revista asebir diciembre 2009

Dic

iem

bre

2009

Vol

.14

· N

º2

REVISTA

ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN

PROGRAMA CIENTÍFICO

GRUPO DE INTERES ASEBIR

SESIÓN EMBRIOLOGÍASESIÓN ANDROLOGÍA

SESIÓN GENÉTICA Y REPRODUCCIÓN

AULA VIRTUAL

DEBATE

EVOLUCIÓN PREMIOS ASEBIR EMB 2007

COMUNICACIONES ORALES

COMUNICACIONES POSTER

AGRADECIMIENTOS

CONGRESO ACREDITADO POR LA COMISIÓNDE FORMACIÓN CONTINUADA DE LA COMUNIDADVALENCIANA CON 2,5 CRÉDITOS

CON LA COLABORACIÓN DEL VICERRECTORADODE INVESTIGACIÓN Y POLÍTICA CIENTÍFICADE LA UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

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SUMARIO

Í N D I C E

EDITAAsociación para el Estudio de la Biología

de la Reproducción (ASEBIR).

JUNTA DIRECTIVAPresidente: Mark Grossmann i Camps.

Vicepresidenta: Mª Victoria Hurtado

de Mendoza.

Secretaría: Nieves Cremades Fernández

Tesorero: Manuel Ardoy Vilches

Vocalía de Docencia y Formación: Jorge

Martín Cuadros Fernández, Montserrat

Boada Palá.

Vocalía del Sitio Web: Jorge Ten Morro,

Fernando Marina Rugero.

Vocalía de Publicaciones: María Bonada

Sanjaume, Antonio Urries López.

Vocalía de Congresos: Mª José de los

Santos Molina, Begoña Arán Corbella,

Nieves Cremades Fernández.

Vocalía de Relaciones Públicas: Fernando

Marina Rugero, Jorge Ten Morro.

COORDINACIÓNMaría Bonada Sanjaume,

Antonio Urries López.

PUBLICIDAD YCOLABORACIONESSecretaría ASEBIR

C/ Cronos 20, Edificio 4, 1º, 6ª

28037 Madrid - Tfno: 91 367 89 94

www.asebir.com · [email protected]

DISEÑO, MAQUETACIÓNE IMPRESIÓNGÓBALO

Gráfica · Web · Multimedia · Consultoría

C/ Nogal 1, 1º Pta.31

28250 · Torrelodones · Madrid

Tfno - Fax.: 91 859 57 22

www.gobalo.es · [email protected]

Depósito legal: M-18873-1996

ISSN: 1136-4424

Soporte válido: 78-R-CM

EDITORIAL 3Mark Grossmann i Camps y Mª José de los Santos Molina.

PROGRAMA CIENTÍFICO CONGRESO ASEBIR 4GRUPO DE INTERES ASEBIR 8Estado Actual del Grupo de Interés de Calidad Embrionaria. Jorge Cuadros

Indicadores Laboratorio de Embriología Clínica Juan Manuel Moreno

Estado Actual del Grupo de Interés de DGP Esther Fernández

Registro de la Sociedad Española de Fertilidad de Técnicas de Reproducciónasistida Jose A. Castilla

SESIÓN EMBRIOLOGÍA 22Requisitos del laboratorio de embriología clínica M. Cristina Magli, Luca Gianaroli, Anna P. Ferraretti

Manejo de pacientes con enfermedades infecciosas en el laboratorio deReproducción Asistida. ¿Representa realmente un riesgo en el laboratorio?Fernando Marina, Ruth Alcolea y Simón Marina

Oocyte and Embryo Oxygen Consumption Can it tell us anything aboutdevelopmental potential? Lynette Scott, PhD,

SESIÓN ANDROLOGÍA 33Integridad del ADN y patrón de expresión génicaMarcos Meseguer, Sandra García-Herrero, Cristobal Aguilar, Thamara Viloria,Nicolás Garrido

Impacto del Grado de Fragmentación del ADN en los resultados en FIVconvencional e ICSIJorge Ten, Joaquín Llácer, Belén Lledó, Adoración Rodríguez, Ruth Morales, RafaelBernabeu

SESIÓN GENÉTICA Y REPRODUCCIÓN 47Uso de Microarrays en Diagnóstico Genético Preimplantacional Carles Giménez

¿Qué nos aporta el estudio de FISH en espermatozoides en el estudio de la parejainfértil?Joan Blanco, Zaida Sarrate, Ester Anton, Lydia Garcia-Quevedo, ÒscarMolina, Francesca Vidal

Infertilidad y Genética: Producción de Gametos a partir de Células MadreEmbrionarias. Ana Isabel Marqués Marí , Carlos Simón

AULA VIRTUAL 63La microscopía de luz polarizada: aplicaciones clínicas en las técnicasde reproducción asistida Gemma Arroyo

DEBATE 68Mitos y Leyendas en el laboratorio de Embriología Clínica: Efecto perjudicial de laluz del laboratorio sobre los embriones humanosA FAVOR - Emilio Gómez Sánchez e Inmaculada Torres GonzálezEN CONTRA - Antonio Urries, Carolina Roméu, Montse Lierta, Cristina Calzada

EVOLUCIÓN PREMIOS ASEBIR EMB 2007 72Incidencia de anomalías epigenéticas de los loci H19 y SNRPNen espermatozoides de individuos que consultan por problemas de fertilidadMarta Pladevall, Cristina Camprubí, Joan Blanco

Vitrificación y hatching asistidoEmpar Ferrer, Minerva Ferrer, Carmen Calatayud, Miguel Ruiz Jorro y Maria Vila.

COMUNICACIONES ORALES 89COMUNICACIONES POSTER 118AGRADECIMIENTOS 228

Diciembre 2009 Vol. 14 · Nº2

SUMARIO Pág.

af.interior:Maquetaci n 1 09/11/2009 10:03 PÆgina 1

E D I T O R I A L

Diciembre 2009 Vol. 14 · Nº 2

QUERIDOS COMPAÑEROS Y COMPAÑERAS DE ASEBIR

Tenéis en vuestras manos el libro de comunicaciones de nuestro V Congreso ¡Todo un orgullo llegar a este número! Y gran satisfacciónobservar que nuestra sociedad sigue creciendo y consolidándose como podéis apreciar por la respuesta: muchas inscripciones queesperamos se conviertan en un alto grado de participación, más comunicaciones enviadas que en las ediciones anteriores y trabajosde gran interés.

A pesar de la crisis económica, nuestras mentes y espíritu emprendedor en el área clínica y básica no se han visto en absolutoafectados ¡Enhorabuena!

Esperamos que encontréis muy interesantes las ponencias, los trabajos seleccionadas, así como los temas elegidos para losSimpósiums Satélites. Los comités organizador y científico han participado considerablemente para conseguirlo, sin olvidar lainestimable ayuda de la secretaría de nuestra sociedad. En la línea de la edición anterior en Bilbao, la comisión de FormaciónContinuada de la Comunidad Valenciana nos reconoce con 2,5 créditos el interés formativo del Congreso, otro paso más que puedeayudarnos a conseguir nuestra identidad en el área de la Biología de la Reproducción.

Una vez más, queremos hacer extensivo nuestro agradecimiento a nuestros colaboradores de la industria que han contribuidoenormemente a que el V Congreso de ASEBIR sea una realidad. El éxito del Congreso dependerá de todos nosotros, claro, perotambién del soporte continuo que recibimos de ellos, nuestros proveedores.

El Congreso de Valencia será el primero en el que se elija una Junta Directiva por el sistema de listas cerradas. En su día propusimosesta modificación para tener equipos directivos compactos capaces de afrontar nuevos hitos y para que ASEBIR siga creciendo yobtenga el máximo reconocimiento, tanto en la investigación básica como en la embriología clínica, en todos los niveles de laAdministración. Elegir una nueva Junta Directiva significa también el cese de las anteriores, y en concreto en esta ocasión, BegoñaAran, Nieves Cremades y M. Victoria Hurtado de Mendoza finalizan sus responsabilidades después de nueve años de dedicación, queson muchos, con muchas energías consumidas y muchos proyectos realizados. Aunque seguro que ellas que no se desvincularán deASEBIR, sabemos que en Valencia estarán muy tristes y esperamos que las miméis mucho.

Finalmente, deseamos que disfrutéis de vuestra estancia en Valencia y os extendemos una calurosa bienvenida al mismo tiempo queenviamos un afectuoso recuerdo a los que, por permitir que otros compañeros asistan al evento y así no desatender a los pacientes,no podáis estar con nosotros.

¡Un abrazo! ¡Nos vemos en Valencia!Atentamente,

Dra. Mª José de los Santos Mark Grossmann i CampsPresidenta del Comité Organizador Presidente de ASEBIR

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COMITÉ DE HONOR:

· EXCMA. SRA. DÑA. TRINIDAD JIMÉNEZ GARCÍA-HERRERA. Ministra de Sanidad y Política Social del Gobierno de España

· HONORABLE SR. MANUEL CERVERA TAULET. Conseller de Sanitat de la Generalitat Valenciana

· PROFESOR D. ESTEBAN MORCILLO SÁNCHEZ . Vicerrector de Investigación y Política Científica de la Universitat de València

PRESIDENTA· Dra. Mª José de los Santos

VOCALES· Dra. Carmela Albert· Dra. Pilar Buendía· Dra. Juana Crespo· Dr. José Mª de los Santos· Dra. Arancha Delgado· Dra. Blanca Gadea· Dra. Arancha Galán

· Dra. Pilar Gámiz · Dra. Noelia Grau · Dra. Emilia Mateu· Dra. Amparo Mercader· Dra. Amparo Mifsud· Dr. Miguel Milán· Dr. Antonio Pellicer· Dra. Amparo Ruiz· Dr. Alberto Tejera · Dra. Tamara Viloria· Dr. Jesús Zulategui

· Dra. Begoña Arán· Dra. Montserrat Boada· Dra. Ana Cobo· Dra. Nieves Cremades· Dr. Jorge Martín Cuadros· Dra. Mª José Escribá· Dr. Nicolás Garrido· Dr. Julio Martín· Dr. Marcos Meseguer

· Dra. Inmaculada Molina· Dr. Joaquín Moreno· Dra. Sonia Pérez· Dra. Lorena Rodrigo· Dr. Josep Lluis Romero· Dra. Carmen Rubio· Dra. María Vila

V C O N G R E S O N A C I O N A L D E A S E B I R

Programa Científico4

COMITÉ ORGANIZADOR COMITÉ CIENTÍFICO

SECRETARÍA TÉCNICAGrupo Process, Betaprocess, S.L.C/ Cronos, 20, Bloque 4, 1º, 6ª - Madrid 28037 · Telf.: +34 91 377 14 23Fax: +34 91 377 49 65E-mail: [email protected]

· Congreso acreditado por la Comisión de Formación Continuada de la Comunidad Valenciana con 2,5 créditos

· Con la colaboración del Vicerrectorado de Investigación y Política Científica de la Universitat de València.

· Congreso auspiciado por la Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia (S.E.G.O.)

PATROCINADOR PLATINO

OTROS PATROCINADORES


MIÉRCOLES, 25 DE NOVIEMBRE - TARDE15:00 - 20:00 hrs. Apertura de secretaría y colocación de Pósters I.

16:00 - 17:00 hrs. Inauguración oficial del V Congreso Nacional ASEBIR.

17:00 - 19:30 hrs. Grupos de Interés ASEBIR. Moderadora: Mª José Figueroa (Cádiz) - Inmaculada Molina (Valencia).

17:00 - 17:30 hrs. Estado actual del Grupo de Interés de Calidad Embrionaria. Actualización de la clasificación de ASEBIR.Ponente: Dr. Jorge Martín Cuadros (Clínica FIV, Madrid)

17:30 - 18:00 hrs. Creación del tercer Cuaderno de Embriología “Afianzamiento de calidad: aspectos técnicos y aspectos biológicos”.Ponente: Dr. Manuel Ardoy (H. Univ. Gregorio Marañón, Madrid)

18:00 - 18:30 hrs. Indicadores Laboratorio de Embriología Clínica. Ponente: Dr. Juan Manuel Moreno (Clínica Vistahermosa, Alicante)

18:30 - 19:00 hrs. Estado actual de Grupo de Interés de DGP. Ponente: Dra. Esther Fernández (GENIALITY, Madrid)

19:00 - 19:30 hrs. Registros SEF. Ponente: Dr. José Antonio Castilla (H. U. Virgen de las Nieves, Granada)

20:30 hrs. Cocktail Inaugural en el Palacio de Congresos.


P R O G R A M A C I E N T Í F I C O



Programa Científico

JUEVES, 26 DE NOVIEMBRE - MAÑANA08:00 - 14:00 hrs. Apertura de secretaría y colocación de Pósters II.

09:00 hrs. Apertura mesa electoral ASEBIR.

09:00 - 11:00 hrs. Sesión Embriología. Moderadores: Amparo Ruiz (Valencia) - María Bonada (Londres).

09:00 - 09:40 hrs. Ponencia I: Requisitos del laboratorio de embriología clínica: Implicaciones de la transposición de las Directivas Europeas. Ponente Dra. Cristina Magli (Clínica SISMER, Bologna).

09:40 - 10:20 hrs. Ponencia II: Manejo de pacientes con enfermedades infecciosas en laboratorio de Reproducción Asistida. ¿Representa realmente un riesgo en el laboratorio? Ponente Dr. Fernando Marina (I. de Reproducción CEFER, Barcelona)

10:20 - 11:00 hrs. Ponencia III: Métodos no invasivos de evaluación de la calidad embrionaria. Respirometría.Ponente Dra. Lynette Scott (Reading. MA, USA)

11:00 - 11:30 hrs. Pausa café.

11:30 - 13:10 hrs. Comunicaciones Orales. Sesión Embriología Moderadores: Mª José Escribá (Valencia) – Ezequiel Pérez Campos (SEC).

11:30 - 11:40 hrs.Comunicación O-001 - Análisis de la calidad ovocitaria mediante el consumo de oxígeno; relación con fecundación, desarrollo y calidad embrionaria. A. Tejera, J. Herrero, P. Romero, M. J. de los Santos, J. Remohí, M. Meseguer.(IVI, Valencia)

11:40 - 11:50 hrs.Comunicación O-002 - Análisis de la inducción de la reacción acrosómica en el espermatozoide humano mediante el uso de ZP3 recombinante expresada en diferentes líneas celulares de ovario de hámster chino con glicosilación modificada. M. T. Zomeño-Abellán, M. A. Ramírez, A. Gutiérrez-Adán, M. J. Izquierdo-Rico, M. Jiménez-Movilla, J. L. Girela, M. J. Gómez-Torres, J. De Juan, J. Ballesta, J. C. Martínez, J. Landeras, M. Avilés. (F. Medicina, UM, Murcia)

11:50 - 12:00 hrs.Comunicación O-003 – Fertilidad previa en donantes de ovocitos: ¿factor predictivo de embarazo? L. Echeverria, E. Clua, M. Boada, L. Latre, F. Martínez, A. Veiga. (USP Institut Universitari Dexeus. Barcelona)

12:00 - 12:10 hrs.Comunicación O-004 - Identificación de embriones de ratón mediante micropartículas codificadas de polisilicio. S. Novo, R. Gómez, L. Barrios, M. Duch, J. Esteve, J. A. Plaza, J. Santaló, C. Nogués, E. Ibáñez. (F. Biociències, UAB, Barcelona)

12:10 - 12:20 hrs.Comunicación O-005 - Diferencias en la expresión génica y localización de los precursores proteicos de los péptidos opioides POMC y PDYN en espermatozoides humanos. N. Subirán, F. M. Pinto, J. L. de Pablo, M. Fernández-Sánchez, M.L.Candenas, J. Irazusta. (UPV/EHU. Leioa, Bizkaia)

12:20 - 12:30 hrs.Comunicación O-006 - Aplicación de la tecnología del embrioscope para la cuantificación de la calidad ovocitaria mediante el análisis de los patrones de respiración. J. Herrero, A.Tejera, J. M. de los Santos, M. J. de los Santos, A. Pellicer, M. Meseguer. (IVI, Valencia)

12:30 - 12:40 hrs.Comunicación O-007 - El cultivo de embriones en bajas tensiones de oxígeno, mejora las tasas de gestación e implantación en ciclos de donación de ovocitos: Resultados preliminares. P. Gámiz, A. Tejera, J. M. De Los Santos, S. Pérez, C. Albert, P. Romero, M. J. De Los Santos. (IVI, Valencia)

12:40 - 12:50 hrs.Comunicación O-008 - Influencia de la multinucleación en las tasas de implantación y de aborto en un programa de fecundación In Vitro. C. Alonso, M. Lara, B. Buch, C. Segura, R. Garnica, M. Martínez-Moya. (UR, Centro Gutenberg, Málaga)

12:50 - 13:00 hrs.Comunicación O-009 - Resultado acumulado tras la transferencia de embriones re-vitrificados en ciclos de donación deovocitos de banco. A. Mifsud, D. Castelló, N. Grau, M. Meseguer, J. M. de los Santos, A. C. Cobo. (Instituto Universitario IVI, Valencia)

13:00 - 13:10 hrs.Comunicación O-010 - Congelación lenta vs. Vitrificación con Cryotop en día 3 de desarrollo y blastos estadio de blastocisto. Resultados del 2008 en el IVI Madrid. L. Herrero, S. Pareja, C. Losada, M. Jiménez, J. Fernández, Y. Mínguez. (IVI, Madrid)

13:10 - 14:00 hrs. Simposium Satélite. EMB-Nidacon.

14:00 - 16:00 hrs. Comida congresual.

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JUEVES, 26 DE NOVIEMBRE - TARDE15:00 - 19:30 hrs. Apertura de secretaría.

16:00 - 17:20 hrs. Sesión Andrología. Moderadores: Miguel Ruiz (Valencia) - Ferran García (ASESA).

16:00 - 16.40 hrs. Ponencia I: Marcadores moleculares de calidad espermática. Ponente. Dr. Marcos Meseguer (IVI, Valencia).

16:40 - 17:20 hrs. Ponencia II: Integridad del ADN espermático y su efecto sobre la calidad embrionaria. ¿Es clínicamente útil?Ponente Dr. Jorge Ten (Instituto Bernabeu, Alicante)

17:20 - 18:20 hrs. Sesión de Pósters.

18:00 hrs. Cierre mesa electoral ASEBIR.

18:20 - 19:30 hrs. Comunicaciones Orales. Sesión Andrología. Moderadores: Joaquín Moreno (Valencia) -Nieves Cremades

(Alicante).

18:20 - 18:30 hrs.Comunicación O-011 - Patrón de expresión génica diferencial entre muestras de semen que consiguen o no embarazo con la misma cohorte oocitaria en ciclos de ICSI con ovocitos Donados. S. García-Herrero, N. Garrido, J. A. Martínez-Conejero, A. Pellicer, J. Remohí, M. Meseguer. (IVI, Valencia)

18:30 - 18:40 hrs.Comunicación O-012 - Relación entre la fragmentación del DNA espermático y las tasas de implantación, embarazo evolutivo y aborto en ciclos de FIV. C. Puche, A. Rabanal, C. Castelló, A. Busquets, A. Farreras, E. Toro, E. Velilla, F. García, M. López-Teijón, J. G. Álvarez.(Instituto Marqués, Barcelona)

18:40 - 18:50 hrs.Comunicación O-013 - Asociaciones entre metabolitos urinarios de ftalatos [Di(2-etilhexil) ftalato (DEHP)] y niveles de hormonas reproductivas en varones fértiles. J. Mendiola, N. Jørgensen, A. M. Andersson, F. Liu, S. H. Swan. University of Rochester Medical Center, New York, USA)

18:50 - 19:00 hrs.Comunicación O-014 – Efecto del tabaco sobre la oxidación del ADN espermático y su defensa contra el estrés oxidativo. T. Viloria, M. Meseguer, J. A. Martínez-Conejero, P. Romero, J. Remohí, N. Garrido. (IVI, Valencia)

19:00 - 19:10 hrs.Comunicación O-015 - La Met-encefalina se expresa en espermatozoides humanos y regula la movilidad espermática por vía de los receptores opioides. N. Subirán, M. L. Candenas, E. Agirregoitia, F. M. Pinto, J. L de Pablo, C. G. Ravina, J. Irazusta.(UPV/EHU. Leioa, Bizkaia)

19:10 - 19:20 hrs.Comunicación O-016 - Validación de un nuevo sistema automático para el estudio de aneuploidías en espermatozoides. S. Santillán, X. Vendrell, E. García-Mengual, M. Pérez Alonso. (Sistemas Genómicos. Valencia)

19:50 - 19:30 hrs.Comunicación O-017 - Relación entre las vacuolas nucleares observadas por alta magnificación en espermatozoides y la fragmentación del ADN espermático. M. González, M. Dorado, M. Hebles, B. Migueles, L. Aguilera, F. Sánchez, J. A. Lara, A. Rodríguez, P. Sánchez. (Clínicas GINEMED, Sevilla)

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Programa Científico

VIERNES, 27 DE NOVIEMBRE - MAÑANA08:00 - 14:00 hrs. Apertura de secretaría.

08:30 - 10:30 hrs. Sesión Genética y Reproducción. Moderadores: Begoña Arán (Barcelona) - Carmen Rubio (Valencia).

08:30 - 09.10 hrs. Ponencia I: Uso de Microarrays en Diagnóstico Genético PreimplantacionalPonente: Dr. Carles Giménez (Reprogenetics Spain, Barcelona).

09:10 - 09:50 hrs. Ponencia II: Qué nos aporta el análisis genético en espermatozoides en la pareja infértil.Ponente Dr. Joan Blanco (UAB, Barcelona)

09:50 - 10:30 hrs. Ponencia III: Infertilidad y genética: Producción de gametos a partir de células madre embrionarias.Ponente Dra. Anabel Marqués (C. de Investigación Príncipe Felipe, Valencia)


11:00 - 11:50 hrs. Comunicaciones Orales. Sesión Genética y Reproducción Moderadores: Montserrat Boada (Barcelona) - Ana

Monzó (SEF)

11:00 - 11:10 hrs. Comunicación O-018 - Blastocistos vitrificados procedentes de Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) como fuente para la derivación de células madre embrionarias (CME). M. Solé, B. Aran, M. Parriego, I. Rodríguez-Pizà, J. Santaló, M. Boada, B. Coroleu, A. Veiga. (I. U. Dexeus, Barcelona)

11:10 - 11:20 hrs. Comunicación O-019 - Hibridación genómica comparada en célula única (SC CGH): nueva herramienta para el screening genético preimplantacional (SGP). B. Lledó, J. A. Ortiz, R. Morales, R. Bernabeu. (Instituto Bernabeu Biotech, Alicante)

11:20 - 11:30 hrs. Comunicación O-020 - Correlación entre las anomalías cromosómicas observadas en espermatozoides y en embriones preimplantatorios. L. Rodrigo, V. Peinado, E. Mateu, M. Milán, P. Mir, N. Al-Asmar, M. Gil-Salom, C. Rubio. (IVI, Valencia)

11:30 - 11:40 hrs. Comunicación O-021 - Estudio de embriones cromosómicamente alterados procedentes de ciclos de FIV-DGPI y su relación con el tipo de anomalía meiótica. A. Colomar, S. Fernández, E. Toro, O. Serra, F. Del Rio, G. López, M. Brassesco, J. G. Álvarez, M. López-Teijón, E. Velilla.(Institut Marquès, Barcelona)

11:40 - 11:50 hrs. Comunicación O-022 - Translocaciones robertsonianas: estudio de segregación y efecto intercromosómico en embriones preimplantacionales. A. R. Jiménez-Macedo, L. Rabinad, E. García-Guixé, C. Giménez, M. Sandalinas. (Reprogenetics Spain, Barcelona)

11:50 - 12:35 hrs. Simposium Satélite. ORIGIO MediCult Media.

12:35 - 14:00 hrs. ASAMBLEA ASEBIR

14:00 - 16:00 hrs. Comida congresual

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VIERNES, 27 DE NOVIEMBRE - TARDE15:00 - 19:30 hrs. Apertura de secretaría.

16:00 - 16.40 hrs. Sesión Aula Virtual. Moderadores: Victoria Hurtado de Mendoza (Sevilla) – Jesús Zulategui (Valencia)

Uso y aplicación de clínica de la luz polarizada en Reproducción. Ponente: Dra. Gemma Arroyo (Institut Universitari Dexeus, Barcelona).

16:40 - 17:20 hrs. Sesión Debate. Moderadores: Victoria Hurtado de Mendoza (Sevilla) – Pilar Gámiz (Valencia)

Mitos y Leyendas en el laboratorio de Embriología Clínica: Efecto perjudicial de la luz del laboratorio sobre los embriones humanos.

Ponentes: Dr. Antonio Urries (Clínica Quirón, Zaragoza). Dr. Emilio Gómez (TAHE Fertilidad, Murcia).


17:40 - 17:55 hrs. Premio IVI al Mejor Póster 2009 (Auditorio III - Sala Póster) Entregará el premio la Dra. Amparo Ruiz (IVI, Valencia)

18:00 - 19:00 hrs. Comunicaciones Orales. Ovocito como objeto de investigación. Moderadores: Arancha Galán (Valencia) - Jorge Ten

(Alicante).

18:00 - 18:10 hrs. Comunicación O-023 - Efecto de la vitrificación con “Cryotop” sobre la configuración del huso meiótico “in vivo”. J. F. Zulategui, M. J. de los Santos, V. García, A. Galán, J. L. Romero, A. C. Cobo.( IVI, Valencia)

18:10 - 18:20 hrs. Comunicación O-024 - Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico y organización cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. C. C. Duque, J. Alfonso, R. P. Cervera, A. Monzó, V. Montañana, R. Moreno, M. Stojkovic, A. Romeu. (URH Hospital Universitario la Fe, Valencia)

18:20 - 18:30 hrs. Comunicación O-025 – Estudio mediante Embryoscope de la maduración nuclear de oocitos VG recuperados de ciclo estimulado. Efecto del envejecimiento oocitario in vitro sobre la competencia citoplasmática. N. Grau, L. Escrich, T. Viloria, P. Gamiz, M. Borges, M. J. Escribá. (IVI, Valencia)

18:30 - 18:40 hrs. Comunicación O-026 - Metabolómica del líquido folicular procedente de ciclos naturales y estimulados mediante Resonancia Magnética Nuclear de alta resolución. V. García-Laez, E. Piñero-Sagredo, M. J. de los Santos, V. Esteve, B. Celda. (IVI, Valencia)

18:40 - 18:50 hrs. Comunicación O-027 – Resultados del estudio de la tasa de aneuploidías en ovocitos de donante tras análisis del primer y segundo corpúsculo polar mediante FISH. E. Velilla, A. Colomar, S. Fernández, E. Toro, A. Casanovas, O. Serra, R. Olivares, M. López-Teijón. (Institut Marquès, Barcelona)

18:50 - 19:00 hrs. Comunicación O-028 - Los ovocitos humanos expresan los receptores cannabinoides CB1 y CB2 y su localización varía en los diferentes estados de maduración ovocitaria. L. Peralta, E. Agirregoitia, R. Mendoza, A. Expósito, R. Matorras, N. Agirregoitia. (Dpto. Fisiología, F. Medicina y Odontología UPV/EHU, Leioa, Bizkaia)

19:00 - 19:30 hrs. Exposición Premios ASEBIR-EMB 2007. Moderadores: Mark Grossman i Camps (Barcelona) - Mª José de los Santos (Valencia)

19:00 - 19:15 hrs. Premio ASEBIR-EMB de Investigación Básica 2007 “Incidencia de anomalías epigenéticas de los loci H19 y SNRPNen espermatozoides de individuos que consultan por problemas de fertilidad” Ponente: Dra. Marta Pladevall Sierra (UAB, Barcelona)

19:15 - 19:30 hrs. Premio ASEBIR-EMB de Embriología Clínica 2007 “Vitrificación y hatching asistido” Ponente: Dra. Empar Ferrer Robles (CREA, Valencia)

19:30 - 20:00 hrs. Clausura V Congreso de ASEBIR 2009 por parte del Dr. Mark Grossmann, Presidente de ASEBIR y la Dra. Mª José

de los Santos, Presidenta del Comité Organizador.

21:30 hrs. Cena de Clausura, anuncio y entrega de los Premios ASEBIR-EMB 2009 por parte del Sr. Sergio Oliveró (Dir. Gral. Grupo

EMB) y la Dra. Mª José de los Santos (Pta. Comité Organizador)


G R U P O D E I N T E R É S A S E B I R

Jorge Cuadros. Clínica FIV Madrid

El año 2005, en el Congreso de ASEBIRde Zaragoza, Mª Jose Torelló presentóuna ponencia donde se comunicaban losresultados de un año de trabajo de laComisión “Definición de criterios devaloración morfológica y sucategorización, de oocito a blastocisto”,cumpliendo el encargo de la JuntaDirectiva de ASEBIR de alcanzar unconsenso para la clasificación de losembriones humanos, valorando lascaracterísticas de los oocitos y de lospreembriones desde cigoto hastablastocisto. Hasta entonces, no existíauna clasificación universalmenteaceptada, mediante la cual se pudieraseleccionar los embriones con mayorpotencial de implantación, para latransferencia embrionaria.

Hasta entonces, y hasta la fecha, lascaracterísticas morfológicas de losoocitos y embriones se han utilizadopara alcanzar este objetivo, seleccionarlos mejores embriones para conseguir,sobre todo, un embarazo único. Sinembargo, son numerosos los parámetrosmorfológicos que podrían ser valoradosy, de hecho, diferentes laboratoriosalrededor del mundo han escogidodiferentes parámetros para la selecciónembrionaria. A parte de parámetros yaclásicos, como el número de células, elporcentaje y tipo de fragmentacióncitoplásmica, el tamaño de las células yla ausencia de multinucleación, se hanutilizado otros parámetros como ladistribución de los cuerpos precursoresnucleolares, la división temprana, elinicio de adhesión en día 3, y otros más.Inclusive hay quienes han sugerido laposibilidad de seleccionar los cigotos oembriones con una sola imagen puntual,como podría ocurrir en el estadio depronúcleos. En algunos casos esto hasurgido por las exigencias legales dealgunos países.

Ante la diversidad de sistemas declasificación y sistemas de puntuación,en muchos casos sólo útiles a nivel

interno en el laboratorio, surgía elproblema de la dificultad paraintercambiar información entrelaboratorios para, por ejemplo,desarrollar estudios multicéntricos,haciéndose necesario, en el caso de laliteratura científica, tener muy clarocómo se seleccionan los embriones encada artículo, para comprender elalcance de los resultados. También hay que llamar la atención sobre los resultados, en muchos casoscontradictorios, respecto de lacapacidad de algunos de los parámetrossugeridos para determinar el potencialde implantación de los embriones.

En este contexto, la Comisión “Definiciónde criterios de valoración morfológica y sucategorización, de oocito a blastocisto”realizó un esfuerzo para alcanzar eseconsenso que pudiera ser aceptado demanera general por cualquier laboratorio.Siendo un acuerdo de mínimos, tuvimosen cuenta la posibilidad de que losembriólogos clínicos expertos echaran demenos algún parámetro que ellosutilizaran en sus laboratorios. Sinembargo, esperábamos que nadie tuvierareparos en aceptar los parámetrossugeridos como determinantes de lacalidad de los embriones.

Y así se presentó el sistema declasificación embrionaria, ahoraconocido como “clasificación ASEBIR”.La aceptación general fue muy positiva;sin embargo, nada más cumplido esteencargo, la primera conclusión a la quellegamos dentro de la Comisión, cuyafunción se extinguía, fue que realmenteno habíamos terminado el trabajo, queno habíamos hecho nada más queempezar, y que era imperativo continuaresta labor, para lo cual solicitamos a laJunta Directiva de ASEBIR laconstitución del Grupo de Interés“Calidad Embrionaria”.

El trabajo realizado por la Comisión,luego Grupo de Interés, se plasmó en el

II Cuaderno de Embriología Clínica deASEBIR “Criterios ASEBIR de valoraciónmorfológica de oocitos, embrionestempranos y blastocistos humanos”,cuya 2ª edición se imprimió en 2007. Eneste tiempo, el Grupo ha pasado de los10 integrantes de la Comisión, a 14miembros pertenecientes a centros dereproducción asistida de toda España, yhemos revisado algunos de los aspectosque no fueron concluyentes en el trabajoinicial.

Por ejemplo, realizamos ya una nuevarevisión exhaustiva de la literatura sobrela división temprana. La primerarevisión, que se encuentra en el IICuaderno de Embriología Clínica, nopermitió concluir si la división tempranaes o no determinante del potencial deimplantación embrionaria. En estasegunda revisión tampoco encontramossuficientes argumentos en la literaturacomo para modificar lo establecidoinicialmente. No se ha demostrado fuerade toda duda que la división tempranasea determinante de la calidadembrionaria. Sin embargo, podemosmantener como recomendación que, unavez que se haya realizado la selección delos mejores embriones en base a lascaracterísticas morfológicas elegidas,entre embriones de calidad similar sepodría escoger los que hayan presentadodivisión temprana a las 24-27 horas.

De esto, también dedujimos, en estepunto, que la manera de profundizar enel conocimiento del embrión debía sercon nuestros propios datos, evaluando ennuestros propios laboratorios la eficaciade la clasificación ASEBIR. Por lo tanto, enel Grupo de Interés “Calidad Embrionaria”decidimos evaluar las tasas deimplantación de los embriones según lascategorías establecidas en la clasificaciónASEBIR (A, B, C y D), en un estudiomulticéntrico realizado por los propiosmiembros del grupo de interés, entre el 8de Enero y el 31 de Marzo de 2009. Esteestudio comprendió más de 1000

ESTADO ACTUAL DEL GRUPO DE INTERÉS DE CALIDAD EMBRIONARIA.ACTUALIDAD DE LA CLASIFICACIÓN DE ASEBIR

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Dr. Jorge Cuadros. Clínica FIV Madrid




transferencias embrionarias, conalrededor de 2000 embriones transferidos.Los criterios de inclusión para los ciclos defecundación in vitro fueron lastransferencias homogéneas, donde losembriones transferidos tuvieran la mismacategoría según la clasificación ASEBIR (A,B, C o D), o las transferencias mixtas,donde los embriones transferidos podríanser de diferente categoría ASEBIR, sólo sila implantación embrionaria hubiera sidodel 0% o del 100%.

Los objetivos establecidos para esteestudio multicéntrico fueron lossiguientes:

Análisis de la tasa de implantación de losembriones transferidos según laclasificación ASEBIR.

Análisis de la tasa de implantación de lasdiferentes categorías ASEBIR, en funciónde la edad de la mujer, estableciéndose

los grupos de edad de <30, 30-34, 35-39, 40-44 y >44.

Análisis de la tasa de implantacióndentro de una categoría ASEBIR, según los parámetros morfológicosobservados.

Análisis de la influencia de lamultinucleación en la clasificaciónASEBIR.

En última instancia, el objetivo final deeste estudio sería la confirmación, o ensu defecto la modificación, de loestablecido en las diferentes categoríasde la clasificación ASEBIR.

Los resultados obtenidos, después deuna primera valoración de los datosrecogidos de los diferentes centros dereproducción asistida que participaronen este estudio, han servido, de formageneral, para confirmar la validez de la

clasificación ASEBIR. Estos resultadospreliminares han sido los siguientes:

La tasa de implantación embrionariadisminuye a medida que disminuye lacategoría ASEBIR, independientementede la edad de la mujer.

Los embriones de categoría A y B secomportan de manera óptima en losgrupos de edad de <30 y 30-34 años.

La tasa de implantación de losembriones de categoría C desciende enlos diferentes grupos de edad.

La disminución de la tasa deimplantación en los embriones decategoría D se hace más drástica; sinembargo, siendo de alrededor del 10%,no es despreciable.

En el momento de la redacción de estetexto, estos resultados, aún

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INDICADORES LABORATORIO DE EMBRIOLOGÍA CLÍNICA

Dr. Juan Manuel Moreno1, Dr. Manuel Ardoy2, Dr. José Antonio Castilla3 y Dr. Emilio Gómez4

1 Hospital-Clínica Vistahermosa, Alicante 3 Hospital Virgen de las Nieves, Granada2 Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid 4 TAHE Fertilidad, Murcia


Jorge Cuadros. Clínica FIV Madrid

preliminares, están siendo procesadospara la valoración de las significanciasestadísticas de las diferenciasobservadas en las tasas de implantaciónde los embriones según su categoríaASEBIR. Sin embargo, lo obtenido hastael momento apunta a la confirmación dela eficacia de la clasificación ASEBIR

para seleccionar los embriones conmayor potencial de implantación para latransferencia embrionaria.

Con los resultados definitivos de laevaluación estadística, que seránpresentados en el V Congreso NacionalASEBIR de Valencia, esperamos que estas

aseveraciones se confirmen, aunque éstesólo será un paso más en la comprensióndel embrión humano. Estamos seguros deque este trabajo tendrá que continuar, enese camino, aún utópico, de “un embrión,un niño en el parque”.

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INTRODUCCIÓN

La elaboración de unos Indicadores deCalidad pretende ofrecer al embriólogouna herramienta con la que medir y

evaluar la “calidad” de su trabajo en ellaboratorio. En este sentido, losestándares deben ser consideradoscomo orientativos de la meta a alcanzar,pero nunca como una exigencia. Por ello

los Indicadores no deben serinterpretados como herramientas decontrol de nuestra labor sino más biencomo un sistema de autoevaluación, quesomos libres de utilizar o no, pero que


empleado correctamente nos va apermitir analizar y cuantificar cómo es ycómo está nuestro laboratorio, y en caso necesario cuales son los aspectos a mejorar, cambiar o utilizaradecuadamente.

Indudablemente, los estándaresestablecidos no son definitivos, y aligual que los protocolos, deben serrevisados y adaptados periódicamenteen la misma medida en que cambia lapráctica asistencial y la evidenciacientífica.

Aún así, hay que considerar losindicadores de calidad como unaherramienta de trabajo indispensablepara nuestro quehacer diario profesional.

MATERIAL Y MÉTODOS

Dado que un indicador es uninstrumento de medida, queutilizaremos de forma sistemática y cuyoresultado será tenido en cuenta en lagestión de calidad, tendremos queasegurarnos que refleje la realidad.

Para ello hay que tener en cuenta trespropiedades que debe reunir todoindicador para considerarlo útil:

Validez: identifica situaciones en que sepodría mejorar la calidad del proceso aevaluar.

Sensibilidad: detecta todos los casos enque se produce una situación o problemareal de calidad.

Especificidad: detecta sólo aquelloscasos en que existen problemas decalidad.

Estos aspectos deben ser tenidos encuenta cuando se procede a laconstrucción de indicadores,seleccionando aquellos con mayor nivelde validez, sensibilidad y especificidad.

Además, para la construcción deindicadores, es recomendable definir yconsiderar una serie de apartados queserán de gran ayuda para seleccionaraquellos que reúnan las mejorescaracterísticas:

- Nombre del Indicador- Dimensión

- Justificación- Fórmula- Explicación de términos- Población- Periodicidad- Tipo- Fuente de datos- Estándar- Comentarios

Dimensión: Característica o atributo delindicador para que sea considerado decalidad.

Justificación: Utilidad del indicadorcomo medida de la calidad. Se relacionacon la validez; es decir, lo que vamos amedir ¿tiene sentido?

Fórmula: Expresión matemática quereflejará el resultado de la medición.Habitualmente se expresa en forma deporcentaje, pero también puede hacersecomo una media o número absoluto.

Explicación de términos: Definición deaquellos aspectos del indicador quepuedan ser ambiguos o sujetos adiversas interpretaciones.

Población: Descripción de la unidad deestudio que van a ser objeto de medida.En algunas ocasiones será necesariointroducir criterios de exclusión en lapoblación así definida.

Periodicidad: Para realizar lacuantificación del indicador, no esnecesario hacer la medición sobre latotalidad de la población definida sinoque se recurre a la revisión de unamuestra. Para elegir la muestra esnecesario que el resultado del indicadorsea considerado representativo de lapoblación definida.

Tipo: Se refiere a la clasificación deindicadores según el enfoque de laevaluación. Se identifica como deestructura, proceso o resultado.

Fuente de datos: Define cuál será elorigen de la información y la secuenciade obtención de datos necesaria parapoder cuantificar el indicador.

Estándar: Refleja el nivel deseado decumplimiento para el indicador. Nosreferimos siempre a este apartado con laexpresión “estándar orientativo”, dada

la variabilidad de las fuentesbibliográficas consultadas, que nosiempre coinciden o presentan unamplio intervalo de resultados.

Comentarios: Este apartado se reservapara las reflexiones a la validez delindicador o a poner de manifiestoposibles factores de confusión quedeberán ser tenidos en cuenta a la horade interpretar los resultados.

RESULTADOS

Evidentemente, todos los indicadoresexpuestos en “Datos para lanormalización de los resultados dellaboratorio de reproducción humana”,listado de datos elaborado por unacomisión del “Grupo de Interés deCalidad Embrionaria”, son necesarios enun laboratorio; pero hemos consideradooportuno empezar con los que sonverdaderamente útiles y dejar para másadelante el resto.

Los indicadores seleccionados son lossiguientes:

ANDROLOGÍA% de REMTest de descongelación

EMBRIOLOGÍA% de fecundación normal por ICSI% de fecundación normal por FIV% de fallo total de fecundación normal(ICSI/FIV)Bloqueo en pronucleosTasa de supervivencia embrionaria(CRIOPRESERVACIÓN)

GESTACIÓN% de gestación clínicaTasa de implantación

CONCLUSIONESDurante la ponencia se irán definiendocada uno de los indicadoresseleccionados.




Esther Fernández García

INTRODUCCIÓN

En octubre de 2001 en el seno del primerCongreso de ASEBIR (Asociación para elEstudio de la Biología de laReproducción) se creó el grupo deinterés de Diagnóstico GenéticoPreimplantacional (GIdgp) con el objetode recopilar la información de todos loscentros implicados en el DGP y podervalorar la situación del DGP en nuestropaís. Desde entonces hasta ahora laaplicación de las técnicas de DGP se havisto incrementada año tras año.Después del primer registro realizado en2005 (III Congreso de ASEBIR enZaragoza), donde se recogían los ciclosde DGP realizados desde Abril de 1993,hasta Septiembre del año 2005 (11Centros). En 2007 (IV Congreso deASEBIR en Bilbao) el GIdgp presentó elsegundo registro de datos donde serecogían los ciclos de DGP realizados enEspaña desde Septiembre de 2005 aDiciembre de 2006 (27 Centros). Esteregistro, actividad principal del GIdgp,se ha actualizado y de nuevo en 2009,esta vez en Valencia en nuestro VCongreso Nacional, presentamos losdatos de los ciclos de DGP realizados ennuestro país del 1 enero al 31 diciembrede 2006, recogidos por 32 Centros.Aunque el esfuerzo en la participaciónha sido mayor, no podemos olvidar queen España hay un total de 229 Centros deReproducción Asistida (Dato publicadoen la página web de ASEBIR).

