆT NAM (DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM IV, 2009):

Các công đoạn sản xuất gồm: chế tạo kháng nguyên, gây mẫn cảm ngựa

tạo nguồn kháng thể hiệu giá cao, tinh chế HTKNR, kiểm định chất lượng cơ

sở và kiểm định quốc gia. Các công đoạn này đều có thể thực hiện; mỗi công

đoạn đều quan trọng, đòi hỏi phải đạt chất lượng tốt, mục đích cuối cùng cho

ra sản phẩm đạt các chỉ tiêu Dược điển Việt Nam IV yêu cầu.

4.1.1. Chế tạo kháng nguyên:

Khâu quan trọng đầu tiên là chế tạo kháng nguyên, đây là chìa khóa

thành công của quy trình sản xuất HTKNR. Kháng nguyên phải đảm bảo đã

được làm giảm hoặc mất hoàn toàn độc lực nọc rắn, an toàn cho động vật gây

mẫn cảm đồng thời có tính sinh miễn dịch mạnh. Tất cả các khâu trong chế

tạo kháng nguyên đều nhằm phục vụ mục đích này.

Để chế tạo được kháng nguyên, phải có nguyên liệu là nọc rắn, đảm bảo

chất lượng và số lượng. Bảng 3.1 cho thấy, việc tuyển chọn rắn đã đạt yêu

cầu: chính xác, lấy đủ số lượng, đảm bảo chất lượng nọc, an toàn tuyệt đối .

Do tính đặc hiệu của nọc rắn theo vùng địa lý, phải lấy được nọc rắn cạp nia ở

khắp các vùng miền, đại diện cho quần thể rắn cạp nia trong cả nước, đây là

yêu cầu quan trọng, có tác dụng làm tăng tính hiệu lực của HTKN-RCN đa

giá sau khi được sản xuất. Ngoài tuyển chọn rắn đúng chủng loài, phải tiến

hành lấy nọc nhiều lần để có đủ số lượng cần thiết. Lượng nọc của rắn cạp nia

rất ít so với rắn hổ mang, rắn choàm quoạp, rắn hổ chúa... nên qua sáu lần lấy,

số nọc của 276 con rắn cạp nia bắc chỉ được 1,6 gam; của 145 con rắn cạp nia

nam chỉ được 1,5 gam, như vậy: rắn cạp nia nam có thể cho nọc nhiều hơn so

với mỗi con rắn cạp nia bắc. Lượng nọc của một rắn cạp nia có thể lấy được

khoảng từ 4,6 – 11,6 mg. Kết quả này tương tự thông báo của một số tác giả

92

khác, cho rằng số lượng nọc rắn cạp nia mỗi lần cắn vào khoảng 4,6 mg –

18,4 mg [162]. Số lượng nọc rắn cạp nia bằng 1/5 - 1/10 các loài rắn khác,

đây là điểm khó khăn cho nghiên cứu. Số lượng nọc rắn mỗi con liên quan

đến nhiều yếu tố: kích thước, trọng lượng, tuổi rắn, rắn đã ăn bao lâu...Tuy

vậy, khó có thể biết được trước con rắn sắp lấy nọc có nhiều hay ít nọc.

Ngoài đảm bảo đủ về số lượng, phải đảm chất lượng nọc rắn. Nọc phải

sạch, không lẫn máu, độc tính nọc và các thành phần được giữ nguyên [20],

[21]. Tuân thủ các hướng dẫn của WHO, nhóm nghiên cứu đã mua và thu

nhận rắn lấy nọc từ tự nhiên, sử dụng chuồng trại nuôi đúng quy cách theo tập

tính loài rắn, nuôi nhốt hàng tháng để loại trừ rắn bệnh...Do nanh độc của rắn

cạp nia rất nhỏ, khi lấy nọc phải quan sát rất nhanh, đưa dụng cụ vô trùng

đúng vào vị trí nanh độc, tránh xây xước, chảy máu lẫn vào nọc rắn, làm giảm

chất lượng nọc. Với các loài rắn độc khác có nanh độc to hơn, khi lấy nọc, có

thể cho rắn ngoạm vào một màng polyten mỏng bịt kín miệng ống đựng nọc

vô trùng, tẩm sẵn chất sát trùng, để sát trùng nanh độc. Nọc rắn cạp nia sau

khi lấy được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, bảo quản ở nhiệt độ lạnh, sau

đó tiến hành đông khô nọc để không làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của

nọc rắn. Nọc rắn khô có chứa chủ yếu là protein (70 - 90%) và một lượng nhỏ

chất vô cơ, polypeptide, nucleotide, carbonhydrates, chất béo và các amin.

Các thành phần protein bao gồm: các enzyme và protein không phải enzyme.

Nọc rắn đông khô bảo quản ở - 20oC giữ được độc tính nọc 15 – 20 năm, hầu

như không thay đổi so với ban đầu.

Việc đảm bảo tuyệt đối an toàn trong quá trình làm việc với rắn và nọc

rắn là một đòi hỏi nghiêm ngặt, đã được tuân thủ ngay từ đầu. Trong thực tế,

nhiều người bắt rắn, buôn bán rắn, thậm chí là nhà khoa học về rắn - đã tử

vong do bất cẩn. Thí dụ, tiến sĩ Joseph Bruno Slowinski (1963 - 2001), người

Mỹ đã chết tại Mianma khi bắt một con rắn cạp nia bắc (Bungarus

93

multicinctus). Tên ông đã được đặt cho loài rắn “khúc đen, khúc trắng” tìm

thấy tại lưu vực sông Hồng, đó là rắn khoang sông Hồng hay còn gọi là rắn

khoang Bungarus slowinki [158]. Trước khi lấy nọc rắn, phải chuẩn bị tốt về

sức khỏe, kiến thức về đặc tính loài rắn, hiểu rõ về cấu trúc, vị trí răng độc,

cách giữ đầu rắn đuôi rắn, cách phối hợp thao tác khi lấy nọc... Dụng cụ lấy

nọc: gậy bắt rắn, túi lưới, bàn lấy nọc, ủng, găng tay... được chuẩn bị đầy đủ.

Người lấy nọc luôn tỉnh táo đề phòng rắn cắn trong lúc thao tác kỹ thuật và

tuyệt đối không để nọc rắn dính vào tay.

Cho đến nay, do không có cơ sở cung cấp nọc rắn chuẩn Việt Nam, nên

việc chủ động tuyển chọn, nuôi và lấy nọc rắn vẫn là vấn đề đặt ra cho người

nghiên cứu.

Để sản xuất HTKNR đa giá có kết quả tốt, hiệu lực mạnh, thường sản xuất

kháng nguyên lấy từ các loài rắn độc cùng họ (họ rắn hổ Elapidae, họ rắn lục

Vipridae...), cùng chi (chi Naja, chi Bungarus...). Việc khảo sát sự phân bố,

mức độ thường gặp của các loài rắn khác trong chi rắn cạp nia là rất có giá trị,

giúp định hướng sản xuất HTKNR đa giá cho những loài rắn nào thường gặp,

nguy hiểm nhất. Mặc dù đây không phải là nghiên cứu dịch tễ học với những

số liệu thống kê lớn, chỉ là một số khảo sát sơ bộ, số liệu hạn chế, xong cũng

đã nói lên được nhiều điều (Bảng 3.2).

Thứ nhất, trong các loài rắn khoang chi rắn cạp nia (Bungarus) Việt Nam,

rắn cạp nia nam (B.candidus), rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) và rắn khoang

sông Hồng (B.slowinkii) là ba loài rắn “khúc đen, khúc trắng” có trong tự

nhiên. Khắp Việt Nam, khi hỏi về rắn khúc đen khúc trắng rất nhiều người

biết. Việc dễ dàng sưu tầm và tuyển chọn những loài rắn này cho nghiên cứu

là bằng chứng cho thấy sự thường gặp của chúng. Người ta thường khó phân

biệt các loài rắn nói trên ngoài việc chỉ xác định chúng là “rắn khúc đen, khúc

trắng” mà thôi.

94

Thứ hai, chỉ có hai loài rắn cạp nia bắc và rắn cạp nia nam là thường gặp

trong ba loài “rắn đen - trắng” trên. Với rắn khoang sông Hồng (Bungarus

slowinskii), do dễ nhầm với rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), khi

tuyển chọn rắn cạp nia đã được lưu ý để loại khỏi nhóm nghiên cứu. Loài này

có khúc đen, khúc trắng với khoang trắng hẹp hơn khoang đen, đầu và thân có

vạch trắng hình chữ V là điểm chủ yếu phân biệt với rắn cạp nia bắc, nam

[175]. Tuy nhiên, trong thời gian khảo sát, đã không gặp loài rắn này trong cả

quá trình nghiên cứu.

Thứ ba, hầu như khi tuyển chọn rắn cạp nia tại miền Bắc, rắn cạp nia

nam (Bungarus candidus) đã không được phát hiện thấy. Ngược lại, khi tuyển

chọn rắn cạp nia ở các tỉnh miền Nam, rắn cạp nia bắc (Bungarus

multicinctus) cũng không thấy. Kết quả này hiện có vẻ phù hợp với thông tin

trong các nghiên cứu của Hà Trần Hưng, Nguyễn Thị Dụ, Jonas Höjer, Trịnh

Xuân Kiếm 2009 - 2010 [71],[72] về rắn cạp nia bắc và các nghiên cứu của

Trịnh Kim Ảnh, Trịnh Xuân Kiếm (2001) [6], Trịnh Xuân Kiếm, Lê Khắc

Quyến, Trịnh Xuân Long, David A. Warrell (2010) [88] về rắn cạp nia nam.

Các loài rắn cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus

flavicep) có nọc độc song hiếm gặp. Kết quả sơ bộ khảo sát về phân bố các

loài rắn trong chi rắn cạp nia cần được tiếp tục bổ sung. Kết quả này phù hợp

với thông báo của các tác giả Trần Kiên, Nguyễn Quốc Thắng (1995)[24],

Nguyễn Quang Trường, Nguyễn Thiên Tạo (2011)[39].

Mặc dù tiêm nọc rắn chưa biến đổi hoặc chưa tác động để làm mất độc

lực có thể tạo ra kháng thể đặc hiệu tốt hơn ở động vật gây mẫn cảm nhưng

lại tạo ra các nghiêm hiểm cho động vật, điều này khiến việc sử dụng nọc

nguyên chất đã không được khuyến khích. Từ năm 1894, nhiều phương pháp

chuẩn bị nọc độc được đề xuất làm giảm độc tính và bảo đảm tính chất kháng

nguyên. Giải độc có thể thu được kết quả với các phương pháp khác nhau: xử

95

lý bằng nhiệt, hypochlorite, xà phòng, hỗn hợp với lipoids, hydrogen

peroxide, bức xạ ion hóa và một số phương pháp khác [101]. Tuy nhiên,

không có phương pháp nào trong số này có hiệu quả hoàn hảo. Phức hợp của

nọc độc và formalin tạo thành anavenin là phương pháp tốt nhất vẫn được sử

dụng cho đến ngày nay, điển hình như aldehyde (glutaraldehyde) [70]. Tannin

cũng đã được sử dụng nhưng hạn chế của formalin hoặc tannin là có thể được

đào thải ra khỏi anavenin (Chippaux JP, Goiffon M, 1998) [55].

Kháng nguyên chế tạo đạt thử nghiệm về an toàn chung (Bảng 3.4),

không có chất gây sốt (Bảng 3.5) và vô khuẩn (Bảng 3.6). Thử nghiệm tiến

hành trên các động vật nghiên cứu nhạy cảm cao với độc tố, chất gây sốt là

chuột lang Cobaye, thỏ và được cấy khuẩn, cấy nấm trong các môi trường và

nhiệt độ tối thích. Đây là yêu cầu bắt buộc trước khi tiến hành chính thức gây

mẫn cảm cho ngựa sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn. Với loại độc tố nọc

rắn có độc lực rất mạnh với sinap thần kinh - cơ như nọc rắn cạp nia, chế tạo

kháng nguyên nếu không an toàn, có thể gây chết ngựa, gây tổn thất kinh tế,

mất thời gian và tốn kém cho nghiên cứu. Liều 1ml/100g cân nặng, tức 110

µg/gam đã được sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 3.3). Liều này cao gấp 733

lần LD50 của rắn cạp nia bắc (0,15 µg/gam chuột, theo Steven D. et al., 1999)

[131] và cao gấp 1100 lần LD50 rắn cạp nia nam (0,1 µg/gam chuột, theo Tan

N.H et al., 2004) [135]. Như vậy, nếu không khử độc, chuột thí nghiệm chắc

chắn tử vong. - Theo Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9] thử nghiệm an toàn có

thể dùng tối đa dưới 5 ml sinh phẩm tiêm phúc mạc chuột lang, ở nghiên cứu

này, lượng kháng nguyên sử dụng nhiều nhất là 2,5ml.

