1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị
máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; ngoài máu và các chế phẩm
máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết thanh như:
gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D
globulin, antivenom [141],[147],[152]...trong đó, huyết thanh kháng nọc rắn
(antivenom) là loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn
đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae.
Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biển
dài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển.
Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông nghiệp, rừng núi,
hải đảo...nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn
thất nhân mạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy
hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để cứu tính
mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lít
máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174].
Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải
sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên
cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8]. Đến
nay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngàn
bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]...
Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm
trọng nhiều loại HTKNR; hầu như ta chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn
hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc
rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc
gia mình (khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu,
2
điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR;
đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong
các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc
họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây
tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều trị kịp thời) [14].
Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy:
nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu là rắn cạp nia nam
(Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Đây là hai
loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất
khó phân biệt. Hai loài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm
sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụng
chéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15].
Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm
nói trên là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp
nia cắn trong cả nước. Để tăng tính an toàn của chế phẩm, dạng F(ab’)2 là tối
ưu, đồng thời phải áp dụng các giải pháp kỹ thuật và kiểm soát chất lượng
toàn diện để chế phẩm có thể đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về HTKNR dùng cho
người, theo Dược điển Việt Nam [9].
Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng
thí nghiệm” được thực hiện, nhằm các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa,
đạt Tiêu chuẩn Quốc gia.
2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.
3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ ĐIỂM CẦN CHÚ Ý VỀ MÁU VÀ HUYẾT TƯƠNG
1.1.1. Máu:
Máu là mô lỏng màu đỏ lưu thông trong hệ thống tuần hoàn; tạo thành từ
các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu
và phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước....Máu chiếm 1/13
trọng lượng cơ thể (60-70 ml/kg); thể tích ở nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít;
tỷ trọng: 1.055-1.063, pH 7,33-7,43 [31].
Máu động vật có vú cũng gồm HC, BC, TC, huyết tương,.. với chức năng
cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ cơ thể,...tương tự ở người.
1.1.2. Huyết tương:
Là phần dịch lỏng thu được sau ly tâm hoặc để lắng tự nhiên máu đã
chống đông. Thành phần chủ yếu của huyết tương là nước (92%), các protein
hòa tan (albumin, globulin, fibrinogen...), đường, các yếu tố đông máu, các
chất điện giải, vitamin, hormon, carbon dioxide... [31],[167].
Protein huyết tương gồm: globulin miễn dịch, bổ thể, các yếu tố đông
máu, các yếu tố enzyme, các protein liên kết với lipid, các protein vận
chuyển...các thành phần này thay đổi trong bệnh lý.
Điện di protein, điện di miễn dịch sẽ tách được các thành phần protein.
Mỗi protein huyết tương đều có điểm đẳng điện tương ứng với pH.
Tính hòa tan của protein chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và tính tan trong
dung dịch muối.
Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hòa tan cũng thay đổi, tính chất sinh học
có thể mất đi; các yếu tố gây biến tính protein là: nhiệt độ, acid, base, tia cực
tím (làm đứt gãy liên kết peptid), sóng siêu âm (gây oxy hóa) [31],[163].
4
1.2. CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG
1.2.1. Máu toàn phần:
Máu toàn phần là máu lấy từ mạch máu người cho (hoặc động vật cho
máu), bảo quản trong túi (hoặc chai, bình chuyên dụng) có chất chống đông
và bảo quản máu (thông thường là CPDA gồm citrate, phosphat, đường
dextrose, adenin). Mỗi đơn vị máu người cho khỏe mạnh (250 ml) có 30 - 40
gam hemoglobin [31],[170]. Bảo quản máu toàn phần ở nhiệt độ 2 - 6oC, thời
gian bảo quản tối đa 42 ngày với dung dịch CPDA. Máu toàn phần lưu trữ
chứa thành phần chính là hồng cầu, máu mới thu nhận còn có tiểu cầu và một
số yếu tố đông máu; bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ và giải phóng ra các
chất trung gian; ngoài ra máu toàn phần còn chứa các bạch cầu lympho và các
yếu tố huyết tương.
1.2.2. Khối hồng cầu [31],[170]:
Khối hồng cầu là máu toàn phần đã được ly tâm và tách phần huyết tương
ở trên; tuỳ cách sản xuất mà có 5 loại khối hồng cầu sau:
+ Khối hồng cầu đậm đặc: là khối hồng cầu có hematocrit (Hct) khoảng 75%,
gồm có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một ít huyết tương; bảo quản ở nhiệt độ
2 - 6°C; là chế phẩm có tính đậm đặc nên phải truyền chậm.
+ Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: là khối hồng cầu sau khi tách huyết
tương được trả lại dung dịch bảo quản; thành phần gồm có hồng cầu và dung
dịch bảo quản, một ít bạch cầu, lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần;
bảo quản ở nhiệt độ 2 - 6°C, thời gian tối đa 42 ngày.
+ Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: là chế phẩm máu được sản xuất từ máu
toàn phần tách huyết tương và phần buffy coast; thành phần gồm có hồng cầu
và khoảng 10% bạch cầu so với khối hồng cầu thông thường; có ưu điểm làm
5
giảm các phản ứng do bạch cầu, giảm các nguy cơ lây bệnh do tác nhân cư trú
trong bạch cầu.
+ Khối hồng cầu rửa: là máu toàn phần hoặc khối hồng cầu được ly tâm bỏ
hết huyết tương, sau đó thay thế bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9% trộn đều,
ly tâm tiếp để rửa ba lần; thành phần gồm có: hồng cầu + nước muối sinh lý;
bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 6°C dưới 24 giờ, ở nhiệt độ 22°C dưới 6 giờ.
+ Khối hồng cầu lọc bạch cầu và khối hồng cầu chiếu xạ: là khối hồng cầu đã
được dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hoặc cả hai, bảo quản ở 2 - 6°C dưới
hai tuần từ khi chiếu xạ. Nếu dùng màng lọc rời thì sau lọc không để quá 24
giờ. Thành phần chủ yếu là hồng cầu, còn rất ít bạch cầu, bạch cầu bị bất
hoạt.
Như vậy: sau khi tách huyết tương, tùy điều kiện và nhu cầu truyền trả
khối hồng cầu cho ngựa sớm hay muộn để quyết định sử dụng chống đông,
dung dịch nuôi dưỡng hồng cầu và phương pháp bảo quản, vận chuyển trên
đường đến nơi truyền trả khối hồng cầu ngựa. Nếu lấy máu ngựa vào các túi
đôi, túi ba, dung tích 450ml, việc tách huyết tương và truyền trả khối hồng
cầu ngựa sẽ đơn giản hơn lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít).
1.2.3. Khối tiểu cầu:
Tuỳ cách sản xuất, có hai loại khối tiểu cầu sau:
+ Khối tiểu cầu pool: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng cách ly tâm các túi
máu toàn phần, gạn lấy lớp buffy coast rồi ly tâm tách lấy tiểu cầu; thông
thường từ 3 - 4 đơn vị máu toàn phần cùng nhóm ABO có thể sản xuất được
một đơn vị pool tiểu cầu; khối tiểu cầu nếu chưa pool, được bảo quản ở 22°C,
lắc liên tục, thời gian từ 3 - 5 ngày; nếu đã pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 giờ;
số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011.
6
+ Khối tiểu cầu máy: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng máy tách tế bào lấy
tiểu cầu từ một người cho, thành phần có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/đơn vị, có ít
bạch cầu; bảo quản ở 22°C trong máy lắc liên tục, tối đa được 5 ngày.
1.2.4. Huyết tương tươi đông lạnh:
Huyết tương tươi đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần trong
6 giờ kể từ lúc lấy máu, bảo quản đông lạnh; thành phần có albumin, globulin
miễn dịch, các yếu tố đông máu bền vững và yếu tố VIII còn khoảng 70%;
lượng huyết tương tách từ một đơn vị máu (250 ml) thường ≈ 125 - 150 ml.
Thường pool lượng huyết tương tươi của hai đơn vị máu toàn phần cùng
nhóm, dung tích khoảng 250 - 300ml. Bảo quản ở nhiệt độ - 25°C/năm, bảo
quản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170].
Khi sản xuất HTKNR, phải bảo quản huyết tương của nhiều đợt, được
lấy trong nhiều thời điểm khác nhau, bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 25°C để tránh
các biến tính của protein theo thời gian do nhiều yếu tố tác động bất lợi.
1.2.5. Tủa VIII (cryo):
Để huyết tương tươi đông lạnh ở 4°C, huyết tương tan ra có một phần
tủa, ly tâm thu nhận các tủa này đó là tủa lạnh yếu tố VIII (cryo); thành phần:
cryo có khoảng 2 - 3 đơn vị yếu tố VIII /ml và yếu tố V, fibrinogen; trọng
lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn hơn trọng lượng phân tử
IgG (150 kD) [16] và được tách ta trong phương pháp tủa Cohn ở Fraction I,
loại bỏ phần này khi tách γ-globulin vì không cần thiết sử dụng.
1.2.6. Huyết tương tươi đã tách tủa:
Huyết tương tươi đã tách tủa là phần huyết tương tách ra sau khi lấy tủa
ở huyết tương tươi đông lạnh, bảo quản ở - 25°C; thành phần gồm có:
albumin, globulin, một số yếu tố đông máu. Nếu sản xuất HTKNR theo
7
phương pháp Cohn, đây là phần cần thiết giữ lại để sản xuất do có γ -globulin.
Sản phẩm này cần bảo quản như huyết tương tươi đông lạnh: ở nhiệt độ -
25°C / năm, bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170].
1.2.7. Huyết tương đông lạnh:
Huyết tương đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần sau 6 giờ
kể từ khi lấy máu; thành phần gồm các yếu tố huyết tương,...các yếu tố đông
máu không bền vững còn lại ít; bảo quản ở nhiệt độ - 25°C, như huyết tương
tươi đông lạnh. Huyết tương để sản xuất HTKNR được sản xuất, tách chiết
theo dạng chế phẩm này.
1.2.8. Khối bạch cầu hạt:
Là chế phẩm huyết tương tách từ phần buffy-coast và pool của nhiều
người cho máu; thành phần chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu và một số tế
bào lympho và các chất do bạch cầu giải phóng; do sản xuất theo phương
pháp pool từ nhiều người cho nên nguy cơ nhiễm virus rất cao. Bảo quản: ở
nhiệt độ 22°C ≤ 24 giờ. Trong sản xuất HTKNR, chỉ cần tách huyết tương, vì
vậy cần để lại phần bạch cầu và tiểu cầu cùng với khối hồng cầu; cần truyền
lại máu ngựa sớm để ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục.
1.2.9. Albumin:
Albumin là protein hình cầu, tính hòa tan cao, trọng lượng phân tử
66.500 Da, chiếm nhiều nhất trong huyết thanh; chức năng chính là duy trì 70
– 80% áp lực keo trong huyết tương và liên kết vận chuyển các chất có phân
tử nhỏ như bilirubin, hormon, steroid, acid béo, các phân tử thuốc.
Dung dịch albumin được điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 -
20% protein toàn phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa
5% protein [163]; do trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩm
này theo phương pháp tủa Cohn sẽ thu được albumin ở Fraction V, phần tủa
8
Cohn cuối cùng; khi sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ; theo
tiêu chuẩn tinh sạch protein của dược điển Việt Nam III-2002, albumin chỉ
được phép còn dạng vết, phát hiện được bằng điện di miễn dịch [7].
1.2.10. Gamma globulin:
Hình 1.1. Các thành phần protein khi điện di protein huyết thanh [176].
Gamma globulin (-globulin) là các lớp globulin xác định được khi điện
di protein huyết thanh; với 5 lớp -globulin là IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; trong
đó chiếm tỷ lệ nhiều nhất là IgG, sau đó là IgM; IgD, IgA, IgE chiếm rất ít.
Năm 1940, -globulin đã được tách chiết lần đầu tiên trên thế giới.
Không lâu sau đó, globulin miễn dịch tiêm bắp (IGIM) được đưa vào sử dụng,
tạo miễn dịch thụ động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô -
globulin huyết (1950). Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IGIV) được
sản xuất và đưa vào sử dụng năm 1970, ít đau, tác dụng nhanh hơn IGIM.
Năm 1981, Gamimune do Mile phân lập, là IGIV đầu tiên được đăng
ký ở Mỹ. Sandoglobulin của hãng Sandoz có ở thị trường năm 1984.
Gamimune được chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986; sản phẩm này
được đổi tên thành Gamimuner N. Sau đó, một số IGIV khác được đăng ký ở
Mỹ như: Gammagard do Hyland, Polygam bởi hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam
9
bởi Immuno, Venoglobulin - I bởi Alpha Therapeutic, Gammar-IV bởi Armor
và GammaRaas của tập đoàn RAAS (Mỹ) [167].
Năm 1991, IGIV sản phẩm dạng bột hoà tan lần đầu tiên được chấp
nhận (Venoglobulin-S). Năm 1994, sau một vụ dịch viêm gan C liên quan đến
Gammagard, sản phẩm điều chế dạng bột không hoà tan Gammagard và
Polygam bị đình chỉ.
Năm 1980, bệnh nhân dùng IGIV điều trị giảm -globulin huyết, xuất
huyết giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy đa số gây tăng số lượng tiểu cầu. Tiếp
theo phát hiện ngẫu nhiên này, việc sử dụng IGIV cho ITP được nghiên cứu
và hiện nay nó chính thức được dùng cho chỉ định này. Kể từ khi IGIV có
hiệu quả đối với ITP, chúng tiếp tục được đánh giá trong điều trị những bệnh
khác với giả định cơ chế tự miễn. Hầu hết sử dụng IGIV đối với bệnh tự miễn
đều có hiệu quả; ví dụ bệnh Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷ
myelin viêm mạn tính, hội chứng Guillain-Barre...
Các chỉ định -globulin được thừa nhận hiện nay gồm: suy giảm miễn
dịch tiên phát, xuất huyết do giảm tiểu cầu tự phát, bệnh Kawasaki, ngăn
ngừa nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực hiện ghép tuỷ xương.
Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IGIV) là chế phẩm có trên 95% IgG từ
huyết tương người hiến máu được tinh chế. IGIM chứa 15 - 18% protein,
trong đó IgG chiếm trên 90%. IGIM là dung dịch trong suốt hoặc hơi đục, có
thể có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt. Cả hai loại đều là dung dịch vô khuẩn,
không chứa chất gây sốt, gồm các -globulin chứa nhiều loại kháng thể có
mặt trong máu người bình thường.
Sau khi tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết thanh đạt đỉnh trong hai
ngày, được phân bổ nhanh và ngang nhau giữa các khu vực trong và ngoài
mạch máu. Ở những người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian bán hủy
của IgG khoảng 23 ngày. Khi liều tiêm IGIM lớn hơn 10 ml thì phải chia ra
10
thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhau nhằm làm
giảm đau tại chỗ và bớt khó chịu. Tổng liều một lần tiêm bắp thịt không được
vượt quá 20 ml - ngay cả đối với người lớn. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 8oC và
không được để đông băng. Thời hạn dùng của IGIM không được quá 3 năm
kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) của nhà sản xuất [31],[123].
Bảng 1.1. Các thành phần của protein huyết tương [31],[167],[176]
Globulins
α-globulins
α1-antitrypsin, α2-antiplasmin, antithrombin α1- transcortin, α2-ceruloplasmin, retinol binding protein, orosomucoid, α2-macroglobulin, haptoglobin
β-globulinshormone, binding globulin, transferrin angiostatin, hemopexin, β-2 microglobulin, factor H, plasminogen, properdin
-globulin Immunoglobulins (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE)
Loại khác Fibronectin, macroglobulin/microglobulin, Transcobalamin
Albumins
Lòng trắng trứng
Conalbumin, ovalbumin, avidin
Serum albumin Human serum albumin, bovine serum albumin, prealbumin
Loại khác C-reactive protein, α-lactalbumin, parvalbumin, ricin
1.2.11. Kháng huyết thanh:
Kháng huyết thanh (KHT) là sinh phẩm chứa -globulin miễn dịch có
khả năng trung hòa kháng nguyên đặc hiệu, thu được từ huyết tương động vật
hoặc huyết tương người đã được mẫn cảm với kháng nguyên trước đó, được
tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết theo quy định và loại bỏ các
protein không cần thiết [7],[9]. Một số KHT đã được nghiên cứu, sử dụng
trong chuyên ngành Huyết học và Truyền máu:
11
- Anti-HBs globulin: dùng cho con của những bà mẹ có HBV (+), sản xuất từ
huyết tương người cho máu giàu anti-HBs globulin [30],[41],[173].
- Anti-T lymphocyte globulin: điều trị suy tủy xương, điều trị bệnh tự miễn
(sản xuất từ huyết tương thỏ gây miễn dịch) [75],[86],[97],[109].
- Anti-hairy cell serum: điều trị leucemie tế bào tóc (sản xuất từ huyết tương
thỏ gây mẫn cảm) [132].
- Anti-D globulin: điều trị huyết tán do bất đồng nhóm máu mẹ con hệ Rh,
dùng cho người mẹ Rh (-) sau khi sinh con Rh (+) [57],[74],[138],[139] và
điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) [119].
- Anti-γG globulin: điều trị đái huyết sắc tố kịch phát lạnh PNH (Paroxysmal
nocturnal hemoglobinuria) [99].
- Anti-neutrophil serum (ANS): gây giảm bạch cầu đoạn trung tính (sản xuất
từ huyết tương thỏ) [127].
- Anti-thymocyte globulin: sản xuất từ huyết thanh thỏ [111].
- Antivenom (SAV): điều trị các rối loạn đông máu, DIC, tan máu,... do rắn
độc họ Viperidae cắn [33] (sản xuất từ huyết tương ngựa, dê, bò, cừu,...).
- Antiglobulin người sử dụng trong chẩn đoán (Coombs test), sản xuất từ
huyết tương thỏ, ngựa...[22].
Hiện nay lượng KHT rất thiếu hụt ở các nước nghèo do các nhà sản xuất
chỉ sản xuất KHT từ huyết tương người hoặc từ động vật tinh chế hai
bước,...giá thành tăng lên gấp nhiều lần, kèm theo là nguy cơ phải đóng cửa
các trang trại nuôi ngựa sản xuất KHT vì không đem lại lợi nhuận, do giá đắt,
do thị trường eo hẹp, do những đạo luật bảo vệ động vật không cho lấy máu,...
đã khiến việc sản xuất KHT càng trở lên kém hấp dẫn; kết quả là sự khan
hiếm về số lượng và chủng loại trên thị trường, hậu quả tất cả đổ lên người
bệnh. Để duy trì sản xuất KHT phục vụ đa số như hiện nay, chính phủ một số
nước miễn thuế cho sản xuất KHT [77], tăng cường hỗ trợ sản xuất KHT
miễn phí cho người nghèo (Thái Lan) [96],[104],[119],[160],[148], tăng
12
cường hỗ trợ ngân sách từ các tổ chức quốc tế, các tổ chức từ thiện để duy trì
số lượng, chất lượng các sản phẩm [153],[67],[63],[68],[149].
1.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG:
1.3.1. Phương pháp tủa lạnh bằng Ethanol:
+ Phương pháp tủa Cohn:
Là phương pháp tách các thành phần máu và huyết tương bằng thay đổi
nồng độ ethanol, pH, nhiệt độ, lực ion...quy trình này còn được gọi là: quy
trình tách "tủa protein" đã biết ra khỏi các protein chưa biết trong huyết
tương; được phát minh lần đầu tiên bởi Edwin Joseph Cohn (1892-1953),
người Mỹ [169]; phát minh lúc đó đã góp phần cứu sống hàng vạn người
trong Chiến tranh thế giới thứ II; đến nay vẫn là phương pháp cơ bản trong
tách chiết các chế phẩm máu và huyết tương tại các Trung tâm Huyết học -
Truyền máu trên thế giới [31].
Phân đoạn huyết tương theo phương pháp Cohn thu được albumin
huyết thanh, -globulin, fibrinogen, thrombin và một số yếu tố đông máu.
Fibrinogen và các phần phân đoạn của thrombin được nghiên cứu sâu hơn,
chế tạo thành các sản phẩm fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin.
Các -globulin tìm thấy trong Fraction Cohn II, III được chứng minh có
tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh sởi, bệnh bại liệt, điều chỉnh và ngăn ngừa
bệnh viêm gan truyền nhiễm cho những người lính trong chiến tranh thế giới
thứ hai. Fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin đã được sử dụng điều trị
nạn nhân bỏng, trong đó có một số nạn nhân từ cuộc tấn công tại Trân Châu
Cảng, giúp tỷ lệ ghép da thành công tăng cao. Fibrinogen keo lỏng rất hữu ích
trong kết nối dây thần kinh bị cắt đứt. Fibrin bọt và thrombin được sử dụng để
kiểm soát chảy máu, đặc biệt là trong tổn thương gan và khối u, giảm thiểu
chảy máu từ tĩnh mạch lớn cũng như đối phó với dị tật mạch máu trong não.
13
Màng fibrin được sử dụng để cầm máu trong các ứng dụng phẫu thuật khác
nhau, bao gồm cả phẫu thuật thần kinh, tuy nhiên, không hữu ích trong việc
kiểm soát chảy máu động mạch.
Sau này Martin MacPhee (Hội chữ thập đỏ Mỹ) trong đầu những năm
90, đã thử nghiệm thành công sản phẩm "Băng keo fibrin” trong quân y Mỹ;
đây là loại fibrinogen có khả năng ngăn chặn xuất huyết động mạch.
+ Phương pháp Cohn cải tiến [31]:
Để sản xuất một lượng lớn albumin, -globulin miễn dịch; nhiều nơi sử
dụng phương pháp Cohn có bổ xung điều kiện pH, nhiệt độ, lực ion, nồng độ
ethanol của môi trường tủa cho phù hợp với từng thành phần của huyết tương,
như: các cải tiến của tác giả Gerlough (1955), Hink (1957), Van Aken (1996),
Mulford , Kistler và Nitschmann, William N. Drohan....
- Phương pháp Van Aken (1996):
Fraction I (F1): sử dụng ethanol 8%, pH 7,2, - 3oC, lực ion 0,14.
Thu được F-VIII, Von - Willebrand, fibrinogen (5,1% protein).
Fraction II (F2): xử lý nước mặt bước 1, ethanol 25%,- 5oC, pH 6,9.
Thu được F-II, V, VII, IX, X và IgG, IgA, ít IgM (3% protein)
Fraction III (F3): xử lý nước mặt bước 2 bằng ethanol 18%, pH 5,2.
Thu được AT-III, bổ thể, IgM, protease inhibitor.
Fraction IV (F4): xử lý nước mặt bước 3 (IV- 1) bằng ethanol 40%, pH 5,8.
Thu được tủa IV- 2 có haptoglobin transferrin, -globulin.
Fraction V (F5): xử lý nước mặt bước 4 (IV- 2) bằng ethanol 40%, pH 5,8.
Thu được tủa V chứa albumin và -globulin (1% protein).
Nước mặt V được tủa ethanol 40%, - 3oC, pH 5,2 thu được albumin sạch.
Quy trình này cho 5 sản phẩm (Fraction I, II + III, IV- 1; IV- 2, V) trong
đó, mỗi bước lại chiết tách các sản phẩm tinh khiết hơn.
Như vậy, Gamma globulin miễn dịch có mặt trong F-II.
14
Sản phẩm này có thể sử dụng với dung dịch lỏng tiêm bắp cơ IGIM; để
đảm bảo an toàn và hiệu quả cao, cần sản xuất dạng tiêm tĩnh mạch IGIV. Có
nhiều phương pháp sản xuất IGIV, nhưng phương pháp sử dụng F-II Cohn
loại bỏ Fc của IgG được nhiều nước sử dụng có kết quả. Có thể tóm tắt
phương pháp này như sau: F-II thu được bằng phương pháp Cohn cho tác
dụng với pepsin ở pH 5; sản phẩm thu được đem thẩm tích loại bỏ Fc và
pepsin, cho sản phẩm an toàn hơn, giảm phản ứng phụ, có thể tiêm tĩnh mạch.
- Phương pháp Gerlough (1955): sử dụng ethanol 20% thay vì 40%
trong Fraction II và III, làm giảm tiêu thụ ethanol; ngoài ra, tác giả kết hợp
hai Fraction IV vào một bước, giảm số fraction yêu cầu.
- Phương pháp Hink (1957): phương pháp này năng suất cao hơn do tái sử
dụng một số các protein huyết tương bị loại bỏ trong các Fraction IV.
- Phương pháp kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol của William N. Drohan:
Phương pháp này kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol, tách được ba thành phần
huyết tương có giá trị: tủa lạnh yếu tố VIII, fibrinogen, yếu tố Von-
Willebrand; IgG (F-II); albumin. Phương pháp này được Mỹ, Đức, Pháp, Italy
và nhiều nước đang phát triển sử dụng có hiệu quả, trang bị đơn giản, các sản
phẩm đạt độ tinh khiết tốt, nhất là albumin đạt trên 85%, giảm được dịch tủa
ethanol.
- Phương pháp Mulford: sử dụng Fraction II và III là bước cuối trước khi
xử lý nhiệt, kết hợp Fraction IV và V (hạn chế là albumin không tinh khiết).
- Phương pháp Kistler và Nitschmann: cung cấp albumin tinh khiết hơn,
tương tự như phương pháp Gerlough, Fraction II, III thực hiện ở nồng độ
ethanol thấp hơn 19%, pH 5,8. Fraction IV được kết tủa ở điều kiện ethanol
40%, pH 5.8 và nhiệt độ - 8oC; albumin, bị thu hồi trong Fraction V, được
tinh chế bằng cách chiết xuất ở ethanol 10%, pH 4,6 và nhiệt độ - 3oC.
15
Sau phát minh của Cohn, việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm máu,
chế phẩm huyết tương và truyền máu từng phần đã phát triển nhanh ở các
nước tiên tiến. Tới nay, một số nước đã tách được trên 20 sản phẩm, tập trung
vào các nhóm sản phẩm có hiệu quả cao trong điều trị như albumin, globulin
miễn dịch, các yếu tố đông máu.
1.3.2. Phương pháp tủa bằng muối:
Phương pháp này dùng trong tinh chế IgG, mảnh kháng thể Fab, F(ab’)2.
Để thu được một thành phần protein, cần phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh
phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein các dung môi hoặc các
hoá chất có ái lực với nước mạnh hơn để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein
đó, giúp cho protein kết tủa. Thường sử dụng dung môi (acetone, ethanol)
hoặc muối trung tính để kết tủa protein. Sự kết tủa có tính chọn lọc: các
protein khác nhau kết tủa ở nồng độ dung môi và muối khác nhau.
Để kết tủa protein huyết tương, thường dùng nhất là ammonium
sulphate (NH4)2SO4, do muối này có mức độ hoà tan rất cao trong nước, ít
làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme; ưu
điểm nữa là khả năng kết tủa chọn lọc protein, loại bỏ được nhiều protein
không mong muốn trong huyết tương. Lưu ý, khi sử dụng, phải bổ sung vào
huyết tương một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá
nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm
chí có thể làm biến tính một số protein kém bền. Hạn chế của phương pháp là
mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulphate cao, tỷ trọng của dung
môi lớn, để kết tủa được các protein, phải ly tâm tốc độ cao và nhiệt độ thấp,
sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo.
Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường dùng biện
pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng
cách lọc qua gel sephadex.
16
Muối (NH4)2SO4 rẻ và phổ biến, độ hòa tan lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở
25oC); thường được sử dụng ở dạng bột rắn, cho vào huyết tương tới nồng độ
bão hoà 40-50%, ủ ở nhiệt độ, pH nhất định, trong thời gian thích hợp tùy loại
huyết tương của người hay động vật để đạt kết quả cao nhất. Thu IgG qua ly
tâm hoặc lọc thu tủa, hòa lại kết tủa bằng một lượng đệm tối thiểu; thẩm tích
đối với đệm trước khi dùng.
Để loại bỏ những thành phần protein không cần thiết, có thể gây biến
tính chọn lọc bằng nhiệt độ, pH. Phương pháp này thích hợp với protein chịu
acid và bền nhiệt: đưa nhiệt độ của dung dịch protein lên 50 - 70oC và pH ≤ 5;
những protein không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính, được
loại bỏ bằng ly tâm hoặc lọc.
Khi thu hoạch các mảnh kháng thể F(ab), F(ab’)2, phải cắt Fc bằng các
enzyme pepsin hoặc papain. Đây là các protease thủy phân protein, xúc tác
cho quá trình thủy phân liên kết peptid của phân tử protein. Nhiệt độ có tác
dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme đến tốc độ cực đại chừng nào
enzyme chưa bị biến tính; khi nhiệt độ tăng đến 60 - 70oC, enzyme mất hẳn
hoạt tính. Các bước tinh sạch protein thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp
dưới 40oC, để hạn chế sự biến tính enzyme. Để loại bỏ các protein tạp và các
tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường kết hợp nhiều biện pháp khác
nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của
môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các
dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi
ion), điện di, phương pháp lọc gel.
1.3.3. Phương pháp sắc ký (chromatography):
Dựa trên nguyên lý trao đổi ion dùng DEAE (Diethyl amino ethyl), CM
(Carboxyl methyl), hoặc lọc qua gel sử dụng Sephacryl S - 200,...bằng
phương pháp này, độ tinh khiết của sản phẩm đạt 99%. Tuy nhiên giá rất cao,
17
sử dụng một khối lượng lớn dung dịch đệm (buffer), trong khi so với phương
pháp Cohn chất lượng cũng không tốt hơn là bao. Mất mát trong quá trình sắc
ký nhiều hơn, hiệu suất thấp, làm số lượng lớn sẽ khó khăn, cho nên nhiều
nước kết hợp các phương pháp tủa lạnh ethanol với sắc ký. Theo phương
pháp này, sau ly tâm huyết tương tươi đông lạnh có ba nhóm nguyên liệu cần
tinh khiết và chiết tách bằng phương pháp sắc ký.
+ Nhóm 1 (tủa lạnh sau ly tâm): nếu sắc ký ta thu được bốn thành phần: F-
VIII, fibrinnogen, F.Von Willebrand, fibronectin.
+ Nhóm 2 (nước mặt sau ly tâm): Nếu sắc ký sẽ thu được sáu thành phần: F-
VII, IX, XI, AT III, pascal, protease inhibitor, IgG.
+ Nhóm 3: nhóm này có hàm lượng lớn nhất được tủa bằng ethanol 40%, pH
5,8 nhiệt độ 5oC sẽ thu được albumin và -globulin, có thể tủa thêm lần hai,
với ethanol 40%, pH 4,8. Phương pháp sắc ký tuy thu được các sản phẩm khá
tinh khiết, nhưng mất mát qua các bước của quy trình cũng khá nhiều.
1.3.4. Phương pháp miễn dịch hấp thụ:
Sử dụng kháng thể đơn dòng, đặc hiệu kéo các sản phẩm cần thu hoạch
ra khỏi hỗn hợp chung. Tuy nhiên chi phí cho phương pháp này quá cao nên
chỉ dùng trong phòng thí nghiệm.
1.3.5. Phương pháp lọc qua màng ma trận với các vật rắn:
Gần tương tự như phương pháp sắc ký trao đổi ion. Phương pháp này
sản xuất được lượng nhưng giá trị lọc không cao, nên vấn đề chất lượng, giá
thành đầu ra là một vấn đề cần bàn tới.
Tóm lại: sản xuất - globulin miễn dịch đặc hiệu chống nọc rắn từ
huyết tương người không khó đối với các cơ sở sản xuất chế phẩm máu của
ngành Huyết học - Truyền máu, vấn đề là người cho huyết tương chứa KT
18
chống nọc rắn không đủ số lượng máu để cung cấp cho sản xuất với số
lượng lớn, hiệu giá KT thấp và nhiều phiền phức khác. Vậy nên, chỉ có thể
tạo nguồn huyết tương từ ngựa theo phương pháp miễn dịch chủ động.
1.4. HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN:
1.4.1. Khái niệm:
HTKNR là sinh phẩm chứa các γ-globulin miễn dịch kháng nọc rắn có
khả năng trung hòa đặc hiệu nọc rắn tương ứng, thu được từ động vật hoặc từ
người đã được miễn dịch, được tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết
theo quy định và để loại bỏ các protein không cần thiết [7],[9].