Sin embargo estos dos últimos años elGIdgp, ha visto incrementada suactividad, como no podía ser de otromodo, teniendo una participación activaa todos los niveles, tanto en laAdministración, colaborando comoexpertos en diferentes reuniones de laComisión Nación de ReproducciónAsistida, como a nivel de AsociacionesCientíficas con la creación de la Comisión

de DGP en la Asociación Española deGenética Humana (AEGH), y en elpanorama Científico con la publicaciónde una carta al editor en el HumanReproductión y en nuestra revista deASEBIR.

El grupo de interés de DGP de ASEBIR, hacumplido ya 8 años, el camino andadonos da la proyección de lo quellegaremos a ser, como siempre, con lacolaboración de todos vosotros.

A continuación presentamos un resumende las distintas actividades del grupo deinterés que han tenido lugar a lo largode 2008 y 2009.

RECOGIDA DE DATOS DE DGPCORRESPONDIENTE AL AÑO 2006.

Lo primero de todo agradeceros a todoslos socios la participación en la nuevarecogida de datos correspondiente alaño 2006. En este caso han sido 32 loscentros que han participado (Tabla I). Sehan presentado un total de 1917 ciclos(Tabla II), de los cuales 1665 cicloscorresponden a ciclos de Screening deAneuploidías (Tabla III), y 252 cicloscorresponden a ciclos de DGP conindicaciones genéticas conocidas quetienen riesgo de herencia a ladescendencia. De ellos 124 cicloscorresponden a reorganizacionescromosómicas (Tabla IV) y 128 ciclos alDiagnóstico Preimplantacional deenfermedades monogénicas (Tabla V).

CONTROVERSIA DEL PGS: CARTA ALHUMAN Y A LA REVISTA ASEBIR, FUTURACARTA PARA LA SEF.

En estos últimos dos años, todos hemosasistido a la crítica feroz a que ha sidosometida la técnica de DGP para eldespistaje de aneuploidías quefrecuentemente vemos referenciado

como PGS (del inglés, preimplantationgenetic screening). Han sido varios losartículos que han querido poner demanifiesto la “no utilidad” de estatécnica en el campo de la reproducciónhumana. Lo más llamativo no ha sido lapublicación casi al unísono de estosartículos, sino la buena aceptación quehan tenido por parte de losprofesionales de la Reproducción, sinprofundizar en el diseño, la metodologíao los resultados clínicos de los mismos.Estas técnicas, asociadas a la FIV, quellevan practicándose durante más de 15años, en unos meses han sidodesechadas sin contemplaciones.

Como no podía ser de otro modo, desdeel Grupo de Interés en DGP de ASEBIRhemos estado muy pendientes yrevisamos estos estudios en los que seque concluía que la selección deembriones cromosómicamentenormales, para un panel concreto decromosomas, no mejoraba las tasas deembarazo por ciclo para las indicacionesde edad materna avanzada, fallorepetido de implantación o en pacientesde buen pronóstico de FIV.

Debido a la trascendencia que han tenidoestas afirmaciones para aquellos quepracticamos la medicina reproductiva,nuestro primer planteamiento fueresponder de una manera constructivamediante una carta al editor, que enestos momentos está aceptada para supublicación (The importance of goodpractice in preimplantation geneticscreening: critical viewpoints. HumanReproduction, Vol.00, No.00 pp. 1–3,2009), en la que hicimos hincapié en laimportancia que “una buena práctica”puede tener en los resultados finales delPGS.

En el último número de la revistaASEBIR, por cierto muy interesante,

ESTADO ACTUAL DEL GRUPO DE INTERÉS DE DGP

Dra. Esther Fernández García - Geniality Diagnóstico Genético. MadridE-mail: [email protected] de Interés de Diagnostico Genético Preimplatacional: Dra. Esther Fernández, Dr. Carles Giménez, Dra. Carmen Rubio.Vocales: Dra. Mònica Parriego, Dra. Lorena Rodrigo, Dra. Esther Velilla y Dr. Xavier Vendrell.

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publicamos esta vez para todos losasociados de nuestra asociación, eldebate creado y nuestras conclusionesfinales, siendo conscientes que estasdeliberaciones se tienen que plantear enel seno de la Ginecología Reproductiva,ya que es ahí donde más daño hancausado estas afirmaciones. Queda portanto pendiente la publicación en la SEFde los resultados que aquí se exponen yde nuestras conclusiones.

ACTIVIDAD EN LA CNRHA.

La Ley 35/1988, de 22 de noviembre,sobre técnicas de reproducción asistida,encomendó al Gobierno establecer,mediante real decreto, la creación deuna Comisión Nacional de carácterpermanente, dirigida a orientar sobre lautilización de estas técnicas y colaborarcon la Administración en la recopilacióny actualización de conocimientoscientíficos y técnicos y en fijar criteriosde funcionamiento de los centros oservicios en los que se realizan estastécnicas.

La Comisión se creó mediante el RealDecreto 415/1997, de 21 de marzo, queregula su composición, competencias yfuncionamiento en armonía con elcontenido de aquella disposición legal.

La Ley 14/2006, de 26 de mayo, sobretécnicas de reproducción humanaasistida, abrió la posibilidad de practicarnuevas técnicas y otras que en un futuropuedan surgir por los avancescientíficos. Esta apertura se realiza bajoestrictas garantías, entre las que seencuentra el reforzamiento del papelasesor de la Comisión Nacional deReproducción Humana Asistida.

Por este motivo, se hizo necesariomodificar el Real Decreto 415/1997, de21 de marzo, recogiendo las funcionesque la ley vigente añadía a la Comisión,incorporando vocales que por susconocimientos contribuirán a su logro einstituyendo una Comisión TécnicaPermanente que facilitará el trabajo delPleno. Esta modificación del RealDecreto 415/1997, de 21 de marzo, tuvolugar el día 6 de julio de 2007.

La Comisión Nacional de ReproducciónHumana Asistida, ha tenido duranteestos dos últimos años una actividad que

podríamos denominar frenética, si lacomparamos con la actividad a la quenos tenía acostumbrados desde sucreación (1997). Y lo que es másimportante ASEBIR, con su presidente ala cabeza, Dr. Mark Grossmann, haparticipado en diferentes reuniones y hatenido un papel destacado en laelaboración de documentos:

4 de diciembre de 2008, la CNRHA decideformar un Grupo de Trabajo ad-hoc parael estudio de Diagnóstico GenéticoPreimplantacional y Cáncer hereditario.

2008, Propuesta para la creación de laTabla de recogida de datos de DGParmonizada para todas las CCAA. Estapropuesta está pendiente de suaprobación por el Ministerio de Sanidady Política Social. (página web)

11, Marzo de 2009, reunión del Grupo detrabajo ESTUDIO DE DGP Y CANCERHEREDITARIO. En este grupo de trabajoparticipan entre otros, MontserratBoada (representante española enESHRE), Esther Fernández (presidentedel GIdgp de ASEBIR) y Julio Martín(Experto en Genética del IVI deValencia). A partir de esta reunión saliópublicado en nota de prensa (21 de abrilde 2009):

El Ministerio de Sanidad y Política Socialda luz verde a una pareja que quieretener un bebé libre de un cáncer demama hereditario.

Primeros casos de cáncer hereditarioque pasan por la Comisión Nacional deReproducción Humana Asistida.

La Comisión Nacional de ReproducciónHumana Asistida da su visto bueno a laaplicación del diagnóstico genéticopreimplantacional en este caso y otro deneoplasia endocrina múltiple (cáncerhereditario de tiroides).

Es la primera vez que la Comisión estudiaen España la posible aplicación de laselección genética de embriones encasos concretos de cáncer hereditariosgraves, de desarrollo precoz y, en lamayoría de los casos, carentes detratamiento.

La Comisión ha analizado otras 17solicitudes para el uso del Diagnóstico

Genético Preimplantacional. De ellas, 6son para su posible aplicación con finesterapéuticos (curar a un hermano).

Abril del 2009, ASEBIR recibe laSOLICITUD DE LA CNRHA DE ELABORARUNA LISTA DE PRINCIPALESENFERMEDADES MONOGÉNICAS. ASEBIRapoyado en su grupo de interés en DGP,recibe la solicitud de la Dirección Generalde Terapias Avanzadas y Trasplantes deelaborar una lista con las principalesenfermedades monogénicassusceptibles de diagnóstico medianteDGP. Los expertos que participaron en lareunión de consenso celebrada el 4 deMayo de 2009 fueron: Esther Fernández,Silvia Fernández, Carles Giménez, JulioMartín, Mónica Parriego, Esther Velilla yXavier Vendrell, todos ellos miembros deASEBIR y del grupo de interés en DGP, yMontse Boada y Mark Grossmann enrepresentación de la Junta Directiva deASEBIR.

ORGANIZACIÓN DE CURSOS PARA EL 2009Y 2010: CURSO DE BIOPSIAEMBRIONARIA Y CURSO DE GENÉTICAPARA EMBRIÓLOGOS Y GINECÓLOGOS

Este año 2009 coincidiendo con lacelebración del V Congreso ASEBIR, elGIdgp inicia una nueva etapa docentecon la puesta en marcha del primerCurso de Biopsia Embrionaria.

Es labor de la asociación y en concretode su grupo de interés, poner a ladisposición de los asociados elaprendizaje de las distintas técnicas debiopsia embrionaria, con el fin deintroducirlas en la rutina del laboratoriode FIV, se trata de una técnica demicromanipulación embrionaria queestá en manos de los profesionales de lareproducción asistida y son ellos los quedeben iniciarse y llevarla a cabo con elfin de poder facilitar el DGP en losdistintos Centros.

Para este primer curso contamos con laparticipación de Dres. por todosconocidos, que tratarán en cada caso deacercar la técnica de biopsia a losembriólogos.

Por un lado se tratarán aspectos Teóricosde las técnicas, este apartado correrá acargo del Dr. Josep Santaló, y porsupuesto aspectos prácticos donde se





podrá realizar la biopsia (Tyrode´s,mecánica y láser) y fijación de lascélulas para los estudios con FISH, asícomo el tubing para los casos de PCR.Para la parte práctica contaremos con 9monitores: Monitores biopsia: EstherFernández (biopsia mecánica), CarlesGiménez y Antonio Alcaide (biopsiaTyrode´s) y Mónica Parriego y XaviVendrell (biopsia láser). Monitoresfijación: Esther Velilla, Josep Santaló,Antonio González-Utor y Carmen Rubio.

El lugar de celebración del curso será elHotel Sorolla, situado junto al Palacio deCongresos. El número de Participantesen esta ocasión será de 16 a repartir en8 puestos de trabajo.

Los Patrocinadores: IZASA, EMB,OLYMPUS, LEICA y DURVIZ

En el año 2010, el GIdgp se ha propuestoponer en marcha el Curso de Genética

para Embriólogos y Ginecólogos, del queos tendremos oportunamente informadoen la web.

ACTIVIDAD Y NUEVA CREACIÓN DECOMISIÓN DE DGP EN LA AEGH

En el año 2007, el GIdgp presentó unposter en el “XXIV Congreso Nacional dela AEGH”, dando a conocer todos losresultados recogidos desde ASEBIR.Después de esta experiencia, el GIdgp seplanteó la necesidad de tener unaparticipación activa y presencial dentrode la Asociación Española de GenéticaHumana (AEGH), sociedad de la cualmuchos de nosotros somos socios desdehace años, y en donde cada vezadquieren mayor protagonismo lastécnicas de DGP, sus indicaciones yresultados.

El paso siguiente fue el envío por partedel GIdgp de una Solicitud formal a la

Junta de la AEGH, para la creación deuna Comisión de DGP donde se hacíareferencia entre otras cosa: “Debido alenorme impacto social de la aplicaciónde estas técnicas, así como a lonovedoso de la tecnología que se estáaplicando en estos casos, consideramosinteresante y necesario la creación deuna comisión dedicada expresamente alDGP dentro de la AEGH. Las indicacionesclínicas, la metodología y los avancesque puedan aportar los grupos deexpertos que practican estas técnicasresultan de radical importancia a la horade trasmitir a los usuarios, prescriptoresy a la comunidad en general la situaciónactual del DGP en nuestro país.”

Esta propuesta se realiza de formapresencial por Xavier Vendrell y EstherFernández, a la Junta en la ASAMBLEAORDINARIA DE MIEMBROS DE LA AEGHcelebrada durante la “European HumanGenetics Conference 2008”, en

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Barcelona, el día 3 de junio de 2008. El25 de noviembre de 2008, la Junta de laAEGH aprueba por unanimidad lacreación de la Comisión de DGP. Aunquelas personas que tuvimos la iniciativa decrear esta Comisión, nos presentamospara participar activamente en ella, fuela junta de la AEGH quien al final, eligióa los miembros de entre los posiblescandidatos. Está Comisión esta formadapor: Sandra Morfort, Ana Peciña López,Carmen Ramos Corrales, Carles Gimenez,Carmen Rubio y Esther Fernández. EnSeptiembre de 2009, tendrá lugar laprimera reunión oficial de esta Comisiónde DGP, de la os mantendremosdebidamente informados.

ACREDITACIÓN LABORATORIOS DGP

Debido a la trascendencia que este tematiene para el GIdgp, aprovechamos laasistencia de tres personas Lorena ,Monica y Trinidad estuvieron presentesen el Curso ESHRE Campus 2008, BrnoCzech Republic, 23-24 October 2008titulado: Quality Management Systemand Accreditation in PGD Clinics andLaboratorios.

El principal objetivo del curso fuesensibilizar a los participantes de laimportancia de la implementación desistemas de calidad (QC) específicospara los laboratorios de DGP.

El objetivo de un sistema de calidad esasegurar la efectividad y reproducibilidadde todos los procesos realizados así comola competencia del personal paradesarrollar las funciones que le han sidoadjudicadas. Con este fin es posibleidentificar y corregir los posiblesproblemas que pudieran aparecer.

Existen distintas documentos/normativasque incluyen apartados específicos sobrecalidad en Reproducción Asistida tantonivel nacional e internacional:

Nacional: Real Decreto 1301/2006: es unatransposición de las Directivas delParlamento Europeo 2004/23/CE y2006/17/CE por el que se establecen lasnormas de calidad y seguridad para ladonación, la obtención, la evaluación, elprocesamiento, la preservación, elalmacenamiento y la distribución decélulas y tejidos humanos y se aprueban

las normas de coordinación yfuncionamiento para su uso.

Internacional:ESHRE guidelines for good practice inIVF laboratoriesEN ISO 9001 certificationEN ISO 170 25 accreditationEN ISO 151 89 accreditation

A nivel práctico, y dentro del ámbito delDGP, debemos distinguir entrecertificación, autorización yacreditación, que son tres documentosdistintos otorgados por entidadesdiferentes:

Certificación: Es el resultado de unainspección externa que verifica que unproducto, proceso o servicio se ajusta alos requisitos definidos en las normas oespecificaciones técnicas.

PERO la posesión de una certificación NOasegura la COMPETENCIA del laboratorio.

La Certificación la pueden emitir lasempresas certificadoras acreditadas.

Autorización: La ley vigente sobretécnicas de reproducción humanaasistida, 14/2006 establece en elartículo 12 sobre DiagnósticoPreimplantacional que podrán practicardicha técnica los centros debidamenteautorizados.

La emisión de dicha autorizacióncorresponde a las ComunidadesAutónomas (CA).

Acreditación: Proceso por el cual unaautoridad da un consentimiento formalde que un laboratorio o una persona esCOMPETENTE para llevar a cabo tareasespecíficas. Se otorgan a nivel nacional,en la mayoría de países no existe unaacreditación específica paralaboratorios de DGP.

La única autoridad competente para laacreditación en España es ENAC (EntidadNacional de Acreditación). No existetampoco una acreditación específicapara laboratorios de DGP.

Así pues, en nuestro país, laautorización por parte de la CA es unrequisito imprescindible para loslaboratorios de DGP. A diferencia, la

certificación no resulta un requisitoimprescindible, si bien quedaestablecido en el Real Decreto1301/2006 (artículo 16) que losestablecimientos deberán desarrollar ymantener actualizado un sistema decalidad y de gestión integrado. Dichosistema de calidad debe incluir todos lospuntos citados en el artículo y debeestar disponible para posiblesinspecciones por parte de lasautoridades sanitarias competentes.

Por otro lado, la ley 14/2006 estableceen el artículo 19 que los centros dereproducción humana asistida deberánsometerse a auditorias externas queevaluarán tanto los requisitos técnicos ylegales. La periodicidad de dichasauditorias la establecerá cada CA. Hastael momento, no era posible dentro delámbito del DGP someterse a un controlde calidad externo puesto que no habíaninguno disponible. La aparición esteaño del External Quality Assesment(EQA) de la Cytogenetic EuropeanQuality Assessement abre la posible quelos laboratorios de DGP pasen un controlexterno, que evalúe su competencia. Sibien en la mayoría de CA no se haestablecido la periodicidad de lasauditorías, sería recomendable que loscentros que ofrecen DGP en Españarealizaran el EQA.

CREACIÓN DE UNA BASE DE DATOS PARALA RECOGIDA DE DATOS DE DGP.

En la última Reunión del grupo deinterés, que tuvo lugar en Bilbao en2007, quedó patente que la recogida dedatos y posterior exposición de losmismos, no debía ser el único objetivo denuestro grupo. Éramos conscientes de lanecesidad de contar con una base dedatos donde no solamente pudiéramosincluirlos sino también sacarconclusiones.

Después de una consulta interna con losmiembros del GIdgp y quedandopendiente el desarrollo de lo que seráesa base de datos, Esther Fernández ennombre del grupo de interés mantienecontactos con Apara Creadores deMercapus S.L. Apara es una empresadedicada al desarrollo de aplicacionesinformáticas y prestación de servicios deconsultoría, que ha creado la gama deproductos informáticos dLife y

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derivados, aplicando dLife a diversaspatologías, entre las que se encuentranalgunas de las más importantes encuanto a incidencia en la población serefiere, como son el caso de la HepatitisC, la cardiología o los problemas deinfertilidad.

La idea es que APARA ponga a nuestroservicio la plataforma dLife y que laadapte a nuestras necesidades sin quepor ello ASEBIR tenga que desembolsarninguna cantidad que no sea la dotacióneconómica que le ofrece a los distintosgrupos de interés.

En Marzo de 2009 dentro de laconvocatoria de ayudas AcciónEstratégica de Telecomunicaciones ySociedad de la Información del planAVANZA I+D, del Ministerio de Industria,Turismo y Comercio, Apara y Geniality(representando los intereses del GIdgp)presentan un proyecto para la realizaciónde una plataforma biomédica llamado:dOne - Plataforma biomédica paradiagnóstico genético preimplantacionalde embriones humanos. (Número deIdentificación del expediente: TSI-020100-2009-370).

Con fecha de 30 de junio de 2009, Apararecibe una notificación de la Propuestade Resolución Provisional relativa alSubprograma Avanza I+D de estaconvocatoria. Una vez terminado elproyecto de AVANZA en el año 2010,ASEBIR contará con una copia de la basede datos resultante para el análisis delos datos que recoge anualmente elGIdgp.

En este momento contamos con laaprobación provisional, empieza portanto la segunda fase, la creación de labase de datos que nos permitirá a partirdel año 2010, desde la web de ASEBIR,poder incluir anualmente los datos deDGP recogidos por los centros quedeseen participar, de forma anónima, yponer a disposición de todos losresultados obtenidos.

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Tabla I. 32 Centros participantes

Tabla II. Resultados Globales




Tabla III. Screening de Aneuploidías (2007)

Tabla IV. Reorganizaciones Cromosómicas (2007)

Tabla V. Diagnóstico Preimplantacional de enfermedades monogénicas (2007).



Jose A. Castilla et al. Registro de la Sociedad Española de Fertilidad de Técnicas de Reproducción asistida.

INTRODUCCIÓN

Las novedades a destacar del registroSEF son: los resultados correspondientesa 2007 y los cambios que van a tenerlugar durante la recogida de datos delaño 2008.

A.- REGISTRO SEF 2007

Las principales cambios en el registro2007 se resumen en dos, incrementosignificativo en el número de centrosparticipantes y ciclos registrados, asícomo en la ampliación de técnicas dereproducción asistida recogidas.

EVOLUCIÓN DEL NÚMERO DE CENTROSPARTICIPANTES Y ACTIVIDAD REGISTRADA

Han participado un total de 138 centros,lo que supone aproximadamente el 75%de los centros acreditados en España. En2007 se han registrado un total de83.454 ciclos de reproducción asistida.Distribuidos de la siguiente manera54.720 ciclos de FIV/ICSI y técnicasafines, de IAC 22.917 ciclos y de IAD5.917 ciclos. A lo largo de su existenciael registro TRA SEF ha contabilizado494.368 ciclos de TRA. Toda estaactividad sitúa en 2007 a España en 3ºlugar entre los países europeos con másciclos de FIV/ICSI y técnicas afinesregistrados, encabezando la lista Franciay Alemania. España sigue a la cabeza deEuropa en donación de ovocitos y DGP.

Se han registrado 382 ciclos de FIV/ICSIy 683 de IAC en parejasserodiscordantes. Se han realizado 28ciclos de maduración ovocitaria in vitroy se han registrado por primera vez 234ciclos con ovocitos crioconservados.

PARÁMETROS CLÍNICOS

El porcentaje de pacientes >35 añostratadas con FIV/ICSI es de un 54% en

2007 frente al 50,9% y al 50,8% en 2002y 2003 respectivamente. El porcentajede pacientes receptoras de ovocitos >35años es del 86,5%. La indicación másfrecuente de FIV/ICSI fue el factormasculino en 2007 (34,7%)

El porcentaje de ciclos con antagonistasse ha estabilizado en un 35,3% de todoslos ciclos de FIV/ICSI. La utilización deICSI sigue aumentando llegando al 77%de los ciclos de FIV/ICSI realizados en2007 frente al 68 de 2002.

Accesibilidad: con las limitaciones de unregistro voluntario, hemos estimado queen España se realizaron 1241 ciclos deFIV/ICSI y técnicas afines por millón dehabitantes. Y los nacidos por estastécnicas en 2007 representaron el 2,9%de todos los recién nacidos en España en2007. Datos que sitúan a Españaligeramente por encima de las medias delos países europeos en estosindicadores.

EFICACIA: TASA DE EMBARAZO

La tasa de embarazo por transferenciaha seguido creciendo en comparacióncon años anteriores siendo del 39% enFIV/ICSI, 28,3% en criotransferencias yun 50,7% en donación de ovocitos. Estascifras sitúan a España en los puestos decabeza del registro europeo en tasas deembarazo.

CALIDAD DE TRA

La evolución en el número de embrionestransferidos entre los años 1998 y 2007demuestra que se ha producido undescenso continuo en las transferenciasde más de 3 embriones. La subida de lastransferencias de 2 embriones, que haido produciendose claramente desde1998, también ha continuado en 2007,aunque con menos intensidad. Latransferencia de un solo embrión ha ido

aumentando paulatinamente aunquelentamente (Fig 3).

El cambio en la política de transferenciadesde 1998 ha hecho que el número deembriones transferidos por cadaembarazo sea similar en el registroeuropeo que en el español (7 vs 5,3embriones transferidos/embarazo),hecho que en el año 1999 era 7,8 en elregistro europeo frente a 10,2 en elregistro español.

SEGURIDAD DE TRA

En la evolución de la multiplicidad de lospartos se observa un ligero descenso enlos partos únicos, a la vez que los partosmúltiples experimentan un ascenso (Fig4). Estos cambios observados en lospartos múltiples sugieren que paramantener el descenso en partosmúltiples de años anteriores quizá seanecesario la adopción de nuevasmedidas científicas (guías de buenapráctica) o legislativas. El porcentaje deembarazo múltiple en España siguesiendo son superior a la media europea(24% vs 20.5%). El porcentaje desíndrome de hiperestimulación fuemenor en el registro español que en eleuropeo (0.3% vs1%).

INSEMINACIÓN ARTIFICIAL

De los 30 países que participan en elregistro europeo solo 21 aportan datossobre IA, siendo España uno de ellos.Como ya se comentó en España en 2007se realizaron de IAC 22.917 ciclos y deIAD 5.917 ciclos. La tasa de embarazospor inseminación global (IAC+IAD) fuedel 15,6%, siendo superior en IAD conun 20,9% que en IAC con un 14,1%. Latasa de embarazo múltiple fue en IAC del13,8% y en IAD 13,6%. Como vemos latasa de embarazo múltiple tras IA fuemucho menor que tras IVF/ICSI (13,6%vs 24%).

REGISTRO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE FERTILIDAD DETÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

Dr. Jose A. Castilla, Dra. Yolanda Cabello, Dra. Juana Hernández, Dr. Jose Luis Gómez, Dr. Javier Marqueta, Dra. Esther Vidal, Dra. SylviaFernandez-Shaw, Dr. Julio Herrero, Dra. Francisca Luceño, Dra. Buenaventura Coroleu.Comité de Registro SEF, MadridContacto: Dr. Jose A. Castilla, U. Reproducción, HU Virgen de las Nieves 18014 Granada, España.

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CONCLUSIONES DEL REGISTRO 2007

El registro TRA SEF se ha consolidadocomo uno de los registros más activos anivel europeo. El análisis de datosrecogidos ha permitido comprobar comoel porcentaje de embarazo por ciclo esde los más altos de Europa y que elporcentaje de embarazo múltiple enEspaña aun no ha alcanzado el niveleuropeo. Además, existen varios puntosen la actividad realizada en España quedifieren de la actividad registrada enEuropa: elevado porcentaje de ICSI fretea FIV, y elevado número de donación deovocitos y DGP. El estudio de estos datosdebe tener siempre presente que enalgunos países de nuestro entorno no serealizan estas técnicas por limitacioneslegales. Por último, entre los retosfuturos que se presentan al Registro TRASEF se encuentra el aumentar elporcentaje de participación, el registrode ciclos realizados a parejasprocedentes de otros países (cross-border reproductive care), el registro yseguimiento de los partos y reciénnacidos por TRA y la colaboración con lasautoridades sanitarias para el desarrollodel registro de actividad previsto en lalegislación vigente.

B.- REGISTRO SEF 2008

Desde un punto de vista logístico, elRegistro del año 2008 se presenta congrandes cambios, fruto de lacolaboración entre la SEF y el Ministeriode Sanidad y Política Social, y quesupone que el Ministerio de Sanidad yPolítica Social considera útil el registrode la SEF mientras se redacta el RealDecreto que desarrollará el registrooficial. El Ministerio de Sanidad yPolítica Social facilitará el acceso a lospacientes al informe anual del RegistroSEF 2008.

Este nuevo escenario conlleva algunoscambios. El primero a nivel definanciación, pues el Ministeriofinanciará parte del registro SEF 2008,siendo el resto financiado por Schering-Plough. En segundo lugar, lainstauración de un procedimiento demonitorización de datos. Estasmonitorizaciones, además de ser muybien valoradas por el Ministerio deSanidad y Política Social, son unapetición reiterada desde el registroeuropeo (EIM) y se consideran un pasoadelante por todos lo miembros delcomité de registro de la SEF, que

aportaran credibilidad y fiabilidad anuestro registro. Dicha monitorizaciónserá realizada por Dynamic Solutions (lamisma consultora que desarrolla yexplota la base de datos del registro)mediante visitas presénciales de un día.Estas validaciones se realizaran al 10%de los centros participantes escogidos alazar. En tercer lugar, se pondrá adisposición de los pacientes y delMinisterio de Sanidad y Politica Socialademás de la memoria habitual con losdatos de todos los centros agregados,los datos (tasas de embarazo, número deembriones transferidos, embarazosmúltiples, etc) de los centrosparticipantes individualizados (centropor centro). Este cambio es el que haceque denominemos a esta nueva etapacomo de “transparencia”. Y en últimolugar, a nivel de base datos este añointroducimos las siguientes novedades:Se solicita información sobre parejasatendidas no residentes en España y elnumero de ovocitos crioconservados.Esperamos que todos estos cambiossirvan para aumentar la utilidad delregistro tanto a pacientes, como aprofesionales y autoridades sanitarias.

21

Fig 1. Evolución del número de centros participantes en el Registro TRA SEF.



Jose A. Castilla et al. Registro de la Sociedad Española de Fertilidad de Técnicas de Reproducción asistida.22

Fig 2. Ciclos analizados en el Registro TRA SEF según técnica

Fig 3. Evolución de la política del número de embriones a transferir

Fig 4.Evolución de la multiplicidad de los partos


S E S I Ó N E M B R I O L O G Í A

M. Cristina Magli et al. Requisitos del laboratorio de embriología clínica: Implicaciones de la transposición de las Directivas Europeas

INTRODUCTION

In March 2004, the European Parliamentissued the Directive 2004/23/EC ‘Onsetting standards of quality and safety forthe donation, procurement, testing,processing, preservation, storage, anddistribution of human tissues and cells’.This is a legal document originating fromthe European Union’s public healthprogramme, known as the EuropeanUnion Tissues and Cells Directive (EUTCD).

The Directive applies to human tissuesand cells, including fresh or frozenreproductive cells for application to thehuman body, meaning that ARTlaboratories are covered by thisdirective. The directive is basicallyconcerned with increasing quality andsafety in application of human tissuesand cells to the human body andanticipates common standards whosebasic requirements were laid down in the“mother” Directive 2004/23/EC and twosubsequent Technical Directives2006/17/EC and 2006/86/EC.

THE EUTCD IN ART LABORATORIES: WHY?

The application of the directive in ART isespecially focussed on minimizing therisk of two severe adverse events,namely 1) transmission of infectionsfrom one sample to the other (cross-contamination) or to the operators, and2) prevention of gamete/embryoexchange (mix-up). In order to do so,the directive promotes quality byimposing a comprehensive qualitymanagement system in ART laboratories(called as tissue establishments). Thisimplies a policy of quality control andquality assurance at all units havingadequately trained and certified staff,full documentation and formulation ofstandard operating procedures.

There is no doubt that EUTCD will have aprofound impact on units performing

ART. All tissue establishments will havenot only to be licensed or accredited onthe basis of the national authorities, butthey must also implement a qualitymanagement system and ensurecomplete documentation of allconducted activities, including fulltraceability for all records and materialsused in each treatment.

ESHRE, the European Society for HumanReproduction and Embryology, has givenfull support and guidance toprofessionals working in ARTlaboratories by formulating the‘Guidelines for good practice in IVFlaboratories’. This document represents,in the current revised version, acomplement to the requirements issuedby the EUTCD. It constitutes the minimalrequirements for any laboratory offeringART and contains relevant informationfor embryologists who, in their dailypractice, have the responsibility for thecorrect and justified application of ARTin the laboratory,

IMPLEMENTATION OF THE DIRECTIVE.

The EUTCD has to be interpreted andimplemented through nationalauthorities in each individual country.This means that depending on thenational interpretation, the directivemay be implemented differently in thedifferent European member states. Inaddition, the national implementation issubject to national regulations thatpossibly are already in place in eachmember state.

POINTS OF GENERAL AGREEMENT

The directive applies to fresh andcryopreserved gametes, pronuclearstages, embryos, ovarian and testiculartissues that are being processed,cultured, banked or stored. Practicallyspeaking, the term ‘direct use’ does notapply to current ART procedures where

all samples are processed, including thecase of intrauterine insemination.Germany is the only exception to thispoint, as they consider embryos notcovered by the directive,

Each ART unit has to put in place andupdate a quality management systembased on the principles of good practicewith the specific aim of preventing thetransmission of infectious disease andavoiding misidentification or mix-up ofgametes or embryos.

Biological testing of the donor isnecessary whenever the donated cellswill be processed, cultured, banked orstored. Required tests are: HIV 1-2,Hepatitis B surface Antigen, Hepatitis BCore antibodies and Hepatitis Cantibodies. In the case of non-partnerdonation, additional screening forsyphilis and Chlamydia is required, aswell as the genetic screening forrecessive diseases known to be prevalentin the ethnic background. Theimplementation of viral screening for allART patients makes it is possible to havean objective distinction betweeninfected and non-infected patients.Positivity for HIV or Hepatitis does notautomatically exclude patients fromtreatments, and national authoritiesshould clearly define how and whereviral positive patients should be treated.

Cells and tissues have to be traceablefrom donor to recipient and vice versa.Traceability is also mandatory for allproducts and critical materials cominginto contact with tissues and cells,including culture media, supplementsand disposables.

A unique European coding will beproposed for non-partner donation,whereas it has been established thatpartner donation traceability isguaranteed by a code that is uniquewithin the clinic.

REQUISITOS DEL LABORATORIO DE EMBRIOLOGÍA CLÍNICA:IMPLICACIONES DE LA TRANSPOSICIÓN DE LAS DIRECTIVASEUROPEAS

M. Cristina Magli, Luca Gianaroli, Anna P. FerrarettiSISMER, Reproductive Medicine Unit, Bologna, Italy

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In ART every misidentification or mix-upof gametes or embryos is to be considereda serious adverse event or reaction.

POINTS OF NON-AGREEMENT

Some other points in the EUTCD are stilldebatable with significant diversities ofinterpretation given by the memberstates.

This regards particularly some matters inthe directive that are problematic for theART methodology due to the widecoverage of the directive in comparison tothe specificity of ART, in which the samepatient can perform repeated procedureswhose duration is relatively long.

The screening for viral infections shouldbe done at the “time of donation”, butno specification is given regarding theneed for re-testing patients prior to eachtreatment or whether a specifiedinterval is tolerable. The interpretationof the member states are quite different,both regarding the time of donation(especially in the case of oocyte pick-upfor partner donation) and the validity ofthe exams (ranging between 6 and 24months). ESHRE suggests testingpatients for partner donation no morethan 30 days before starting the initial

treatment with validity, if the test isnegative, of at least 24 months. If thetest is positive, the couple is consideredto be positive in all future treatments.There is no doubt that the frequency oftesting will have a profound financialimpact on the directive implementation.

The directive establishes that the airquality should be a GMP defined Grade Aon a background air quality of Grade Dunless a less stringent air quality may bejustified according to a series ofprovisions listed in the document. Alsoin this case the interpretation of thedifferent member states varies withsome states having no specific airquality requirements, while others haverequirements as strict as those in cleanrooms for pharmaceutical production.The decision of not requiring specific aircondition is substantiated by theconsideration that ART have beenperformed in Europe for more than 20years with no documented evidence oftransmission of viral infections(hepatitis/HIV etc) due to the air qualityin the laboratory. In addition, thesystematic screening of ART patientsprior to treatment will greatly decreaseany potential risk by enabling to handleinfectious patients in a dedicatedenvironment.

Based on these observations, ESHREconsiders assisted reproduction to becovered by the exceptions listed in theEUTCD as to air quality requirements.

Inspections by the national authorityhave started in a very few memberstates. The great majority of regulatorsare experienced in non-ART tissueestablishments and this makes itdifficult for them to understand whydifferent conditions and situations arecharacterized in ART laboratories.

CONCLUSIONS

This lack of harmonisation leads toconfusion and frustration among ARTprofessionals and regulators, but thereis no doubt as to the fact that theimplementation of the EUTCD will causea profound change in the mode ofperforming assisted reproduction. Themember states where a constructivedialogue between professionals andregulators has been set up from thebeginning of the EUTCD implementationdemonstrated that this is possibly thebest way of working in the respect ofnational and European regulations, aswell as of the very nature of ART.

INTRODUCCIÓN

La experiencia acumulada de más de 15años trabajando en el laboratorio dereproducción asistida con pacientesportadores de enfermedades infecciosas

nos ha obligado a introducirnos en uncampo de la biología y la medicina ajenoal que estamos acostumbrados. Una vezconocida la experiencia del doctorSemprini (Semprini et al, 1992) en 1994decidimos empezar a aplicar técnicas de

lavado seminal y dejar de emplear semende banco para tratar a mujeres conparejas infectadas por el VIH (virus de lainmunodeficiencia humana). Estaexperiencia ha sido publicada en variostrabajos (Marina, 1998; Marina et al.,


MANEJO DE PACIENTES CON ENFERMEDADES INFECCIOSAS EN ELLABORATORIO DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA. ¿REPRESENTAREALMENTE UN RIESGO EN EL LABORATORIO?

Fernando Marina, Ruth Alcolea y Simón MarinaInstituto de Reproducción CEFER. Barcelona. Marquesa de Vilallonga, 12. Desp. 21 08017 Barcelona. E-mail: [email protected]. www.institutocefer.com

RESUMEN

La presencia de pacientes con enfermedades infecciosas en los laboratorios de reproducción asistida requiere que dichoslaboratorios adapten sus protocolos para utilizar técnicas de lavado seminal avaladas y procedimientos clínicos de actuaciónen caso de mujeres seropositivas. El riesgo que los laboratorios asumen deben ir encaminados a prevenir la transmisiónhorizontal y vertical en los pacientes que acceden a las técnicas de reproducción asistida, a prevenir que el material biológicode otros pacientes que cohabiten en el laboratorio no se contamine y a velar por la seguridad del personal del laboratorio.



Fernando Marina et al. Manejo de pacientes con enfermedades infecciosas en el laboratorio de Reproducción Asistida.

1998; Marina et al., 1998a; Alcolea etal., 2006) y refrendada por otros autores(Bujan et al., 2007). En aquel momentofue una apuesta pionera, no exenta deriesgos. Tuvimos que adquirirconocimientos sobre el estudio ytratamiento de enfermedadesinfecciosas; sobre los mecanismos dedetección y transmisión; sobre lamanera más eficiente de eliminar elriesgo de contagio y sobre cómogarantizar la seguridad del personal quetenía que trabajar con este tipo demuestras y no tenía la formaciónadecuada para ello. Aunque en lamayoría de las ocasiones nos referimosal VIH, las actuaciones en el laboratoriofrente a otros virus como el VHC o el VHBsuelen ser similares. Queremos en estetrabajo aportar nuestro conocimiento yexperiencia para ayudar a loslaboratorios que quieran tratar con estetipo de muestras.

PROTOCOLOS DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA

La experiencia de CEFER está basada endos Protocolos de investigación clínicaaprobados por el Comité Ético y deInvestigación. El primer protocolo deinvestigación concluyó que la práctica delos lavados seminales en pacientesportadores del VIH es una técnica seguray que reduce el riesgo de contagio en lospacientes con deseo reproductivorespecto al coito. En un segundoprotocolo se establecen las actuacionesencaminadas a tratar con técnicas dereproducción a mujeres portadoras deenfermedades infecciosas para reducir elriesgo de transmisión vertical y el riesgode contagio a la pareja. Es necesarioafirmar que en ningún momento de losprotocolos se habla de eliminar porcompleto el riesgo de contagio, sino dereducirlo al máximo y así consta en losconsentimientos informados. Estosprotocolos estaban básicamenteencaminados a aportar seguridad a lospacientes. Posteriormente, con laaparición del Real Decreto 664/1997Sobre la protección de los trabajadorescontra los riesgos relacionados con laexposición a agentes biológicos duranteel trabajo, se implementaron medidaspara mejorar la seguridad deltrabajador.

LEGISLACIÓN

El problema del SIDA y la Reproducciónes un tema sensible para la Sociedad ypor ende para la Autoridad Sanitaria. Lomismo ocurre aunque en menor medidacon otras enfermedades infecciosas.

La actuación médica tendente a que unapareja serodiscordante tenga un hijopuede comportar aspectos éticos yaspectos legales. Los posibles reparoséticos que se pueden aducir los podemosresumir en cuatro:

Riesgo que la mujer inseminada secontagie del virus del SIDA. Bajo laexperiencia acumulada en nuestrocentro, el riesgo es mínimo, y en todocaso inferior al riesgo de contagio conun coito sin preservativo.

Se crean falsas expectativas en estasparejas. El impreso del ConsentimientoInformado que la pareja ha de conocer yfirmar informa veraz y objetivamentesobre el tema.

Existen claras expectativas de que lapareja consiga un hijo sin que secontagie la mujer y por tanto tampoco elhijo

Se comenta que, dada la sobrevivenciaprevisiblemente menor de los hombresseropositivos, se estaría contribuyendoa que viniesen hijos que quedaríanhuérfanos.

Ante este punto de vista hemos derecordar:

a) que ya la primera Ley de ReproducciónAsistida (Ley 35/1988) admitía lainseminación artificial en mujeres sinpareja masculina (artículo 6.1). Estepunto no ha cambiado en la nueva Ley45/2006 (artículo 6.1). Inevitablementeese niño nacido será en la prácticaequiparable al huérfano de padre.

b) La citada Ley 45/2006 permite lainseminación con semen congelado delmarido ya fallecido por lo que, antes deser concebido, ya es huérfano (artículo9.2).

Estas dos situaciones admitidas yrecogidas por la Ley 45/ 2006 son másdrásticas que la situación de la parejaserodiscordante en la que el hombre esseropositivo sano. Los avances en el

tratamiento del SIDA están claramentealargando la sobrevivencia de estospacientes.

Existe riesgo de contagio para elpersonal que trabaja en reproducciónasistida y no tiene la formaciónespecífica. Existe también el riesgo quese contamine material biológico de otrospacientes presentes en el laboratorio.

En el Real Decreto 664/1997 y laDirectiva Europea 90/679/CEE, sedefinen las medidas a adoptar para elmanejo de muestras infecciosas. ElMinisterio de Trabajo y Asuntos Sociales,a través del Instituto Nacional deSeguridad e Higiene en el Trabajo,desarrolla este Real Decreto en una GuíaTécnica Para la Evaluación y Prevenciónde los Riesgos Relacionados con laExposición a Agentes Biológicos. Castillay Magán (2003) profundizan en estalegislación para su implantación en loslaboratorios de reproducción asistida.

EVALUACIÓN DEL RIESGO

Como hemos comentado en el apartadoanterior, en el RD 664/1997 se definenlos riesgos, las obligaciones y lasindicaciones necesarias para podertrabajar en nuestros laboratorios conagentes biológicos potencialmenteinfecciosos. En la Guía Técnica elaboradapor el Instituto Nacional de Seguridaden el Trabajo, se desarrolla este RD664/1997.

Según establece el RD 664/1997 en suartículo 2, los agentes biológicos sonclasificados, en función del riesgo deinfección, en cuatro grupos (Tabla I)

Siguiendo esta misma clasificación, enel anexo II de dicho Real Decreto seasignan a cada grupo los diferentesagentes biológicos. En la Tabla II semuestra la clasificación de losprincipales virus que tratamos. Dichaclasificación de riesgo se ha realizadoconsiderando sus posibles efectos sobretrabajadores sanos. No se ha tenido encuenta los efectos particulares quepuedan tener en trabajadores cuyasensibilidad se vea afectada por causastales como patología previa,medicación, trastornos inmunitarios,embarazo o lactancia.

