ALCAPTONURIA

Rosales ,Gabriela Cordero, BelénAragón, Carolina Martín, VanesaZambrano, Karen Ortiz, Malena

¿QUE ES LA AKU?

Enfermedad autosómica recesiva poco frecuente, en la cual el ÁCIDO HOMOGENTISICO no es metabolizado.

La enzima deficiente es la ÁCIDO HOMOGENTISICO OXIDASA.

HGA se acumula y causa la triada característica de la enfermedad: aciduria, ocronosis y artritis.aciduria

artrititis ocronosis

VÍA METABÓLICA

Uno de los síntomas más característicos: ORINA NEGRA. Debido

a que HGA se excreta en grandes cantidades en orina.

Cuando esta se expone al aire se vuelve oscura.

OCRONOSIS Es un trastorno caracterizado por el depósito

de un pigmento marrón-negruzco en el tejido conectivo y en el cartílago, como resultado de la acumulación de ácido homogentísico.

Generalmente, el primer cambio que se presenta es una ligera pigmentación de las escleróticas o los oídos.

La pigmentación aparece con la transpiración, por lo que la piel puede presentar una descoloración parduzca en la región de las axilas y los genitales.

Exámenes microscópicos, muestran que el pigmento es depositado intercelular e intracelularmente y puede ser granular u homogéneo.

El pigmento depositado en la ocronosis es un polímero derivado del ácido homogentísico, pero su estructura química no ha sido determinada.

FORMACIÓN DEL PIGMENTO

La piel y cartílago contienen una enzima llamada polifenol oxidasa del ácido homogentísico, la cual cataliza la oxidación del ácido homogentísico para el pigmento ocronótico.

Las polifenol oxidasas son enzimas que catalizan una reacción que transforma o-difenoles en o-quinonas. Las o-quinonas son muy reactivas y atacan a una gran variedad de componentes celulares, favoreciendo la formación de polímeros negro-marrón. Éstos polímeros son los responsables del oscurecimiento de tejidos.

Y finalmente conduce a artritis.

ARTRITIS La artritis es la inflamación de las

articulaciones, caracterizada por dolor y tumefacción.

Los síntomas que se presentan de manera temprana, incluyen cierto grado de limitación en el movimiento de la cadera, las rodillas y ocasionalmente los hombros.

Conforme avanza, puede existir una marcada limitación en el movimiento.

Se ha propuesto que el pigmento presente en el tejido conectivo actúa como un químico irritante que acelera el proceso degenerativo en el cartílago.

Otras manifestaciones Trastornos Cardiacos: Valvulits Mitral y aórtica Aneurisma aórtico Aneurisma del ventrículo izquierdo Arteriosclerosis en las válvulas cardiacas

Ruptura de discos invertebrales

Prostatitis Piedras en la próstata

Cálculos renales Nefrocalcinosis Nefrosis Ocronótica

Policitemia

UN POCO DE HISTORIA…

1898

•Garrod: Demuestra que la sustancia responsable es HGA

1902

•Garrod: Interpreta la enfermedad como un rasgo autosómico recesivo

1908

•Garrod: Propone que AKU resulta de la perdida de actividad de la enzima HGO

1958

•Se demuestra la ausencia de la enzima a partir de extracto de hígado, de un paciente con AKU.

1992

•Se asigna el gen de AKU a la banda 2 del brazo largo del cromosoma 3.

1995

•Fernandez- Cañon y colegas: Trabajaron con el hongo Aspergillus nidulas, lo que contribuye a la caracterizacion del gen AKU.

1996

•Se busco la proteína homologa en la genoteca de cDNA.

EL AÑO: 1996

Se identifico un clon + que contenía un gen humano cuyo producto tendría 445 aa y con 52% de similitud respecto del hongo.

Se demuestra la actividad HGO en E. coli. El gen se utiliza como una sonda en Northern

e hibrida con un RNA de tamaño esperado. El clon de c DNA se utilizó para recuperar el

gen completo a partir de una genoteca genómica.

El gen contiene 14 exones y se extiende en un total de 60 kb.

A-Secuencia Completa de nucleótidos del inserto de cDNA

B- secuencia de aa deducidas de HGO A hmgA.

C- Northern blot de la expresión de HGA en los tejidos humanos.

FISH Cuando el gen clonado se utilizo para

realizar hibridación in situ, la sonda hibridó con la banda 3q2, demostrando efectivamente que se trataba del gen responsable de AKU.

Análisis de mutaciones frecuentes en dos familias Se estudiaron dos familias españolas no

relacionadas: M y S Se utilizó ADN genómico obtenido de

leucocitos de todos los miembros AKU Los padres de estas familias no eran

consanguíneos Los 14 exones del gen HGO fueron

amplificados por PCR y secuenciados para cada miembro AKU

Los datos obtenidos permitieron identificar los diferentes alelos HGO.