Thuật ngữ “antivenin” xuất phát từ tiếng Pháp “venin”, nghĩa là nọc, từ
gốc chữ Latinh “venenum”, nghĩa là chất độc “poison”. Năm 1895, thuật ngữ
antivenin bắt đầu được sử dụng, đến nay đã phổ biến khắp toàn cầu. Từ 2003,
thuật ngữ “antivenin” tiếng Pháp đã được WHO chuyển thành tiếng Anh:
“antivenom”, cả hai danh pháp đều được công nhận và sử dụng như nhau.
1.4.2. Lịch sử phát minh:
Năm 1894, Calmette, Phisalix và Bertrand báo cáo tại hội nghị khoa
học tại Paris về kết quả xác định đặc tính kháng nọc rắn hổ của huyết thanh
thỏ. Năm 1895, Albert Calmette và Le’Pinay đã chế tạo thành công HTKNR
rắn hổ đất Việt Nam từ huyết tương ngựa và sử dụng HTKNR chế tạo điều trị
cứu sống nạn nhân, lần đầu tiên trên thế giới, HTKNR được sử dụng hiệu quả
trên người (Barbara J. Hawgood, 1999)[43]. Việc gây miễn dịch cho động
vật, lấy huyết thanh trị bệnh cứu người - kiểu miễn dịch thụ động (passive
immunity), do Emil Adolf Von Behring và Shibasaburo Kitasato phát minh
năm 1890 đã được A. Calmette ứng dụng trong thực tiễn, sản xuất thành công
HTKNR [64]. Nghiên cứu, chế tạo thành công HTKNR đã mở ra một thời kỳ
19
mới trong điều trị tai nạn rắn độc trên trái đất. Từ đó, các nghiên cứu về
HTKNR ngày càng phát triển, ứng dụng điều trị ngày càng hiệu quả, an toàn.
HTKNR có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược hầu hết các triệu chứng nhiễm độc
nọc rắn và đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu tử vong và tàn
phế (Chippaux J.P., Goiffon M., 1992 [54], Isbister G.K., 2010) [79]. Hàng
nhiều thập kỷ trôi qua, qua tác dụng thực tiễn của HTKNR, WHO đã khẳng
định: “HTKNR là thuốc đặc trị rắn độc cắn duy nhất phổ biến khắp toàn cầu,
giải quyết một trong những vấn đề y tế còn tồn tại của thế giới”[6].
1.4.3. Cơ sở miễn dịch học:
1.4.3.1. Kháng nguyên nọc rắn:
Các độc tố nọc rắn sau khi đã được khử độc tính, bảo đảm an toàn cho
động vật gây mẫn cảm mà vẫn giữ được tính sinh miễn dịch, tính kháng
nguyên gọi là KN nọc rắn. Nọc rắn trở thành kháng nguyên do có đủ các đặc
điểm của chất sinh miễn dịch đó là tính lạ, kích thước phân tử đủ lớn, có
thành phần và tính không thuần nhất về phương diện hoá học, có khả năng
giáng hoá. Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể thì mức độ sinh miễn dịch
phụ thuộc vào mức độ lạ. Khác biệt về di truyền càng lớn, khác biệt về kháng
nguyên giữa hai cơ thể càng nhiều. Do đó, các độc tố nọc rắn có đặc điểm thứ
nhất là hoàn toàn “lạ” với cơ thể động vật gây mẫn cảm. Các kháng nguyên
có tính sinh miễn dịch tốt thường có trọng lượng phân tử trên 100 kDa.
Những phân tử có trọng lượng phân tử thấp từ 0,5-10 kDa, có tính sinh miễn
dịch yếu. Một số trường hợp có trọng lượng phân tử < 1 kDa có tính sinh
miễn dịch rất yếu [16],[34]. Độc tố nọc rắn họ Elapidae chủ yếu là dạng
neurotoxins, là các polypeptide có kích thước nhỏ, lan truyền, hấp thụ trong
cơ thể nạn nhân rất nhanh, nhưng khi chế tạo kháng nguyên lại khó khăn do
có tính sinh miễn dịch yếu. Các phân tử không hoà tan có tính sinh miễn dịch
lớn hơn các phân tử nhỏ và hoà tan do dễ bị đại thực bào nuốt và xử lý. Vì
20
vậy, có thể gây ngưng tập các toxins dạng polypeptid trọng lượng phân tử nhỏ
bằng nhiệt, làm tăng tính không hoà tan của các đại phân tử, tạo thuận lợi cho
đại thực bào nuốt chúng và làm tăng tính sinh miễn dịch.
Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên mạnh hay yếu còn phụ thuộc tính
chất của hệ thống sinh học mà nó xâm nhập, kiểu hình di truyền của túc chủ
và cách gây mẫn cảm (liều lượng, đường vào của kháng nguyên, sử dụng các
tá chất miễn dịch hay không) [16],[19],[28]. Cấu trúc di truyền của túc chủ
ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh miễn dịch cũng như cường độ của đáp ứng.
Việc sử dụng động vật gây mẫn cảm cho hiệu quả cao cần phải lựa chọn.
Ngay cả chế độ ăn cũng cần phải đảm bảo, giúp cho sinh kháng thể tốt nhất.
Ngoài ra, bất kỳ kháng nguyên nào cũng cần sự kết hợp giữa liều lượng tối
ưu, đường vào của kháng nguyên và qui trình gây mẫn cảm, nhằm đạt đáp
ứng miễn dịch với cường độ cao nhất. Liều kháng nguyên quá thấp và liều
quá lớn kháng nguyên cũng không kích thích được đáp ứng miễn dịch vì
chúng làm cho các tế bào lympho rơi vào trạng thái không đáp ứng. Đưa
kháng nguyên vào cơ thể một lần, chỉ kích thích sinh miễn dịch với cường độ
thấp. Nếu kháng nguyên vào cơ thể lặp lại nhiều lần trong vòng thời gian vài
tuần sẽ gây đáp ứng miễn dịch với cường độ cao [16],[25].
Tá dược (adjuvant): là những chất khi được trộn với kháng nguyên, tiêm
gây mẫn cảm sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên. Sử dụng tá
dược làm tăng đáp ứng miễn dịch khi kháng nguyên có tính sinh miễn dịch
thấp hoặc khi chỉ có được một lượng nhỏ kháng nguyên. Tá dược kéo dài sự
tồn tại của kháng nguyên trong cơ thể túc chủ gây mẫn cảm. Khi tiêm kháng
nguyên + tá dược, kháng nguyên được giải phóng chậm hơn từ nơi tiêm vào
cơ thể túc chủ, thời gian tiếp xúc với kháng nguyên sẽ tăng lên [1],[2],[16].
Sự tăng kích thước của tá chất + kháng nguyên làm tăng hiệu quả đáp ứng
miễn dịch vì các đại phân tử dễ được đại thực bào nuốt hơn. Tá dược Freund
21
là một tá dược hay được sử dụng. Tá dược Freund hoàn toàn (Freund’s
complete adjuvant) có thêm Mycobarterium chết, hoà trong nhũ tương dầu, có
hiệu lực cao hơn tá dược Freund không hoàn toàn (Freund’s incomplete
adjuvant). Các dipeptide của Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào, làm
tăng hoạt động thực bào, tăng biểu lộ các phân tử MHC lớp II trên màng tế
bào, đồng thời tăng tiết các cytokine như IL-1, cytokine do đại thực bào tiết
ra, là đồng kích thích tố hoạt hoá các tế bào lympho TH. Cả hoạt động trình
diện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào lympho TH đều tăng
lên khi có tá chất. Một số tá dược kích thích phản ứng viêm tại chỗ và mạn
tính, thu hút các tế bào làm nhiệm vụ thực bào và lympho đến nơi có kháng
nguyên. Sự thâm nhiễm các tế bào này tại nơi tiêm tá chất dẫn đến hình thành
các u hạt. Đại thực bào tại u hạt là đại thực bào hoạt hoá, làm tăng hoạt hoá
lympho TH. Tùy từng trường hợp, khi gây mẫn cảm cho túc chủ, kháng
nguyên nọc rắn được phối hợp với các tá dược khác nhau, theo nhiều phương
pháp khác nhau, theo từng tác giả,... miễn sao hiệu quả nhất [16],[25].
1.4.3.2. Kháng thể chống nọc rắn:
Bản chất kháng thể chống nọc rắn là gamma globulin miễn dịch IgG,
đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, lưu hành trong máu và bạch huyết, hoạt
động đáp ứng miễn dịch bằng cách trung hoà, loại bỏ các kháng nguyên nọc,
được tạo ra sau khi gây mẫn cảm cho động vật với kháng nguyên nọc rắn
tương ứng, đặc hiệu.
Kháng thể chống nọc rắn nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một
kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên. Trong phản ứng chống
độc tố nọc rắn (toxins), kháng thể chống nọc rắn gắn với độc tố, trung hòa,
làm giảm mất độc tính của độc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các độc tố trên
lên các thụ thể tế bào, giúp các tế bào của cơ thể tránh được các rối loạn do
các độc tố đó gây ra. Một cơ chế khác là hoạt hóa bổ thể. Khi hệ thống bổ thể
22
được hoạt hóa bởi kháng thể chống nọc rắn IgG, hiện tượng thực bào, thanh
lọc phức hợp miễn dịch và phóng thích các phân tử hóa hướng động được
diễn ra. Sau khi gắn vào kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có
thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc). Các tế bào NK có
thể thực hiện chức năng độc tế bào và ly giải các độc tố bị opsonine hóa bởi
các kháng thể. Tiếp xúc lặp đi lặp lại với cùng một kháng nguyên, sẽ dẫn đến
việc tạo ra kháng thể có ái lực cao hơn với kháng nguyên (thuần thục ái lực),
tạo ra các kháng thể có khả năng bám và trung hoà độc tố hiệu quả hơn [16],
[25]. Khi lượng IgG được tạo ra đã đạt số lượng cần thiết, các tế bào
lymphocyte B sử dụng một cơ chế đặc biệt gọi là phản hồi kháng thể
(antibody feedback), dập tắt các đáp ứng miễn dịch dịch thể. Tế bào plasma
chế tiết kháng thể sẽ di chuyển đến tuỷ xương, tại đây chúng tiếp tục sản sinh
ra các kháng thể ngay cả khi kháng nguyên đã được loại bỏ. Các tế bào
lymphocyte B mang trí nhớ miễn dịch không chế tiết kháng thể nhưng lưu
hành trong máu, tồn tại hàng tháng hoặc hàng năm, khi kháng nguyên tái xuất
hiện thì chúng sẽ nhanh chóng đáp ứng. Kháng thể chống nọc rắn cạp nia đa
giá là tập hợp nhiều kháng thể đặc hiệu chống rất nhiều thành phần độc tố
khác nhau; hiện nay không thể sản xuất HTKNR theo dạng sản xuất kháng
thể đơn dòng (Jose’ Maria Gutierrez, Guillermo Leon, 2003) [82],[125],[32].
1.4.4. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR:
1.4.4.1. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn:
Mục đích nhằm khử độc tính nọc, đảm bảo an toàn cho ngựa gây mẫn
cảm, kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh. Để chế tạo được kháng
nguyên, phải có nọc rắn chuẩn, chất lượng tốt, đại diện cho quần thể rắn độc
cần sản xuất HTKNR. Phải tuyển chọn chính xác, nhận diện đúng, phân loại
đúng loài rắn cần nghiên cứu. Tuyển chọn rắn không đại diện, HTKNR sẽ
23
không có tác dụng. Nọc để tạo HTKNR phụ thuộc theo mùa, vùng địa lý, đặc
tính di truyền từng loài rắn. Một số cơ sở sản xuất HTKNR dùng nọc rắn thu
được từ các quốc gia khác nhau để sản xuất HTKNR, kết quả không cao. Thí
dụ, Viện Nghiên cứu y học Nam Phi dùng nọc rắn Đông Phi chế tạo HTKNR
cho Tây Phi, kết quả hiệu lực kháng nọc rất hạn chế (Daltry J.C, Wuster W.,
Thorpe R.S, 1996) [20],[60]. Tuyển chọn rắn khỏe, tiến hành nuôi dưỡng cẩn
thận, giúp cho việc lấy nọc nhiều lần. Nọc rắn thu được phải sạch, không lẫn
máu, làm khô tự nhiên sau đó đông khô và bảo quản ở - 20oC. Chế tạo kháng
nguyên có nhiều phương pháp, hiện nay nhiều cơ sở thường dùng phương
pháp của Theakston RDG, sử dụng glutaraldehyde để bất hoạt độc tính nọc.
Khử độc bằng chiếu xạ hoặc nhiệt độ... có thể gây hủy hoại hoàn toàn những
kháng nguyên quan trọng, thậm chí phá vỡ cả cấu trúc protein nọc, tạo ra
những kháng thể không cần thiết, làm ra các HTKNR hiệu lực thấp.
Sau khi chế tạo được kháng nguyên, phải kiểm tra tính an toàn cho động
vật trước khi sử dụng)[13]: kiểm tra tính an toàn trên chuột lang (Safety test),
kiểm tra chí nhiệt tố trên thỏ (Pyrogen test), cấy khuẩn để xác định kháng
nguyên vô khuẩn (Sterility test). Để đánh giá được tính sinh miễn dịch,
thường phải sau hai, ba lần gây mẫn cảm. Có thể kiểm tra bằng gây mẫn cảm
trên thỏ trước khi làm chính thức.
Theo dõi đáp ứng miễn dịch sau mẫn cảm bằng thử nghiệm Ouchterlony,
ELISA, điện di miễn dịch huyết thanh đã có kháng thể và hiệu giá kháng thể
[12],[15],[22],[26][73].
1.4.4.2. Gây mẫn cảm, tạo nguồn huyết tương giàu kháng thể:
- Lựa chọn động vật: có thể chọn ngựa, lừa, dê, thỏ, chó, phôi trứng gà [126],
[129]...Dùng ngựa gây mẫn cảm, cung cấp huyết thanh đã có từ thế kỷ trước,
nhưng đến nay, nhiều trung tâm sản xuất HTKNR vẫn chọn ngựa, do ngựa
cho số lượng lớn huyết tương với giá rẻ và dễ làm, máu được lấy đều đặn một
24
khối lượng lớn mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của ngựa, mang đến hiệu
quả kinh doanh cho nhà sản xuất, nhất là đối với các nước đang phát triển,
nạn nhân rắn độc nhiều, khả năng chi trả của bệnh nhân thấp. Thường dùng
ngựa đực trưởng thành, từ 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 - 350 kg.
Cứ một lít máu ngựa có thể cho 100 ml HTKNR, một con ngựa cho khai thác
huyết tương khoảng sáu năm (Lê Văn Hiệp, 2010) [159]. Cừu có đáp ứng
miễn dịch khác với ngựa, không gây phản ứng tại chỗ như ở ngựa khi dùng tá
dược Freund’s (Karlson-Stiber C., Persson H., Heath A. et al., 1997) [84].
Tuy gây mẫn cảm chỉ cần một lượng nhỏ nọc đã đạt mức kháng thể đặc hiệu
tối đa, nhưng số máu lấy chỉ được 500ml/lần với cừu lớn trưởng thành.
- Gây mẫn cảm: hiệu lực của HTKNR phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể, tính
đặc hiệu và mức cô đặc. Vì vậy, huyết tương sản xuất cần có hiệu giá kháng
thể cao, đây là một yêu cầu quan trọng và là một vấn đề thường xuyên đặt ra
cho tất cả các nhà sản xuất. Thông thường, phải miễn dịch ngựa theo lịch
trình tăng dần lượng nọc tiêm vào cơ thể ngựa, hiệu giá kháng thể sẽ tăng
theo mỗi lần miễn dịch. Liều kháng nguyên và khoảng cách thời gian giữa các
lần tiêm kháng nguyên được xác định trước khi gây mẫn cảm, thường từ 2-4
tuần. Tùy theo mức độ độc của nọc rắn (LD50) và kỹ thuật chế tạo kháng
nguyên để qui định liều kháng nguyên mỗi lần gây mẫn cảm cho phù hợp. Tá
dược tạo sự thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa tế bào macrophages và tế bào
lympho, hỗ trợ hiệu quả quá trình sinh kháng thể. Huyền dịch kháng nguyên
nọc rắn trong tá dược Freund’s cũng làm giảm độc tính nọc vì nọc được giải
phóng từ từ vào cơ thể động vật mẫn cảm (Christensen, Latifi, Sawai, 1972)
[20].
- Theo dõi hình thành kháng thể: trong suốt lịch trình gây mẫn cảm, theo dõi
sự hình thành kháng thể đặc hiệu, sử dụng kỹ thuật Ouchteclony, khuếch tán
hai chiều trong gel agarose1%, nếu xuất hiện các đường vòng cung tủa KN -
25
KT đặc hiệu, cho thấy đã hình thành kháng thể trong máu ngựa. Điện di miễn
dịch huyết thanh ngựa sau khi gây mẫn cảm với kháng nguyên nọc rắn để xác
định tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên.
1.4.4.3. Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể:
Sau khi ngựa đã có kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn với hiệu giá cao sẽ
lấy máu, thu huyết tương hoặc huyết thanh để sản xuất HTKNR. Theo Warrell
D.A, Theakston R.D.G (1971) tuy một số nhà sản xuất vẫn dùng huyết thanh
để sản xuất, song ngày nay đa số nhà sản xuất dùng huyết tương thu được từ
máu chống đông [20].
Dùng huyết tương có lợi điểm sớm hoàn trả được khối hồng cầu cho
ngựa, đảm bảo sức khỏe ngựa hồi phục sớm, giúp cho đáp ứng sinh kháng thể
chống nọc rắn được mạnh hơn. Ly tâm hoặc để lắng, tách khối hồng cầu để
truyền trả cho ngựa càng sớm càng tốt. Thường lấy máu vào bình thủy tinh
hoặc bình nhựa vô khuẩn chuyên dùng với thể tích lớn trên 10 lít. Hệ thống
lấy máu được thiết kế theo vòng kín để đảm bảo vô trùng, dễ khử khuẩn. Máu
lấy không được để vỡ hồng cầu, ảnh hưởng đến chất lượng huyết thanh.
Lượng máu lấy cần tính toán cân nhắc trước, tùy theo trọng lượng, sức khỏe
ngựa. Theo Lê Văn Hiệp (2010) thường lấy số lượng máu không quá 1,5%
trọng lượng cơ thể ngựa, trung bình một tháng/lần; cứ 1 lít máu ngựa cho
được ≈ 100ml HTKNR [159].
Cần chú ý an toàn cho người lấy máu khi làm việc với ngựa. Phải có các
dụng cụ chuyên dùng cố định thân mình và cổ ngựa, vừa dễ lấy máu, an toàn
cho người lấy máu.
1.4.4.4. Tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn:
Đến nay, việc tinh chế HTKNR có thể thực hiện theo một trong ba kỹ
26
thuật chế tạo là IgG, F(ab’)2 và Fab [136]. Tùy điều kiện và kinh nghiệm của
nhà sản xuất, nhu cầu điều trị của từng quốc gia, từng địa phương và từng loại
nọc rắn; có thể sản xuất HTKNR ở một trong ba dạng sản phẩm trên, sau đó
tinh chế loại bỏ các thành phần khác, chỉ để lại phần đặc hiệu tác dụng với
độc tố nọc rắn là phần IgG, F(ab’)2 hoặc Fab, với mức độ cô đặc cao nhất. Để
giảm thiểu phản ứng quá mẫn khi sử dụng HTKNR, dùng pepsin cắt bỏ phần
Fc của γ-globulin miễn dịch, tạo ra mảnh F(ab’)2 (Latifi, 1978) [20], sau đó
tinh chế, cô đặc mảnh F(ab’)2. Phần Fc là nơi có nhiều thụ thể kết dính tế bào,
là trung gian của các phản ứng quá mẫn được loại bỏ. Mảnh F(ab’)2 vẫn còn
khả năng kết hợp hai kháng nguyên được giữ lại.
Một phương pháp khác tinh chế HTKNR là dùng papain cắt Fc của IgG,
thu hồi hai mảnh Fab, mỗi mảnh có một vị trí kết hợp kháng nguyên. Trọng
lượng Fab khoảng 50.000.
Hình 1.2. Vị trí tác động của pepsin và papain.
27
Mảnh Fab có ưu điểm: chỉ có một vị trí kết hợp kháng nguyên, Fab
không hình thành phức hợp miễn dịch, không gây phản ứng quá mẫn type -
III [11]; phần Fc đã mất nên không kết hợp bổ thể, hoặc macrophages, loại bỏ
quá trình giải phóng amin hoạt mạch; mảnh Fab không gây shock phản vệ
hoặc phản ứng dạng phản vệ; do kích thước nhỏ, Fab thấm vào khoang nội
bào nhanh hơn. Tuy nhiên, do thời gian bán hủy F(ab’)2 là 36 giờ, dài hơn bán
hủy F(ab) (khoảng 4 giờ), dẫn đến hiệu quả điều trị thấp. (Dart R.C, McNally
J., 2001) [61].
Tại Hội nghị độc học thế giới tại Mexico lần thứ 12 (1997), các nhà khoa
học đã thống nhất quan điểm cho rằng hiệu quả điều trị của HTKNR F(ab’)2
phù hợp hơn F(ab). Hàng chục năm nay, ba vấn đề lớn của sản xuất HTKNR
từ ngựa vẫn là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu là: hiệu lực chưa đủ
mạnh, phản ứng không mong muốn còn cao và giá thành đắt.
1.4.4.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm:
Bất kỳ nhà sản xuất HTKNR nào cũng đều có hệ thống kiểm tra chất
lượng của mình, bao trùm tất cả quy trình sản xuất, quản lý chất lượng toàn
diện (Total quality management - TQM) [18]. Kiểm soát, làm chủ được quy
trình sản xuất thể hiện ở chất lượng sản phẩm có đạt Tiêu chuẩn Quốc gia và
Quốc tế hay không. Trong từng giai đoạn sản xuất, công tác kiểm tra, giám
sát và đánh giá chất lượng được thực hiện thường xuyên, chặt chẽ. Giai đoạn
nào cũng hoàn thành mục tiêu, yêu cầu chất lượng của giai đoạn đó, đây là
nền tảng thành công của sản phẩm cuối cùng. Không hoàn thành tốt kết quả
giai đoạn trước sẽ làm hỏng toàn bộ công việc của giai đoạn sau.
Sau khi HTKNR ra đời, sản phẩm sẽ được đánh giá chất lượng với hai
bước độc lập với nhau là Kiểm định cơ sở và Kiểm định Quốc gia [7],[9].
Kiểm định cơ sở thực hiện tại cơ sở sản xuất HTKNR, với những thử
nghiệm cơ bản: an toàn chung, vô khuẩn, không có chí nhiệt tố và hiệu lực;
28
nếu đạt, sẽ được tiếp tục kiểm tra tiếp bước sau, đó là kiểm định Quốc gia tại
Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế. Cơ quan này có
trách nhiệm đánh giá, kiểm định chất lượng độc lập, khách quan, khoa học
cho các sinh phẩm y tế đã được nhà sản xuất đánh giá chất lượng. Tiêu chuẩn
chất lượng của huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) được quy định thống
nhất trong Dược điển Việt Nam, có tính chất pháp lý và trọng tài, có giá trị
tiêu chuẩn hóa chất lượng, giúp quản lý và nâng cao chất lượng dược phẩm
sản xuất và lưu hành trong nước.
Tóm lại: quy trình sản xuất HTKNR cho thấy, bản chất HTKNR là
các IgG chống nọc rắn đặc hiệu, do đó các cơ sở Huyết học - Truyền máu
có điều kiện tách chiết và tinh chế được gamma globulin, đều có thể sản
xuất được chế phẩm HTKNR.
1.5. TAI NẠN DO RẮN CẠP NIA VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN
XUẤT HTKN-RCN TẠI VIỆT NAM
1.5.1. Tình hình tai nạn do rắn cạp nia tại Việt Nam:
Việt Nam có địa hình và khí hậu rất thuận lợi cho rắn độc phát triển,
trong đó có các loài rắn cạp nia. Cho đến nay, Việt Nam được biết là nơi cư
ngụ của 193 loài rắn thuộc 69 giống, 8 họ; trong đó ghi nhận tổng số 53 loài
rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ Rắn hổ Elapidae và 18 loài (8 giống)
thuộc họ Rắn lục Viperidae. Bên cạnh đó, sự phân bố theo vùng địa lý của các
loài rắn độc cũng khác nhau: 12 loài chỉ ghi nhận ở miền Bắc, 19 loài chỉ ghi
nhận ở miền Nam và 22 loài ghi nhận ở cả hai miền đất nước.
Với hệ thống kênh rạch chằng chịt và mùa nước nổi hàng năm, cùng
thời tiết ấm áp phù hợp với sự phát triển của rắn, số nạn nhân rắn độc hàng
năm ở miền Nam nhiều hơn miền Bắc.
29
Các loài rắn nguy hiểm nhất ở miền Nam là rắn cạp nia nam (Bungarus
candidus), rắn choàm quạp (Agkistrodon rhodostoma), rắn hổ mèo (Naja naja
siamensis). Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) gây tử vong tại bệnh viện
tới > 80% (Trịnh Xuân Kiếm, 2010) [6],[89]; trong khi tỷ lệ tử vong do rắn
choàm quạp (Agkistrodon rhodostoma) khoảng 22% (WHO, 1999) [147], tử
vong do rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) xấp xỉ 40% (Lê Khắc Quyến,
2010) [6],[33]...
Ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung, thường gặp nhất là rắn cạp nia bắc
(Bungarus multicinctus), rắn hổ mang phì (Naja naja atra), rắn hổ mang chúa
(Ophiophagus hannah) và một số loài rắn lục, trong đó nhiều nhất và nguy
hiểm hàng đầu là rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) [71],[72].
Như vậy, rắn cạp nia bắc và cạp nia nam là hai loài rắn nguy hiểm nhất
Việt Nam, độc tính nọc rắn ức chế rất mạnh cả màng trước và màng sau sinap
thần kinh-cơ, gây liệt cơ vân, trong đó có cơ hô hấp, gây tử vong nhanh nếu
không được cấp cứu kịp thời. Khi điều trị không đặc hiệu - không có HTKNR
- bệnh nhân phải thở máy dài ngày, trung bình 4 - 6 tuần, rất vất vả, tốn kém,
nhiều biến chứng và vẫn có thể tử vong.
Đến nay, chúng ta vẫn chưa có số liệu đầy đủ về tình hình và ước tính
số lượng nạn nhân do rắn cạp nia cắn trong cả nước. Theo Trịnh Xuân Kiếm
(2001), tại bệnh viện Chợ Rẫy, từ năm 1990 đến tháng 4/1996, có 23 trường
hợp nhập viện, chiếm 2,6% tổng số nạn nhân rắn độc cắn vào viện Chợ Rẫy
điều trị [6], tỷ lệ tử vong của nhóm bệnh nhân này tại viện lên tới trên 80%.
Cũng theo tác giả và cộng sự (2010), từ 1998 đến 2007, bệnh viện Chợ Rẫy
tiếp nhận 42 trường hợp rắn cạp nia nam cắn, chiếm 2,1% [88]. Theo Phạm
Ngọc Thảo (2010) [35], trung bình mỗi năm bệnh viện Chợ Rẫy tiếp nhận
2500 trường hợp nhập viện, trong đó do rắn độc chiếm 34,7%, xấp xỉ hàng
ngàn người mỗi năm. Như vậy, số nạn nhân rắn cạp nia ước chừng hơn 20
30
người/năm, bằng khoảng 1/3 so với bệnh viện Bạch Mai. Theo Nguyễn Thị
Dụ, Hà Trần Hưng (2010), tại ICU - Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch
Mai, có 81 bệnh nhân bị rắn cạp nia bắc cắn trong ba năm 2004 - 2006, trong
đó 27 trường hợp nhập viện trong năm 2006. Tỷ lệ tử vong tại viện dù được
cấp cứu với đầy đủ điều kiện tốt nhất vẫn tới ≈ 7%.[72]. Trong thực tế, tai nạn
do rắn cạp nia tại Việt Nam hiện chưa được thống kê đầy đủ và có hệ thống
ngoài một số nghiên cứu đề cập trên đây. Đây là thực tế không chỉ diễn ra tại
Việt Nam và đã được Tổ chức y tế Thế giới khuyến cáo toàn cầu: “Tai nạn do
rắn độc là một vấn đề y tế bị lãng quên”[147].
Tuy nhiên, qua báo chí hàng năm, liên tiếp nhiều nơi trong cả nước có
thông tin về việc cấp cứu điều trị bệnh nhân bị rắn cạp nia cắn, đa số là rất
nặng, điều trị vất vả do thở máy dài ngày và biến chứng; điều này cho thấy sự
phổ biến của tai nạn do rắn cạp nia trong cộng đồng, mức độ nguy hiểm trong
thực tế do loài rắn này gây ra, cũng như tình hình cấp cứu ở các tuyến cơ sở
và tuyến bệnh viện cho loại mặt bệnh này. Thí dụ: Ngày 29/7/2007: “Bệnh
nhân “ôm” máy thở… bác sĩ đứng canh”, nói về tình trạng vất vả của bệnh
nhân, người nhà bệnh nhân và các bác sĩ, nhân viên y tế tại Trung tâm chống
độc bệnh viện Bạch Mai do không có HTKN-RCN [165]; Ngày 27/6/2008:
“Chữa ngộ độc rắn cắn: vất vả do thiếu huyết thanh” [166], phản ánh tình
trạng bức xúc trong cứu chữa rắn độc cắn mà không có HTKNR hiện nay;
Ngày 22/5/2013 [172]: “Đi thể dục, thiếu nữ suýt tử vong vì rắn cắn”; Ngày
22/5/2013: “Đầu hè, trúng độc do rắn độc tăng đột biến”[176]; Ngày
23/8/2013 [171]: “Xin về chờ chết vì không có tiền chữa rắn cắn”,...
Như vậy, đây là mặt bệnh có tỷ lệ tử vong cao, gây nhiều khó khăn cho
công tác cấp cứu điều trị; bệnh nhân phải thở máy dài ngày, rất vất vả cho gia
đình và nhân viên y tế, nhiều biến chứng do thở máy và nằm lâu, như viêm
phổi, viêm đường tiết niệu, suy kiệt...., ngoài ra còn gây tổn thất rất lớn về
31
kinh tế. Các vấn đề này có thể được giải quyết dễ dàng hơn rất nhiều nếu có
HTKN-RCN đa giá đặc hiệu. Trong khi, về kỹ thuật, chúng ta có đủ điều kiện
nhân lực và cơ sở vật chất để sản xuất được loại HTKNR này.
1.5.2. Chi “rắn cạp nia” Việt Nam:
- Việt Nam có 5 loài rắn độc thuộc chi Rắn cạp nia (chi Bungarus), trong đó
ba loài có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” là dễ nhầm với nhau nhất.
+ Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus):
Tên khác: rắn mai gầm, rắn mai gầm bạc.
Phân bố: miền Bắc Việt Nam, Thái Lan; Đài Loan, Trung Quốc, Mianma, bắc
và trung Lào.
Hình 1.3. Khu vực cư trú của rắn cạp nia bắc (B. multicinctus) [156].
Loài này có thể tìm thấy ở độ cao tới 1.300 m, sinh sống chủ yếu ở các
khu vực thấp, trong các bụi cây, rừng, bờ ruộng, ao hồ, đầm và rừng ngập
mặn. Rắn hoạt động về ban đêm, ban ngày ẩn trong các hang, hốc. Xuất hiện
32
nhiều từ cuối mùa xuân và ngủ đông trong tháng mười một. Thức ăn là các
loài rắn khác, lươn, chạch, ếch nhái, chột và thỉnh thoảng ăn cả thằn lằn. Rắn
đẻ 3 - 15 trứng, nở thành con sau một tháng rưỡi, thường vào tháng 6,7 trong
năm. Loài rắn này nhút nhát dưới ánh sáng ban ngày nhưng rất hoạt động vào
ban đêm. Dễ bị chúng cắn nếu bị khiêu khích hoặc bị đụng phải. Lượng nọc
độc trung bình khoảng 4,6 mg -18,4 mg mỗi vết cắn. Nọc rắn cạp nia bắc có
LD50 khoảng 0,15µg/g (Steven D., Aird Glen C., et al., 1999) [131].
+ Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus):
Tên khác: Malayan kraid, Common krait, Blue krait, Javan krait.
Phân bố: Việt Nam, Campuchia, Indonexia, Lào, Malaysia [136],
Myanmar, Singapore, Thái Lan [157],[24]. Đây là loài rắn phổ biến nhất đồng
bằng và trung du Việt Nam.
Hình 1.4. Khu vực cư trú của rắn cạp nia nam (B.candidus) [155].