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El anexo IV del RD 664/1997 define lasindicaciones relativas a las medidas decontención y a los niveles de contención(ver Tabla III)

En la Tabla IV se hace referencia a losniveles de contención aplicables a losprocedimientos empleados en loslaboratorios y a los virus que tratamosen este trabajo según la Nota Técnica dePrevención NTP 520 elaborada por elCentro Nacional de Condiciones deTrabajo. Según esta tabla, en caso deriesgo de producción de salpicaduras yaerosoles es necesario aplicar un nivelde contención 3. En ningún momento,con los virus que solemos tratar, esnecesaria la aplicación de un nivel decontención 4.

OBLIGACIONES DEL RESPONSABLE DELLABORATORIO

Según el Real Decreto 664/1997 en suArtículo 4 se establece que es obligacióndel responsable del laboratorio realizaruna evaluación de los agentesbiológicos, determinando la naturaleza,el grado y duración de la exposición delos trabajadores. Esta evaluación ha deser periódica y, en cualquier caso, cadavez que se produzca un cambio en lascondiciones que pueda afectar a laexposición de los trabajadores a agentesbiológicos. Además, se procederá a unanueva evolución del riesgo cuando sehaya detectado en algún trabajador unainfección o enfermedad que se sospecheque sea consecuencia de una exposicióna agentes biológicos en el trabajo

REDUCCIÓN DE RIESGOS

En el Artículo 6 del RD 664/1997 sedefinen las actuaciones encaminadas areducir el riesgo para la seguridad de lostrabajadores. Estas actuaciones seresumen en 9 puntos:

Establecer procedimientos de trabajoadecuados

Reducir, al mínimo posible, el número detrabajadores que estén o puedan estarexpuestos

Adopción de medidas de seguridad parala recepción, manipulación y transportedentro del lugar de trabajo

Adopción de medidas de proteccióncolectiva o, en su defecto, de protecciónindividual, cuando la exposición nopueda evitarse por otros medios

Medidas seguras de recogida,almacenamiento y evacuación deresiduos

Medidas de higiene para evitar odificultar la dispersión del agente fueradel lugar de trabajo.

Utilización de señal de peligro biológico.

Establecimiento de planes para hacerfrente a accidentes de los que puedanderivarse exposiciones a agentesbiológicos.

Verificación, cuando sea necesario yteóricamente posible, de la presencia delos agentes biológicos utilizados en eltrabajo fuera del confinamiento físicoprimario.

MEDIDAS HIGIÉNICAS

El Artículo 7 del RD 664/1997 define lasmedidas higiénicas que se debenadoptar en las actividades en las queexista riesgo para la seguridad de lostrabajadores. Estas medidas consistenen 5 puntos:

Prohibir que los trabajadores coman,beban o fumen en las zonas de trabajo

Proveer a los trabajadores de prendas deprotección apropiadas o de otro tipo deprendas especiales adecuadas

Disponer de retretes y cuartos de aseoapropiados y adecuados para uso de lostrabajadores, que incluyan productospara la limpieza ocular y antisépticospara la piel.

Disponer de un lugar para elalmacenamiento de los equipos deprotección.

Especificar los procedimientos deobtención, manipulación yprocesamiento de muestras de origenhumano o animal.

PROCEDIMIENTOS DE TRABAJORECOMENDADOS

Desarrollando los dos apartadosanteriores y desde el punto de vista dela seguridad y las buenas prácticas en ellaboratorio referentes a la exposición aagentes biológicos y según la NotaTécnica de Prevención NTP 376 elaboradapor el Centro Nacional de Condiciones deTrabajo, se establecen las siguientesrecomendaciones:

Nunca se pipeteará con la boca,empleándose los dispositivos de tipomecánico.

Deben utilizarse guantes adecuados entodos los trabajos que entrañen algúncontacto con sangre o materialinfeccioso.

Hay que utilizar batas o uniformes detrabajo para evitar la contaminación delos vestidos de calle. No se utilizará laropa de laboratorio fuera de éste(cafetería, biblioteca, etc.)

Siempre que haya peligro desalpicaduras se utilizarán gafas deseguridad, pantallas faciales u otrosdispositivos de protección.

A fin de evitar cortes accidentales, sepreferirá el uso de material plástico al decristal

En la zona del laboratorio no sepermitirá comer, guardar alimentos,beber, fumar ni usar cosméticos.

El uso de agujas hipodérmicas y dejeringas debe evitarse. Cuando ello nosea posible, las agujas se recogerán enrecipientes adecuados que eviten lospinchazos accidentales

Las superficies de trabajo sedecontaminarán por lo menos una vez aldía y siempre que haya un derrame. Unanota debe especificar el modo de empleode desinfectantes, la naturaleza deldesinfectante a utilizar y suconcentración

Todos los desechos biológicos, ya seanlíquidos o sólidos tienen que serdescontaminados antes de sueliminación y se seguirán las normasexistentes sobre la gestión de residuossanitarios

Todo el personal se lavará las manos

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después de haber manipulado materialinfeccioso, así como al abandonar ellaboratorio

El acceso al laboratorio debe sercontrolado

El material contaminado, que deba serdescontaminado en un lugar exterior allaboratorio, se colocará en uncontenedor especial, y se cerrará antesde sacarlo del laboratorio

Deberá existir un programa de luchacontra insectos y roedores que se pondráen práctica.

DOCUMENTACIÓN

Es obligación del responsable dellaboratorio de disponer de la siguientedocumentación (artículo 9, RD664/1997):

Resultados de la evaluación de losagentes biológicos (artículo 4)

Lista de trabajadores expuestos en laempresa a agentes biológicos de losgrupos 3 y 4.

INFORMACIÓN Y FORMACIÓN DE LOSTRABAJADORES

En el artículo 12 del RD 664/1997 obligaal responsable del laboratorio a tomarlas medidas apropiadas para garantizarque los trabajadores reciban laformación suficiente y adecuada, enparticular en forma de instrucciones, enrelación con:

Los riesgos potenciales contra la salud

Las precauciones que deben tomar paraprevenir la exposición

Las disposiciones en materia de higiene

La utilización de equipos de protecciónindividual

Medidas en caso de accidente

EQUIPOS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL

En el Real Decreto 773/97 se definen yclasifican los equipos de protecciónindividual (EPI) y se establecen lasobligaciones que deben cumplir tanto

los trabajadores como los responsablesdel Laboratorio.

CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA

No hay que confundir las Cabinas deSeguridad Biológica (CSB) con lascabinas de flujo laminar horizontal overtical. El Centro para el Control yPrevención de Enfermedades de Atlanta(CDC) define y clasifica este tipo decabinas (ver Tabla V). Para el manejo delos virus que tratamos, en la mayoría delos casos es suficiente el empleo de EPI.Sólo sería aconsejable la utilización deCSB de tipo II en el caso de laboratoriosque manejen un gran volumen de estetipo de muestras. Sería obligatorio suuso en caso que se quiera concentrar ocultivar el agente biológico.

CONDUCTA A SEGUIR ANTE UN ACCIDENTELABORAL CON EXPOSICIÓN A SANGRE YFLUIDOS CORPORALES CONTAMINADOS

Según la Nota Técnica Preventiva NTP398 elaborada por el Centro Nacional deCondiciones de Trabajo la actuación encaso de accidente se resume en tresacciones con el siguiente orden:

Limpieza de la herida. Inmediatamentedespués de producirse el contactoaccidental con sangre u otros fluidos hayque quitarse los guantes y lavarsecuidadosamente la herida con iodóforos(p.e. Povidona iodada). En personasalérgicas al yodo se puede emplear lacloramina.

Comunicación al Servicio de Prevención.Todo accidente con sangre y susderivados debe ser comunicado alServicio de Prevención einmediatamente se realizará una fichaepidemiológica para conocer los datosrelacionados con el accidente (nombre,edad, categoría profesional, lugar delaccidente, hora en que ocurrió,mecanismo de producción, localizacióny naturaleza de la lesión, etc.)

Estudio inmunológico del individuoaccidentado. Cuando puedaidentificarse la fuente, previoconsentimiento y tras haber sidoinformado, se procederá a extracciónsanguínea para determinar losanticuerpos frente al antígeno delnúcleo o core (AntiHB-core) total, frente

al VHC y los anticuerpos frente al VIH.Según la naturaleza de la “fuente” seprocederá a la quimioprofilaxis yseguimiento adecuado a cada casosegún la siguiente figura tomada del“Manual de protección frente a RiesgosBiológicos” del Instituto Nacional deSeguridad e Higiene en el Trabajo(Figura 1)

RECOMENDACIONES ASEBIR

Las siguientes recomendaciones soncopia de la revisión que se hizo en 2007del 1er Cuaderno de Embriología Clínica“Recomendaciones sobre RecursosHumanos y Físicos para el Laboratorio deReproducción Asistida Humana” editadopor ASEBIR. En dicho cuaderno existe unapartado específico para estos pacientestitulado: “PROCESADO DE MUESTRAS DEPACIENTES CON ENFERMEDADESINFECCIOSAS TRANSMISIBLES” y que acontinuación transcribimos:

“Al contrario que en otros laboratoriosclínicos (microbiología, análisis,inmunología, etc), donde las muestrasbiológicas tras su uso son desechadas,gran parte del material biológico que semaneja en el laboratorio de reproducciónes para uso clínico. Esto obliga a tomarmedidas de seguridad específicas a lahora de manejar muestras de pacientescon enfermedades infecciosastransmisibles. Estas medidas tienen porobjeto no sólo la protección de lostrabajadores, sino la eliminación (en lamedida de lo posible) de lacontaminación cruzada entre pacientes,la transmisión vertical y el contagio entreambos miembros de la pareja. Dentro delos aspectos a tener en cuenta en laatención a los deseos reproductivos deestos pacientes se encuentran:

Debe realizarse por equiposmultidisciplinares de profesionales queengloben entre otros microbiólogos, yclínicos especialistas en enfermedadesinfecciosas.

El riesgo de transmisión de laenfermedad se minimiza mediante lastécnicas de reproducción asistida perono se anula

Debe existir una separación temporalentre el material biológico de estospacientes y el resto de pacientes.

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Todos los equipos pueden sercompartidos por estos pacientes entiempos diferentes, excepto lasbombonas de almacenamiento denitrógeno líquido, que deben ser de usoexclusivo para estos pacientes. En elcaso de los incubadores se recomiendaque sean de uso exclusivo, pero si noexiste otra opción se pueden destinar lasúltimas bandejas de las mismas para eluso de estos pacientes.

Las punciones de estos pacientes debenrealizarse en último lugar de la lista detrabajo diaria.

La limpieza de los aparatos que secompartan con otros pacientes(Campana de flujo laminar vertical,microscopios, etc) debe serespecialmente cuidadosa paragarantizar la eliminación de los virus. Se

recomienda el uso de desinfectantesoxidativos que no contengan alcohol(cloro activo a muy baja concentración,dióxido de cloro, ozono, peróxido dehidrógeno…).

Para la protección del personal serecomiendas equipos de protecciónbiológica individual (utilizar gafas,mascarillas, dobles guantes, etc)

Se deben evitar los pipeteos con la bocay los instrumentos cortantes

En el caso de varones seropositivos serecomienda una técnica de lavado desemen validada que garantice la nodetección del virus.

En el caso de mujeres seropositivas serecomiendan lavados de los ovocitosmás exhaustivos.

En el caso de congelar embriones en estetipo de pacientes se recomienda el usode pajuelas de seguridad biológica.También podría ser eficaz el uso detanques de nitrógeno secos o lautilización de contenedores denitrógeno independientes.”

CONCLUSIONES

La correcta utilización de los EPI frenteal riesgo biológico como herramientacomplementaria a las medidas generalesde tipo higiénico, es aun hoy en día unaasignatura pendiente. Sin embargo, conel descubrimiento en los años 80 delvirus de la inmunodeficiencia humana,el personal sanitario empezó a tenerconciencia del riesgo profesional quesupone la exposición a determinadosagentes biológicos. Este hecho fue eldetonante para que la cultura preventivafrente al riesgo biológico cambiara y enconsecuencia se empezaron a utilizarprotecciones personales adecuadas yprocedimientos de contenciónadecuados. En el laboratorio dereproducción asistida no estageneralizada esta cultura y esperamosque las indicaciones que se muestran enéste trabajo arrojen luz sobre losrequisitos y maneras de actuar parapoder tratar a pacientes portadores deenfermedades infecciosas en nuestroslaboratorios.

Es de suma importancia que se tenganen cuenta estas medidas antes deempezar a trabajar con pacientesportadores de enfermedadesinfecciosas. Aplicando estas medidashemos conseguido, hasta la fecha, queninguna mujer, ni hombre, ni niño, nitrabajador se contagie de ninguno de losvirus tratados. Aunque lasprobabilidades de contagio son bajas,aún sin tener en cuenta muchas de estasmedidas, las consecuencias de un solocontagio pueden ser catastróficas paraun centro de reproducción. Es por estoque recomendamos que todo centro dereproducción asistida esté informado detodos los aspectos referentes a laseguridad del laboratorio.

BIBLIOGRAFÍA

I Cuaderno de Embriología Clínica“Recomendaciones sobre Recursos Humanosy Físicos para el Laboratorio de

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Tabla I. Grupos de riesgo de los agentes biológicos




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Tabla II. Clasificación de los agentes biológicos

Tabla III. Indicaciones relativas a las medidas de contención y a los niveles de contención




Tabla IV. Niveles de contenciónaplicables a diferentes virus

Tabla V. Cabinas de Flujo Laminar yCabinas de Seguridad Biológica(CDC, 1995; Castilla et al. 2003)



Lynette Scott, PhD, HCKD Fertility Centers of New England Reading, MA, USA

Embryo morphology is the only form ofselection during human assistedreproductive technologies. Gamete(sperm and oocyte) morphology is notutilized due to the lack of sufficient datacorrelating any particular morphologywith outcome. In order to get afunctional embryo, both gametes mustbe normal. During any growth anddevelopment, an oocyte or embryoneeds energy in the form of ATP, themajority of which is formed throughoxidative respiration. During respirationoxygen is consumed and by measuringoxygen consumption, the level or rate ofrespiration could be calculated.

As the oocyte is developing, it usesabout 90% of delivered oxygen forrespiration but once it matures in theantral follicle this has dropped to about70%. Cleaving embryos only use 30% ofoxygen uptake for respiration, with thebulk being used in alternate cellularmechanisms. However, as the embryobegins to compact, form a blastocysts

and expand, the amount of oxygen usedin respiration increases to approximately70%.

Oxygen uptake or use by an oocyte orembryo can be measured in a non-destructive manner using anEmbryoScope. This is not a clinicaltechnique as it is not entirely non-invasive but it has lead to insights ongamete and embryo function, normalityand ability to grow as related to oxygenconsumption.

It was shown that oocytes at differentstages of maturation have differentlevels of oxygen consumption and thatoocytes that have the ability to continuedeveloping have greater oxygenconsumption than those thatsubsequently stopped growing. Oxygenconsumption was correlated with knownparameters that affect oocyte qualitysuch as FSH levels and age. Oocytes frompatients with advanced age or high FSHhad lowered oxygen consumption.

Oocytes that fail to fertilize, but wherethere is no male factor, also had loweredoxygen consumption.

Oxygen fluxes or consumption in humanembryos growing from the one cell toblastocysts stage, can be an indirectmeasure of their respiration. Embryosthat continue developing have a verystable rate of oxygen consumption.Embryos that become attretic or stopdeveloping have significantly reducedconsumption rates prior to the demise.Oxygen consumption was not related tonormality, merely to continueddevelopment with a 2 fold increase inconsumption as the embryo forms ablastocyst. Oxygen consumption doesnot correlate with morphology onlycontinued development. Aneuploidembryos have similar oxygenconsumption to euploid embryos, if theycontinue cleaving.

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OOCYTE AND EMBRYO OXYGEN CONSUMPTION CAN IT TELL USANYTHING ABOUT DEVELOPMENTAL POTENTIAL?

Lynette Scott, PhD, HCKD Fertility Centers of New England Reading, MA, USA


S E S I Ó N A N D R O L O G Í A


INTRODUCCIÓN

El diagnóstico del varón como fértil oinfértil es extremadamente difícil, yaque este estado pude variar en uncorto espacio de tiempo e incluso porexistir diferentes parejas. Estasaseveraciones deben de considerarsedesde el punto de vista de cadaeyaculado.

La herramienta clásica para estimar elpotencial fértil del varón es el análisisbásico del semen como lo refleja la OMS(Wild et al. 2004). Este análisis se basaen la evaluación macroscópica ymicroscópica de las características delespermatozoide. Los resultados de estejunto con los estudios en la mujerproveen a la pareja información pararecomendar el tratamiento dereproducción asistida más apropiadoteniendo en cuenta los costes (médicos,biológicos y económicos) y la efectividadde los ratios.

Un porcentaje importante de las parejas,incluso después de varios intentos, sonincapaces de procrear, aunque se realizóun análisis de esterilidad concienzudo yno se detectó ninguna causa aparente osubyacente. Esto podría deberse enparte a algunos defectos espermáticosque no están siendo valorados en elespermiograma clásico (Garrido et al.2008).

Entre los marcadores moleculares deinfertilidad, existen muchos datos en laliteratura algunos contradictoriosrespecto a la utilidad del estudio de laintegridad del ADN. El estrés oxidativo(EO) en el espermatozoide también hasido estudiado en profundidad en lasúltimas décadas como marcador deinfertilidad masculina (Garrido et al.2006, Alvarez and Agarwal. 2006) conla intención de predecir la habilidad paraser padre. Otros marcadoresmoleculares se han estudiado para

averiguar su capacidad predictiva en lafecundación y en el embarazo(Braundmeier and Miller. 2001,Meseguer et al. 2004a) y todos estosestudios demuestran que el origen de lainfertilidad masculina es multifactorial.

Actualmente, la amplia variedad deanálisis proporcionados por las –ómicashan sido implementados en los estudiosde fertilidad (Martinez-Conejero et al.2008, Horcajadas et al. 2007, Martinez-Heredia et al. 2006) permitiendo lacaracterización de perfiles de fertilidadrelacionados con la expresión de mRNAproteínas e incluso metabolitos.

Los modelos experimentalesactualmente utilizados en reproducciónasistida para caracterizar la infertilidadmasculina presentan importantessesgos, ya que el factor masculino es enmuchas ocasiones ignorado, lo quepermite hallar en muchas ocasionesrelaciones espurias entre determinadosparámetros y la infertilidad. Parasolucionar este problema, la utilizacióndel modelo de la donación de óvulospara estandarizar la calidad ovocitariaproporciona una herramienta muypoderosa (Meseguer et al. 2006b).

El objetivo de esta ponencia es recopilarla información generada hasta elmomento en relación a algunosparámetros moleculares espermáticosrelacionados con la infertilidadmasculina y su potencial diagnóstico.Nos centraremos en el ADN y en el ARNmensajero. El primero es obviamente elque lleva la información genética para elfuturo feto y su integridad pude estarafectada por el entorno lo quecomplicaría el proceso reproductivo. Elsegundo (ARNm) puede ser importantedurante las primeras divisionesembrionarias (hasta que la maquinariadel embrión está activa). Las variacionesen los patrones de ARNm podrían serdeterminantes en el éxito reproductivo.

INTEGRIDAD DEL ADN

Generalmente la cromatina epermáticaestá muy organizada, siendo unaestructura compacta de ADN connucleoproteinas heterogéneas queprotegen la integridad genética yfacilitan el transporte del genomapaterno a través de los tractosreproductivos masculino y femenino(Manicardi et al. 1995). Por lo tanto laintegridad del ADN es necesaria para lacorrecta transmisión de la informacióngenética de vital importancia paramantener el embarazo.

ORIGEN DEL DAÑO EN EL ADN

Existen defectos intrínsecos quegeneran daño en ADN y estos incluyendeficiencias durante la espermiogénesis(periodo durante el cual las protaminasespermáticas son depositadas), omutaciones que afectan adversamente lacompactación del ADN. Las protaminasson responsables de la compactación delADN y están fuertemente unidas a este ydefectos en las mismas podría dañarcomponentes del ADN y su estructura(Oliva. 2006). Una etiología adicional es la que refiere que aquellosespermatozoides que entran en apoptosis(o muerte celular programada). Esteproceso ocurre regularmente durante lavida adulta y ayuda a eliminar aquellascélulas que tienen alterada la función oson afuncionales, no obstante algunascélulas podrían escapar de esta limpiezay presenten altos niveles de ADN (Sakkaset al. 1996).

Además el propio metabolismoespermático genera especies reactivasdel Oxígeno (ERO) que podrían afectar ala integridad del ADN, especialmente(O2−), (H2O2) y (NO). No obstante losespermatozoides han desarrolladodefensas contra los niveles excesivos deERO y predominantemente incluyesuperoxido dismutasa (SOD), glutation

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INTEGRIDAD DEL ADN Y PATRÓN DE EXPRESIÓN GÉNICA;INDICADORES DE CALIDAD ESPERMÁTICA Y ÉXITO REPRODUCTIVO

Marcos Meseguer, Sandra García-Herrero, Cristobal Aguilar, Thamara Viloria, Nicolás GarridoInstituto Valenciano de Infertilidad, Universidad de Valencia, Valencia, Spain;



Marcos Meseguer et al. Integridad del ADN y patrón de expresión génica

peroxidasa (GPxs) y glutation reductasa(GR) (Meseguer et al. 2004b, Santiso, R.,Tamayo, M., Gosálvez, J., Meseguer, M.,Garrido, N., Fernández, JL. 2009).

ERO pueden reaccionar con cualquiercomponente celular y el espectro de lasmodificaciones oxidativas dependen de lacantidad de ERO, el momento y lalocalización de esta generación y lapresencia de los mecanismos de defensa.Concretamente estamos interesados en elefecto de ERO en el ADN en particular laformación de 8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG) uno de los mayores productosoxidativos del ADN (Figura 1).

El daño oxidativo lo encontramos endeterminadas situaciones comoconsecuencia de la generación deradicales libres, estas incluyenenfermedad inflamatoria autoinmune yenfermedades neurodegenerativas,arterioesclerosis y los dañosconsecuencia de la isquemia. Estosdaños también se observan duranteprocesos de mutagénesis ycarcinogénesis originados por factoresdiversos como los agentes químicos lasradiaciones y la actividad metabólicanormal. El estrés oxidativo podría causarfragmentación en el ADN posiblementecomo consecuencia de la oxidación delmismo (Garrido et al. 2004b).

Los factores externos como el calor, losagentes quimioterapéuticos la radiacióny otras gonadotoxinas están asociadascon un aumento en de losespermatozoides con el ADN dañado.Pero además el cancer por si mismo seconsidera un factor intrínseco de dañoen el ADN. Recientemente publicamos untrabajo en el que observamos unaumento en la fragmentación del ADN enlos pacientes con cáncer que escomparable al de los pacientes infértiles(Meseguer et al. 2008b).

Otra causa potencial de daño en el ADNes la exposición a toxinas ambientalesaunque en este campo los resultados soncontrovertidos (Sun et al. 1997). Locierto es que una de estas toxinas podríaproducirse por el consumo de tabaco quees uno de los hábitos tóxicos máscomunes en la población general, el cualademás es potencialmente capaz deinducir efectos deletéreos en losgametos (Viloria et al. 2005).

La relación entre el consumo de tabacoy el daño en el ADN se ha investigado enprofundidad por Viloria y cols (Viloria etal. 2009, Rubio et al. 2007). Ellosdeterminaron elevados niveles defagmentación en pacientes fumadores,sin embargo no detectaron un aumentoen el daño oxidativo del ADNespermático. Esto sugiere que loselevados niveles de fragmentaciónencontrados en los varones fumadoresno son consecuencia de la oxidación delADN lo que también va en contra de quela fragmentación del ADN es precedidade la oxidación (Figura 2).

EVALUACIÓN DEL DAÑO EN EL ADNESPERMÁTICO; ESTUDIO EN REPRODUCCIÓNASISTIDA

Existen numerosos tests que directa oindirectamente evaluan el daño en elADN, aquellos que estudian lafragmentación del ADN no son objetivode esta charla y no los comentaremos.Para estudiar la oxidación del ADNnosotros utilizamos el OXI DNA assay kitbasado en la unión de anticuerpo confluorescceina a la 8 oxoguanina,presente en las células con ADN oxidado,esta fluoresceína se cuantificautilizando citometría de flujo (Mesegueret al. 2008a).

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Figura 1. Transformación de la deoxyguanosina (dG) y la formación of 8-hydroxydeoxyguanosina (8-OHdG)

Figura 2. Porcentaje de espermatozoide con el ADN oxidado de acuerdo al consumo de tabaco del varón.




La infertilidad masculina está asociadaa la pobre integridad del ADNespermático y se ha sugerido que estasanomalías podrían afectar a la capacidadde procreación de los varones teniendorelaciones sexuales regulares y enaquellos tratados con tratamientos dereproducción asistida (Larson-Cook etal. 2003, Muriel et al. 2006a, Muriel etal. 2006b).

En esta ponencia no repasaremos

aquellos estudios de nuestro grupocentrados en la fragmentación del ADNpero si determinaremos la relevancia dela oxidación del ADN en la calidadembrionaria y en el éxito reproductivoestudiando prospectivamente ciclos dedonación donación de ovocitosemparejados, es decir aquellos casosdonde donantes con buena respuestaoriginan una cohorte ovocitariasuficiente para dos receptoras,consiguiendo que una de las pocasdiferencias entre los dos ciclos sea lamuestra espermática diferente (Melo etal. 2006).

En referencia a la morfologíaembrionaria, realizamos un estudiodetallado de todos los estadíos deldesarrollo. Se ha correlacionado lamorfología embrionaria, basándonos enla división celular y la fragmentaciónembrionaria. Es más, observamos unaimportante asociación entre la asimetríaembrionaria y altos niveles de oxidacióndel ADN espermático. Además, en losestadíos más avanzados, aquellosembriones que alcanzaron el estadío deblastocisto se asociaron con menoresniveles de oxidación.

Aunque observamos un aumento en losniveles de oxidación en aquellospacientes que no consiguieron embarazoevolutivo, las diferencias no eransignificativas. Esto podría deberse alproceso de selección antes de latransferencia, de manera que losembriones de mal pronóstico no seescogerían para transferencia. Enausencia de esa selección, sería posibleobservar una asociación entre laoxidación del ADN y el embarazo.

Además, analizando estas diferenciasentre pacientes que compartieron cohorteovocitaria (misma donante), observamosun claro aumento en las relaciones entrela calidad embrionaria y la oxidación delADN. Conjuntamente el daño oxidativoesta asociado con una disminución de lamotilidad espermática. Todas estasasociaciones encontradas apoyan larelevancia de la hidroxilación de la 8-oxoguanina como biomarcador de calidadespermática reflejando el daño de losradicales libres en los espermatozoides(Meseguer et al. 2008a).

Siguiendo en esta linea de trabajo,determinamos la relevancia de laoxidación del ADN originada por losradicales libres en los espermatozoidesprocedentes de testículo, analizando lostratamientos de reproducción asistidarealizados con ellos y utilizando elmodelo de donación de ovocitos paraestadarizar el factor femenino.

Las células obtenidas del testículopresentan una amplia variedad de tiposy ploidías (haploides; espermatozoidesy espermátidas redondas, diploides;espermatogoniasm, espermatocitossecundarios, células de Leydig y Sertoli,

células inmunes, células mioides,fibroblastos, etc…, tetraploides;espermatocitos primarios). Paradeterminar la ploidía celular realizamosuna tinción dual con ioduro de propidio,permitiendo analizarla simultáneamentecon la tinción del la 8-OHdG, separandoentre categorías celulares como semuestra en la figura 3 . Además fuimoscapaces de distinguir entre célulashaploides espermáticas y noespermáticas analizando las formas

celulares en función de cómo secomporta el haz laser del citómetro alatravesar el espermatozoide. Cuando elporcentaje de células 8-OHdG positivases considerado para cada ploidía,observamos un aumento en lasazoospermias de origen no obstructivo(NO) en comparación con lasobstructivas (O) pero solo considerandolas células haploides. Aproximadamenteun 4% más de células haploidespresentan el DNA oxidado mientras quesolo un existe un 1,5% de incrementocuando consideramos las célulasdiploides, por último considerando lascélulas tetraploides las diferencias en laseñal de 8-OH estaban solo en un 0.16%estando de nuevo más oxidadas aquellascélulas procedentes de pacientes conazoospermia NO.

No encontramos ninguna relevanciaclínica entre el estado de la oxidacióndel ADN espermático y tasa defecundación junto con variosparámetros de calidad embrionaria(desarrollo temprano y desarrollotardío; días 5-6), tampoco con laconsecución de embarazo evolutivo(Aguilar et al. 2009).

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Figura 3. Histogramas de citometría de flujo sobre la ploidía y la oxidación de ADN en células testiculares. Las ventanas muestran A= células seleccionadas mediante elforward y side scatter, C=Células 8-OH positivas G= células haploides, H= células diploides, I= células tetraploides, M= total de células 8-OH positivas, N= célulashaploides 8-OH positivas, O= células diploides 8 OH positivas, P= células tetraploides 8 OH positivas.




PATRÓN DE EXPRESIÓN GÉNICADIFERENCIAL; MICROARRAYS

En la última década, conocida como laera post-genómica, las herramientas deanálisis genético han sufrido unarevolución técnica. La entrada en escenade sistemas que permiten el análisismasivo de genes en un solo experimentovs. aquellos en los que sólo permitían elestudio gen por gen (o de un pequeñogrupo de ellos) han proporcionado una nueva dimensión a la hora deplantear y extraer conclusiones de losexperimentos. Los microarrays, que escomo se conocen estos sistemas, fuerondescritos por primera vez por Schennaen 1995 (Schena et al. 1995) y nospermiten estudiar, por ejemplo, quégenes se expresan en un situaciónbiológica concreta y compararla con unapatológica y ver en qué se diferencian,qué genes se expresan y en quéproporción, dándonos una visión globalde una enfermedad y cuáles son losmecanismos que operan en dichoproceso patológico además de ser unpotencial papel en el diagnóstico deenfermedades.

Básicamente el microarray es un formatoexperimental en el que una superficiesólida en las que están impresas miles desondas que detectan genes de secuenciaconocida.

Microarrays hay de diferentes tipos y suclasificación depende, por ejemplo, delos que queremos detectar (oligos,cDNA, proteínas…), del tipo de soporte(un slide, sílice o gel) o del tipo deimpresión de las sondas en la matriz.

El caso que nos ocupa es el de losmicroarrays de expresión génica que nospermiten evaluar el conjunto de ARNmensajeros que se generan en un tejido oun grupo de células en una situaciónbiológica determinada y saber que genesse expresan de manera diferencial en cadasituación (Genes diferencialmenteexpresados (GDE)). En este caso la matrizcontiene una serie de sondas que son unosoligonucleótidos sintéticos que seránexpuestos a un pool de ARN mensajerosque son extraídos de las muestrasbiológicas que queremos estudiar.

La muestras biológicas que nuestrogrupo ha estudiado son de semen de

donantes y pacientes que se someten adiversas técnicas de reproducción asistida(TRAs). También nuestro grupo planteó lahipótesis de que debe haber diferenciasentre las muestras de semen queconsiguen un embarazo frente aquellasque no, y que además estas, eranindetectables para el espermiograma.

La diferencias pues se pueden encontrara un nivel molecular, a nivel de los ARN mensajeros presentes en el escaso citoplasma presente en elespermatozoide y que parece que estánimplicados en el proceso de fecundacióny en las primeras divisionesembrionarias (Ostermeier et al. 2005a,Ostermeier et al. 2005b, Ostermeier etal. 2004, Miller and Ostermeier. 2006a,Miller and Ostermeier. 2006a, Miller andOstermeier. 2006b, Miller et al. 2005)

Asimismo se planteó que losrequerimientos moleculares de lasmuestras de semen capaces de lograr unembarazo no son los mismos para todaslas TRAs, siendo más cuánto menosinvasivas son, por ejemplo en una IAH,frente a las que más, como es el caso deICSI.

DIFERENCIAS DE EXPRESIÓN GÉNICAASOCIADOS A LA INFERTILIDADMASCULINA

Nuestro grupo ha realizado variascomparaciones para ver las diferenciasmoleculares (a nivel de expresióngénica, esto es a nivel de los genes quese expresan de manera diferencial(GDE)) en el semen de hombres queembarazan a sus parejas frente aquellosque no y el objetivo a largo plazo esdiseñar una herramienta diagnósticacomplementaria al espermiograma paraevaluar el potencial fértil de unamuestra de semen basada en latecnología del microarray.

Con este objetivo en mente se realizó unexperimento en el que se comparabanmuestras de semen de donantes con unafertilidad probada (ya habían sidopadres con el programa de donación) yse comparó con semen de pacientes queacudían a la clínica porque no concebíande manera natural (Garrido et al. 2008).Tanto donantes como pacientespresentaban parámetros seminalessimilares y dentro de lo normal. Una vez

realizados los microarrays se observó,que efectivamente, la expresión de losgenes era diferente en ambos grupos yque estas diferencias podrían en parteexplicar el mayor o menor éxitoreproductivo de un grupo u otro.

El siguiente paso fue estudiar pacientesque conseguían embarazo frenteaquellos que no tras someterse a lamisma técnica de reproducción asistida,tanto a una Inseminación artificialhomóloga (IAH) como a unamicroinyección intracitoplásmica (ICSI).

DONANTES VS. PACIENTES

Se hizo una comparación entre muestrasde semen de donantes de fertilidadprobada que ya habían sido padresdentro del programa de donación deesperma y pacientes que acudían anuestra clínica ante la imposibilidad deconcebir de manera natural (Garrido etal. 2008). Ambos grupos presentabanparámetros seminales normales segúnlas indicaciones de la OMS de 1999 y sindiferencias significativas entre losparámetros de los donantes y de lospacientes. También se examinaron lasparejas femeninas de los pacientesincluidos en el estudio. Todas ellas eranmenores a 37 años y no presentabanninguna patología asociada a laincapacidad de quedarse embaraza(ovario poliquístico, obstruccióntubárica o endometriosis).

Una vez realizado el array los resultadosobtenidos indicaban grandes diferenciasentre ambos grupos. Un total de 1662genes se expresaban diferencialmenteen el grupo de donantes y 1568 en elgrupo de pacientes. Un posterioranálisis de esos genes con unaherramienta de ontología génica (quenos permite conocer las asociacionescomplejas que forman un grupodeterminado de genes y ver en queprocesos biológicos están implicados) nos mostró más diferencias, esta vez a nivel de asociación en redes biológicas complejas(http://david.abcc.ncifcrf.gov/) (GeneOntology Consortium. 2006, Huang da etal. 2007). Por ejemplo, alguno de losprocesos que salían estadísticamentesignificativos al analizar los GDE en elgrupo de donantes con un claro papelreproductivo eran la espermatogénesis,

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generación de los gametos masculinos,desarrollo de las espermátidas oreproducción sexual. Sin embargo estosprocesos no aparecen cuando seanalizan los 1568 GDE de pacientes. Estopuede indicar que estos sistemas sonmás operativos en el grupo de losdonantes y por eso su tasa de éxitoreproductivo.

PACIENTES SOMETIDOS A IAH; EMBARAZOVS NO EMBARAZO

El siguiente paso era el de compararmuestras de pacientes que lograbanembarazo frente aquellos que no(estudio de casos y controles),sometiéndose todos ellos a su primerciclo de IAH, teniendo ellos unarecuperación de espermatozoidesmóviles mayor de 3 millones y ellascumplían todos los requisitosanteriormente mencionados en lacomparación de donantes frentepacientes.

Los resultados también reflejaron clarasdiferencias entre ambos grupos, si bienestas diferencias no eran ni tantas ni tanclaras como cuando se comparaban losdonantes frente a los pacientes.

Encontramos 756 GDE en el grupo queembaraza y 194 en el grupo que nolograba embarazo y el análisisontológico no encontramos procesosbiológicos con un claro papel en lareproducción descrito.

PACIENTES SOMETIDOS A CICLOS DE ICSICON OVOCITOS DONADOS.

Para este experimento se escogieron 5casos, cada caso constaba de 2 parejasde pacientes que se sometían a unproceso de ICSI con semen fresco propioy ovocitos de la misma donante (modeloexplicado anteriormente en el quefinalmente quedando embarazada sólouna de ellas), siendo el diseño unestudio de casos y controles.

Las ventajas de este modelo son laestandarización del factor femeninousando ovocitos de donantes jóvenes,además una pareja se queda embarazaday otra no con los ovocitos de una mismapaciente y de la misma cohorteovocitaria con lo que el factor femeninoaún se estandariza mucho más. Por

último se usaron para los experimentosalícuotas del semen con el que luego seiba a realiza el ciclo de ICSI.

Teníamos 5 casos (5 sémenes queembarazaban (Grupo E, n=5) y 5 que no(Grupo NE, n=5)), se procedió a haceragrupaciones (pools) de ambos grupos yse realizó el microarray.

Los resultado volvieron a evidenciardiferencias entre ambos grupos, en elgrupo E teníamos 44 GDE y en NE sólo 5.

Entre los 44 GDE del grupo que logra elembarazo cabe destacar los siguientesgenes que pueden tener alguna papel enla función reproductora.

Der los 44 GDE, 4 son catepsinas (9% delos GDE del grupo E). En mamíferoscomo la oveja, el toro o el ratón queestán implicadas en los procesos deimplantación y placentación (Sireeshaet al. 2008, Song et al. 2007). Ademásestán implicadas en los procesosproteolíticos que juegan un papel en laremodelación del epitelio seminífero entestículos de roedores (Jervis andRobaire. 2001, Anway et al. 2004).

La apolipoproteína E implicada en laespermatogénesis y en la maduraciónespermática en ratas (Law et al. 1997).

La proteína epidimal secretora E1 o NPC2puede estar implicada en la regulaciónde la composición de las membranas del espermatozoide durante lasegregación del epidídimo ya que estárelacionada con el transporte delcolesterol durante la maduraciónespermática (http://www.expasy.ch/ )(Legare et al. 2006).

También hay varias metaloproteasas,que están implicadas en la protección enlas espermatogonias, espermatocitos ycélulas de Sertoli frente al efecto tóxicode metales pesados como el cadmiohaciendo a estos tejidos más resistentesal daño producido por la acción de losmismos (Kusakabe et al. 2008a,Kusakabe et al. 2008b).

La galectina 3 parece estar implicada enla maduración y activación de losespermatozoides en toros y cerdos.

Finalmente cabe destacar la familia de

las glutation peroxidasas, en este casola GPX1, cuyos niveles (junto con los dela GPX4) son importantes para protegeral espermatozoide del daño celular trasla descongelación. También se haencontrado una correlación entreniveles de la glutatión peroxidas 1 lacalidad embrionaria en día 3.(Garrido etal. 2004a, Meseguer et al. 2006a,Meseguer et al. 2004c).

CONCLUSIONES

Hay evidencias de que existendiferencias a nivel molecular (en estecaso de integridad del ADN y de perfilesde expresión génica) entre las muestrasde semen en función de su calidad que seve reflejada en aquellas muestras queconsiguen embarazar a sus parejasfrente aquellas que no lo consiguen.

Estas diferencias pueden ser utilizadascomo marcadores de potencial fértil delas muestras de semen.

Las diferencias en la integridad del ADNespermático se observan dentro y entrepacientes, están influenciadas porfactores externos y pueden condicionarel éxito reproductivo aunque lamaquinaria reparadora ovocitaria juegaun papel decisivo.

Las diferencias de expresión génicaentre las muestras de semen son cadavez menores a medida que eltratamiento al que se someten es másinvasivo. Sólo hay que tener en cuentael número de genes que estándiferencialmente expresados cuando seanalizan los donantes frente a lospacientes en general que cuando estacomparación se hace pacientes frente apaciente (en el caso de las IAH o ICSI)(Figura 4).

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Figura 4. Representación de las diferencias de expresión génica entre las muestras de semen a medida que eltratamiento al que se someten es más invasivo.



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NOTA ACLARATORIA: Los datospresentados en este resumen estánpendientes de publicación. Estos datospueden sufrir alguna modificación hastael momento de su presentación.

INTRODUCCIÓN

La esterilidad afecta al 10-15% de lasparejas (WHO, 1987), siendo el factormasculino responsable enaproximadamente el 50% de los casos(Huynh T y cols., 2002). Este hecho haceque en los últimos años se hayan puestoen marcha técnicas de biologíamolecular y genética encaminadas a laprofundización del estudio masculino anivel cromosómico ( fluorescence in situ hybridization (FISH) enespermatozoides y microdeleciones delcromosoma Y) y a nivel de la integridadestructural del ADN espermático.Respecto a esta integridad del ADN, sonvarios los factores descritos que puedenproducir un daño en el mismo (Álvarez yLewis, 2008):

-Apoptosis durante el proceso de laespermatogénesis.

-Roturas del ADN producidas durante laremodelación de la cromatina delespermatozoide durante laespermiogénesis.

-Fragmentación post-testicular, inducidaprincipalmente por radicales libres deoxígeno durante el transporte de losespermatozoides a través de los túbulosseminíferos y epidídimo.

-Fragmentación inducida porendonucleasas endógenas.

-Tratamientos de radio y quimioterapia.

-Tóxicos ambientales.

Las técnicas que existen para estudiar lafragmentación del ADN espermático se

pueden dividir en dos grupos. En primerlugar se encuentran aquellas que midenla susceptibilidad diferencial del ADNpara ser desnaturalizado por diversostratamientos.

En este grupo se encuentran lassiguientes:

SCSA o Sperm Chromatin Structure AssayDBD-FISH o DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization.SCD o Sperm Chromatin Dispersion Ensayo cometa .

Y en el segundo grupo se incluyenaquellas que marcan las roturas en lacadena de ADN, porque incorporanmoléculas marcadas con fluorocromosen los extremos de rotura:

TUNEL o Terminal dUTP Nick-EndLabeling .ISNT o In Situ Nick Translation.

En el presente estudio se determina elíndice de fragmentación del ADN (DFI) através de la técnica TUNEL, ya que comose ha indicado anteriormente mide eldaño real que existe en la muestraseminal analizada y no la susceptibilidadal daño. Esta técnica se está imponiendocomo la más adecuada para establecer elnivel de fragmentación en el ADNespermático (Álvarez y Lewis, 2008)

Se han intentado correlacionar losvalores de DFI con los resultados de lastécnicas de reproducción asistida (TRA)para establecer un punto de corte quepermita predecir el resultado de lasmismas. En este sentido, parece ser quelas muestras de semen que muestranniveles elevados de daño en el ADN y queson empleadas en los ciclos de FIV e ICSIpodrían estar asociadas con unadisminución de las tasas de fecundación,un empeoramiento de la calidad de losembriones, incluyendo el bloqueo de losmismos, una disminución de la tasa de

implantación y un incremento de la tasade aborto (Lopes y cols., 1998; Larson ycols., 2000). No obstante, lametodología empleada para medir laintegridad del ADN espermático, asícomo el diseño de la mayor parte de losestudios publicados hasta la fecha,hacen que no podamos establecer unacorrelación fiable y predictiva entre elDFI y el éxito/fracaso de lostratamientos de reproducción asistida(Collins y cols., 2008; The PracticeCommittee of The American Society forReproductive Medicine, 2008).