Có nhiều phương pháp khử độc, bất hoạt độc tính nọc rắn nhưng chúng

tôi chọn phương pháp dùng glutaraldehyde (WHO, 2008) [151] phương pháp

này được Trịnh Xuân Kiếm bổ sung và sử dụng thường xuyên trong khử độc

nọc rắn hổ mang, hổ đất, hổ chúa, choàm quạp... cho kết quả tốt, làm mất độc

96

tính nọc mà vẫn giữ nguyên được tính kháng nguyên [21],[23]. Phương pháp

này được nhiều tác giả sử dụng (Huang R.J., et al., 1986 [76], Rogero J.R.,

Nasimento N., 1995 [122]). Nọc rắn cạp nia sau quá trình khử độc với

glutaraldehyde, vi khuẩn đã bị tiêu diệt, nếu còn cũng bị loại bỏ khi lọc vô

khuẩn với màng lọc celluloze axetat 0,2 µm. Toàn bộ quá trình chế tạo kháng

nguyên: lấy nọc, khử độc nọc, tiến hành ly tâm, bỏ cặn, thu dung dịch kháng

nguyên, lọc vô trùng, chiết vào các lọ nhỏ, đóng nắp lọ... được tuân thủ chặt

chẽ nguyên tắc vô khuẩn. Các dụng cụ lấy nọc và chế tạo kháng nguyên được

sấy hấp tiệt trùng; khi chiết dung dịch kháng nguyên vào các lọ nhỏ, đã khử

khuẩn nút lọ bằng nhiệt đèn cồn; các thao tác vô khuẩn được thực hiện trong

box vô trùng... Các thử nghiệm xác định kháng nguyên an toàn không độc tố,

vô khuẩn, không có chất gây sốt, đảm bảo độ tinh khiết, giúp ngựa không bị

nhiễm trùng, bị sốt khi gây mẫn cảm, nhất là các tháng cuối gây mẫn cảm, sử

dụng số lượng kháng nguyên lớn và nhiều điểm tiêm.

Chí nhiệt tố là sản phẩm chuyển hóa do các vi sinh vật như vi khuẩn,

nấm mốc, nấm men, virus, sinh ra trong quá trình sống của chúng và xác chết

của các vi sinh vật này, gây phản ứng sốt khi tiêm (Nguyễn Đăng Hòa, 2006)

[17]. Đạt tiêu chuẩn không có chất gây sốt, vô khuẩn cũng chứng tỏ quy trình

kỹ thuật được thực hiện trong điều kiện tốt. So với LD50 của rắn cạp nia bắc là

0,15µg/gam chuột (Steven D. et al., 1999) [131] và rắn cạp nia nam

0,1µg/gam chuột (Tan N.H et al., 2004) [135], độc tính KN nọc rắn cạp nia đa

giá nếu không khử độc sẽ cao gấp 73 lần so với LD50 của nọc rắn cạp nia bắc

và 110 lần so với LD50 của nọc rắn cạp nia nam (tính tương tự 3.1.1.4 ở trên).

Một yêu cầu quan trọng thứ hai của chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp

nia đa giá là bảo đảm giữ được nguyên vẹn tính kháng nguyên của nọc độc cả

hai loài rắn cạp nia bắc và nam. Đảm bảo được điều này sẽ quyết định sự

thành công của quy trình sản xuất HTKN-RCN đa giá, giúp HTKNR sản xuất

97

ra có tính đặc hiệu cao, khi sử dụng có thể trung hòa hiệu quả, nhanh chóng

các độc tố nọc nguy hiểm trong cơ thể nạn nhân.

Thực tế kết quả quá trình gây mẫn cảm, theo dõi đáp ứng miễn dịch đã

chứng minh một lần nữa cho sự thành công trong đảm bảo tính sinh miễn dịch

của kháng nguyên trong chế tạo kháng nguyên giảm độc lực.

4.1.2. Qui trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch:

Quá trình gây mẫn cảm, chăm sóc theo dõi sức khỏe ngựa, theo dõi hình

thành kháng thể đặc hiệu là quãng thời gian rất quan trọng, có ý nghĩa quyết

định tiếp theo sau khâu chế tạo kháng nguyên nọc rắn đa giá giảm độc lực.

Giai đoạn này, đòi hỏi phải chăm sóc ngựa thật tốt để ngựa đủ sức chịu đựng

quá trình mẫn cảm với lượng kháng nguyên và tá dược ngày càng nhiều. Việc

tiêm kháng nguyên và tá dược phải bảo đảm kỹ thuật, đúng vị trí, đúng liều

lượng dự kiến. Đi kèm theo là việc đánh giá kết quả đáp ứng miễn dịch với

kháng nguyên đã chế tạo, khẳng định chất lượng kháng nguyên và quá trình

gây mẫn cảm, quyết định các thay đổi về liều lượng kháng nguyên, tá dược,

cách thức, vị trí gây mẫn cảm cho phù hợp, thậm chí quyết định cả phương

pháp chăm sóc, chế độ ăn uống cụ thể trong từng tình huống. Đây là thời gian

vất vả nhất của cán bộ nghiên cứu do phải làm việc nhiều với động vật trong

môi trường kém vệ sinh và không ít nguy hiểm. Do yêu cầu nghiên cứu, mọi

công việc vẫn phải đảm bảo cẩn thận, tỉ mỉ, trực tiếp và cụ thể sát sao theo

diễn biến của từng ngựa nghiên cứu.

Ngoài các yếu tố về bản chất của kháng nguyên như tính lạ, kích thước

trọng lượng phân tử, cấu trúc, khả năng hòa tan của kháng nguyên,... đáp ứng

miễn dịch ở ngựa gây mẫn cảm còn phụ thuộc vào đặc điểm sinh học riêng

của cá thể ngựa gây mẫn cảm, liều lượng kháng nguyên và tá dược (Đỗ Trung

Phấn, 1979) [28]. Như khuyến cáo của WHO (Guidelines, 2008), với ngựa

98

gây mẫn cảm, quãng cách thời gian giữa hai lần tiêm kháng nguyên và tá

dược khoảng từ 3 - 5 tuần. Đây là khoảng thời gian cần thiết bảo đảm an toàn

cho ngựa sau miễn dịch, đảm bảo liền vết loét chỗ tiêm, ngựa không còn mệt

yếu, đủ sức khỏe cho lần mẫn cảm tiếp theo. Nghiên cứu của chúng tôi đã để

thời gian một tháng/lần gây mẫn cảm, tuy mất thời gian hơn so với lịch trình 3

tuần/lần, nhưng nhờ có thời gian, việc chăm sóc đã giúp ngựa phục hồi sức

khỏe tốt hơn, sẵn sàng cho lần gây mẫn cảm tiếp theo. Xét khía cạnh kinh tế,

nên theo một lịch trình ngắn hơn, khoảng hai đến ba tuần/lần (Philadelphia

Wahby et al., 2010 [115], Clara, Miller, 1971 [20]). Điều này cũng tùy điều

kiện của nhà nghiên cứu, diễn biến sức khỏe ngựa (loét, bỏ ăn, bại liệt,..). Có

tác giả cho rằng có thể dự kiến lịch trình miễn dịch trong 3 - 15 tháng, với 10

- 50 mũi tiêm kháng nguyên và tá dược Chippaux J.P, Goiffon M. (1992) [54].

Về liều lượng kháng nguyên gây mẫn cảm, trong nghiên cứu chúng tôi đã

sử dụng liều đầu tiên rất nhỏ (0,1 ml kháng nguyên chứa 1,1 mg nọc rắn cạp

nia) - ngay cả khi không khử độc, liều này cũng không nguy hiểm cho ngựa

(320 kg). Các lần gây mẫn cảm tiếp theo, đã sử dụng liều lượng tăng dần. Độc

tố nọc rắn cạp nia cực độc, nếu khử độc không tốt, sẽ nguy hiểm với ngựa khi

sử dụng liều cao. Liều cao nhất khi gây mẫn cảm là 6 ml kháng nguyên, chứa

≈ 66 mg nọc rắn cạp nia. Khi tiêm cho ngựa có trọng lượng 320 kg, liều này

tương ứng 3,7µg/chuột Swiss 18 - 20g; cao hơn liều chết 50% của nọc rắn cạp

nia (LD50 = 2,17 µg). Theo Steven D. et al. (1999) LD50 của rắn cạp nia bắc

là 0,15µg/gam [131]; theo Tan N.H, (2004) LD50 của rắn cạp nia nam là

0,1µg/gam, [135], thấp hơn rất nhiều so với liều 11,3 µg/gam chúng tôi đã

dùng khi tiêm đủ 6 ml KN. Liều này quá mạnh, đủ sức gây chết ngựa nếu KN

không khử được hết độc tính nọc. Như vậy, do kháng nguyên được khử độc

hoàn toàn và đã thử nghiệm xác định đảm bảo an toàn trên chuột lang Cobaye

và thỏ thí nghiệm (Bảng 3.4 và Bảng 3.5), liều này đã được sử dụng và thực tế

99

cho thấy ngựa nghiên cứu vẫn khỏe mạnh.

Về sử dụng tá dược: do độc tố thần kinh trong nọc rắn cạp nia có trọng

lượng phân tử thấp, tính sinh miễn dịch yếu, sử dụng tá dược Freund’s phối

hợp với kháng nguyên là cần thiết. Tá dược Freund’s mang tên Jules Freund,

người phát minh ra tá dược. Đó là một huyền dịch kháng nguyên được nhũ

hóa (emulsify) trong dầu khoáng, để tăng cường độ đáp ứng miễn dịch

(immunopotentiator). Tá dược Freund’s đã nhũ hóa, tạo thành huyền dịch

gồm các tiểu phân cực nhỏ, chứa kháng nguyên nọc (dịch treo) lơ lửng trong

môi trường, kéo dài thời gian tồn tại của kháng nguyên tại nơi vết tiêm kháng

nguyên. Trực khuẩn lao đã xử lý không còn vai trò gây bệnh cho cơ thể chủ,

nhưng lại là yếu tố kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, làm

tăng tiềm năng sinh γ-globulin miễn dịch IgG bằng cách tạo ra ổ viêm tại chỗ,

kêu gọi các tế bào có thẩm quyền miễn dịch tới ổ viêm để xử lý tác nhân gây

viêm; qua đó nhận biết nhóm quyết định kháng nguyên nọc rắn cạp nia, thông

tin cho toàn hệ thống miễn dịch của cơ thể ngựa, phát động quá trình đáp ứng

sinh kháng thể đặc hiệu (Nguyễn Năng An, 1975[2]). Tế bào trí nhớ miễn dịch

(memory cells) có chức năng nhận biết và ghi nhớ các dấu ấn miễn dịch của

kháng nguyên. Khi được tiêm liều kháng nguyên nọc rắn cạp nia nhắc lại, tế

bào trí nhớ miễn dịch lập tức được phát động, nhân lên gấp bội để sinh kháng

thể IgG (Nguyễn Năng An, Trương Đình Kiệt, 1986) [1]. Nhiều tác giả đã sử

dụng phương pháp kết hợp kháng nguyên và CFA để tăng mạnh hiệu giá

kháng thể cho thấy hiệu quả rất rõ rệt. Pratanaphon R et al., (1997) [116], đã

trộn lẫn kháng nguyên nọc rắn hổ đất Thái Lan và với các tá dược khác nhau,

tỷ dụ CFA đơn thuần (50% CFA + 50% KN) hoặc CFA với tỷ lệ 25% (75%

kháng nguyên và 25% CFA), hoặc kháng nguyên + vắc xin nội độc tố uốn ván

(tetanus toxoid), kháng nguyên + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria

toxoid ) với tỷ lệ khác nhau, thu được kết quả tốt, hiệu giá kháng thể tăng cao

mạnh mẽ trong thời gian ngắn so với nhóm chứng chỉ dùng kháng nguyên và

100

tá dược là bentonite gel.