33
Về hình thái, loài này thoáng nhìn giống hệt rắn cạp nia bắc. Rắn cạp nia
nam chỉ có tối đa 32 khoang đen trên toàn bộ cơ thể. Khoang trắng rộng hơn
khoang đen, bao toàn bộ mặt bụng liên tiếp đến mặt bên thân rắn.
Rắn cạp nia nam sống chủ yếu ở đồng bằng, đồi, rừng,... đôi khi gặp ở độ
cao tới 1600 mét. Đặc tính loài giống rắn cạp nia bắc: thích sống gần nước,
bên bờ ruộng, ao hồ, đầm; hoạt động về đêm, thích ăn lươn, chạch... Rắn cạp
nia nam thường gặp nhiều nhất ở miền đông Nam Bộ đến Trung Bộ. Đây là
loài rắn độc vào loại nhất Việt Nam và là một loài rắn độc nhất thế giới, với
LD50 ≈ 0,1 µg/g (Tan N.H. et al., 2004) [135], tỷ lệ gây tử vong rất cao [117].
+ Rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) [10],[24]:
Loài rắn này có 24 - 27 khoang đen, khoang vàng xen kẽ nhau, khoang
đen bao quanh thân rắn. Rắn có ở khắp mọi miền ba nước Đông Dương. Ở
Việt Nam, loài rắn này thường gặp ở vùng đồng bằng và trung du. Rắn hay ở
bờ ruộng, bờ đê, bụi tre, gò đống... Hoạt động về đêm. Thức ăn là các loại rắn
khác, ếch, rắn mối, chuột, thậm chí cả cá. Nọc rắn cạp nong có độc tính mạnh
(Pe T., Myint T., et al., 1997)[113]. Loài rắn này chậm chạp, ít cắn người.
+ Rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus flaviceps) [24],[39]:
Đầu và phần chót đuôi rắn có mầu đỏ. Loài rắn này hiếm gặp. Ở Việt
Nam đến nay mới chỉ phát hiện thấy ở Núi Dinh, tỉnh Đồng Nai, với độ cao
trên 914 mét so với mực nước biển. Tại các nước như Thái Lan, Malaysia
cũng chỉ tìm thầy loài rắn này ở vùng núi cao. Rắn cạp nong đầu đỏ là loài rắn
độc họ rắn hổ, cùng chi rắn cạp nia (Bungarus) nhưng khá hiếm gặp. Nọc độc
loài này chủ yếu tác động màng trước sinapse và có khả năng gây rối loạn
đông máu (Ang Swe Siang, et al., (2010)[42].
+ Rắn khoang sông Hồng (RKSH) - Bungarus slowinskii:
34
RKSH (Red River Krait), mang tên nhà sinh học Mỹ chuyên nghiên cứu
về bò sát Joseph Bruno Slowinskii (1965 - 2001), người đã chết do bị rắn cạp
nia bắc cắn, khi đang nghiên cứu về loài rắn này tại Mianma [158]. Năm
2005, Kuch, Kizirian, Lawson, Donnelly, Nguyễn Quang Trường và Mebs, đã
phát hiện loài rắn này tại tỉnh Yên Bái, huyện Văn Yên, Na Hầu và lưu vực
sông Hồng. Sau đó còn phát hiện thấy loài rắn này tại Quảng Nam, Quảng
Trị, Thừa Thiên – Huế và Lào [93]. Đây cũng là loài rắn khúc đen, khúc trắng
như rắn cạp nia bắc, cạp nia nam. Loài rắn này có khoang đen rộng, khoanh
trắng rất hẹp. Đây là loài rắn độc mới phát hiện trên thế giới, thuộc chi rắn
cạp nia (Bungarus), và là một trong 5 loài rắn đặc hữu có ở Việt Nam [39].
Các hiểu biết về độc tố nọc loài rắn này chưa nhiều.
1.5.3. Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh:
- Thành phần: nọc rắn khô có trên 90% là protein, trong đó 25-70% là enzym,
còn lại là các độc tố polypeptide không enzyme, polypeptide không phải độc
tố và một số chất vô cơ.
+ Các enzym: thường gặp nhất là phospholipase A2, hyaluronidase,
phosphoesterases, peptidase [48],[50],[66],[78],[90],[124],[133]....tác dụng
phá hủy các tế bào máu, các dây thần kinh ngoại vi, cơ vân, nội mạc mạch
máu, tác động vào hoạt động màng trước synapse.
+ Độc tố polypeptide: gồm 2 loại
α-Neurotoxins: độc tố tác động màng sau synapse (Postsynaptic active
toxin), liên kết đặc biệt với các thụ thể acetylcholine, ngăn chặn dẫn truyền
xung động thần kinh-cơ [5],[62],[85],[92],[94],[100],[106],[144].
β,γ-Neurotoxins: hoạt tính màng trước synapse, gây ức chế giải phóng
acetylcholine, ngăn cản tái hấp thu choline để tổng hợp achetylcholine, thay
đổi điện thế màng sinapse do thay đổi hấp thu ion K+, Na+, gây ngưng trệ dẫn
truyền thần kinh-cơ, dẫn đến liệt cơ không hồi phục [48],[49],[91],[110].
35
Theo Middlebrook J.L., Kaiser II (1989) [102]; Manjunatha Kini (2003)
[98], thành phần nọc của rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus ) và rắn cạp
nia nam (Bungarus candidus) đều chứa hai loại độc tố thần kinh là α-
neurotoxin và β,γ-neurotoxins nhưng số lượng, thành phần khác nhau [59].
Theo Khow O., et al., (2003) [87], Inn-Ho Tsai et al., (2002) [78], trọng
lượng phân tử độc tố nọc hai loài rắn này này từ 25-25,5 kDa, cấu tạo bởi các
polypeptide 16-16,5 kDa và 7-8,5 kDa, nhỏ hơn nhiều loài rắn khác [44],[50].
Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của độc tố nọc rắn cạp nia [6].
- Bệnh cảnh lâm sàng của bệnh nhân rắn cạp nia nam cắn thường nặng nề
hơn cạp nia bắc do khác biệt về thành phần nọc và vị trí tác động tại synapse
thần kinh-cơ của hai loài rắn độc khác nhau. Cũng chính vì vậy, HTKN-RCN
đơn đặc hiệu của từng loài rắn cạp nia không có tác dụng trung hòa chéo nhau
hoặc tác dụng rất hạn chế (Warell D.A. và cs, 1983) [146].
Hướng dẫn truyền thần
kinh
Màng trước sinapse
Màng sau sinapse
36
- Nọc rắn cạp nia là loại độc tố thần kinh có trọng lượng phân tử thấp, hấp
thu và lan tỏa rất nhanh trong cơ thể, tác động cả màng trước và sau sinapse,
ức chế rất mạnh dẫn truyền thần kinh-cơ. Các dấu hiệu nhiễm độc tại chỗ rắn
cắn thường mờ nhạt, nạn nhân thường không đau, không chảy máu, khiến
phát hiện không kịp thời hoặc chủ quan coi thường. Khi triệu chứng yếu, bại,
liệt cơ xuất hiện, nạn nhân trở tay không kịp, tử vong.
1.5.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất HTKN rắn cạp nia:
1.3.1. Trên thế giới:
- Năm 1983, David Warrell khi thông báo kết quả nghiên cứu về các tai nạn
do Bungarus candidus (Malayan kraid) gây ra tại miền đông Thái Lan và tây
bắc Malaysia, tác giả đã dẫn nghiên cứu của Kuo T.P., Wu C.S. trên tạp chí
The Snake (1972) về 925 trường hợp bị rắn Bungarus multicinctus cắn tại Đài
Loan với tỷ lệ tử vong tới 23%. Đây là những cảnh báo đầu tiên về sự nguy
hiểm do rắn cạp nia gây ra [146].
- Năm 1995, Chan J.C., Cockram C.S., Buckley T. (Hongkong) [47], thông
báo về hai trường hợp bị rắn cạp nia bắc cắn (Bungarus multicinctus), với đầy
đủ triệu chứng nhiễm độc nọc rắn cạp nia, có liệt cơ hô hấp, sụp mi,...sau khi
được điều trị với HTKNR đơn giá chống nọc Bungarus fasciatus và thở máy
hỗ trợ, đã hồi phục sau tám ngày. Thời điểm này chưa có nước nào sản xuất
được HTKN-RCN cho hai loài rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) và rắn cạp nia
nam (B.candidus).
- Năm 1999, Chanhome L., Wongtongkam et al., 1999 (Thái Lan) dùng
HTKN rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) trung hòa nọc rắn cạp nia nam
(Bungarus candidus) trong in - vivo, thấy có hiệu quả tương tự như với nọc
rắn Bungarus flavicep [51], tuy nhiên nghiên cứu không nói rõ mức độ thành
công đến đâu. Như vậy, tới thời gian này Thái Lan chưa sản xuất được
37
HTKN-RCN, trong khi ở Việt Nam, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã chế tạo
thành công HTKN rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) tại Đơn vị nghiên
cứu huyết thanh kháng nọc, bệnh viện Chợ Rẫy [88].
- Năm 2002, với nghiên cứu dùng nọc rắn cạp nia nam không khử độc để gây
miễn dịch cho thỏ, các tác giả Thái Lan cho biết, thỏ nghiên cứu đã chịu được
liều tiêm dưới da với nồng độ nọc 150 – 200 µg/kg ở lần gây mẫn cảm thứ 5,
trong vòng 6 tháng nghiên cứu. Khi tăng liều trên mức này ở các lần miễn
dịch sau, thỏ đều tử vong (Chanhome L. et al., 2002) [52]. Đây là nghiên cứu
tạo nền tảng cho sản xuất HTKN rắn cạp nia nam ở Thái Lan sau này.
- Năm 2004, Trịnh Xuân Kiếm, Nguyễn Thị Dụ, Hà Trần Hưng và cộng sự
sản xuất và thử lâm sàng thành công HTKN-RCN bắc trên 27 bệnh nhân bị
Bungarus multicinctus cắn, hiệu quả rất cao [71].
- Năm 2007, Leeprasert W., Kaojarern S., (Thái Lan) [95] đã sử dụng
HTKNR của Viện QSMI, sản xuất 2004, điều trị cho ba bệnh nhân nhiễm độc
nọc rắn cạp nia nam, vào viện và được dùng HTKNR đặc hiệu rất sớm. Kết
quả có so sánh với một trường hợp vào viện cùng thời điểm, không được điều
trị bằng B.candidus antivenom. Các tác giả cho biết, ở cả ba bệnh nhân,
HTKNR đều có hiệu lực, triệu chứng liệt được cải thiện trong vòng 40 giờ sau
khi dùng thuốc. Tuy nhiên, lượng antivenom được sử dụng quá nhiều: 80, 88,
87 lọ trong thời gian 90 giờ. Điều này cho thấy, công hiệu của HTKNR
Bungarus candidus của họ không cao, nhiều nguy cơ bệnh huyết thanh sau
điều trị. Các bệnh nhân này nhiễm độc nặng (khó thở, khó nói, sụp mi mắt
trong 30 – 60 phút; được đặt nội khí quản trong 2 - 3 giờ sau khi bị rắn cắn).
Như vậy, sau Việt Nam 5 năm, Thái Lan đã sản xuất thành công B.candidus
antivenom [160], nhưng chất lượng còn phải bàn.
- Năm 2009, theo Chieh-Fan C. et al., (Đài Loan) [53], Trung tâm Vacxin và
Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Đài Loan - đã sản xuất được nhiều loại
38
HTKNR phục vụ cho cứu chữa sáu loài rắn độc nguy hiểm thường gặp nhất
Đài Loan, trong đó có loài rắn cạp nia bắc Bungarus multicinctus, loài rắn độc
gây tử vong cao nhất Đài Loan hiện nay: khi các loài rắn độc khác chỉ gây tử
vong 2,4% thì loài rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) vẫn gây tử vong
đến 24%. Hiện nay Đài Loan đã sản xuất được bốn loại HTKNR, trong đó có
HTKNR đa giá cho hai loài: rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) và rắn
hổ mang phì (Naja atra) (Chi - Wen Juan, 2012) [56].
- Malaysia là một nước ASEAN hiện đang phát triển rất mạnh các nghiên cứu
về nọc độc của rắn cũng như sản xuất các loại HTKNR ứng dụng điều trị các
loài rắn của Malaysia, trong đó có rắn cạp nia nam. Năm 2012, Tan N.H.,
Leon P.K., Phung S.Y. (Malaysia) [137], đã thí nghiệm đánh giá tác dụng
trung hòa độc tính nọc của rắn cạp nia nam Bungarus candidus (Malayan
kraid) bằng hai loại HTKN rắn hổ đa giá thường dùng nhất ở Ấn Độ là Vins
polyvalent antivenom (VPAV) và Bharat polyvalent antivenom (BPAV), kết
quả: các loại HTKNR này đều không có tác dụng. Như vậy, cho đến nay, với
nhiều thành công trong nghiên cứu, Malaysia vẫn chưa sản xuất được loại
HTKN rắn cạp nia nào, đây quả là một vấn đề không đơn giản.
- Trung Quốc cũng là nước đang phát triển mạnh các cơ sở nghiên cứu sản
xuất HTKNR, việc ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào sản xuất HTKNR
diễn ra rất nhanh chóng, làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do tai nạn rắn độc trong
những năm gần đây. Hiện nay, Trung Quốc đã sản xuất được HTKNR đa giá
cho rắn hổ mang (Naja atra) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Tuy
nhiên, ít có thông báo của các tác giả Trung Quốc về vấn đề này.
- Theo Warrell D.A. (2010), chuyên gia hàng đầu của WHO về rắn độc [147],
hiện nay thế giới mới chỉ có hai loại sản phẩm HTKN-RCN trên thị trường là:
“Bungarus candidus antivenom”, “Malayan Krait antivenin” do Viện Queen
Saovabha Memorial Institute, Thái Lan sản xuất, liều dùng 50 ml (10ml/ống),
39
trung hòa được 0.4 mg/ml nọc rắn cạp nia nam; và “Bungarus multicinctus
and Naja atra antivenom”do Chinese Shanghai Vaccine & Serum Institute
sản xuất, “Taipei Naja-Bungarus antivenin” do Đài Loan sản xuất [147].
1.3.2. Tại Việt Nam:
- Trước 1990, chúng ta vẫn chưa có một loại HTKNR nào. Việc điều trị rắn
độc cắn chỉ duy nhất bằng các phương pháp không đặc hiệu. Rất nhiều bệnh
nhân tử vong, tàn phế [6].
- Năm 1991, Đơn vị nghiên cứu chế tạo HTKN được thành lập tại bệnh viện
Chợ Rẫy, đơn vị đã nghiên cứu chế tạo được HTKNR hổ đất (Naja kaothia
antivenom) ứng dụng lâm sàng hiệu quả, làm giảm tỷ lệ tử vong từ 19,5% còn
3,1% [5],[6].
- Từ đó đến nay, việc nghiên cứu về nọc rắn và sản xuất HTKNR ở Việt Nam
đã có nhiều tiến bộ. Đã thử nghiệm thành công nhiều loại HTKNR, đáp ứng
một phần nhu cầu của bệnh nhân bị rắn độc cắn, như: HTKN rắn hổ chúa
(King cobra antivenom)[21], HTKNR choàm quoạp (Agkistrodon rhodostoma
antivenom), HTKNR lục tre (Trimeresurus albolabris antivenom), HTKNR
hổ đất (Naja kaothia antivenom), HTKNR hổ mang (Naja atra) [6],[23].
- Năm 1999, Trịnh Xuân Kiếm đã nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn
cạp nia nam (Bungarus candidus antivenom), trước Thái Lan 5 năm [88].
- Năm 2004, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã nghiên cứu, chế tạo thành công
HTKN rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), kết quả đã được Hà Trần
Hưng, Höjer J., Nguyễn Thị Dụ, Trịnh Xuân Kiếm đăng trên J. Med Toxicol,
Dec, 6, pp. 393-7 [71],[72].
40
- Với các thành công trên, Việt Nam là nước nghiên cứu, chế tạo thành công
HTKN rắn cạp nia đơn giá của hai loài rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam tương
đối sớm hơn so với các nước khác trong khu vực. Tuy nhiên, do nhiều nguyên
nhân, cho đến nay, trong khi Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc đã cho ra thị
trường sản phẩm thương mại, chúng ta vẫn chưa có HTKN rắn cạp nia đơn
giá (Monospecific) trên thị trường.
- Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, nhập khẩu
antivenom để điều trị, lâu dài không phải là biện pháp tốt, trong khi đất nước
còn ngèo, ta có tiềm lực khoa học công nghệ, đầu tư không cần nhiều. Nhu
cầu HTKNR cho bệnh nhân điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam là đòi hỏi cấp
thiết, trước mắt cũng như lâu dài. Cần chủ động tìm một giải pháp cho vấn đề
này một cách căn cơ, bài bản: đó là sản xuất HTKNR có chất lượng tốt, an
toàn, hiệu lực cao, giá thành hợp lý, sẵn sàng cứu chữa nạn nhân.
- Để cứu chữa nạn nhân rắn cạp nia cắn, cần cả antivenom monospecific và
polyspecific. Trong nhiều trường hợp không xác định được loài rắn cắn, điều
trị với HTKNR polyspecific hay hơn monospecific.
- Trên cơ sở những thành công trong nghiên cứu, sản xuất HTKN rắn cạp nia
nam và HTKN rắn cạp nia bắc, việc nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 cho cả hai loài Bungarus candidus và Bungarus multicinctus là giải
pháp tốt, đáp ứng kịp thời nhu cầu cấp cứu điều trị nạn nhân rắn cạp nia cắn
hiện nay, nhất là khi chưa có VDK (Venom detection kits) đặc hiệu [15],[83].
41
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU:
2.1.1. Động vật thí nghiệm:
Ngựa (horse): ngựa đực 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 và 320 kg;
chăm sóc, nuôi dưỡng trong trang trại riêng biệt, đảm bảo các điều kiện
môi trường và dinh dưỡng, đủ thức ăn thô và tinh, cỏ không phun thuốc
bảo vệ thực vật, nước uống sạch: 2 con.
Thỏ (rabbit): khỏe, trọng lượng 2,5 - 3,0 kg/con, nuôi trong môi trường ổn
định nhiệt độ, chưa từng được sử dụng vào thí nghiệm khác, 6 con.
Chuột lang (Cobaye), khỏe, nuôi dưỡng đầy đủ, chưa từng được sử dụng
vào thí nghiệm khác, trọng lượng 250 - 300 gam/con, 6 con.
Chuột nhắt trắng (Swiss), 3 tuần tuổi, khỏe, trọng lượng 18 - 20 gam/con,
nuôi dưỡng tốt, chưa từng được sử dụng vào thí nghiệm khác, 100 con.
Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), rắn cạp nia nam (Bungarus
candidus): khỏe, đủ các độ tuổi, tuyển chọn ngẫu nhiên ở các vùng miền
khác nhau (đồng bằng, miền núi, ven sông...), số lượng > 100 con.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu:
42
Nọc rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), nọc rắn cạp nia nam
(Bungarus candidus) đông khô, bảo quản đông lạnh: 3,1 gam.
2.1.3. Hóa chất, sinh phẩm:
Tá dược Freund hoàn toàn (CFA), không hoàn toàn (IFA): hãng Sigma
và tự chế. Glutaraldehyde, pepsin, ammonium sulphate, acid clohydric, acid
sulfuric, NaOH, toluen, merthiolat: hãng Merk, Đức. Dung dịch đệm PBS: tự
chế. NaCl 0,9%: Dược phẩm TW2. Chống đông CPDA1, Heparin.
Môi trường Sabouraud, Thioglycolate, thạch agarose.
2.1.4. Dụng cụ, phương tiện, trang bị:
Laboratory của Đơn vị nghiên cứu HTKN, Trung tâm chống độc Bệnh
viện Bạch Mai, có các điều kiện trang bị kỹ thuật như sau:
- Phòng thí nghiệm thường xuyên ổn định nhiệt độ (lạnh) và vô trùng.
- Hốt lạnh vô trùng Telstar (Tây Ban Nha).
- Cân điện 0,01 mg của Heiligenstadt (Đức).
- Máy ly tâm lạnh, tủ lạnh bảo quản sinh phẩm, huyết tương.
- pH - Meth của hãng Hana (Italia).
- Nhiệt kế chính xác (Anh).
- Máy lọc Seiz + đĩa lọc Cellulose 0,2 - 0,45µm(Mỹ),
- Màng cellulose acetate thẩm tích (Đài Loan).
- Cốc đong, que khuấy thủy tinh, pipet thủy tinh, ống nghiệm,...,
- Tủ ấm, tủ sấy, bình cách thủy Bain - marie (Mỹ).
- Hệ thống cung cấp nước cất, điều chỉnh nhiệt độ nước.
- Hệ thống lọc vô trùng theo từng công đoạn kỹ thuật.
- Hệ thống sấy hấp và khử trùng dụng cụ.
- Hệ thống đóng lọ.
Dụng cụ bắt rắn, lấy nọc, bảo quản nọc chuyên dùng (Mỹ).
43
Dụng cụ gây mẫn cảm ngựa (Đài Loan).
Dụng cụ lấy máu, truyền máu ngựa chuyên dùng (Đài Loan).
Dụng cụ tách huyết tương, sản xuất khối hồng cầu ngựa.
Dụng cụ kiểm tra chất lượng KN và kiểm định cơ sở.
Máy điện di protein tự động Geni – 0 (Italia)
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu labo + thực nghiệm trên động vật.
2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm cần đạt:
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9][36]:
TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt của HTKN-RCN đa giá
1 An toàn chung Đạt an toàn chung
2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm
3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt
4 Hiệu giá KT/lọ Đạt > 100 LD50/lọ 5ml theo đề cương NC
5 pH 6 - 7
6 Merthiolat ≤ 0,01%
7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%
8 Nitơ toàn phần ≤ 15 %
Bảng 2.2. Tiêu chuẩn cần đạt, theo WHO guidelines, 2008 [151]:
TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt (Tham khảo)
1 An toàn chung Đạt
2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm
3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt
4 Hiệu giá KT/lọ Đạt đăng ký của nhà sản xuất
44
5 pH 6 - 7
6 Lượng chất bảo quản Phenol < 2,5 g/l, Cresols < 3,5 g/l
7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%
8 Nitơ toàn phần ≤ 100 g/l
9 Albumin ≤ 1 %
10 Globulin > 90%
2.2.3. Nội dung nghiên cứu:
2.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.
- Chế tạo kháng nguyên nọc RCN đa giá, giảm độc lực, an toàn, hiệu lực.
- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành kháng thể đặc hiệu.
- Lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu.
- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định độ tinh sạch của sản phẩm.
2.2.3.2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.
- Kiểm định cơ sở, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của HTKNR đa giá.
- Kiểm định Quốc gia tại Viện kiểm định Quốc gia VX&SPYT, Bộ y tế.
- Sơ bộ tính giá thành sản xuất, đánh giá hiệu quả kinh tế, xã hội.
2.2.4. Các phương pháp kỹ thuật nghiên cứu:
2.2.4.1. Tuyển chọn rắn, lấy nọc, bảo quản nọc:
- Chọn rắn cạp nia bắc, nam; lấy nọc, bảo quản nọc theo phương pháp của
Trần Kiên, Trịnh Xuân Kiếm và David Warell [21],[23],[24]:
+ Chọn rắn: xác định loài rắn theo hình thái và nanh độc. Rắn cạp nia bắc
(Bungarus multicinctus) có thân mình khúc đen, khúc trắng xen kẽ, khoang
trắng hẹp, số lượng khoang nhiều (trên 40 khoang). Rắn cạp nia nam
(Bungarus candidus): thân rắn “khúc đen, khúc trắng”, có ít khoang (tối đa 32
45
khoang) màu đen nhánh không khép kín, bao quanh lưng đến sát mặt bụng,
xen kẽ là các khoang trắng rộng hơn khoang đen. Rắn Bungarus slowinskii:
cũng có hình dạng “khúc đen, khúc trắng”, nhưng khúc trắng hẹp, khoang đen
rộng, thân và đầu rắn có khoang trắng hình chữ V. Nanh độc nhỏ, ngắn, sắc
nhọn và có rãnh, dễ gãy.
+ Nuôi rắn và lấy nọc rắn: cách ly, kiểm tra loại bỏ rắn ốm, tiến hành lấy nọc.
Khi lấy, ép hai bên đầu rắn, cho rắn há miệng để lộ răng độc, đưa ống capile
vào hứng nọc, lấy xong nọc từng con, bơm nọc vào lọ vô khuẩn, để khô, giữ ở
nhiệt độ 2 - 4oC, tránh ánh sáng, đông khô nọc, bảo quản - 20oC.
A B C
Hình 2.1. Ba loại rắn “khúc đen, khúc trắng” có thể gặp tại Việt Nam.
A: Rắn cạp nia bắc. B: Rắn cạp nia nam. C: Rắn khoang sông Hồng.
2.2.4.2. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực:
- Chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực: theo phương
pháp của Trịnh Xuân Kiếm và khuyến cáo của WHO, 2008 [151]:
+ Trộn lẫn hai loại nọc rắn cạp nia bắc và nam, mỗi loại 1500 mg. Pha nọc
đông khô trong dung dịch đệm BPS thành dung dịch nọc rắn cạp nia đa giá,
nồng độ 1%. Trộn dung dịch glutaraldehyde 0,25% với dung dịch nọc theo tỷ
lệ quy định, ủ ở 37oC/72 giờ/pH 7,3. Ủ tiếp ở 56oC/24 giờ.
46
+ Ly tâm lấy dịch nổi, lọc vô trùng dung dịch nọc, thu được kháng nguyên đa
giá giảm độc lực. Đóng lọ, dán nhãn, ghi ngày sản xuất, khối lượng nọc, thể
tích kháng nguyên, bảo quản ở 2 - 4oC.
- Kiểm tra chất lượng kháng nguyên theo Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9].
+ Thử an toàn chung, xác định độc tố bất thường: thực hiện trên chuột lang
Cobaye. Tiêm phúc mạc kháng nguyên với liều 1 ml/100g cho ba chuột, chuột
thứ tư không tiêm (Dược điển Việt Nam IV, 2009, chuyên luận 15, liều cho
phép < 5 ml)[9]. Theo dõi bảy ngày liên tiếp về hình thái (xù lông), giảm
trọng lượng, giảm vận động, chết. Nếu có trên một chuột bị ốm (rụng lông,
giảm trọng lượng...) hoặc chết là kháng nguyên không đạt an toàn.
+ Kiểm tra chất gây sốt trên thỏ: đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước khi thí
nghiệm; tiêm tĩnh mạch tai thỏ liều 1ml/kg cân nặng (Dược điển Việt Nam IV,
2009, chuyên luận 15, liều cho phép 1 ml/kg) [9]. Theo dõi nhiệt độ thỏ ba
giờ liên tiếp, mỗi giờ một lần. Nếu trong ba giờ, nhiệt độ mỗi thỏ thay đổi
dưới 1oC là đạt tiêu chuẩn kháng nguyên không có chất gây sốt.
+ Cấy khuẩn, cấy nấm: cấy 1ml kháng nguyên trong môi trường
Thioglycolate, để ở nhiệt độ 30 - 35oC/72 giờ, cấy 1ml kháng nguyên vào môi
trường Sabouraud, để ở nhiệt độ 20 - 25oC, theo dõi trong bảy ngày. Nếu
không mọc vi khuẩn, vi nấm là kháng nguyên đạt vô khuẩn, không có nấm.
+ Đánh giá hiệu lực sinh kháng thể bằng thử nghiệm Ouchterlony [26],[29]:
Sau khi gây mẫn cảm, lấy máu tĩnh mạch cổ ngựa, tách huyết thanh, đun
sôi và trải gel agarose 1,5% lên phiến kính + đĩa petri trong suốt, đục một lỗ
trung tâm và sáu lỗ đường kính 4 mm ở xung quanh. Nhỏ 10 µl kháng nguyên
vào ô trung tâm, 10 µl huyết thanh ngựa vào mỗi ô với tất cả sáu ô xung
quanh, ghi chép, đánh dấu vị trí kháng nguyên và huyết thanh, để vào hộp ẩm
ở nhiệt độ 37oC và nhiệt độ lạnh 2 - 6oC, sau 6, 12, 24 giờ: xem kết quả. Nếu
47
có đường tủa KN - KT, nhuộm đĩa và lam thạch agarose 1,5% với dung dịch
coomasie blue, tẩy màu bằng dung dịch tẩy màu (Methanol, acetic acid, nước
cất với tỷ lệ 4:1:5), rửa nước cất, để khô. Nếu có tủa giữa ô trung tâm và các ô
xung quanh là huyết thanh ngựa có kháng thể chống nọc rắn cạp nia, kháng
nguyên đạt yêu cầu về tính sinh miễn dịch.
+ Xác định tính đặc hiệu của kháng thể kháng nọc rắn cạp nia bằng điện di
miễn dịch HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 và kháng nguyên nọc rắn.
2.2.4.3. Gây mẫn cảm cho ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu:
- Gây mẫn cảm cho ngựa theo khuyến cáo của WHO [151] với lịch trình miễn
dịch 1 tháng/lần x 9 tháng. Tiêm kháng nguyên trộn lẫn tá dược Fruend hoàn
toàn (FCA) hoặc không hoàn toàn (FIA), với tỷ lệ 1:1. Thể tích kháng nguyên
mỗi lần tiêm là: 0,1- 0,3 - 0,5 - 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 ml. Trong đó, 1 ml kháng
nguyên có chứa ≈ 11 mg nọc rắn cạp nia đa giá của cả hai loài. Khi tiêm, cố
định thân ngựa vào khung cố định, sát trùng vùng tiêm, xác định liều lượng
cho mỗi vị trí tiêm, trộn kháng nguyên và tá dược, lắc trộn kỹ, tiêm dưới da.
Chia nhỏ lượng kháng nguyên và tá dược thành nhiều mũi, tiêm ở các vị trí
theo quy định (hình 2.2). Ngựa được ăn đầy đủ thức ăn thô và thức ăn tinh.
Lượng thức ăn tinh (ngô, cám) ≈ 6 - 8 kg/ngày. Ngựa được ăn đầy đủ loại cỏ
tươi, cỏ khô, cây ngô, cây đậu...và được chăn thả tự nhiên trong khu vực riêng
biệt, có nước uống sạch sẽ, chuồng trại đảm bảo vệ sinh.
48
Hình 2.2. Vị trí tiêm kháng nguyên nọc để gây mẫn cảm cho ngựa.
Nguồn: “WHO- Guidelines for the production, control and regulation
of antivenom immunoglobulines”, 2008 [151].
- Theo dõi sức khỏe ngựa sau tiêm KN và tá dược: theo dõi, thống kê các rối
loạn về vận động, hô hấp, tiêu hóa, tổn thương tại chỗ sau mỗi lần gây mẫn
cảm. Biểu hiện tại chỗ được theo dõi, thống kê, ghi chép (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Phân loại mức độ ảnh hưởng sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm.
Cơ quan Mức độ ảnh hưởng
Nhẹ Vừa Nặng
Vận động Mệt mỏi, uể oải Yếu, bại Liệt
Hô hấp Thở nhanh Khó thở Rối loạn hô hấp
Tiêu hóa Ăn ít Bỏ ăn chướng bụng
Tại chỗ tiêm viêm Loét nhỏ Loét lớn
- Theo dõi hình thành KT đặc hiệu bằng thử nghiệm Ouchternoly: sau mỗi lần
49
gây mẫn cảm cho ngựa, lấy 10 ml máu ngựa, để đông, ly tâm, tách huyết
thanh, pha loãng huyết thanh với các độ pha loãng khác nhau, theo dõi mức
độ, khả năng hình thành kháng thể đặc hiệu sau mỗi lần gây mẫn cảm.
2.2.4.4. Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể:
Thu hoạch huyết tương bằng phương pháp Plasmaferesis.
- Lấy máu ngựa: cắt bờm gọn, vệ sinh sạch, cho ăn nhẹ. Khử khuẩn buồng lấy
máu, chuẩn bị các dụng cụ lấy máu vô trùng có sẵn chất chống đông, bơm
kim tiêm 10, 20 ml, kẹp cố định, đèn cồn, dây garo...). Tiến hành: cố định
ngựa, cạo lông cổ ngựa vùng lấy máu, sát trùng iod và cồn ethanol 70o, garo
tĩnh mạch cổ ngựa, lấy máu với kim lấy máu chuyên dùng có chống đông, cố
định kim. Lắc máu nhẹ nhàng tránh vỡ hồng cầu và tắc kim. Kết thúc: rút
kim, kẹp mạch máu, thả dây cố định ngựa, cho ngựa ăn cháo ấm và cỏ non.