El objetivo del presente trabajo esconocer si existe una influencia real delDFI medido mediante TUNEL en losresultados tras FIV e ICSI.

Si realmente encontramos unacorrelación positiva, se podrían poner enmarcha tratamientos antioxidantesencaminados a disminuir el daño en elADN espermático, incrementando lastasas de éxito. Por el contrario, si noencontramos efectos negativos,supondría desestimar este tipo depruebas, abaratando el coste de lostratamientos reproductivos.

METODOLOGÍADISEÑO:

Estudio prospectivo randomizado y adoble ciego entre el Instituto Bernabeude Alicante, el Instituto Bernabeu deElche y el Instituto Bernabeu Biotech,llevado a cabo entre Abril de 2008 yJulio de 2009.

Se establecieron dos grupos de estudio:

1) Evaluación de la incidencia del DFIsobre los resultados tras ICSI:

Un total de 68 parejas realizaron un cicloICSI por factor masculino en el InstitutoBernabeu de Alicante, cumpliendo unoscriterios:

IMPACTO DEL GRADO DE FRAGMENTACIÓN DEL ADN EN LOSRESULTADOS EN FIV CONVENCIONAL E ICSI

Jorge Ten, Joaquín Llácer, Belén Lledó, Adoración Rodríguez, Ruth Morales, Rafael BernabeuInstituto Bernabeu Alicante




Jorge Ten et al. Impacto del Grado de Fragmentación del ADN en los resultados en FIV convencional e ICSI

· El recuento de espermatozoides en lamuestra seminal fue superior a 1 x 106spz/ml.

· La edad de la mujer fue inferior a 38años. De esta forma evitamos el sesgo enlos resultados debido a una edadmaterna avanzada.

· Tras un protocolo de estimulaciónovárica, la mujer se sometió a unapunción ovárica en la que se recuperaronun mínimo de 6 ovocitos maduros(metafases II) que fueronmicroinyectados mediante ICSI.

2) Evaluación de la incidencia del DFIsobre los resultados tras FIV:

En total, 113 parejas se sometieron a unciclo FIV con donación anónima deovocitos por fallo ovárico en el InstitutoBernabeu de Alicante. La calidadseminal de los varones fue normal(normozoospermia,WHO, 1997), lo quenos permitió realizar en todos los casosun FIV sin microinyección. Tras unprotocolo de estimulación ovárica, ladonante de ovocitos se sometió a unapunción ovárica. La inseminación fuellevada a cabo con un mínimo de 6ovocitos con la muestra capacitada delcónyuge de la receptora. El grosorendometrial fue normal en todos loscasos, no existiendo ninguna alteraciónen la cavidad uterina de las receptoras.

ESTIMULACIÓN OVÁRICA CONTROLADA:

El Comité Médico del instituto Bernabeuasignó a las pacientes protocolosespecíficos de estimulación ovárica enfunción de su historia clínica. Seemplearon gonadotropinas exógenas yse llevaron a cabo controles exahustivosmediante ecografías y análisis seriadosde estradiol. La ovulación fuedesencadenada mediante laadministración de gonadotropinacoriónica humana (HCG) o agonistas dela hormona liberadora degonadotropinas (GnRH).

RECUPERACIÓN OVOCITARIA:

Tras 34-36 horas post-HCG o agonistasde la GnRH, los complejos ovocito-corona-cúmulo fueron obtenidosmediante aspiración foliculartransvaginal guiada mediante

ultrasonido en un medio tamponado (G-Rinse, Vitrolife, Goteborg, Suecia) entubos de 14 ml. Esto tubos se pasaron allaboratorio de FIV, donde se procedió ala búsqueda de los complejos, los cualesfueron lavados en un medio tamponado(G-MOPS®; Vitrolife, Goteborg, Suecia)y distribuídos en pocillos con un medioespecífico (G-IVF®, Vitrolife, Goteborg,Suecia) hasta su inseminación omicroinyección.

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRASSEMINALES:

Las muestras de semen fueron obtenidasel mismo día de la recuperaciónovocitaria mediante masturbación trasun período de abstinencia de 3-5 días.Tras su licuefacción, los parámetrosanalizados incluyeron: volumen,concentración, movilidad y morfología.La metodología y los criterios paravalorar la calidad seminal son losestablecidos por la OrganizaciónMundial de la Salud. Las muestras fueroncapacitadas siguiendo un protocolo degradientes de densidad conPureSpermâ100 (Nidacon InternationalAB, Goteborg, Suecia). Utilizamos ungradiente de dos fases, una al 80% y otraal 40%.

Para llevar a cabo la FIV, la muestra fueajustada a un volumen final de 3x106sptz/ml. En el caso de la ICSI, secogieron alicuotas de mayor o menorconcentración en función de lascaracterísticas de la muestra.

FIV E ICSI:

Entre 3-5 horas tras la obtención de loscomplejos ovocito-corona-cúmulo, sellevó a cabo la FIV convencional o la ICSI.

Para la FIV, se inseminó con 150.000espermatozoides por pocillo. Seprocedió a la inseminación de cadapocillo en campana de flujo y a 37º.Cubrimos los pocillos con 300 μl deaceite mineral estéril (Ovoil; Vitrolife,Goteborg, Sweden) e incubamos a 37º Cy atmósfera al 6% de CO2. En cadapocillo hubo un máximo de 5 complejosovocito-corona-cúmulo.

Para la microinyección, las células delcúmulo fueron eliminadas mediante suexposición en un medio con 80 UI de

hialuronidasa (Hyase, Vitrolife,Goteborg, Suecia), quedando losovocitos liberados de sus células degranulosa. Sólo fueron microinyectadosaquellos ovocitos en metafase II omaduros. Inmediatamente tras la ICSI,los ovocitos fueron cultivados de formaindividual en microgotas de 50 μl demedio G-IVF cubiertos con aceitemineral estéril a 37ºC en una atmósferade 6% de CO2.

FIJACIÓN DE LAS MUESTRAS CAPACITADASPARA LA DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DEFRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO:

En el mismo momento de la realizaciónde la FIV o la ICSI, una alícuota de cadamuestra seminal capacitada (30 μl) fueextendida sobre un portaobjetos para sufijación. Una vez las muestras quedaronsecas, les fue asignado un código y seremitieron al Instituto Bernabeu Biotechpara la determinación de lafragmentación del ADN mediante latécnia TUNEL.

DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DEFRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO:

En las extensiones seminales sedeterminó la fragmentación del ADNmediante la técnica TUNEL empleando elKit de la casa comercial Roche ysiguiendo en todo momento susindicaciones técnicas. Para evaluar elporcentaje de espermatozoides con elADN fragmentado ó DFI se usó unmicroscopio de fluorescencia con unobjetivo de inmersión 100x. El DFI sedeterminó como el cociente entre elnúmero de espermatozoides en los quese detecta fluorescencia verde (DNAfragmentado) y el número total deespermatozoides contabilizados portinción con DAPI. Se evaluaronaproximadamente 500 espermatozoidestotales por cada muestra. Un valor delDFI igual o superior al 15% fueconsiderado como patológico.

COMPROBACIÓN DE LA FECUNDACIÓN:

Los ovocitos con una fecundacióncorrecta presentaron dos pronúcleos yextrusión del segundo corpúsculo polar16-18 horas tras la FIV o lamicroinyección. El resto de ovocitosfueron clasificados como no fecundadoso con fecundación anómala (haploides,

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triploides, etc.). Los ovocitosfecundados fueron pasados de formaindividual a microgotas de 50 μl demedio G.1 (Vitrolife, Sweden) cubiertoscon aceite mineral estéril a 37ºC en unaatmósfera de 6% de CO2 para controlarsu desarrollo posterior.

VALORACIÓN DE LA CALIDADEMBRIONARIA, TRANSFERENCIA YEMBARAZO:

Tras 44-47 horas, 67-71 horas, 94-98horas, 112-120 horas y 136-140 horas seobservaron los embriones enmicroscopio invertido a 400 aumentospara valorar su calidad y establecercuales eran los embriones que setransferían al útero materno y cuales secongelaban o desechaban por malacalidad. Los criterios establecidos paravalorar dicha calidad fueron los deASEBIR (Asociación para el Estudio de laBiología de la Reproducción). Latransferencia embrionaria se realizó endía 2 (D+2), día 3 (D+3) o día 5 (D+5) enfunción del número de embrionesevolutivos y de su morfología. El númerode embriones a transferir dependió de lahistoria médica y de su calidad.

Los embriones fueron transferidos a lacavidad uterina mediante una cánulaRocket® (Embryo transfer catheterRocket Medical, Washington, UK), conayuda de un ecógrafo.

Tras 13-14 días post-punción se realizóun test de embarazo (determinación deβ-hCG en sangre). La confirmación deembarazo fue llevada a cabo medianteecografía vaginal, con presencia devesícula gestacional con latido cardiacopositivo. Se llevó a cabo un seguimientodel embarazo para confirmar suevolución hasta la semanadecimosegunda y evaluar el abortodurante el primer trimestre degestación.

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS:

Una vez obtenidos los datos defragmentación de ADN y los datosclínicos, éstos fueron remitidos alcoordinador del estudio. Se llevó a caboun análisis estadístico empleando elpaquete SPSS. La variables de estudiofueron las siguientes:

Calidad Seminal

Tasa de Fecundación

Calidad Embrionaria (Criterios ASEBIR)Tasa Embarazo positivo (ß +)Tasa Embarazo clínico.Tasa de Implantación.Tasa de Aborto.

RESULTADOS

Respecto al grupo de pacientes sometidosa ICSI, la edad materna media fue de 33,7años y la paterna de 37,7. Una de lasmuestras no pudo ser evaluada paradeterminar el DFI. Del total de las 67muestras evaluadas, el DFI medio fue del5,8%. Sesenta muestras (89,5%)presentaron un DFI inferior al 15%, conuna media de fragmentación del 3,9%,considerándose, por tanto, muestrasnormales. El 10,5% restante de las

muestras (n=7) fueron patológicas, conun DFI medio de un 21,9%. Como muestrala tabla I, no se encontraron diferenciasestadísticamente significativas enninguna de las variables de estudio.

Respecto al grupo de pacientesreceptoras de ovocitos sometidas a FIVconvencional, la edad materna media delas receptoras fue de 40,0 años y de lasdonantes de ovocitos de 25,3. Pormotivos técnicos, cinco muestras nopudieron ser analizadas para determinarel DFI. Del total de las 108 muestrasevaluadas, el DFI medio fue del 7,6%.Ochenta y ocho muestras (81,5%)presentaron un DFI inferior al 15%, conuna media de fragmentación del 3,8%,considerándose, por tanto, muestrasnormales. El 18,5% restante de lasmuestras (n=20) fueron patológicas, con

45

Tabla I: Resultados en el grupo de pacientes sometido a ICSI




un DFI medio de un 24,4. En la tabla IIse muestran los resultados obtenidoscomparando las muestras consideradasnormales respecto a las patológicas.

Como se observa, no se encontrarondiferencias estadísticamente significativasen ninguna de las variables de estudio.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en el presenteestudio no muesran ninguna relación dela fragmentación del ADN espermático(considerando una muestra patológicacon un DFI ≥15%) respecto a la calidadseminal, fecundación, calidadembrionaria, tasas de gestación y

aborto del primer trimestre en unprograma de ICSI por factor masculino yen otro de FIV convencional empleandoovocitos donados.

Los DFI medios obtenidos en los 2grupos de estudio fueron del 5,8% enpacientes que van a ICSI por factormasculino y un 7,6% en varonesnormozoospérmicos que van a FIVconvencional con donación de ovocitos.Es decir, encontramos un ligeroincremento de la fragmentación del ADNespermático en muestras normalesrespecto a muestras con una calidadseminal alterada. Además, el porcentajede muestras patológicas también fuesuperior en el grupo de varones

normozoospérmicos respecto al devarones con alteraciones seminales(18,5% vs 10,5%, respectivamente).

Respecto a la calidad seminal, tanto enmuestras con unos parámetros alterados(tabla I), como en muestrasnormozoospérmicas (tabla II), noencontramos diferencias significativasen el volumen, recuento, movilidad ymorfología en muestras con DFI alteradorespecto a muestras con DFI normal.Aunque hay varios autores que sí hanencontrado un asociación entreparámetros seminales anormales yroturas en el ADN nuclear de losespermatozoides del eyaculado (Singh ycols., 1988; Gandini y cols., 2000; Irviney cols., 2000; Zini y cols., 2001; Huang ycols., 2005), nuestros datos están enconsonacia con los obtenidos porLarson-Cook y cols., (2003). Unaobservación interesante es que ennuestro trabajo, el 18,5% de los varonesnormozoospérmicos y potencialementefértiles, presentaron un DFI superior al15%, con una media del 24,2%.

En cuanto a la relación que existe entreel DFI y la tasa de fecundación trasFIV/ICSI, los resultados encontrados sontambién controvertidos. Sakkas y cols.,(1996), Morris y cols., (2002), Larson-Cook y cols., (2003), Virro y cols., (2004)y Henkel y cols., (2004) observaron queambos parámetros no estabanrelacionados. Sin embargo otros autorescomo Sun y cols., (1997), Lopes y cols.,(1998) y Saleh y cols., (2003)observaron que un nivel de daño elevadoen el ADN estaba asociado con una bajatasa de fecundación. Nuestros datosindican que no existe una correlaciónentre DFI y tasa de fecundación, tantotras emplear ICSI, como FIVconvencional. No obstante, observamosuna tendencia hacia una mejor tasa defecundación en muestas con DFI inferiora 15 tras la realización de FIVconvencional (p=0,08, tabla II).

Respecto al desarrollo embrionario, laexpresión de los genes paternoscomienza cuando el embrión tiene 4-8células. En este momento, si existenalteraciones en el ADN paterno, podríanponerse de manifiesto, perjudicando eldesarrollo embrionario. Estacircunstancia podría explicar una mayorincidencia de bloqueos embrionarios,

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Tabla II: Resultados en el grupo de pacientes sometidos a FIV con donación de ovocitos. * Muestras con teratozoospermias leves/moderadas que permitieron llevar a cabo el FIV convencional.




así como ciertos fallos de implantación,embarazos bioquímicos o abortosclínicos (Seli y cols., 2004). Noobstante, la implicación de lafragmentación del ADN espermático esun tema controvertido y sin unaexplicación demostrable. Nuestros datosnos indican que no existe ningunarelación entre la fragmentación del ADNespermático con el bloqueo en laprimeras divisiones y el desarrolloembrionario hasta la fase de blastocisto(datos no mostrados). De la mismaforma, tampoco encontramos unarelación entre el DFI y la calidad de todala cohorte embrionaria (datos nomostrados).

En cuanto a la fragmentación del ADNespermático y las tasas de embarazo yaborto, tampoco encontramos ningunaasociación (Tablas I y II). Los resultadospublicados en la literatura también soncontradictorios al respecto. Empleandola técnica SCSA, hay grupos que con unDFI superior al 27% no tuvieronembarazos tras FIV/ICSI (Larson y cols.,2000, Larson-Cook y cols., 2003; Saleh ycols., 2003). No obstante, Bungum ycols., (2004) y Payne y cols., (2005) siconsiguieron embarazos con un DFIsuperior al 27%. Utilizando la técnicaTUNEL, Benchaib y cols., (2003) noobtuvieron ningún embarazo con un DFIsuperior al 20%. Borini y cols., (2006)obervaron que la tasa de embarazoclínico y la tasa de aborto eransignificativamente diferentes entrepacientes con alta y baja fragmentaciónespermática en los casos de ICSI, aunqueno en los de FIV, atribuyéndolo a que enFIV se produce una selección natural delespermatozoide. No obstante, Seli ycols., (2004) y Huang y cols., (2005) noencontraron ninguna relación entre latasa de embarazo y la tasa defragmentación del ADN espermáticomedido mediante TUNEL.

El empleo de diferentes técnicas demedida, las diferencias que puedenhaber entre la medida de lafragmentación en semen fresco ocapacitado, el número deespermatozoides analizados, el punto decorte establecido para catalogar unamuestra como normal o patológica, asícomo todas aquellas pequeñasdiferencias metodológicas y/o dediseño, hacen que los resultados

publicados no ofrezcan un valor clarodesde un punto de vista clínico y que,por tanto, estemos en una situaciónaparentemente irreal de lo que sucede.El empleo de la técnica TUNEL parece quees la mejor para medir un daño real sobreel ADN espermático (Álvarez y Lewis,2008). Por otra parte, empleando unaalicuota de la muestra capacitada que seemplea para llevar a cabo lainseminación o la microinyección nosaproximamos más al nivel defragmentación “real” de la muestraespermática. Aunque el tamaño de lamuestra en el presente trabajo siguesiendo relativamente pequeño y tieneque incrementarse y contrastarse, losdatos son claros, hablando a favor deque la medida de la fragmentación delADN espermático no influye en losresultados tras FIV/ICSI. Es importanteplantearse a partir de ahora laconveniencia de solicitar estas pruebaspor parte de los clínicos. Además, lostratamientos antioxidantes enfocadospara intentar disminuir la fragmentacióndel ADN espermático dejarían de tenervalidez, ya que no influyen en losresultados de las técnicas dereproducción asistida.

Finalmente, la realización de puntos decorte más altos o más bajos paraconsiderar una muestra como normal opatológica debería tenerse en cuenta enbase a los resultados obtenidos en cadalaboratorio. En nuestro caso, lavariación del punto de corte paraequilibrar el tamaño muestral en cadagrupo no supuso ningún cambio en losresultados (datos no mostrados).

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S E S I Ó N G E N É T I C A Y R E P R O D U C C I Ó N

INTRODUCCIÓN:

La mayoría de los ciclos de fecundaciónin vitro (FIV) conllevan la transferenciade más de un embrión -el 85.3% de losciclos de FIV, FIV-ICSI o FIV+ICSI segúnel último registro de la SociedadEspañola de Fertilidad en referencia adatos de 2006. Aunque esta práctica, latransferencia de más de un embrión,incrementa las posibilidades deconseguir un embarazo, tambiénaumenta el riesgo de embarazosmúltiples, los cuales, están asociados aun aumento del riesgo decomplicaciones durante el embarazocomo la pre-eclamsia, histerectomía,bajo peso al nacer o malformacionescongénitas, entre otras (Stromberg etal., 2002; Pinborg et al., 2003; Walker etal., 2004).

La tendencia actual para evitar lascomplicaciones derivadas de losembarazos múltiples es la disminucióndel número de embriones a transferir. Dehecho, las recomendaciones de laEuropean Society of HumanReproduction and Embriology (ESHRE)apuestan por la transferencia de un soloembrión (Magli et al., 2008). Sinembargo, la transferencia de un únicoembrión comporta un descenso en latasa de embarazo. Para evitar esedescenso, es preciso diseñar estrategiasque permitan la selección del embrióncon mayor potencial de implantación.

Hasta el momento, la estrategia seguidaes definir que criterios morfológicospermiten determinar el embrión de todala cohorte con mayores posibilidades dedar lugar a un embarazo que llegue atérmino (Sakkas and Gardner, 2005). Eneste sentido nuestra asociación redactóunos criterios de valoración morfológicacon la finalidad de homogenizar lacategorización de la descripciónmorfológica y unificar el criterio en elmomento de seleccionar que embrióntransferir (ASEBIR, 2008).

No obstante, a pesar de las estrictasvaloraciones morfológicas, muchosembriones morfológicamente “normales”no dan lugar a un embarazo o abortan deforma espontánea después de laimplantación. Aunque en muchos casosno sabemos porque, en otros, la ausenciade implantación y los abortos puedenexplicarse por la presencia de anomalíascromosómicas numéricas, es decir, por elfenómeno conocido como aneuploidía.

Una elevada proporción de los ovocitosy embriones provenientes de ciclos defecundación in vitro (FIV) presentananomalías cromosómicas (Angell et al.,1983; Delhanty et al., 1993; Munné etal., 1993; Munné et al., 1995; Gutiérrez-Mateo et al., 2004)(tabla 1). Además,sabemos que la mitad de los abortos deprimer trimestre presentan anomalíascromosómicas (Hassold and Jacobs,1984).

La mayoría de las anomalíascromosómicas son letales, por lo que elembrión no llegará a implantar o, si lohace, dará lugar a una pérdida deembarazo. Parece lógico pensar queevitando la transferencia de estosembriones las tasas de embarazo y,sobretodo, las de niño en casa, mejoren,y la de abortos, disminuya. El problemareside en que los embriones aneuploidesno pueden diferenciarse de los euploidesmediante la observación morfológica. Laúnica opción real en estos momentos es eldiagnóstico genético preimplantacional(DGP).

Aunque el análisis de aneuploidías enembriones preimplantacionalesmediante protocolos óptimos dehibridación in situ fluorescente (FISH)ha ofrecido excelentes resultados enpacientes correctamente indicadas(Gianaroli et al., 1999; Munné et al.,1999, 2003, 2005; Schoolcraft et al.,2008; Rubio et al., 2009), estametodología presenta dos limitacionestécnicas. En primer lugar disponemos deun número limitado de fluorocromos,por lo que el número de cromosomasanalizables en una sola hibridación espequeño y para poder analizar unnúmero aceptable de cromosomas (almenos 8) deben realizarse varias rondasde hibridación. Los protocolos máscompletos analizan entre 9 y 12cromosomas, por lo que inevitablementequedará un determinado porcentaje de

USO DE MICROARRAYS EN DIAGNÓSTICO GENÉTICOPREIMPLANTACIONAL.

Carles GiménezReprogenetics Spain, S.A. [email protected]


Tabla 1: Porcentaje de embriones cromosómicamente anormales en función de la edad.



Carles Giménez. Uso de Microarrays en Diagnóstico Genético Preimplantacional.

aneuploidía sin detectar. En segundolugar, la FISH es dependiente de cómo sehaya realizado la fijación. No todas lastécnicas de fijación permiten obtenernúcleos interfásicos en condicionesóptimas y en función de la morfologíadel núcleo, de su tamaño y/o de lapresencia de citoplasma la FISH puedeverse comprometida.

La aparición en 1992 de la hibridacióngenómica comparada (CGH), descritapor Kallioniemi (Kallioniemi et al.,1992), que permitía la detección deganancias y pérdidas de materialgenético en tumores sólidos, hapermitido, previa evolución delprotocolo (Wells and Delhanty, 1996), elanálisis de todo el complementocromosómico. Así, la CGH ha permitido

solventar los dos principales problemasde la FISH. Por una parte, no se precisade la fijación celular, las células semanipulan como si se tratará de un DGPde enfermedad monogénica,introduciéndolas en un tubo de PCR; porotro, se analizan todos los cromosomas.

La técnica utiliza la hibridacióncompetitiva de dos fuentes de DNA (uno,la muestra que queremos analizar; dos,DNA de referencia cromosómicamente

normal) marcadas con fluorocromosdiferentes (verde y rojo,respectivamente), contra metafasesnormales (46,XX o 46,XY). Sobre loscromosomas de las metafases hibridarántantos fragmentos del DNA muestracomo del de referencia (figura 1). Laproporción de fluorescencia verde:roja alo largo de cada cromosoma nosproporcionará el número de copiaspresentes en la muestra, de manera queuna desproporción a favor delfluorocromo de color verde en uncromosoma determinado, nos indicaráde la presencia de más copias de esecromosoma en la muestra, mientras quesi la desproporción es a favor del colorrojo, nos indicará una pérdida para esecromosoma.

Las primeras aplicaciones de la CGH enreproducción humana datan de 2001cuando el equipo de la Dra Wilton(Wilton et al., 2001) consiguió unembarazo tras biopsia embrionaria enD+3, congelación, análisis medianteCGH, descongelación del embriónnormal y transferencia. Otrasaproximaciones han sido descritas porotros autores, como la biopsia de primercorpúsculo polar (Wells et al, 2002)análisis mediante CGH y transferencia en

D+3, aunque esta aproximación nopermite determinar las anomalíasacaecidas en meiosis II, las de origenpaterno ni las postzigóticas.Recientemente se han conseguidoembarazos mediante el análisiscombinado de aneuploidía en primercorpúsculo polar junto con DGP paraenfermedad monogénica en D+3(Obradors et al., 2008).

Los datos más recientes de aplicación dela CGH en reproducción asistida los hanaportado la colaboración entreReprogenetics y el Colorado Center forReproductive Medicine. Utilizando laCGH como herramienta diagnóstica y labiopsia de blastocisto junto con lavitrificación del embrión biopsiado enpacientes con fallos de implantación, seha conseguido una tasa de embarazo del85% con una tasa de implantación del66% (Wells et al., 2008; comunicaciónpersonal).

Pero lo más importante es lo que la CGHnos ha enseñado (Wells and Delhanty,2000; Voullaire et al., 2002; Wilton etal., 2003):

1) la aneuploidía puede afectar, y afecta,a cualquier cromosoma durante eldesarrollo preimplantacional;

2) aún así, no todos los cromosomastienen el mismo riesgo de aneuploidía;

3) se han detectado anomalías encromosomas para los que nunca se habíaobservado aneuploidía en diagnósticoprenatal o en material abortivo por lo quese presume que causan bloqueo deldesarrollo embrionario preimplantacional,fallo de implantación o abortostempranos;

4) se han detectado roturascromosómicas no detectables medianteFISH;

5) entre el 20-40% de los embriones sonportadores de anomalías cromosómicasno detectables mediante los kits de FISHcomerciales.

Pero la CGH presenta algunasdesventajas. Precisa de un largo periodode tiempo para obtener resultados, locual la hace incompatible con latransferencia en D+3/D+5. Los

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Figura 1: Metafase tras CGH (foto: Dra. Fragouli©, publicada en Hum Reprod 2008; 23:2596-2608)




embriones biopsiados necesitan sercongelados, aunque la aparición de latécnica de vitrificación está facilitandomucho este proceso y arrojan un muybuen rendimiento del proceso con unasupervivencia en algunos casos superioral 90%. Recientemente se ha presentadouna modificación de la metodología quepermitiría una reducción en el tiemponecesario para obtener resultado (Riuset al, 2009), lo cual permitiría latransferencia dentro del mismo ciclo.Aún así, las principales desventajas de laCGH es que se trata de una técnicaextremadamente compleja y el análisisde resultados es extraordinariamentelento, lo que la convierte en unametodología de difícil uso rutinario en lapráctica clínica.

En estos momentos, existe la posibilidaddel uso de los “chips” o “microarrays”,como alternativa para la obtención de undiagnóstico de todo el complementocromosómico en un espacio de tiempocompatible con la transferencia enfresco si así se quiere. La mayoría de lasdiferentes plataformas de microarraysestán basadas en una hibridacióncompetitiva de un DNA muestra y un DNAde referencia marcados confluorocromos diferentes. La diferenciaestriba sobre “que” se hacen hibridar(BAC’s, oligos, librerías, SNP’s). Laventaja de los microarrays sobre la CGHconvencional, es que la lectura de lafluorescencia es simple y rápida y que eltiempo de hibridación es generalmentemenor.

El primer obstáculo que se debe sortearantes de proceder al uso de losmicroarrays es la amplificación total delgenoma (WGA) previa al marcaje delDNA. Diferentes métodos se utilizan parallevar a cabo la WGA: PEP PCR, DOP PCR,MDA, GenomePlex. Sólo una buena yhomogénea amplificación del genomajunto con una reducida tasa de “alleledrop out” (ADO) permitirá obtenerbuenos resultados con los microarrays.Por este motivo es preciso una extensivavalidación del proceso previa a laaplicación de la metodología demicroarrays.

CGH MICROARRAYS DE BAC’S:

La plataforma sobre la que se hacehibridar el DNA de la muestra y el test, la

constituyen “puntos” formados porclones de cromosomas artificiales debacteria (BAC) de tamaño relativamentegrande (150-200Kb) que cubren la totallongitud de cada uno de los cromosomas(ver figura 2). Sobre cada uno de estos

puntos hibridan un gran número defragmentos del DNA muestra yreferencia. El annealing de múltiplesfragmentos derivados de la mismaregión del cromosoma sobre el mismopunto, reduce el efecto que puedantener los artefactos técnicos creados porposibles amplificaciones preferencialesy el ADO. Como en cada punto hibridancentenares o miles de fragmentosamplificados, el hecho de que unospocos fragmentos no se hayanamplificado queda diluido por la grancantidad de otros que sí se han adheridoa la sonda. De todas formas, eldiagnóstico no se puede basar en elresultado obtenido en un solo BAC, sinoque se obtiene combinando resultado devarias sondas adyacentes (Figura 3).Esto disminuye la resolución de losarrays de BAC’s.

CGH MICROARRAYS DE LIBRERÍASCROMOSÓMICAS:

En este tipo de plataforma, el DNAmuestra y el test, se hacen hibridar

sobre sondas fabricadas a partir de laamplificación al azar de regionescromosómicas obtenidas pormicrodisección o citometría de flujo decada uno de los cromosomas. Elresultado es un chip en el que cada

punto está compuesto por una mezclamuy heterogénea de fragmentos de DNAderivados de múltiples sitios a lo largode cada cromosoma (Hu et al., 2004).

CGH MICROARRAYS DE OLIGOS:

La base de esta plataforma sonpequeñas sondas de entre 25 y 85nucleótidos sintetizadas directamenteen la base sólida del microarray y sobrelas que se hará hibridar el DNA muestray el test. Esta plataforma ha sidoprobada para la detección deaneuploidía en células únicasprovenientes de líneas linfoblásticas, enfibroblastos y en blastómeros(LeCaignec et al., 2006). Conposterioridad se ha aplicadoclínicamente en el DGP para análisis deaneuploidías resultando en variosembarazos (Hellani et al., 2008).

Los arrays de oligos tienen la desventajade que el pequeño tamaño de las sondasaumenta el riesgo de observar gananciasy/o pérdidas artefactuales introducidos

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Figura 2: imagen de un array de BAC’s después de la hibridación.




durante la WGA. Se puede aumentar elnúmero de sondas con la finalidad dediluir estos artefactos, pero entonces elcoste aumenta.

SNP’s microarrays: Plataforma basada enel análisis de polimorfismos de un solonucleótido (SNP’s) distribuidos al azar alo largo de todo el genoma y presentesen gran número. Este tipo de microarraydifiere ligeramente en relación a losarrays basados en CGH. El DNA muestra yel de referencia no se combinan, sinóque se hibridan por separado y sevaloran en paralelo, por este motivopueden tener el mismo marcaje. Lavaloración se realiza por dos métodos. Elprimero consiste en reconocer quecromosomas se han heredado de losprogenitores a través de los haplotiposobtenidos. Si se observan treshaplotipos, dos de ellos correspondiendoa un mismo progenitor, sabremos que setrata de una trisomía. El segundoconsiste en comparar la intensidad delmarcaje obtenido del DNA muestra y el dereferencia, si para unas sondas enconcreto se observa mayor brillo del DNAde referencia, pensaremos que hay unamonosomía en el DNA muestra.

Este tipo de plataforma presenta algúnproblema en relación a la detección de latrisomía, ya que no todas estas sederivan de una no disyunción en meiosis1, por lo que en caso de producirse enmeiosis 2 la diferenciación solo se podríallevar a cabo por intensidad de marcaje,pero no por haplotipo, y no haysuficientes datos sobre la fiabilidad del

método basándose solo en intensidad.

Numerosos grupos utilizan este tipo deplataforma (Treff et al, 2007, 2009;Handyside et al, 2008; Kearns et al 2008;Rabinowitz et al, 2008; Scott et al,2008), que entre otras, tiene la ventajaque permite obtener una huella digitalde cada embrión, de manera que puedemonitorizarse que embrión haimplantado por ejemplo, o se podríallegar a realizar un diagnóstico indirectode una enfermedad monogénica sinnecesidad de desarrollar un protocoloespecífico para cada pareja.

La desventaja del array de SNP’s es lafalta de exactitud a nivel de un SNP y elalto coste.

Tal y como se ha comentadoanteriormente el uso conjunto de CGH,biopsia de blastocisto y vitrificación deembriones en un programa de FIV haresultado en un espectacular aumentode la tasa de implantación hasta valorescercanos al 66% y de embarazo atérmino con un 78%. Estos son datospreliminares de unos 128 ciclos llevadosa cabo por Reprogenetics encolaboración con el centro de FIV deColorado liderado por el Dr. WilliamSchoolcraft y considerado uno de losmejores centros en el mundo. Pero esteprotocolo precisa del cultivoembrionario hasta el estadio deblastocisto, por lo que era necesariodisponer de alguna otra herramientaque permitiera el mismo tipo de análisisen cualquier estadio celular y compatible

con la transferencia dentro del mismociclo.

El uso de los microarrays de BAC’sbasados en la técnica de CGH (aCGH) nosha permitido examinar todos loscromosomas en 24-30 horas de larecepción de la muestra, siendo laobtención de resultados compatible conla transferencia dentro del mismo ciclode FIV.

En los estudios de validación que hemosllevado a cabo en Reprogenetics, hemospodido observar como este nuevoprocedimiento detecta un 20% más deaneuploidías que la FISH con 12 sondas.

Aunque teóricamente la aCGH puededetectar pequeñas deleciones y/oamplificaciones de regiones de DNA,este aspecto está en proceso devalidación por lo que por el momentoestamos utilizando los aCGH paradetectar únicamente anomalíascromosómicas numéricas. De todasformas, los aCGH que estamos utilizandoestán diseñados para la detección de laganancia o pérdida de todo uncromosoma y no se valora ningúnpolimorfismo de número de copia (CNP),ni ningún rasgo fenotípico, ni ningúnresultado que pudiera ser éticamentecuestionable (como enfermedades deaparición tardía, predisposición alcáncer, …) así como tampocodesequilibrios de significado incierto.

Mediante los aCGH no es posibledetectar cambios en la ploidía delembrión. Los embriones haploides no sedesarrollan hasta blastocisto, por lo quedifícilmente darán lugar a error.

En cuanto a los embriones poliploides,aquéllos que provienen de zigotos 3PNdeberían ser detectados por losembriólogos y descartados. Otra fuentede poliploidía es la proveniente deespermatozoides diploides u ovocitosdiploides. Los ovocitos diploides songigantes y no deberían utilizarse,mientras que un 1% de losespermatozoides son diploides.Habitualmente son megalocefálicos y nose utilizan al hacer ICSI, pero podríanfecundar en FIV convencional. Los aCGHno detectan este tipo de poliploidía.Finalmente, un 5% de zigotos 2PNpueden dar lugar a poliploidía por

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Figura 3: Resultado de un aCGH procedente del análisis de un blastómero presentando una monosomía parael cromosoma 9




endoreduplicación y ausencia decitocinesis. La mayoría de estosembriones poliploides tendrán otrasanomalías cromosómicas detectablesmediante aCGH. Sólo un 1% de lascélulas poliploides provinientes dezigotos 2PN son poliploides puras y nopueden ser detectadas mediante aCGH(ni por cualquier otro tipo de array).

A falta de incrementar el número decasos clínicos, esperamos obtenerresultados equiparables a los obtenidosmediante la CGH convencional.

AGRADECIMINETOS:

Expresar mi agradecimiento a todo elequipo de Reprogenetics y muyespecialmente al Dr. Dagan Wells, sin laaportación del cual no habría podidoescribir este trabajo.

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INTRODUCCIÓN

En humanos genética y reproducciónpresentan lazos de unión muy estrechos.Estos dos conceptos convergen demanera evidente durante lagametogénesis. Disfunciones oanomalías que afecten una o más etapasimplicadas en la formación de

espermatozoides u ovocitos puederepercutir en la capacidad reproductivade los individuos afectos. En estesentido, la infertilidad se ha asociado ala presencia de anomalías genéticas,pero también a disfuncioneshormonales, a edad avanzada, aobesidad, a infecciones víricas obacterianas, a problemas inmunológicos,

psicológicos, entre otros (Maduro et al.2003).

La contribución genética a problemas defertilidad es difícil de valorar. Hoy en díaconocemos genotipos en los cualespodemos establecer claramente el tipode alteración que producen y sus efectosen la capacidad reproductiva de los

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¿QUÉ NOS APORTA EL ESTUDIO DE FISH EN ESPERMATOZOIDES ENEL ESTUDIO DE LA PAREJA INFÉRTIL?

Joan Blanco, Zaida Sarrate, Ester Anton, Lydia Garcia-Quevedo, Òscar Molina, Francesca VidalUnitat de Biologia Cel·lular. Facultat de Biociències. Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra (Cerdanyola del Vallès)E-mail: [email protected]

RESUMEN

Los estudios citogenéticos mediante FISH en espermatozoides forman parte de la mayoría de protocolos de estudio de lainfertilidad masculina. La técnica permite obtener datos fidedignos sobre la frecuencia de anomalías cromosómicas en losespermatozoides ofreciendo una información valiosa en el consejo genético reproductivo. Algunos autores recomiendan unanálisis de FISH en espermatozoides si el varón pertenece a un grupo de riesgo: pacientes candidatos a presentar un riesgoincrementado de transmisión de anomalías cromosómicas a su descendencia.

En este artículo se revisan los resultados obtenidos a partir de la aplicación de las metodologías de FISH en espermatozoidesde individuos infértiles de cariotipo normal o alterado y su posible implicación en el consejo genético reproductivo.




individuos afectos. En general, lamanifestación fenotípica de lainfertilidad de origen genético implicauna reducción significativa de lacantidad de gametos formados,problemas en el desarrollo del embrión oincrementos del riesgo de abortosespontáneos. Diversos autoresresponsabilizan directamente a lagenética del 15% de los casos deinfertilidad humana. No obstante, si aeste porcentaje le sumamos los efectosindirectos de la genética y la más queprobable implicación en los casos deinfertilidad de etiología desconocida,nos podemos hacer una idea de losenormes condicionamientos genéticosque presenta la reproducción enhumanos.

El desarrollo de las técnicas dereproducción asistida ha permitido elacceso a la maternidad / paternidad enparejas con problemas graves defertilidad. Algunos investigadorescuestionan las técnicas de reproducciónasistida, en el sentido de que éstaspermiten superar las barreras biológicasnaturales y por tanto la reproducción deuna población de individuos que encondiciones “normales” no podríantener descendencia. Una situación quepodría provocar un incremento deanomalías en la población de individuosconcebida mediante estosprocedimientos. En este contexto, elconocimiento del origen de lasanomalías, su incidencia y sobre todo elriesgo de transmisión a la descendencia,es indispensable en el consejo genéticoreproductivo ofrecido a los individuosafectos. Este hecho queda claramentereflejado en las disposiciones generalesde la Ley 14/2006, de 26 de mayo, sobretécnicas de reproducción humanaasistida, donde se cita entre losobjetivos de la ley (Artículo 1): Regularla aplicación de las técnicas dereproducción humana asistida en laprevención y tratamiento deenfermedades de origen genético,siempre que existan las garantíasdiagnósticas y terapéuticas suficientes ysean debidamente autorizadas en lostérminos previstos en esta Ley.

En consecuencia, las técnicas de análisisgenético forman parte de la mayoría deprotocolos de estudio de la infertilidad,siendo de gran importancia para el

consejo reproductivo de las parejasafectadas. Destacamos tres ámbitos deanálisis: Limfocitos de sangre periférica,células germinales masculinas (metafasesI y espermatozoides) y embriones enestadios preimplantacionales.

El análisis del cariotipo forma parte dela evaluación básica de la infertilidadmasculina, observándose que laincidencia de anomalías cromosómicasen poblaciones de individuos infértileses claramente superior a la descrita enla población general (de Braekeleer yDao 1991). Los estudios meióticos enbiopsia testicular, dirigidos a ladetección de anomalías que afectanexclusivamente a la línea germinal, hanmostrado que alrededor del 6% de lospacientes con cariotipo somático normalque consultan por infertilidad presentanalteraciones meióticas (Egozcue et al.2000). Las anomalías del cariotiposomático o meiótico pueden afectar elgrado de fertilidad de un individuo dediversas formas: reducción significativadel número de gametos, incremento en laproducción de gametos portadores deanomalías cromosómicas o formación deembriones con anomalías cromosómicas.

En la detección de espermatozoidesportadores de anomalías cromosómicas,hoy en día se está aplicando lametodología de la hibridación in situfluorescente (FISH). La técnica,conocida comúnmente como FISH enespermatozoides, consiste en lautilización de sondas de DNA específicasque reconocen determinadoscromosomas. Las sondas de DNA estánmarcadas con diferentes fluorocromos.Mediante el microscopio defluorescencia podemos inferir elgenotipo de cada espermatozoide apartir del número, el color y ladistribución de las señales dehibridación presentes en cada célula.

Algunos autores recomiendan estudiosde FISH en espermatozoides si el varónpertenece a un grupo de riesgo, es decir,pacientes que presentan un riesgoincrementado de transmitir unaanomalía cromosómica a ladescendencia. En este sentido, la técnicase ha incorporado como herramientadiagnóstica en los protocolos de estudiode la infertilidad masculina. Noobstante, los estudios publicados

evidencian una extremada variabilidad(Sarrate et. al. 2005), que ha provocadoque algunos autores se cuestionen lavalidez de la técnica como herramientadiagnóstica (Foresta et al. 2002; Griffinet al. 2003).

En este artículo se revisan los resultadosobtenidos a partir de la aplicación de lasmetodologías de FISH en lacaracterización citogenética de losespermatozoides en tres grupos deindividuos: 1) portadores de variantescromosómicas estructurales 2)portadores de anomalías numéricas delos cromosomas sexuales, y 3)individuos infértiles de cariotiponormal.

Para cada uno de ellos se detallará elcomportamiento de los cromosomasimplicados en las anomalías a lo largodel proceso meiótico, el riesgo detransmisión para la descendencia y lasposibles implicaciones en el consejoreproductivo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

VARONES PORTADORES DE VARIANTESCROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES

En un sentido amplio, una variantecromosómica estructural consiste en unreordenamiento de la disposición linealde los genes sobre los cromosomas. Elreordenamiento no suele alterar lafunción génica, es decir, la mayoría delos individuos portadores no presentanalteraciones fenotípicas deconsideración. No obstante, la presenciade segmentos cromosómicosreorganizados condiciona el procesomeiótico. Durante la primera divisiónmeiótica, estos segmentos tienden aformar estructuras que permiten elapareamiento de los segmentoshomólogos. Estas estructuras soncaracterísticas de cada tipo dereorganización y dan lugar a patrones desegregación característicos que, ennumerosas ocasiones, conducen a laformación de espermatozoidesportadores de anomalías.