Chúng tôi đã tự chế tá dược theo công thức của hãng Difco để tiết kiệm

chi phí. CFA, gồm: mannide monooleate (1,5ml), dầu paraffin (8,5ml) và trực

khuẩn lao chết đông khô (Mycobacterium tuberculosis): 5-10 mg; IFA gồm:

mannide monooleate (1,5ml), dầu paraffin (8,5ml), không có trực khuẩn lao.

Kháng nguyên và tá dược đóng lọ riêng biệt. Trước khi tiêm miễn dịch ngựa,

tá dược được trộn thật kỹ với kháng nguyên theo tỷ lệ 1/1. Kháng nguyên nọc

rắn cạp nia đa giá được tiêm dưới da ở nhiều vị trí tiêm khác nhau (hơn 10

điểm tiêm) theo khuyến cáo của WHO & hãng Difco. Kết quả: ngựa khỏe,

đáp ứng sinh kháng thể mạnh.

Về đường tiêm kháng nguyên + tá dược: trong quá trình gây mẫn cảm,

ngựa hoàn toàn được tiêm dưới da vì theo khuyến cáo của WHO, trong các

đường tiêm, đường tiêm dưới da là tốt nhất, tránh được nguy cơ gây loét, hoại

tử, tróc da nếu tiêm trong da; gây què quặt tạm thời hoặc vĩnh viễn nếu tiêm

bắp thịt; gây tắc mao mạch phổi nếu tiêm đường tĩnh mạch. Các khu vực tiêm

kháng nguyên và tá dược đã được áp dụng theo khuyến cáo của WHO. Liều

kháng nguyên và tá dược được chia đều với nhiều điểm tiêm cùng kỹ thuật

tiêm gây mẫn cảm đúng giúp ngựa bớt đau, đi lại cử động dễ dàng, không bị

nhiễm trùng lan tỏa. Theo bảng 3.7 cho thấy, tổng liều kháng nguyên và tá

dược ngày càng tăng, khiến cho việc phân chia các điểm tiêm kháng nguyên

và tá dược phải tính toán trước. Với tá dược CFA, cần chia ra nhiều điểm tiêm

và khoảng cách tiêm giữa các điểm phải được cân nhắc cụ thể tùy tình trạng

loét da ngựa. Điều này nhằm tránh cho vết loét da rộng quá hoặc lâu liền,

chăm sóc đỡ vất vả, lần miễn dịch sau dễ dàng hơn. Theo WHO, nên tiêm tá

dược CFA một lần duy nhất, sau đó chỉ tiêm kháng nguyên và tá dược IFA

vẫn làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên nhưng không gây tình

trạng loét da ngựa. Trong nghiên cứu này chúng tôi chưa áp dụng.

101

Như vậy, công đoạn gây mẫn cảm cho ngựa đã hoàn thành tốt với sự

phối hợp lịch trình miễn dịch với liều lượng kháng nguyên và tá dược

Freund’s. Đây là một giai đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất huyết

thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2. Kết quả gây mẫn cảm ngựa khẳng

định một lần nữa kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá được chế tạo đạt chất

lượng tốt, an toàn cho động vật miễn dịch.

Theo dõi, chăm sóc ngựa sau mỗi lần mẫn cảm là việc vất vả, đòi hỏi có

khoa học; trong suốt thời gian chín tháng của lịch trình gây mẫn cảm, đến khi

lấy máu ngựa, thu huyết tương giàu kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn. Nếu

chăm sóc không đảm bảo, ngựa có thể tử vong hoặc mắc bệnh, sinh kháng thể

không tốt, hiệu giá kháng thể không cao. Điều này đã được WHO cảnh báo và

là một vấn đề rất quan trọng trong số các giải pháp góp phần làm tăng hiệu

giá kháng thể trong sản xuất HTKNR nói chung.

Trước hết, sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược gây mẫn cảm, cần theo

dõi các biểu hiện toàn thân, tại chỗ của ngựa và xử trí kịp thời. Bảng 3.8 chỉ

ra: khi tiêm kháng nguyên và tá dược Freund’s cho hai ngựa nghiên cứu, thấy

các biểu hiện ở hai ngựa sau tiêm xảy ra tương tự nhau. Ngay những ngày

đầu sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược CFA ở cả hai ngựa nghiên cứu đều

thấy các biểu hiện mệt mỏi, bỏ ăn, yếu bại, ngựa nằm tại chỗ không đứng dậy

được, thở nông và nhanh, tại chỗ tiêm dần dần xuất hiện vết loét, đường kính

2 - 7 cm. Trong những lần gây mẫn cảm tiếp theo, KN được trộn với tá dược

Freund’s không hoàn toàn (IFA), thấy biểu hiện toàn thân, vận động, tiêu hóa,

hô hấp của ngựa gần như bình thường, ngựa vẫn đi lại, ăn uống, không cần

chăm sóc, đặc biệt không thấy xảy ra hiện tượng loét da.

Loét da nơi tiêm xảy ra sau miễn dịch ngựa bằng tá dược Freund’s hoàn

toàn (CFA) nhưng không xuất hiện khi miễn dịch với tá dược IFA đặt ra câu

hỏi phải chăng loét da ngựa là do BCG có trong thành phần tá dược Freund’s

102

hoàn toàn? Khi kháng nguyên đã được xác định an toàn trên chuột lang với

liều tiêm phúc mạc chuột là 1 ml/100 gam trọng lượng (bảng 3.4), đây là liều

lớn gấp 90 lần LD50 đối với chuột lang thí nghiệm nặng 250 - 300 gam. Trong

quá trình gây mẫn cảm, liều kháng nguyên từ 0,1 ml khởi đầu đã được nâng

cao dần đến 6 ml (Bảng 3.7), tương đương 1,1 mg/kg ---> 66 mg/kg trọng

lượng ngựa 320kg. Trừ những lần tiêm đầu tiên, những liều tiêm kháng

nguyên cuối cùng có nồng độ nọc sử dụng cao hơn LD50 của nọc rắn cạp nia

(3,7 µg so với 2,17 µg/chuột nhắt trắng Swiss 18 – 20g), nếu không khử độc,

sẽ gây nguy hiểm cho ngựa. Với việc hoàn thành quá trình gây mẫn cảm, một

lần nữa khẳng định kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá được chế tạo là thực

sự an toàn. Hiện tượng loét da xảy ra sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược

CFA do trong thành phần tá dược có BCG chết, gây phản ứng viêm rất mạnh,

tương tự tiêm vắc xin phòng lao ở người (Hiện tượng Koch, Nguyễn Năng An,

1975[2]). Điều này cũng phù hợp với khuyến cáo của WHO khuyên chỉ nên

tiêm một lần CFA và hạn chế việc tiêm tại một điểm một số lượng lớn kháng

nguyên và tá dược. Có nhiều ý kiến khác nhau về vấn đề này; dùng kháng

nguyên và tá dược thế nào còn tùy theo quan điểm, kinh nghiệm của các cơ sở

nghiên cứu, của từng tác giả (Đỗ Trung Phấn, 1979) [28].

Riêng về chăm sóc các vết loét da ngựa sau gây mẫn cảm là một vấn đề

rất cần chú ý. Do chuồng ngựa không thể đảm bảo vệ sinh, vết loét chắc chắn

bị nhiễm trùng, ruồi bâu bám,...nên càng lâu liền. Thông thường, việc sát

khuẩn vết thương hoặc băng vết loét cho ngựa rất khó khăn. Nếu vết thương

rộng và ở vị trí vận động (vùng cổ và ức ngựa) hầu như không thể băng hay

đắp gạc mà phải bắt buộc để hở, ảnh hưởng đến sức khỏe ngựa và không còn

vị trí để tiêm kháng nguyên và tá dược trong những lần gây mẫn cảm về sau.

Một điểm nữa cần nói đến, sẽ là thuận lợi hơn nếu việc chăm sóc ngựa

có nhân viên chuyên nghiệp, hiểu biết về tập tính, các bệnh thường gặp, các

103

loại thức ăn ưa thích có giá trị dinh dưỡng cao của ngựa,... Người chăn và

chăm sóc ngựa chuyên nghiệp sẽ tạo được sự thân thiện dễ gần với ngựa, giúp

cho tiếp cận ngựa gây mẫn cảm, lấy máu dễ dàng hơn, bảo đảm an toàn,

không bị ngựa đá hay dứt đứt dây trói khi lấy máu. Ngoài ra, cần đảm bảo

nước uống sạch cho ngựa, cung cấp các loại rơm cỏ không có hóa chất bảo vệ

thực vật, đủ thức ăn thô và tăng cường thức ăn tinh; che chắn chuồng trại cẩn

thận, nhất là vào mùa đông, thời tiết giá lạnh, rét đậm rét hại....Ngựa béo khỏe

là một dấu hiệu tốt báo hiệu thuận lợi cho việc sinh kháng thể có hiệu quả.

Chế tạo kháng nguyên đã thành công khi đảm bảo an toàn cho ngựa miễn

dịch (Bảng 3.8), tuy nhiên, mục đích cuối cùng của nghiên cứu là chế tạo

HTKN rắn cạp nia đa giá F(ab’)2 đặc hiệu. Vì vậy, tạo nguồn huyết tương

ngựa có hiệu giá kháng thể kháng nọc rắn cạp nia cao là hết sức quan trọng.

Theo dõi sự hình thành KT miễn dịch kháng nọc rắn cạp nia đa giá là công

việc cần thiết, được làm thường xuyên trong quá trình gây mẫn cảm.

Kết quả bảng 3.9 cho thấy, sau miễn dịch chín lần, hiệu giá kháng thể

đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn cạp nia tăng lên mức 2048 ở cả hai ngựa

và ổn định sau lần miễn dịch thứ tám và chín. Đây là mức đạt yêu cầu của kế

hoạch nghiên cứu. So sánh mức độ tăng hiệu giá kháng thể với khoảng thời

gian miễn dịch của các loại HTKNR khác như rắn hổ đất, rắn hổ chúa; hiệu

giá kháng thể ở rắn cạp nia ở ngựa tăng tương đương. Với rắn choàm quoạp

và rắn lục, thời gian đạt hiệu giá này sớm hơn, do đó có thể lấy máu sớm hơn

sau bảy lần miễn dịch bằng kháng nguyên nọc rắn cạp nia và tá dược.

Kết quả ở Bảng 3.9 cũng cho thấy, với hai ngựa khỏe mạnh, có cân

nặng gần như tương đương và được nuôi ở hai địa điểm khác nhau, cùng một

liệu trình miễn dịch với liều lượng như nhau, có thể cho kết quả hiệu giá

kháng thể khác nhau. Điều này cho thấy chế độ dinh dưỡng, đặc điểm sinh

học cá thể động vật gây mẫn cảm đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn

104

dịch của ngựa. Ngựa số 2 nuôi tại Thư Phú, Thường Tín, có chế độ dinh

dưỡng tốt hơn đã đạt hiệu giá kháng thể cao hơn ngay từ sau lần miễn dịch

đầu tiên. Điều này phù hợp với nhận định của Daltry J.C et al.,1996 [60].

Sau khi chế tạo kháng nguyên, kiểm tra đã có kháng thể đặc hiệu hình

thành trong máu ngựa hay không là việc rất quan trọng. Chúng tôi dùng thử

nghiệm Ouchterlony để kiểm tra thường xuyên hàng tháng sau khi gây miễn

dịch. Kháng nguyên sử dụng là kháng nguyên nọc rắn cạp nia (bắc + nam),

được bố trí ở trung tâm của lam thạch agarose 1,5%, xung quanh để huyết

thanh ngựa đã gây miễn dịch. Kết quả nêu ở mục 3.1.2.4 cho thấy: vết tủa KN

- KT trên thạch cho thấy trong máu ngựa đã hình thành kháng thể chống

kháng nguyên nọc rắn cạp nia. Pha huyết thanh với nồng độ khác nhau, đặt ở

các vị trí khác nhau để xem xét mức độ hình thành tủa KN - KT. Thử nghiệm

này có độ nhạy không cao, phụ thuộc nhiều yếu tố, so với thử nghiệm ELISA,

tuy nhiên, do điều kiện không cho phép, thử nghiệm Ouchternoly là một lựa

chọn cần thiết.

Để khẳng định kết quả sinh kháng thể và xác định tính đặc hiệu với

kháng nguyên nọc, sau khi sản xuất được HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 thành

phẩm, điện di miễn dịch, kết quả cho thấy vết tủa KN-KT rất rõ (Ảnh 3.5).