Khi lấy máu, chú ý khối lượng máu lấy, phát hiện bất thường: thở nhanh, toát
mồ hôi, hí ầm ĩ, giãy giụa... để kịp xử trí. Vận chuyển nhẹ nhàng, tránh vỡ
hồng cầu. Bảo quản ở nhiệt độ 18 - 20oC.
- Tách huyết tương: ly tâm túi máu, tách huyết tương, bảo quản ở 2 - 4oC.
Khối hồng cầu được bù dung dịch bảo quản, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 4oC.
- Truyền trả khối hồng cầu: cố định ngựa, garos tĩnh mạch cổ ngựa, sát trùng,
chọc kim luồn sâu 5 - 7cm trong tĩnh mạch cổ ngựa, truyền trả khối hồng cầu
cho ngựa. Tốc độ truyền tùy theo sức chịu đựng mỗi ngựa.
2.2.4.5. Kỹ thuật tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab')2 :
- Tinh chế HTKNR theo phương pháp F(ab’)2 của WHO [151], gồm 6 bước:
Bước 1. Cắt Fc của phân tử kháng thể bằng pepsin: huyết tương ngựa giàu
kháng thể, trộn đều với pepsin 1%, duy trì pH 3,2 ở nhiệt độ 20oC/60 phút.
Bước 2. Tủa các thành phần không phải kháng thể: hòa tan ammonium
sulphate vào huyết tương tới tỷ lệ 14%, nâng nhiệt độ lên 56oC/60 phút. Lọc
50
bỏ tủa chứa Fc, albumin và một số thành phần khác bằng giấy lọc Whatman,
thu dịch lọc có F(ab’)2 đặc hiệu.
Bước 3. Thu tủa F(ab’)2 đặc hiệu với kháng nguyên nọc RCN đa giá: thêm
vào dịch lọc ammonium sulphate, cho tới 36% (thêm 22%). Ủ hỗn dịch trên ở
20oC, pH: 6,8 trong 60 phút. Lọc thu tủa chứa γ-globulin miễn dịch và F(ab’)2
đặc hiệu gắn với ammonium sulphate, để khô tủa.
Bước 4. Thẩm tích loại bỏ ammonium sulphate: thẩm tích bằng màng
cellulose acetate với nước cất,Thu hồi dịch thẩm tích, lọc vô trùng với máy
lọc Seiz với đĩa lọc đường kính 0,45 µm và 0,2µm, được HTKNR F(ab')2.
Bước 5. Đóng lọ vô trùng, bảo quản.
Bước 6. Xác định độ tinh sạch của HTKNR: định lượng protein, albumin,
globulin, A/G , IgG, IgG, IgM và điện di protein huyết tương ngựa sản xuất,
và điện di HTKNR-RCN đa giá F(ab’)2.
2.2.4.6. Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm:
Bước 1: sau khi tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, sản phẩm thô được đóng
chai vô khuẩn 450 - 500 ml và lấy mẫu ngẫu nhiên 30 - 50 ml dùng cho các
thí nghiệm kiểm định cơ sở gồm: an toàn chung, chí nhiệt tố, vô khuẩn, công
hiệu (hiệu giá) theo quy định của Dược điển Việt Nam III, 2002 [7], Dược
điển Việt Nam IV, 2009 [9].
Bước 2: sau khi đạt yêu cầu kiểm định cơ sở, đóng lọ vô khuẩn 5 ml/lọ, thành
một lô; tiếp theo, yêu cầu Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế
(Bộ y tế) tiến hành kiểm định chất lượng. Mẫu kiểm định được lấy ngẫu
nhiên, các thử nghiệm đánh giá chất lượng được thực hiện hoàn toàn độc lập,
khách quan với cơ sở sản xuất. Kiểm định ở Viện KĐQGVX&SPYT gồm các
thử nghiệm đánh giá an toàn và công hiệu, các thử nghiệm lý hóa để đánh giá
chất lượng HTKNR.
51
Sau khi có kết quả kiểm định quốc gia, xác định các vấn đề tồn tại, quyết
định việc xử lý tiếp đối với lô HTKNR đã sản xuất.
Kiểm định cơ sở:
- Thử nghiệm an toàn chung (Safety test):
+ Nhằm xác định sự có mặt của các độc tính bất thường trong HTKNR.
+ Tiến hành: dùng 3 chuột lang khỏe, trọng lượng từ 300 - 350 gam, nuôi
trong điều kiện ổn định một tuần trước khi thí nghiệm. Tiêm phúc mạc chuột
HTKNR, liều 1ml/100 gam trọng lượng [9]. Theo dõi sự thay đổi trọng lượng,
hình thái, sự vận động của chuột trong ba tuần. Nếu chuột vẫn phát triển bình
thường, tăng cân là đạt an toàn trên động vật thí nghiệm. Nếu có chuột ốm
hoặc chết là không đạt.
- Thử nghiệm chất gây sốt (Pyrogen test):
+ Nhằm tìm chất gây sốt có trong HTKNR nghiên cứu sản xuất.
+ Tiến hành: chọn ba thỏ khỏe, trọng lượng 2,5 - 3,0 kg; chưa từng sử dụng
vào thí nghiệm nào, nuôi một tuần trong điều kiện ổn định nhiệt độ từ 20 -
25oC. Đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước khi tiêm.
+ Tiêm tĩnh mạch rìa tai thỏ với liều lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2
1ml/kg trọng lượng [9]. Đo nhiệt độ hậu môn thỏ sau tiêm 1, 2, 3 giờ. Xác
định chênh lệch nhiệt độ ở từng con và giữa ba con với nhau trước và sau
tiêm.
+ Bình thường chênh lệnh nhiệt độ cao nhất và thấp nhất với một thỏ dưới
0,7oC; cả ba thỏ có nhiệt độ chênh lệch cộng dồn dưới 1,3oC. Nếu kết quả thử
nghiệm có giá trị cao hơn quy định là thử nghiệm không đạt.
- Thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test):
+ Cấy nấm: dùng môi trường Sabouraud /37oC.
52
+ Cấy khuẩn: dùng môi trường thạch máu /20 - 25oC.
+ Theo dõi mọc vi khuẩn trong 7 ngày, vi nấm trong 14 ngày. Nếu không mọc
vi khuẩn, vi nấm là đạt.
- Thử nghiệm công hiệu (Potency test):
+ Xác định LD50 theo phương pháp Karber [27]: cân nọc RCN hai loài cạp
nia bắc và cạp nia nam có trọng lượng như nhau, hòa tan nọc trong NaCl
0,9% để có dung dịch nồng độ 1000 g/ml. Từ dung dịch này pha loãng tiếp
để có nồng độ 500 g/ml. Tiến hành pha loãng tiếp, cách nhau 1,5 lần thành
năm độ pha loãng liên tiếp, sao cho sau khi tiêm nọc rắn có độ pha loãng thấp
nhất chuột phải chết 100% và tiêm nọc rắn có độ pha loãng cao nhất chuột
phải sống 100% (sau khi pha xong lắc đều và để ở 37oC /30 phút, tránh ánh
sáng). Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột với liều 0,2 ml/con. Mỗi độ pha tiêm 8
chuột. Theo dõi số chuột sống, chết 24 giờ với mỗi độ pha loãng.
Tính LD50 theo công thức Karber [27]:
LD50 = LD100 – ∑ Z . d/n
Trong đó: Z: số trung bình tử vong của 2 nhóm kế cận.
d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.
n: số động vật thử nghiệm trong từng nhóm.
+ Xác định ED50 của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2: pha loãng HTKN-RCN
đa giá F(ab’)2 với NaCl 0,9% để có nồng độ tăng dần từ 60 µl/ml - 80 µl/ml.
Nọc rắn cạp nia đa giá pha trong dung dịch NaCl 0,9% để có nồng độ 40 LD50
/ml. Lấy 1 ml nọc rắn cạp nia đa giá 40 LD50 /ml cho vào mỗi ống nghiệm vô
khuẩn, trộn đều với 1 ml dung dịch NaCl 0,9% + nọc rắn cạp nia đa giá ở
từng độ pha loãng. Ủ hỗn dịch trên ở 37oC/1 giờ. Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột
hỗn dịch trên với liều 0,2 ml/chuột. Số chuột thí nghiệm mỗi lượt tám
con.Theo dõi 24 giờ, ghi số chuột sống chết, tính ED50 theo quy tắc tam suất.
53
Kiểm định Quốc gia:
Lấy mẫu kiểm định, thực hiện thí nghiệm theo quy trình riêng của Viện
kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế, gồm các thử nghiệm
an toàn, công hiệu và các thử nghiệm lý hóa.
- Thử nghiệm an toàn chung (Safety test):
+ Tiến hành trên chuột lang. Theo dõi các triệu chứng nhiễm độc như: thay
đổi diện mạo bên ngoài (xù lông), trạng thái bất thường, giảm hoạt động,
giảm cân, chết do nhiễm độc.
+ Dùng hai chuột lang, 250 – 350 gam, chưa dùng cho thí nghiệm nào trước
đó, khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường trong thời gian cách ly 3 - 7 ngày.
+ Tiêm phúc mạc mỗi chuột một liều tiêm cho người ≤ 5 ml.
+ Đánh giá: thử nghiệm đạt yêu cầu nếu toàn bộ chuột thí nghiệm khoẻ mạnh
tăng trọng hoặc giảm cân không có ý nghĩa thống kê. Nếu có nhiều hơn một
chuột chết thì thử nghiệm không đạt yêu cầu. Nếu có một chuột chết hoặc chỉ
ra dấu hiệu ốm do nhiễm độc trong lần thử đầu tiên, cần làm lại thử nghiệm
với số lượng chuột gấp đôi. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu lần thử thứ hai
không có chuột chết hoặc ốm.
- Thử nghiệm chất gây sốt (Pyrogen test):
+ Dùng thỏ khỏe, trưởng thành, đực hoặc cái (nhưng không được mang thai),
cân nặng trên 1,5 kg, nuôi dưỡng bằng thức ăn không có kháng sinh. Thử
nghiệm tiến hành trong phòng yên tĩnh, tránh tiếng động và ánh sáng, nhiệt độ
phòng chênh lệch dưới 3oC so với nơi ở cũ. Trước ngày tiêm, để thỏ nhịn ăn
qua đêm (được uống nước) cho đến khi thí nghiệm kết thúc. Không cho uống
trong thời gian thí nghiệm.
+ Khi đo nhiệt độ, nhiệt kế phải đặt sâu trong trực tràng thỏ ít nhất 5 cm, để
tối thiểu năm phút. Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, kim tiêm: tất cả phải được
rửa sạch bằng nước và sấy khô 250oC/30 phút hoặc 200oC/60 phút, nếu dùng
54
đồ nhựa phải không chứa chất gây sốt và phải vô trùng. Lồng thỏ chuyên
dụng: trước khi bắt đầu, đặt thỏ trong lồng chuyên dụng trong tư thế thỏa mái
trên một giờ và duy trì ở đó suốt thời gian thí nghiệm.
+ Tiến hành: đo nhiệt độ thỏ hai lần, cách nhau 30 phút. Nhiệt độ ban đầu của
thỏ là giá trị trung bình của các lần đo này. Đưa vào thí nghiệm là những thỏ
có nhiệt độ chênh lệch giữa các lần đo dưới 0,2oC và nhiệt độ ban đầu trong
khoảng 38 - 39,8oC.
+ Tiêm tĩnh mạch tai thỏ HTKNR thử nghiệm trong bốn phút.
+ Thể tích: tiêm 1 ml/kg cân nặng. Làm ấm dung dịch đến 38,5oC trước tiêm.
+ Đo nhiệt độ thỏ 1giờ/lần trong ba giờ.
+ Mẫu được coi là đạt yêu cầu về tiêu chuẩn chất gây sốt nếu nhiệt độ chênh
lệch của mỗi thỏ ≤ 0,6oC và tổng nhiệt độ chênh lệch của ba thỏ ≤ 1,3oC.
- Thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test) [9]:
+ Dùng môi trường Thioglycolat để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí.
+ Dùng môi trường SCD để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm.
Mỗi mẫu lấy 10 ml, cấy vào hai loại môi trường, mỗi ống môi trường 1ml cho
đến hết. Cấy xong, các ống môi trường thioglycolat được chia ra để ủ ở hai nhiệt
độ 30 - 35oC và 20 - 25oC, các ống SCD ủ ở 20 - 25oC trong 14 ngày. Các ống
môi trường được theo dõi hàng ngày trong vòng 14 ngày. Sản phẩm được coi là
vô khuẩn khi không có ống môi trường nào bị nhiễm. Trường hợp bị ô nhiễm,
phải làm đồ phiến nhuộm Gram soi kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn hoặc
nấm và nhắc lại thử nghiệm với mẫu lưu. Nếu không bị nhiễm ở lần kiểm tra
thứ hai thì sản phẩm được coi là vô khuẩn. Nếu bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ
hai, dù chỉ một ống có cùng loại vi sinh vật như lần thứ nhất thì loạt sản phẩm
đó không đạt yêu cầu về vô khuẩn, lô thử nghiệm phải huỷ bỏ. Nếu không có
vi khuẩn hoặc vi nấm mọc trên môi trường thích hợp sau 14 ngày là đạt.
- Thử nghiệm xác định hiệu giá (Potency test) [9]:
55
+ Xác định LD50 nọc rắn cạp nia: pha dung dịch nọc rắn gốc bằng cách
cân một lượng nọc rắn, hoà tan nọc bằng NaCl 0,9% để có dung dịch 1000
µg/ml, bảo quản ở 2 - 4oC. Từ dung dịch nọc rắn gốc, pha trong NaCl 0,9% để
có dung dịch nồng độ 250 hoặc 500 µg/ml. Từ dung dịch nọc rắn thử nghiệm
này, pha loãng cách nhau 1,2 hoặc 1,4 lần thành 5 độ liên tiếp, sao cho sau khi
tiêm độ pha loãng thấp nhất chuột phải chết 100% và độ pha loãng cao nhất
chuột phải sống 100%. Pha xong, lắc đều để ở 37oC/30 phút, tránh ánh sáng.
Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột với liều 0,5 ml/con. Mỗi độ pha tiêm 6 chuột. Đọc
kết quả sau 24 - 48 giờ, theo dõi số chuột sống chết trong mỗi độ pha.
Tính kết quả theo công thức Spearman – Karber [9]:
Log LD50 = X0 + d/2 – d x (∑ri/n)
Trong đó:
X0 là Log của độ pha loãng nọc rắn cao nhất, làm chuột chết 100%.
d: Log của bậc pha loãng.
ri: số chuột chết của mỗi độ pha loãng.
n: số chuột được tiêm của mỗi độ pha loãng.
+ Xác định hiệu giá HTKNR: chuẩn bị dung dịch nọc rắn chứa 20 LD50/ml:
từ dung dịch nọc rắn gốc chứa 1000 µg/ml, bảo quản 4oC, pha bằng NaCl
0,9% để có dung dịch 20 LD50/ml. HTKNR thử nghiệm được lựa chọn tối
thiểu 5 mức pha loãng khác nhau, cách nhau liên tiếp 1,2 hoặc 1,4 lần sao cho
sau khi trung hòa với một lượng nọc rắn cố định thì mức pha loãng cao nhất
bảo vệ được 100% số chuột được tiêm và mức thấp nhất sẽ gây chết 100% số
chuột được tiêm. Trung hòa: trong dãy ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống:
2,5 ml dung dịch nọc rắn chứa 20 LD50/ml; một thể tích thay đổi đã lựa chọn
của HTKNR thử nghiệm; một lượng NaCl 0,9% để vừa đủ 5,0 ml mỗi ống.
Lắc nhẹ các ống, trung hòa ở 37oC trong 30 phút, tránh ánh sáng. Tiêm 0,5 ml
vào tĩnh mạch đuôi của mỗi chuột, dùng sáu chuột cho mỗi độ pha. Theo dõi
56
và ghi số chuột chết trong vòng 48 giờ.
Tính liều bảo vệ (ED50) theo công thức Spearman – Karber [9]:
Log ED50 = X0 + d/2 – d x (∑ri/n)
Trong đó:
X0: Log của thể tích huyết thanh ít nhất, bảo vệ được 100% chuột.
d: Log của bậc chênh lệch của các mức thể tích khác nhau.
ri: số chuột chết của mỗi dung dịch trung hòa.
n: số chuột được tiêm dung dịch trung hòa.
Xác định số LD50 trung hòa (nhóm chứng): từ dung dịch nọc rắn chứa
20 LD50/ml pha loãng 1/20; 1/14; 1/10; 1/7; 1/5 bằng NaCl 0,9%. Lắc nhẹ các
ống, trung hòa ở 37oC trong 30 phút, tránh ánh sáng. Tiêm 0,5 ml vào tĩnh
mạch đuôi của mỗi chuột, dùng sáu chuột cho mỗi độ pha. Theo dõi và ghi số
chuột chết trong vòng 48 giờ. Tính số LD50 trung hòa (tính T) như tính LD50
của nọc rắn ở trên.
Xác định hiệu giá theo công thức Spearman – Karber [9]:
Hiệu giá = (T – 1) / ED50
T là số LD50 dùng trung hoà trong một liều tiêm, ED50 là liều bảo vệ 50%.
o Xác định tính chất lý hóa của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2: theo quy trình
của Viện kiểm định quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế.
- Xác định pH.
- Xác định nồng độ NaCl.
- Xác định hàm lượng chất bảo quản merthiolate.
- Định lượng protein toàn phần.
2.2.5. Thời gian, địa điểm nghiên cứu:
57
- Từ 6/2008 đến 11/9/2008: Xây dựng và bảo vệ đề cương nghiên cứu tại
trường Đại học y Hà Nội. Quyết định phê duyệt đề cương số: 997 QĐ/YHN.
- Từ 1/2009 đến 5/2009: Tuyển chọn, lấy nọc rắn cạp nia nam (B.candidus) tại
cơ sở Núi Chúa Kito, Vũng Tàu. Tuyển chọn và lấy nọc rắn cạp nia bắc
(B.multicinctus) tại Lệ Mật, Gia Lâm, Hà Nội. Chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa
giá (bắc + nam) tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai.
- Từ 6/2009 - 4/20010: Nuôi ngựa, miễn dịch, lấy máu ngựa theo dõi sinh
kháng thể đặc hiệu, thực hiện tại xã Thư Phú, huyện Thường Tín, Hà Nội và
Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm dã ngoại Học viện Quân y. Theo dõi hình
thành và hiệu giá kháng thể tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai,
khoa Huyết học – Truyền máu Bệnh viện 103. Lấy máu, truyền trả khối hồng
cầu ngựa tại Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm dã ngoại Học viện Quân y.
- Từ 15/5/2010 - 15/7/2010: Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2. Kiểm định
cơ sở HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tại Đơn vị nghiên cứu huyết thanh kháng
nọc Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai.
- Từ 21/7/2010 - 11/2011: Kiểm định Quốc gia HTKN-RCN đa giá F(ab’)2
thực hiện tại viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế. Định lượng
protein, albumin, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, điện di protein huyết thanh ngựa
nghiên cứu và HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tại Phòng xét nghiệm Miễn dịch,
Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương.
Điện di miễn dịch HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tại viện IMVS, Australia.
Cấy nấm tại khoa Ký sinh trùng và Nấm y học, HVQY.
Cấy khuẩn tại khoa Vi sinh y học Bệnh viện 103 và bệnh viện Bạch Mai.
- 12/2011: Bảo vệ luận án cấp cơ sở.
2.2.6. Xử lý số liệu: theo các thuật toán thống kê.
2.2.7. Sơ đồ nghiên cứu: (trang tiếp theo)
58
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH KHÁNG NỌC
RẮN CẠP NIA ĐA GIÁ F(ab’)2 TỪ HUYẾT TƯƠNG NGỰA
Chế tạo KN (đa giá, giảm độc lực)
an toàn, hiệu lực
Gây mẫn cảm cho ngựa Theo dõi hình thành KT đặc hiệu
Thu huyết tương Truyền trả khối hồng cầu
Tinh chế HTKNR Đánh giá mức độ tinh sạch
59
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN
CẠP NIA ĐA GIÁ F(ab’)2 ĐÁP ỨNG TIÊU CHUẨN VIỆT NAM:
3.1.1. Kết quả chế tạo KN, đánh giá chất lượng KN:
3.1.1.1. Kết quả tuyển chọn và lấy nọc rắn cạp nia:
Bảng 3.1. Kết quả tuyển chọn và lấy nọc rắn cạp nia (bắc + nam).
Lần lấy nọc rắn
B.multicinctus B. candidus Số rắn mỗi lần lấy nọc
Rắn(con)
Nọc(gam)
SLNTB (mg/con)
Rắn(con)
Nọc(gam)
SLNTB (mg/con)
Lần 1 84 0,5 5,9 30 0,3 10 114
Lần 2 130 0,6 4,6 55 0,5 9,0 185
Lần 3 62 0,5 8,0 60 0,7 11,6 122
Cộng 276 1,6 5,79 145 1,5 10,3 421
* Chú thích: SLNTB: số lượng nọc trung bình của một con rắn/lần lấy nọc.
Kiểm định cơ sởXác định mức độ an toàn & hiệu lực
Kiểm định Quốc giaKết luận về mức độ an toàn & hiệu lực của
HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu
Bảo quản, sử dụng
60
- Tổng số rắn lấy nọc cả ba đợt là 421 con, với 276 rắn cạp nia bắc và 145 cạp
nia nam. Đợt thứ nhất lấy nọc 114 con, thu được 0,8 gam nọc. Đợt hai lấy nọc
185 con thu được 1,1 gam nọc. Đợt ba lấy nọc 122 con được 1,2 gam nọc.
- Ba đợt lấy nọc tại Vũng Tàu thu được 1,5 gam nọc rắn cạp nia nam (145 lần
lấy nọc). Nọc rắn cạp nia bắc thu được qua ba đợt lấy nọc tại Lệ Mật (Gia
Lâm, Hà Nội) là 1,6 gam (276 lần lấy).
- Lượng nọc rắn thu được trung bình trong một lần lấy ở một con rắn cạp nia
bắc thấp nhất là 4,6mg, nhiều nhất là 8 mg, trung bình là 5,79 mg/con.
- Lượng nọc trung bình trong một lần lấy ở một con rắn cạp nia nam thấp nhất
là 9 mg, nhiều nhất là 11,6 mg, trung bình là 10,3 mg/con.
3.1.1.2. Khảo sát mức độ thường gặp của các loài rắn độc trong chi rắn cạp
nia (Bungarus) ở Việt Nam:
Bảng 3.2. Đánh giá sơ bộ về mức độ thường gặp của chi RCN ở Việt Nam
Loài rắn
Nơi gặp
Rắn cạp nong
Bungarusfasciatus
Cạp nia nam
Bungaruscandidus
Cạp nia bắcBungarusmulticinctus
RKSHBungarusslowinskii
Cạp nong đầu đỏ
Bungarus flaviceps
Bắc bộ, Trung bộ
(++) (-) (+++) (+) (-)
Nam bộ, nam Trung
bộ
(++) (+++) (-) (-) (-)
* Chú thích: Không gặp: (-). Gặp nhưng số lượng rất ít: (+) .
Thường gặp, số lượng ít: (++). Thường gặp, số lượng nhiều: (+++)
- Khảo sát sơ bộ về mức thường gặp của các loài rắn độc thuộc chi Rắn cạp
nia (Bungarus) tại một số địa phương ở miền Bắc, miền Trung: Lệ Mật (Gia
Lâm, Hà Nội), Phụng Thượng (Phúc Thọ, Hà Nội), Vĩnh Sơn (Vĩnh Tường,
61
Vĩnh Phúc), Cẩm Thủy (Thanh Hóa), Thanh Chương (Nghệ An), Hương Khê
(Hà Tĩnh), Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng,... không gặp Rắn khoang sông Hồng
Bungarus slowinskii, Rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus flaviceps), Rắn cạp nia
nam (Bungarus candidus); chỉ gặp Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus)
và Rắn cạp nong (khúc đen khúc vàng - Bungarus fasciatus).
- Khảo sát tại miền Tây-Nam bộ và Nam Trung-Bộ: Nha Trang (Khánh Hòa),
Trại rắn Đồng Tâm & Bảo tàng rắn Việt Nam (Tiền Giang), Cần Thơ, Bến Tre
và Miền Đông Nam bộ: Bình Phước, Bình Dương, Tây Ninh, Bà Rịa-Vũng
Tàu,...chúng tôi không gặp Rắn cạp nia bắc, Rắn khoang sông Hồng, Rắn cạp
nong đầu đỏ; chỉ gặp Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) và Rắn cạp nong
(Bungarus fasciatus).
3.1.1.3. Kết quả chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực:
Bảng 3.3. Thể tích KN và lượng nọc tương ứng được khử độc.
Loại lọ
KN
Thể tích KN & lượng nọc được khử độc
0,1 ml
0,3 ml
0,5 ml
1 ml
2 ml
3 ml
4 ml
5 ml
6 ml
Số mg nọc/lọ ≈ 1,1 3,3 5,5 11 22 33 44 55 66
Số lọ KN 12 12 12 22 12 12 12 12 12
Thể tích (ml)
∑ = 272,8 ml1,2 3,6 6 22 24 36 48 60 72
- Thể tích kháng nguyên sau khi lọc vô trùng là 272,8 ml.
- Số nọc rắn cạp nia (bắc và nam) đã dùng chế tạo kháng nguyên là ba gam
62
(3000 mg), như vậy: trong 1 ml kháng nguyên có 3000 mg: 272,8 = 10,997
mg nọc (≈ 11mg/ml).
- Đã đóng lọ kháng nguyên với chín loại thể tích, ba loại lọ thể tích từ 0,1 đến
0,3 ml/lọ và sáu loại lọ thể tích từ 1 đến 6 ml/lọ, tương đương 12 liều kháng
nguyên.
- Liều tiêm thấp nhất đã dùng là 0,1 ml chứa 1,1 mg (1100 µg) nọc rắn cạp nia
đa giá. Đã dùng tiêm cho ngựa 320 kg, tức là 1100 µg : 320 kg = ~ 3,4 µg
nọc/kg trọng lượng ngựa.
- Đã tiêm liều cao nhất với lọ 6 ml, chứa lượng kháng nguyên bằng 60 lần liều
thấp nhất (0,1 ml), với lượng nọc rắn cạp nia đa giá là: 60 x 3,4 = 204 µg
nọc/kg trọng lượng ngựa (= 11,3 µg/gam).
3.1.1.4. Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên:
Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm an toàn chung với kháng nguyên.
ChuộtTN
Trọng lượng(gam)
Số ml KN
đã sử dụng
Số mg nọc
trong KN
Thay đổi của chuột NC Trọng lượng tăng thêm (gam)
Vận động
Hình thái
Trọng lượng (gam)
1 230 2,3 25,3 Bt Bt 240 10
2 235 2,35 25,8 Bt Bt 250 15
3 250 2,5 27.5 Bt Bt 260 10
4 245 0,0 0 Bt Bt 255 10
* Chú thích: Bt = bình thường.
- Trọng lượng chuột lang từ 230 gam đến 245 gam.
63
- Đã tiêm liều lượng 1 ml kháng nguyên /100 gam cân nặng cho chột lang, với
tổng liều tiêm chuột số 1: 2,3 ml; chuột lang số 2: 2,35 ml; chuột lang số 3:
2,5 ml; chuột lang số 4 là chuột chứng nên không tiêm.
- Theo bảng 3.3, 1 ml kháng nguyên có 11 mg nọc; vậy số lượng nọc rắn được
khử độc khi tiêm kháng nguyên với chuột lang số 1 là 11 x 2,3 = 25,3 mg; với
chuột số 2 là 11 x 2,35 = 25,8 mg; với chuột số 3 là 11 x 2,5 = 27,5 mg.
- Cả ba chuột lang số 1,2,3 đều sống và hoạt động bình thường, không thay
đổi hình thái, không bị rụng lông, tăng trọng từ 10 đến 15 gam giống như
chuột chứng (chuột số 4).
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm chí nhiệt tố với kháng nguyên.
ThỏTN
Trọng lượng(kg)
KN(ml)
Số lượng nọc(mg)
Nhiệt độ trước/sau tiêm KN(oC)Thay đổinhiệt độcao nhấtKhởi
đầuSau
1 giờSau
2 giờSau
3 giờ
1 2,1 2,1 23,1 38,5 38,9 39,0 38,5 0,5oC
2 2, 3 2,3 25,3 39,1 39,8 39,2 39,1 0,7 oC
3 2,2 2,2 24,2 39,3 39,5 39,8 39,3 0,5 oC
- Trọng lượng thỏ thí nghiệm từ 2,1 đến 2,3 kg. Tiêm liều 1 ml/kg, vậy số
lượng kháng nguyên tiêm cho thỏ số 1 là 2,1 ml; thỏ số 2 là 2,3 ml; thỏ số 3 là
2,2 ml. Theo bảng 3.3, 1 ml kháng nguyên có 11 mg nọc; vậy số lượng nọc
rắn cạp nia đa giá tương ứng số lượng kháng nguyên dùng cho thỏ thứ nhất là:
64
11 x 2,1 = 23,1 mg; thỏ thứ hai là 11 x 2,3 = 25,3 mg; thỏ thứ ba là 11 x 2,2 =
24,2 mg.
- Trong 01 ml kháng nguyên có 11 mg (11.000 µg) nọc rắn cạp nia đa giá
(bảng 3.3), tức là 11 µg nọc/gam trọng lượng thỏ (11.000 µg/1000 gam).
- Nhiệt độ ban đầu khi chưa tiêm kháng nguyên ở thỏ số 1 là 38,5oC ; thỏ số 2
là 39,1oC; thỏ số 3 là 39,3 oC: chênh nhau dưới 1oC.
- Sau tiêm KN 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ: ở cả ba thỏ thí nghiệm nhiệt độ thay đổi
dưới 1oC (từ 0,5 – 0,7oC). Thay đổi nhiệt độ ở thỏ số 1 là 0,5oC; thỏ số 2 là
0,7oC; thỏ số 3 là 0,5 oC. Cả ba thỏ nghiên cứu không bị ốm, bị chết.
Bảng 3.6. Kết quả cấy khuẩn, cấy nấm với kháng nguyên.
Môi trường Sabouraud (37oC) Môi trường Thioglycolate (20-25oC)
Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
- Dùng dung dịch kháng nguyên cấy vào môi trường Sabouraud, điều kiện
nhiệt độ tối ưu (37oC); quan sát tại các thời điểm: ngày thứ 3, ngày thứ 7,
ngày thứ 14: không thấy mọc vi nấm.
- Dùng dung dịch kháng nguyên cấy vào môi trường Thioglycolate, nhiệt độ
20 - 25oC, quan sát sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày: không thấy mọc vi khuẩn.
- Kết quả cấy khuẩn cấy nấm với kháng nguyên nọc rắn nghiên cứu chế tạo,
thấy không mọc vi khuẩn, vi nấm.
65
Ảnh 3.1: Nọc rắn cạp nia đông khô.
3.1.2. Kết quả gây mẫn cảm ngựa và theo dõi đáp ứng miễn dịch:
3.1.2.1. Liều lượng kháng nguyên, tá dược gây mẫn cảm ngựa:
Bảng 3.7. Liều lượng KN nọc rắn cạp nia đa giá và tá dược đã sử dụng.
Lần mẫn cảm
Liều lượng
Lần
1
Lần
2
Lần
3
Lần
4
Lần
5
Lần
6
Lần
7
Lần
8
Lần
9
Kháng nguyên (ml)
∑ = 21,9 ml0,1 0,3 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Nọc rắn (mg)
∑ = 232 mg1,1 3,3 5,5 11 22 33 44 55 66
66
Tá dược CFA (ml)
∑ = 0,9 ml0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 0
Tá dược IFA (ml)
∑ = 21 ml0 0 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
KN + tá dược (ml)
∑ = 33,8 ml0,2 0,6 1 2 4 6 8 10 12
Số vị trí tiêm
∑ = 51 1 3 5 2 4 6 8 10 12
- Số lần gây mẫn cảm là chín lần, cách nhau một tháng/lần.
- Tổng cộng số lượng kháng nguyên dùng gây mẫn cảm cho ngựa chín lần là
21,9 ml.
- Số lượng nọc rắn cạp nia đa giá dùng gây mẫn cảm chín lần là 232 mg.
- Lượng tá dược Freund’s hoàn toàn (CFA) đã sử dụng là 0,9 ml với ba lần sử
dụng, mỗi lần cách nhau một tháng.
- Lượng tá dược Freund’s không hoàn toàn (IFA) đã dùng là 21 ml, với sáu
lần sử dụng, mỗi lần cách nhau một tháng.