Mediante FISH en espermatozoides es posible realizar estudios de segregación en portadores de translocaciones recíprocas,translocaciones Robertsonianas e

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José Blanco et al. ¿Qué nos aporta el estudio de FISH en espermatozoides en el estudio de la pareja infértil?

inversiones (pericéntricas yparacéntricas). En portadores deinversiones la frecuencia deespermatozoides anormales varía enfunción del tamaño de la regiónimplicada, oscilando entre el 0,7% y el54,3% (Sarrate et al. 2005). Para losindividuos portadores de translocacionesRobertsonianas los espermatozoidesanormales producidos oscilan entre el 7%y el 36% y en portadores detranslocaciones recíprocas entre el 29,4%y el 70,2% (Sarrate et al. 2005). Entre losdiferentes factores que condicionan lasegregación destacan los cromosomasimplicados en la reorganización y lascaracterísticas de las regionesinvolucradas.

No obstante, en no pocas ocasiones laaproximación experimental y el modo depresentar y discutir los resultadosplantea algunos interrogantes,cuestionando la asignación de lavariabilidad a las características de lareorganización en exclusiva, y abriendola puerta a otras posibilidades. Ennuestro laboratorio hemos realizadoestudios de segregación en individuosportadores con el objetivo dedeterminar, en un mismo laboratorio ycon criterios de análisis estandarizados,el origen de la variabilidad publicada. Sehan analizado un total de 23 individuos:11 translocaciones recíprocas, 7translocaciones Robertsonianas y 5inversiones. Los resultados muestran uncomportamiento meiótico similar paracada tipo de reorganización: Enportadores de translocacionesrecíprocas la media de espermatozoidesnormales fue del 46.5±7.4%,presentando la mayoría de los individuos(9/11) un patrón de segregaciónhomogéneo (Anton et al. 2006). Todoslos individuos portadores detranslocaciones Robertsonianaspresentaron resultados similares, conuna producción media del 86.5±2% degametos normales (Anton et al. 2004).Finalmente la segregación eninversiones mostró una relación directacon el tamaño de la región invertida y suproporción relativa respecto elcromosoma (Anton et al. 2005).

Por otro lado, la presencia dereorganizaciones estructurales puedecausar un efecto intercromosómico (ICE)caracterizado por un comportamiento

anormal de uno o más cromosomas noinvolucrados en la reorganización. Lainteracción de regiones asinápticas dealgunos segmentos reorganizados conotros cromosomas es el mecanismopropuesto para explicar este fenómeno.Diversos estudios de FISH donde se havalorado este fenómeno muestran unICE positivo en el 38,5% de lastranslocaciones Robertsonianasestudiadas y de alrededor de un 34,5%en las translocaciones recíprocasmanifestándose en forma deincrementos significativos de anomalíascromosómicas numéricas enespermatozoides de los individuosportadores (Sarrate et al. 2005).

La situación descrita en los párrafosanteriores limita la utilidad de losestudios de segregación en dos ámbitos:en portadores de translocacionesrecíprocas en los cuales las característicasde la reorganización precisa un estudioconcreto (por ejemplo aquellas en las queparticipan cromosomas acrocéntricos), yen inversiones donde el tamaño de laregión invertida afecta el 40-50% delcromosoma. Para otro tipo dereorganizaciones los resultadospublicados ponen de manifiesto una clarahomogeneidad, pudiendo realizar unconsejo genético preciso sin necesidad deun análisis particular.

Finalmente, debido a la susceptibilidadde los individuos portadores dereorganizaciones estructurales enproducir espermatozoides aneuploides odiploides, un screening de anomalías esuna opción recomendable.

VARONES PORTADORES DE ANOMALÍASCROMOSÓMICAS NUMÉRICAS

Las anomalías numéricas para loscromosomas sexuales son lasalteraciones más frecuentes enpacientes portadores de anomalíascromosómicas que consultan porinfertilidad (de Braekeleer y Dao 1991).La presencia de líneas celulares 47,XXYorigina el síndrome de Klinefelter.Generalmente se asocia con diversosgrados de bloqueo meiótico y laesterilidad de los individuos afectos. Loshombres de cariotipo 47,XYY presentanun grado de fertilidad muy variable; elnúmero de espermatozoides oscila entrenormozoospermia y azoospermia.

Estudios de FISH realizados enespermatozoides muestran un incrementoen la incidencia de espermatozoides condisomías para los cromosomas sexuales enmás del 80% de los individuos analizados(Sarrate et al. 2005). En individuosKlinefelter aparentemente no mosaicos, laincidencia media es del 6,3% (rango 1,4-25%), mientras que en individuosmosaicos 46,XY/47,XXY es del 2,5% (rango0-7%). Finalmente un 3,7% (rango 0,1-14,4%) de los espermatozoidesanalizados en individuos 47,XYY presentanun cromosoma sexual extra. En individuoscontrol, la incidencia de disomías paraestos cromosomas se sitúa alrededor del0,3%.

Cabe remarcar que tanto los individuosKlinefelter como la mayoría de losindividuos 47,XYY son mosaicos en líneagerminal, es decir, coexisten dos líneascelulares, una aneuploide (47,XXY o47,XYY) y otra de cariotipo normal 46,XY.Aunque en estos pacientes el riesgogenético teórico se había asociado a laentrada a meiosis de las líneasaneuploides, estudios más recientesindican la imposibilidad de que estascélulas inicien la meiosis (Mroz et al.1998; Blanco et al. 2001). Losespermatozoides de constitucióncromosómica anormal producidos porestos individuos derivarían de la líneacelular euploide 46,XY inmersa en unmicroambiente testicular anormal queafectaría la segregación cromosómica

En nuestra opinión, la elevadavariabilidad en los incrementos quemuestran los estudios publicados justificaun análisis de FISH en espermatozoidespara cada caso en particular. A modo deejemplo, es evidente que en un paciente47,XXY que presente una incidencia del21,7% de disomías para los cromosomassexuales (Estop et al. 1998), el consejoreproductivo será muy diferente al de otroindividuo también Klinefelter no mosaico,pero con una incidencia de disomíasmucho menor (1,4%; Blanco et al. 2001).

VARONES CON ALTERACIONES DELSEMINOGRAMA Y CARIOTIPO NORMAL

Numerosos autores han demostradoalteraciones del seminograma asociadascon incrementos de anomalíascromosómicas en espermatozoides deindividuos de cariotipo somático normal

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(Burrello et al., 2005; Machev et al.,2005; Miharu, 2005; Rives, 2005;Sarrate et al., 2005).

Hoy en día se esta intentando acotar enque grupo de pacientes con alteracionesdel seminograma los estudios de FISH enespermatozoides estarían especialmenteindicados. No obstante, la variabilidaddescrita entre los estudios publicados(número de individuos analizados,criterios de clasificación, característicasdel grupo control, criterios de análisis,análisis estadístico) limita elestablecimiento de indicaciones clara.Esta situación ha conducido a quealgunos autores se cuestionen la técnicacomo herramienta de diagnóstico clínico(Foresta et al., 2002).

Otro aspecto de los estudios de FISH enespermatozoides que suscita interés enel ámbito del diagnóstico clínico es ladeterminación del número y del tipo decromosomas que deben de seranalizados. La mayoría de los centrosque han incorporado la técnica basansus resultados en el análisis de lasanomalías numéricas, en concretodisomías y diploidías, para cincocromosomas: X, Y, 13, 18 y 21.Recientemente, un número considerablede centros han comenzado a incluir otroscromosomas en sus estudios, con la ideade que cuanta más información másprecisión en el diagnóstico. Estasituación ha planteado dudas acerca decómo elegir la estrategia más coherentey equilibrada en relación al tiempo deanálisis, coste y resultados obtenidos.

Finalmente es importante destacar quela mayoría de los incrementos descritosen la frecuenta de anomalíasespermáticas son incrementosmoderados, derivando eninterpretaciones diferentes a partir deun mismo resultado y, por tanto, en unconsejo genético reproductivo diferente.

Partiendo de la situación descritapreviamente, y a partir de la recopilaciónde los resultados de FISH enespermatozoides realizados en nuestrolaboratorio entre 1998 y 2005 nosplanteamos un estudio retrospectivo contres objetivos básicos (Sarrate et al,aceptado para publicación):

1. Acotar las indicaciones.

2. Determinar el número básico decromosomas a estudiar y precisar cualesson al fin de optimizar la técnica entérminos de tiempo, coste einformación.

3. Establecer directrices para lainterpretación de los resultados.

Analizamos un total de 319 muestras desemen de individuos infértiles deetiología desconocida. El historial de lospacientes incluía la edad, los datos delseminograma, el cariotipo (266/319) yen algunos casos el resultado del estudiomeiótico (106/319).

A partir del análisis de cincocromosomas del complemento (X, Y, 13,18 y 21), los resultados poblacionalespusieron de manifiesto la elevadaincidencia de individuos conincrementos significativos respecto de lapoblación, un 14,73% (47/319). Lasdisomías de los cromosomas sexuales ylas del cromosoma 21 eran los genotiposresponsables de estos incrementos(p<0.05). Cuando los individuos seagruparon según la clasificaciónseminológica (Tabla I), los porcentajes

más elevados de individuos conanomalías se observaron en los gruposque presentaban un bajo recuentoespermático: oligozoospérmicos (33.3%),

oligoastenozoospérmicos (28.3%) yoligoastenoteratozoospérmicos (17%).

De hecho, la disminución en el recuentoespermático fue el único parámetro delseminograma que mostró correlacióncon el incremento de anomalíascromosómicas en gametos (Figura 1).

Con respecto a la relación entre losresultados de FISH en espermatozoides yel estudio meiótico (Tabla II), un 27% delos individuos con un cariotipo meióticoalterado mostraban incrementossignificativos de anomalías cromosómicasen gametos. Este porcentaje fue del 8%para los casos de meyosis normal y FISHalterada.

Estos resultados ponen de manifiesto laausencia de efectos de algunas de lasanomalías meióticas detectadas en lacarga genética final de losespermatozoides, un resultadocoincidente con la falta de efectos de lasanomalías sinápticas de los autosomasen metafase I en el genotipo de lascélulas en el estadio de metafase II(Sarrate et al. 2007). La ausencia deefectos se ha relacionado con la

eliminación selectiva de las célulasportadoras de anomalías (Blanco et al.2001, 2003). Una interpretaciónalternativa es considerar el resultado de

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José Blanco et al. ¿Qué nos aporta el estudio de FISH en espermatozoides en el estudio de la pareja infértil?

la FISH en espermatozoide como falsosnegativos, dado que no se analizantodos los cromosomas del cariotipo. Eneste sentido, es importante remarcarque ninguno de los 319 individuosanalizados mostró incrementossignificativos de disomías para loscromosomas 13 o 18. Además, en laliteratura especializada ningúnindividuo ha mostrado incrementosexclusivos de los autosomas(exceptuando el 21), sin que vayanacompañados de incrementos dedisomías para los cromosomas sexualeso de espermatozoides diploides (Sarrateet al. Aceptado para publicación). Anuestro entender, estas observacionescuestionan el argumento de los falsosnegativos de la FISH enespermatozoides, al tiempo que indicanque la técnica, mediante el análisis detres cromosomas (X, Y, 21), puedeclasificar a los pacientes en función delriesgo de transmisión de una anomalíacromosómica a la descendencia.

En términos generales, los incrementosde anomalías cromosómicas observadosen los pacientes de nuestra serie (desdeun mínimo de 0,54% hasta un máximode 4,92%) y los publicados en laliteratura especializada, muestranvalores moderados (Sarrate et al. 2005).Un resultado de FISH alterado es lamanifestación citológica de anomalíasen los procesos de apareamiento,recombinación y/o segregacióncromosómica. Las presencia defrecuencias incrementadas de anomalíascromosómicas en espermatozoides se harelacionado con disminuciones de la tasade embarazo (Rubio et al. 2001), con

incremento de abortos (Rubio et al.1999, 2001; Carrell et al. 2003) y con unincremento de embrionescromosómicamente desequilibrados(Gianarolli et al. 2005). Enconsecuencia, un resultado alterado setiene que interpretar como unaindicación para la aplicación de técnicasde diagnóstico citogenético en etapasembrionarias (diagnóstico genéticopreimplantacional) o fetales(diagnóstico genético prenatal).

En resumen, el estudio de FISH enespermatozoides en individuos conproblemas de fertilidad se aconsejaclaramente en pacientes de cariotiposomático normal que presentan unrecuento espermático bajo. Enindividuos con otras alteraciones delseminograma, su aplicación dependeráde la historia reproductiva de la pareja.La máxima competitividad de la técnicaen términos de tiempo, gasto económicoy utilidad diagnóstica se consigueanalizando tres cromosomas X, Y y 21.Finalmente, un resultado alterado tieneque formar parte del conjunto deindicaciones de los diagnóstico genéticopreimplantacional y prenatal.

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Figura 1: Correlación inversa (p<0.05) entre la disminución del recuento espermático y el incremento deanomalías cromosómicas.




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INTRODUCCIÓN

Las células madre son célulasindiferenciadas que retienen lacapacidad de proliferación ydiferenciación a células especializadasbajo condiciones controladas, tantodurante el desarrollo embrionario comopara reemplazar las células perdidascomo consecuencia de la renovaciónnormal, o por enfermedad, en los tejidosespecíficos en los que puedenencontrarse.

Dependiendo de su procedencia sedistinguen, clásicamente, tres tiposdiferentes de células madre:embrionarias, germinales y adultas.Recientemente se ha añadido un cuartotipo celular, las células iPS (del inglésinduced pluripotent stem cells),obtenidas tras reprogramación decélulas adultas diferenciadas y concaracterísticas muy similares a lascélulas madre embrionarias.

Las células madre embrionarias presentandos cualidades principales: la capacidadde dividirse casi indefinidamente encultivo permaneciendo indiferenciadas, yla de diferenciarse en cualquier tipocelular perteneciente a cada una de lastres capas germinales embrionarias:endodermo, mesodermo y ectodermo.

Desde 2000, año en que Reubinoff ycolaboradores (Reubinoff et al., 2000)demostraran el potencial de estascélulas para ser diferenciadas in vitro, hahabido muchos progresos en estecampo, y se han publicado numerosostrabajos con distintos métodos yaproximaciones para la diferenciación decélulas madre embrionarias haciadistintos tipos celulares, incluyendocélulas germinales.

Esta capacidad de las células madreembrionarias para diferenciarse encélulas germinales y gametos hacausado un gran impacto debido a supotencial aplicación en la medicina

reproductiva. La generación de estosgametos in vitro podría ayudar a parejasinfértiles con problemas en produccióno fertilización de ovocitos y/o esperma,respondiendo a la creciente demanda dedescendencia propia por parte de estasparejas.

Los resultados obtenidos en animaleshan creado expectativas hasta ahorainéditas. En los últimos años, variosgrupos han demostrado que las célulasmadre embrionarias de ratón puedendiferenciarse en esperma (Toyooka etal., 2003; Geijsen et al., 2004; Nayerniaet al., 2006) y ovocitos (Hübner et al.,2003; Lacham-Kaplan et al., 2006;Novak et al., 2006; Qing et al., 2007),incluso que las células madreembrionarias humanas pueden tambiéndiferenciarse a células germinales encultivo bajo condiciones adecuadas(Clark et al., 2004; Kee et al., 2006; Chenet al., 2007; Nayernia et al., 2009; Parket al., 2009. Para una revisión Marqués-Marí et al., 2009).

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INFERTILIDAD Y GENÉTICA: PRODUCCIÓN DE GAMETOS A PARTIRDE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS.

Ana Isabel Marqués Marí , Carlos SimónBanco Nacional de Células Madre, Nodo Valencia. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Valencia.E-mail: [email protected]



Ana Isabel Marqués Marí et al, Infertilidad y Genética: Producción de Gametos a partir de Células Madre Embrionarias.

En cualquier caso, aunque estadiferenciación ha sido ya inducida en ellaboratorio, falta todavía muchainformación acerca de los factoresmicroambientales y factores clave queregulan los procesos de diferenciaciónde las células madre y de formación degametos.

Así, aunque ocasionalmente pueden sergenerados gametos con las condicionesde cultivo apropiadas, su capacidad paragenerar un ser vivo sano es, de momento,muy cuestionable y requiere ulterioresinvestigaciones. Cabe mencionar, alrespecto, el trabajo realizado por el grupode Nayernia y colaboradores en 2006

(Nayernia et al., 2006). Si bien losautores obtuvieron gametos masculinoscapaces de generar descendencia viable apartir de células madre embrionarias deratón, lo cierto es que los animalesmurieron prematuramente.

MÉTODOS

En los últimos años la investigación engametos derivados a partir de célulasmadre ha cobrado importancia y se haganado la atención del campo de labiología reproductiva.

En el presente capítulo se pretendeponer de manifiesto el progreso en la

investigación en los últimos años engeneración de gametos a partir decélulas madre embrionarias (Tabla I),tanto en ratón como en humanos, y lospotenciales beneficios que puede tenerpara terapias de reproducción.

Sin duda, cuanto más detallada sea lainformación de la que se disponga acercadel proceso de gametogénesis in vivo, sepodrán plantear las estrategias másadecuadas para poder obtener losgametos in vitro (Figura 1).

Una de las principales dificultades en ladiferenciación de células germinales invitro es la falta de métodos no invasivosque permitan la visualización de lascélulas germinales durante su desarrolloy distinguirlas de las células somáticas.Una estrategia para resolver esteproblema es mediante la transfección delas líneas de células madre embrionariascon proteínas marcadas o fluorescentesasociadas a los promotores dedeterminados genes (genes implicados enpluripotencia o en desarrollo de la líneagerminal). Esto posibilita la visualizaciónde las células en las cuales se estáexpresando el gen de interés durante elproceso de diferenciación. Sin embargo,el uso de líneas transfectadas haceimposible el uso de los gametos obtenidospara su aplicación en terapia clínica.

Básicamente, se han usado dosmétodos para diferenciación de célulasgerminales a partir de células madreembrionarias, tanto en ratón como enhumano. El primero de ellos consiste enla diferenciación espontánea en cultivoadherente o monocapa (Hübner et al.,2003; Novak et al., 2006; Nayernia etal., 2006b; Chen et al., 2007; Park etal., 2009; Nayernia et al., 2009),mientras que el segundo implica laformación de estructurastridimensionales llamadas cuerposembrionarios (Toyooka et al., 2003;Geijsen et al., 2004; Clark et al., 2004;Lacham-Kaplan et al., 2006; Qing et al.,2007; Chen et al., 2007). Combinandoademás, cualquiera de estos dosmétodos con la adición de factoresexógenos al medio de cultivo.

RESULTADOS

Células germinales a partir de célulasmadre embrionarias de ratón.

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Figura 1.- Durante el desarrollo embrionario in vivo, el establecimiento de la línea germinal engloba distintasetapas identificadas por diferentes marcadores moleculares, inducidas y guiadas por distintos factores. Enhumanos, las PGCs se originan a partir de una población celular localizada en el epiblasto, por efecto de BMP4,2 y 8b procedentes del ectodermo extra-embrionario. Estas células empiezan a migrar hacia las crestasgonadales y allí empiezan a proliferar por mitosis. En este punto, las células germinales masculinas y femeninaspresentan, condicionados por sus respectivos nichos, comportamientos distintos: las células germinalesmasculinas se bloquean durante el proceso de mitosis, mientras que las femeninas entran en meiosis y sebloquean en MI. Durante la vida postnatal ambas poblaciones finalizan el proceso de meiosis y sufren unproceso de maduración, dando lugar a gametos maduros. Las líneas discontinuas indican proceso postnatal.




Usando este primer método, basado enretirar los factores que promuevenpluripotencia, como feeders y bFGF o LIF(en el caso de células embrionarias deratón), Hübner y colaboradorespublicaron la obtención de estructurassimilares a folículos ováricos in vitro en2003. Tras estimulación congonadotropinas, estos folículos extruíanuna célula central, supuestamente unovocito con una zona pelúcida muy frágil

debido a la ausencia de la proteína ZP1.La presencia de proteínas específicas demeiosis como SCP3 indicaba la entradade los ovocitos en meiosis.

Sin embargo, cuando Novak ycolaboradores (2006) replicaron losexperimentos vieron que no seexpresaban otras proteínas de meiosiscomo SCP1 y SCP2 o Rec8. Así, aunque enalgunas de estas células se ha iniciado elproceso de meiosis, el programa noprogresa de forma adecuada, al menos invitro. Algunas de estas estructuras,además, se activaron espontáneamentellevando a la formación de embionespartenogenéticos, los cuales sebloquearon y degeneraron en estadiostempranos de desarrollo.

Poco tiempo después, Toyooka et al.(2003) y Geijsen et al. (2004),consiguieron diferenciar célulasgerminales masculinas a partir de célulasmadre embrionaras de ratón,combinando la formación de cuerposembrioides tridimensionales con el usode líneas celulares marcadas en genesasociados a pluripotencia o específicos delínea germinal, y la adición de factores decrecimiento al medio de cultivo.

Tooyoka y colaboradores marcaron ellocus para el gen Mvh (homólogo de Vasaen ratón, marcador premeióticoespecífico de línea germinal) paradetectar la diferenciación de célulasmadre embrionarias a células de la líneagerminal in vitro. Tras cultivo, las célulasmarcadas fluorescentes, las cualesestaban expresando el gen Mvh, fueronaisladas y cultivadas con gónadasmasculinas de estadio embrionarioE13.5. Estos agregados se trasplantaronen los testículos de ratones para testar elpotencial de las células diferenciadas, y,tras dos meses, espermatozoidesmarcados fluorescentes fuerondetectados en los túbulos seminíferos deestos animales. No obstante, no se hizoningún análisis posterior para determinarla funcionalidad del esperma obtenido.

Geijsen y colaboradores transfectaronuna línea celular en la que marcaron ellocus para el gen Oct4 (marcador depluripotencia, también expresado enPGCs, células germinales primordiales).Diferenciaron las células mediante laformación de cuerpos embrioides yañadieron ácido retinoico (AR) al mediode cultivo para expandir la población dePGCs. Mediante análisis por PCR sedetectó la expresión de marcadoresespecíficos de línea germinal masculina,pero también de células de Leydig y deSertoli. Así, aunque se encontraronalgunas células haploides, los resultadossugieren una ineficiente meiosis en elmicroambiente de los cuerposembrioides. Para testar la funcionalidadde estas células haploides derivadas delos cuerpos embrioides los autoresfertilizaron ovocitos normales.Alrededor de un 20% de estosprogresaron hasta blastocisto, pero nose analizó si los embriones eran capacesde desarrollarse normalmente trastransferencia uterina.

Los mejores resultados en cuanto aprogresión del proceso de meiosis yformación de gametos haploides seobtuvieron tras trasplantar las célulasgerminales obtenidas in vitro en lostestículos de ratones químicamenteesterilizados para su desarrollo ymaduración final hasta gametos(Nayernia et al., 2006). Los autoresobtuvieron descendencia viable tras lafertilización de ovocitos normales conlos gametos obtenidos mediantediferenciación de las ESCs (del inglésembryonic stem cells, células madreembrionarias).

El diseño experimental incluía latransfección de las ESCs de ratón congenes modificados ligados a la viaespermatogonial, para, de este modo,posibilitar la detección y aislamiento delas células en las que estos genesestuvieran activados. La diferenciaciónse indujo mediante la formación decuerpos embrioides e incluía la adiciónde AR al medio de cultivo. Detectaroncélulas fluorescentes con motilidad queeran liberadas al medio. Estas célulasfueron analizadas y se observó laexpresión de marcadores meióticos ypostmeióticos tras la adición de AR. Paradeterminar su funcionalidad in vivo lascélulas fueron trasplantadas en

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Tabla I.- Resumen de los trabajos más destacados en la diferenciación de células de la línea germinal apartir de células madre embrionarias. ESC: (del inglés embryonic stem cells) células madre embrionarias;NT: no testado; BP: blastocisto partenogenético; FO: feritlización de ovocitos; DF: degeneración de folículos;hESCs: células madre embrionarias humanas; mESCs: células madre embrionarias de ratón; PGCs: (del inglésprimordial germ cells) células germinales primordiales.



Ana Isabel Marqués Marí et al, Infertilidad y Genética: Producción de Gametos a partir de Células Madre Embrionarias.

testículos de ratones estériles y seobtuvieron espermatozoides haploides,aunque sin motilidad, con los cuales sefertilizaron ovocitos normales. Comoresultado nacieron doce animales que,sin embargo, murieron prematuramente,probablemente debido a un patrónepigenético anormal en los gametosobtenidos in vitro.

Dos estudios han explorado sistemas deco-cultivo para diferenciar ovocitos apartir de ESCs de ratón (Lacham-Kaplanet al., 2006; Quing et al., 2007), ambosmediante la formación de cuerposembrioides.

Lacham-Kaplan y colaboradores (2006)exploraron los efectos del mediocondicionado obtenido de cultivoscelulares de células testiculares en ladiferenciación de ESCs de ratón a célulasgerminales mediante formación decuerpos embrioides. Los autoresdemostraron que tras cultivar los cuerposembrioides con el medio condicionadoobtenían un mayor número de estructurassimilares a ovocitos incluidas en lo queparecían folículos ováricos.

Qing y colaboradores (2007), de modosimilar, generaron cuerpos embrioides apartir de las ESCs y los transfirieron sobreuna monocapa de células de granulosa deratón. Tras 10 días en cultivo identificaroncélulas similares a ovocitos dentro dedichos cuerpos embrioides. Sin embargo,aunque detectaron la expresión delmarcador específico de meiosis SCP3,estaba localizado en el citoplasma (como

proteína esencial para la sinapsis decromosomas homólogos durante elproceso de meiosis su localización esnuclear).

En ambos estudios, los ovocitosobtenidos carecían de zona pelúcida ysu apariencia era muy similar a la degonocitos en una fase temprana delproceso de ovogénesis in vivo. Estosovocitos, curiosamente, no sufrieronactivación espontánea para darblastocistos partenogenéticos comolos descritos por Hübner et al. (2003).

Células germinales a partir de célulasmadre embrionarias humanas.

Los trabajos realizados en ladiferenciación de células germinales apartir de ESC en humanos han dadosimilares resultados a los descritos enratón. Las células diferenciadas in vitro apartir de células madre embrionarias, yasea mediante la formación de cuerposembrioides o en monocapa, expresanmarcadores de células germinaleshumanas (Clark et al., 2004; Kee et al.,2006; Chen et al., 2007; Nayernia et al.,2009; Park et al., 2009).

Clark y colaboradores (Clark et al., 2004)obtuvieron células de la línea germinalmediante la formación de cuerposembrioides a partir de ESCindiferenciadas, las cuales fueronanalizadas mediante PCR. Con estemodelo establecieron una secuencia de

expresión de genes durante distintosestadios del proceso de diferenciaciónde las ESC humanas a células germinalesin vitro: migración, colonización,mitosis, meiosis, etc., facilitando deeste modo la caracterización de lascélulas de la línea germinal ypermitiendo su localización yaislamiento durante el proceso dediferenciación. Además, observaron quelas hESCs indiferenciadas tambiénexpresan algunos marcadorestempranos de la línea germinal comoDAZL, Stellar o c-Kit, pero no otros comoVASA, SCP3 o GDF9, que son específicosde células germinales (Figura 2).

En un trabajo posterior, el mismo grupodemostró que la combinación defactores exógenos tales como BMP-4,BMP-7 y BMP-8 añadidos al medio decultivo incrementa el porcentaje decélulas VASA positivas, y, por tanto, elnúmero de posibles células germinales,pero no necesariamente induce elprogreso correcto del proceso de meiosis(Kee et al., 2006).

No obstante, de los pocos estudios queexploran la habilidad de las ESCshumanas para diferenciarse en célulasgerminales, el estudio publicado porChen y colaboradores (2007) es el únicoque describe estructuras folicularesobtenidas tras la diferenciación encultivo, ya sea en monocapa o mediantela formación de cuerpos embrioides. Sinembargo, a pesar de la detección por PCRdel marcador GDF9 (marcadorpostmeiótico específico de ovocitos), los

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Figura 2.- Las distintas etapas en el desarrollo de la línea germinal in vitro se corresponden con la expresión de determinados marcadores moleculares. Dado quelas células madre embrionarias indiferenciadas comparten la expresión de algunos marcadores con células de la línea germinal durante estadios tempranos dedesarrollo tales como DAZL, Stellar, c-Kit, Oct4 o Nanog, para la detección de estas células se consideran más útiles marcadores meióticos y postmeióticos, específicosde células germinales, siendo VASA uno de los más utilizados.




autores no caracterizaron las célulasincluidas dentro de las estructurasfoliculares para identificarlas comoovocitos.

Muy recientemente, dos nuevos trabajoshan sido publicados demostrando ladiferenciación de células germinales apartir de hESCs.

Park y colaboradores (Park et al., 2009)reportaron la obtención de PGCsmediante el co-cultivo de hESCsindiferenciadas con células gonadalesfetales humanas. La detección de co-localización de los marcadores c-Kit ySSEA1 mediante citometría de flujo, loscuales también co-localizan con VASA, fueusada como un indicador de ladiferenciación a la línea germinal. Delmismo modo, también obtuvieron PGCsdesde células iPS, aunque con una menoreficiencia. Tras analizar el estado deimprinting de las células obtenidas vieronque estas habían iniciado el proceso deborrado característico de las célulasgerminales durante el primer trimestre dedesarrollo embrionario in vivo.

Nayernia y colaboradores (Nayernia etal., 2009) obtuvieron GSC (del inglésgerm stem cells, células madregerminales) masculinas desde hESCstransfectadas con un constructo ligadoa la vía espermatogonial. Ladiferenciación se indujo en monocapatras la retirada de bFGF y posteriormentese añadió AR al medio de cultivo. Lascélulas marcadas se aislaron mediantecitometría de flujo y se cultivaronposteriormente con la adición dediversos factores exógenos al medio decultivo. Las células obtenidasexpresaban marcadores meióticos ypostmeióticos, indicando la maduracióna gametos masculinos haploides.

Así pues, estas células eran capaces deentrar en el proceso de meiosis,generando células haploides y conmotilidad in vitro, muy similares aespermatozoides.

Dado que son células humanas, y debidoa la legalidad vigente, no han podidoprobar la funcionalidad de estosgametos in vivo, ya que esto implicaríao bien la formación de quimerashumano-animal o la generación deembriones humanos en laboratorio.

CONCLUSIONES

Así pues, aunque se han conseguidograndes avances en los últimos años enla diferenciación in vitro de célulasgerminales a partir de células madreembrionarias, aún sigue siendonecesario proseguir con lasinvestigaciones al respecto paraentender y desarrollar los nichosapropiados y las condiciones de cultivoidóneas. El proceso de diferenciación degametos in vitro, debería ser, además,fiable y reproducible si se quieretrasladar su empleo a terapia clínica.

Una de las mayores dificultades duranteel proceso de diferenciación es ladetección y selección de las célulasgerminales obtenidas. Dado que las ESCcomparten algunos marcadores con lasPGCs, las alternativas son la detección demarcadores meióticos y postmeióticos ola transfección de las líneas de ESC conmarcadores fluorescentes ligados apromotores específicos de célulasgerminales. Sin embargo, los métodosque implican modificaciones genéticas yel uso de vectores retrovirales impidenque los gametos obtenidos puedan serusados en un futuro en clínica.

Si bien, los principales problemas en losque deben incidir las futurasinvestigaciones en la diferenciación degametos a partir de ESC es laconsecución del proceso de meiosiscorrectamente para evitar aneuploidías,y el establecimiento de un patrónepigenético adecuado. De este modo, losgametos derivados de ESC podrían teneraplicación clínica en técnicas dereproducción asistida en aquellos casosen que los pacientes carecen de gametoso estos no son funcionales.

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A U L A V I R T U A L

INTRODUCCIÓN

La calidad del ovocito y del embrión quese genera a través de él son aspectosdeterminantes del éxito en FIV. Lacorrecta maduración del ovocito implicauna maduración nuclear y citoplasmática

La evaluación de la calidad del ovocitobasada en criterios morfológicos ha sidoextensamente estudiada (Serhal et al.,1997; Plachot et al., 2002; Ebner et al.,2006; Ubaldi et al., 2008) con el fin depoder establecer criterios de calidad convalor pronóstico.

Se han intentado establecer criteriosmorfológicos relacionados con la calidadovocitaria tales como el color, lagranularidad, la presencia de vacuolas elas inclusiones citoplasmáticas (Boltonet al., 1989). Muchos de estos cambiosmorfológicos corresponden a orgánulosintracitoplasmáticos y por ello son signodel metabolismo del ovocito y supotencial de desarrollo. Hasta estemomento sólo se disponía de estosmarcadores para la valoración delovocito.

En el momento de la ovulación, losovocitos se encuentran detenidos enmetafase II de la meiosis. En estemomento, los cromosomas se hallandispuestos en la placa metafásicasujetos por los microtúbulos que lacomponen. Durante la meiosis y lafecundación las fibras del huso son lasresponsables de la segregación delmaterial nuclear y anormalidades en sufrágil estructura pueden dar lugar ainfertilidad, abortos y enfermedadesgenéticas fruto de anomalíascromosómicas.

Cerca del 80% de las aneuploidías delembrión son de origen materno(Hassold and Hunt, 2001) y existenevidencias de que el estado del huso y su

funcionamiento se ven afectados con elincremento de la edad materna(Battaglia et al., 1996). Gran parte deerrores en la segregación de loscromosomas en la ovogénesis tienenlugar en la meiosis I. Estudios en ratonesy humanos demuestran que con la edadincrementa el riesgo de erroresmeióticos en la anafase II. La edadpuede inducir una precoz separación delas cromátidas (Mailhes and Young,1998), reducción de la expresión de losgenes que controlan el huso(Steuerwald, et al., 2005) y sudegeneración (Eichenlaub-Ritter et al.,1988).

Clásicamente, la estructura del huso sevisualizaba con técnicas invasivas comola microscopía electrónica, o marcadoresfluorescentes en la microscopíaconfocal, incompatibles con la prácticaclínica.

Recientemente, la luz polarizada hademostrado ser equivalente a lamicroscopía confocal (Shen et al.,2008). Por otra parte, la inocuidad de lamicroscopía de luz polarizada, basada enlas propiedades de birrefringencia de lasmoléculas que forman el huso, lapresentan como alternativa idealaplicable a las técnicas de fecundaciónin Vitro.

MICROSCOPÍA DE LUZ POLARIZADA

La birrefringencia es una propiedadóptica que deriva de la ordenaciónmolecular encontrada enmacromoléculas que forman lasmembranas, los microtúbulos, losmicrofilamentos y otros componentesdel citoesqueleto (Oldenbourg, 1999).La luz polarizada pone de manifiesto labirrefringencia de estas estructurasdinámicas. La medida de labirrefringencia es la retardancia de laluz al atravesar estas estructuras.

El paso de un único haz de luzpolarizada sobre el cuerpobirrefringente, hace que éste salgaproyectado en 2 haces de luzortogonales. En el inicio de lautilización de la técnica, labirrefringencia se medía como el cambiorelativo de fase (retardancia) entreestos 2 haces de luz polarizadaacoplados a un microscopio ópticoconvencional. Con la ayuda decompensadores y diferentes estadosrotativos de estas estructurastridimensionales, se logró ajustar lamedida de la retardancia al tamaño ycomplejidad de husos. El proceso eralento y por ello imposible de aplicar amaterial biológico humano. Lasretardancias conseguidas se analizabanajustando manualmente el analizador yel compensador, y el hecho de que la luzse proyectara desde un mismo planolimitaba mucho las conclusiones(Oldenbourg, 1999).

Fue difícil lograr el paso siguiente haciaun procesador de imágenes digital,microscopios invertidos, luz polarizadacasi circular y algoritmos quecombinaban medidas de retardancia yorientación de la birrefringencia(Oldenbourg, 1999).

Finalmente era necesario calcular laintensidad de la luz necesaria para cadaespecie, así como demostrar la inocuidadde la técnica en sí. Las mediciones debíantomarse en muy poco tiempo si no sequería comprometer la viabilidad de losovocitos (Silva et al., 1999; Liu et al.,2000; Wang et al., 2001a).

HUSO MEIÓTICO

Hay que recordar que el huso es unaestructura tremendamente dinámica quedepende de las condiciones detemperatura y manipulación de losovocitos.

LA MICROSCOPÍA DE LUZ POLARIZADA: APLICACIONES CLÍNICASEN LAS TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

Gemma ArroyoInstitut Universitari Dexeus, Barcelona




Gemma Arroyo, La microscopía de luz polarizada

Visualización

Los ovocitos madurados in vivopresentan el huso visible en un 80% delos casos (Shen et al., 2005; Wang et al.,2001b; Rienzi et al., 2003). Dejar losovocitos a temperatura ambiente 10minutos induce daños irreversibles en elhuso (Wang et al., 2001a). Por debajode los 33oC el huso empieza adesintegrarse, siendo irreversible sureestructuración si la temperatura llegaa los 25oC (Pickering et al., 1990).También cabe la posibilidad de que lareestructuración del huso de produzcade manera anómala, con el consecuentemal posicionamiento de los cromosomasy un aumento de aneuploidías. Aunqueya está extendido el funcionamiento demicroscopios con placa calefactora, unbuen control de calidad delfuncionamiento del laboratorio es pues,la visualización del huso.

Presencia y localización

La presencia del huso se ha relacionadocon mayores tasas de fecundación enalgunos estudios (Wang et al., 2001b;Cooke et al., 2003; Rienzi et al., 2003,2005; Cohen et al., 2004; Madaschi etal., 2008; Rama Raju et al., 2007)excepto en uno (Moon et al., 2003).

La posición del huso respecto al CPtambién se ha relacionado con las tasasde fecundación. Rienzi et al., 2003encuentra relación a partir deldesplazamiento de más de 90o. Estopuede ser debido a la manipulacióndurante la denudación de las células delcúmulo. Sin embargo Fang et al., 2007no halla peor tasa de fecundaciónrespecto a un grupo control sinvisualización de huso.

La relación de la presencia del huso conel desarrollo embrionario tiene aspectoscontrovertidos. Algunos estudios lorelacionan con una mayor competenciaen día 3 (Wang et al., 2001b; Cooke et al.,2003; Moon et al., 2003; Madaschi et al.,2008) y en la formación de blastocistos(Wang et al., 2001b; Rama Raju et al.,2007) pero no es así en otros (Rienzi etal., 2003; Cohen et al., 2004). En cuantoa las tasas de embarazo e implantacióntambién se contradicen los resultadospositivos (Madaschi et al., 2008) frentelos negativos (Chamayou et al., 2006).

Dinamismo

Estudios de videocinematografía revelanque el huso es una estructura dinámicay que en telofase I desaparece por 40-60min. En el peor de los casos, en lamayoría de ovocitos que no lo presentantardará 2 h en reestructurarse y la tasade fecundación no varía (Montag et al,2006). Sólo aquellos ovocitos quepasadas estas 2-3h de cultivo siguen sinmostrar el huso tienen peor tasa defecundación (Montag et al., 2006).

Tanto como la presencia, es importantetener en cuenta la localización del husoA pesar de observar el primer corpúsculopolar, puede que el huso del ovocito enanafase tardía o telofase I, estéformando un puente entre CP ycitoplasma. En caso de proceder a lamicroinyección espermática (ICSI)cuando todavía persiste este puenteentre CP y citoplasma, lo más frecuentees que el momento de la valoración de lafecundación se observen 3 pronúcleos(PN) (Montag, datos no publicados).

Maduración in vitro

Shen et al., 2007 realizó un estudio paraobservar la dinámica de maduración inVitro (MIV) de los ovocitos. Estudiaronovocitos en profase I (VG) queretomaron la meiosis tras 12 horas decultivo. Los primeros husosbirrefringentes de MI se detectaron a las12h. En 24h el 16.1% de las VG teníanhuso MI, 17.9% alcanzaron la telofase I,y 14.3% extrusionaron el primercorpúsculo polar (CP). Aunque a las 30hla mayoría tenían CP, sólo se observóhuso en 28.7%. A las 36h presentabanCP el 66.1%., pero sólo en un tercio sevisualizaba el huso.

Fang et al., 2007 halló huso en el 77.1%de los ovocitos madurados in Vitro, conuna tasa de fecundación mayor cuandoéste estaba adyacente al CP. Resultadosque fueron confirmados por otrosgrupos (Arroyo et al., 2007; Almeida etal., 2008) y relacionados con embrionesde mejor calidad.

Queda pendiente establecer el timing delos ovocitos de ciclos de MIV. Estopermitirá reducir la frecuencia deaneuploidías y optimizar el momento dela ICSI o congelación.

Congelación

El estudio de la de/construcción de losmicrotúbulos del huso también haservido para la optimización deprotocolos de congelación de losovocitos (Rienzi et al., 2004; Ciotti et al.,2009). Se ha intentado encontrarparalelismo de las imágenes demicroscopía polarizada con la confocal,dando importancia ya no sólo a lapresencia o no del huso, si no también ala estructura y longitud de éste y a lalocalización de los cromosomas en laplaca metafásica (Bromfield et al.,2009).

Densidad

Se ha intentado cuantificar la robustezdel huso midiendo la longitud y grosorde las fibras a lo largo de los 0.5 mm queseparan los polos, y la retardancia mediade sus fibras. Esta idea tiene como finmedir la estabilidad del huso yrelacionarlo con la calidad embrionaria.Hasta el momento se ha relacionado lacuantificación de la retardancia con lamorfología de los pronúcleos (Shen elal., 2006), potencial de desarrollo en día3 (Trimarchi et al., 2003) y formación deblastocisto (Rama Raju et al., 2007). Elgran dinamismo de esta estructura y elvalor relativo de la clasificación depronúcleos, hace que sean necesariosmás estudios que la relacionen con elpotencial de implantación y desarrollodel embrión.

Estudios recientes de microscopíaconfocal ponen de manifiesto laslimitaciones del valor predictivo de lamicroscopía de luz polarizada paravalorar el grado de orden de la fibras delhuso y la posición de los cromosomas enla rutina del laboratorio (Coticchio etal., 2009).

ZONA PELÚCIDA

La zona pelúcida está compuesta portres glicoproteínas filamentosas (ZP1,ZP2, ZP3) que se entretejen dando lugara una estructura multilaminar. Las trescapas tienen birrefringencia condistinta retardancia y orientación.(Keefe et al., 1997).

Parece ser que la capa interna de la ZP esla que exhibe mayor birrefringencia

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(Pelletier et al., 2004) y que el cultivo invitro de los embriones altera el procesonormal de afinamiento de la ZP,afectando selectivamente la capainterna de ésta (Silva et al., 1997). Sehan encontrado diferencias en la capainterna de la ZP en ciclos con fallo defecundación (Shen et al., 2005) y serelaciona también con el potencial dedesarrollo del embrión hasta blastocisto(Kilani et al., 2006; Rama Raju et al.,

2007). También se ha demostrado queembriones con mayor potencial deimplantación tienen una mayorintensidad de birrefringencia de la ZP, yse han perfeccionado sofwares que lacuantifican y proporcionan un score acada ovocito (Montag et al., 2006;Madaschi et al., 2009) (Figura 1)

El endurecimiento y grosor de la ZP delos ovocitos varía también con la edad dela paciente. Se ha visto que los ovocitosde mujeres de edad avanzada presentanZP menos refringentes y su relación conel potencial desarrollo hasta blastocistoha corroborado la idea de que el estadode la ZP es un buen marcador de lacalidad ovocitaria.