Điều này khẳng định kháng nguyên nọc rắn cạp nia được nghiên cứu chế tạo

đã đảm bảo có tính sinh miễn dịch đủ mạnh để kích thích cơ thể động vật sinh

kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn cạp nia.

4.1.3. Lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối HC:

Lấy máu, thu hoạch huyết tương giàu kháng thể là công đoạn rất quan

trọng trong sản xuất HTKNR. Máu lấy phải đảm bảo vô khuẩn, không bị

đông, không vỡ hồng cầu, thực hiện tách huyết tương ngay, truyền trả kịp thời

105

khối hồng cầu cho ngựa. Ngựa được lấy máu phải đảm bảo an toàn tuyệt đối.

Việc đảm bảo vô khuẩn cho tất cả các lần lấy máu ngựa đã được thực

hiện nghiêm túc. Máu ngựa được lấy vào bình thủy tinh hoặc bình nhựa vô

khuẩn, thể tích 10 lít/bình. Dây và kim lấy máu vô trùng được tráng heparin

pha trong dung dịch NaCl 0,9%. Tất cả dụng cụ lấy máu được đảm bảo vô

trùng khử khuẩn tại khoa chống nhiễm khuẩn bệnh viện Bạch Mai. Ngựa

trước khi lấy máu đã được cắt bờm gọn ghẽ, tắm rửa sạch sẽ, chải kỹ da bằng

bàn chải, xà phòng và dung dịch sát khuẩn. Cố định kỹ cổ ngựa và cố định

thân ngựa vào khung ép, có chắn trước và sau chân ngựa. Cạo lông sạch sẽ

vùng cổ ngựa, khu vực lấy máu. Khi lấy máu, sát trùng rộng bằng Iod 3%, sát

trùng lại bằng cồn sát trùng 70o. Nhân viên lấy máu mặc áo vô khuẩn, đeo

khẩu trang, đội mũ, mang găng tay vô khuẩn. Khi kết thúc, bình đựng máu

được bọc kỹ với ga vô khuẩn, buộc chặt trong quá trình vận chuyển.

Vấn đề an toàn cho ngựa khi lấy máu khối lượng lớn đã được quan tâm.

Kết quả Bảng 3.10 cho thấy, qua bốn lần lấy máu, mỗi lần lấy ở hai ngựa

cùng ngày tại cùng Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm dã ngoại Học viện

Quân y, Hòa Lạc, Thạch Thất, Hà Nội - tuy tiện lợi về mọi mặt, song vất vả

vì khối lượng công việc nhiều, mệt mỏi cho nhân viên và dễ dẫn đến sơ xuất.

Trong lần lấy máu đầu tiên, thu được lượng máu 5,9 lít (3,6 lít ở ngựa số 1 và

2,3 lít ở ngựa số 2). Trong lần lấy máu thứ hai thu được gần gấp đôi (5,1 lít ở

ngựa số 1 và 5,5 lít ở ngựa số 2).

Quá trình lấy máu, chú ý mối liên quan giữa lượng máu lấy và sức khỏe

của ngựa. Lấy máu an toàn tuyệt đối cho ngựa là một yêu cầu quan trọng. Để

ngựa chết, ngoài thiệt hại về vật chất, về kinh tế, còn là vấn đề thời gian và rất

nhiều công lao động của nhiều người trong quá trình gây mẫn cảm hàng nhiều

tháng....Bảng 3.11 cho thấy, khi lấy máu ít hơn 3,5 lít, ở cả hai ngựa đều

không có biểu hiện gì. Khi lấy từ 3,6 --> 5,4 lít máu, tùy theo từng ngựa, khả

106

năng chịu đựng khác nhau, các mức độ phản ứng với lấy máu khác nhau. Mức

độ lấy máu nhiều hơn 5,5 lít/ngựa, nếu không chú ý sẽ xảy ra mất an toàn cho

ngựa do shock mất máu. Không nên lấy quá 1,5% trọng lượng ngựa (Lê Văn

Hiệp, 2010) [159] (ngựa khoảng 300 kg, không lấy quá 4,5 lít). Nhất thiết

phải lấy lượng máu trong khả năng chịu đựng của ngựa. Phải chú ý đề phòng

shock mất máu.

Theo công ước Quốc tế bảo vệ động vật, cần tránh để đau đớn quá mức

và để chết động vật thí nghiệm (Paula G., Sells, 2003) [112]. Với Việt Nam,

công ước không được tuân thủ ngặt ngèo lắm. Tuy nhiên, với lương tâm của

nhà khoa học, tấm lòng biết ơn các động vật hy sinh vì con người, vẫn phải

thí nghiệm trên động vật, động vật vẫn phải lặng lẽ cống hiến vì con người,

song nên có một giới hạn. Giới hạn đó tốt cho con người nhưng cũng tốt cho

động vật đã cống hiến vì con người. Khi thực hiện nghiên cứu, cần đối xử tốt

nhất với chúng: vừa thể hiện sự nhân văn, vừa là khoa học.

4.1.4. Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đạt chất lượng cao:

Trước năm 1992, hệ thống tiêu chuẩn chất lượng thuốc có 4 cấp: tiêu

chuẩn Dược điển Việt Nam (TCVN), tiêu chuẩn ngành (TCN), tiêu chuẩn địa

phương (TCV), tiêu chuẩn cơ sở (TC). Hiện nay chỉ còn hai cấp tiêu chuẩn là:

tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam và tiêu chuẩn cơ sở. Tiêu chuẩn cơ sở do cơ

sở sản xuất biên soạn đối với chế phẩm mình sản xuất (Hoàng Ngọc Hùng,

2005) [18]. Để tinh chế HTKN-RCN đạt chất lượng tốt, ngoài bám sát tiêu

chuẩn quy định của Dược điển Việt Nam [36], phải có quy định chặt chẽ về

chất lượng, bảo đảm nguồn huyết tương sản xuất có chất lượng (vô khuẩn,

hiệu giá cao...), chuẩn độ acid, base chính xác, duy trì nhiệt độ tốt, xác định

pH đúng, tính đúng và đủ số lượng ammonium sulphate theo đúng hàm lượng

quy định, lọc giấy lọc Whattman vô khuẩn, thẩm tích cẩn thận với nước cất,

107

lọc với máy lọc Seiz có đĩa lọc đúng tiêu chuẩn, đóng lọ và bảo quản đúng

quy định về nhiệt độ [3]. Tất cả các khâu này của quy trình tinh chế đều cần

quản lý chất lượng chặt chẽ.

Về kỹ thuật, hiện thế giới đang sử dụng cả ba loại kỹ thuật tinh chế

IgG, Fab và F(ab')2. Cả ba phương pháp đều sử dụng nguyên liệu ban đầu như

nhau. Các kỹ thuật đều nhằm loại bỏ mọi thành phần phi kháng thể, cô đặc

phần kháng thể đặc hiệu; điểm khác biệt là sản phẩm cuối cùng chứa phân tử

kháng thể IgG nguyên vẹn hay IgG đã được cắt, tách từng phần bằng pepsin,

hoặc papain. Bản chất kháng thể cuối cùng sẽ quyết định tính an toàn, hiệu

lực và giá thành của sản phẩm. Nhiều trung tâm khoa học trên thế giới đã

nghiên cứu vấn đề này suốt nhiều thập kỷ, từ đó mỗi trung tâm lựa chọn qui

trình kỹ thuật phù hợp yêu cầu của mình. Thí dụ: Trung tâm sản xuất HTKNR

Nam Phi, Ấn Độ… chế tạo HTKNR IgG; công ty Protherics (Anh - Úc - Mỹ)

sản xuất HTKNR Fab (Karlson., et al 2009) [84],[120]. Hầu hết các nước

đang phát triển đều sử dụng qui trình kỹ thuật chế tạo HTKNR F(ab')2: Viện

Common Serum Laboratories-CSL (Australia), viện Butantan (Brazil) viện

Queen Saovabha (Thailand), Trung tâm kiểm tra bệnh tật - CDC (Đài

Loan),...Chúng tôi đã lựa chọn tinh chế HTKN-RCN dạng F(ab')2. Dạng

HTKNR này an toàn hơn cho người bệnh, hiệu quả trung hòa độc tố nọc rắn

rất tốt do ammonium sulphate gây tủa protein nhưng không làm biến đổi tính

chất của chúng, thời gian bán hủy thuốc tương đối chậm, đủ thời gian trung

hòa độc tố nọc rắn cạp nia, phản ứng huyết thanh thấp (< 15%) (Bảng 4.1).

Bảng 4.1: So sánh đặc điểm ba loại HTKNR: IgG, F(ab')2 và Fab.

Đặc điểmLoại HTKNR

IgG F(ab')2 Fab

108

Thời gian phân phối/cơ thể (h) > 3 3 1

Thời gian loại trừ khỏi cơ thể (h) 100 60 10

Gắn vào mô cơ thể Mạnh Vừa yếu

Hoạt hóa bổ thể Có Không Không

Đường loại trừ khỏi cơ thể Mô miễn dịch Mô miễn dịch Thận

Phản ứng không mong muốn (%) >80 <15 <10

Giá thành (USD/lọ) 40 70 1.200

Bảng 4.1 cho thấy, HTKNR F(ab')2 có thời gian phân phối thuốc chậm

hơn so với HTKNR Fab (3 giờ và 1 giờ), song điều đó không ảnh hưởng đến

cứu chữa nạn nhân vì có máy thở hỗ trợ trong khoảng thời gian thuốc chưa

được phân phối khắp cơ thể. Giá thành HTKN-RCN F(ab')2 không cao

(khoảng 70 USD/lọ) trong khi giá của HTKNR Fab rất cao (> 1.200 USD/lọ).

Mặt khác, HTKNR Fab có thời gian phân phối thuốc nhanh nhưng thời gian

thải loại khỏi cơ thể cũng nhanh, chỉ khoảng 10 giờ, giá thành lại rất đắt so

với HTKNR dạng IgG và F(ab')2; do vậy, HTKNR Fab không phù hợp với

các nước đang phát triển như Việt Nam. HTKNR IgG tác dụng trung hòa nọc

độc mạnh, giá thành rẻ nhưng phản ứng huyết thanh cao trên 80%, nên không

được lựa chọn để sản xuất sản phẩm này [38],[130]. Trong sản xuất HTKNR,

việc lựa chọn quy trình tinh chế phù hợp được cân nhắc rất sớm, trước khi bắt

tay vào chế tạo kháng nguyên nọc rắn. Sản xuất bằng kỹ thuật gì tinh chế

được phần F(ab’)2 đặc hiệu kháng nọc rắn với tỷ lệ cao nhất, tinh sạch nhất là

điều cực kỳ quan trọng.

Theo tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV đề ra ban đầu và

tiêu chuẩn của WHO về HTKNR (Guidelines, 2008), ngoài việc thiết kế mục

tiêu là HTKNR có chứa nhiều nhất F(ab’)2, cần loại bỏ hầu hết những chất

không cần thiết của protein ngựa (albumin, globulin không cần thiết), chất

109

bảo quản (phải trong giới hạn cho phép), ammonium sulphate; vi khuẩn, vi

nấm, chí nhiệt tố và phải có đủ các điều kiện lý hóa cần thiết của HTKNR như

pH trung tính, áp lực thẩm thấu đẳng trương, đảm bảo nồng độ chất bảo quản

(thiomersan) ở dưới hàm lượng cho phép...vì vậy, tinh chế huyết tương chứa

kháng thể kháng nọc rắn cạp nia đa giá (bắc + nam) thành HTKN-RCN đa giá

F(ab’)2 là một quy trình rất quan trọng, ảnh hưởng quyết định đến chất lượng

cuối cùng của sản phẩm. Quy trình đòi hỏi phải được thực hiện rất chặt chẽ,

chính xác theo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của sản xuất.

Việc đầu tiên của công đoạn tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2 là cắt Fc của

IgG có trong huyết tương nguyên liệu bằng pepsin. Phân tử IgG nguyên vẹn

có mảnh Fc, là nguyên nhân của các phản ứng không mong muốn trên lâm

sàng, nhất là shock phản vệ. Fc mang thụ thể gắn các tế bào mastocyte, bạch

cầu ưa kiềm, đó là kho chứa các chất trung gian hóa học histamin, serotonin,

bradykinin... gây phản vệ, phản ứng nguy hiểm nhất trong huyết thanh trị liệu.