- Tổng số kháng nguyên và tá dược đã dùng là 33,8 ml; tỷ lệ kháng nguyên /tá
dược là 50/50.
- Tổng số mũi tiêm đã gây mẫn cảm là 51 mũi; lần tiêm gây mẫn cảm ít nhất
là 01 mũi; lần tiêm nhiều nhất là 12 mũi.
- Theo bảng 3.3, 1 ml kháng nguyên có 11 mg nọc; vậy liều kháng nguyên tối
thiểu (0,1 ml) chứa 1,1 mg nọc rắn cạp nia đa giá và liều kháng nguyên tối đa
(6 ml) chứa: 11 x 6 = 66 mg.
67
Ảnh 3.2: Kháng nguyên.
3.1.2.2. Kết quả theo dõi sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm:
Bảng 3.8. Các thay đổi về sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm.
Lầ
ngâ
y
mẫn
cảm
Ngựa 1 Ngựa 2
Toàn thân
Tại
chỗ
Toàn thân
Tại
chỗVận
động
Hô
hấpTiêu hóa
Vận
động
Hô
hấp
Tiêu
hóa
1Yếu,
bạibt
Bỏ ăn,
ăn kémbt
Yếu,
bạibt
Bỏ ăn,
ăn kémbt
2 Yếu,
bạibt Bỏ ăn,
ăn kém
Loét
da
Yếu,
bạibt Bỏ ăn,
ăn kém
Loét
da
68
3Yếu,
bạibt
Bỏ ăn,
ăn kém
Loét
da
Yếu,
bạibt
Bỏ ăn,
ăn kém
Loét
da
4 bt bt bt bt bt bt bt bt
5 bt bt bt bt bt bt bt bt
6 bt bt bt bt bt bt bt bt
7 bt bt bt bt bt bt bt bt
8 bt bt bt bt bt bt bt bt
9 bt bt bt bt bt bt bt bt
* Chú thích: bt = bình thường.
- Ba lần đầu với liều khởi động hệ miễn dịch, cả hai ngựa xuất hiện yếu bại,
hạn chế vận động, ngựa mệt mỏi, bỏ ăn hoặc ăn kém vài ba ngày, loét da xuất
hiện tại chỗ tiêm.
69
Ảnh 3.3: Sẹo và vết loét sau tiêm KN+tá dược CFA.
- Sau tiêm kháng nguyên và tá dược tá dược Freund’s hoàn toàn (CFA) gây
mẫn cảm lần thứ nhất (một điểm tiêm): tại chỗ tiêm tấy đỏ, sau đó hình thành
một vết loét đường kính khoảng 2 - 4 cm.
- Gây mẫn cảm lần thứ hai (tiêm ba vị trí) và lần thứ ba (tiêm năm vị trí): tại
chỗ tiêm sưng tấy đỏ, hình thành các vết loét lớn có đường kính khoảng 5 - 10
cm, chảy dịch, tạo mủ viêm.
- Gây mẫn cảm lần thứ bốn đến lần thứ chín với kháng nguyên + tá dược
Freund’s không hoàn toàn (IFA), sức khỏe ngựa bình thường; toàn thân và tại
chỗ không có biểu hiện giống như khi tiêm kháng nguyên và tá dược Freund’s
hoàn toàn (CFA).
70
3.1.2.3. Hiệu giá kháng thể kháng nọc RCN sau mỗi lần gây mẫn cảm:
Bảng 3.9. Kết quả hiệu giá KT đặc hiệu kháng nọc RCN sau gây mẫn cảm.
Ngựa NC
Hiệu giá kháng thể sau mỗi lần gây mẫn cảm
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 4
Lần 5
Lần 6
Lần 7
Lần 8
Lần 9
Ngựa
số 11/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/2048 1/2048
Ngựa
số 2 1/8 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/2048
- Sau gây mẫn cảm tháng đầu tiên, xuất hiện kháng thể đặc hiệu kháng nọc
rắn cạp nia đa giá ở cả hai ngựa thí nghiệm, với hiệu giá là 1/8.
- Sau tháng thứ hai, ngựa số 2 có hiệu giá kháng thể 1/32 và ngựa số 1 là 1/16.
- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ ba ở ngựa số 1 là 1/32; ở ngựa
số 2 là 1/64.
- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ tư ở ngựa số 1 là 1/64; ở ngựa
số 2 là 1/128.
- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ năm ở ngựa số 1 là 1/128; ở
ngựa số 2 là 1/256.
- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ sáu ở ngựa số 1 là 1/256; ở
ngựa số 2 là 1/512.
- Hiệu giá kháng thể sau gây mẫn cảm lần thứ bảy ở ngựa số 1 là 1/512; ở
ngựa số 2 là 1/1024.
71
- Sau gây mẫn cảm lần thứ tám và lần thứ chín: hiệu giá kháng thể ở cả hai
ngựa nghiên cứu đạt mức cao nhất, ổn định, với hiệu giá 1/2048.
Lần 1Lần 2
Lần 3Lần 4
Lần 5Lần 6
Lần 7Lần 8
Lần 90
500
1000
1500
2000
2500
8 16 32 64128
256
512
2048 2048
Ngựa 1 Ngựa 2
Biểu đồ 3.1. Đáp ứng miễn dịch ở ngựa trong quá trình gây mẫn cảm.
3.1.2.4. Xác định kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên nọc RCN đa giá:
- Xác định sự hình thành kháng thể kháng nọc rắn cạp nia bằng thử nghiệm
Ouchterlony. Sử dụng kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá gây mẫn cảm cho
ngựa và huyết thanh ngựa sau gây mẫn cảm để thử nghiệm.
- Kết quả cho thấy: xuất hiện các vết tủa trên thạch agarose 1,5% giữa vị trí
trung tâm có kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá và các vị trí xung quanh có
huyết thanh ngựa (hình 3.2).
72
Ảnh 3.4: Vết tủa KN-KT trên thạch agarose 1,5% (Ouchterlony test).
- Kết quả điện di miễn dịch huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia nghiên cứu
với nọc Rắn cạp nia Bungarus candidus, thấy các vạch tủa KN - KT xuất hiện
rất rõ (hình 3.3).
Ảnh 3.5: Xác định KT đặc hiệu với KN nọc RCN bằng điện di miễn dịch.
73
3.1.3. Kết quả lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối hồng cầu:
Bảng 3.10. Khối lượng máu, huyết tương và khối hồng cầu thu được.
Số lượng
Ngựa NC Máu ngựa
(lít)Huyết tương
(lít)Khối hồng cầu
(lít)
Ngựa 1Lần 1 3,6 2,2 1,4
Lần 2 5,1 3,1 2,0
Ngựa 2Lần 1 2,3 1,4 0,9
Lần 2 5,5 3,3 2,2
Cộng cả 2 lần 16,5 10,0 6,5
-Mỗi ngựa nghiên cứu đã được lấy máu hai lần: ngựa số 1 lấy được 8,7 lít.
ngựa số 2 lấy được 7,8 lít.
-Cả hai ngựa với tổng cộng bốn lần lấy máu thu được 16,5 lít máu.
-Từ số máu trên tách được 10 lít huyết tương và 6,5 lít khối hồng cầu.
-Lần lấy máu đợt một ở cả hai ngựa nghiên cứu đã thu được 5,9 lít máu. Lần
lấy máu đợt hai thu được 10,6 lít.
-Số lượng huyết tương thu được ở cả hai ngựa trong lần lấy máu thứ nhất là
3,6 lít và lần lấy máu thứ hai là 6,4 lít.
-Số lượng huyết tương thu được của ngựa thứ nhất là 5,3 lít với hai lần lấy
máu; số lượng huyết tương thu được của ngựa thứ hai là 4,7 lít.
-Số lượng khối hồng cầu đã truyền trả lại cho ngựa sau bốn lần lấy máu là 6,5
lít. Ngựa số 1 đã truyền trả lại 3,4 lít; ngựa số 2 đã truyền trả lại 7,8 lít.
Bảng 3.11. Lượng máu lấy và phản ứng của ngựa trong khi lấy máu.
74
Số lượng máu lấy (lít)Biểu hiện của ngựa
Bình thường Choáng nhẹ Shock
Ngựa 1Lần 1 3,6 X X
Lần 2 5,1 X X
Ngựa 2Lần 1 2,3 X
Lần 2 5,5 X X X
* Chú thích:- Bình thường: không có biểu hiện bất thường khi lấy máu.
- Choáng nhẹ: ngựa thở nhanh, bồn chồn, đứng không yên, hí, lắc đầu dữ dội.
- Shock mất máu: ngựa thở dồn, dãy dụa, mồ hôi chảy ròng ròng, mắt trợn
ngược, đái ỉa tự động, chân khuỵu xuống.
- Lấy máu bốn lần ở hai ngựa.
- Ngựa số 1:
+ Lấy lần thứ nhất 3,6 lít, ngựa an toàn, có biểu hiện choáng nhẹ khi lấy máu.
+ Lấy lần thứ hai 5,1 lít máu: ngựa an toàn, có biểu hiện choáng nhẹ.
- Ngựa số 2:
+ Lấy máu lần thứ nhất: 2,3 lít, ngựa hoàn toàn bình thường.
+ Lấy máu lần thứ hai: 5,5 lít, ngựa choáng, sốc mất máu.
- Khi khối lượng máu lấy đến 3,5 lít, ngựa không có biểu hiện gì.
Khi lấy lượng máu từ 3,6 --> 5,4 lít: cả ba lần hai ngựa đều có biểu hiện
choáng nhẹ: thở nhanh, bồn chồn, đứng không yên, hí, lắc đầu...
Khi lấy > 5,5 lít đã xảy ra shock mất máu. Do xử trí không kịp thời, ngựa số 2
đã tử vong.
3.1.4. Kết quả tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2:
75
3.1.4.1. Cắt Fc bằng pepsin, tủa protein không phải KT bằng ammonium
sulphate 14%; lọc bỏ tủa bằng giấy lọc Whatman, thu dịch lọc có F(ab’)2:
Bảng 3.12. Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 thu được.
Chỉ số NC
Lô NC
Huyết tương đưa
vào sản xuất (ml)
Dịch lọc
thu được
có KT (ml)
Tỷ lệ dịch lọc thu
được/huyết tương sx
(%)
Lô 1 3600 2900 80,6%
Lô 2 6400 5140 80,3%
Cộng : 10.000 8040 80,4%
Lô 1 Lô 2 Cộng0
2000
4000
6000
8000
10000
3600
6400
10000
2900
5140
8040
HT đưa vào sản xuất Dịch lọc thu được có KT
Biểu đồ 3.2. Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 trong 2 lần tinh chế.
- Lần tinh chế thứ nhất (lô 1): lấy máu lần đầu ở hai ngựa nghiên cứu tách từ
76
5,9 lít máu ngựa (bảng 3.11) được 3,6 lít huyết tương.
- Lần tinh chế thứ hai (lô 2): lấy máu lần hai ở hai ngựa thu được 10,6 lít máu
(bảng 3.11), tách được 6,4 lít huyết tương.
- Tổng lượng huyết tương đưa vào sản xuất là 10 lít, khi cắt Fc, tủa
ammonium sulphate 14%; lọc bỏ tủa bằng giấy lọc Whatman, thu dịch lọc có
F(ab’)2: số dịch lọc cả thu được là 8,04 lit (lô thứ nhất thu được 2,9 lít; lô thứ
hai thu được 5,140 lít).
- Tỷ lệ thu lại dịch lọc chứa kháng thể kháng nọc RCN đa giá ở lô thứ nhất là
80,6%; ở lô thứ hai là 80,3%; cả hai lô là 80,4%.
3.1.4.2. Tủa F(ab’)2 với ammonium sulphate 22%, lọc thu tủa bằng giấy lọc
Whatman, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2.
Bảng 3.13. Lượng tủa có F(ab’)2 thu được.
Chỉ số NC
Lô NC
Dịch lọc có chứa F(ab’)2
(ml)
Lượng tủa có F(ab’)2
thu được (gam)
Lô 1 2900 210
Lô 2 5140 395
Cộng 2 lần tinh chế 8040 605
- Lần tinh chế thứ nhất (Lô 1): 2900 ml dịch lọc sau khi tủa phân đoạn với
ammonium sulphate 22%, lọc thu tủa chứa F(ab’)2 đặc hiệu chống nọc RCN ở
nhiệt độ 20oC, pH 6,8/60’; thu được 210g tủa lẫn muối ammonium sulphate.
- Lần tinh chế thứ hai (Lô 2): 5140 ml dịch lọc sau tủa phân đoạn như lần
đầu, thu được 395g tủa.
- Tổng cộng cả hai lần tủa 8040 ml dịch lọc chứa kháng thể đặc hiệu kháng
nọc rắn cạp nia đa giá, thu được 605 gam tủa kháng thể dạng F(ab’)2 lẫn muối
77
ammonium sulphate.
Bảng 3.14. Lượng dịch thẩm tích và HTKN-RCN đa giá bán thành phẩm.
Chỉ số N/CLô N/C
Dịch thẩm tích (ml)
HTKN-RCN bán thành phẩm (ml)
Lượng dịch thẩm tích bị hao hụt (ml)
Lô 1 190 165 25 (13,1%)
Lô 2 510 485 25 (5,2%)
∑ 2 lần tinh chế 700 650 50 (7,7%)
Lô 1 Lô 2 Tổng 2 lần0
200
400
600
800
190
510
700
165
485
650
Dịch thẩm tích HTKN-RCN bán thành phẩm
Biểu đồ 3.3. Lượng dịch thẩm tích và HTKNR đa giá F(ab’)2 thu được.
- Sau khi làm khô tủa chứa F(ab’)2 đặc hiệu gắn với ammonium sulphate;
thẩm tích với nước cất cho đến khi sạch muối ammonium sulphate, lô thứ
78
nhất thu được 190 ml, lô thứ hai thu được 510 ml dịch thẩm tích chứa mảnh
F(ab’)2, cả hai lô là 700 ml HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 dạng bán thành phẩm.
- Lọc vô trùng dịch thẩm tích đã sạch ammonium sulphate bằng máy lọc
Seitz, màng cellulose acetate, đường kính lỗ lọc 0,45 µm và 0,2 µm; lô thứ
nhất thu được 165 ml; lô thứ hai thu được 485ml.
- Hao hụt sau lọc của hai đợt tinh chế là 25 ml, chiếm 7,7% lượng HTKN-
RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất.
Bảng 3.15. Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất.
Tên sản phẩm Đơn vị Thể tích (ml)
Số lượng (lọ)
HTKN-RCN bán thành phẩm Chai 500 ml 650 2
HTKN-RCN F(ab’)2 Lọ 5 ml 650 130
- Tổng số 650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 bán thành phẩm chưa qua kiểm định
chất lượng ở cơ sở sản xuất được đóng vào hai chai vô khuẩn có thể tích 500
ml (chai lô 1: 165 ml và chai lô 2 là 485 ml), bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8oC. Sau
khi trộn lẫn HTKN-RCN bán thành phẩm của hai lần tinh chế, lấy mẫu
HTKNR bán thành phẩm thử nghiệm kiểm định chất lượng cơ sở.
- Số lượng lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất, chưa kiểm định chất
lượng là 130 lọ, thể tích 5 ml/lọ. Sau kiểm định cơ sở có kết quả, đạt yêu cầu,
tiến hành lấy mẫu trong số 130 lọ HTKN-RCN này, gửi kiểm định tại Viện
Kiểm định quốc gia Vắc xin và sinh phẩm y tế, Bộ y tế để đánh giá chất lượng
sản phẩm cấp độ quốc gia.
Bảng 3.16. Nguyên liệu, hóa chất đã sử dụng tinh chế HTKN-RCN đa giá.
79
Tên nguyên liệu, hóa chất Lô I Lô II Cả 2 lần tinh chế
Huyết tương sản xuất (lít) 3,6 6,4 10,0
Pepsin đã sử dụng (gam) 3,6 6,4 100
Ammoni sulfate 14% (gam) 504 896 1400
Ammoni sulfate 22% (gam) 638 1130,8 1768
Lượng tủa có F(ab')2 (gam) 210 495 605
Dịch thẩm tích chứa F(ab’)2 (ml) 190 510 700
HTKN F(ab')2 (ml) 165 485 650
Merthiolat 1% (gam) 36 64 100
- Tinh chế hai đợt, tổng cộng 10 lít huyết tương, thu được 8,04 lít dịch lọc
chứa F(ab')2 kháng nọc RCN đặc hiệu; tủa phân đoạn thu được 605 gam tủa
F(ab')2 lẫn ammonium sulphate, thẩm tích với nước cất, thu được 700 ml dịch
thẩm tích chứa F(ab’)2 đặc hiệu với nọc RCN; lọc vô trùng, thu được HTKN-
RCN đa giá bán thành phẩm dạng F(ab’)2.
- Lượng pepsin dùng tinh chế là 100 gam.
- Lượng ammonium sulphate sử dụng là 3168 gam, bao gồm tất cả quá trình
tinh chế, tủa phân đoạn với ammonium sulphate 14% là 1400 gam và
ammonium sulphate 22% là 1768 gam.
- Lượng chất bảo quản merthiolat (1%) cho vào huyết tương từ đầu giai đoạn
tinh chế của cả hai đợt là 100 gam.
3.1.4.3. Mức độ tinh sạch của sản phẩm:
80
Bảng 3.17. Định lượng protein, albumin, globulin, IgG, IgG, IgM, tỷ lệ A/G.
Xét nghiệmHuyết thanh
ngựa
HTKN-RCN F(ab’)2
Số lượng Tỷ lệ
Protein (g/l) 87,1 49,8 100 %
Albumin (g/l) 28,7 1,4 2,8 %
Globulin (g/l) 58,4 48,4
100% 97,2 %IgG (mg/dl) 865 203
2,141 g/l
≈ 4,4%
IgM (mg/dl) 67,8 8,6
IgA (mg/dl) 6,3 2,5
Tỷ lệ A/G 0,49 0,03
- HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 có lượng protein là 49,8 g/l gồm hai thành phần:
albumin có 1,4 g/l, chiếm 2,8% và globulin là 48,4 g/l (chiếm 97,2%),
globulin là thành phần chủ yếu trong HTKN-RCN đa giá nghiên cứu sản xuất
(48,4/49,8g/l = 97,2%).
- Tỷ lệ A/G = 0,03 cho thấy độ tinh sạch cao của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.
Trước đó, điện di protein huyết thanh ngựa, tỷ lệ A/G = 0,49.
- Trong số 48,4 g/l globulin, định lượng cả IgG, IgA và IgM tổng cộng chỉ có
2,14g/l, chiếm ≈ 4,4%; như vậy phần còn lại là F(ab’)2 chiếm tới 95,6% phần
globulin của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 có số lượng 46,26 gam/lít (48,4 g/l –
2,14 g/l = 46,26 g/l). Nếu tính trên tổng số protein của HTKN-RCN đa giá
nghiên cứu, lượng mảnh F(ab’)2 chiếm tới ≈ 93% (46,26/49,8 = 92,89%).
81
1 2
Ảnh 3.6. So sánh hình ảnh điện di protein huyết thanh ngựa (1) và
HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 (2) trên máy tự động Geni – 0 (Italia) cho thấy:
Hình hai đỉnh rõ rệt của albumin, globulin đã không còn trên điện di HTKN-RCN, chỉ
còn lại hình ảnh thuần nhất một đỉnh tương ứng với dải phân bố albumin - trong khi định
lượng albumin chỉ còn một lượng nhỏ 2,8% - Điều này cho thấy F(ab’)2 chiếm tỷ lệ cao
gần như tuyệt đối.
- Kết quả điện di protein huyết thanh ngựa thấy rất rõ hai đỉnh tương ứng hai
dải phân bố của albumin và globulin huyết thanh. Kết quả điện di protein
HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 chỉ thấy còn một đỉnh thuần nhất, tương ứng với
dải phân bố của albumin huyết thanh (100%).
- Kết quả định lượng protein đã cho biết albumin chỉ có 1,4g (2,8%); lượng
IgM, IgG, IgA là 2,141 g/l (4,3%). Như vậy, phần có trọng lượng phân tử thấp
mà điện di chỉ ra trong khu vực điện di của albumin chính là phần của F(ab’)2.
- Kết quả định lượng albumin, globulin, IgM, IgG, IgA phù hợp với hình ảnh
điện di protein. Đối chiếu với hình ảnh điện di protein huyết thanh ngựa cho
thấy HTKN-RCN F(ab’)2 được tinh chế có độ tinh khiết cao (≈ 93%).
82
Ảnh 3.7: Huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2 nghiên cứu sản xuất.
3.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2:
3.2.1. Kết quả kiểm định cơ sở:
3.2.1.1. Thử nghiệm an toàn (Safety test):
Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm an toàn chung HTKN-RCN trên chuột lang.
TT
Trọng
lượng
(gam)
HTKN
(ml)
Theo dõi chuột thí nghiệm Tăng
trọng
(gam)Hình
thái
Vận
động
Trọng lượng
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3
1 310 3,1 bt bt 320 325 340 +30
2 330 3,3 bt bt 343 350 355 +25
3 350 3,5 bt bt 358 363 370 +20
( bt: bình thường).
83
- Chuột thứ nhất nặng 310 gam, chuột thứ hai nặng 330 gam, chuột thứ ba
nặng 350 gam.
- Lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã dùng cho tứng chuột thí nghiệm lần
lượt là 3,1 ml; 3,3 ml; 3,5 ml.
- Cả ba chuột đều bình thường về hình thái, vận động sau khi được tiêm
HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu.
- Tăng trọng chuột thứ nhất trong ba tuần là 30 gam; chuột thứ hai là 25 gam,
chuột thứ ba là 20 gam: cả ba chuột nghiên cứu đều tăng trọng, phát triển bình
thường; không có chuột bị ốm, chết.
- Kết quả cho thấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu đạt chỉ tiêu an toàn
chung, không có độc tố bất thường.
3.2.1.2. Kết quả thử nghiệm chí nhiệt tố (Pyrogen test):
Bảng 3.19. Xác định chất gây sốt trong HTKN-RCN đa giá bán thành phẩm.
TT
Trọng
lượng
(kg)
Thể tích
HTKNR
(ml)
Nhiệt độ thỏ trước/sau khi tiêm
HTKN-RCN (oC)Nhiệt độ
chênh lệch
(oC)Trước
tiêm
Sau
1 giờ
Sau
2 giờ
Sau
3 giờ
1 2,8 2,8 39,3 39,6 39,8 39,3 + 0,5
2 2,8 2,8 39,4 39,7 39,8 39,4 + 0,4
3 3,0 3,0 39,6 39,8 39,9 39,6 + 0,3
- Thỏ thứ nhất và thỏ thứ hai nặng 2,8 kg; thỏ thứ ba nặng 3,0 kg.
- Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tiêm cho thỏ thứ nhất là 2,8 ml.
- Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tiêm cho thỏ thứ hai là 2,8 ml.
84
- Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 tiêm cho thỏ thứ ba là 3 ml.
- Nhiệt độ hậu môn thỏ thứ nhất trước tiêm HTKN-RCN đa giá là 39,3 oC; thỏ
thứ hai là 39,4 oC; thỏ thứ ba là 39,6 oC.
- Sau tiêm, thay đổi nhiệt độ trong ba giờ liên tiếp ở thỏ thứ nhất là 0,5 oC.
- Sau tiêm, thay đổi nhiệt độ trong ba giờ liên tiếp ở thỏ thứ hai là 0,4 oC.
- Sau tiêm, thay đổi nhiệt độ trong ba giờ liên tiếp ở thỏ thứ ba là 0,3oC.
- Cộng dồn nhiệt độ thay đổi của cả 3 thỏ = 1,2 oC.
- Thay đổi nhiệt độ ba thỏ dưới 1,4oC; điều đó cho thấy HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 đạt tiêu chuẩn không có chất gây sốt.
3.2.1.3. Kết quả thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test):
Bảng 3.20. Kết quả thử nghiệm vô khuẩn của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.
Môi trường Sabouraud (37oC)Môi trường thạch Chocolate,
thạch máu (20oC – 25oC)
Lô HTKN- RCN
Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7
Lô IÂm
tính
Âm
tínhÂm tính
Âm
tính
Âm
tínhÂm tính
Lô IIÂm
tính
Âm
tínhÂm tính
Âm
tính
Âm
tínhÂm tính
- Cấy khuẩn: cấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 trong môi trường thạch
chocolate và môi trường thạch máu sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày đều không thấy
mọc vi khuẩn.
- Cấy nấm: cấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 trong môi trường Sabouraud sau 3
ngày, 7 ngày, 14 ngày thấy không mọc vi nấm.
85
3.2.1.1. Kết quả thử nghiệm xác định công hiệu (Potency test):
3.2.1.1.a. Xác định LD50 của nọc RCN đa giá :
Bảng 3.21. Xác định LD50 của nọc rắn cạp nia đa giá (bắc + nam).
Lô
Nồng độ
nọc
(µg/ml)
Số nọc/
chuột
(µg)
Theo dõi chuột thí nghiệm Tỷ lệ
chuột chết
(%)Chết Sống Tổng số
1 22,50 4,5 8 0 8 100,00
2 15,00 3,00 7 1 8 87,50
3 10,00 2,00 4 4 8 50,00
4 6,66 1,33 1 7 8 12,50
5 4,44 0,88 0 8 8 0,00
6 0 0 0 8 8 0,00
- Pha loãng nọc rắn cạp nia trong NaCl 0,9% với bậc pha loãng = 1,5.
- Số chuột thí nghiệm = 8.
- Thể tích dịch nọc tiêm chuột = 0,2 ml/chuột.
- Nồng độ nọc RCN đa giá pha loãng cao nhất gây chết 100% số chuột thí
nghiệm là 22,5 µg/ml hay 4,5 µg/chuột.
- Nồng độ nọc pha loãng thấp nhất không gây chết chuột nào là 4,44 µg/ml
hay 0,48 µg/chuột.
- Dựa trên kết quả ở bảng 3.21, tính LD50 theo công thức của Karber [27]:
LD50 = LD100 – ∑ Z.d/n
Trong đó:
Z: số trung bình tử vong của 2 nhóm kế cận.
d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.
n: số động vật thử nghiệm trong từng nhóm.
86
Thay số ở bảng 3.21 vào công thức Karber ở trên để tính toán, ta có:
Liều lượng nọc 4,5 3 2 1,33 0,88
Số tử vong 8 7 4 1 0
Z 7,5 5,5 2,5 0,5
d 1,5 1,0 0,67 0,45
d.Z 11,25 5,5 1,675 0,225
∑ d.Z = 18,65 n = 8
LD50 = LD100 – ∑ Z.d/n
= 4,5 – 18,65/8 = 2,17
Ảnh 3.8: Xác định LD50 của nọc rắn cạp nia đa giá (lô 2).
87
3.2.1.1.b. Xác định ED50 của HTKN-RCN đa giá:
Bảng 3.22. Kết quả xác định hiệu giá của HTKNR đa giá F(ab’)2
Loạt TN
HTKN-RCN
(ml)
NaCl 0,9%
(ml)
Nọc RCN 40 LD50
(ml)
Số LD50/ 1 chuột
Tình trạng chuột
Chết Sống Cộng
1 0.000 2.000 0.000 0 0 8 8
2 0.000 1.000 1.000 4 8 0 8
3 0.060 0.940 1.000 4 6 2 8
4 0.070 0.930 1.000 4 4 4 8
5 0.080 0.920 1.000 4 0 8 8
- Khi trộn 1 ml dung dịch nọc RCN đa giá 40 LD50/ml với 1 ml dung dịch
HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 để trung hòa nọc độc, trong 1 ml này đã có lần
lượt là 60, 70, 80 µl HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 pha trong NaCl 0,9% để làm
đủ 1 ml; nồng độ nọc rắn cạp nia đa giá đã bị pha loãng giảm còn một nửa (20
LD50); như vậy: trong thử nghiệm đã dùng liều tiêm tĩnh mạch đuôi chuột 0,2
ml/chuột, liều này tương ứng với hàm lượng nọc là 4 LD50.
- Với liều nọc rắn cạp nia 4 LD50 với chuột nhắt trắng 18 - 20g và không có
HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 bảo vệ, đã gây chết 100% số chuột thí nghiệm.
- Với liều nọc 4 LD50, sau khi được trung hòa bởi 60 µl HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2, chỉ có 6 chuột thí nghiệm trong tổng số 8 con bị chết. Như vậy, liều
HTKN rắn cạp nia đã bảo vệ được 2 chuột thí nghiệm.
- Cũng với liều nọc độc 4 LD50 như trên, sau khi được trung hòa bởi 80 µl
HTKN rắn cạp nia đa giá F(ab’)2, tất cả số chuột thí nghiệm 8 con đều sống.
- Cũng với liều nọc 4 LD50 như trên, sau khi được trung hòa bởi 70 µl HTKN-
88
RCN đa giá F(ab’)2 (lượng HTKNR thấp hơn 10 µl), 50% số chuột thí
nghiệm được bảo vệ.
- Sử dụng 1ml HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 điều trị có thể trung hòa được
57,14 LD50 nọc độc (tức 124 µg nọc). Khi sử dụng một lọ HTKN-RCN 5ml,
sẽ trung hòa được 285,7 LD50 nọc độc hay trung hòa được 620 µg nọc RCN.
- Kết quả kiểm định cơ sở cho thấy: hiệu giá KT của HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 nghiên cứu là: 285,7 LD50 /lọ, trung hòa được 620 µg nọc rắn cạp nia.
3.2.2. Kiểm định Quốc gia về chất lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2:
Bảng 3.23. Kết quả kiểm định Quốc gia về chất lượng chế phẩm nghiên cứu.
TT Tên thử nghiệm Kết quả
1 An toàn chung Đạt
2 Chất gây sốt Đạt
3 Vô khuẩn Đạt
4 Hiệu giá 267,5 LD50/lọ (5ml)
5 NaCl 0,87%
6 pH 7.012
7 Nồng độ Protein 7,43 mg/ml
8 Nồng độ Merthiolate 0 g%
- Kiểm định quốc gia của Viện kiểm đinh quốc gia Vắc xin và sinh phẩm y tế
của Bộ y tế đã đánh giá dựa trên 8 chỉ tiêu về chất lượng HTKN-RCN nghiên
89
cứu sản xuất gồm: an toàn chung, chí nhiệt tố, vô khuẩn, hiệu giá, nồng độ
chất bảo quản merthiolat, nồng độ NaCl, pH, nồng độ protein.
- Kết quả cho thấy: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đạt an toàn chung ở động vật
thí nghiệm, đạt vô khuẩn, không có chí nhiệt tố, có hiệu giá 267,5 LD50/lọ 5
ml; nồng độ NaCl 0,87%; nồng độ chất bảo quản merthiolat là 0 gam%; pH là
7.012; nồng độ protein là 7,43 mg/ml.
3.2.3. Tính khái quát giá thành chế phẩm:
Bảng 3.24. Chi phí cơ bản sản xuất một lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.
Chi phí Số tiền (VN đồng)
Ngựa 20.000.000,00
Công nuôi + thức ăn (10 tháng) 25.000.000,00
Nọc rắn (RCN Nam, RCN Bắc) 20.000.000,00
Hóa chất 20.000.000,00
Điện nước, trang bị 20.000.000,00
Lấy máu + truyền trả khối hồng cầu 4.000.000,00
Tinh chế 01 lô 2.000.000,00
Kiểm định tại cơ sở 4.000.000,00
Kiểm định Quốc gia 10.000.000,00
Xe cộ, chi phí đi lại, vận chuyển ngựa... 20.000.000,00
Công miễn dịch ngựa + lấy máu XN 20.000.000,00
90
Chuồng trại, thú y 10.000.000,00
Cộng 175.000.000,00
- Sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 trong 18 tháng: tuyển chọn rắn và chế
tạo kháng nguyên: 3 tháng; miễn dịch ngựa, theo dõi hình thành kháng thể: 10
tháng, lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu và tinh chế HTKN-
RCN: 2 tháng, kiểm định cơ sở và kiểm định quốc gia: 3 tháng.
- Chi phí cơ bản 175 triệu đồng, thu được 650 ml HTKN-RCN đa giá F(ab’)2,
tương đương 269.000/ml. Đóng lọ 5 ml, giá thành của một lọ HTKN- RCN đa
giá F(ab’)2 khoảng 1.346.000 VNĐ/lọ (chỉ tính nhân công thời vụ).
- Những lần sản xuất sau có giá thành rẻ hơn do các chi phí trước không phải
tính đến (chi mua ngựa, chuồng trại, dụng cụ,..từ trước).