FAMILIA M

Ambos padres fueron heterocigotos en el locus HGO:

Alelo normal: HGO+ Alelo mutado: HGO p230s. Esta es una

mutación de cambio de sentido (transición 817C>T) que causa pérdida de función de la enzima sintetizada.

El alelo HGO es el alelo coheredado en los enfermos.

Los dos niños de la familia AKU son homocigotas para este alelo.

FAMILIA S

Ambos padres son heterocigotos en el locus HGO.

La madre posee: HGO +/P230S El padre posee: HGO +/V300G V300G : transversión en 1028T>G en el

exón 12. Generaría una enzima no funcional.

Hijos: 1, 3 y 5 son enfermos (heterocigotas compuestos); 2 y 6 son sanos (homocigotas HGO+). El 4 porta un solo alelo mutado (+/P230S).

CONCLUSIONES

Solo los individuos afectados heredan dos alelos mutados HGO: HERENCIA AUTOSOMICA RECESIVA.

Los individuos afectados son homocigotas o heterocigotas compuestos.

Los dos tipos de mutaciones provocarían pérdida de función de HGO.

DISCUSIÓN AKU es una enfermedad relativamente

benigna y los individuos afectados tienen una expectativa de vida normal.

Durante la infancia son asintomáticos. Es característico la aparición de HGA en

orina. Pueden sufrir artritis debilitante. Los daños en el tejido conectivo, se deben

a la deposición de pigmentos ocronóticos. Como tratamiento: ac. Ascórbico que

provoca inhibición de la polifenol oxidasa, sin afectar la excreción de homogentisato.

Es común cálculos es la próstata. Se hallaron altos niveles de m RNA

de HGO en la próstata. Lo que sugiere que el catabolismo de la fenilalanina juega un papel importante en la fisiología de este órgano.

AVANCES DE LA ALCAPTONURIA

• Miguel A. Pañalva y Santiago Rodríguez de Córdoba de Madrid, identificaron y caracterizaron el gen humano HGD, única copia de 54.363 pb.

• transcripto de HGD: 17.715 pb de longitud, 14 exones que oscilan entre 35 y 360 pb.• proteína HGD: compuesta por 445

aminoácidos.• El 26% de la secuencia genómica del HGD

humano representa elementos repetitivos

Las mutaciones del gen HGD

Fernández-Cañón y colaboradores en 1996, identificaron las dos primeras mutaciones:

P230S en el exón 10 V300G que afecta al exón 12

Hoy en día hay en total 115 mutaciones conocidas de HGD.

Se creo una base de datos de mutaciones de HGD en internet http://hgddatabase.cvtisr.sk/

Todas las variantes de AKU son descriptas ahora de acuerdo a la nomenclatura de La Sociedad de Variación del Genoma Humano.

Prevalencia de mutaciones

Los distintos tipos de mutaciones en el HGD

Las 23 mutaciones más frecuentes se presentan en 361 de 496 cromosomas de AKU (72,8%)

hay alrededor de 30 cromosomas de AKU informados en los cuales no se identificó ninguna mutación en el gen HGD.

Posiblemente llevan mutaciones intrónicas profundas afectando el empalme.

Puntos críticos de mutación en el gen HGD

Beltrán-Valero de Bernabé y colaboradores mostraron que el motivo de la secuencia “CCC” y su complemento invertido “GGG” son preferentemente mutados

Son puntos críticos mutacionales en el gen HDG:

> nucleótido c.342+1 G,

> triplete “CCC”,

> los dinucleótidos CpG.

Estructura cristalina de la enzima HGD humana

La enzima en su forma activa es una proteína hexamérica, siendo un dímero de trímeros El sitio activo está formado por el dominio c-terminal y la interfaz del trímero, y contiene His292, His335, His365, His371 y Glu341.

Las interacciones intersubunidades son importantes para la actividad de la enzima HGD

La estructura de HGD puede ser fácilmente alterada por las mutaciones.

La mayoría de las enzimas mutantes mostraron una ausencia total o muy bajos niveles de actividad enzimática

Grasko y colaboradores informaron de la mutación con pérdida de sentido K57N

Mutaciones según las consecuencias estructurales: 1° : Afectan directamente a los residuos del sitio activo

• alterando el cofactor de unión .

2° : Afectan indirectamente al sitio activo• modificando su conformación.

3° : Interfieren en el plegamiento de la subunidad de HGD• alterando la estructura hidrofóbica intra-subunidad,• modificando las interacciones electrostáticas, • removiendo un aminoácido polar de una posición

importante, • introduciendo un contacto estérico desfavorable.

4° : Afectan interacciones intersubunidades • dentro del trímero, • entre trímeros.

5° : Mutaciones que truncan el C-terminal• su pérdida conduce a la pérdida de interacción y a defectos

estructurales generales.

Diagnóstico de ADN

Cuando se encuentra una nueva variante se usan varios programas.