Pepsin có bản chất là enzyme tiêu protein (protease), thành viên của họ

men aspartate protease. Pepsinogen là tiền chất của pepsin, do tế bào niêm

mạc dạ dày tiết ra để cắt phân tử protein có trong thức ăn thành peptides. Năm

1836, Theodor Schwann đã phát hiện ra pepsin, và đặt tên “pepsin” từ chữ

gốc tiếng Hy lạp “pepsis”, nghĩa là tiêu hóa (peptein: to digest). Năm 1929,

pepsin đã là một trong những enzyme đầu tiên được John H. Northrop kết

tinh. Cùng với hai enzyme đồng hành: chymotrypsin và trypsin, pepsin vừa có

chức năng chuyên biệt, vừa hợp tác với hai enzyme đồng hành để tiêu huỷ

protein của thức ăn. Pepsin hoạt động tối ưu ở môi trường acid (pH 2 - 3,2)

(Morais V., Massaldi H., 2005) [103], cùng papain là hai loại enzyme được sử

dụng rộng rãi và hiệu quả nhất để nghiên cứu cấu trúc của phân tử kháng thể

bằng cách cắt rời phân tử kháng thể ở vị trí aminoacide đặc hiệu. Đặc biệt hơn

nữa, các mảnh peptides đã cắt rời vẫn còn nguyên chức năng sinh học của nó

110

(Nisini R., Le Moli S., et al., 1989), [108].

Papain cắt phân tử kháng thể IgG tại vị trí amino acid tận cùng của cầu

nối disulfide, tạo thành ba mảnh (fragments), hai mảnh có hoạt tính “gắn”

KN, được gọi là mảnh Fab (Fragment antigen biding), vì có một “tay” của

phân tử kháng thể, gồm chuỗi nhẹ ghép đôi với vùng lãnh địa (domains) VH

và CH1 của chuỗi nặng. Mảnh còn lại không có hoạt tính gắn KN, nhưng có

thể kết tinh, được gọi là Fc (Fragment crystallize). Trong khi đó, pepsin cũng

tác dụng tại vùng tưng tự như papain, nhưng ở vị trí carboxyl tận cùng của

cầu nối disulfide, tạo ra mảnh F(ab)2, có cả hai “tay” của phân tử IgG và mảnh

Fc. Fc cặp đôi với CH2 và CH3 của chuỗi nặng và là phần của kháng thể có

chức năng tương tác với tế bào và phân tử khác (effector molecules), là

nguyên nhân của các phản ứng không mong muốn khi điều trị kháng huyết

thanh, trong đó nguy hiểm nhất là shock phản vệ. Bằng kỹ thuật sử dụng

pepsin cắt bỏ Fc, chỉ còn lại mảnh F(ab)2 có đặc tính “gắn” kháng nguyên

giống hệt kháng thể gốc nguyên vẹn, nhưng lại không có khả năng tương tác

với bất cứ phân tử hoặc tế bào nào; do vậy F(ab)2 có tiềm năng ứng dụng điều

trị rất lớn.

Theo Bảng 3.12, lượng huyết tương đưa vào sản xuất lần đầu (lô I) của

hai ngựa là 3,6 lit. Sau khi cắt Fc bằng pepsin, tủa các thành phần không chứa

kháng thể kháng nọc RCN bằng ammonium sulphate 14%, thu dịch lọc chứa

kháng thể kháng nọc RCN đa giá F(ab’)2, được 2,9 lít. Tỷ lệ thu lại dịch lọc

có KT là 80,6%. Trong lần sản xuất thứ hai (lô II), đưa vào tinh chế 6,4 lít

huyết tương, thu được 5,1 lít dịch lọc chứa kháng thể, tỷ lệ 80,3%. Như vậy,

với phương pháp như nhau, kết quả thu được tương tự. Tỷ lệ thu lại huyết

tương giàu F(ab’)2 với hai lần tinh chế là 80,4%. Tỷ lệ này cho thấy, trong ≈

20% thể tích loại bỏ có chứa các thành phần protein không phải F(ab’)2. Đây

là sự cần thiết đầu tiên cho tinh sạch sản phẩm.

111

Tủa với ammonium sulphate có lợi điểm giữ được nguyên tính chất của

các mảnh F(ab’)2 nhưng hiệu xuất kém hơn so với các kỹ thuật tinh chế khác

như Sắc ký trao đổi ion (Ion - exchange chromatography) và kỹ thuật Sắc ký

ái lực (Affinity chromatography). Sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện

khác nhau giữa HTKNR và các chất tạp nhiễm. Cột trao đổi anion DEAE,

QAE gels hoặc màng như màng vi xốp cellulose, ở pH trung tính sẽ hấp phụ

chất nhiễm bẩn là protein. Cột trao đổi cation như carboxymethyl gel hoặc

sulfopropyl khi tinh chế HTKNR IgG hoặc F(ab’)2, ở pH= 4,5 sẽ bám dính

HTKNR trong khi chất nhiễm bẩn protein bị loại bỏ qua cột. Kỹ thuật sắc ký

áp dụng theo GMP, có thể vệ sinh, xử lý, bảo quản sử dụng nhiều lần, nhưng

phải được kiểm tra, đề phòng nhiễm bẩn từ lô HTKNR này sang lô HTKNR

khác. Sắc ký ái lực sử dụng nọc cố định trên cột để gắn các phân tử globulin

hoặc mảnh của nó khi cho dung dịch HTKNR chảy qua. Tuy nhiên, cột

thường bị kém chất lượng khá nhanh, cần phải rửa, vệ sinh, xử lý rất cẩn thận,

bảo quản trong điều kiện thích hợp. Kỹ thuật này phải đảm bảo chắc chắn

chất bẩn đã hoàn toàn bị loại bỏ theo qui trình nghiêm ngặt, không ảnh hưởng

tới chất lượng của sản phẩm. Kỹ thuật ái lực có thể ảnh hưởng sự hồi phục

của kháng thể ái lực mạnh, sẽ làm mất hoặc hủy hoại kháng thể. Tuy nhiên,

nếu sử dụng bổ sung thêm hai kỹ thuật này sau tinh chế, chất lượng HTKNR

không tăng thêm đáng kể, nguy cơ nhiễm bẩn cao, và đặc biệt sẽ đẩy giá

thành HTKNR lên cao nhiều lần ( > 800 USD/lọ), vượt quá xa khả năng chấp

nhận của nạn nhân bị rắn cắn nghèo khó.

Kỹ thuật tủa protein bằng ammoni sulphat đã được biết đến từ rất lâu.

Việc thu nhận và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của

protein, như: độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan...của protein cần

chiết xuất. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc

chiết xuất các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn

112

thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự

nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau như: nhiệt độ,

pH, dùng chất hóa học như muối: (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4.., các dung môi

hữu cơ như ethanol, acetone...vv. Trong các phương pháp đó, dùng muối

ammonium sulphate tách protein đã và đang được sử dụng phổ biến và hiệu

quả nhất. Thêm muối vào dung dịch protein là làm giảm lớp hydrate hóa. Lớp

hydrate bao quanh phân tử protein giảm đi sẽ bộc lộ nhóm “kỵ nước”, lực hút

tĩnh điện tăng lên, protein bị kết tủa. Ammonium sulphate có khả năng hòa

tan rất cao tới nồng độ 4M, trong khi ở nồng độ 3,2M hầu hết các loại protein

đều đã bị tủa. Tăng nồng độ ammonium sulphate sẽ làm tăng sự tranh chấp

phân tử nước, protein càng nhanh chóng kết tủa. Điều chỉnh nồng độ

ammonium sulphate tăng dần bằng cách thêm trực tiếp muối vào dung dịch,

vừa tách chọn lọc từng loại protein, vừa kiểm soát được thể tích dung dịch.

Chỉ sau 30-60 phút hòa tan ammonium sulphate theo từng nồng độ chọn lọc,

toàn bộ protein tương ứng đã bị tủa. Khi tái hòa tan hạt protein kết tủa trong

đệm mới, cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của protein vẫn được giữ

nguyên. Một số muối cùng tủa theo protein, cần phải loại bỏ bằng thẩm tích.

Như vậy, dung dịch protein thành phẩm vừa tinh sạch vừa được cô đặc, vẫn

giữ nguyên được chức năng sinh học của kháng thể. Tất nhiên, ngoài nồng độ

và tính chất của ammonium sulphate, tủa protein còn phụ thuộc vào pH và

nhiệt độ của dung môi. Ở pH = 4,2 và nhiệt độ 20oC, với nồng độ ammonium

sulphate = 14%, mọi thành phần protein không phải F(ab’)2, kể cả Fc và lipid

đều bị tủa và được loại bỏ, dịch lọc chứa F(ab')2 được thu lại trong dịch lọc

huyết tương [3],[30],[37]. Khi điều chỉnh pH dịch lọc lên 6,8 ở 20oC, rồi thêm

ammonium sulphate tới 22%, trộn đều, sau 60 phút sẽ tủa toàn bộ kháng thể

F(ab')2 cùng với muối ammonium sulphate. Nhiều tác giả cũng giải thích

tương tự về kỹ thuật và đạt kết quả tinh chế tốt (Jones R.G.A,, Landon J.,

2003) [80].

113

Theo Bảng 3.13, ở lô I, với 2,9 lít dịch lọc chứa KT đưa vào tinh chế,

sau khi thêm ammonium sulphate tới 22%, thu được 210 gam tủa kháng thể

F(ab')2. Trong lần sản xuất thứ 2 (lô II), với 5,1 lít dịch lọc giàu kháng thể, tủa

tiếp với muối ammonium sulphate 22%, thu được 495 gam tủa giàu kháng

thể. Với tỷ lệ thu lại lượng tủa so với huyết tương sản xuất của lần II, giống

như lần I cho thấy: phương pháp như nhau thì kết quả giống nhau.

Tiếp tục công đoạn tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2, cần phải tiến hành

thẩm tích loại bỏ ammonium sulphate khỏi tủa giàu F(ab’)2 và lọc với máy

lọc Seiz, đĩa lọc cellulose kích thước lỗ lọc 0.2 µm, tạo HTKN-RCN F(ab')2

dạng bán thành phẩm hoàn toàn vô trùng. Bảng 3.14 cho thấy: Lô I, sau khi

thẩm tích 190 ml dịch tủa giàu kháng thể kháng nọc RCN F(ab’)2 và lọc, thu

được 165 ml HTKN-RCN bán thành phẩm (chưa kiểm định cơ sở). Thẩm tích

Lô II, với 510 ml sau thẩm tích và lọc, thu được 485 ml. Cả hai lần thu được

650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 bán thành phẩm. Tỷ lệ hao hụt như nhau, 25

ml/lần, cho thấy, lọc nhiều huyết tương một lần tiết kiệm hơn. Như ở đây, một

lần lọc sẽ giảm được 25 ml HTKN-RCN dạng F(ab’)2, tương đương 5 lọ, mỗi

lọ có giá sản xuất chừng 70 USD (bảng 3.24, phần Phụ lục), cũng là giảm một

khoản chi phí đáng kể. Tỷ lệ này vẫn còn cao, do dùng máy lọc Seiz, kiểu cũ.

Nếu lọc với máy mới, ngoài chất lượng tốt hơn, thời gian lọc nhanh hơn, còn

tiết kiệm được nhiều HTKNR hơn. Bảng 3.15 chỉ ra một số hóa chất chính đã

sử dụng tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2. Kết hợp với bảng phụ lục 4, thấy số

lượng kinh phí cho công đoạn tinh chế không lớn. Sản xuất HTKN-RCN loạt

đầu tiên, tiến hành trong khoảng 14 - 16 tháng (tuyển chọn rắn và chế tạo KN

1 - 2 tháng, miễn dịch ngựa trong chín tháng, sản xuất và tinh chế HTKN một

tháng, kiểm định cơ sở và kiểm định quốc gia 1 - 2 tháng). Chi phí ≈ 175

triệu đồng thu được 650 ml HTKN-RCN sản phẩm, tương đương 269.000/ml.

Nếu đóng lọ 5 ml, giá thành của một lọ HTKN- RCN khoảng 1.346.000

114

VNĐ/lọ. Những lần sản xuất sau sẽ có giá thành rẻ hơn do chi phí trước

không phải tính đến (chi phi mua ngựa giống, chuồng trại, dụng cụ, trang thiết

bị chuyên dùng đã mua từ trước). Đây là một kỹ thuật dễ thực hiện, quy mô

nhỏ, phục vụ nhu cầu của đối tượng BN không lớn. Bảng 3.16 cho thấy đã

tinh chế được 650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 dạng bán thành phẩm và sau khi

kiểm định cơ sở đạt yêu cầu, đóng lọ 5 ml, được 130 lọ HTKN-RCN đa giá

F(ab’)2 thành phẩm, đạt yêu cầu số thành phẩm theo đề cương nghiên cứu đặt

ra (100 - 200 lọ). Liều lượng ammonium sulphate mà Guidlolin R.G,

Marcelino R.M, et al., (2010) [69] sử dụng là 29%, cao hơn chúng tôi.