Con el fin de llevar acabo una buenaselección del embrión a transferir sedeberá tener en cuenta en cuenta tantolas características del ovocito,

incluyendo las de la ZP a través de lamedida de su birrefringencia, así comoel timing de maduración nuclear con lapresencia y posición del huso.

Se observa el huso visible adyacente alcorpúsculo polar y la zona pelúcidabirrefringente. En el cuadrante inferiorizquierdo el score automático de la carainterna de la zona pelúcida fruto de lasmediciones de 180 puntos (verde).

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D E B A T E

70Emilio Gómez Sánchez et al, Mitos y Leyendas en el laboratorio de Embriología Clínica

INTRODUCCIÓN

A finales de los años 90 se inició undebate en el mundo de la embriologíaclínica sobre si la luz era perjudicial o nopara los gametos y embriones quemanejamos en el laboratorio defecundación in vitro. De repente pareciólógico pensar que si tanto gametos comoembriones no estaban expuestos a la luzde forma natural, la exposición artificiala ésta en el laboratorio podría serdañina para su integridad y por tantopara la capacidad de desarrollo eimplantación de los embriones. No sepresentaron pruebas irrefutables ni afavor ni en contra de esta afirmación, asíque unos decidimos trabajar con pocaluz y otros continuaron haciéndolo conla luz encendida o incluso con ventanasen el laboratorio. ¿Qué es mejor? Yopersonalmente creo que es acertadotrabajar con un bajo nivel de luzambiental en los laboratorios deembriología clínica y voy a intentardemostrarlo con la bibliografíaexistente.

LUZ, GAMETOS Y EMBRIONES

En condiciones naturales la fecundaciónse produce en el interior de la trompa deFalopio, por tanto ni ovocitos, niespermatozoides, ni embriones seexponen nunca a la luz solar o a unafuente artificial de luz, así que nodisponen de un sistema de protecciónfrente a la luz, por lo que parece lógicopensar que la exposición de gametos yembriones a la luz en el laboratorio esun factor estresante y que puedeperjudicar la capacidad implantatoria deestas células. Esto contrasta con lo queocurre con los gametos de muchosanimales ovíparos, como peces yanfibios, que pueden recibirdirectamente la luz solar durante lafecundación y el desarrollo. Para evitar

los daños que podría ocasionar laradiación solar sobre ellos, estosgametos y embriones han desarrolladodiversos mecanismos de protección. Laprincipal adaptación que permite quegametos y embriones recibandirectamente rayos ultravioleta es laincorporación de compuestos queabsorben las radiaciones UV-A y UV-B.Así, el aminoácido micosporina es unejemplo de éstos; prueba de su funciónprotectora es que los embriones de erizode mar con niveles bajos de él en la dietason más susceptibles a los dañosproducidos por los rayos UV que losembriones con altos niveles. En laAntártida, donde hay altos niveles derayos UV-A, algunas especies de erizosde mar producen huevos que se hundenhasta el fondo, de manera que no sonalcanzados por los rayos solares,permaneciendo así protegidos de ellos.

Desde finales de los años 70 se hanrealizado estudios sobre el efecto de laluz en gametos y embriones en cultivo inVitro. En 1978 Hirao y Yanagimachidemostraron que los ovocitos dehámster son muy vulnerables a la luz, ysu meiosis se ve afectada por la luzvisible de baja longitud de onda emitidapor las lámparas fluorescentes frías quese utilizan normalmente en loslaboratorios. Bedford y Dobrinis (1989)publicaron que la exposición de ovocitosy cigotos de conejo a luz blanca fría noprodujo un efecto negativo sobre eldesarrollo embrionario. La divisiónembrionaria de los embriones dehámster se reduce con el mismo tipo deluz (Umaoka et al, 1992; Yamauchi Y etal, 2002). Además, la utilización dehabitaciones con bajo nivel de luz esclave para que un programa defecundación in Vitro de hámster tengaéxito (Yamauchi Y et al, 2002). Másrecientemente, Takenaka ycolaboradores (2007) expusieron

cigotos de hámster y de ratón a luz fríablanca, observando que el desarrollohasta blastocisto se detenía en los dehámster pero no en los de ratón. Cuandose transferían los blastocistos de ratón,la tasa de implantación era más baja enlos blastocistos provenientes de cigotosexpuestos a la luz que en los que no sehabían expuesto a ella. Nematollahi-mahani y colaboradores (2009)expusieron embriones de ratón de 2células a 1600 lux de luz visible durantediferentes tiempos y encontraron quedespués de 45 minutos de exposición ladivisión embrionaria se veía afectada.Cuando embriones de 2 células dehámster se expusieron a diferentesintensidades de luz durante 10 minutos,se comprobó que con 200 lux había unmayor desarrollo embrionario hastablastocisto. Al analizar el efecto dediferentes longitudes de onda sobre eldesarrollo embrionario, se detectó quela luz azul (445-500nm) era la másperjudicial provocando la producción demás radicales libres y la presencia demás células apoptóticas en elblastocisto.

De todos los artículos publicados sepuede deducir que ovocitos y embrionesde la mayoría de los mamíferos sonsensibles a la luz, siendo el hámster elejemplo de animal cuyos ovocitos sonmás afectados por la luz.

¿CÓMO AFECTA LA LUZ A LA CALIDAD DEGAMETOS Y EMBRIONES?

Desde hace bastante tiempo se sabe quela luz ultravioleta (300-400nm) y la luzazul (400-500 nm) provocan laproducción de radicales libres deoxígeno, como el H2O2 en el interior delas células, que a su vez dañaran lasproteínas, los lípidos y el ADN celular(Squirrell et al, 1999; Hockberger et al,1999). Aunque la luz visible de longitud

MITOS Y LEYENDAS EN EL LABORATORIO DE EMBRIOLOGÍACLÍNICA: EFECTO PERJUDICIAL DE LA LUZ DEL LABORATORIOSOBRE LOS EMBRIONES HUMANOS (A FAVOR).

Emilio Gómez Sánchez e Inmaculada Torres GonzálezTAHE FERTILIDAD. Avd de Europa nº 11- Bajo. 30007 MurciaE-mail: [email protected]


D E B A T E


de onda corta (400-450 nm) de laslámparas fluorescentes de luz blanca esmenos dañina que la luz UV, laexposición prolongada de ovocitos yembriones de mamíferos a ésta podríaprovocar los mismos efectosperjudiciales sobre el desarrollo o lacapacidad de implantación (Takenaka etal 2007).

¿QUÉ PODEMOS HACER EN ELLABORATORIO FIV PARA EVITAR QUE LALUZ DAÑE A GAMETOS Y EMBRIONES?

En el laboratorio de FIV gametos yembriones reciben luz de diferentesfuentes: la luz del laboratoriopropiamente dicha, la luz solar si hayventanas, la luz de las campanas de flujolaminar y la luz de microscopios yestereomicroscopios. Para evitar el dañoproducido por la luz, en primer lugardeberemos trabajar con baja luzambiente, para lo cual no tendremosventanas en el laboratorio y las lucesdispondrán de reguladores de potencia.No utilizaremos la luz de las cabinas deflujo laminar cuando en ellas hayagametos o embriones, y por últimoajustaremos la luz del microscopio oestereomicroscopio al mínimo posiblepara trabajar, además de utilizar filtrospara la luz azul.

CONCLUSIÓN

Los gametos y embriones de losmamíferos no tienen ningún mecanismode defensa frente a la luz solar oartificial y ésta les afecta produciendoradicales libres del oxígeno en suinterior, por lo que sería aconsejableeliminar en lo posible las fuentes de luzdentro de un laboratorio de fecundaciónin Vitro.

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INTRODUCCIÓN

Está claro que el fin último de todos losque trabajamos en ReproducciónAsistida es el de intentar obtenerembriones sanos con alta capacidadimplantatoria. Todos igualmentecoincidiremos en que, para ello,debemos extremar los cuidados durantelas primeras etapas de desarrollo delembrión generado in vitro, etapas en lasque se encuentra particularmente

vulnerable frente a posibles agresionesdel entorno que le rodea.

Naturalmente esto no es nuevo, ya en1988 Schumacher publicaba en elJournal of Reproduction and Fertility untrabajo titulado Influence of visible lightand room temperature on cellproliferation in preimplantation rabbitembryos en el cuál constataban el efectoperjudicial de la luz visible y de latemperatura ambiental sobre el

desarrollo celular de los embriones deratón. Con ello se abrió la veda y poco apoco, al amparo de otros trabajos quefueron apareciendo en la década de los90, fuimos tomando nota. Aflojamos unabombilla, luego otra y así hasta acabarconvirtiendo nuestros laboratorios enautenticas cuevas.

A lo largo de esta charla no voy aintentar quitarle importancia al efectonocivo de la luz. Tiene importancia. Al

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MITOS Y LEYENDAS EN EL LABORATORIO DE EMBRIOLOGÍACLÍNICA: EFECTO PERJUDICIAL DE LA LUZ DEL LABORATORIOSOBRE LOS EMBRIONES HUMANOS (EN CONTRA).

Antonio Urries(1), Carolina Roméu(1), Montse Lierta(1), Cristina Calzada(2)

(1)Reproducción Asistida Quirón Zaragoza,(2) Departamento de Prevención Quirón ZaragozaE-mail: [email protected]


D E B A T E

Antonio Urries et al, Mitos y Leyendas en el laboratorio de Embriología Clínica

igual que la tiene la temperatura, lapresencia de compuestos orgánicosvolátiles, el estrés generado por elpipeteado de los embriones o lo limpio yaseado que sea el embriólogo, pero sique voy a cuestionar la forma como se haintentado solucionar. Excesiva según mipunto de vista. Como vulgarmente sedice “matando moscas a cañonazos”. Sinolvidar tampoco que al disminuir deforma tan drástica las luces de nuestroslaboratorios estamos empeorandonuestras condiciones de trabajo,incrementando la posibilidad de erroresy/o accidentes e incluso, posiblemente,perjudicando nuestra propia saludocular.

¿Y ninguno de los directores delaboratorio que puedan estar leyendoesto han pensado nunca que puedenestar incurriendo en delito al incumplirla normativa existente sobreprevención, seguridad y salud en loslugares de trabajo, con las subsiguientesdemandas y sanciones que ello podríaconllevar?.

A continuación voy a intentar presentarsuficientes argumentos paraconvenceros de que para matar unamosca sólo hace falta un dedo, y de que,como dice Lars D.M. Ottosen, y yocomparto, “the use of dark laboratoriesis not justified”.

DISCUSIÓN

¿A QUÉ NOS PARECEMOS MÁS? ¿AL RATÓNO AL CONEJO?.

Hamster, conejos, vacas, ratones…

Todos los estudios revisados muestranaltas variaciones según el mamíferoobjeto de estudio. Los embriones dehamster tienen una sensibilidadexcepcionalmente elevada a la luz,mientras que los de conejo sonaltamente resistentes (Oh et al 2007,Takenaka et al. 2007).

La diferencia puede estar relacionadacon el momento de activación delgenoma, distinto según las especies.Dicho momento supone una dramáticareprogramación de la expresión génicaesencial para su desarrollo posterior(Schultz 2007). Curiosamente en losembriones de ratón esa activación se

produce en el estadio de 1-2 células(Flach 1982), mientras que en el conejoesto ocurre con 8 células (Manes 1971).

Dado que en los embriones humanos talactivación se produce en estadio de 6-8podríamos pensar que estamos máscerca de la respuesta del conejo que ladel ratón, y con ello en el grupo de los“altamente resistentes”.

OOCITOS Y EMBRIONES A LA PLANCHA

¿Cuánto tiempo de exposición esnecesario para notar los efectosnegativos sobre los embriones?

Takenaka sometió a los embriones dehamster un largo minuto de exposicióna la luz del sol (¡¡¡20.000 luxes!!!) paradeterminar que es catastrófica para sudesarrollo.

En 1992 Barlow expuso a los ovocitosmaduros de ratón, previo a sufertilización, a intensidades de luzvisible de 4000 luxes durante 1, 2 ó 4horas y no encontró diferencias con elgrupo control, que había estadoprotegido de la luz, en cuanto a tasa dedivisión, tasa de implantación ynormalidad fetal.

En los estudios de Takenaka los cigotosse mantuvieron durante 15 minutos auna exposición de 1200 luxes de luzfluorescente blanca fría, observando queninguno de ellos se desarrollaba más alláde dos células. La luz fluorescenteblanca fría es especialmente deletéreapara el desarrollo embrionario.

GAFAS DE CARTÓN NEGRO PARA EVITARLA MALA UV-A DE LA LUZ SOLAR O CÓMOMATAR MOSCAS A CAÑONAZOS.

Está claro que ante la duda lo máscómodo ha sido apagar la luz de nuestroslaboratorios (clic y ya está), pero noparece que sea lo más adecuado, al igualque no es lógico querer evitar la luz solarponiéndonos una cartulina negradelante de los ojos.

Para empezar no debemos olvidar que el95% de la radiación que recibe el embriónen su manipulación proviene de las luceshalógenas de los microscopios (Ottosen etal. 2007) y más del 90% de esta radiaciónes de longitudes de onda >500 nm.

Por otro lado es bien sabido que la luzcon longitudes de onda de entre 300-500 nm es la que puede producir dañosen el ADN (Schultz 2007), por lo quesería ese 10% de radiación restante laque originaría los efectos deletéreossobre el embrión.

Esto nos llevaría a dos conclusiones:

La primera es que colocando filtrossobre las fuentes de luz de losmicroscopios que eliminen laslongitudes de onda <500 nm sesolucionaría el problema. (Korhonen etal. 2009)

Y segundo, que la influencia luminosaque pueda tener la luz ambiental denuestros laboratorios es prácticamentenula, por lo que el mantenerlos a oscuraso poco iluminados no es práctico ytotalmente innecesario (Takenaka et al.2007; Ottosen et al. 2007).

Pero esto no es nuevo, ya lo dijoYanagimachi en 1978 cuando propusotapar las fuentes de luz de losmicroscopios con celofán rojo paraminimizar los efectos deletéreos de laluz visible sobre la meiosis de los huevosde mamíferos cultivados in vitro.

Posiblemente podamos poner unassimples gafas de sol a nuestroslaboratorios y quitar las cartulinasnegras que les hemos puesto.

¿QUÉ ES PRIMERO, EL EMBRIÓN O ELEMBRIÓLOGO?

¿Y que pasa respecto a nuestra salud?Los ópticos manifiestan continuamenteque una iluminación insuficiente originaque el trabajador deba acercar la vista auna distancia menor que la normal (30cms), lo que puede producir miopía yotros trastornos visuales comohiperemia conjuntival, lagrimeo ynistagmo, además de fatiga ocular,cansancio, dolor de cabeza, estrés yaccidentes/errores.

Por otra parte, el excesivo contrastelumínico que sufrimos cuando pasamosde la luz intensa del microscopio a lasemioscuridad ambiental que nos rodeatambién es peligroso, ya que nos puedegenerar disminución de la agudezavisual y de la capacidad acomodaticia del

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D E B A T E


ojo. Todo esto puede tener comoconsecuencia cegueras temporales,mientras el ojo se adapta a la nuevailuminación. Es el mismo motivo por elcuál se recomienda no ver la televisióntotalmente a oscuras.

Por último, la falta de una buenailuminación obliga en ocasiones aadoptar posturas inadecuadas desde elpunto de vista ergonómico.

NISTAGMUS DE LOS EMBRIÓLOGOS.NUEVA ENFERMEDAD PROFESIONAL.

Un poco de historia: En 1910 el Dr. MLiébert presentó en el II CongresoInternacional de EnfermedadesProfesionales en Bruselas los resultadosde un estudio encargado por el Serviciode Inspección de Minas Belga con motivode haber observado una incidenciaelevada de la enfermedad del Nistagmusen sus mineros.

Dicha enfermedad se caracterizaba pormovimientos rotatorios o bienhorizontales, rápidos e incontrolados delos ojos, que aparecían con los cambiosde luz-oscuridad o al mirar hacia arribaestando agachados. Los afectadossufrían deslumbramiento ante cualquierluz brillante, además de trastornosnerviosos, temblores de cabeza y demanos, dificultades de agudeza visualpara la visión binocular, pudiendo llegara caerse por pérdida de equilibrio.

El estudio, realizado sobre 1412 minerosde la cuenca hullera de Lieja, mostró que217 estaban afectados de dichaenfermedad, lo que suponía un 19,2% .

A lo largo de dicho congreso se llegó aafirmar que dicha enfermedad “podía serconsiderado el gran proveedor deaccidentes de trabajo, pudiendo serexcepcionalmente la causa de grandescatástrofes “ (Dransart M). Igualmentese constató que la enfermedad aparecíaprincipalmente en mineros de 30-45años que llevaban de 6 a 10 años detrabajo en la mina y como probablecausa una iluminación insuficiente y la“actitud encorvada que el minero debede adoptar en el fondo de la mina”.

En el debate surgido a raíz de lapresentación de este trabajo, M. Gigliolirecordó “haber publicado dos casos de

esta afección en un obrero pintor y en uncalderero. Los dos trabajaban como losmineros, en una posición molesta yanormal y en condiciones de iluminacióninsuficentes”. ¿Os suena de algo?

NOTA: En el año 1951 fue incluida en elcuadro de enfermedades profesionalesdel Gobierno de España el Nistagmus delos Mineros (Código 2N0101), aunqueactualmente es una enfermedad queestá desapareciendo gracias a los nuevossistemas de iluminación de las minas.

¿Nistagmus de los Embriologos paradentro de 50 años?

ACORDAROS PARA EL FUTURO: REALDECRETO 5/2000. LEY SOBREINFRACCIONES Y SANCIONES. INSTITUTONACIONAL DE SEGURIDAD E HIGIENE ENEL TRABAJO. GOBIERNO DE ESPAÑA.

El Real Decreto 486/1997, por el que seestablecen las disposiciones mínimas deseguridad y salud en los lugares detrabajo, desarrollado en la Guía Técnicapara la Evaluación y Prevención de losRiesgos Relativos a la Utilización de losLugares de Trabajo, establece en suArtículo 8. (Iluminación) que “Lailuminación de los lugares de trabajodeberá permitir que los trabajadoresdispongan de condiciones de visibilidadadecuadas para poder circular por losmismos y desarrollar en ellos susactividades sin riesgo para su seguridady salud”.

Posteriormente, en dicha Guía Técnicaen su anexo A. (Tablas de Iluminación),establece que los laboratorios deben demantener un nivel medio de iluminaciónsobre el área de trabajo de 500 luxes.

Para finalizar, recalcar que “elempresario deberá adoptar las medidasnecesarias para que la utilización de loslugares de trabajo no origine riesgospara la seguridad y salud de lostrabajadores…. y los lugares de trabajodeberán cumplir las disposicionesmínimas establecidas en el Real Decretoen cuanto a…iluminación…”

Todo esto puede llevar consigo posiblessanciones por negligencia en caso deque en un futuro se confirmaran efectosperjudiciales en la salud por larealización de una actividad laboral en

unas condiciones que incumplen lanormativa vigente sobre “disposicionesmínimas de seguridad y salud en loslugares de trabajo”. Sancionesobviamente sobre los empresarios, peroque finalmente recaerían sobre losResponsables(as)/Directores(as)/Jefes(as) de los Laboratorios.

Y según el Real Decreto 5/2000, que osrecomiendo recordar, en su sección 2ª,artículo 11, punto 4, manifiesta que sonInfracciones Leves “las que suponganincumplimientos de la normativa deprevención de riesgos laborales, siempreque carezcan de trascendencia gravepara la integridad física o la salud de lostrabajadores”.

Pero no olvidemos que una InfracciónLeve puede transformarse en Muy Graveen caso de no corregir la anomalía y quefinalmente, fruto de ese incumplimientode la normativa, se haya originado unriesgo grave para la seguridad y saluddel trabajador”. (artículo 13, punto 10).

Actualmente las infracciones en materiade prevención de riesgos laborales sesancionan con cantidades que, en sugrado máximo, alcanzan los 819.780euros. Y cancelación de la acreditaciónotorgada por la autoridad laboral.

Para el Gobierno de España es primero elEmbriólogo al Embrión.

CONCLUSIÓN.

Una intensidad luminosa moderada enlos microscopios (aprox 200 luxes) confiltros que eliminen longitudes de ondainferiores a 500 nm y reducir el tiempode exposición de los embriones almínimo posible debería permitirnosmantener una luz ambientesuficientemente confortable y acordecon la normativa vigente. Debiendoextremar las precauciones únicamenteen el momento de realización decualquier tipo de micromanipulación(ICSI, DGP,…). A lo largo del Debate seincidirá más profundamente en estetema.

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INTRODUCCIÓN

IMPRONTA GENÓMICA

La impronta genómica es una marcaepigenética heredable y reversible queimplica la inactivación específica dedeterminados genes en función de suorigen parental. Se establece mediantela metilación de dinucleótidos 5’-CG-3’ ymodificaciones covalentes en lashistonas que conllevan cambiosconformacionales de la cromatina

bloqueando la expresión del alelomaterno o paterno (expresiónmonoalélica). El carácter heredable yreversible se manifiesta en la líneagerminal dónde la impronta se borra y sevuelve a establecer durante lagametogénesis en función del sexo delindividuo y para cada gen en particular(Figura 1). Este mecanismo asegura quedespués de la fecundación seanheredadas la copia paterna metilada y lamaterna desmetilada o al revés. Enhombres, el patrón de metilación se

establece en espermatogonias para lamayoría de genes estudiados, (Kerjeanet al., 2000; Manning et al., 2001). En laovogénesis el proceso parece serasincrónico. Algunos estudios proponenque la metilación se establece alrededorde la fecundación (El-Maarri et al.,2001), mientras que en otros se proponeque la impronta materna se hacompletado en ovocitos maduros (Geunset al., 2003). Después de la fecundaciónla impronta genómica se mantiene entodas las células somáticas del embrión

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INCIDENCIA DE ANOMALÍAS EPIGENÉTICAS DE LOS LOCI H19 YSNRPN EN ESPERMATOZOIDES DE INDIVIDUOS QUE CONSULTANPOR PROBLEMAS DE FERTILIDAD.

Marta Pladevall, Cristina Camprubí, Joan BlancoUnidad de Biología Celular, Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología. Facultad de Biociencias. Universitat Autònomade Barcelona. 08193, Bellaterra (Cerdanyola del Vallès).E-mail: [email protected]


E V O L U C I Ó N P R E M I O S A S E B I R - E M B 2 0 0 7


y del individuo adulto para borrarse denuevo únicamente en células germinalesprimordiales.

En humanos se conocen aproximadamente80 genes regulados por improntagenómica. Muchos de ellos seencuentran relacionados con elcrecimiento y desarrollo del embrión y laplacenta así como con desarrollo defunciones neurológicas. Así pues,alteraciones en el establecimiento y/o

mantenimiento de la impronta genómicase encuentran relacionadas con laaparición de enfermedades queconllevan anomalías del crecimiento prey postnatal y alteraciones en lasfunciones neurológicas (Murphy andJirtle, 2003). A modo de ejemplo,alteraciones epigenéticas de los genesregulados por impronta genómicapresentes en la sub-banda 11p15.5conllevan el desarrollo del síndrome deBeckwith-Wiedeman (SBW) o Silver-

Russell (SRS) y anomalías epigenéticasde los genes presentes en la región15q11-q13 conllevan el desarrollo delsíndrome de Prader-Willi (SPW) oAngelman (SA).

RELACIÓN ENTRE TÉCNICAS DEREPRODUCCIÓN ASISTIDA (TRA) YALTERACIONES EN LA IMPRONTA GENÓMICA

Existen numerosas revisiones quesugieren una posible relación entre TRAy un incremento de las alteraciones de laimpronta genómica en la descendenciaconcebida mediante estas técnicas (Coxet al., 2002; DeBaun et al., 2002;Orstavik et al., 2003; Niemitz et al.,2004; Halliday et al., 2004). La conexiónreside en la posible interferencia quepodrían causar los distintosprocedimientos utilizados enreproducción asistida en el ciclo dereprogramación de la improntagenómica en los gametos y elmantenimiento de ésta en las primerasetapas del desarrollo embrionario(figura 1). Diferentes hipótesis noexcluyentes entre sí y basadas en elconocimiento de los mecanismosresponsables en el establecimiento ymantenimiento de la improntagenómica, han sido formuladas pordiferentes investigadores intentandoexplicar estos resultados. Una de lashipótesis relaciona la superovulación yla maduración in vitro de ovocitos comoposibles mecanismos de interferenciapara el correcto establecimiento de laimpronta durante la ovogénesis (Ludwiget al., 2005; Borghol et al., 2006).También existen trabajos con modelosanimales que relacionan la manipulacióny el cultivo in vitro de embriones con lapresencia de defectos de improntagenómica (Khosla et al., 2001, Li et al.,2005; Mann et al., 2004; Lawrence andMoley, 2008). Otros sugieren queanomalías en la impronta genómica enlos espermatozoides de individuosinfértiles sean la causa del fenotipoinfértil. Se han presentado trabajos queavalan experimentalmente una relaciónentre recuentos espermáticos bajos y lapresencia de anomalías en distintosgenes regulados por impronta genómica(Marques et al., 2004; 2008; 2009;Kobayashi et al., 2007).

Existen aproximaciones experimentalesque permiten valorar la presencia de

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Figura 1. Esquema donde se representa la gametogénesis femenina y masculina relacionada con los distintosacontecimientos en la impronta genómica durante este período (en rojo) y las técnicas de reproducciónasistida (en verde). CGP: células germinales primordiales, Oog: ovogonia, POo: ovocito primario, SOo:ovocito secundario, Oo: ovocito maduro, PM: pronúcleo masculino, PF: pronúcleo femenino, PSpg:proespermatogonia, Spg: espermatogonia, PSp: espermatocito primario, SSp: espermatocito secundario,SO: superovulación, MIV: maduración in vitro, FIV: fecundación in vitro, ICSI: intracytoplasmic sperminjection, ZIFT: zygote intrafallopian transfer, SECSI: secondary spermatocyte injection, ROSI: roundspermatid injection, ROSNI: round spermatid nucleous injection. (Figura adaptada de Laprise, 2009).



Marta Pladevall et al, Incidencia de anomalías epigenéticas de los loci H19 y SNRPN

errores epigenéticos en amplias seriesde pacientes y en numerosos loci.Consisten en el tratamiento del DNA conbisulfito sódico, amplificación por PCR,clonaje y posterior secuenciación. Estastécnicas permiten realizar estudioscuantitativos de los niveles demetilación pero requieren un elevadotiempo para la obtención de resultados.Recientemente, se ha desarrollado unanueva tecnología, denominadapirosecuenciación, que permiteoptimizar la obtención de estosresultados cuantitativos (Tost and Gut,2007), siendo la metodología deelección para nuestro estudio.

OBJETIVO

Determinar la incidencia de errores demetilación en regiones diferencialmentemetiladas de los genes regulados porimpronta genómica H19 (sub-banda11p15.5) y SNRPN (región 15q11-q13)en espermatozoides de individuos queconsultan por problemas de fertilidadmediante pirosecuenciación.

MATERIAL Y MÉTODOSMuestras biológicas:Individuos control:

Se analizaron 30 muestras control, 23procedentes de donantes de semen decariotipo normal y fertilidad probada.Las 7 restantes procedían de individuosde características seminales normales.

INDIVIDUOS INFÉRTILES:

Se analizaron 107 muestras de semen de individuos que consultaron por problemas de fertilidad:15 normozoospérmicos , 1oligozoospérmico, 8astenozoospérmicos, 30teratozoospérmicos, 1oligoastenozoospérmico, 5oligoteratozoospérmicos, 30astenozoospérmicos y 17oligoastenoteratozoospérmicos. Losindividuos expresaron su voluntad departicipar en el estudio mediante la firmadel correspondiente consentimientoinformado. Para garantizar la objetividaddel análisis, el estudio se realizó a ciegas:no se conocía ni la etiología de losproblemas de fertilidad ni tampoco lascaracterísticas del seminograma.

EXTRACCIÓN DE DNA ESPERMÁTICO:

La extracción de DNA espermático serealizó con el Kit de extracciónPUREGEN® (QIAGEN) adaptando elprotocolo a las concentracionescelulares de cada muestra.

TRATAMIENTO CON BISULFITO SÓDICO:

El bisulfito sódico convierte las citosinasno metiladas en uracilos bajodeterminadas condiciones de pH ytemperatura mediante una reacción dedeaminación. Cuando el DNA modificadoes amplificado por PCR, los residuos decitosina que se encuentran metilados seamplifican como citosinas y presentanguaninas como base complementaria.Las citosinas no metiladas convertidasen uracilos, se amplifican como timinasy presentan como base complementariaadeninas. En el análisis de la secuenciadel producto de amplificación puededistinguirse las citosinas metiladas delas no metiladas en función de lapresencia de citosinas y guaninas oadeninas y timinas.

DESCRIPCIÓN DE LOS LOCI DE LASREGIONES 11P15.5 Y 15Q11-Q13:

En los cromosomas humanos 11 y 15 seencuentran dos de los dominiosregulados por impronta genómica másestudiados debido a les implicacionesque presentan en el desarrollo del SBW,SSR, SPW o SA (Soejima and Wagstaff,2005; Gicquel et al., 2005).

La sub-banda 11p15.5 contiene unsegmento de aproximadamente 1 Mbdonde se localizan diversos genesregulados por impronta genómica. Elsegmento se encuentra organizado endos dominios regulados cada uno por supropio centro de regulación de laimpronta (IC1 e IC2). El dominio 1,regulado por IC1, contiene el gen IGF2 yel gen H19. El promotor del gen H19 eIC1 se encuentran metilados en el

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Tabla I. Cebadores utilizados para la amplificación de los loci H19 y SNRPN a Descritos por Kerjean et al.,2000* Cebadores generados con el programa informático Pyro Q-CpG (QIAGEN)** Cebadores generados con el programa informático MethPrimer

Tabla II. Cebadores utilizados para la pirosecuenciación de los loci H19 y SNRPN* Cebadores generados con el programa informático Pyro Q-CpG (QIAGEN)




cromosoma de origen paterno y nometilados en el cromosoma de origenmaterno. Errores en el establecimientoy/o mantenimiento de la metilacióndiferencial en este locus conlleva eldesarrollo del SBW o del SSR. Paraestudiar el patrón de metilación seanalizaron 12 citosinas diferencialmentemetiladas en un fragmento de 265 pb(nucleótidos 6064-6328, número deacceso al GenBank: AF087017) del IC1,que en el texto se nombrará locus H19para facilitar su identificación.

El segmento cromosómico 15q11-q13contiene un dominio de 4 Mb condiversos genes regulados por improntagenómica. El IC incluye la regiónpromotora, el intrón 1 y el exón 1 delgen SNRPN y se encuentra metilado en elcromosoma materno y no metilado en elcromosoma paterno. Errores en elestablecimiento y/o mantenimiento dela metilación diferencial en elcromosoma de origen materno conllevael desarrollo del SA, mientras queerrores en el cromosoma paternoconlleva el desarrollo del SPW. Paraestudiar el patrón de metilación seanalizaron 20 citosinas diferencialmentemetiladas en un fragmento de 296 pb(nucleótidos 131166-131465, número deacceso al GenBank: NC 000015) del ICque incluye el exón 1 del gen SNRPN.

AMPLIFICACIÓN POR PCR DE LOS LOCIH19 Y SNRPN:

El DNA tratado con bisulfito sódico seamplificó por PCR con cebadoresdiseñados para ser complementarios alDNA deaminado mediante dos rondas deamplificación.

Para generar el producto del locus H19,después de una primera ronda deamplificación con los cebadores H19F yH19R, se realizó una PCR semi-aninadacon el cebador P-H19F y el cebador PBT-H19R marcado en el extremo 5’ conbiotina (Tabla I). La incorporación de uncebador biotinilado es necesaria parapoder realizar la posteriorpirosecuenciación. Las cantidades dereactivos utilizadas el la primeraamplificación corresponden a 10mM dePCR buffer II, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mMdNTPs, 0.5 μM de cada uno de loscebadores y 1.25 U de AmpliTaq GoldDNA Polymerase. Las condiciones de

amplificación utilizadas corresponden a:Hot start de 94ºC durante 10 minutosseguidos de 40 ciclos dedesnaturalización a 94ºC durante 45segundos, annealing de 61ºC durante 45segundos, extensión a 72ºC durante 1minuto y 10 minutos de extensión final a72ºC. Los fragmentos obtenidos despuésde la primera ronda de amplificaciónpresentan un tamaño de 322 pb y fueronrecuperados de gel de agarosa al 2% conel Kit Qiaquik gel extraction (QIAGEN)antes de realizar la PCR semi-anidada.Las cantidades de reactivos utilizadas enla segunda ronda de amplificacióncorresponden a 10mM de PCR buffer II, 2mM MgCl2, 0.4 mM dNTPs, 0.5 μM de cadauno de los cebadores y 2 U de AmpliTaqGold DNA Polymerase. Las condiciones deamplificación utilizadas corresponden a:Hot start de 95ºC durante 15 minutos,seguidos de 50 ciclos dedesnaturalización a 95ºC durante 30segundos, annealing de 61ºC durante 30segundos, y extensión a 72ºC durante 10segundos. Los fragmentos obtenidosdespués de la PCR semi-aninadapresentan un tamaño de 265 pb.

Para generar el producto del locusSNRPN, después de una primera rondade amplificación con los cebadoresSNRPNF y SNRPNR, se realizó una PCRaninada con el cebador P-SNF y elcebador PBT-SNR marcado en el extremo5’ con biotina (Tabla I). Las cantidadesde reactivos utilizadas el la primeraamplificación corresponden a 10mM dePCR buffer II, 2 mM MgCl2, 0.8 mMdNTPs, 1 μM de cada uno de loscebadores y 1.25 U de AmpliTaq GoldDNA Polymerase. Las condiciones deamplificación utilizadas corresponden a:Hot start de 94ºC durante 10 minutos,seguidos de 40 ciclos dedesnaturalización a 94ºC durante 45segundos, annealing de 53ºC durante 45segundos, extensión a 72ºC durante 45segundos y 10 minutos de extensiónfinal a 72ºC. Los fragmentos obtenidosdespués de la primera ronda deamplificación presentan un tamaño de400 pb y fueron recuperados a partir degel de agarosa al 2% don el Kit Qiaquikgel extraction (QIAGEN) antes de realizarla PCR anidada. Las cantidades dereactivos utilizados en la segunda rondade amplificación corresponden a 10mMde PCR buffer II, 2 mM MgCl2, 0.4 mMdNTPs, 0.5 μM de cada uno de los

cebadores y 2 U de AmpliTaq Gold DNAPolymerase. Las condiciones deamplificación utilizadas corresponden a:Hot start de 95ºC durante 15 minutos,seguidos de 50 ciclos dedesnaturalización a 95ºC durante 30segundos, annealing de 63ºC durante 30segundos, y extensión a 72ºC durante 10segundos. Los fragmentos obtenidosdespués de la PCR aninada presentan untamaño de 296 pb.

Las reacciones de amplificación tantopara H19 como para SNRPN se hanrealizado en un volumen final de 25 μlen un termociclador EppendorfMastercycler gradient (Eppendorf). Losproductos de amplificación sevisualizaron en un gel de agarosa al 2 %teñido con Bromuro de Etidio.

PIROSECUENCIACIÓN:

La incorporación de un cebador marcadoen el extremo 5’ con biotina en lasegunda ronda de amplificación tantodel locus H19 como SNRPN permite larecuperación de cadenas sencillas deDNA (a través de la unión entre la biotinay sefarosa-estreptavidina) para larealización de la pirosecuenciación. Larecuperación de cadenas sencillas se harealizado mediante la utilización delVaccuum Preparation Tool (QIAGEN).

La reacción de pirosecuenciación se harealizado con el PyroGold SQA reagentkit (QIAGEN) según el protocolocomercial. La secuencia de los loci H19 ySNRPN se han obtenido con loscebadores especificados en la Tabla II.La obtención de los resultados se harealizado en un pirosecuenciadorPyroMark Q96 MD (QIAGEN).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El gen H19 presenta metilación en elalelo paterno. Las citosinas metiladas deeste locus no han sido modificadas porel tratamiento con bisulfito sódico y seconsidera que la impronta correctaconsiste en observar citosinas en susecuencia. Por contra, el gen SNRPNpresenta metilación en el alelo materno.Así pues, las citosinas en este locus hansido modificadas con el tratamiento debisulfito sódico y se considera correctala presencia de timinas en su secuencia.

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Marta Pladevall et al, Incidencia de anomalías epigenéticas de los loci H19 y SNRPN

Se han clasificado como anomalíastotales aquellas que afectan a latotalidad de las CpG analizadas y comoanomalías puntuales a las que sóloafectan a determinadas CpG dentro de laregión analizada.

En la tabla III se muestran los resultadosobtenidos para el locus H19. En todos losindividuos controles analizados y en 54individuos infértiles se detectó el patrónde metilación esperado para el locus H19.De la población de individuos infértiles,

35 presentaron anomalías puntuales y 18anomalías totales en este locus.

En la tabla IV se muestran los resultadosobtenidos para el locus SNRPN. Seobtuvo el patrón de metilación esperadoen todos los individuos controles y en 96individuos infértiles. Se detectaronanomalías puntuales en 11 individuosinfértiles, de los cuales, 6 tambiénpresentaban anomalías en H19 (1anomalía total y 5 anomalías puntuales).

Se han correlacionado las anomalías delos loci H19 y SNRPN con lascaracterísticas del seminograma de lospacientes (Tabla V). Se han encontradoanomalías relacionadas con todos losparámetros seminales, siendomayoritarias en los individuos quepresentan el componente oligo y terato.Existen trabajos previos, en los que sehan relacionado errores en la improntagenómica con recuentos espermáticosbajos (Marques et al., 2004; 2008; 2009;Kobayashi et al., 2007). Nuestrosresultados avalan de forma consistentela relación entre problemas de fertilidady anomalías en la impronta genómica,dado que todas las anomalías estánpresentes únicamente en la poblacióninfértil. A pesar de que en los estudiosprevios de la literatura las anomalías enla impronta se habían relacionadoúnicamente con el componente oligo,nuestros resultados correlacionan tantocon el componente oligo como con elterato, siendo mayoritarias en aquellosindividuos que presentan amboscomponentes (Tabla V).

Cabe mencionar que la mayor parte deanomalías epigenéticas se hanidentificado en el locus H19. Estasanomalías consisten principalmente enerrores puntuales de metilación que noafectan a la totalidad de la regiónanalizada y en el caso de los errorestotales se encuentran siempre enmosaicismo afectando sólo a una parte dela población celular del individuo. Estosresultados correlacionan con los estudiosprevios de la literatura dónde se describeuna mayor susceptibilidad del gen H19 apresentar anomalías de metilación.

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Tabla III. Resultados del locus H19 relacionados con el número de individuos que lo presentan. Cada filarepresenta un patrón de metilación y el número de individuos que lo presentan. Patrón de metilaciónesperado, Patrón anómalo.

Tabla VI. Resultados del locus SNRPN relacionados con el número depacientes que lo presentan. Cada fila representa un patrón de metilacióny el número de individuos que lo presentan. Patrón de metilaciónesperado, Patrón anómalo.




Nuestra aproximación experimental nospermite estudiar un amplio número deindividuos y de genes con el objetivo decompletar nuestros resultados y ver si larelación entre errores epigenéticos yinfertilidad se cumple también para otrosgenes regulados por impronta genómica.

AGRADECIMIENTOS:

Dr. Mark Grossmann y Mª Carme Pons(URA, Centro Médico Teknon). Dr.Nicolás Garrido (IVI- Valencia). ProyectoEME2005-38 y beca UAB2006-00213(Universitat Autònoma de Barcelona).

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Tabla V. Correlación entre anomalías en los loci H19, SNRPN, y presentes en ambos loci y el seminograma delos individuos infértiles. N: Normozoospérmicos, A: Astenozoospérmicos, T: Teratozoospérmicos, O:Oligozoospérmicos, OA: Oligoteratozoospérmicos, OT: Oligoteratozoospérmicos, AT:Astenoteratozoospérmicos, OAT: Oligoastenozoospérmicos.



Empar Ferrer et al, Vitrificación y hatching asistido

INTRODUCCIÓN

La crioconservación es hoy en día unapráctica necesaria en los laboratorios deembriología clínica, tanto como métodopara almacenar los embrionessobrantes, como para la prevención delSíndrome de Hiperestimulación Ovárica,ayuda en las estrategias terapéuticas enlos casos de alteración de la receptividadendometrial o para preservar lafertilidad de determinadas pacientes. Lacalidad asistencial de un centro dereproducción asistida dependerá, engran parte, del éxito de su programa decrioconservación, que permitirámejorar, no solo la efectividad de lostratamientos al aumentar la tasaacumulada de gestación, sino tambiénsu seguridad y simplicidad, de maneraque el método utilizado debe ser tenidomuy en cuenta al incorporarlo al SistemaIntegral de Calidad del laboratorio deembriología. En la presente revisiónhacemos un repaso de nuestra

experiencia con la vitrificaciónembrionaria y el Hatching Asistido.

En 1983, Trounson y Mohr describieronla primera gestación en humanos conembriones congelados. Posterioresmodificaciones de la técnica añadieron1,2-propanodiol (PrOH) y sacarosa comocrioprotectores, y un proceso decongelación lenta hasta -30ºC antes dela inmersión directa en nitrógeno

líquido. Esta se ha considerado unatécnica segura, debido a que loscambios osmóticos no producendeformaciones extremas en las células yla concentración de crioprotectores nocausa daños tóxicos severos. Noobstante, estas bajas concentracionespueden ser insuficientes para evitar laformación de cristales dentro de lacélula. Existe un límite muy pequeñoentre el porcentaje de pérdida de aguade la célula y la formación de cristalesextracelulares, porque una excesivadeshidratación podría conducir a nivelesde crioprotector intracelular tóxicos.Aunque este procedimiento decongelación lenta sigue siendo hoy endía el método más utilizado decriopreservación, cada vez son másnumerosos los centros que escogen lavitrificación como método paracrioconservar los embriones, animados,entre otras cosas, por los resultadospublicados comparando ambas técnicas(Tabla I).

La primera publicación sobre estatécnica fue presentada en 1985 por Ralland Fahy en roedores, definiendo lavitrificación como: “La solidificación deuna solución acuosa a una bajatemperatura sin la formación decristales de hielo debido a un aumentode su viscosidad”. La vitrificación, evitala formación de cristales de hielo tantoen el medio intracelular como en elextracelular que directamente se

solidifican y pasan a un estado vítreo.Para que esto pueda ocurrir, se debenutilizar altas concentraciones decrioprotectores, aumentar de lavelocidad de enfriamiento (15000ºC-30000ºC/min) y disminuir el volumen dela solución de vitrificación.