Chương 4
BÀN LUẬN
91
4.1. SẢN XUẤT HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 ĐÁP ỨNG TIÊU CHUẨN
VIỆT NAM (DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM IV, 2009):
Các công đoạn sản xuất gồm: chế tạo kháng nguyên, gây mẫn cảm ngựa
tạo nguồn kháng thể hiệu giá cao, tinh chế HTKNR, kiểm định chất lượng cơ
sở và kiểm định quốc gia. Các công đoạn này đều có thể thực hiện; mỗi công
đoạn đều quan trọng, đòi hỏi phải đạt chất lượng tốt, mục đích cuối cùng cho
ra sản phẩm đạt các chỉ tiêu Dược điển Việt Nam IV yêu cầu.
4.1.1. Chế tạo kháng nguyên:
Khâu quan trọng đầu tiên là chế tạo kháng nguyên, đây là chìa khóa
thành công của quy trình sản xuất HTKNR. Kháng nguyên phải đảm bảo đã
được làm giảm hoặc mất hoàn toàn độc lực nọc rắn, an toàn cho động vật gây
mẫn cảm đồng thời có tính sinh miễn dịch mạnh. Tất cả các khâu trong chế
tạo kháng nguyên đều nhằm phục vụ mục đích này.
Để chế tạo được kháng nguyên, phải có nguyên liệu là nọc rắn, đảm bảo
chất lượng và số lượng. Bảng 3.1 cho thấy, việc tuyển chọn rắn đã đạt yêu
cầu: chính xác, lấy đủ số lượng, đảm bảo chất lượng nọc, an toàn tuyệt đối .
Do tính đặc hiệu của nọc rắn theo vùng địa lý, phải lấy được nọc rắn cạp nia ở
khắp các vùng miền, đại diện cho quần thể rắn cạp nia trong cả nước, đây là
yêu cầu quan trọng, có tác dụng làm tăng tính hiệu lực của HTKN-RCN đa
giá sau khi được sản xuất. Ngoài tuyển chọn rắn đúng chủng loài, phải tiến
hành lấy nọc nhiều lần để có đủ số lượng cần thiết. Lượng nọc của rắn cạp nia
rất ít so với rắn hổ mang, rắn choàm quoạp, rắn hổ chúa... nên qua sáu lần lấy,
số nọc của 276 con rắn cạp nia bắc chỉ được 1,6 gam; của 145 con rắn cạp nia
nam chỉ được 1,5 gam, như vậy: rắn cạp nia nam có thể cho nọc nhiều hơn so
với mỗi con rắn cạp nia bắc. Lượng nọc của một rắn cạp nia có thể lấy được
khoảng từ 4,6 – 11,6 mg. Kết quả này tương tự thông báo của một số tác giả
92
khác, cho rằng số lượng nọc rắn cạp nia mỗi lần cắn vào khoảng 4,6 mg –
18,4 mg [162]. Số lượng nọc rắn cạp nia bằng 1/5 - 1/10 các loài rắn khác,
đây là điểm khó khăn cho nghiên cứu. Số lượng nọc rắn mỗi con liên quan
đến nhiều yếu tố: kích thước, trọng lượng, tuổi rắn, rắn đã ăn bao lâu...Tuy
vậy, khó có thể biết được trước con rắn sắp lấy nọc có nhiều hay ít nọc.
Ngoài đảm bảo đủ về số lượng, phải đảm chất lượng nọc rắn. Nọc phải
sạch, không lẫn máu, độc tính nọc và các thành phần được giữ nguyên [20],
[21]. Tuân thủ các hướng dẫn của WHO, nhóm nghiên cứu đã mua và thu
nhận rắn lấy nọc từ tự nhiên, sử dụng chuồng trại nuôi đúng quy cách theo tập
tính loài rắn, nuôi nhốt hàng tháng để loại trừ rắn bệnh...Do nanh độc của rắn
cạp nia rất nhỏ, khi lấy nọc phải quan sát rất nhanh, đưa dụng cụ vô trùng
đúng vào vị trí nanh độc, tránh xây xước, chảy máu lẫn vào nọc rắn, làm giảm
chất lượng nọc. Với các loài rắn độc khác có nanh độc to hơn, khi lấy nọc, có
thể cho rắn ngoạm vào một màng polyten mỏng bịt kín miệng ống đựng nọc
vô trùng, tẩm sẵn chất sát trùng, để sát trùng nanh độc. Nọc rắn cạp nia sau
khi lấy được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, bảo quản ở nhiệt độ lạnh, sau
đó tiến hành đông khô nọc để không làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của
nọc rắn. Nọc rắn khô có chứa chủ yếu là protein (70 - 90%) và một lượng nhỏ
chất vô cơ, polypeptide, nucleotide, carbonhydrates, chất béo và các amin.
Các thành phần protein bao gồm: các enzyme và protein không phải enzyme.
Nọc rắn đông khô bảo quản ở - 20oC giữ được độc tính nọc 15 – 20 năm, hầu
như không thay đổi so với ban đầu.
Việc đảm bảo tuyệt đối an toàn trong quá trình làm việc với rắn và nọc
rắn là một đòi hỏi nghiêm ngặt, đã được tuân thủ ngay từ đầu. Trong thực tế,
nhiều người bắt rắn, buôn bán rắn, thậm chí là nhà khoa học về rắn - đã tử
vong do bất cẩn. Thí dụ, tiến sĩ Joseph Bruno Slowinski (1963 - 2001), người
Mỹ đã chết tại Mianma khi bắt một con rắn cạp nia bắc (Bungarus
93
multicinctus). Tên ông đã được đặt cho loài rắn “khúc đen, khúc trắng” tìm
thấy tại lưu vực sông Hồng, đó là rắn khoang sông Hồng hay còn gọi là rắn
khoang Bungarus slowinki [158]. Trước khi lấy nọc rắn, phải chuẩn bị tốt về
sức khỏe, kiến thức về đặc tính loài rắn, hiểu rõ về cấu trúc, vị trí răng độc,
cách giữ đầu rắn đuôi rắn, cách phối hợp thao tác khi lấy nọc... Dụng cụ lấy
nọc: gậy bắt rắn, túi lưới, bàn lấy nọc, ủng, găng tay... được chuẩn bị đầy đủ.
Người lấy nọc luôn tỉnh táo đề phòng rắn cắn trong lúc thao tác kỹ thuật và
tuyệt đối không để nọc rắn dính vào tay.
Cho đến nay, do không có cơ sở cung cấp nọc rắn chuẩn Việt Nam, nên
việc chủ động tuyển chọn, nuôi và lấy nọc rắn vẫn là vấn đề đặt ra cho người
nghiên cứu.
Để sản xuất HTKNR đa giá có kết quả tốt, hiệu lực mạnh, thường sản xuất
kháng nguyên lấy từ các loài rắn độc cùng họ (họ rắn hổ Elapidae, họ rắn lục
Vipridae...), cùng chi (chi Naja, chi Bungarus...). Việc khảo sát sự phân bố,
mức độ thường gặp của các loài rắn khác trong chi rắn cạp nia là rất có giá trị,
giúp định hướng sản xuất HTKNR đa giá cho những loài rắn nào thường gặp,
nguy hiểm nhất. Mặc dù đây không phải là nghiên cứu dịch tễ học với những
số liệu thống kê lớn, chỉ là một số khảo sát sơ bộ, số liệu hạn chế, xong cũng
đã nói lên được nhiều điều (Bảng 3.2).
Thứ nhất, trong các loài rắn khoang chi rắn cạp nia (Bungarus) Việt Nam,
rắn cạp nia nam (B.candidus), rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) và rắn khoang
sông Hồng (B.slowinkii) là ba loài rắn “khúc đen, khúc trắng” có trong tự
nhiên. Khắp Việt Nam, khi hỏi về rắn khúc đen khúc trắng rất nhiều người
biết. Việc dễ dàng sưu tầm và tuyển chọn những loài rắn này cho nghiên cứu
là bằng chứng cho thấy sự thường gặp của chúng. Người ta thường khó phân
biệt các loài rắn nói trên ngoài việc chỉ xác định chúng là “rắn khúc đen, khúc
trắng” mà thôi.
94
Thứ hai, chỉ có hai loài rắn cạp nia bắc và rắn cạp nia nam là thường gặp
trong ba loài “rắn đen - trắng” trên. Với rắn khoang sông Hồng (Bungarus
slowinskii), do dễ nhầm với rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), khi
tuyển chọn rắn cạp nia đã được lưu ý để loại khỏi nhóm nghiên cứu. Loài này
có khúc đen, khúc trắng với khoang trắng hẹp hơn khoang đen, đầu và thân có
vạch trắng hình chữ V là điểm chủ yếu phân biệt với rắn cạp nia bắc, nam
[175]. Tuy nhiên, trong thời gian khảo sát, đã không gặp loài rắn này trong cả
quá trình nghiên cứu.
Thứ ba, hầu như khi tuyển chọn rắn cạp nia tại miền Bắc, rắn cạp nia
nam (Bungarus candidus) đã không được phát hiện thấy. Ngược lại, khi tuyển
chọn rắn cạp nia ở các tỉnh miền Nam, rắn cạp nia bắc (Bungarus
multicinctus) cũng không thấy. Kết quả này hiện có vẻ phù hợp với thông tin
trong các nghiên cứu của Hà Trần Hưng, Nguyễn Thị Dụ, Jonas Höjer, Trịnh
Xuân Kiếm 2009 - 2010 [71],[72] về rắn cạp nia bắc và các nghiên cứu của
Trịnh Kim Ảnh, Trịnh Xuân Kiếm (2001) [6], Trịnh Xuân Kiếm, Lê Khắc
Quyến, Trịnh Xuân Long, David A. Warrell (2010) [88] về rắn cạp nia nam.
Các loài rắn cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus
flavicep) có nọc độc song hiếm gặp. Kết quả sơ bộ khảo sát về phân bố các
loài rắn trong chi rắn cạp nia cần được tiếp tục bổ sung. Kết quả này phù hợp
với thông báo của các tác giả Trần Kiên, Nguyễn Quốc Thắng (1995)[24],
Nguyễn Quang Trường, Nguyễn Thiên Tạo (2011)[39].
Mặc dù tiêm nọc rắn chưa biến đổi hoặc chưa tác động để làm mất độc
lực có thể tạo ra kháng thể đặc hiệu tốt hơn ở động vật gây mẫn cảm nhưng
lại tạo ra các nghiêm hiểm cho động vật, điều này khiến việc sử dụng nọc
nguyên chất đã không được khuyến khích. Từ năm 1894, nhiều phương pháp
chuẩn bị nọc độc được đề xuất làm giảm độc tính và bảo đảm tính chất kháng
nguyên. Giải độc có thể thu được kết quả với các phương pháp khác nhau: xử
95
lý bằng nhiệt, hypochlorite, xà phòng, hỗn hợp với lipoids, hydrogen
peroxide, bức xạ ion hóa và một số phương pháp khác [101]. Tuy nhiên,
không có phương pháp nào trong số này có hiệu quả hoàn hảo. Phức hợp của
nọc độc và formalin tạo thành anavenin là phương pháp tốt nhất vẫn được sử
dụng cho đến ngày nay, điển hình như aldehyde (glutaraldehyde) [70]. Tannin
cũng đã được sử dụng nhưng hạn chế của formalin hoặc tannin là có thể được
đào thải ra khỏi anavenin (Chippaux JP, Goiffon M, 1998) [55].
Kháng nguyên chế tạo đạt thử nghiệm về an toàn chung (Bảng 3.4),
không có chất gây sốt (Bảng 3.5) và vô khuẩn (Bảng 3.6). Thử nghiệm tiến
hành trên các động vật nghiên cứu nhạy cảm cao với độc tố, chất gây sốt là
chuột lang Cobaye, thỏ và được cấy khuẩn, cấy nấm trong các môi trường và
nhiệt độ tối thích. Đây là yêu cầu bắt buộc trước khi tiến hành chính thức gây
mẫn cảm cho ngựa sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn. Với loại độc tố nọc
rắn có độc lực rất mạnh với sinap thần kinh - cơ như nọc rắn cạp nia, chế tạo
kháng nguyên nếu không an toàn, có thể gây chết ngựa, gây tổn thất kinh tế,
mất thời gian và tốn kém cho nghiên cứu. Liều 1ml/100g cân nặng, tức 110
µg/gam đã được sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 3.3). Liều này cao gấp 733
lần LD50 của rắn cạp nia bắc (0,15 µg/gam chuột, theo Steven D. et al., 1999)
[131] và cao gấp 1100 lần LD50 rắn cạp nia nam (0,1 µg/gam chuột, theo Tan
N.H et al., 2004) [135]. Như vậy, nếu không khử độc, chuột thí nghiệm chắc
chắn tử vong. - Theo Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9] thử nghiệm an toàn có
thể dùng tối đa dưới 5 ml sinh phẩm tiêm phúc mạc chuột lang, ở nghiên cứu
này, lượng kháng nguyên sử dụng nhiều nhất là 2,5ml.
Có nhiều phương pháp khử độc, bất hoạt độc tính nọc rắn nhưng chúng
tôi chọn phương pháp dùng glutaraldehyde (WHO, 2008) [151] phương pháp
này được Trịnh Xuân Kiếm bổ sung và sử dụng thường xuyên trong khử độc
nọc rắn hổ mang, hổ đất, hổ chúa, choàm quạp... cho kết quả tốt, làm mất độc
96
tính nọc mà vẫn giữ nguyên được tính kháng nguyên [21],[23]. Phương pháp
này được nhiều tác giả sử dụng (Huang R.J., et al., 1986 [76], Rogero J.R.,
Nasimento N., 1995 [122]). Nọc rắn cạp nia sau quá trình khử độc với
glutaraldehyde, vi khuẩn đã bị tiêu diệt, nếu còn cũng bị loại bỏ khi lọc vô
khuẩn với màng lọc celluloze axetat 0,2 µm. Toàn bộ quá trình chế tạo kháng
nguyên: lấy nọc, khử độc nọc, tiến hành ly tâm, bỏ cặn, thu dung dịch kháng
nguyên, lọc vô trùng, chiết vào các lọ nhỏ, đóng nắp lọ... được tuân thủ chặt
chẽ nguyên tắc vô khuẩn. Các dụng cụ lấy nọc và chế tạo kháng nguyên được
sấy hấp tiệt trùng; khi chiết dung dịch kháng nguyên vào các lọ nhỏ, đã khử
khuẩn nút lọ bằng nhiệt đèn cồn; các thao tác vô khuẩn được thực hiện trong
box vô trùng... Các thử nghiệm xác định kháng nguyên an toàn không độc tố,
vô khuẩn, không có chất gây sốt, đảm bảo độ tinh khiết, giúp ngựa không bị
nhiễm trùng, bị sốt khi gây mẫn cảm, nhất là các tháng cuối gây mẫn cảm, sử
dụng số lượng kháng nguyên lớn và nhiều điểm tiêm.
Chí nhiệt tố là sản phẩm chuyển hóa do các vi sinh vật như vi khuẩn,
nấm mốc, nấm men, virus, sinh ra trong quá trình sống của chúng và xác chết
của các vi sinh vật này, gây phản ứng sốt khi tiêm (Nguyễn Đăng Hòa, 2006)
[17]. Đạt tiêu chuẩn không có chất gây sốt, vô khuẩn cũng chứng tỏ quy trình
kỹ thuật được thực hiện trong điều kiện tốt. So với LD50 của rắn cạp nia bắc là
0,15µg/gam chuột (Steven D. et al., 1999) [131] và rắn cạp nia nam
0,1µg/gam chuột (Tan N.H et al., 2004) [135], độc tính KN nọc rắn cạp nia đa
giá nếu không khử độc sẽ cao gấp 73 lần so với LD50 của nọc rắn cạp nia bắc
và 110 lần so với LD50 của nọc rắn cạp nia nam (tính tương tự 3.1.1.4 ở trên).
Một yêu cầu quan trọng thứ hai của chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp
nia đa giá là bảo đảm giữ được nguyên vẹn tính kháng nguyên của nọc độc cả
hai loài rắn cạp nia bắc và nam. Đảm bảo được điều này sẽ quyết định sự
thành công của quy trình sản xuất HTKN-RCN đa giá, giúp HTKNR sản xuất
97
ra có tính đặc hiệu cao, khi sử dụng có thể trung hòa hiệu quả, nhanh chóng
các độc tố nọc nguy hiểm trong cơ thể nạn nhân.
Thực tế kết quả quá trình gây mẫn cảm, theo dõi đáp ứng miễn dịch đã
chứng minh một lần nữa cho sự thành công trong đảm bảo tính sinh miễn dịch
của kháng nguyên trong chế tạo kháng nguyên giảm độc lực.
4.1.2. Qui trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch:
Quá trình gây mẫn cảm, chăm sóc theo dõi sức khỏe ngựa, theo dõi hình
thành kháng thể đặc hiệu là quãng thời gian rất quan trọng, có ý nghĩa quyết
định tiếp theo sau khâu chế tạo kháng nguyên nọc rắn đa giá giảm độc lực.
Giai đoạn này, đòi hỏi phải chăm sóc ngựa thật tốt để ngựa đủ sức chịu đựng
quá trình mẫn cảm với lượng kháng nguyên và tá dược ngày càng nhiều. Việc
tiêm kháng nguyên và tá dược phải bảo đảm kỹ thuật, đúng vị trí, đúng liều
lượng dự kiến. Đi kèm theo là việc đánh giá kết quả đáp ứng miễn dịch với
kháng nguyên đã chế tạo, khẳng định chất lượng kháng nguyên và quá trình
gây mẫn cảm, quyết định các thay đổi về liều lượng kháng nguyên, tá dược,
cách thức, vị trí gây mẫn cảm cho phù hợp, thậm chí quyết định cả phương
pháp chăm sóc, chế độ ăn uống cụ thể trong từng tình huống. Đây là thời gian
vất vả nhất của cán bộ nghiên cứu do phải làm việc nhiều với động vật trong
môi trường kém vệ sinh và không ít nguy hiểm. Do yêu cầu nghiên cứu, mọi
công việc vẫn phải đảm bảo cẩn thận, tỉ mỉ, trực tiếp và cụ thể sát sao theo
diễn biến của từng ngựa nghiên cứu.
Ngoài các yếu tố về bản chất của kháng nguyên như tính lạ, kích thước
trọng lượng phân tử, cấu trúc, khả năng hòa tan của kháng nguyên,... đáp ứng
miễn dịch ở ngựa gây mẫn cảm còn phụ thuộc vào đặc điểm sinh học riêng
của cá thể ngựa gây mẫn cảm, liều lượng kháng nguyên và tá dược (Đỗ Trung
Phấn, 1979) [28]. Như khuyến cáo của WHO (Guidelines, 2008), với ngựa
98
gây mẫn cảm, quãng cách thời gian giữa hai lần tiêm kháng nguyên và tá
dược khoảng từ 3 - 5 tuần. Đây là khoảng thời gian cần thiết bảo đảm an toàn
cho ngựa sau miễn dịch, đảm bảo liền vết loét chỗ tiêm, ngựa không còn mệt
yếu, đủ sức khỏe cho lần mẫn cảm tiếp theo. Nghiên cứu của chúng tôi đã để
thời gian một tháng/lần gây mẫn cảm, tuy mất thời gian hơn so với lịch trình 3
tuần/lần, nhưng nhờ có thời gian, việc chăm sóc đã giúp ngựa phục hồi sức
khỏe tốt hơn, sẵn sàng cho lần gây mẫn cảm tiếp theo. Xét khía cạnh kinh tế,
nên theo một lịch trình ngắn hơn, khoảng hai đến ba tuần/lần (Philadelphia
Wahby et al., 2010 [115], Clara, Miller, 1971 [20]). Điều này cũng tùy điều
kiện của nhà nghiên cứu, diễn biến sức khỏe ngựa (loét, bỏ ăn, bại liệt,..). Có
tác giả cho rằng có thể dự kiến lịch trình miễn dịch trong 3 - 15 tháng, với 10
- 50 mũi tiêm kháng nguyên và tá dược Chippaux J.P, Goiffon M. (1992) [54].
Về liều lượng kháng nguyên gây mẫn cảm, trong nghiên cứu chúng tôi đã
sử dụng liều đầu tiên rất nhỏ (0,1 ml kháng nguyên chứa 1,1 mg nọc rắn cạp
nia) - ngay cả khi không khử độc, liều này cũng không nguy hiểm cho ngựa
(320 kg). Các lần gây mẫn cảm tiếp theo, đã sử dụng liều lượng tăng dần. Độc
tố nọc rắn cạp nia cực độc, nếu khử độc không tốt, sẽ nguy hiểm với ngựa khi
sử dụng liều cao. Liều cao nhất khi gây mẫn cảm là 6 ml kháng nguyên, chứa
≈ 66 mg nọc rắn cạp nia. Khi tiêm cho ngựa có trọng lượng 320 kg, liều này
tương ứng 3,7µg/chuột Swiss 18 - 20g; cao hơn liều chết 50% của nọc rắn cạp
nia (LD50 = 2,17 µg). Theo Steven D. et al. (1999) LD50 của rắn cạp nia bắc
là 0,15µg/gam [131]; theo Tan N.H, (2004) LD50 của rắn cạp nia nam là
0,1µg/gam, [135], thấp hơn rất nhiều so với liều 11,3 µg/gam chúng tôi đã
dùng khi tiêm đủ 6 ml KN. Liều này quá mạnh, đủ sức gây chết ngựa nếu KN
không khử được hết độc tính nọc. Như vậy, do kháng nguyên được khử độc
hoàn toàn và đã thử nghiệm xác định đảm bảo an toàn trên chuột lang Cobaye
và thỏ thí nghiệm (Bảng 3.4 và Bảng 3.5), liều này đã được sử dụng và thực tế
99
cho thấy ngựa nghiên cứu vẫn khỏe mạnh.
Về sử dụng tá dược: do độc tố thần kinh trong nọc rắn cạp nia có trọng
lượng phân tử thấp, tính sinh miễn dịch yếu, sử dụng tá dược Freund’s phối
hợp với kháng nguyên là cần thiết. Tá dược Freund’s mang tên Jules Freund,
người phát minh ra tá dược. Đó là một huyền dịch kháng nguyên được nhũ
hóa (emulsify) trong dầu khoáng, để tăng cường độ đáp ứng miễn dịch
(immunopotentiator). Tá dược Freund’s đã nhũ hóa, tạo thành huyền dịch
gồm các tiểu phân cực nhỏ, chứa kháng nguyên nọc (dịch treo) lơ lửng trong
môi trường, kéo dài thời gian tồn tại của kháng nguyên tại nơi vết tiêm kháng
nguyên. Trực khuẩn lao đã xử lý không còn vai trò gây bệnh cho cơ thể chủ,
nhưng lại là yếu tố kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, làm
tăng tiềm năng sinh γ-globulin miễn dịch IgG bằng cách tạo ra ổ viêm tại chỗ,
kêu gọi các tế bào có thẩm quyền miễn dịch tới ổ viêm để xử lý tác nhân gây
viêm; qua đó nhận biết nhóm quyết định kháng nguyên nọc rắn cạp nia, thông
tin cho toàn hệ thống miễn dịch của cơ thể ngựa, phát động quá trình đáp ứng
sinh kháng thể đặc hiệu (Nguyễn Năng An, 1975[2]). Tế bào trí nhớ miễn dịch
(memory cells) có chức năng nhận biết và ghi nhớ các dấu ấn miễn dịch của
kháng nguyên. Khi được tiêm liều kháng nguyên nọc rắn cạp nia nhắc lại, tế
bào trí nhớ miễn dịch lập tức được phát động, nhân lên gấp bội để sinh kháng
thể IgG (Nguyễn Năng An, Trương Đình Kiệt, 1986) [1]. Nhiều tác giả đã sử
dụng phương pháp kết hợp kháng nguyên và CFA để tăng mạnh hiệu giá
kháng thể cho thấy hiệu quả rất rõ rệt. Pratanaphon R et al., (1997) [116], đã
trộn lẫn kháng nguyên nọc rắn hổ đất Thái Lan và với các tá dược khác nhau,
tỷ dụ CFA đơn thuần (50% CFA + 50% KN) hoặc CFA với tỷ lệ 25% (75%
kháng nguyên và 25% CFA), hoặc kháng nguyên + vắc xin nội độc tố uốn ván
(tetanus toxoid), kháng nguyên + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria
toxoid ) với tỷ lệ khác nhau, thu được kết quả tốt, hiệu giá kháng thể tăng cao
mạnh mẽ trong thời gian ngắn so với nhóm chứng chỉ dùng kháng nguyên và
100
tá dược là bentonite gel.
Chúng tôi đã tự chế tá dược theo công thức của hãng Difco để tiết kiệm
chi phí. CFA, gồm: mannide monooleate (1,5ml), dầu paraffin (8,5ml) và trực
khuẩn lao chết đông khô (Mycobacterium tuberculosis): 5-10 mg; IFA gồm:
mannide monooleate (1,5ml), dầu paraffin (8,5ml), không có trực khuẩn lao.
Kháng nguyên và tá dược đóng lọ riêng biệt. Trước khi tiêm miễn dịch ngựa,
tá dược được trộn thật kỹ với kháng nguyên theo tỷ lệ 1/1. Kháng nguyên nọc
rắn cạp nia đa giá được tiêm dưới da ở nhiều vị trí tiêm khác nhau (hơn 10
điểm tiêm) theo khuyến cáo của WHO & hãng Difco. Kết quả: ngựa khỏe,
đáp ứng sinh kháng thể mạnh.
Về đường tiêm kháng nguyên + tá dược: trong quá trình gây mẫn cảm,
ngựa hoàn toàn được tiêm dưới da vì theo khuyến cáo của WHO, trong các
đường tiêm, đường tiêm dưới da là tốt nhất, tránh được nguy cơ gây loét, hoại
tử, tróc da nếu tiêm trong da; gây què quặt tạm thời hoặc vĩnh viễn nếu tiêm
bắp thịt; gây tắc mao mạch phổi nếu tiêm đường tĩnh mạch. Các khu vực tiêm
kháng nguyên và tá dược đã được áp dụng theo khuyến cáo của WHO. Liều
kháng nguyên và tá dược được chia đều với nhiều điểm tiêm cùng kỹ thuật
tiêm gây mẫn cảm đúng giúp ngựa bớt đau, đi lại cử động dễ dàng, không bị
nhiễm trùng lan tỏa. Theo bảng 3.7 cho thấy, tổng liều kháng nguyên và tá
dược ngày càng tăng, khiến cho việc phân chia các điểm tiêm kháng nguyên
và tá dược phải tính toán trước. Với tá dược CFA, cần chia ra nhiều điểm tiêm
và khoảng cách tiêm giữa các điểm phải được cân nhắc cụ thể tùy tình trạng
loét da ngựa. Điều này nhằm tránh cho vết loét da rộng quá hoặc lâu liền,
chăm sóc đỡ vất vả, lần miễn dịch sau dễ dàng hơn. Theo WHO, nên tiêm tá
dược CFA một lần duy nhất, sau đó chỉ tiêm kháng nguyên và tá dược IFA
vẫn làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên nhưng không gây tình
trạng loét da ngựa. Trong nghiên cứu này chúng tôi chưa áp dụng.
101
Như vậy, công đoạn gây mẫn cảm cho ngựa đã hoàn thành tốt với sự
phối hợp lịch trình miễn dịch với liều lượng kháng nguyên và tá dược
Freund’s. Đây là một giai đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất huyết
thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2. Kết quả gây mẫn cảm ngựa khẳng
định một lần nữa kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá được chế tạo đạt chất
lượng tốt, an toàn cho động vật miễn dịch.
Theo dõi, chăm sóc ngựa sau mỗi lần mẫn cảm là việc vất vả, đòi hỏi có
khoa học; trong suốt thời gian chín tháng của lịch trình gây mẫn cảm, đến khi
lấy máu ngựa, thu huyết tương giàu kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn. Nếu
chăm sóc không đảm bảo, ngựa có thể tử vong hoặc mắc bệnh, sinh kháng thể
không tốt, hiệu giá kháng thể không cao. Điều này đã được WHO cảnh báo và
là một vấn đề rất quan trọng trong số các giải pháp góp phần làm tăng hiệu
giá kháng thể trong sản xuất HTKNR nói chung.
Trước hết, sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược gây mẫn cảm, cần theo
dõi các biểu hiện toàn thân, tại chỗ của ngựa và xử trí kịp thời. Bảng 3.8 chỉ
ra: khi tiêm kháng nguyên và tá dược Freund’s cho hai ngựa nghiên cứu, thấy
các biểu hiện ở hai ngựa sau tiêm xảy ra tương tự nhau. Ngay những ngày
đầu sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược CFA ở cả hai ngựa nghiên cứu đều
thấy các biểu hiện mệt mỏi, bỏ ăn, yếu bại, ngựa nằm tại chỗ không đứng dậy
được, thở nông và nhanh, tại chỗ tiêm dần dần xuất hiện vết loét, đường kính
2 - 7 cm. Trong những lần gây mẫn cảm tiếp theo, KN được trộn với tá dược
Freund’s không hoàn toàn (IFA), thấy biểu hiện toàn thân, vận động, tiêu hóa,
hô hấp của ngựa gần như bình thường, ngựa vẫn đi lại, ăn uống, không cần
chăm sóc, đặc biệt không thấy xảy ra hiện tượng loét da.
Loét da nơi tiêm xảy ra sau miễn dịch ngựa bằng tá dược Freund’s hoàn
toàn (CFA) nhưng không xuất hiện khi miễn dịch với tá dược IFA đặt ra câu
hỏi phải chăng loét da ngựa là do BCG có trong thành phần tá dược Freund’s
102
hoàn toàn? Khi kháng nguyên đã được xác định an toàn trên chuột lang với
liều tiêm phúc mạc chuột là 1 ml/100 gam trọng lượng (bảng 3.4), đây là liều
lớn gấp 90 lần LD50 đối với chuột lang thí nghiệm nặng 250 - 300 gam. Trong
quá trình gây mẫn cảm, liều kháng nguyên từ 0,1 ml khởi đầu đã được nâng
cao dần đến 6 ml (Bảng 3.7), tương đương 1,1 mg/kg ---> 66 mg/kg trọng
lượng ngựa 320kg. Trừ những lần tiêm đầu tiên, những liều tiêm kháng
nguyên cuối cùng có nồng độ nọc sử dụng cao hơn LD50 của nọc rắn cạp nia
(3,7 µg so với 2,17 µg/chuột nhắt trắng Swiss 18 – 20g), nếu không khử độc,
sẽ gây nguy hiểm cho ngựa. Với việc hoàn thành quá trình gây mẫn cảm, một
lần nữa khẳng định kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá được chế tạo là thực
sự an toàn. Hiện tượng loét da xảy ra sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược
CFA do trong thành phần tá dược có BCG chết, gây phản ứng viêm rất mạnh,
tương tự tiêm vắc xin phòng lao ở người (Hiện tượng Koch, Nguyễn Năng An,
1975[2]). Điều này cũng phù hợp với khuyến cáo của WHO khuyên chỉ nên
tiêm một lần CFA và hạn chế việc tiêm tại một điểm một số lượng lớn kháng
nguyên và tá dược. Có nhiều ý kiến khác nhau về vấn đề này; dùng kháng
nguyên và tá dược thế nào còn tùy theo quan điểm, kinh nghiệm của các cơ sở
nghiên cứu, của từng tác giả (Đỗ Trung Phấn, 1979) [28].
Riêng về chăm sóc các vết loét da ngựa sau gây mẫn cảm là một vấn đề
rất cần chú ý. Do chuồng ngựa không thể đảm bảo vệ sinh, vết loét chắc chắn
bị nhiễm trùng, ruồi bâu bám,...nên càng lâu liền. Thông thường, việc sát
khuẩn vết thương hoặc băng vết loét cho ngựa rất khó khăn. Nếu vết thương
rộng và ở vị trí vận động (vùng cổ và ức ngựa) hầu như không thể băng hay
đắp gạc mà phải bắt buộc để hở, ảnh hưởng đến sức khỏe ngựa và không còn
vị trí để tiêm kháng nguyên và tá dược trong những lần gây mẫn cảm về sau.