Theo Bảng 3.17, kết quả định lượng protein, albumin, globulin, IgG,

IgM, tỷ lệ A/G huyết thanh ngựa và HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 cho thấy:

thành phần chủ yếu của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 là globulin, chiếm 97,2%.

Trong số 48,4 g/l globulin (100%), các globulin IgG, IgA, IgM có số lượng là

2,14g/l, chỉ chiếm 4,4%. Như vậy 95,6% còn lại là mảnh F(ab’)2. Mảnh

F(ab’)2 có trọng lượng phân tử 100 kD [81], chiếm tỷ lệ tuyệt đối, đã cho hình

ảnh điện di protein dạng thuần nhất, trong khi định lượng albumin đã cho biết

chỉ còn 1,4 gam chiếm 2,8%. Hình ảnh điện di protein không có phần

globulin, trong khi định lượng vẫn còn 2,141 g/l. Chính vì số lượng globulin

còn lại quá ít, điện di protein không xác định được đỉnh (IgM có 86mg/l, IgG

có 2,03g/l, IgA có 25mg/l, tổng cộng 3 loại là 2,141 g/l). Như vậy, F(ab’)2 là

thành phần chủ yếu trong HTKN-RCN (48,4/49,8 g/l = 97,2%), còn lại

albumin 2,8%. Với tổng lượng globulin gồm IgM, IgG, IgA là 4,4%

(2,141/48,4 = 4,4%), cho thấy: lượng F(ab’)2 chiếm tỷ lệ tuyệt đối (46,26 g/l

= 95,6%), phù hợp với hình ảnh điện di protein.

Tóm lại: kết hợp điện di protein và định lượng các thành phần trong

HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 cho thấy kết quả tinh chế rất hiệu quả. HTKN-

RCN đa giá F(ab’)2 được chế tạo có độ tinh sạch cao, lượng F(ab’)2 đặc hiệu

115

chống nọc rắn cạp nia chiếm tới 95,6% (= 46,26 g/l). Các globulin miễn dịch

còn lại chiếm 4,4% (= 2,141 g/l); lượng albumin chiếm 2,8% (1,4 g/l). Đây là

ba thành phần protein duy nhất có trong HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 được sản

xuất.

4.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM HTKN-RCN ĐA GIÁ

F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM:

4.2.1. Kiểm định cơ sở và vấn đề kiểm soát chất lượng:

4.2.1.1. Tính “An toàn” của chế phẩm:

Theo Bảng 3.18, kết quả thử nghiệm an toàn chung (Safety test) trên

chuột lang Cobaye cho thấy: với liều tiêm phúc mạc 1 ml HTKN-RCN đa giá

F(ab’)2 /100 gam cân nặng, theo dõi trong 21 ngày ba chuột cho kết quả đạt

yêu cầu: cả ba chuột đều tăng cân, phát triển bình thường, không có chuột ốm,

chuột chết. Đây là thử nghiệm xác định sự tồn tại của các độc tố bất kỳ nói

chung trong sinh phẩm y tế. Thử nghiệm này được tiến hành ở hầu hết các cơ

sở sản xuất HTKNR trên thế giới, và được WHO giới thiệu trong các hướng

dẫn kiểm tra chất lượng HTKNR. Đây là thử nghiệm dễ làm, theo dõi không

phức tạp và có độ nhạy cao. Thử nghiệm là bắt buộc với tất cả các sinh phẩm

kháng huyết thanh, nhất là kháng huyết thanh dùng đường tiêm tĩnh mạch.

Theo kết quả ở Bảng 3.19, thử nghiệm chí nhiệt tố (Pyrogen test) cho

thấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 bán thành phẩm đã đạt yêu cầu, HTKNR

không có chất gây sốt. Theo Bảng 3.20, HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 sau cấy

khuẩn (Sterility test) đã đạt vô khuẩn, không có vi khuẩn, vi nấm mọc trong

môi trường thạch Chocolat, thạch máu và môi trường Sabouraud, với điều

kiện nhiệt độ tối ưu, theo dõi trong 14 ngày liên tiếp.

Như vậy, trong kiểm định cơ sở, tiêu chuẩn “An toàn” của HTKN-RCN

116

F(ab’)2 đã được xác nhận mức “Đạt”. Đây là yêu cầu đầu tiên trong kiểm tra

chất lượng sản phẩm ở mức cơ sở sản xuất. Đối với bất kỳ thuốc gì dùng cho

người, tiêu chuẩn an toàn là tiêu chuẩn đầu tiên, tiêu chuẩn số một. Nếu

không an toàn, thuốc nguy hiểm cho người bệnh, sẽ phải hủy bỏ. Việc sản

xuất được HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã đảm bảo loại bỏ rất nhiều nguy cơ

mất an toàn về miễn dịch do cắt bỏ được phần Fc. Tuy nhiên, do quá trình

tinh chế gồm rất nhiều công đoạn, nhiều loại hóa chất được sử dụng, tiềm ẩn

rất nhiều nguy cơ nhiễm khuẩn, nhiễm độc các loại độc tố khác nhau, các chất

gây sốt...Việc chấp hành tốt các yêu cầu quy định trong tất cả các khâu kỹ

thuật là tiền đề quan trọng đảm bảo an toàn cho sản phẩm HTKNR nghiên

cứu. Việc kiểm tra thường xuyên các khâu của các công đoạn sản xuất

HTKNR cho thấy vai trò quan trọng của kiểm định sản xuất. Đây là tiền đề

cho ra đời sản phẩm HTKNR an toàn. Thử nghiệm đã được tiến hành trên

động vật thí nghiệm và trong phòng thí nghiệm để chắc chắn “An toàn” cho

người bệnh, kể cả trường hợp liều HTKNR cần phải sử dụng tăng cao nhiều

lần hơn giới hạn quy định.

Cũng như với bất kỳ chế phẩm sinh học nào, qui trình kỹ thuật sản xuất

HTKNR phải đảm bảo giảm thiểu tối đa nguy cơ nhiễm virus ngay từ nguyên

liệu ban đầu. Xuyên suốt tất cả các bước tiếp theo của qui trình sản xuất, cần

bất hoạt, loại bỏ mọi nguy cơ nhiễm khuẩn, nhiễm virus tiềm ẩn. Cần phải

giảm thiểu tối đa nguy cơ nhiễm vi khuẩn, virus bằng việc thi hành một hệ

thống kiểm tra chất lượng nguyên liệu ban đầu, bố trí qui trình sản xuất nhằm

bất hoạt và loại bỏ virus còn sót lại trong suốt quá trình sản xuất HTKNR,

tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn GMP ở tất cả các bước sản xuất, đáp ứng kịp

thời và phù hợp với mọi sự cố nhiễm trùng được ghi nhận trong khi sử dụng

HTKNR trên lâm sàng. Theo WHO (Guidelines, 2008), từ trước đến nay chưa

có báo cáo về trường hợp nào lây truyền virus gây bệnh qua đường sử dụng

117

kháng huyết thanh [151]. Điều đó là do các công đoạn tinh chế đã tách hết tế

bào, chỉ còn huyết tương, virus không thể tồn tại phát triển nếu không có tế

bào chủ. Đồng thời, cùng với việc sử dụng hóa chất có tính diệt khuẩn như

pepsin, ammonium sulfate, merthiolat,...cũng như các điều kiện nhiệt độ cao

kéo dài hàng giờ, pH acide thấp tới 3 và 3,5 (WHO Guidelines, 2008, [151],

[154], Burnouf T., et al 2007 [45],[46], Reid K.G., Cuthbertson B, et al., 1988

[121]); việc lọc bỏ tủa, thẩm tích, lọc vô trùng với màng lọc 0,2 µm đã góp

phần từng bước loại bỏ nguy cơ này (đã được chứng minh qua nhiều nghiên

cứu) (Terpstra F.G. et al., 2006) [140]. Tuy vậy, khi sản xuất HTKNR, chúng

ta vẫn phải luôn lưu ý, không bỏ sót vấn đề này. Cần thường xuyên chú ý các

thông tin về nghiên cứu lây nhiễm virus trong thực tế [142],[143].

4.2.1.2. Tính “Hiệu lực” của chế phẩm nghiên cứu:

Theo kết quả Bảng 3.21, đã xác định được liều chết trung bình (LD50)

của nọc rắn cạp nia Việt Nam (gồm cả hai loài rắn cạp nia bắc và nam) là 2,17

µg/chuột (18 - 20 gam). Đây là công việc bắt buộc trước khi tính ED50.

Ngay khi tiến hành thử nghiệm, đếm số chuột sống chết đã xác định

nhanh LD50 = 2 µg/chuột nhắt trắng. Tuy nhiên, để chính xác, nhóm nghiên

cứu cần phải tính toán. Khi tính LD50, chúng tôi đã sử dụng công thức tính

LD50 của G. Karber [27]: LD50 = LD100 – (Z d/n). Trong đó: Z là số trung

bình tử vong của 2 nhóm kế cận, d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm, n:

số động vật thử nghiệm trong từng nhóm. Sau khi tính toán cụ thể cho kết quả

LD50 = 2,17 µg/chuột nhắt trắng (18 - 20g). So sánh tính toán và đếm nhanh,

chúng tôi thấy tương đương (2,17 & 2), tính toán theo công thức chính xác

hơn 0,17 µg. Như vậy, nhóm nghiên cứu đã pha loãng nọc rắn với hệ số 1,5

lần (Bảng 3.21), khác so với độ pha loãng tính theo Dược điển Việt Nam IV,

2009 (theo Dược điển Việt Nam IV, bậc pha loãng là 1,2 hoặc 1,4 lần). Cách

118

tính LD50 theo công thức Karber đã được chúng tôi lựa chọn do dễ sử dụng,

dễ tính toán hơn so với các công thức tính LD50 khác, song vẫn đảm bảo độ

chính xác.

Liều chết 50% (Lethal Dose 50%) - LD50 trên chuột nhắt trắng trọng

lượng 18 - 20g/con đã được WHO khuyết cáo cách tính toán từ năm 1971.

Tuy nhiên, WHO không quy định cụ thể phải tính theo công thức tính LD50

nào, của ai [151],[27],[105]. Dược điển Việt Nam III và IV quy định cụ thể

cách tính LD50 theo Spearman – Karber tính toán phức tạp hơn cách chúng

tôi đã sử dụng (Phương pháp Karber, Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh,

1995) [27]. Phần này đã nêu trong Chương 2, đối tượng và phương pháp

nghiên cứu, mục Kiểm định quốc gia, cách tính LD50 và ED50.

Việc pha nọc rắn xác định LD50 tiến hành theo nhiều nồng độc khác

nhau. Nước muối sinh lý NaCl 0,9% dùng làm dung môi pha loãng nọc, sao

cho thể tích dịch nọc mỗi lần tiêm tĩnh mạch đuôi chuột nhắt trắng Swiss 10 -

20 gam là 0,2 ml/con, tiêm phúc mạc chuột là 0,5 ml/con. Thời gian theo dõi

chuột tiêm tĩnh mạch là 24 giờ, tiêm phúc mạc là 48 giờ, ghi nhận liều nọc

gây chết chuột từ 0% đến 100% và liều nọc gây chết một nửa số chuột (LD50),

qua đó xác định mức độ độc của nọc. Theo Bảng 3.21, LD50 nọc rắn cạp nia

đa giá là 2,17 µg trên chuột nhắt trắng 20 gam, cao hơn so với LD50 nọc B.

candidus Thái Lan trong nghiên cứu của Chanhome L. et al., 2009 (0,053 -

0,070 µg/g) [50], và của B.candidus Malaysia trong nghiên cứu của Tan N.H

et al., 2004 (0,1 µg/g) [135], đồng thời cũng thấp hơn LD50 rắn cạp nia bắc

(B.multicinctus) trong nghiên cứu của Steven D., 1999 (0,15 µg/g) [131].