En los últimos años, se han descritodiferentes protocolos de vitrificaciónpara ovocitos, embriones en estadio dedivisión y blastocistos, con diferentescombinaciones de crioprotectores(Dimetilsulfóxido, Propanodiol, Glicerol,Etilenglicol…) y nuevos sistemas desoporte, ya sean “abiertos” (Grills,Open pulls straws, Cryoloop, Cryotop…),o “cerrados” (Hemi-straws, Cryotip…).Existe una amplia bibliografía donde seevalúa su eficacia clínica frente a lacongelación lenta. Aunque existenalgunos resultados contradictorios,parece evidente que la vitrificaciónconsigue un aumento en la tasa desupervivencia embrionaria y mejora las

tasa de gestación e implantación. Porotra parte los primeros estudiosneonatales con niños nacidos de estastécnicas avalan por el momento laseguridad del proceso ya que losresultados son similares a losencontrados cuando se realizan losciclos en fresco (Takahashi et al., 2005;Rama Rayu et al., 2008). Además lavitrificación ofrece otras ventajasprácticas relacionadas no solo con la

VITRIFICACIÓN Y HATCHING ASISTIDO

Empar Ferrer, Minerva Ferrer, Carmen Calatayud, Miguel Ruiz Jorro y Maria Vila.CREA (Centro Médico de Reproducción Asistida) – [email protected].

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eficacia de la técnica, sino también consu sencillez y su seguridad, como son elhecho de no depender de uninstrumental específico y caro, larapidez del proceso o el tiempo limitadoque los embriones permanecen fueradel incubador. Por todo ello, cada vezson más los centros que consideran lavitrificación como el mejor método parala crioconservación de embriones.

En nuestro centro, tras un periodoinicial de práctica para conseguir lasuficiente destreza y seguridad en todoel proceso, primero con embriones deratón y después con embrioneshumanos no viables, decidimos dejar deutilizar la congelación lenta de formadefinitiva, a tenor de los buenosresultados obtenidos ya en embrioneshumanos viables, en Noviembre de2005, siendo desde entonces nuestroúnico método de crioconservaciónembrionaria. En el año 2007,presentamos nuestros resultados trasdos años de experiencia (Ferrer et al,2007), demostrando la efectividad de latécnica, con una tasa de supervivenciaa la vitrificación del 96,4%, una tasa degestación del 51,8% y una tasa de implantación del 34,1% en 84 ciclos de transferencia deembriones desvitrificados en D+3.Después de estos alentadoresresultados, hemos ido valorandodiferentes modificaciones de la técnicacon el fin de intentar mejorar las tasasde implantación embrionaria. Uno delos procedimientos que nos planteamosfue hacer Hatching Asistido a losembriones desvitrificados.

HATCHING EN EMBRIONES VITRIFICADOS

En el proceso natural de Hatching in vivo,la zona pelúcida (ZP) se va adelgazando yreblandeciendo, debido a la lisisproducida por enzimas secretadas por elembrión y a la presión hidrostáticaejercida por la expansión del blastocisto.Algunos embriones presentan una zonauniforme, mientras que otros presentansecciones más delgadas que podríanfavorecer la expansión del blastocisto y elhatching (Cohen 1988). La media delgrosor de la zona pelúcida (ZPT) y sobretodo, la asincronía o variación en sugrosor (ZPTV), son índices que informande las características de la ZP y de lasposibilidades de eclosión del embrión.Durante el proceso de crioconservaciónde embriones se ha descrito un posibleendurecimiento de la zona pelúcida, loque podría conducir a un fallo en surotura e impedir la eclosión y por tanto,la implantación (Van den Abbeel et al.,2000; Moreira Da Silva et al., 2005;Hiraoka et al., 2008).

El Hatching Asistido (HA) está definidocomo una rotura artificial en la ZP, y seintrodujo en el laboratorio de fecundaciónin vitro por Malter y Cohen en 1989 comoun método para facilitar el hatching ymejorar los porcentajes de gestación.Desde entonces se han desarrolladodiferentes técnicas para a “agujerear” oadelgazar la zona pelúcida tales como ladisección parcial de la zona (PZD y PZD-3),el uso de soluciones ácidas, proteinasas,vibradores piezo eléctricos o Láser. Desdesus primeras aplicaciones se han realizadonumerosos trabajos para valorar en quégrado afectan estos procesos a laviabilidad del embrión y todavía existe

hoy una gran controversia acerca de suutilidad clínica. Mientras que algunosestudios demuestran indicios de quemejora las tasas de implantación y degestación, especialmente en mujeres conmal pronóstico, con edad avanzada, fallosrepetidos de implantación, malascalidades embrionarias o en embrionescongelados ( Gabrielsen et al., 2004), enotros no se demostró ningún beneficiosignificativo (Ng EH et al., 2005). Estadisparidad en los resultados puedejustificarse por la diferencia en los diseñosexperimentales, en los criterios deselección, al tamaño de la muestra o ladiferente técnica de Hatching utilizada.Estudios de metanálisis y revisionesCochrane realizados concluyen que lostrabajos publicados son insuficientes parapoder aconsejar el uso clínico delHatching Asistido, aunque en ciertosperfiles de pacientes, con peor pronósticode embarazo, sí podría aportar unbeneficio, como en el caso concreto de latransferencia de embriones congelados(Sallam et al., 2003; Edi-Osagie et al.,2003; Seif et al, 2006). Efectivamente, lamayoría de los estudios prospectivosobservan alguna mejora en los resultadosclínicos al realizar Hatching Asistido enembriones congelados (Tabla II). Existen,sin embargo, muy pocas publicaciones quevaloren su eficacia en embrionesvitrificados, los cuales podríancomportarse de forma diferente, en esteaspecto, a los embriones congelados; seha observado que en ovocitos, lacongelación lenta afecta más a la zonapelúcida que la Vitrificación, y esto podríaocurrir también a nivel embrionario (Ko,2008).

Ante estos hechos, nos marcamos comoobjetivo valorar la efectividad del

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Hatching Asistido en embrionesvitrificados. Para poder estimar laeficacia real de la técnica,cuantificamos, en primer lugar y deforma retrospectiva, la pérdida deviabilidad de los embriones de buenacalidad tras su vitrificación ydesvitrificación, en tres gruposdiferentes de pacientes: (i) Grupo deBuen Pronóstico (BP) que incluyepacientes jóvenes (menos de 37 años deedad) y receptoras de ovocitos. (ii)Grupo de pacientes con Fallo deImplantación (FI) que incluye mujeresjóvenes con al menos dos ciclos previosfallidos de FIV/ICSI. (iii) Grupo de EdadAvanzada (EA) que incluye mujeres con37 ó más años de edad. Una vez conocidala pérdida de potencial implantatoriodebido a la vitrificación, nos planteamosanalizar, en segundo lugar y de formaprospectiva y randomizada, los posiblesbeneficios clínicos obtenidos tras el usodel Hatching Asistido en embrionesdesvitrificados, comparando losresultados obtenidos en cada grupo depacientes, según el grosor de la zonapelúcida y dependiendo del grado dereactivación de la mitosis en losembriones desvitrificados, con el fin deencontrar aquellos grupos o indicadoresen los cuales el HA podría ser másbeneficioso.

MATERIAL Y MÉTODO

SELECCIÓN DE PACIENTES

Para valorar la tasa implantación de losembriones, en fresco y tras suvitrificación, se seleccionaron denuestra base de datos, de formaretrospectiva, aquellas pacientes conmás de 2 embriones de buena calidad enlas que se vitrificó algún embrión elmismo día de la transferencia y secalculó la tasa de implantación de dichosembriones en el ciclo en fresco y en elciclo de vitrificados, si lo hubo,clasificando los resultados para cadagrupo de estudio. Para valorar la eficaciadel HA se diseñó un estudio prospectivorandomizado que continúa en marcha yque por el momento incluye 88 ciclos detransferencias de embriones vitrificadosen día +3 (46 con hatching asistido y 42sin hatching asistido). Se realizaron trestablas de asignación randomizada paracada uno de los perfiles de pacientesestudiados: Buen Pronóstico (BP), Fallo

de Implantación (FI) y Edad Avanzada(EA).

CULTIVO EMBRIONARIO. PROCEDIMIENTODE VITRIFICACIÓN Y DESVITRIFICACIÓN

Tras la aspiración e inseminación omicroinyección de los ovocitos, losembriones han sido cultivados enmedios secuenciales (Vitrolife G5Series). En D+3 se clasificaron siguiendolos criterios de ASEBIR y se realizó latransferencia embrionaria y lavitrificación de los embriones sobrantesde calidad A ó B. Los embriones novitrificados este día, se han mantenidoen cultivo, vitrificándose aquellos quealcanzaron el estadio de blastocisto.Para el proceso de vitrificaciónutilizamos el sistema Vit Kit (IrvineScientific) con DMSO y Etilenglicol (EG)como crioprotectores permeables,siguiendo el protocolo indicado por lacasa comercial. El soporte utilizado hasido las Hemistraws, HSV kit: HighSecurity Vitrification Kit (CBS Systems).

Para la desvitrificación de las pajuelasHSV, las sumergimos directamente en unbaño de a agua a 30º C durante 3segundos, inmediatamente trasextraerlas del nitrógeno líquido. Losmedios utilizados son el Thaw Kit (IrvineScientific) siguiendo las instruccionesde la casa comercial. Una vez terminadoel proceso de desvitrificación, losembriones se cultivan hasta el díasiguiente en gotas de medio G-2(Vitrolife G5 Series), suplementadas conalbúmina (HSA) hasta unaconcentración final de 12mg/ml, igual ala que presentan los medios devitrificación.

CÁLCULO DE ZPTV Y ZPT

Una vez desvitrificados y antes derealizarles el HA, se captura una imagen a400 aumentos de cada uno de losembriones. Para el análisis de lasimágenes utilizamos el programa USI-OVO(PROISER), obteniéndose cinco medidasde la ZP: a las 12, 4 y 8 horarias, el valormáximo y el mínimo (fig.1). Los valores dela variación del grosor de la zona pelúcida(ZPTV) y la media (ZPT) se han calculado apartir de la siguiente fórmula:

ZPmed: La media de los 5 valores, a las12 , 4 y 8, el valor máximo y el mínimo.

ZPTV: Cálculo del porcentaje devariación de la ZP:

PROCEDIMIENTO DEL HATCHING ASISTIDO(HA)

El día de la desvitrificación, tras 2 horasde cultivo, llevamos a cabo el HA de cadaembrión. En gotas independientes de G-MOPS PLUS (Vitrolife G5 Series), serealiza con solución ácida Tyrode (Medi-Cult) un orificio aproximado de 30 μm enla ZP, a las tres horarias (fig.2). Losembriones se cultivan hasta el díasiguiente en gotas de G-2 (Vitrolife G5Series) suplementadas con unaconcentración final de 12 mg/ml de HSA.

EVALUACIÓN ESTADÍSTICA

Las gestaciones clínicas se han definidopor la presencia de uno o más sacosgestacionales. La tasa de implantación seha calculado a partir de la proporción deembriones transferidos que presentaronun saco gestacional. Los resultados seanalizaron utilizando la t-student o testANOVA para las variables numéricas y eltest Chi-cuadrado para las categóricas.

RESULTADOS

Tasa de implantación en embriones debuena calidad transferidos “en fresco” opost-vitrificación.

Hasta hoy, se han incluido, para elanálisis retrospectivo, 349transferencias en día D+3 de embrionesen fresco de buena calidad (clasificaciónA-B según los criterios ASEBIR),procedentes de ciclos de FIV, ICSI odonación de óvulos en fresco, en las queademás se realizó vitrificación deembriones el mismo día. Se hanvitrificado un total de 975 embriones, delos cuales se han desvitrificado, hasta lafecha, 572 y se han transferido 406 en224 ciclos de criotransferencia, ya sea de embriones propios o deembriodonación. No se ha realizado HAen 171 de los 224 ciclos decriotransferencia y de ellos 143 han sidoincluidos para el cálculo de la pérdida de

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potencial implantatorio en embrionesde buena calidad tras ser vitrificados, alhaberse descartado los casos contransferencias mixtas (embriones condiferente grado de reanudaciónmitótica) (Tabla III).

Cuando el número de embrionesdesvitrificados viables ha sido superioral número de embriones a transferir, losno transferidos se han mantenido encultivo, revitrificándose aquellos quealcanzan el estadio de blastocisto. Larevitrificación es también una técnicaútil en el laboratorio de embriología ycuya efectividad ya hemos confirmadocon anterioridad (Ferrer et al, 2007). En7 pacientes no hubo transferencia, al nosuperar el proceso de desvitrificaciónninguno de los embriones.

Uno de los resultados más importantesencontrados es la alta correlación entreel grado de Reanudación de la Mitosis(RM) tras 20 horas de cultivopostdesvitrificación y la tasa degestación e implantación embrionaria

para todos los perfiles de pacientesestudiados (Tabla III). La tasa deimplantación de un embrión vitrificadotras sobrevivir a la desvitrificación(<50% células degeneradas) puededisminuir del orden de un 6% si tras 20hcultivo se ha observado división en másde 2 de sus blastómeros o presentaindicios de compactación, o hasta un26% si el numero de blastómerosdivididas ha sido menor. El fuerte valorpredictivo del número de blastómerosdivididas tras 20 h post cultivo es

todavía mas patente cuando los ciclos decriotransferencia se categorizan enintervalos más concretos, como sedescribe en la Tabla IV.

HATCHING ASISTIDO EN EMBRIONESDESVITRIFICADOS

Se han desvitrificado un total de 192embriones, correspondientes a 88 ciclosde criotransferencia y de formaprospectiva y randomizada, se harealizado Hatching Asistido en 46 de losciclos, antes de la transferencia.

No existen diferencias entre los gruposHA y el control en cuanto a la media deembriones transferidos (1,91 ± 0,05 vs

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1,97 ± 0,02) o el porcentaje deembriones con una adecuadareanudación de la mitosis (53,4 vs57,8%). Las tasas de gestación clínicacomparadas entre el grupo de HatchingAsistido y el grupo control, no sonestadísticamente significativas (41,3 vs45,2 %), ni tampoco las tasas deimplantación (27,3 vs 31,3 %).

CORRELACIÓN DE ZPTV Y HA CON LA TASADE IMPLANTACIÓN

Basándonos en el valor medio de ZPTV serealizaron dos grupos: ZPTV mayor oigual al 20% y ZPTV menor del 20%.Dado el reducido tamaño muestral con elque por el momento cuenta el estudio,no es posible realizar un análisis porgrupos de pacientes (BP, FI, EA), por loque se muestran todos los datosagrupados. Para el análisis de los datosno se han tenido en cuenta lastransferencias mixtas (embriones conZPTV mayor y menor del 20%). En laTabla V se observa que los porcentajes de

gestación clínica y de implantaciónembrionaria son mayores en el grupo deZPTV >20%, tanto en el grupo con HAcomo en el control, pero no se llega aobservar significancia estadística.Tampoco se ha encontrado una mejorasignificativa al realizar HA en el grupo depeor pronóstico con ZPTV<20%.

CORRELACIÓN DE ZPT Y HA CON LA TASADE IMPLANTACIÓN

Basándonos en el valor medio de ZPT, sehan realizado dos grupos: ZPT mayor oigual a 15μm y ZPT menor de 15μm. El

análisis de los datos por subgrupos(Tabla VI) indica que las tasas degestación clínica e implantación nomejoran de forma significativa cuandose realiza HA en ninguno de los dosgrupos.

DISCUSIÓN

La aplicación de la vitrificación comotécnica de crioconservación, nos aportaunos resultados de supervivencia, tasasde implantación y gestación, superioresa los que obteníamos con la congelaciónlenta; sin embargo, si esto es así yconseguimos tener las mismas calidadesembrionarias en fresco que envitrificados, ¿por qué continúan siendomás bajos los porcentajes de gestaciónen transferencias de embrionesvitrificados comparados con los ciclos deembriones en fresco?

Durante la vitrificación (como en lacongelación), los embriones estánexpuestos a un notable stress mecánico,

químico y térmico que podríacomprometer el desarrollo celular.Algunos marcadores están relacionadoscon la viabilidad de los embrionesvitrificados, como la supervivencia delas blastómeras o la reanudación de lamitosis tras su desvitrificación. Variosestudios has demostrado que lareanudación de la mitosis aumentasignificativamente las tasas deimplantación (Ziebe et al., 1998). Segúnnuestros resultados, la capacidadimplantatoria de los embrionesdesvitrificados disminuye una media deun 12% respecto a los embriones frescos

y la tasa de gestación clínica, un 16.1%.Esta disminución en el potencialimplantatorio del embrión, vienedeterminada, especialmente, por elgrado de Reanudación de la Mitosis (RM)tras 20 horas de cultivo post-desvitrificación y en concreto, por elnúmero de blastómeras divididas en eseperiodo de tiempo. Así, la tasa deimplantación de los embriones conmenos de 2 blastomeras divididas fue un21% menor que la observada en el grupode pacientes donde alguno de losembriones transferido tuvo una divisiónapropiada (definido como aquel en elque se observaron más de dosblastomeras divididas o signos decompactación tras 20 h post-desvitrificación). Existe una relaciónlineal significativa entre ambasvariables de forma que hay unincremento aproximado de un 10% en elpotencial de implantación a medida queaumenta el número de divisionescelulares post desvitrificación. Estarelación entre capacidad de reanudar la

mitosis y el potencial implantatorio delembrión desvitrificado es tan evidente ysus consecuencias tan importantes queconsideramos que la valoración delporcentaje de embriones desvitrificadosque reanudan correctamente la mitosispodría ser un excelente indicador decalidad de un laboratorio de embriologíaclínica.

Por otra parte, incluso los embrionescon mejor RM tras la desvitrificación,tienen un menor potencial deimplantación (5,3%) que los embrionesfrescos. Para explicar esta diferencia en

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la tasa de implantación entre embrionesfrescos y vitrificados, algunos autoreshan señalado como una posible causa, elendurecimiento de la ZP tras el procesode vitrificación. El endurecimiento de la

zona, que ocurre espontáneamente trasla fecundación natural, ha sido descritotambién tras la exposición prolongada acondiciones de cultivo artificiales y trasprocedimientos de congelación lenta(Cohen et al.,1990, Tucker et al.,1991).Mientras que en la congelación deovocitos, se produce un endurecimientode la zona como consecuencia delelevado aumento de Calcio quedesencadena la reacción cortical enrespuesta al PrOH (Larman et al., 2007),la naturaleza exacta del daño producidoen la ZP de los embriones no está clara yse apunta a cambios en las propiedadesestructurales de las glicoproteínas demembrana que alteran la elasticidad yobstaculizan el proceso deadelgazamiento (Vanderwalzmen et al.,2003). Recientemente se ha otorgadoespecial atención a ZPT y ZPTV comoparámetros morfológicos adicionalespara la selección embrionaria, ya que esposible que el grosor de la zona pelúcidasea distinto en diferentes puntos, lo quesegún algunos autores, podría facilitar

el transporte a través de la membrana yla liberación de substancias para digerirla zona de forma local y selectiva (Sun etal., 2005).

Los resultados obtenidos en este estudioprospectivo no demuestran, enprincipio, ningún efecto beneficioso delHatching Asistido sobre los grupos decontrol en términos de tasa deimplantación o gestación. Autores comoGarside o Gabrielsen demostraron que lamedición del grosor de la zona pelúcidade los embriones in vitro podía actuarcomo un factor pronóstico de éxito enlos ciclos de FIV y que su variación(ZPTV) frente a su media (ZPT) presentauna correlación mayor con las tasas degestación (Gabrielesen et al., 2000, Sunet al., 2005). En nuestro estudio losresultados obtenidos tras la medición deZPT y su variación (ZPTV) en frescomuestran una ligera disminución nosignificativa en la tasa de implantaciónde aquellos embriones con ZPTV superiorinferior a 20 micras y ZPT superior a 15micras. El HA aplicado en este grupo deestudio tampoco ha conseguidodemostrar un aumento en la tasa deimplantación de embrionesdesvitrificados. Este hecho podría ser

debido al reducido tamaño muestral delestudio que podría enmascarar un efectobeneficioso del HA en los embrionesdesvitrificados, pero también podríadeberse a un menor endurecimiento de

la zona en los embriones vitrificadosrespecto a los embriones congelados yque por ello el HA fuera menosbeneficioso cuando se utiliza lavitrificación. Aunque existepreocupación por las consecuencias quela crioconservación pueda tener sobre laviabilidad y desarrollo de ovocitos yembriones, los resultados obtenidos enlos últimos años con los métodos devitrificación presuponen que puedatener un impacto menor que lacongelación lenta. Estudios recientes en

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Figura 2: Hatching Asistido en un embrión desvitrificado.

Figura 1: Análisis de ZPT y ZPTV en un embrióndesvitrificado.




ovocitos maduros de ratones hanvalorado la respuesta del Calciointracelular a la exposición de DMSO yEG. El aumento del Calcio que se observacomo respuesta a la exposición al DMSOy al EG es transitorio en comparación conla respuesta prolongada y elevada que seproduce con la exposición a PrOH y partedel endurecimiento observado puedereducirse eliminando el Calcio del mediode vitrificación (Larman et al.,2006 y2007). Además la cuantificación deproteoma y metaboloma en ovocitos harevelado que la congelación lenta tieneun mayor impacto en su fisiología almostrar un efecto significativo en laexpresión de proteínas no observada enovocitos vitrificados (Larman et al.2007). Aunque los últimos hallazgosindican que la vitrificación es menostraumática que la congelación lenta,pocos estudios se han realizado paraevaluar su impacto en embriones(Vanderzwalmen et al., 2003).

En conclusión, nuestros resultados nodemuestran en principio ningún efectobeneficioso del Hatching Asistido enembriones desvitrificados, si bien esnecesario prolongar el estudio parapoder valorar su utilidad en cada perfilde paciente dependiendo del grado dereactivación de la mitosis de losembriones y determinar, finalmente, sila vitrificación, a diferencia de lacongelación, no requiere la aplicacióndel HA más allá de lo indicado paraembriones frescos.

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C O M U N I C A C I O N E S O R A L E S




INTRODUCCIÓN:

La calidad ovocitaria es fundamentalpara el posterior desarrolloembrionario, ya que este depende engran medida de la maquinaria celular delmismo y condiciona el éxito reproductivosubsiguiente. La necesidad de generarnuevos métodos cuantitativos deevaluación ovocitaria para evaluar elpotencial reproductivo de las cohortesde las pacientes está promoviendo eldesarrollo de nuevas técnicas noinvasivas. Las mediciones de actividadmetabólica en ovocitos pueden tener unvalor predictivo del potencial desarrolloembrionario, el consumo de oxígeno seha considerado como el mejor indicadorde actividad metabólica, ya que esteestá directamente relacionado con lacapacidad del ovocito para producir ATP.Nuestro objetivo es evaluar la capacidad diagnóstica del consumo deoxígeno ovocitario como marcador decalidad correlacionándolo con lafecundación, posterior calidad ydesarrollo embrionario.

MATERIAL Y MÉTODOS:

Realizamos un estudio de cohortes decarácter prospectivo y observacionalpara determinar la validez del métodoautomatizado y cuantitativoproporcionado por el Embrioscope(Unisense, Dinamarca). Analizamos untotal de 146 ovocitos de donantesrecibidos por 30 parejas incluidas en elprograma de donación de ovocitos, en suprimer intento y con los queposteriormente se realizó lainseminación mediante ICSI ytransferencia embrionaria a las 72horas. En el estudio analizamos la mitadde la cohorte ovocitaria y los criteriosde inclusión/exclusión incluyeron uníndice de masa corporal < 30 kg/m2,ausencia de patología uterina (miomas,adenomiosis, malformaciones uterinasadquiridas o congénitas), endometriosis,

hidrosalpinx e historia de pérdidagestacional recurrente. Sobre losovocitos analizamos la respiración mediaen fentomoles de oxígeno/hora.Consideraremos para el estudio unaserie de variables independientesrelacionadas con el desarrolloembrionario: la fecundación, laformación de un embrión óptimo a las 48horas (entre 3-5 blastómeras, <20 defragmentación, ausencia demultinucleación y buena simetría) y eldestino final de los embriones obtenidosa las 72 horas de la inseminación (pororden de calidad; Transferidos,Congelados o No-viables). Las

mediciones de oxígeno se tomaron porduplicado en intervalos de 30 minutos,expresándose la media de ambas. Encada experimento se utilizaron pocillossin ovocitos que sirvieron como “blanco”para valorar los niveles basales deconcentración de oxígeno. Lasmediciones se realizaron con un sensorelectroquímico (sensibilidad = 0,05 fmolde Oxígeno/h). El análisis estadístico serealizó mediante regresión logística,siendo la respiración ovocitaria lavariable dependiente. Tambiénrealizamos un estudio ANOVA paracomparar los niveles de respiración enfunción de la calidad de los embriones alas 72 horas y en función de su destinofinal mediante el software SPSS 17.

RESULTADOS:

la tasa media de respiración ovocitariaobservada en nuestra población deovocitos fue de 3,27 fmol/h (IC95%

3,04-3,50) (rango 0,00-7,19). El análisisde regresión logística reveló unaausencia de relación entre la respiraciónembrionaria y la posterior fecundacióntras la microinyección espermáticaOR=1,180 (IC95% 0,813-1,713). Tambiéndeterminó la asociación entre altosniveles de respiración ovocitaria y malacalidad embrionaria a las 48 horasOR=0,562 (IC95%0,370-0,852).Finalmente, en la siguiente tablase presentan los valores medios derespiración ovocitaria según el destinofinal que experimentaron los embrionesobtenidos a partir de estos ovocitos.

El análisis de varianza reveló diferenciassignificativas entre los valorespresentados p<0,0001.

CONCLUSIONES: Existe una relacióndirecta muy intensa entre los valores derespiración ovocitaria y la calidadembrionaria obtenida tras el proceso deinseminación (en día 2).Los datosobtenidos sugieren la utilidad de larespiración ovocitaria como marcador decalidad, pudiendo ser una herramientade interés para la selección de losovocitos con mayores probabilidades deéxito, aumentando así las posibilidadesde implantación.

001: ANÁLISIS DE LA CALIDAD OVOCITARIA MEDIANTE ELCONSUMO DE OXÍGENO; RELACIÓN CON FECUNDACIÓN,DESARROLLO Y CALIDAD EMBRIONARIA

A. Tejera, J. Herrero, P. Romero, M. J. de los Santos, J. Remohí, M. Meseguer IVI, Valencia

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INTRODUCCIÓN:

El acrosoma es una estructura vesicularque cubre la parte anterior del núcleodel espermatozoide. Para que lafecundación tenga lugar es necesarioque se produzca la reacción acrosómica(RA). La RA se produce por la fusiónentre la membrana acrosomal externa yla membrana plasmática en diferentespuntos. Este proceso lleva consigo laliberación de las enzimas acrosomalesque junto con la motilidad espermáticapermiten al espermatozoide atravesar lazona pelúcida (ZP) y la fecundación. LaRA es iniciada por progesterona y la ZP.La ZP está formada por cuatro proteínasdenominadas ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4. Se hadescrito que ZP3 induce la RA enespermatozoides capacitados. Variosestudios indican que los carbohidratosjuegan un papel clave en la interacciónespermatozoide-ovocito; sin embargo,el grado de implicación y tipo decarbohidrato implicado sigue siendo aúntema de controversia. Estos estudios sonlimitados debido a la escasez de ZPdisponibles. Por ello, la producción deproteínas recombinantes de la ZPpermite la obtención de materialsuficiente para realizar estudios básicosacerca de la interacción entre gametos.


El cDNA de ZP2 y ZP3, (donados por el Dr.Dean, NIH) fue subclonado en el plásmidode expresión pEGFP-N1 (Clontech). Lasconstrucciones se electroporaron encélulas de ovario de hámster chino (CHO)para obtener clones constitutivamenteexpresando ZP2 y ZP3. Además ZP3también se utilizó para transformar CHOlec1 y CHO lec8 que tienen su glicosilación modificada. CHO lec1 tiene

carencia en la actividad de la N-acetilglucosamintransferasa I impidiendola formación de carbohidratos del tipo N-unidos complejos; mientras que CHO lec8produce glicoproteínas con déficit delazúcar galactosa. Se obtuvieron 10muestras seminales procedentes de ochodonantes, previo consentimientoinformado de los mismos. Las muestrasuna vez lavadas fueron capacitadasmediante swim-up durante 1 hora a 37ºCy 5% CO2 en medio HTF suplementado conHSA. Los ensayos de RA se hicieron con 10millones de espermatozoide por mililitroy se midió la inducción de RA mediada porlas diferentes glicoproteínas de la ZPsecretadas por las CHO a unaconcentración de proteína total de1μg/μl, progesterona (10 y 3,2 μM) y elionóforo de calcio (10 μM) utilizando lalectina Pisum sativum. La vitalidadespermática fue determinada mediante elensayo de eosina-nigrosina.

RESULTADOS:

El análisis mediante Western-blotmostró la presencia de ZP3 con un pesomolecular aproximado de 60 kDa, 39 kDay 42 kDa para las células CHO, CHO lec1 yCHO lec8 respectivamente.

El sobrenadante que contiene laproteína recombinante ZP3 producida encélulas CHO, CHO lec1 y CHO lec8 produjouna RA del 46,4, 29,13 y 28,9%respectivamente. Se observa únicamenteun incremento estadísticamentesignificativo con la ZP3 producido enCHO. Progesterona a 3,2 y 10 M indujo50,5 y 52,1% de RA respectivamente. Elporcentaje de RA en las muestrasincubadas con la proteína ZP2 y sintratamiento fue de 27,7 y 27,5%respectivamente. El ionóforo de calcio

indujo un 84, 8% de RA. Tras todos lostratamientos la vitalidad espermática semantuvo aproximadamente alrededordel 90%, excepto en el tratamiento conionóforo en el que la vitalidad desciendehasta un 13%.

CONCLUSIONES:

En conclusión, ZP3 producida en CHOmuestra una actividad biológica similar aprogesterona, mientras que ZP3producida en CHO lec1 y CHO lec8 noinduce un incremento de la RAcomparado con la RA espontánea y conZP2. Estos resultados indican quecambios en el patrón de glicosilación dela ZP3 humana producen una pérdida desu actividad biológica implicando muyprobablemente la participación decadenas oligosacarídicas del tipo N- y O-unidas.

Estudio financiado por la FundaciónSéneca de la Región de Murcia0452/GERM/2006 y IVI-Murcia.

002:ANÁLISIS DE LA INDUCCIÓN DE LA REACCIÓN ACROSÓMICAEN EL ESPERMATOZOIDE HUMANO MEDIANTE EL USO DE ZP3RECOMBINANTE EXPRESADA EN DIFERENTES LÍNEAS CELULARESDE OVARIO DE HÁMSTER CHINO CON GLICOSILACIÓN MODIFICADA.

M. T. Zomeño-Abellán1, M. A. Ramírez2, A. Gutiérrez-Adán2, M. J. Izquierdo-Rico1, M. Jiménez-Movilla1, J. L. Girela3, M. J. Gómez-Torres3, J. deJuan3, J. Ballesta1, J. C. Martínez4, J. Landeras4, M. Avilés1.1Departamento de Biología Celular e Histología, Facultad de Medicina, Universidad de Murcia, Murcia. 2Departamento de Reproducción Animal,INIA, Madrid. 3Departamento de Biotecnología, Universidad de Alicante, Alicante. 4 IVI, Murcia.




INTRODUCCIÓN:

Desde que en 1983 Lutjen y colaboradoresdesarrollaron la técnica de la donación deovocitos, su utilidad y el alcance de susaplicaciones ha ido en aumento en losúltimos años. Entre los factores descritosque condicionan los resultados de ladonación destacan la edad de la donante,la edad de la receptora y el número deovocitos obtenido. Algunos estudioscontemplan la fertilidad previa de ladonante como variable que puede afectarla eficacia de la técnica.

Objetivo: Comprobar si hay diferenciassignificativas entre las tasas deembarazo de pacientes receptoras deovocitos procedentes de donantes confertilidad probada (partos, abortos ointerrupciones legales del embarazo) ylas de receptoras de ovocitos dedonantes nuligrávidas. Se pretendetambién determinar si el hecho de haberconseguido un embarazo en un primerciclo repercute sobre la posibilidad deéxito en una segunda donación.


Estudio retrospectivo que incluye untotal de 605 ciclos sincrónicosprocedentes de 504 donantes, llevadosa cabo en el Institut Universitari Dexeus(Mayo 2005- Diciembre 2007).

Variables analizadas para las donantes:Edad de la donante, gravidez, dosis degonadotropinas, [E2] en día de HCG,ovocitos totales recuperados, número deovocitos MII, número de ovocitosasignados/receptora, número deovocitos MII asignados/receptora.

Variables analizadas para las receptoras:edad de la receptora, tasa defecundación, número de embrionesevolutivos, número de embrionestransferidos y tasa de embarazo.

El análisis estadístico utilizado fue el testChi-cuadrado, Fisher, T-Student con=0.05 y regresión logística multivariable.

RESULTADOS: La media de edad de lasdonantes fue de 27.4 ± 4.5 años.

Del total de 504 donantes, 236 erangrávidas y 268 nuligrávidas. Repitieronciclo de donación 62 donantes (12.3%).

Comparando las distintas variablesanalizadas para los dos grupos sólo seobservaron diferencias estadísticamentesignificativas (p<0.05) en la media deedad de las donantes siendo superior enel grupo de donantes grávidas (29.3 ±3.9) respecto al de nuligrávidas (25.7 ±4.5) y en el número de ovocitosrecuperados, siendo significativamente(p<0.05) inferior en el grupo de donantesgrávidas (15.2 ± 7.2 vs 16.5 ± 7.4)

La media de edad de las receptoras fuede 41.7 ± 5.7 años.

En 294 (48.6%) ciclos las pacientesreceptoras recibieron ovocitosprocedentes de donantes con fertilidadprobada consiguiéndose 158 (53.7%)embarazos. Los 311 ciclos restantesprocedían de donantes nuligrávidas y se consiguieron 172 (55.3%)embarazos, no observándose diferenciasestadísticamente significativas.

De las 62 donantes con más de un ciclorealizado, 36 (58.1%) dieron lugar aembarazo en el primer ciclo de donación.De éstas, 19 (52.8%) generaron unsegundo embarazo. Mientras que de las 26que no dieron lugar a embarazo en elprimer ciclo, 19 (73.1%) sí lo hicieron enel segundo ciclo. No observándosediferencias significativas.

CONCLUSIONES:

En este estudio, la fertilidad anterior de

la donante no es un factor predictivo deembarazo para las receptoras así comotampoco parece serlo el hecho de haberdado lugar a un embarazo en un cicloanterior de donación. Por ello,consideramos que la fertilidad previa dela donante y/o el haber generadoembarazo en ciclos anteriores nodeberían constituir requisitosimprescindibles para la aceptación de lascandidatas.

003: FERTILIDAD PREVIA EN DONANTES DE OVOCITOS:¿FACTOR PREDICTIVO DE EMBARAZO?

L. Echeverria1, E. Clua1, M. Boada1, L. Latre1, F. Martínez1, A. Veiga1, 2.1 Departament d’Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció de USP Institut Universitari Dexeus. Barcelona. 2 Centre de Medicina Regenerativa deBarcelona (CMRB). Barcelona

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INTRODUCCIÓN:

En las clínicas de reproducción asistida,la simultaneidad de ciclos puedecomportar problemas de trazabilidad delos gametos/embriones. ESHRE proponela supervisión de todo el proceso por unasegunda persona, pero esta acción noelimina la posibilidad de cometererrores. Con el fin de automatizar elproceso de control de trazabilidad, secomercializan productos para etiquetare identificar automáticamente elmaterial de laboratorio utilizado. Noobstante, como el material reproductivodebe cambiar de recipiente a lo largo delproceso, estas herramientas no sonsuficientes para evitar los problemas detrazabilidad. Una alternativa es el marcajedirecto de los gametos/embrionesmediante micropartículas codificadas(microdispositivos) de polisilicio.Concretamente, el objetivo de estetrabajo fue determinar la validez de estaaproximación como sistema decodificación embrionario mediante laintroducción de microdispositivos en elespacio perivitelino (EPV) de embrionesde ratón.


Los microdispositivos fueron fabricadosmediante microtecnologías de silicio. Sediseñaron tres modelos (A, B y C) condiferentes formas, dimensiones ysistemas de codificación. Losmicrodispositivos fueron microinyectadosen el EPV de zigotos de ratón, que secultivaron in vitro hasta el estadio deblastocisto. Se valoró la viabilidadembrionaria, la retención de losmicrodispositivos en el EPV durante todoel periodo de cultivo in vitro, laidentificabilidad de los embriones y laliberación de los microdispositivos en elmomento de la eclosión. Inicialmente semicroinyectó un microdispositivo de cada

modelo por embrión con el objetivo dedeterminar el modelo más idóneo.Posteriormente se determinó el númerode microdispositivos necesarios paraalcanzar una identificación embrionariapróxima al 100%.

RESULTADOS:

No se detectaron diferenciassignificativas para ninguno de losparámetros analizados entre los tresmodelos de microdispositivos (ver

tabla), pero se seleccionó el modelo C porconsiderarse el de más fácil lectura almicroscopio. Se comprobó que tanto el método de incorporación como el propio microdispositivo,independientemente del modelo onúmero, no afectan al desarrollo invitro de los embriones. La tasa deretención del total de microdispositivosdisminuyó significativamente cuandose microinyectaron dos o más porembrión, aunque el 100% de losembriones retuvo como mínimo unmicrodispositivo. La tasa deidentificación embrionaria incrementósignificativamente al aumentar elnúmero de microdispositivos porembrión. Es importante destacar que, elobjetivo final es disponer de un sistema

automatizado de lectura, para ello y a fin de simularlo, el proceso de identificación se realizó sinmanipulación de los embriones.Finalmente, se valoró la liberación delos microdispositivos después de laeclosión del embrión, puesto que elobjetivo del sistema es manteneridentificado al embrión únicamentedurante su cultivo in vitro. La tasa de liberación disminuyesignificativamente al aumentar elnúmero de microdispositivos presentes.

CONCLUSIONES:

El sistema de codificación embrionariopresentado demuestra su utilidad,considerando la tasa de supervivencia eidentificación obtenida. No obstante, ellaborioso método de incorporación y labaja tasa de liberación de losmicrodispositivos después de laeclosión, requieren una mejora delsistema o la búsqueda de alternativas.En este sentido, actualmente estamostrabajando en el desarrollo de unsistema alternativo de etiquetajeexterno mediante microdispositivos depolisilicio funcionalizados paraadherirse a la zona pelúcida.

004: IDENTIFICACIÓN DE EMBRIONES DE RATÓN MEDIANTEMICROPARTÍCULAS CODIFICADAS DE POLISILICIO

S. Novo1, R. Gómez1, L. Barrios1, M. Duch2, J. Esteve2, J. A. Plaza2, J. Santaló1, C. Nogués1, E. Ibáñez1*1Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Facultat Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra2Instituto de Microelectrónica de Barcelona, IMB-CNM (CSIC), Campus Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra


a,b,c,d Diferentes superíndices indican diferencias significativas entre las diversas filas de la mismacolumna (c2: p<0,05)

n.d.= no determinado.



INTRODUCCIÓN:

El sistema opioide se encuentraampliamente distribuido en el apartoreproductor masculino regulando amúltiples niveles la función reproductora(1). Los péptidos opioides se generan porhidrólisis de precursores proteicos. Lapro-encefalina (PENK), laproopioimelanocortina (POMC) y la pro-dinorfina (PDYN) son los precursoresproteicos de las encefalinas, lasendorfinas y la dinorfinasrespectivamente. Estos péptidosbioactivos ejercen su acción a través delos receptores opioides presentes enespermatozoides humanos (2). Por lotanto, nuestro objetivo fue analizar laexpresión y localización de POMC y PDYNen espermatozoides humanos paradeterminar si el espermatozoide es capazde generar péptidos opioides endógenos.


La expresión y localización de POMC yPDYN se determinó por RT-PCR einmunocitoquímica respectivamente enespermatozoides capacitados aisladosmediante gradiente de Percoll.

RESULTADOS:

Mediante RT-PCR detectamos el mRNAdel precursor PDYN en espermatozoidesmaduros, pero no observamos lapresencia del mensajero que codificapara el precursor POMC. La PDYN selocaliza en la región ecuatorial de lacabeza espermática formando un anillo,mientras que POMC apareceexclusivamente en la cola espermática.

CONCLUSIONES:

Los precursores opioides POMC y PDYNpresentan una expresión génica

diferencial lo que confirma la existenciade una población estable y selectiva deRNAs en espermatozoides maduros cuyoperfil podría ser utilizados comodiagnóstico en los tratamientos deinfertilidad masculina. Las diferenciasde localización de POMC y PDYN indicanque los péptidos generados a partir deestos precursores podrían estarregulando diferentes procesos ya que losespermatozoides, debido a la altapolarización estructural y funcional,compartimentalizan metabolitosespecíficos y vías de señalización enregiones donde los necesita.

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AGRADECIMIENTOS:

Trabajo financiado por el MEC (BFU2006-07779), la Diputación Foral de Bizkaia(7/12/EK/2006/61) y la Junta deAndalucía (P08-CVI-04185). N. Subiránposee una Ayuda de Formación delPersonal Investigador de la UPV/EHU

005: DIFERENCIAS EN LA EXPRESIÓN GÉNICA Y LOCALIZACIÓN DELOS PRECURSORES PROTEICOS DE LOS PÉPTIDOS OPIOIDES POMC YPDYN EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS

N. Subirán1, 2, F. M. Pinto2, J. L. de Pablo3, M. Fernández-Sánchez 4, M L. Candenas2, y J. Irazusta1.1 Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina y Odontología. UPV/EHU. Leioa, Bizkaia. 2 Laboratorio de Farmacología. Instituto deInvestigaciones Químicas, CSIC-Universidad de Sevilla. Sevilla. 3 Laboratorio FIV. Clínica de Reproducción Asistida Quirón. Bilbao, Bizkaia. 4

Laboratorio de Andrología. Instituto Valenciano de Infertilidad, Fundación IVI. Sevilla.

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INTRODUCCIÓN:

En la actualidad el único método derutina utilizado para valorar la calidadovocitaria se basa en criteriosmorfológicos sometidos a la subjetividaddel observador. La necesidad de generarnuevos métodos cuantitativos deevaluación ovocitaria que mejoren laselección y más aun las tasas de

implantación, está promoviendo eldesarrollo de nuevas técnicas noinvasivas. En este sentido, la actividadmetabólica ovocitaria puede actuarcomo predictor del potencial desarrolloembrionario y la medición del consumode oxígeno ha sido considerada como sumejor indicador, ya que estádirectamente relacionado con lacapacidad del ovocito para producir ATP.Nuestro objetivo es evaluar la capacidaddiagnóstica del consumo de oxígenoovocitario como marcador de calidadcorrelacionándolo con determinadosvalores clínicos de la paciente.