Vilboux y colaboradores (2009), usaron cinco herramientas bioinformáticas especialmente diseñadas (SIFT, PANTHER, PMUT ,POLYPHEN, y SNAP);siendo entre 50% y 80% exactos

Más confiables (estructura en 3D),pero tienen limitaciones

Se utilizó dos herramientas BDGP y NetGene2 para analizar el potencial efecto de las variantes del sitio de empalme

HUMAN SPLICING FINDER: predice el efecto de las mutaciones del

empalme, el análisis de secuencia permite una comprobación rápida de la

mutación.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Se secuencia toda la región codificante, incluyendo las secuencias intrónicas adyacentes

Para confirmar el efecto patogénico de una nueva variante con pérdida de sentido

se recomienda probar si la variante segrega en la familia y se asocia con

la enfermedad

RELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO

No existe correlación aparente entre el genotipo de un paciente y el nivel excretado de ácido homogentísico.

El fenotipo de la enfermedad es causado por mutaciones con pérdida de función aparentemente parciales.

La correlación genotipo-fenotipo son complicados cuando se consideran pacientes con dos mutaciones diferentes

Genética de población de AKU Tiene muy baja prevalencia de 1:100.000-250.000 en la

mayoría de los grupos étnicos, y está incrementada en Eslovaquia y la República Dominicana en el orden de hasta 1:19.000.

AKU en el mundo...

Se emplean las asociaciones alélicas de los polimorfismos intragénicos del HGD

Los haplotipos del HGD son construidos en base a la segregación en la familia de algunos polimorfismos

Beltrán-Valero de Bernabé y colaboradores (1998) mostraron que los pacientes que compartían las mismas mutaciones -M368V, V300G, o P230S- también compartían el mismo haplotipo.

Los haplotipos diferían entre estos pacientes sólo en las regiones distales a la posición de la mutación.

Mutaciones

•Europa principalmete y en Finlandia, Francia, Alemania, Portugal, Eslovaquia, España, Estados Unidos y el Reino Unido, entre otros.

El cambio con pérdida de sentido

M368V es la mutación más

frecuente •Finla

ndia, Eslovaquia, India, Turquía, UAE, Reino Unido, y Estados Unidos, entre otros.

También hay otras varias mutaciones como S59fs (R58fs)

•Francia, Alemania, la isla de la Reunión, Portugal, Eslovaquia, España, Estados Unidos y el Reino Unido

V300G es una de las primeras mutaciones

de identificadas

•España, Turquía, Eslovaquia, Estados Unidos y las Islas Canarias.

P230S

•Eslovaquia, República Checa, República Dominicana.

Otras mutaciones son más específicas de algunos países o

regiones

Análisis de Haplotipo

Usada en países con una incidencia incrementada de AKU

Siendo identificadas dos mutaciones: C120W (14/16), mutación fundadora clásica G270R (2/16), es un evento de mutación

recurrente En Eslovaquia han siendo identificadas un total

de 12 mutaciones diferentes Es difícil explicar el incremento en la incidencia

de AKU en este país relativamente pequeño por un efecto fundador clásico.

La incidencia de esta enfermedad en muchos países puede que sea mayor de lo pensado.

Especificidades genéticas de la AKU ESLOVACA Revelando una notable heterogeneidad alélica de

AKU Fue realizada una asociación alélica para:

11 polimorfismos intragénicos de HGD en un total de 69 cromosomas de AKU de 32 pedigrees eslovacos.

“para estudiar el posible origen de estas mutaciones”

El estudio geográfico muestra un notable agrupamiento en un área pequeña en el noroeste de Eslovaquia. Probablemente tuvo incidencia la ruptura del

aislamiento genético en 1950

Análisis y comparación de haplotipos Fueron observadas en Eslovaquia dos grupos

de mutaciones HDG:

El 1 er grupo: P230S, V300G, S59fs (R58fs), M368V e IVS1-1

G>A Probablemente introducidas por las

poblaciones fundadoras que se diseminaron por Europa.

El 2do grupo: son las restantes siete mutaciones

establecidas más predominantes G161R (44,2%), D153fs (G152fs) (14,4%), H371fs (P370fs) (11,5%), y G270R (7,7%), IVS5+1 G>A, S47L y E178G

Es probable que se hayan originado en Eslovaquia

Se a demostrado que las mutaciones que se originaron en Eslovaquia están asociadas con secuencias hipermutadas en el HGD

Es responsable de la alta heterogeneidad génica una determinada mutación

El incremento en el número de mutaciones podría ser por: • La acumulación azarosa de mutaciones en la

región• La colonización Valaquia

La preservación de las variantes de AKU más predominantes, pueden ser el resultado de:• Un efecto fundador y derivaciones genéticas.

GRACIAS POR SU ATENCION!!!!! Que tengan un buen viernes!!!!