Hiệu lực trung hòa hoạt tính độc của nọc là mục tiêu của sản xuất

HTKNR (Peres C.M.; Bastos F.M., et al, 2006) [114]. Bước quan trọng là

thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng cả trong phòng thí nghiệm và trên

động vật, xác định khả năng trung hòa nọc độc của HTKNR, bao gồm khả

119

năng cứu sống động vật, chống chảy máu, chống tiêu sợi huyết, chống hoại

tử, trung hòa độc tố thần kinh… do nọc độc gây nên. Đầu tiên phải xác định

hoạt tính gây chết của nọc, liều gây chảy máu tối thiểu (Minimum

haemorrhagic dose - MHD), liều đông tối thiểu của nọc tác động lên sợi huyết

và huyết tương (Minimum coagulant dose - fibrinogen & plasma: MCD-F,

MCD-P). Xác định hiệu lực trung hòa nọc 50% (ED50) của HTKNR là tiêu

chuẩn so sánh HTKNR giữa các lô của một cơ sở sản xuất với các cơ sở khác.

Chuột nhắt trắng nên dùng nhóm 5 - 6 con, trọng lượng 18 - 20 gam/con.

Dung dịch nọc cố định trộn đều với HTKNR (tăng dần). Đường tiêm tĩnh

mạch là phổ biến, đôi khi cũng dùng đường tiêm phúc mạc. Theo dõi 24 giờ

số lượng chuột sống 50% sau khi tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nọc và HTKNR

chính là khả năng bảo vệ hay hiệu lực của HTKNR. Tuy nhiên, chủng loại

chuột nhắt trắng, số lượng nọc (LD50) để trộn với HTKNR, đường tiêm cho

chuột… luôn được lưu ý để kết quả thí nghiệm đạt yêu cầu đồng khả năng thì

so sánh mới có ý nghĩa.

Các thí nghiệm xác định khả năng trung hòa của HTKNR với các hoạt

tính đặc biệt như chảy máu, phù nề, tiền đông, tiêu hủy sợi huyết, hoại tử

không thực hiện thường qui. Tuy nhiên, khi cần, có thể tham khảo tài liệu

hướng dẫn của WHO. Cần có HTKNR và nọc tiêu chuẩn tham chiếu để so

sánh, đánh giá chất lượng. Vì vậy, mỗi quốc gia, mỗi khu vực cần có tiêu

chuẩn tham chiếu nọc và HTKNR của địa phương mình.

Điểm thống nhất chung là các thử nghiệm trên động vật rất tốn kém.

Mối tương quan về nhiễm độc từ động vật tới điều trị trên người rất hạn chế

hoặc không rõ. Gần đây, các quốc gia Âu-Mỹ đề nghị không nên thử nghiệm

gây chết trên chuột. Từ đó các tác giả đưa ra thử nghiệm trên phôi gà thay thế

thử nghiệm trên động vật. Theo dõi phôi gà sống hoặc chết phản ánh khả năng

trung hòa của HTKNR với liều chết của nọc. Kỹ thuật này cũng được áp dụng

120

để xác định hoạt tính gây chảy máu của nọc và khả năng trung hòa của

HTKNR bằng cách đo đường kính vùng chảy máu khi nhỏ nọc, so sánh với

kết quả khi nọc đã được ủ trước với HTKNR. Giá thành thử nghiệm loại này

cũng rất rẻ. Tuy nhiên, thử nghiệm trên phôi gà lại không áp dụng được với

độc tố thần kinh.

Trong kiểm tra chất lượng HTKNR, trước hết là xét nghiệm xác định

khả năng trung hòa nọc độc (Neutralization potency test). Đây là khâu quyết

định hiệu quả của thuốc. Nọc rắn độc là nguyên nhân đe dọa tính mạng, đang

tồn tại trong cơ thể nạn nhân, phải được trung hòa, loại bỏ càng nhanh càng

tốt. Kết quả nghiên cứu đã xác định hai xét nghiệm về hiệu lực, đó là: liều gây

chết 50% (LD50) của nọc rắn cạp nia là 2,17 µg/chuột (20g) và liều hiệu lực

trung hòa, có khả năng giải độc cứu người của HTKN cạp nia đa giá F(ab’)2

(ED50) của loạt sản xuất nghiên cứu này là 57.14 LD50/ml = 124.2 µg/ml. Kỹ

thuật được tiến hành theo khuyến cáo của WHO, tại Đơn vị nghiên cứu chế

tạo huyết thanh kháng nọc, Trung tâm chống độc, bệnh viện Bạch Mai. Kết

quả này phù hợp với “Phiếu trả lời kết quả kiểm định số: 00610/SPĐT-NC

của Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, ngày 1/12/2010.

4.2.2. Kiểm định chất lượng của Kiểm định Quốc gia :

Kiểm định Quốc gia về HTKNR bao gồm hai nhóm kiểm định: nhóm

kiểm định an toàn, công hiệu và nhóm kiểm định tính chất lý hóa (thử nghiệm

xác định nồng độ NaCl, nồng độ protein, nồng độ chất bảo quản, pH...).

Thông thường, kiểm định Quốc gia làm công tác đánh giá chất lượng sau

cùng, sau khi kiểm định cơ sở đã tiến hành xong cho kết quả đạt yêu cầu.

Kiểm định Quốc gia được tiến hành theo yêu cầu của nhà sản xuất, thường là

kiểm định các thành phẩm đã hoàn chỉnh. Đây là những thử nghiệm được

thực hiện độc lập với cơ sở sản xuất, với các trang thiết bị hiện đại, động vật

121

thí nghiệm đạt chuẩn, phòng thí nghiệm hoàn thiện nhất, cho thử nghiệm

được tiến hành trong điều kiện tốt nhất, hóa chất chuẩn nhất, nhân viên lành

nghề nhất.... Kiểm định Quốc gia có hệ thống các quy trình kỹ thuật riêng,

tiêu chuẩn đánh giá riêng, tuân thủ gần như tuyệt đối theo các điều khoản quy

định chặt chẽ có tính pháp lý của Dược điển Việt Nam. Việc lấy mẫu kiểm

định là ngẫu nhiên, theo quy trình lấy mẫu riêng, cũng được quy định rất cụ

thể, rõ ràng trong Dược điển Việt Nam.

Mỗi quốc gia có Dược điển của mình. Sản xuất HTKNR có thể tham

khảo Dược điển các nước về tiêu chuẩn cho sản phẩm; cũng có thể tham khảo

theo hướng dẫn của WHO, tuy nhiên cuối cùng vẫn phải tuyệt đối tuân thủ

luật pháp trong sản xuất, sử dụng thuốc...theo các tiêu chuẩn quốc gia của

Dược điển Việt Nam. Do đó, kết quả thử nghiệm của Viện kiểm định quốc gia

Vắc xin và Sinh phẩm y tế (Bộ y tế) là quan trọng nhất trong kết luận về chất

lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đề tài nghiên cứu sản xuất.

Kiểm định cấp I hay kiểm định sản xuất là khâu đầu tiên của kiểm tra chất

lượng toàn diện. Kiểm định cơ sở hay kiểm định cấp II thực hiện đánh giá cơ

bản qua bốn thử nghiệm an toàn, công hiệu là rất quan trọng. Tuy điều kiện cơ

sở sản xuất chưa tốt, chúng tôi vẫn đánh giá cẩn thận theo tiêu chí chất lượng

bốn kiểm định an toàn, công hiệu (Bảng 3.18; 3.19; 3.20; 3.21). Sau khi có

kết quả của kiểm định quốc gia, đối chiếu với kết quả của chúng tôi, thấy

hoàn toàn phù hợp: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu Đạt an toàn

chung, không có chất gây sốt, vô khuẩn; chỉ khác một chút về kết quả đánh

giá công hiệu: hiệu giá do chúng tôi xác định là 285,7 LD50/lọ; Kiểm định

Quốc gia xác định là 267,5 LD50/lọ (thấp hơn 18 LD50/lọ 5 ml so với Kiểm

định cơ sở). Theo Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV, đều

không quy định cụ thể về hiệu giá HTKNR là bao nhiêu, bởi đây là khâu khó

xác định trước, do từng nhà sản xuất đặt mục tiêu. Hướng dẫn của WHO cũng

122

tương tự, không có quy định cụ thể mức đạt về công hiệu (hiệu giá). Theo

Dược điển Châu Âu (Eropean Pharmacopoeia 5.0) hiệu giá phải > 100 LD50

như vậy sản phẩm có hiệu giá gấp đôi yêu cầu [65].

Theo dõi thông tin sản phẩm HTKNR trên thế giới cho thấy: HTKN-RCN

đa giá F(ab’)2 chống nọc hai loại rắn cạp nia Bungarus candidus và Bungarus

multicinctus từ huyết tương ngựa của đề tài là sản phẩm thành công trong

phòng thí nghiệm đầu tiên trên thế giới. Các hội nghị khoa học về HTKNR

trên thế giới, gần nhất là Hội nghị độc chất học Châu Á – Thái Bình Dương

tại Vladivostoc (Nga) tháng 11/2011 và Hội nghị chống độc châu Á lần thứ X

(APAMT) tại Penang, Malaysia (2011) [89], thông tin trên các tạp chí Quốc

tế, chưa có tác giả nào thông báo sản xuất sản phẩm tương tự.

Hiện nay, trong khu vực Đông Nam Á, Thái Lan và Malaysia là hai nước

phát triển nghiên cứu sản xuất HTKNR mạnh nhất. Về sản phẩm HTKN-RCN

cho hai loài Rắn cạp nia bắc, Rắn cạp nia nam, các nước trên có nhiều nghiên

cứu đáng chú ý. Theo Fung S.Y; Ponnudurai G., Tan N.H (2004) [135], những

nhà khoa học hàng đầu của Malaysia về HTKNR - sản phẩm HTKN-RCN đa

giá, trong phòng thí nghiệm (trên thỏ) cho loài rắn cạp nia B. flavicep của

Malaixia có hiệu giá là 42 LD50/ml, 167 LD50/ml, có khả năng phản ứng chéo

trung hòa nọc rắn cạp nia B. candidus, B. multicinctus. Trước đó, Chanhome

L., Wongtongkam N., Khow O. (1999) [51], sản xuất HTKN rắn cạp nong (B.

fasciatus), cũng nhận thấy có nhiều sự tương đồng giữa nọc B. fasciatus với

nọc B. candidus, B. multicinctus. Các tác giả trên đã nghiên cứu sản xuất

HTKNR đa giá chống nọc Rắn hổ mang Thái Lan, Rắn hổ chúa và Rắn cạp

nong; sau đó thí nghiệm thử trung hòa chéo nọc độc B. candidus, B.

multicinctus trên chuột nhưng đã không thành công. Các tác giả Ponnudurai

G., Tan N.H (1990) [134] cho rằng: có nhiều sự tương đồng về kháng nguyên

nọc giữa B. flavicef, B. fasciatus với B. candidus, B. multicinctus (cùng chi

123

Bungarus). Các tác giả này cho rằng có thể dùng HTKNR B. flavicef của

Malaysia, hay B. fasciatus của Thái Lan trung hòa nọc độc B. candidus, B.

multicinctus. Tuy nhiên, điều này rất khó, khi nọc rắn có tính đặc hiệu địa

phương và khi sản xuất HTKNR đa giá, tính đặc hiệu kháng nọc giảm đi so

với HTKNR đơn giá chống một loại nọc rắn, hiệu quả khi điều trị sẽ thấp và

phải dùng số lượng HTKNR nhiều, hậu quả do protein miễn dịch khác loài

cũng cao hơn. Mặt khác, ở Việt Nam, hai loài rắn cạp nia B. fasciatus và B.

flavicef có số lượng không nhiều, nhu cầu ít hơn nhiều so với Thái Lan và

Malaysia. Trong khi đó, rắn cạp nia Việt Nam, Lào và Campuchia có đặc

điểm giống nhau. Chúng ta đang phát triển nghiên cứu về rắn cạp nia tốt hơn

so với hai nước bạn Lào và Campuchia; tương lai khi chúng ta sản xuất được

đại trà HTKN-RCN cho hai loại Bungarus candidus, Bungarus multicinctus

có thể sản xuất phục vụ các nhu cầu lớn hơn (xuất khẩu cho Lào, Campuchia,

phục vụ cơ số chiến đấu cho Quân đội...).