Một điểm nữa cần nói đến, sẽ là thuận lợi hơn nếu việc chăm sóc ngựa
có nhân viên chuyên nghiệp, hiểu biết về tập tính, các bệnh thường gặp, các
103
loại thức ăn ưa thích có giá trị dinh dưỡng cao của ngựa,... Người chăn và
chăm sóc ngựa chuyên nghiệp sẽ tạo được sự thân thiện dễ gần với ngựa, giúp
cho tiếp cận ngựa gây mẫn cảm, lấy máu dễ dàng hơn, bảo đảm an toàn,
không bị ngựa đá hay dứt đứt dây trói khi lấy máu. Ngoài ra, cần đảm bảo
nước uống sạch cho ngựa, cung cấp các loại rơm cỏ không có hóa chất bảo vệ
thực vật, đủ thức ăn thô và tăng cường thức ăn tinh; che chắn chuồng trại cẩn
thận, nhất là vào mùa đông, thời tiết giá lạnh, rét đậm rét hại....Ngựa béo khỏe
là một dấu hiệu tốt báo hiệu thuận lợi cho việc sinh kháng thể có hiệu quả.
Chế tạo kháng nguyên đã thành công khi đảm bảo an toàn cho ngựa miễn
dịch (Bảng 3.8), tuy nhiên, mục đích cuối cùng của nghiên cứu là chế tạo
HTKN rắn cạp nia đa giá F(ab’)2 đặc hiệu. Vì vậy, tạo nguồn huyết tương
ngựa có hiệu giá kháng thể kháng nọc rắn cạp nia cao là hết sức quan trọng.
Theo dõi sự hình thành KT miễn dịch kháng nọc rắn cạp nia đa giá là công
việc cần thiết, được làm thường xuyên trong quá trình gây mẫn cảm.
Kết quả bảng 3.9 cho thấy, sau miễn dịch chín lần, hiệu giá kháng thể
đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn cạp nia tăng lên mức 2048 ở cả hai ngựa
và ổn định sau lần miễn dịch thứ tám và chín. Đây là mức đạt yêu cầu của kế
hoạch nghiên cứu. So sánh mức độ tăng hiệu giá kháng thể với khoảng thời
gian miễn dịch của các loại HTKNR khác như rắn hổ đất, rắn hổ chúa; hiệu
giá kháng thể ở rắn cạp nia ở ngựa tăng tương đương. Với rắn choàm quoạp
và rắn lục, thời gian đạt hiệu giá này sớm hơn, do đó có thể lấy máu sớm hơn
sau bảy lần miễn dịch bằng kháng nguyên nọc rắn cạp nia và tá dược.
Kết quả ở Bảng 3.9 cũng cho thấy, với hai ngựa khỏe mạnh, có cân
nặng gần như tương đương và được nuôi ở hai địa điểm khác nhau, cùng một
liệu trình miễn dịch với liều lượng như nhau, có thể cho kết quả hiệu giá
kháng thể khác nhau. Điều này cho thấy chế độ dinh dưỡng, đặc điểm sinh
học cá thể động vật gây mẫn cảm đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn
104
dịch của ngựa. Ngựa số 2 nuôi tại Thư Phú, Thường Tín, có chế độ dinh
dưỡng tốt hơn đã đạt hiệu giá kháng thể cao hơn ngay từ sau lần miễn dịch
đầu tiên. Điều này phù hợp với nhận định của Daltry J.C et al.,1996 [60].
Sau khi chế tạo kháng nguyên, kiểm tra đã có kháng thể đặc hiệu hình
thành trong máu ngựa hay không là việc rất quan trọng. Chúng tôi dùng thử
nghiệm Ouchterlony để kiểm tra thường xuyên hàng tháng sau khi gây miễn
dịch. Kháng nguyên sử dụng là kháng nguyên nọc rắn cạp nia (bắc + nam),
được bố trí ở trung tâm của lam thạch agarose 1,5%, xung quanh để huyết
thanh ngựa đã gây miễn dịch. Kết quả nêu ở mục 3.1.2.4 cho thấy: vết tủa KN
- KT trên thạch cho thấy trong máu ngựa đã hình thành kháng thể chống
kháng nguyên nọc rắn cạp nia. Pha huyết thanh với nồng độ khác nhau, đặt ở
các vị trí khác nhau để xem xét mức độ hình thành tủa KN - KT. Thử nghiệm
này có độ nhạy không cao, phụ thuộc nhiều yếu tố, so với thử nghiệm ELISA,
tuy nhiên, do điều kiện không cho phép, thử nghiệm Ouchternoly là một lựa
chọn cần thiết.
Để khẳng định kết quả sinh kháng thể và xác định tính đặc hiệu với
kháng nguyên nọc, sau khi sản xuất được HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 thành
phẩm, điện di miễn dịch, kết quả cho thấy vết tủa KN-KT rất rõ (Ảnh 3.5).
Điều này khẳng định kháng nguyên nọc rắn cạp nia được nghiên cứu chế tạo
đã đảm bảo có tính sinh miễn dịch đủ mạnh để kích thích cơ thể động vật sinh
kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn cạp nia.
4.1.3. Lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối HC:
Lấy máu, thu hoạch huyết tương giàu kháng thể là công đoạn rất quan
trọng trong sản xuất HTKNR. Máu lấy phải đảm bảo vô khuẩn, không bị
đông, không vỡ hồng cầu, thực hiện tách huyết tương ngay, truyền trả kịp thời
105
khối hồng cầu cho ngựa. Ngựa được lấy máu phải đảm bảo an toàn tuyệt đối.
Việc đảm bảo vô khuẩn cho tất cả các lần lấy máu ngựa đã được thực
hiện nghiêm túc. Máu ngựa được lấy vào bình thủy tinh hoặc bình nhựa vô
khuẩn, thể tích 10 lít/bình. Dây và kim lấy máu vô trùng được tráng heparin
pha trong dung dịch NaCl 0,9%. Tất cả dụng cụ lấy máu được đảm bảo vô
trùng khử khuẩn tại khoa chống nhiễm khuẩn bệnh viện Bạch Mai. Ngựa
trước khi lấy máu đã được cắt bờm gọn ghẽ, tắm rửa sạch sẽ, chải kỹ da bằng
bàn chải, xà phòng và dung dịch sát khuẩn. Cố định kỹ cổ ngựa và cố định
thân ngựa vào khung ép, có chắn trước và sau chân ngựa. Cạo lông sạch sẽ
vùng cổ ngựa, khu vực lấy máu. Khi lấy máu, sát trùng rộng bằng Iod 3%, sát
trùng lại bằng cồn sát trùng 70o. Nhân viên lấy máu mặc áo vô khuẩn, đeo
khẩu trang, đội mũ, mang găng tay vô khuẩn. Khi kết thúc, bình đựng máu
được bọc kỹ với ga vô khuẩn, buộc chặt trong quá trình vận chuyển.
Vấn đề an toàn cho ngựa khi lấy máu khối lượng lớn đã được quan tâm.
Kết quả Bảng 3.10 cho thấy, qua bốn lần lấy máu, mỗi lần lấy ở hai ngựa
cùng ngày tại cùng Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm dã ngoại Học viện
Quân y, Hòa Lạc, Thạch Thất, Hà Nội - tuy tiện lợi về mọi mặt, song vất vả
vì khối lượng công việc nhiều, mệt mỏi cho nhân viên và dễ dẫn đến sơ xuất.
Trong lần lấy máu đầu tiên, thu được lượng máu 5,9 lít (3,6 lít ở ngựa số 1 và
2,3 lít ở ngựa số 2). Trong lần lấy máu thứ hai thu được gần gấp đôi (5,1 lít ở
ngựa số 1 và 5,5 lít ở ngựa số 2).
Quá trình lấy máu, chú ý mối liên quan giữa lượng máu lấy và sức khỏe
của ngựa. Lấy máu an toàn tuyệt đối cho ngựa là một yêu cầu quan trọng. Để
ngựa chết, ngoài thiệt hại về vật chất, về kinh tế, còn là vấn đề thời gian và rất
nhiều công lao động của nhiều người trong quá trình gây mẫn cảm hàng nhiều
tháng....Bảng 3.11 cho thấy, khi lấy máu ít hơn 3,5 lít, ở cả hai ngựa đều
không có biểu hiện gì. Khi lấy từ 3,6 --> 5,4 lít máu, tùy theo từng ngựa, khả
106
năng chịu đựng khác nhau, các mức độ phản ứng với lấy máu khác nhau. Mức
độ lấy máu nhiều hơn 5,5 lít/ngựa, nếu không chú ý sẽ xảy ra mất an toàn cho
ngựa do shock mất máu. Không nên lấy quá 1,5% trọng lượng ngựa (Lê Văn
Hiệp, 2010) [159] (ngựa khoảng 300 kg, không lấy quá 4,5 lít). Nhất thiết
phải lấy lượng máu trong khả năng chịu đựng của ngựa. Phải chú ý đề phòng
shock mất máu.
Theo công ước Quốc tế bảo vệ động vật, cần tránh để đau đớn quá mức
và để chết động vật thí nghiệm (Paula G., Sells, 2003) [112]. Với Việt Nam,
công ước không được tuân thủ ngặt ngèo lắm. Tuy nhiên, với lương tâm của
nhà khoa học, tấm lòng biết ơn các động vật hy sinh vì con người, vẫn phải
thí nghiệm trên động vật, động vật vẫn phải lặng lẽ cống hiến vì con người,
song nên có một giới hạn. Giới hạn đó tốt cho con người nhưng cũng tốt cho
động vật đã cống hiến vì con người. Khi thực hiện nghiên cứu, cần đối xử tốt
nhất với chúng: vừa thể hiện sự nhân văn, vừa là khoa học.
4.1.4. Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đạt chất lượng cao:
Trước năm 1992, hệ thống tiêu chuẩn chất lượng thuốc có 4 cấp: tiêu
chuẩn Dược điển Việt Nam (TCVN), tiêu chuẩn ngành (TCN), tiêu chuẩn địa
phương (TCV), tiêu chuẩn cơ sở (TC). Hiện nay chỉ còn hai cấp tiêu chuẩn là:
tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam và tiêu chuẩn cơ sở. Tiêu chuẩn cơ sở do cơ
sở sản xuất biên soạn đối với chế phẩm mình sản xuất (Hoàng Ngọc Hùng,
2005) [18]. Để tinh chế HTKN-RCN đạt chất lượng tốt, ngoài bám sát tiêu
chuẩn quy định của Dược điển Việt Nam [36], phải có quy định chặt chẽ về
chất lượng, bảo đảm nguồn huyết tương sản xuất có chất lượng (vô khuẩn,
hiệu giá cao...), chuẩn độ acid, base chính xác, duy trì nhiệt độ tốt, xác định
pH đúng, tính đúng và đủ số lượng ammonium sulphate theo đúng hàm lượng
quy định, lọc giấy lọc Whattman vô khuẩn, thẩm tích cẩn thận với nước cất,
107
lọc với máy lọc Seiz có đĩa lọc đúng tiêu chuẩn, đóng lọ và bảo quản đúng
quy định về nhiệt độ [3]. Tất cả các khâu này của quy trình tinh chế đều cần
quản lý chất lượng chặt chẽ.
Về kỹ thuật, hiện thế giới đang sử dụng cả ba loại kỹ thuật tinh chế
IgG, Fab và F(ab')2. Cả ba phương pháp đều sử dụng nguyên liệu ban đầu như
nhau. Các kỹ thuật đều nhằm loại bỏ mọi thành phần phi kháng thể, cô đặc
phần kháng thể đặc hiệu; điểm khác biệt là sản phẩm cuối cùng chứa phân tử
kháng thể IgG nguyên vẹn hay IgG đã được cắt, tách từng phần bằng pepsin,
hoặc papain. Bản chất kháng thể cuối cùng sẽ quyết định tính an toàn, hiệu
lực và giá thành của sản phẩm. Nhiều trung tâm khoa học trên thế giới đã
nghiên cứu vấn đề này suốt nhiều thập kỷ, từ đó mỗi trung tâm lựa chọn qui
trình kỹ thuật phù hợp yêu cầu của mình. Thí dụ: Trung tâm sản xuất HTKNR
Nam Phi, Ấn Độ… chế tạo HTKNR IgG; công ty Protherics (Anh - Úc - Mỹ)
sản xuất HTKNR Fab (Karlson., et al 2009) [84],[120]. Hầu hết các nước
đang phát triển đều sử dụng qui trình kỹ thuật chế tạo HTKNR F(ab')2: Viện
Common Serum Laboratories-CSL (Australia), viện Butantan (Brazil) viện
Queen Saovabha (Thailand), Trung tâm kiểm tra bệnh tật - CDC (Đài
Loan),...Chúng tôi đã lựa chọn tinh chế HTKN-RCN dạng F(ab')2. Dạng
HTKNR này an toàn hơn cho người bệnh, hiệu quả trung hòa độc tố nọc rắn
rất tốt do ammonium sulphate gây tủa protein nhưng không làm biến đổi tính
chất của chúng, thời gian bán hủy thuốc tương đối chậm, đủ thời gian trung
hòa độc tố nọc rắn cạp nia, phản ứng huyết thanh thấp (< 15%) (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: So sánh đặc điểm ba loại HTKNR: IgG, F(ab')2 và Fab.
Đặc điểmLoại HTKNR
IgG F(ab')2 Fab
108
Thời gian phân phối/cơ thể (h) > 3 3 1
Thời gian loại trừ khỏi cơ thể (h) 100 60 10
Gắn vào mô cơ thể Mạnh Vừa yếu
Hoạt hóa bổ thể Có Không Không
Đường loại trừ khỏi cơ thể Mô miễn dịch Mô miễn dịch Thận
Phản ứng không mong muốn (%) >80 <15 <10
Giá thành (USD/lọ) 40 70 1.200
Bảng 4.1 cho thấy, HTKNR F(ab')2 có thời gian phân phối thuốc chậm
hơn so với HTKNR Fab (3 giờ và 1 giờ), song điều đó không ảnh hưởng đến
cứu chữa nạn nhân vì có máy thở hỗ trợ trong khoảng thời gian thuốc chưa
được phân phối khắp cơ thể. Giá thành HTKN-RCN F(ab')2 không cao
(khoảng 70 USD/lọ) trong khi giá của HTKNR Fab rất cao (> 1.200 USD/lọ).
Mặt khác, HTKNR Fab có thời gian phân phối thuốc nhanh nhưng thời gian
thải loại khỏi cơ thể cũng nhanh, chỉ khoảng 10 giờ, giá thành lại rất đắt so
với HTKNR dạng IgG và F(ab')2; do vậy, HTKNR Fab không phù hợp với
các nước đang phát triển như Việt Nam. HTKNR IgG tác dụng trung hòa nọc
độc mạnh, giá thành rẻ nhưng phản ứng huyết thanh cao trên 80%, nên không
được lựa chọn để sản xuất sản phẩm này [38],[130]. Trong sản xuất HTKNR,
việc lựa chọn quy trình tinh chế phù hợp được cân nhắc rất sớm, trước khi bắt
tay vào chế tạo kháng nguyên nọc rắn. Sản xuất bằng kỹ thuật gì tinh chế
được phần F(ab’)2 đặc hiệu kháng nọc rắn với tỷ lệ cao nhất, tinh sạch nhất là
điều cực kỳ quan trọng.
Theo tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV đề ra ban đầu và
tiêu chuẩn của WHO về HTKNR (Guidelines, 2008), ngoài việc thiết kế mục
tiêu là HTKNR có chứa nhiều nhất F(ab’)2, cần loại bỏ hầu hết những chất
không cần thiết của protein ngựa (albumin, globulin không cần thiết), chất
109
bảo quản (phải trong giới hạn cho phép), ammonium sulphate; vi khuẩn, vi
nấm, chí nhiệt tố và phải có đủ các điều kiện lý hóa cần thiết của HTKNR như
pH trung tính, áp lực thẩm thấu đẳng trương, đảm bảo nồng độ chất bảo quản
(thiomersan) ở dưới hàm lượng cho phép...vì vậy, tinh chế huyết tương chứa
kháng thể kháng nọc rắn cạp nia đa giá (bắc + nam) thành HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 là một quy trình rất quan trọng, ảnh hưởng quyết định đến chất lượng
cuối cùng của sản phẩm. Quy trình đòi hỏi phải được thực hiện rất chặt chẽ,
chính xác theo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của sản xuất.
Việc đầu tiên của công đoạn tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2 là cắt Fc của
IgG có trong huyết tương nguyên liệu bằng pepsin. Phân tử IgG nguyên vẹn
có mảnh Fc, là nguyên nhân của các phản ứng không mong muốn trên lâm
sàng, nhất là shock phản vệ. Fc mang thụ thể gắn các tế bào mastocyte, bạch
cầu ưa kiềm, đó là kho chứa các chất trung gian hóa học histamin, serotonin,
bradykinin... gây phản vệ, phản ứng nguy hiểm nhất trong huyết thanh trị liệu.
Pepsin có bản chất là enzyme tiêu protein (protease), thành viên của họ
men aspartate protease. Pepsinogen là tiền chất của pepsin, do tế bào niêm
mạc dạ dày tiết ra để cắt phân tử protein có trong thức ăn thành peptides. Năm
1836, Theodor Schwann đã phát hiện ra pepsin, và đặt tên “pepsin” từ chữ
gốc tiếng Hy lạp “pepsis”, nghĩa là tiêu hóa (peptein: to digest). Năm 1929,
pepsin đã là một trong những enzyme đầu tiên được John H. Northrop kết
tinh. Cùng với hai enzyme đồng hành: chymotrypsin và trypsin, pepsin vừa có
chức năng chuyên biệt, vừa hợp tác với hai enzyme đồng hành để tiêu huỷ
protein của thức ăn. Pepsin hoạt động tối ưu ở môi trường acid (pH 2 - 3,2)
(Morais V., Massaldi H., 2005) [103], cùng papain là hai loại enzyme được sử
dụng rộng rãi và hiệu quả nhất để nghiên cứu cấu trúc của phân tử kháng thể
bằng cách cắt rời phân tử kháng thể ở vị trí aminoacide đặc hiệu. Đặc biệt hơn
nữa, các mảnh peptides đã cắt rời vẫn còn nguyên chức năng sinh học của nó
110
(Nisini R., Le Moli S., et al., 1989), [108].
Papain cắt phân tử kháng thể IgG tại vị trí amino acid tận cùng của cầu
nối disulfide, tạo thành ba mảnh (fragments), hai mảnh có hoạt tính “gắn”
KN, được gọi là mảnh Fab (Fragment antigen biding), vì có một “tay” của
phân tử kháng thể, gồm chuỗi nhẹ ghép đôi với vùng lãnh địa (domains) VH
và CH1 của chuỗi nặng. Mảnh còn lại không có hoạt tính gắn KN, nhưng có
thể kết tinh, được gọi là Fc (Fragment crystallize). Trong khi đó, pepsin cũng
tác dụng tại vùng tưng tự như papain, nhưng ở vị trí carboxyl tận cùng của
cầu nối disulfide, tạo ra mảnh F(ab)2, có cả hai “tay” của phân tử IgG và mảnh
Fc. Fc cặp đôi với CH2 và CH3 của chuỗi nặng và là phần của kháng thể có
chức năng tương tác với tế bào và phân tử khác (effector molecules), là
nguyên nhân của các phản ứng không mong muốn khi điều trị kháng huyết
thanh, trong đó nguy hiểm nhất là shock phản vệ. Bằng kỹ thuật sử dụng
pepsin cắt bỏ Fc, chỉ còn lại mảnh F(ab)2 có đặc tính “gắn” kháng nguyên
giống hệt kháng thể gốc nguyên vẹn, nhưng lại không có khả năng tương tác
với bất cứ phân tử hoặc tế bào nào; do vậy F(ab)2 có tiềm năng ứng dụng điều
trị rất lớn.
Theo Bảng 3.12, lượng huyết tương đưa vào sản xuất lần đầu (lô I) của
hai ngựa là 3,6 lit. Sau khi cắt Fc bằng pepsin, tủa các thành phần không chứa
kháng thể kháng nọc RCN bằng ammonium sulphate 14%, thu dịch lọc chứa
kháng thể kháng nọc RCN đa giá F(ab’)2, được 2,9 lít. Tỷ lệ thu lại dịch lọc
có KT là 80,6%. Trong lần sản xuất thứ hai (lô II), đưa vào tinh chế 6,4 lít
huyết tương, thu được 5,1 lít dịch lọc chứa kháng thể, tỷ lệ 80,3%. Như vậy,
với phương pháp như nhau, kết quả thu được tương tự. Tỷ lệ thu lại huyết
tương giàu F(ab’)2 với hai lần tinh chế là 80,4%. Tỷ lệ này cho thấy, trong ≈
20% thể tích loại bỏ có chứa các thành phần protein không phải F(ab’)2. Đây
là sự cần thiết đầu tiên cho tinh sạch sản phẩm.
111
Tủa với ammonium sulphate có lợi điểm giữ được nguyên tính chất của
các mảnh F(ab’)2 nhưng hiệu xuất kém hơn so với các kỹ thuật tinh chế khác
như Sắc ký trao đổi ion (Ion - exchange chromatography) và kỹ thuật Sắc ký
ái lực (Affinity chromatography). Sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện
khác nhau giữa HTKNR và các chất tạp nhiễm. Cột trao đổi anion DEAE,
QAE gels hoặc màng như màng vi xốp cellulose, ở pH trung tính sẽ hấp phụ
chất nhiễm bẩn là protein. Cột trao đổi cation như carboxymethyl gel hoặc
sulfopropyl khi tinh chế HTKNR IgG hoặc F(ab’)2, ở pH= 4,5 sẽ bám dính
HTKNR trong khi chất nhiễm bẩn protein bị loại bỏ qua cột. Kỹ thuật sắc ký
áp dụng theo GMP, có thể vệ sinh, xử lý, bảo quản sử dụng nhiều lần, nhưng
phải được kiểm tra, đề phòng nhiễm bẩn từ lô HTKNR này sang lô HTKNR
khác. Sắc ký ái lực sử dụng nọc cố định trên cột để gắn các phân tử globulin
hoặc mảnh của nó khi cho dung dịch HTKNR chảy qua. Tuy nhiên, cột
thường bị kém chất lượng khá nhanh, cần phải rửa, vệ sinh, xử lý rất cẩn thận,
bảo quản trong điều kiện thích hợp. Kỹ thuật này phải đảm bảo chắc chắn
chất bẩn đã hoàn toàn bị loại bỏ theo qui trình nghiêm ngặt, không ảnh hưởng
tới chất lượng của sản phẩm. Kỹ thuật ái lực có thể ảnh hưởng sự hồi phục
của kháng thể ái lực mạnh, sẽ làm mất hoặc hủy hoại kháng thể. Tuy nhiên,
nếu sử dụng bổ sung thêm hai kỹ thuật này sau tinh chế, chất lượng HTKNR
không tăng thêm đáng kể, nguy cơ nhiễm bẩn cao, và đặc biệt sẽ đẩy giá
thành HTKNR lên cao nhiều lần ( > 800 USD/lọ), vượt quá xa khả năng chấp
nhận của nạn nhân bị rắn cắn nghèo khó.
Kỹ thuật tủa protein bằng ammoni sulphat đã được biết đến từ rất lâu.
Việc thu nhận và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của
protein, như: độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan...của protein cần
chiết xuất. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc
chiết xuất các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn
112
thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự
nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau như: nhiệt độ,
pH, dùng chất hóa học như muối: (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4.., các dung môi
hữu cơ như ethanol, acetone...vv. Trong các phương pháp đó, dùng muối
ammonium sulphate tách protein đã và đang được sử dụng phổ biến và hiệu
quả nhất. Thêm muối vào dung dịch protein là làm giảm lớp hydrate hóa. Lớp
hydrate bao quanh phân tử protein giảm đi sẽ bộc lộ nhóm “kỵ nước”, lực hút
tĩnh điện tăng lên, protein bị kết tủa. Ammonium sulphate có khả năng hòa
tan rất cao tới nồng độ 4M, trong khi ở nồng độ 3,2M hầu hết các loại protein
đều đã bị tủa. Tăng nồng độ ammonium sulphate sẽ làm tăng sự tranh chấp
phân tử nước, protein càng nhanh chóng kết tủa. Điều chỉnh nồng độ
ammonium sulphate tăng dần bằng cách thêm trực tiếp muối vào dung dịch,
vừa tách chọn lọc từng loại protein, vừa kiểm soát được thể tích dung dịch.
Chỉ sau 30-60 phút hòa tan ammonium sulphate theo từng nồng độ chọn lọc,
toàn bộ protein tương ứng đã bị tủa. Khi tái hòa tan hạt protein kết tủa trong
đệm mới, cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của protein vẫn được giữ
nguyên. Một số muối cùng tủa theo protein, cần phải loại bỏ bằng thẩm tích.
Như vậy, dung dịch protein thành phẩm vừa tinh sạch vừa được cô đặc, vẫn
giữ nguyên được chức năng sinh học của kháng thể. Tất nhiên, ngoài nồng độ
và tính chất của ammonium sulphate, tủa protein còn phụ thuộc vào pH và
nhiệt độ của dung môi. Ở pH = 4,2 và nhiệt độ 20oC, với nồng độ ammonium
sulphate = 14%, mọi thành phần protein không phải F(ab’)2, kể cả Fc và lipid
đều bị tủa và được loại bỏ, dịch lọc chứa F(ab')2 được thu lại trong dịch lọc
huyết tương [3],[30],[37]. Khi điều chỉnh pH dịch lọc lên 6,8 ở 20oC, rồi thêm
ammonium sulphate tới 22%, trộn đều, sau 60 phút sẽ tủa toàn bộ kháng thể
F(ab')2 cùng với muối ammonium sulphate. Nhiều tác giả cũng giải thích
tương tự về kỹ thuật và đạt kết quả tinh chế tốt (Jones R.G.A,, Landon J.,
2003) [80].
113
Theo Bảng 3.13, ở lô I, với 2,9 lít dịch lọc chứa KT đưa vào tinh chế,
sau khi thêm ammonium sulphate tới 22%, thu được 210 gam tủa kháng thể
F(ab')2. Trong lần sản xuất thứ 2 (lô II), với 5,1 lít dịch lọc giàu kháng thể, tủa
tiếp với muối ammonium sulphate 22%, thu được 495 gam tủa giàu kháng
thể. Với tỷ lệ thu lại lượng tủa so với huyết tương sản xuất của lần II, giống
như lần I cho thấy: phương pháp như nhau thì kết quả giống nhau.
Tiếp tục công đoạn tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2, cần phải tiến hành
thẩm tích loại bỏ ammonium sulphate khỏi tủa giàu F(ab’)2 và lọc với máy
lọc Seiz, đĩa lọc cellulose kích thước lỗ lọc 0.2 µm, tạo HTKN-RCN F(ab')2
dạng bán thành phẩm hoàn toàn vô trùng. Bảng 3.14 cho thấy: Lô I, sau khi
thẩm tích 190 ml dịch tủa giàu kháng thể kháng nọc RCN F(ab’)2 và lọc, thu
được 165 ml HTKN-RCN bán thành phẩm (chưa kiểm định cơ sở). Thẩm tích
Lô II, với 510 ml sau thẩm tích và lọc, thu được 485 ml. Cả hai lần thu được
650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 bán thành phẩm. Tỷ lệ hao hụt như nhau, 25
ml/lần, cho thấy, lọc nhiều huyết tương một lần tiết kiệm hơn. Như ở đây, một
lần lọc sẽ giảm được 25 ml HTKN-RCN dạng F(ab’)2, tương đương 5 lọ, mỗi
lọ có giá sản xuất chừng 70 USD (bảng 3.24, phần Phụ lục), cũng là giảm một
khoản chi phí đáng kể. Tỷ lệ này vẫn còn cao, do dùng máy lọc Seiz, kiểu cũ.
Nếu lọc với máy mới, ngoài chất lượng tốt hơn, thời gian lọc nhanh hơn, còn
tiết kiệm được nhiều HTKNR hơn. Bảng 3.15 chỉ ra một số hóa chất chính đã
sử dụng tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2. Kết hợp với bảng phụ lục 4, thấy số
lượng kinh phí cho công đoạn tinh chế không lớn. Sản xuất HTKN-RCN loạt
đầu tiên, tiến hành trong khoảng 14 - 16 tháng (tuyển chọn rắn và chế tạo KN
1 - 2 tháng, miễn dịch ngựa trong chín tháng, sản xuất và tinh chế HTKN một
tháng, kiểm định cơ sở và kiểm định quốc gia 1 - 2 tháng). Chi phí ≈ 175
triệu đồng thu được 650 ml HTKN-RCN sản phẩm, tương đương 269.000/ml.
Nếu đóng lọ 5 ml, giá thành của một lọ HTKN- RCN khoảng 1.346.000
114
VNĐ/lọ. Những lần sản xuất sau sẽ có giá thành rẻ hơn do chi phí trước
không phải tính đến (chi phi mua ngựa giống, chuồng trại, dụng cụ, trang thiết
bị chuyên dùng đã mua từ trước). Đây là một kỹ thuật dễ thực hiện, quy mô
nhỏ, phục vụ nhu cầu của đối tượng BN không lớn. Bảng 3.16 cho thấy đã
tinh chế được 650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 dạng bán thành phẩm và sau khi
kiểm định cơ sở đạt yêu cầu, đóng lọ 5 ml, được 130 lọ HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 thành phẩm, đạt yêu cầu số thành phẩm theo đề cương nghiên cứu đặt
ra (100 - 200 lọ). Liều lượng ammonium sulphate mà Guidlolin R.G,
Marcelino R.M, et al., (2010) [69] sử dụng là 29%, cao hơn chúng tôi.
Theo Bảng 3.17, kết quả định lượng protein, albumin, globulin, IgG,
IgM, tỷ lệ A/G huyết thanh ngựa và HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 cho thấy:
thành phần chủ yếu của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 là globulin, chiếm 97,2%.
Trong số 48,4 g/l globulin (100%), các globulin IgG, IgA, IgM có số lượng là
2,14g/l, chỉ chiếm 4,4%. Như vậy 95,6% còn lại là mảnh F(ab’)2. Mảnh
F(ab’)2 có trọng lượng phân tử 100 kD [81], chiếm tỷ lệ tuyệt đối, đã cho hình
ảnh điện di protein dạng thuần nhất, trong khi định lượng albumin đã cho biết
chỉ còn 1,4 gam chiếm 2,8%. Hình ảnh điện di protein không có phần
globulin, trong khi định lượng vẫn còn 2,141 g/l. Chính vì số lượng globulin
còn lại quá ít, điện di protein không xác định được đỉnh (IgM có 86mg/l, IgG
có 2,03g/l, IgA có 25mg/l, tổng cộng 3 loại là 2,141 g/l). Như vậy, F(ab’)2 là
thành phần chủ yếu trong HTKN-RCN (48,4/49,8 g/l = 97,2%), còn lại
albumin 2,8%. Với tổng lượng globulin gồm IgM, IgG, IgA là 4,4%
(2,141/48,4 = 4,4%), cho thấy: lượng F(ab’)2 chiếm tỷ lệ tuyệt đối (46,26 g/l
= 95,6%), phù hợp với hình ảnh điện di protein.
Tóm lại: kết hợp điện di protein và định lượng các thành phần trong
HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 cho thấy kết quả tinh chế rất hiệu quả. HTKN-
RCN đa giá F(ab’)2 được chế tạo có độ tinh sạch cao, lượng F(ab’)2 đặc hiệu
115
chống nọc rắn cạp nia chiếm tới 95,6% (= 46,26 g/l). Các globulin miễn dịch
còn lại chiếm 4,4% (= 2,141 g/l); lượng albumin chiếm 2,8% (1,4 g/l). Đây là
ba thành phần protein duy nhất có trong HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 được sản
xuất.
4.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM HTKN-RCN ĐA GIÁ
F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM:
4.2.1. Kiểm định cơ sở và vấn đề kiểm soát chất lượng:
4.2.1.1. Tính “An toàn” của chế phẩm:
Theo Bảng 3.18, kết quả thử nghiệm an toàn chung (Safety test) trên
chuột lang Cobaye cho thấy: với liều tiêm phúc mạc 1 ml HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 /100 gam cân nặng, theo dõi trong 21 ngày ba chuột cho kết quả đạt
yêu cầu: cả ba chuột đều tăng cân, phát triển bình thường, không có chuột ốm,
chuột chết. Đây là thử nghiệm xác định sự tồn tại của các độc tố bất kỳ nói
chung trong sinh phẩm y tế. Thử nghiệm này được tiến hành ở hầu hết các cơ
sở sản xuất HTKNR trên thế giới, và được WHO giới thiệu trong các hướng
dẫn kiểm tra chất lượng HTKNR. Đây là thử nghiệm dễ làm, theo dõi không
phức tạp và có độ nhạy cao. Thử nghiệm là bắt buộc với tất cả các sinh phẩm
kháng huyết thanh, nhất là kháng huyết thanh dùng đường tiêm tĩnh mạch.