Láng giềng Việt Nam khác là Đài Loan, Trung Quốc hiện nay đã sản

xuất được HTKN-RCN bắc cho mình từ rất sớm. Theo Chippaux J.P, Goiffon

M. (1998) [55], HTKNR bivalent neurotoxic của Đài Loan cho rắn hổ mang

Naja naja atra và Bungarus multicinctus có hiệu giá 1ml serum potency là

100 LD50, như vậy sản phẩm của chúng ta sản xuất có hiệu giá thấp hơn của

Đài Loan, đây là thực tế, chúng ta cần nghiên cứu thêm về phương pháp của

họ để cải thiện hơn về hiệu giá.

Như vậy, sẽ còn phải chờ đợi thời gian khá lâu nữa để có sản phẩm

HTKNR trên thị trường có thể nhập về điều trị, chưa kể giá cả có hợp lý hay

không. Mặt khác, tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý sẽ là

một điều khó khăn cho ý tưởng mua HTKNR của nước khác, trừ việc họ sản

xuất theo đơn đặt hàng của chúng ta. Cũng nên tính đến tính chủ động trong

cung cấp thuốc cho nhu cầu của Việt Nam.

124

Về nhóm các tiêu chuẩn lý hóa: các thử nghiệm này chỉ được yêu cầu làm

khi có một lô HTKNR cần xuất xưởng, ra thị trường hoặc sử dụng trong lâm

sàng. Theo Bảng 3.23, các tiêu chuẩn đều đạt: pH 7.012, NaCl 0,87%; nồng

độ chất bảo quản merthiolat = 0; nồng độ protein = 7,43 g/dl (WHO < 10

g/dl); lượng albumin còn rất ít (1,4g/l), chủ yếu là globulin (48,4 g/l) với

95,6% là mảnh F(ab’)2 cho thấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu đạt

độ tinh sạch cao (Bảng 3.17). Theo khuyến cáo của WHO, nồng độ

merthiolate phải dưới 1/10.000 hoặc không nên sử dụng chất bảo quản này.

Merthiolate là chất bảo quản được sử dụng rộng rãi nhất để bảo quản vắc-xin.

Tuy nhiên, merthiolate có thủy ngân dưới dạng ethyl mercury, thông thường,

mỗi bệnh nhân nhiễm độc nặng sử dụng trên 15 lọ HTKNR, nhưng dùng đến

50 lọ vẫn an toàn. Các nước: Nga, Đan Mạch, Úc, Nhật Bản, Anh và toàn bộ

các nước vùng Scandinavian đều dùng merthiolate là chất bảo quản. Năm

1999, FDA khuyến cáo nên giảm hoặc loại bỏ merthiolate trong vắc-xin.

Trung tâm nghiên cứu và lượng giá chế phẩm sinh học Hoa Kỳ đã gửi thư tới

các cơ sở sản xuất vắc-xin yêu cầu có chương trình tiến tới không có

merthiolate trong vắc-xin và chế phẩm sinh học, đặc biệt cho trẻ sơ sinh và trẻ

em.

Tóm lại: căn cứ kết quả đánh giá chất lượng của Kiểm định cơ sở và của

cơ quan Kiểm định quốc gia, đã khẳng định: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2,

nghiên cứu sản xuất từ huyết tương ngựa, đạt chất lượng tốt: An toàn và Hiệu

lực theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV, 2009 và theo hướng dẫn của

WHO guidelines 2008, đạt mục tiêu nghiên cứu đề ra. Kết quả này đã được sơ

bộ chứng minh bằng thực tiễn lâm sàng (Tham khảo phần Phụ lục 1).

4.2.3. Về giá thành, hiệu quả kinh tế xã hội, qui mô sản xuất:

Hiệu quả kinh tế: tính toán sơ bộ, chưa kể các chi phí công lao động của

nhóm nghiên cứu và chi phí ban đầu về xây dựng labo, mua trang bị,...giá

125

thành là 70 USD/lọ (bảng 3.24), mức giá này cho thấy hiệu quả kinh tế rõ rệt

của nghiên cứu:

Giả định một bệnh nhân nằm viện, cần thở máy khoảng một tháng, chi

phí cho điều trị và thuốc men, khoảng 100 triệu đồng/người. Mỗi năm Trung

tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai có khoảng 30 bệnh nhân RCN bắc cắn,

bệnh nhân phải chi 3 tỷ đồng. Trong khi nhóm nghiên cứu sản xuất ra thuốc

điều trị cần khoảng 200 triệu đồng cho hai lô sản xuất đầu tiên. Nếu chúng ta

bán cho bệnh nhân với giá 70 USD/lọ, mỗi người cần dùng 20 lọ, sẽ chi phí

cho thuốc là 1400 USD, tương đương 30 triệu đồng/BN. Với giả thiết là 30

BN/năm, số tiền thuốc chi điều trị hết 900 triệu đồng. Đã giảm 1/3 chi phí cho

người bệnh.

So với sản phẩm của Mỹ rao bán tại địa chỉ: antibodies-online Inc. 2;

Ravinia Drive, Suite 500. Atlanta, GA 30346. USA, Phone + 1 404 474 4654.

Fax + 1 888 205 9894 (Toll-free). Giá một sản phẩm HTKNR F(ab’)2 chất

lượng tương tự như HTKN-RCN của chúng ta là: 814,67 USD: giá của họ đắt

hơn gấp > 10 lần.

Hiệu quả về mặt xã hội: nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất và

chuẩn hóa HTKN-RCN F(ab’)2 đa giá, hướng đến cứu chữa bệnh nhân tốt hơn

là việc làm thiết thực, cụ thể, thể hiện sự quan tâm của ngành y tế đối với sức

khỏe nhân dân; thể hiện tinh thần tự lực tự cường, tính dân tộc, lòng yêu nước

của các nhà khoa học y tế. Tính mạng con người là vô giá. Sản phẩm tốt, cứu

được bệnh nhân là món quà quý báu mà những người trong ngành y tế chúng

ta đã giành cho đồng bào của mình.

Về quy mô sản xuất: quy mô sản xuất phụ thuộc cung cầu của thị trường,

vì vậy không thể sản xuất lớn nếu thị trường nhỏ. Hiện chưa có thống kê cụ

thể số bệnh nhân bị tai nạn rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) xảy ra hàng

năm, ngoài một vài nghiên cứu cho thấy số bệnh nhân nằm bệnh viện Chợ

126

Rẫy do loài rắn này bị tử vong rất cao, tới trên 80%. Số nạn nhân tử vong tại

tuyến dưới và do không kịp đến bệnh viện thực tế là bao nhiêu, hiện nay chưa

có con số thống kê. Tỷ lệ tử vong trong bệnh viện lên tới trên 80% cho thấy

sự bất lực trong điều trị các bệnh nhân do rắn cạp nia nam cắn. Với vai trò

quan trọng của HTKNR trong điều trị rắn độc cắn đã được WHO khẳng định,

cùng với sự tiến bộ về công nghệ, kỹ thuật hồi sức cấp cứu và sự hiểu biết rõ

hơn về xử trí cấp cứu rắn cắn của người dân, khả năng sẽ đem đến hiệu quả

tốt trong điều trị bệnh nhân RCN nam. Vai trò của HTKN-RCN bắc đã được

khẳng định trong nghiên cứu năm 2006 của Hà Trần Hưng, Nguyễn Thị Dụ và

cộng sự. Với số bệnh nhân vào điều trị không quá trăm người một năm cho

thấy nhu cầu HTKN-RCN không lớn. Tóm lại, rất cần sản xuất HTKN-RCN

vì thực tế rất cần thiết và tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao, không có cách khắc

phục ngoài thở máy và HTKNR đặc hiệu; tuy nhiên, do nhu cầu về HTKN-

RCN của hai loài rắn cạp nia nam và rắn cạp nia bắc không cao. Cũng chỉ nên

sản xuất với qui mô nhỏ và dưới dạng đa giá F(ab’)2 gồm cả hai loài là hợp lý

nhất cả về kỹ thuật và kinh tế.

Về các loại HTKNR nên chú ý: sản xuất HTKNR cần căn cứ nhu cầu

của người bệnh. Ở nhiều quốc gia có công nghệ Dược phẩm và ngành sản

xuất thuốc phát triển, tuy nhu cầu không nhiều nhưng họ vẫn sản xuất cho đủ

chủng loại [147], như Hoa Kỳ, Đài Loan, Úc... Theo nghiên cứu của Wang

J.D., et al (Đài Loan, 2009) [145], thống kê 55 trẻ em bị rắn độc cắn tại Đài

Loan, đã chuẩn bị phương án sẵn sàng sử dụng HTKNR cho bệnh nhân bị rắn

cạp nia bắc Bungarus multicinctus, tuy nhiên, thống kê trong 13 năm, tác giả

không gặp bệnh nhân nào bị rắn cạp nia bắc cắn để sử dụng thuốc (sản phẩm

Bivalent với Naja naja atra). Hoa Kỳ có đến 6000 - 7000 nạn nhân rắn độc

cắn /năm nhưng số tử vong chỉ có 6 - 7 người (do họ có đủ loại HTKNR sẵn

sàng cung cấp cho cấp cứu, điều trị [137]. Việt Nam hiện nay nhu cầu về

127

HTKNR rất lớn. Theo Nguyễn Thiên Tạo (2011) [39], Việt Nam hiện là nơi cư

ngụ của 193 loài rắn thuộc 69 giống, 8 họ. Trong số đó ghi nhận tổng số 53

loài rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ Rắn hổ Elapidae và 18 loài (8

giống) thuộc họ Rắn lục Viperidae. Như vậy, rắn độc chiếm 53/193 loài rắn ở

Việt Nam, ~25%, cao hơn gấp đôi so với số trung bình của thế giới. Hiện nay,

chúng ta mới cung cấp được trên thị trường hai loại: HTKN rắn hổ đất và

HTKN rắn lục tre. Các sản phẩm khác đều mới sản xuất trong phòng thí

nghiệm như HTKN rắn hổ chúa, HTKN rắn cạp nia nam, HTKN rắn hổ

mang; hoặc cung cấp trong phạm vi hẹp, dạng sản phẩm nghiên cứu lâm sàng

đa trung tâm theo Quyết định của Bộ y tế như HTKN rắn choàm quạp, rắn hổ

đất + hổ mang. Như vậy, sản xuất HTKNR (antivenom) ở Việt Nam đang còn

rất nhiều việc phải làm.

Một xu hướng nữa trong sản xuất HTKNR là sản xuất HTKNR dạng đa

giá. Nói chung, với những loài rắn khác nhau về độc tính nọc, nhưng trong

cùng một họ (Elapidae, Viperidae), một chi (Bungarus), khả năng dễ chẩn

đoán nhầm lẫn hoặc ở các vùng giáp ranh, xen kẽ nơi cư trú của các loài rắn

đó, đều có thể sản xuất HTKNR đa giá; có thể dùng cho nhau, khi chưa chẩn

đoán xác định loài nào trong chúng. Thường thường, độc tính của nọc rắn vào

cơ thể, cần được trung hòa càng sớm càng tốt. Chẩn đoán chậm trễ, dùng

HTKNR muộn quá sẽ không có hiệu quả hoặc hiệu quả thấp, hoặc khi đó nọc

đã kịp gây hậu quả xấu, bệnh nhân đã tổn thương hoặc chết trước khi y tế kịp

can thiệp. HTKNR đa giá F(ab’)2 là một giải pháp tốt hiện nay trong giải

quyết vấn đề này.

KẾT LUẬN

1. Đã sản xuất thành công HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 của rắn cạp nia bắc

(Bungarus multicinctus) và rắn cạp nia nam (Bungarus candidus), đạt yêu cầu

128

với 8/8 chỉ tiêu của Tiêu chuẩn Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV, 2009), đạt

9/10 chỉ tiêu của WHO (Guidelines, 2008) về HTKNR dùng cho người.

2. HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 được nghiên cứu sản xuất đã khẳng định tính

“An toàn” và “Hiệu lực” trong phòng thí nghiệm qua Kiểm định chất lượng

cấp cơ sở và Kiểm định Quốc gia.

KIẾN NGHỊ

1. Nghiên cứu trên người tình nguyện khỏe mạnh để xác định tính an toàn.

2. Nghiên cứu hiệu lực trung hòa độc tính nọc của HTKN-RCN đa giá

129

F(ab’)2 với từng loại nọc rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam trên động vật

thực nghiệm với cỡ mẫu lớn.

3. Thử lâm sàng với bệnh nhân tình nguyện bị rắn cạp nia cắn, nhiễm độc

nặng; tiến tới thử lâm sàng đa trung tâm; ứng dụng kết quả nghiên cứu

trên lâm sàng.