Theo kết quả ở Bảng 3.19, thử nghiệm chí nhiệt tố (Pyrogen test) cho
thấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 bán thành phẩm đã đạt yêu cầu, HTKNR
không có chất gây sốt. Theo Bảng 3.20, HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 sau cấy
khuẩn (Sterility test) đã đạt vô khuẩn, không có vi khuẩn, vi nấm mọc trong
môi trường thạch Chocolat, thạch máu và môi trường Sabouraud, với điều
kiện nhiệt độ tối ưu, theo dõi trong 14 ngày liên tiếp.
Như vậy, trong kiểm định cơ sở, tiêu chuẩn “An toàn” của HTKN-RCN
116
F(ab’)2 đã được xác nhận mức “Đạt”. Đây là yêu cầu đầu tiên trong kiểm tra
chất lượng sản phẩm ở mức cơ sở sản xuất. Đối với bất kỳ thuốc gì dùng cho
người, tiêu chuẩn an toàn là tiêu chuẩn đầu tiên, tiêu chuẩn số một. Nếu
không an toàn, thuốc nguy hiểm cho người bệnh, sẽ phải hủy bỏ. Việc sản
xuất được HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã đảm bảo loại bỏ rất nhiều nguy cơ
mất an toàn về miễn dịch do cắt bỏ được phần Fc. Tuy nhiên, do quá trình
tinh chế gồm rất nhiều công đoạn, nhiều loại hóa chất được sử dụng, tiềm ẩn
rất nhiều nguy cơ nhiễm khuẩn, nhiễm độc các loại độc tố khác nhau, các chất
gây sốt...Việc chấp hành tốt các yêu cầu quy định trong tất cả các khâu kỹ
thuật là tiền đề quan trọng đảm bảo an toàn cho sản phẩm HTKNR nghiên
cứu. Việc kiểm tra thường xuyên các khâu của các công đoạn sản xuất
HTKNR cho thấy vai trò quan trọng của kiểm định sản xuất. Đây là tiền đề
cho ra đời sản phẩm HTKNR an toàn. Thử nghiệm đã được tiến hành trên
động vật thí nghiệm và trong phòng thí nghiệm để chắc chắn “An toàn” cho
người bệnh, kể cả trường hợp liều HTKNR cần phải sử dụng tăng cao nhiều
lần hơn giới hạn quy định.
Cũng như với bất kỳ chế phẩm sinh học nào, qui trình kỹ thuật sản xuất
HTKNR phải đảm bảo giảm thiểu tối đa nguy cơ nhiễm virus ngay từ nguyên
liệu ban đầu. Xuyên suốt tất cả các bước tiếp theo của qui trình sản xuất, cần
bất hoạt, loại bỏ mọi nguy cơ nhiễm khuẩn, nhiễm virus tiềm ẩn. Cần phải
giảm thiểu tối đa nguy cơ nhiễm vi khuẩn, virus bằng việc thi hành một hệ
thống kiểm tra chất lượng nguyên liệu ban đầu, bố trí qui trình sản xuất nhằm
bất hoạt và loại bỏ virus còn sót lại trong suốt quá trình sản xuất HTKNR,
tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn GMP ở tất cả các bước sản xuất, đáp ứng kịp
thời và phù hợp với mọi sự cố nhiễm trùng được ghi nhận trong khi sử dụng
HTKNR trên lâm sàng. Theo WHO (Guidelines, 2008), từ trước đến nay chưa
có báo cáo về trường hợp nào lây truyền virus gây bệnh qua đường sử dụng
117
kháng huyết thanh [151]. Điều đó là do các công đoạn tinh chế đã tách hết tế
bào, chỉ còn huyết tương, virus không thể tồn tại phát triển nếu không có tế
bào chủ. Đồng thời, cùng với việc sử dụng hóa chất có tính diệt khuẩn như
pepsin, ammonium sulfate, merthiolat,...cũng như các điều kiện nhiệt độ cao
kéo dài hàng giờ, pH acide thấp tới 3 và 3,5 (WHO Guidelines, 2008, [151],
[154], Burnouf T., et al 2007 [45],[46], Reid K.G., Cuthbertson B, et al., 1988
[121]); việc lọc bỏ tủa, thẩm tích, lọc vô trùng với màng lọc 0,2 µm đã góp
phần từng bước loại bỏ nguy cơ này (đã được chứng minh qua nhiều nghiên
cứu) (Terpstra F.G. et al., 2006) [140]. Tuy vậy, khi sản xuất HTKNR, chúng
ta vẫn phải luôn lưu ý, không bỏ sót vấn đề này. Cần thường xuyên chú ý các
thông tin về nghiên cứu lây nhiễm virus trong thực tế [142],[143].
4.2.1.2. Tính “Hiệu lực” của chế phẩm nghiên cứu:
Theo kết quả Bảng 3.21, đã xác định được liều chết trung bình (LD50)
của nọc rắn cạp nia Việt Nam (gồm cả hai loài rắn cạp nia bắc và nam) là 2,17
µg/chuột (18 - 20 gam). Đây là công việc bắt buộc trước khi tính ED50.
Ngay khi tiến hành thử nghiệm, đếm số chuột sống chết đã xác định
nhanh LD50 = 2 µg/chuột nhắt trắng. Tuy nhiên, để chính xác, nhóm nghiên
cứu cần phải tính toán. Khi tính LD50, chúng tôi đã sử dụng công thức tính
LD50 của G. Karber [27]: LD50 = LD100 – (Z d/n). Trong đó: Z là số trung
bình tử vong của 2 nhóm kế cận, d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm, n:
số động vật thử nghiệm trong từng nhóm. Sau khi tính toán cụ thể cho kết quả
LD50 = 2,17 µg/chuột nhắt trắng (18 - 20g). So sánh tính toán và đếm nhanh,
chúng tôi thấy tương đương (2,17 & 2), tính toán theo công thức chính xác
hơn 0,17 µg. Như vậy, nhóm nghiên cứu đã pha loãng nọc rắn với hệ số 1,5
lần (Bảng 3.21), khác so với độ pha loãng tính theo Dược điển Việt Nam IV,
2009 (theo Dược điển Việt Nam IV, bậc pha loãng là 1,2 hoặc 1,4 lần). Cách
118
tính LD50 theo công thức Karber đã được chúng tôi lựa chọn do dễ sử dụng,
dễ tính toán hơn so với các công thức tính LD50 khác, song vẫn đảm bảo độ
chính xác.
Liều chết 50% (Lethal Dose 50%) - LD50 trên chuột nhắt trắng trọng
lượng 18 - 20g/con đã được WHO khuyết cáo cách tính toán từ năm 1971.
Tuy nhiên, WHO không quy định cụ thể phải tính theo công thức tính LD50
nào, của ai [151],[27],[105]. Dược điển Việt Nam III và IV quy định cụ thể
cách tính LD50 theo Spearman – Karber tính toán phức tạp hơn cách chúng
tôi đã sử dụng (Phương pháp Karber, Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh,
1995) [27]. Phần này đã nêu trong Chương 2, đối tượng và phương pháp
nghiên cứu, mục Kiểm định quốc gia, cách tính LD50 và ED50.
Việc pha nọc rắn xác định LD50 tiến hành theo nhiều nồng độc khác
nhau. Nước muối sinh lý NaCl 0,9% dùng làm dung môi pha loãng nọc, sao
cho thể tích dịch nọc mỗi lần tiêm tĩnh mạch đuôi chuột nhắt trắng Swiss 10 -
20 gam là 0,2 ml/con, tiêm phúc mạc chuột là 0,5 ml/con. Thời gian theo dõi
chuột tiêm tĩnh mạch là 24 giờ, tiêm phúc mạc là 48 giờ, ghi nhận liều nọc
gây chết chuột từ 0% đến 100% và liều nọc gây chết một nửa số chuột (LD50),
qua đó xác định mức độ độc của nọc. Theo Bảng 3.21, LD50 nọc rắn cạp nia
đa giá là 2,17 µg trên chuột nhắt trắng 20 gam, cao hơn so với LD50 nọc B.
candidus Thái Lan trong nghiên cứu của Chanhome L. et al., 2009 (0,053 -
0,070 µg/g) [50], và của B.candidus Malaysia trong nghiên cứu của Tan N.H
et al., 2004 (0,1 µg/g) [135], đồng thời cũng thấp hơn LD50 rắn cạp nia bắc
(B.multicinctus) trong nghiên cứu của Steven D., 1999 (0,15 µg/g) [131].
Hiệu lực trung hòa hoạt tính độc của nọc là mục tiêu của sản xuất
HTKNR (Peres C.M.; Bastos F.M., et al, 2006) [114]. Bước quan trọng là
thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng cả trong phòng thí nghiệm và trên
động vật, xác định khả năng trung hòa nọc độc của HTKNR, bao gồm khả
119
năng cứu sống động vật, chống chảy máu, chống tiêu sợi huyết, chống hoại
tử, trung hòa độc tố thần kinh… do nọc độc gây nên. Đầu tiên phải xác định
hoạt tính gây chết của nọc, liều gây chảy máu tối thiểu (Minimum
haemorrhagic dose - MHD), liều đông tối thiểu của nọc tác động lên sợi huyết
và huyết tương (Minimum coagulant dose - fibrinogen & plasma: MCD-F,
MCD-P). Xác định hiệu lực trung hòa nọc 50% (ED50) của HTKNR là tiêu
chuẩn so sánh HTKNR giữa các lô của một cơ sở sản xuất với các cơ sở khác.
Chuột nhắt trắng nên dùng nhóm 5 - 6 con, trọng lượng 18 - 20 gam/con.
Dung dịch nọc cố định trộn đều với HTKNR (tăng dần). Đường tiêm tĩnh
mạch là phổ biến, đôi khi cũng dùng đường tiêm phúc mạc. Theo dõi 24 giờ
số lượng chuột sống 50% sau khi tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nọc và HTKNR
chính là khả năng bảo vệ hay hiệu lực của HTKNR. Tuy nhiên, chủng loại
chuột nhắt trắng, số lượng nọc (LD50) để trộn với HTKNR, đường tiêm cho
chuột… luôn được lưu ý để kết quả thí nghiệm đạt yêu cầu đồng khả năng thì
so sánh mới có ý nghĩa.
Các thí nghiệm xác định khả năng trung hòa của HTKNR với các hoạt
tính đặc biệt như chảy máu, phù nề, tiền đông, tiêu hủy sợi huyết, hoại tử
không thực hiện thường qui. Tuy nhiên, khi cần, có thể tham khảo tài liệu
hướng dẫn của WHO. Cần có HTKNR và nọc tiêu chuẩn tham chiếu để so
sánh, đánh giá chất lượng. Vì vậy, mỗi quốc gia, mỗi khu vực cần có tiêu
chuẩn tham chiếu nọc và HTKNR của địa phương mình.
Điểm thống nhất chung là các thử nghiệm trên động vật rất tốn kém.
Mối tương quan về nhiễm độc từ động vật tới điều trị trên người rất hạn chế
hoặc không rõ. Gần đây, các quốc gia Âu-Mỹ đề nghị không nên thử nghiệm
gây chết trên chuột. Từ đó các tác giả đưa ra thử nghiệm trên phôi gà thay thế
thử nghiệm trên động vật. Theo dõi phôi gà sống hoặc chết phản ánh khả năng
trung hòa của HTKNR với liều chết của nọc. Kỹ thuật này cũng được áp dụng
120
để xác định hoạt tính gây chảy máu của nọc và khả năng trung hòa của
HTKNR bằng cách đo đường kính vùng chảy máu khi nhỏ nọc, so sánh với
kết quả khi nọc đã được ủ trước với HTKNR. Giá thành thử nghiệm loại này
cũng rất rẻ. Tuy nhiên, thử nghiệm trên phôi gà lại không áp dụng được với
độc tố thần kinh.
Trong kiểm tra chất lượng HTKNR, trước hết là xét nghiệm xác định
khả năng trung hòa nọc độc (Neutralization potency test). Đây là khâu quyết
định hiệu quả của thuốc. Nọc rắn độc là nguyên nhân đe dọa tính mạng, đang
tồn tại trong cơ thể nạn nhân, phải được trung hòa, loại bỏ càng nhanh càng
tốt. Kết quả nghiên cứu đã xác định hai xét nghiệm về hiệu lực, đó là: liều gây
chết 50% (LD50) của nọc rắn cạp nia là 2,17 µg/chuột (20g) và liều hiệu lực
trung hòa, có khả năng giải độc cứu người của HTKN cạp nia đa giá F(ab’)2
(ED50) của loạt sản xuất nghiên cứu này là 57.14 LD50/ml = 124.2 µg/ml. Kỹ
thuật được tiến hành theo khuyến cáo của WHO, tại Đơn vị nghiên cứu chế
tạo huyết thanh kháng nọc, Trung tâm chống độc, bệnh viện Bạch Mai. Kết
quả này phù hợp với “Phiếu trả lời kết quả kiểm định số: 00610/SPĐT-NC
của Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, ngày 1/12/2010.
4.2.2. Kiểm định chất lượng của Kiểm định Quốc gia :
Kiểm định Quốc gia về HTKNR bao gồm hai nhóm kiểm định: nhóm
kiểm định an toàn, công hiệu và nhóm kiểm định tính chất lý hóa (thử nghiệm
xác định nồng độ NaCl, nồng độ protein, nồng độ chất bảo quản, pH...).
Thông thường, kiểm định Quốc gia làm công tác đánh giá chất lượng sau
cùng, sau khi kiểm định cơ sở đã tiến hành xong cho kết quả đạt yêu cầu.
Kiểm định Quốc gia được tiến hành theo yêu cầu của nhà sản xuất, thường là
kiểm định các thành phẩm đã hoàn chỉnh. Đây là những thử nghiệm được
thực hiện độc lập với cơ sở sản xuất, với các trang thiết bị hiện đại, động vật
121
thí nghiệm đạt chuẩn, phòng thí nghiệm hoàn thiện nhất, cho thử nghiệm
được tiến hành trong điều kiện tốt nhất, hóa chất chuẩn nhất, nhân viên lành
nghề nhất.... Kiểm định Quốc gia có hệ thống các quy trình kỹ thuật riêng,
tiêu chuẩn đánh giá riêng, tuân thủ gần như tuyệt đối theo các điều khoản quy
định chặt chẽ có tính pháp lý của Dược điển Việt Nam. Việc lấy mẫu kiểm
định là ngẫu nhiên, theo quy trình lấy mẫu riêng, cũng được quy định rất cụ
thể, rõ ràng trong Dược điển Việt Nam.
Mỗi quốc gia có Dược điển của mình. Sản xuất HTKNR có thể tham
khảo Dược điển các nước về tiêu chuẩn cho sản phẩm; cũng có thể tham khảo
theo hướng dẫn của WHO, tuy nhiên cuối cùng vẫn phải tuyệt đối tuân thủ
luật pháp trong sản xuất, sử dụng thuốc...theo các tiêu chuẩn quốc gia của
Dược điển Việt Nam. Do đó, kết quả thử nghiệm của Viện kiểm định quốc gia
Vắc xin và Sinh phẩm y tế (Bộ y tế) là quan trọng nhất trong kết luận về chất
lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đề tài nghiên cứu sản xuất.
Kiểm định cấp I hay kiểm định sản xuất là khâu đầu tiên của kiểm tra chất
lượng toàn diện. Kiểm định cơ sở hay kiểm định cấp II thực hiện đánh giá cơ
bản qua bốn thử nghiệm an toàn, công hiệu là rất quan trọng. Tuy điều kiện cơ
sở sản xuất chưa tốt, chúng tôi vẫn đánh giá cẩn thận theo tiêu chí chất lượng
bốn kiểm định an toàn, công hiệu (Bảng 3.18; 3.19; 3.20; 3.21). Sau khi có
kết quả của kiểm định quốc gia, đối chiếu với kết quả của chúng tôi, thấy
hoàn toàn phù hợp: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu Đạt an toàn
chung, không có chất gây sốt, vô khuẩn; chỉ khác một chút về kết quả đánh
giá công hiệu: hiệu giá do chúng tôi xác định là 285,7 LD50/lọ; Kiểm định
Quốc gia xác định là 267,5 LD50/lọ (thấp hơn 18 LD50/lọ 5 ml so với Kiểm
định cơ sở). Theo Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV, đều
không quy định cụ thể về hiệu giá HTKNR là bao nhiêu, bởi đây là khâu khó
xác định trước, do từng nhà sản xuất đặt mục tiêu. Hướng dẫn của WHO cũng
122
tương tự, không có quy định cụ thể mức đạt về công hiệu (hiệu giá). Theo
Dược điển Châu Âu (Eropean Pharmacopoeia 5.0) hiệu giá phải > 100 LD50
như vậy sản phẩm có hiệu giá gấp đôi yêu cầu [65].
Theo dõi thông tin sản phẩm HTKNR trên thế giới cho thấy: HTKN-RCN
đa giá F(ab’)2 chống nọc hai loại rắn cạp nia Bungarus candidus và Bungarus
multicinctus từ huyết tương ngựa của đề tài là sản phẩm thành công trong
phòng thí nghiệm đầu tiên trên thế giới. Các hội nghị khoa học về HTKNR
trên thế giới, gần nhất là Hội nghị độc chất học Châu Á – Thái Bình Dương
tại Vladivostoc (Nga) tháng 11/2011 và Hội nghị chống độc châu Á lần thứ X
(APAMT) tại Penang, Malaysia (2011) [89], thông tin trên các tạp chí Quốc
tế, chưa có tác giả nào thông báo sản xuất sản phẩm tương tự.
Hiện nay, trong khu vực Đông Nam Á, Thái Lan và Malaysia là hai nước
phát triển nghiên cứu sản xuất HTKNR mạnh nhất. Về sản phẩm HTKN-RCN
cho hai loài Rắn cạp nia bắc, Rắn cạp nia nam, các nước trên có nhiều nghiên
cứu đáng chú ý. Theo Fung S.Y; Ponnudurai G., Tan N.H (2004) [135], những
nhà khoa học hàng đầu của Malaysia về HTKNR - sản phẩm HTKN-RCN đa
giá, trong phòng thí nghiệm (trên thỏ) cho loài rắn cạp nia B. flavicep của
Malaixia có hiệu giá là 42 LD50/ml, 167 LD50/ml, có khả năng phản ứng chéo
trung hòa nọc rắn cạp nia B. candidus, B. multicinctus. Trước đó, Chanhome
L., Wongtongkam N., Khow O. (1999) [51], sản xuất HTKN rắn cạp nong (B.
fasciatus), cũng nhận thấy có nhiều sự tương đồng giữa nọc B. fasciatus với
nọc B. candidus, B. multicinctus. Các tác giả trên đã nghiên cứu sản xuất
HTKNR đa giá chống nọc Rắn hổ mang Thái Lan, Rắn hổ chúa và Rắn cạp
nong; sau đó thí nghiệm thử trung hòa chéo nọc độc B. candidus, B.
multicinctus trên chuột nhưng đã không thành công. Các tác giả Ponnudurai
G., Tan N.H (1990) [134] cho rằng: có nhiều sự tương đồng về kháng nguyên
nọc giữa B. flavicef, B. fasciatus với B. candidus, B. multicinctus (cùng chi
123
Bungarus). Các tác giả này cho rằng có thể dùng HTKNR B. flavicef của
Malaysia, hay B. fasciatus của Thái Lan trung hòa nọc độc B. candidus, B.
multicinctus. Tuy nhiên, điều này rất khó, khi nọc rắn có tính đặc hiệu địa
phương và khi sản xuất HTKNR đa giá, tính đặc hiệu kháng nọc giảm đi so
với HTKNR đơn giá chống một loại nọc rắn, hiệu quả khi điều trị sẽ thấp và
phải dùng số lượng HTKNR nhiều, hậu quả do protein miễn dịch khác loài
cũng cao hơn. Mặt khác, ở Việt Nam, hai loài rắn cạp nia B. fasciatus và B.
flavicef có số lượng không nhiều, nhu cầu ít hơn nhiều so với Thái Lan và
Malaysia. Trong khi đó, rắn cạp nia Việt Nam, Lào và Campuchia có đặc
điểm giống nhau. Chúng ta đang phát triển nghiên cứu về rắn cạp nia tốt hơn
so với hai nước bạn Lào và Campuchia; tương lai khi chúng ta sản xuất được
đại trà HTKN-RCN cho hai loại Bungarus candidus, Bungarus multicinctus
có thể sản xuất phục vụ các nhu cầu lớn hơn (xuất khẩu cho Lào, Campuchia,
phục vụ cơ số chiến đấu cho Quân đội...).
Láng giềng Việt Nam khác là Đài Loan, Trung Quốc hiện nay đã sản
xuất được HTKN-RCN bắc cho mình từ rất sớm. Theo Chippaux J.P, Goiffon
M. (1998) [55], HTKNR bivalent neurotoxic của Đài Loan cho rắn hổ mang
Naja naja atra và Bungarus multicinctus có hiệu giá 1ml serum potency là
100 LD50, như vậy sản phẩm của chúng ta sản xuất có hiệu giá thấp hơn của
Đài Loan, đây là thực tế, chúng ta cần nghiên cứu thêm về phương pháp của
họ để cải thiện hơn về hiệu giá.
Như vậy, sẽ còn phải chờ đợi thời gian khá lâu nữa để có sản phẩm
HTKNR trên thị trường có thể nhập về điều trị, chưa kể giá cả có hợp lý hay
không. Mặt khác, tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý sẽ là
một điều khó khăn cho ý tưởng mua HTKNR của nước khác, trừ việc họ sản
xuất theo đơn đặt hàng của chúng ta. Cũng nên tính đến tính chủ động trong
cung cấp thuốc cho nhu cầu của Việt Nam.
124
Về nhóm các tiêu chuẩn lý hóa: các thử nghiệm này chỉ được yêu cầu làm
khi có một lô HTKNR cần xuất xưởng, ra thị trường hoặc sử dụng trong lâm
sàng. Theo Bảng 3.23, các tiêu chuẩn đều đạt: pH 7.012, NaCl 0,87%; nồng
độ chất bảo quản merthiolat = 0; nồng độ protein = 7,43 g/dl (WHO < 10
g/dl); lượng albumin còn rất ít (1,4g/l), chủ yếu là globulin (48,4 g/l) với
95,6% là mảnh F(ab’)2 cho thấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu đạt
độ tinh sạch cao (Bảng 3.17). Theo khuyến cáo của WHO, nồng độ
merthiolate phải dưới 1/10.000 hoặc không nên sử dụng chất bảo quản này.
Merthiolate là chất bảo quản được sử dụng rộng rãi nhất để bảo quản vắc-xin.
Tuy nhiên, merthiolate có thủy ngân dưới dạng ethyl mercury, thông thường,
mỗi bệnh nhân nhiễm độc nặng sử dụng trên 15 lọ HTKNR, nhưng dùng đến
50 lọ vẫn an toàn. Các nước: Nga, Đan Mạch, Úc, Nhật Bản, Anh và toàn bộ
các nước vùng Scandinavian đều dùng merthiolate là chất bảo quản. Năm
1999, FDA khuyến cáo nên giảm hoặc loại bỏ merthiolate trong vắc-xin.
Trung tâm nghiên cứu và lượng giá chế phẩm sinh học Hoa Kỳ đã gửi thư tới
các cơ sở sản xuất vắc-xin yêu cầu có chương trình tiến tới không có
merthiolate trong vắc-xin và chế phẩm sinh học, đặc biệt cho trẻ sơ sinh và trẻ
em.
Tóm lại: căn cứ kết quả đánh giá chất lượng của Kiểm định cơ sở và của
cơ quan Kiểm định quốc gia, đã khẳng định: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2,
nghiên cứu sản xuất từ huyết tương ngựa, đạt chất lượng tốt: An toàn và Hiệu
lực theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV, 2009 và theo hướng dẫn của
WHO guidelines 2008, đạt mục tiêu nghiên cứu đề ra. Kết quả này đã được sơ
bộ chứng minh bằng thực tiễn lâm sàng (Tham khảo phần Phụ lục 1).
4.2.3. Về giá thành, hiệu quả kinh tế xã hội, qui mô sản xuất:
Hiệu quả kinh tế: tính toán sơ bộ, chưa kể các chi phí công lao động của
nhóm nghiên cứu và chi phí ban đầu về xây dựng labo, mua trang bị,...giá
125
thành là 70 USD/lọ (bảng 3.24), mức giá này cho thấy hiệu quả kinh tế rõ rệt
của nghiên cứu:
Giả định một bệnh nhân nằm viện, cần thở máy khoảng một tháng, chi
phí cho điều trị và thuốc men, khoảng 100 triệu đồng/người. Mỗi năm Trung
tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai có khoảng 30 bệnh nhân RCN bắc cắn,
bệnh nhân phải chi 3 tỷ đồng. Trong khi nhóm nghiên cứu sản xuất ra thuốc
điều trị cần khoảng 200 triệu đồng cho hai lô sản xuất đầu tiên. Nếu chúng ta
bán cho bệnh nhân với giá 70 USD/lọ, mỗi người cần dùng 20 lọ, sẽ chi phí
cho thuốc là 1400 USD, tương đương 30 triệu đồng/BN. Với giả thiết là 30
BN/năm, số tiền thuốc chi điều trị hết 900 triệu đồng. Đã giảm 1/3 chi phí cho
người bệnh.
So với sản phẩm của Mỹ rao bán tại địa chỉ: antibodies-online Inc. 2;
Ravinia Drive, Suite 500. Atlanta, GA 30346. USA, Phone + 1 404 474 4654.
Fax + 1 888 205 9894 (Toll-free). Giá một sản phẩm HTKNR F(ab’)2 chất
lượng tương tự như HTKN-RCN của chúng ta là: 814,67 USD: giá của họ đắt
hơn gấp > 10 lần.
Hiệu quả về mặt xã hội: nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất và
chuẩn hóa HTKN-RCN F(ab’)2 đa giá, hướng đến cứu chữa bệnh nhân tốt hơn
là việc làm thiết thực, cụ thể, thể hiện sự quan tâm của ngành y tế đối với sức
khỏe nhân dân; thể hiện tinh thần tự lực tự cường, tính dân tộc, lòng yêu nước
của các nhà khoa học y tế. Tính mạng con người là vô giá. Sản phẩm tốt, cứu
được bệnh nhân là món quà quý báu mà những người trong ngành y tế chúng
ta đã giành cho đồng bào của mình.
Về quy mô sản xuất: quy mô sản xuất phụ thuộc cung cầu của thị trường,
vì vậy không thể sản xuất lớn nếu thị trường nhỏ. Hiện chưa có thống kê cụ
thể số bệnh nhân bị tai nạn rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) xảy ra hàng
năm, ngoài một vài nghiên cứu cho thấy số bệnh nhân nằm bệnh viện Chợ
126
Rẫy do loài rắn này bị tử vong rất cao, tới trên 80%. Số nạn nhân tử vong tại
tuyến dưới và do không kịp đến bệnh viện thực tế là bao nhiêu, hiện nay chưa
có con số thống kê. Tỷ lệ tử vong trong bệnh viện lên tới trên 80% cho thấy
sự bất lực trong điều trị các bệnh nhân do rắn cạp nia nam cắn. Với vai trò
quan trọng của HTKNR trong điều trị rắn độc cắn đã được WHO khẳng định,
cùng với sự tiến bộ về công nghệ, kỹ thuật hồi sức cấp cứu và sự hiểu biết rõ
hơn về xử trí cấp cứu rắn cắn của người dân, khả năng sẽ đem đến hiệu quả
tốt trong điều trị bệnh nhân RCN nam. Vai trò của HTKN-RCN bắc đã được
khẳng định trong nghiên cứu năm 2006 của Hà Trần Hưng, Nguyễn Thị Dụ và
cộng sự. Với số bệnh nhân vào điều trị không quá trăm người một năm cho
thấy nhu cầu HTKN-RCN không lớn. Tóm lại, rất cần sản xuất HTKN-RCN
vì thực tế rất cần thiết và tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao, không có cách khắc
phục ngoài thở máy và HTKNR đặc hiệu; tuy nhiên, do nhu cầu về HTKN-
RCN của hai loài rắn cạp nia nam và rắn cạp nia bắc không cao. Cũng chỉ nên
sản xuất với qui mô nhỏ và dưới dạng đa giá F(ab’)2 gồm cả hai loài là hợp lý
nhất cả về kỹ thuật và kinh tế.
Về các loại HTKNR nên chú ý: sản xuất HTKNR cần căn cứ nhu cầu
của người bệnh. Ở nhiều quốc gia có công nghệ Dược phẩm và ngành sản
xuất thuốc phát triển, tuy nhu cầu không nhiều nhưng họ vẫn sản xuất cho đủ
chủng loại [147], như Hoa Kỳ, Đài Loan, Úc... Theo nghiên cứu của Wang
J.D., et al (Đài Loan, 2009) [145], thống kê 55 trẻ em bị rắn độc cắn tại Đài
Loan, đã chuẩn bị phương án sẵn sàng sử dụng HTKNR cho bệnh nhân bị rắn
cạp nia bắc Bungarus multicinctus, tuy nhiên, thống kê trong 13 năm, tác giả
không gặp bệnh nhân nào bị rắn cạp nia bắc cắn để sử dụng thuốc (sản phẩm
Bivalent với Naja naja atra). Hoa Kỳ có đến 6000 - 7000 nạn nhân rắn độc
cắn /năm nhưng số tử vong chỉ có 6 - 7 người (do họ có đủ loại HTKNR sẵn
sàng cung cấp cho cấp cứu, điều trị [137]. Việt Nam hiện nay nhu cầu về
127
HTKNR rất lớn. Theo Nguyễn Thiên Tạo (2011) [39], Việt Nam hiện là nơi cư
ngụ của 193 loài rắn thuộc 69 giống, 8 họ. Trong số đó ghi nhận tổng số 53
loài rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ Rắn hổ Elapidae và 18 loài (8
giống) thuộc họ Rắn lục Viperidae. Như vậy, rắn độc chiếm 53/193 loài rắn ở
Việt Nam, ~25%, cao hơn gấp đôi so với số trung bình của thế giới. Hiện nay,
chúng ta mới cung cấp được trên thị trường hai loại: HTKN rắn hổ đất và
HTKN rắn lục tre. Các sản phẩm khác đều mới sản xuất trong phòng thí
nghiệm như HTKN rắn hổ chúa, HTKN rắn cạp nia nam, HTKN rắn hổ
mang; hoặc cung cấp trong phạm vi hẹp, dạng sản phẩm nghiên cứu lâm sàng
đa trung tâm theo Quyết định của Bộ y tế như HTKN rắn choàm quạp, rắn hổ
đất + hổ mang. Như vậy, sản xuất HTKNR (antivenom) ở Việt Nam đang còn
rất nhiều việc phải làm.
Một xu hướng nữa trong sản xuất HTKNR là sản xuất HTKNR dạng đa
giá. Nói chung, với những loài rắn khác nhau về độc tính nọc, nhưng trong
cùng một họ (Elapidae, Viperidae), một chi (Bungarus), khả năng dễ chẩn
đoán nhầm lẫn hoặc ở các vùng giáp ranh, xen kẽ nơi cư trú của các loài rắn
đó, đều có thể sản xuất HTKNR đa giá; có thể dùng cho nhau, khi chưa chẩn
đoán xác định loài nào trong chúng. Thường thường, độc tính của nọc rắn vào
cơ thể, cần được trung hòa càng sớm càng tốt. Chẩn đoán chậm trễ, dùng
HTKNR muộn quá sẽ không có hiệu quả hoặc hiệu quả thấp, hoặc khi đó nọc
đã kịp gây hậu quả xấu, bệnh nhân đã tổn thương hoặc chết trước khi y tế kịp
can thiệp. HTKNR đa giá F(ab’)2 là một giải pháp tốt hiện nay trong giải
quyết vấn đề này.
KẾT LUẬN
1. Đã sản xuất thành công HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 của rắn cạp nia bắc
(Bungarus multicinctus) và rắn cạp nia nam (Bungarus candidus), đạt yêu cầu
128
với 8/8 chỉ tiêu của Tiêu chuẩn Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV, 2009), đạt
9/10 chỉ tiêu của WHO (Guidelines, 2008) về HTKNR dùng cho người.
2. HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 được nghiên cứu sản xuất đã khẳng định tính
“An toàn” và “Hiệu lực” trong phòng thí nghiệm qua Kiểm định chất lượng
cấp cơ sở và Kiểm định Quốc gia.
KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu trên người tình nguyện khỏe mạnh để xác định tính an toàn.
2. Nghiên cứu hiệu lực trung hòa độc tính nọc của HTKN-RCN đa giá