Realizamos un estudio de cohortes decarácter prospectivo y observacionalpara determinar la validez del métodoautomatizado y cuantitativoproporcionado por Embrioscope(Unisense, Dinamarca). Analizamos untotal de 146 ovocitos procedentes de 30donantes incluidas en un programa dedonación de ovocitos. La respiraciónmedia ovocitaria fue analizada enfentomoles de oxígeno/hora.Consideraremos para el estudio una

serie de variables independientesrelevantes en el desarrollo del ciclo dereproducción asistida: edad, días deestimulación, último Estradiol yProgesterona en sangre, nº de ovocitosrecuperados y nº de metafase IIobtenidos. El ovocito fue situado enpocillos con medio de cultivo (HTF;Human Tubal Fluid). El oxígeno llega alembrión por difusión a través del propio

medio por las capas superiores encontacto con el aceite mineral. A medidaque el embrión consume oxígeno laconcentración se reduce desde la base(donde está el ovocito) hacia lasuperficie y este gradiente lineal esvalorado por un microsensor. Lasmediciones de oxígeno se tomaron porduplicado en intervalos de 30 minutos,obteniendo una información puntual. Encada experimento se utilizaron pocillossin ovocitos que sirvieron como “blanco”para valorar los niveles basales degradiente de oxígeno. Las mediciones serealizaron con un sensor electroquímico(Tipo Clark) cuya sensibilidad es de 0,05fmol de oxígeno/h. El tiempo empleadopara medir la respiración de cada ovocitofue de aproximadamente 90 segundos.

El análisis estadístico se realizómediante regresión lineal, siendo larespiración ovocitaria la variabledependiente. Construimos un modelopredictivo de regresión donde utilizamosun proceso de selección siguiendo elprotocolo forward step del SPSS 17.

RESULTADOS:

la tasa media de respiración ovocitariaobservada en nuestra población deovocitos fue de 3,27 fmol/h (IC95%3,04-3,50) (rango 0,00-7,19). En lasiguiente tabla se presentan los datos delos coeficientes de correlación dePearson entre las variables clínicasanalizadas y la tasa media de respiración

ovocitaria.

Tras el proceso de forward-step segeneró un modelo en el que las variablesrelevantes que condicionan larespiración ovocitaria se ordenan poreste orden: Dosis total degonadotropinas, Progesterona en sangrey Edad. El coeficiente de correlación delmodelo ajustado r fue de 0,591,p>0,0001.

CONCLUSIONES:

Existe una importante relación linealentre la respiración ovocitaria ydeterminados valores clínicos relevantespara el éxito reproductivo. La utilizaciónde altas dosis de gonadotropinas, laluteinización prematura o la edadavanzada afectan a la calidad ovocitariareflejándose en niveles de respiraciónreducidos. Los datos obtenidos sugierenla utilidad de la respiración comomarcador de calidad ovocitaria, evitandola subjetividad e inconsistencia queproporcionan la evaluación de losdismorfismos ovocitarios.

006: APLICACIÓN DE LA TECNOLOGÍA DEL EMBRIOSCOPE PARA LACUANTIFICACIÓN DE LA CALIDAD OVOCITARIA MEDIANTE ELANÁLISIS DE LOS PATRONES DE RESPIRACIÓN

J. Herrero, A. Tejera, J. M. de los Santos, M. J. de los Santos, A. Pellicer, M. Meseguer. IVI, Valencia




INTRODUCCIÓN:

Los embriones humanos pueden creceren concentraciones de oxígenoatmosféricas (20%) o reducidas (5%).Bajas tensiones de O2 durante el cultivoembrionario in vitro intentan reproducirlas condiciones in vivo a las que estánsometidas ovocitos y embriones, perolos resultados obtenidos en distintosestudios con respecto al cultivo enhipoxia no son concluyentes.Recientemente han salido publicadosvarios trabajos prospectivos y aleatoriosen los que se muestran los beneficios delcultivo embrionario en hipoxia hasta elestadio de blastocisto. Nosotros hemosquerido evaluar si esto mismo ocurre enembriones transferidos en día +3 dedesarrollo y si hay alguna implicación enla calidad embrionaria así como en lastasas de gestación e implantación.


Se realizó un estudio prospectivo en untotal de 939 ciclos de nuestro programade donación de ovocitos: 481 ciclos(3754 embriones) fueron cultivados a37ºC, 5,5% de CO2 y 20% de O2 y 458ciclos (3192 embriones) en las mismascondiciones de temperatura y CO2 perocon un 5% de O2. En ambos casos seutilizaron incubadores trigas SANYO MCI5M. Ovocitos y embriones fueroncultivados en microgotas de 50μl de HTFbajo aceite mineral. La morfologíaembrionaria fue evaluada en día +2 y +3de desarrollo según nº de células, gradoy patrón de fragmentación,multinucleación, simetría y tamaño delas células. Todas las transferencias serealizaron en día +3, el test de embarazose realizó 13 días después mediante ladeterminación sérica de ßHCG y unasemana más tarde se confirmó lapresencia de saco gestacional porecografía vaginal. Los datos seanalizaron con el test exacto de Fisher y

valores de p<0.05 fueron consideradosestadísticamente significativos.

RESULTADOS:

No se encontraron diferenciasestadísticamente significativas entre los2 grupos, en tasas de fecundación(70.9% vs. 71.8%) ni tasas de gestacióntotales (60.3% vs. 53.4%). Sin embargo,el porcentaje de embriones de buenacalidad en día +2 y día +3 fuesignificativamente mayor en el grupo deembriones cultivados en baja tensión deO2, 60.0% vs. 54.0% en día +2 y 64.1%vs. 58.0% en día +3, así como la tasa degestación clínica (55.9% vs. 46.2%) y latasa de implantación (38.2% vs. 31.7%).

CONCLUSIONES:

El cultivo de embriones humanos enbajas presiones de O2 mejora la calidadde los embriones en día +2 y día +3 eincrementa las tasas de gestación clínicae implantación de forma significativa.Esta mejora en los resultados puede serdebida a una menor formación deespecies reactivas de oxígeno quepueden afectar al desarrolloembrionario in vitro y por tanto a sucapacidad de implantación.

007: EL CULTIVO DE EMBRIONES EN BAJAS TENSIONES DEOXÍGENO, MEJORA LAS TASAS DE GESTACIÓN E IMPLANTACIÓN ENCICLOS DE DONACIÓN DE OVOCITOS: RESULTADOS PRELIMINARES

P. Gámiz, A. Tejera, J. M. De Los Santos, S. Pérez, C. Albert, P. Romero, M. J. De Los Santos.Instituto Valenciano de Infertilidad. IVI, Valencia

96



INTRODUCCIÓN:

La multinucleación en embrioneshumanos es un fenómeno común que semuestra tanto en embriones in vitrocomo in vivo. Se puede originar por unadivisión nuclear (cariocinesis) sin quehaya divisón celular (citocinesis), poruna fragmentación del núcleo o por unamigración defectuosa durante la anafasemitótica. La multinucleación aparece enaproximadamente el 15%-20% de losembriones desarrollados in vitro (ref. 1).La presencia de blastómerasmultinucleadas está asociada con unpobre desarrollo embrionario en losciclos de FIV, lo que supone una bajadaen las tasas de implantación (ref. 1,2,5)y en la tasa de formación de blastocisto(ref. 1,2). Numerosos trabajosdemuestran el aumento de anomalíascromosómicas en embriones humanosmultinucleados, encontrándose altastasas de mosaicismo y/o poliploidía(ref. 3,4).

Nuestro objetivo es demostrar lainfluencia de la multinucleación en lastasas de implantación y de aborto en unprograma de fecundación in vitro.


Se presentan un total de 820 casos deciclos de FIV/ICSI en los que setransfieren dos embriones en día +3 encada uno de ellos. Los casos sondivididos en tres grupos distintos,Grupo A: (n = 699) transferencia de dosembriones sin multinucleación, Grupo B(n = 94) transferencia de 1 embriónmultinucleado (+2 ó +3) y 1 embrión sinmultinucleación, y Grupo C (n = 27)transferencia de dos embriones conmultinucleación (+2 ó +3).

Determinaremos los porcentajes en lastasas de embarazo, tasa de aborto, tasasde implantación y las tasas de

implantación evolutiva en cada uno delos grupos, analizando las variacionesentre ellos mediante el test estadísticode Chi-cuadrado.

RESULTADOS:

* Diferencias estadísticamentesignificativas entre grupo A y B.

** Diferencias estadísticamentesignificativas entre grupo A y C.

Los resultados demuestran la influenciade la multinucleación en las tasas deimplantación y de aborto. Se observauna bajada estadísticamentesignificativa en las tasas deimplantación (31.4%, 17.64%, 15.78%),tasa de implantación evolutiva (27.0%,14.03%, 14. 3%) y un aumento en lastasas de aborto (11.14%, 25.0%,18.18%) entre el grupo A y los grupos By C respectivamente.

CONCLUSIONES:

Los resultados nos demuestran que lapresencia de blastómerasmultinucleadas está asociada con undesarrollo embrionario comprometidoen los ciclos de FIV, lo que supone unabajada en las tasas de implantación y enla tasa de formación de blastocisto, y unaumento en las tasas de aborto. Esto nosindica que debemos evitar latransferencia de embrionesmultinucleados siempre que sea posible.Pero que en los casos donde solo

tengamos embriones multinucleadosaptos para transferencia podemosintentar la transferencia ya que sonembriones capaces de conseguirembarazos evolutivos.

008: INFLUENCIA DE LA MULTINUCLEACIÓN EN LAS TASAS DEIMPLANTACIÓN Y DE ABORTO EN UN PROGRAMA DE FECUNDACIÓNIN VITRO.

C. Alonso, M. Lara, B. Buch, C. Segura, R. Garnica, M. Martínez-MoyaUnidad de Reproducción, Centro Gutenberg. Málaga




INTRODUCCIÓN:

La técnica de vitrificación de ovocitosofrece resultados muy satisfactorios, loque ha hecho posible el establecimientode bancos de ovocitos de donante. Ladisponibilidad de ovocitos almacenadosen dichos bancos simplificaconsiderablemente el mecanismo de ladonación haciendo de ésta, un procesomás fácil y rápido. Dado el rendimientode los ovocitos vitrificados-desvitrificados, es frecuente contar conembriones adicionales aptos para sercriopreservados tras la transferencia(re-vitrificación de embriones). Elobjetivo de este trabajo es evaluar latasa de gestación acumulada tras latransferencia de embriones re-vitrificados en un programa de ovo-donación utilizando ovocitos vitrificadosde banco.


Este estudio incluye un total de 505ciclos donación de ovocitos vitrificados(media de edad= 26,6 ± 3,8 y 41,2 ± 4,5para las donantes y las receptorasrespectivamente). Se donaron un totalde 5.287 ovocitos. La re-vitrificación deembriones adicionales tras latransferencia se realizó en 294 ciclos(58,2%), 102 de los cuales han sidodesvitrificados hasta el momento. Se hacalculado la tasa acumulada degestación (tasa de gestación tras laprimera transferencia mas la tasa degestación tras la transferencia deembriones re-vitrificados). El métodoutilizado en la vitrificación tanto deovocitos como de embriones fue eldescrito por Kuwayama et al. utilizandoel Cryotop® como dispositivo de carga.

RESULTADOS:

El 92.9% de los ovocitos sobrevivierontras la vitrificación. Se realizaron 452(89,5%) transferencias con una media

de embriones transferidos de 1,9 ± 0,7.La tasa de gestación por transferencia yla tasa de gestación evolutiva fueron de56,9% y 41,2% respectivamente. De los102 ciclos de desvitrificación deembriones 99 finalizaron entransferencia embrionaria (97%). Latasa de supervivencia embrionaria fuedel 96.3%. Se han transferido 186embriones re-vitrificados (media 1,6 ±0,6). La tasa de gestación portransferencia de embriones re-vitrificados y la tasa de gestaciónevolutiva fue de 45,1% y 31,1%respectivamente. Adicionalmente, lastasas de gestación acumulada yacumulada evolutiva fueron de un 72.6%y 59.9% respectivamente. Hasta elmomento han nacido 87 niños.

CONCLUSIONES:

La re-vitrificación de los embrionesadicionales procedentes de los ciclos dedonación de ovocitos vitrificados noafecta su capacidad para implantar yconseguir gestaciones viables, lo quepermite mejorar el rendimiento total delciclo, contribuyendo a incrementar eléxito de las donaciones realizadas conovocitos de banco.

009: RESULTADO ACUMULADO TRAS LA TRANSFERENCIA DEEMBRIONES RE-VITRIFICADOS EN CICLOS DE DONACIÓN DEOVOCITOS DE BANCO.

A. Mifsud, D. Castelló, N. Grau, M. Meseguer, J. M. de los Santos, A. C. CoboInstituto Universitario IVI, Valencia

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INTRODUCCIÓN:

La criopreservación de embriones en ellaboratorio es una técnica de granimportancia que permite rentabilizar almáximo los ciclos de FIV de nuestraspacientes. En el año 2007 hemosintroducido en el laboratorio laVitrificación como método decriopreservación de embriones, ygracias a ella hemos logrado mejorarnuestro programa de criopreservaciónaportándole eficacia y estabilidad.

El objetivo de este trabajo es mostrar losresultados de nuestro programa dedescongelación y transferencia deembriones congelados, comparando lavitrificación y la congelación lenta deembriones en diferentes estadios dedesarrollo.


En este estudio se muestran losresultados de las descongelaciones deembriones llevadas a cabo durante todo

el año 2008 en IVI Madrid. Lacongelación-descongelación lenta endía 2 y 3 de desarrollo embrionario sellevó a cabo con medios de Vitrolife(Freeze Kit y Thaw Kit), y en día 5-6 conlos medios de COOK (blastocyst freezingkit y thawing kit, Sidney IVF). Elcongelador que utilizamos fue unaPlaner (Kryo 360–1.7, Telstar) con unarampa específica para cada estadio dedesarrollo. La vitrificación se realizó conel método del Cryotop (Kitazato).

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

La vitrificación resulta ser más la técnicade criopreservación más efectivaindependientemente del estadioembrionario. Los embriones en día 2/3de desarrollo presentan una tasa desupervivencia significativamente mayoren el caso de la vitrificación,reduciéndose también significativamentela tasa de cancelación de transferencias.Lo mismo se observa en los blastocistos

vitrificados: la supervivencia es mayor ypor tanto la cancelación es menor. La tasa de gestación e implantación es significativamente mayor en las transferencias de blastocistosdesvitrificados.

La eficacia de la vitrificación hapermitido estabilizar los resultados denuestro programa de criopreservación,reduciendo el número de cancelaciones yaumentando las tasas de gestación eimplantación en las pacientes quebuscan en estos embriones una segundaoportunidad de embarazo.

010: CONGELACIÓN LENTA VS. VITRIFICACIÓN CON CRYOTOP ENDÍA 3 DE DESARROLLO Y ESTADIO DE BLASTOCISTO. RESULTADOSDEL 2008 EN EL IVI MADRID.

L. Herrero, S. Pareja, C. Losada, M. Jiménez, J. Fernández, Y. Mínguez.IVI, Madrid


P<0.05.



INTRODUCCIÓN:

El método habitual para la evaluación dela fertilidad masculina es elespermiograma aunque su poderdiagnóstico es limitado a la hora deexplicar el fracaso en los tratamientosde reproducción asistida sobre todo enaquellos de ICSI, indicado para sémenescon parámetros de concentración,movilidad y/o morfología muy alterados.Sin embargo, a pesar de presentarcaracterísticas patológicas unos logranembarazos y otros no. El espermiogramaclásico no analiza factores molecularesque pueden afectar en su potencial fértilcomo es la presencia de ARN mensajero(ARNm). La existencia de estosmensajeros está bien documentada en elproceso de fecundación y en las primerasdivisiones embrionarias hasta latransición materno-cigótica. Las nuevasherramientas de análisis masivo comolos microarrays pueden ayudarnos aincrementar el poder diagnóstico delespermiograma y a conocer mejor losgenes implicados en la fertilidadmasculina.

MATERIAL Y METODOS:

Estudio de casos y controles con 10muestras de semen. Aplicamos elmodelo de donación de ovocitos paraestandarizar el factor femenino.Escogimos aquellos casos en los que deuna donante se obtenían suficientesovocitos para dos parejas sometiéndoseambas a un tratamiento de ICSI, tras elcual una de las mismas lograbaembarazo y la otra no. Tras recolectar 5casos, procedimos a hacer 2 microarrayspor duplicado con las muestras quelograron embarazo (Grupo E, n=5) frenteaquellas que no (Grupo NE n=5). Seextrajo el ARNm por el método delTrizol, se almacenó suspendido en aguaDEPC y se conservó a -80ºC. Además la

calidad del ARNm fue evaluada con elAgilent Bioanalyzer 2100. El microarrayutilizado fue uno de genoma completocon una densidad de 44000 sondasaproximadamente (Agilent WholeGenome Microarray, 4X44, One Color).Un posterior análisis de los datosobtenidos por los microarrays identificólos genes diferencialmente expresados(GDE), es decir aquellos comunes aambos grupos pero que en uno de ellosestaba sobre expresado como mínimo 2 veces respecto al otro y conuna significación estadística menor a 0.05. Posteriormente y con ayuda del Gene Ontology (GO)(http://www.geneontology.org/) seanalizaron los GDE de ambos grupos paracaracterizarlos funcionalmente. El GOnos proporciona un estructuración delconocimiento biológico al que divide entres dominios (GO terms) procesosbiológicos (PB), componentes celulares(CC) o funciones moleculares (FM)estadísticamente afectados (EA).

RESULTADOS:

En el grupo E se identificaron 44 GDEmientras en el NE sólo 5. El análisis conel GO determinó que sólo había PB, CC oFM EA en el grupo E (PB: “respuesta alestrés”, “respuesta al estímulo externo”,“respuesta a estímulos”, “apoptosis” y“muerte celular programada”. CC:“región extracelular”, “vacuola lítica”,“lisosoma”, “vacuola” y “citoplasma”.FM: “unión al ión Cadmio” y “Unión alión de cobre”). Ningún GO term estabaEA en el grupo NE.

CONCLUSIONES:

Este trabajo revela que existendiferencias moleculares (a nivel deexpresión) y funcionales entre muestrasque logran embarazo frentes aquellasque no, mediante tratamientos de ICSI y

que pueden ser indicadores de éxitoreproductivo. El estudio en ovocitosdonados y el hecho de que el semen conel que se realizan los microarrays es unaalícuota del que posteriormente seutiliza en el tratamiento dota al modelode una gran robustez. El análisisfuncional de los GDE se lleva a caboporque los genes por si mismos notienen un sentido biológico, estosinteractúan formando redes máscomplejas, no se pueden tratar comoentes discretos. El presente estudioinicia la aplicación de los microarrays ensemen como herramienta diagnóstica yabre nuevas líneas de investigación paraconocer el papel de determinados genesen el éxito reproductivo.

011: PATRON DE EXPRESIÓN GÉNICA DIFERENCIAL ENTREMUESTRAS DE SEMEN QUE CONSIGUEN O NO EMBARAZO CON LAMISMA COHORTE OOCITARIA EN CICLOS DE ICSI CON OVOCITOSDONADOS S. García-Herrero, N. Garrido, J. A. Martínez-Conejero, A. Pellicer, J. Remohí, M. MeseguerInstituto Universitario IVI Valencia, Valencia

100



INTRODUCCIÓN:

Como ya se ha demostrado previamente,existe una correlación entre el grado defragmentación del DNA espermático(DFI) y peores tasas de embarazo enciclos de fecundación in vitro (FIV).Estudios previos indican que lafragmentación del DNA espermático seproduce, en su mayor parte, durante elpaso de los espermatozoides por elepidídimo y que, como consecuencia deello, el DFI es más alto enespermatozoides eyaculados que entesticulares. El objetivo de este estudiofue el de correlacionar las tasas deimplantación y embarazo evolutivo enciclos de FIV con espermatozoidestesticulares comparado conespermatozoides eyaculados enpacientes con un DFI en semenpatológico.


Se evaluaron un total de 194 ciclos deFIV en los que el DFI en semen erapatológico. La indicación principal parael estudio de fragmentación de DNA enestas parejas fue fallo repetido deembarazo sin causa aparente. Sedeterminaron las tasas de implantacióny embarazo evolutivo en ciclos conespermatozoides eyaculados (grupoeyaculados) (n=53) comparado contesticulares (grupo TESA-ICSI) (n=141).Se consideró un DFI patológico un valor≥ 20% medido por TUNEL y citometría deflujo (Sergerie et al., Hum Reprod,20:3446, 2005). Además se incluyó ungrupo control de TESA-ICSI en el que laindicación fue vasectomía previa obloqueo psicógeno a la hora de producirla muestra de semen (grupo TESA-ICSIcontrol) (n=57) y un grupo control conespermatozoides eyaculados en el queno se había hecho estudio defragmentación de DNA (grupo control

eyaculados) (n=430). Sólo se incluyeronciclos con óvulos de donante o conóvulos propios en mujeresnormorespondedoras con edades < 35años. Los pacientes con meiosis o FISHpatológico fueron descartados de esteestudio. El análisis estadístico se realizómediante two-tailed test Chi-cuadrado(95% CI).

RESULTADOS:

Los resultados se indican en la Tabla 1.Diferencias en las tasas de implantacióny embarazo entre el grupo de eyaculadosy TESA-ICSI fueron estadísticamentesignificativas (P<0,04). Diferencias enlas tasas de implantación y embarazoentre los grupos de TESA-ICSI y TESA-ICSI control no fueron estadísticamentesignificativas (P=0,376), mientras quediferencias entre el grupo controleyaculados y el grupo de TESA-ICSIfueron estadísticamente significativassólo para las tasas de embarazo(P=0,002).

Tabla 1

CONCLUSIONES:

Las tasas de implantación y embarazoevolutivo en ciclos de FIV en parejas conun DFI patológico en semen sonsignificativamente más altas cuando seutilizan espermatozoides testicularesque eyaculados. Dado que en la granmayoría de los casos el DFI enespermatozoides testiculares es normal,esto explicaría estas diferencias en lastasas de implantación y embarazo. El

hecho de que el 89% de los embarazosobservados en el grupo de TESA-ICSI seprodujesen en el primer ciclo podríaestar indicando que la fragmentacióndel DNA espermático es el factorlimitante de la causa de infertilidad enestas parejas.

012: RELACION ENTRE LA FRAGMENTACIÓN DEL DNA ESPERMÁTICOY LAS TASAS DE IMPLANTACIÓN, EMBARAZO EVOLUTIVO Y ABORTOEN CICLOS DE FIV.

C. Puche1, A. Rabanal1, C. Castelló1, A. Busquets1, A. Farreras1, E. Toro1, E. Velilla1, F. García1, M. López-Teijón1, 2, J. G. Álvarez1, 2. 1Instituto Marqués; 2Fundación Leonardo Marqués, Barcelona.




INTRODUCCIÓN:

Existen cada vez más estudios científicosque relacionan las exposicionesambientales a compuestos disruptoresendocrinos (DE) con el riesgo de efectosadversos para la salud reproductivahumana. Ciertas sustancias químicas,como los ftalatos, pueden produciralteraciones hormonales a través dediversos mecanismos moleculares ycelulares. Varios trabajos recientessugieren una asociación entre ladisminución de la concentración deTestosterona masculina y el incrementode las exposiciones a distintos DE.Estudios experimentales yobservacionales han mostrado unaactividad antiandrogénica de estoscompuestos ftalatos. Sin embargo,todavía existe un conocimiento limitadoacerca de la relación entre estassustancias químicas y los niveles dehormonas sexuales en varones fértiles.

MATERIAL Y METODOS:

Todos los sujetos que se incluyeron eneste trabajo participaron en el estudiomulticéntrico denominado “Study forFuture Families” y fueron reclutadosentre las parejas de mujeresembarazadas que acudían a clínicasprenatales afiliadas a hospitalesuniversitarios de 5 estadosnorteamericanos entre los años 1999 y2005. A los varones que aceptaronparticipar en el estudio se les realizó uncuestionario general epidemiológico,exploración andrológica, extracciónsanguínea y recogida de muestra deorina. Los metabolitos urinarios deDEHP, a saber: Mono(2-etilhexil) ftalato(MEHP), Mono(2-etil-5-hidroxihexil)ftalato (MEHHP), Mono(2-etil-5-oxohexil) ftalato (MEOHP) y Mono(2-etil-5-carboxipentil) ftalato (MECPP)

fueron analizados en el Centro deControl de Enfermedades de Atlanta(Georgia, USA). Las hormonas FSH, LH,Testosterona, Inhibina B, Estradiol ySHBG fueron analizadas, o calculadas[Testosterona libre e Índice deAndrógenos Libres (FAI)] en elDepartamento de Crecimiento yReproducción del Rigshospitalet(Copenhague, Dinamarca). Los análisisestadísticos de datos crudos (noajustados) incluyeron pruebasparamétricas y coeficientes decorrelación de Pearson. Posteriormente,se utilizaron modelos de regresiónmultivariante para el ajuste por posiblesfactores de confusión, que en nuestrocaso incluyeron: edad, Índice de MasaCorporal (IMC), tabaquismo, niveles decreatinina plasmática, tiempo deextracción sanguínea y grupo étnico. Losanálisis estadísticos se realizaron con elprograma SPSS 17.0.

RESULTADOS:

El número final de individuos estudiadosfue de 425 varones. La media ydesviación estándar de la edad e IMC fuede 32.2 (6.2) años y 28.2 (5.40)respectivamente. El 21% de los varonesera fumador y el 72% de raza blanca. Enlos análisis crudos se observó unacorrelación inversa estadísticamentesignificativa entre los niveles deTestosterona y la concentración demetabolitos urinarios MEOHP (r= −0.10,p-valor<0.05) y MECPP (r= −0.10, p-valor<0.05) respectivamente. Además,también se observó una correlaciónnegativa estadísticamente significativaentre los niveles de Testosterona libre yla concentración de metabolitosurinarios MEHP (r= −0.15, p-valor<0.01), MEHHP (r= −0.13, p-valor<0.01), MEOHP (r= −0.14,p-valor<0.01) y MECPP (r= −0.13, p-

valor<0.01) respectivamente. Losniveles de FAI mostraron una correlacióninversa significativa con los metabolitosMEHP (r= −0.23, p-valor<0.01), MEHHP(r= −0.14, p-valor<0.01), MEOHP (r=−0.15, p-valor<0.01) y MECPP (r= −0.12,p-valor<0.05) respectivamente. Tras elajuste por los posibles factores deconfusión, los niveles de FAIpresentaron una asociación inversaestadísticamente significativa con losmetabolitos urinarios MEHP ( β −0.05; IC95%, −0.08, −0.02), MEHHP ( β −0.04; IC95%, −0.07, −0.004) y MEOHP ( β −0.04;IC 95%, −0.07, −0.01) respectivamente.

CONCLUSIONES:

Nuestros resultados sugieren que losmetabolitos urinarios de DEHP podríanestar asociados con la alteración de lashormonas sexuales circulantes,principalmente FAI, en varones fértiles.Estos resultados son consistentes contrabajos experimentales previos yseñalan la importancia de ahondar en elestudio de estos DE para conocer conmayor certeza sus implicaciones clínicasen relación con la salud reproductivahumana.

013: ASOCIACIONES ENTRE METABOLITOS URINARIOS DEFTALATOS [DI(2-ETILHEXIL) FTALATO (DEHP)] Y NIVELES DEHORMONAS REPRODUCTIVAS EN VARONES FÉRTILES

J. Mendiola1, 2, N. Jørgensen3, A. M. Andersson3, F. Liu1, S. H. Swan1

1Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester Medical Center, New York, USA. 2Grupo deInvestigación en Salud Pública y Epidemiología, Facultad de Medicina, Universidad de Murcia, España. 3University Department of Growth andReproduction, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark.

102



INTRODUCCIÓN:

Existe información controvertida sobre losefectos del tabaco en la fertilidadmasculina y la calidad espermática.Nuestro grupo ha evaluado el efecto deltabaco sobre la integridad del ADN,produciendo en los pacientes fumadoreselevados niveles de fragmentación delmismo.

El objetivo del presente estudio fueevaluar los efectos indirectos del consumodel tabaco sobre la defensa oxidativa delespermatozoide formada por el sistemadel glutatión y los efectos directos sobreel ADN consecuencia del exceso deradicales libres producidos por el tabaco.

MATERIAL Y METODOS:

Realizamos un estudio experimentaldoble ciego en un total de 117 muestras

de semen de varones infértiles. Para elloanalizamos la actividad enzimática delsistema del glutatión analizando laglutation peroxidasa (GPx) (susisoformas 1 y 4), la glutatión reductasa(GR) y el glutatión celular libre (GSH)(n=29). Por otro lado estudiamos elARNm de GPx1, GPx4 y GR mediante PCRcuantitativa (n=33). Una pequeñaporción de los espermatozoides deleyaculado también fue apartada paramedir la oxidación del ADN mediante elOXI DNA assay kit (OxiDNA Assay,Calbiochem, Barcelona, España), basadoel la unión directa de un anticuerpofluorescente a la 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-0HdG) un productode la oxidación por el ataque de losradicales libres (n=55). La fluorescencia

se midió individualmente en cadaespermatozoide mediante citometría deflujo (Coulter Cytometry, Hialeah, FL).En cada tipo de estudio se establecierondos grupos en función del consumo o node tabaco. Se utilizó el test de T-Studentpara detectar diferencias significativasentre los grupos.

RESULTADOS:

Identificamos una disminuciónsignificativa en la actividad de la enzimaGPx4 (exclusiva de espermatozoides)pero no en la GPx1 ni en la GR de losespermatozoides de varones fumadores.También observamos una disminuciónsignificativa en la expresión de GPx1,GPx4 y GR ARNm. En la siguiente tablapresentamos los datos de los niveles deoxidación del ADN espermático depacientes fumadores y no fumadores.ET= error típico.

Los datos muestran pequeñasdiferencias que carecen de significancia.

CONCLUSIONES:

De nuestros datos podemos deducir queel tabaco está afectando negativamentea los enzimas antioxidantes de origenintracelular presentes en losespermatozoides pero esto no afecta a laintegridad del ADN en lo que hacereferencia a su oxidación y por lo tantono lo podemos considerar como elorigen de la fragmentación del ADN. Porconsiguiente los efectos del tabacoreduciendo la defensa contra losradicales libres están aun pordeterminar.

014: EFECTO DEL TABACO SOBRE LA OXIDACIÓN DEL ADNESPERMÁTICO Y SU DEFENSA CONTRA EL ESTRÉS OXIDATIVO

T. Viloria, M. Meseguer, J. A. Martínez-Conejero, P. Romero, J. Remohí, N. GarridoIVI, Valencia




INTRODUCCIÓN:

La met-encefalina, que se genera porhidrólisis de su precursor proteico pro-encefalina (PENK), es uno de lospéptidos bioactivos mejor conocidos delsistema opioide y su acción es inactivadamediante degradación enzimática (1).La met-encefalina está presente endistintos órganos y tejidos del aparatoreproductor tanto masculino comofemenino (2) sugiriendo que losespermatozoides podrían estarexpuestos a dicha sustancia en sutránsito hasta producirse lafecundación. La presencia de losreceptores opioides (mu, delta, kappa)en espermatozoides humanos (3), indicaademás que la met-encefalina podríaregular la función reproductoraejerciendo una acción directa sobre losespermatozoides. Por lo tanto, nuestroobjetivo fue analizar la expresión ylocalización de PENK y de la met-encefalina en espermatozoides humanoy determinar su implicación en lamovilidad espermática.


La expresión y localización de la PENK yde la met-encefalina se determinó por RT-PCR e inmunocitoquímica enespermatozoides capacitados aisladosmediante gradiente de Percoll. Lamovilidad espermática se determinómediante el sistema CASA tras laincubación de los espermatozoidescapacitados con met-encefalina exógena,y con inhibidores del metabolismo deencefalinas y naloxona (antagonista delos receptores opioides).

RESULTADOS:

El mRNA del precursor PENK estápresente en espermatozoides

capacitados y su proteína se localiza enla región ecuatorial post-acrosomal delespermatozoide. La met-encefalina selocaliza en la región acrosómica aunqueen un 10% de los espermatozoidesanalizados no se observainmunorreactividad. La adición de met-encefalina exógena produce un rápidoaumento dosis-dependiente de lamovilidad espermática, seguido de unrápido descenso a los 30 min. deincubación. Sin embargo, a las tres horasse produce una mejora de la movilidadespermática. La inhibición de lasenzimas-degradadoras de encefalinas(en ausencia de encefalinas exógenas)mejora la movilidad espermática, efectoque es revertido en presencia denaloxona en el medio, lo que indica quedicha acción se produce a través de unavía que implica los receptores opioides.

CONCLUSIONES:

La movilidad espermática es reguladaparacrinamente por la met-encefalinamediante la acción de encefalinaspresentes a lo largo del aparatoreproductor femenino. La inhibición dela degradación de encefalinas (enausencia de encefalinas exógenas)mejora la movilidad espermática a travésde una vía que implica los receptoresopioides, presumiblemente medianteuna acción autocrina de la met-encefalina endógena que se acumula enla región acrosómica de losespermatozoides.

1. Subirán N, Agirregoitia E, Valdivia A,Ochoa C, Casis L, Irazusta J. Expression ofenkephalin-degrading enzymes in humansemen and implications for sperm motility.Fertil Steril. 2008 May;89(5 Suppl):1571-7.

2. Fabbri A, Jannini EA, Gnessi L, Ulisse S,Moretti C, Isidori A. Neuroendocrine control

of male reproductive function. The opioidsystem as a model of control at multiple sites.J Steroid Biochem. 1989 Jan;32(1B):145-50.Review.

3. Agirregoitia E, Valdivia A, Carracedo A, CasisL, Gil J, Subirán N, Ochoa C, Irazusta J.Expression and localization of delta-, kappa-,and mu-opioid receptors in humanspermatozoa and implications for spermmotility.J Clin Endocrinol Metab. 2006 Dec;91(12):4969-75.

AGRADECIMIENTOS:

Trabajo financiado por el MEC (BFU2006-07779), la Diputación Foral de Bizkaia(7/12/EK/2006/61) y la Junta deAndalucia (P08-CVI-04185). N.Subiránposee una Ayuda de Formación delPersonal Investigador de la UPV/EHU

015: LA MET-ENCEFALINA SE EXPRESA EN ESPERMATOZOIDESHUMANOS Y REGULA LA MOVILIDAD ESPERMÁTICA POR VÍA DE LOSRECEPTORES OPIOIDES.

N. Subirán1, 2, M L. Candenas2, E. Agirregoitia1, F. M. Pinto2, J. L de Pablo3, C. G. Ravina4, J. Irazusta1.1 Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina y Odontología. UPV/EHU. Leioa, Bizkaia. 2 Laboratorio de Farmacología. Instituto deInvestigaciones Químicas, CSIC-Universidad de Sevilla. Sevilla. 3 Laboratorio FIV. Clínica de Reproducción Asistida Quirón. Bilbao, Bizkaia. 4 Laboratorio de Andrología. Instituto Valenciano de Infertilidad, Fundación IVI. Sevilla.

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INTRODUCCIÓN:

La infertilidad severa del varón estáasociada a recombinación meióticaalterada que produce un incremento deaneuploidía en espermatozoides. Su efecto fenotípico se traduce en un aumento de embrionescromosómicamente alterados,disminución de la tasa de embarazos,aumento de abortos, mortinatos ofracasos de tratamientos dereproducción asistida así como enalteraciones en el número, movilidad omorfología de espermatozoides.

El estudio de aneuploidías enespermatozoides a través de hibridaciónin situ fluorescente (FISH) hademostrado alteraciones numéricas dela mayoría de cromosomas (1, 8, 6, 10,13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X e Y)detectándose entre el 1.5-5.5% enpacientes con trastornos de fertilidad.

Debido a la baja frecuencia de lasalteraciones, los sistemas manualesexigen el estudio de un número elevadode espermatozoides hibridados con cadauna de las sondas utilizadas. Estorepresenta mucho tiempo de trabajo yun riesgo de variación interobservadores.

En los últimos años se han desarrolladonuevos sistemas automáticos queincluyen la microscopía motorizadajunto a sistemas de segmentación,digitalización de imágenes y análisis consoftware específico para la clasificacióncelular, lectura de señales, manipulacióny archivo de datos.

El objetivo de este estudio es determinarla precisión y exactitud de un sistemaautomático para la detección deaneuploidías en muestras de semen de

varones sanos, previa a la utilización deesta tecnología sobre muestraspatológicas.


El estudio se realizó sobre 10 muestrasde semen de varones sanos confertilidad probada.

Las muestras se procesaron siguiendoprotocolos de descondensación, fijaciónde espermatozoides e hibridación consondas para los cromosomas 13, 21, 18,X e Y (AneuVysion, Abbott). Las sondasfueron sometidas a control de calidadvalorando la intensidad de la señal,especificidad, ruido de fondo yporcentaje de hibridación.

El análisis comparativo se realizó sobre40.000 espermatozoides para el sistemamanual y 53.648 espermatozoides parael sistema automático. Los criterios deevaluación de FISH fueron:espermatozoides con bordes biendefinidos y sin solapamientos, tamaño eintensidad de la señales similares,posición de la señal dentro del núcleo,distancia relativa entre dos señales asícomo los criterios citados en el controlde calidad. Se valoró disomía y nulisomíapara cada uno de los cromosomas.

Además se realizaron controlesintraensayo para valorar lareproducibilidad del sistema automático.

El análisis automático se hizo con elsistema Metafer-MetaCyte (MetaSystems,Alemania).

RESULTADOS:

La tasa global de aneuploidías fue:sistema automático: 1.43% ± 0.45;sistema manual: 1.47% ± 0.46.

El análisis de aneuploidías en cadacromosoma revela los siguientes datospara el sistema automático y manualrespectivamente: Cromosoma 13: 1.36%± 0.43 y 1.37 %± 0.62; Cromosoma 21:1.2% ± 051 y 1.22% ± 0.48; Cromosoma18: 1.22% ± 0.37 y 1.32% ± 0.39;Cromosomas sexuales: 1.93% ± 0.44 y2% ± 039.

CONCLUSIONES:

El estudio de validación realizadodemuestra que los resultados obtenidosde forma manual son comparables conlos resultados obtenidos de formaautomática. Se demuestra que cadacromosoma presenta una frecuenciadistinta de aneuploidías. El estudio nosha permitido establecer el punto decorte para disomías y nulisomías en cadacromosoma estudiado.

Sin embargo, la información que aportaes limitada a los cromosomas y regionesestudiadas.

El método automático ha resultado serun método robusto, rápido, reproducibley capaz de analizar un mayor número denúcleos disminuyendo el tiempo detrabajo.

Sería interesante valorar otrastecnologías que informen sobre todo elcomplemento cromosómico de losespermatozoides.

016: VALIDACION DE UN NUEVO SISTEMA AUTOMATICO PARA ELESTUDIO DE ANEUPLOIDÍAS EN ESPERMATOZOIDES.

S. Santillán1, X. Vendrell1, E. García-Mengual1, M. Pérez Alonso1, 2.1Laboratorio de Citogenética Molecular. Unidad de Genética Reproductiva. Sistemas Genómicos. 2Departament de Genètica. Facultat de CiènciesBiològiques. Universitat de València




INTRODUCCIÓN:

La microscopía convencional nos permiteobservar los espermatozoides a 400aumentos, no siendo visibles las vacuolaspresentes en algunos espermatozoides.

Con la introducción de la microscopía dealta magnificación es posible observar lamorfología de las organelas de losespermatozoides a 6600 aumentos,usando la óptica Nomarski, siendoClínicas Ginemed pionera en laadquisición del primer microscopio dealta magnificación en España.

Al realizar el test de fragmentación delDNA a los espermatozoides, debemosfijarlos previamente, por lo que nopodrían ser ya utilizados, en caso detener su DNA intacto, para realizar ICSI.

El objetivo de este estudio consiste encomprobar si existe relación entre lapresencia de vacuolas nucleares (enelevado número y/o de gran tamaño) yuna fragmentación del DNA espermáticoalterada.


Se analizaron 200 espermatozoides delas muestras seminales de 10 pacientesque llegaron de modo consecutivo anuestro laboratorio. Se les practicó eltest de fragmentación del DNA mediantela técnica SCD (Sperm ChromatinDispersión) con el kit Halosperm, adichas muestras en fresco y se evaluó lamorfología según criterio estricto deKrüger. Además se observaron bajomicroscopía de alta magnificacióncontabilizándose por un lado elporcentaje de espermatozoides sinvacuolas y con 2 ó menos vacuolaspequeñas y por otro el porcentaje deespermatozoides con más de 2 vacuolaspequeñas, una gran vacuola y núcleosaberrantes.

Se analizó mediante el programaestadístico SPSS versión 17, en cada unade las muestras, en primer lugar, larelación existente entre el porcentaje deespermatozoides que presentaban másde 2 vacuolas pequeñas, una granvacuola y núcleos aberrantes con lafragmentación del DNA, y en segundolugar con la fragmentación del DNA másla morfología espermática.

RESULTADOS:

En la comparación del porcentaje deespermatozoides que presentaban másde 2 vacuolas pequeñas, una granvacuola y núcleos aberrantes con lafragmentación del DNA, se obtuvo unajuste a la recta de mínimos cuadradosde un 44,6%. Si además de lafragmentación del DNA tenemos encuenta también la morfologíaespermática el ajuste obtenido fue de un46,7%.

Existe, por tanto, una relación linealentre el porcentaje de espermatozoidescon más de 2 vacuolas pequeñas, unagran vacuola y núcleos aberrantes conuna elevada tasa de fragmentación delDNA espermático. La morfologíaespermática nos permite hacer un mejorajuste, aunque por si sola no seríaconcluyente.

CONCLUSIONES:

La selección de espermatozoides sinvacuolas o con 2 ó menos vacuolaspequeñas mediante microscopía de algamagnificación es una herramienta muyútil que nos permitirá elegir aquellosque no tengan su DNA fragmentado conuna alta probabilidad, mejorando así losresultados de los ciclos de reproducciónasistida, sobre todo en aquellospacientes cuyas muestras seminalespresentan una tasa de fragmentacióndel DNA elevada.

017: RELACIÓN ENTRE LAS VACUOLAS NUCLEARES OBSERVADASPOR ALTA MAGNIFICACIÓN EN ESPERMATOZOIDES Y LAFRAGMENTACIÓN DEL DNA ESPERMÁTICO.

M. González, M. Dorado, M. Hebles, B. Migueles, L. Aguilera, F. Sánchez, J. A. Lara, A. Rodríguez, P. Sánchez.Clínicas GINEMED, Sevilla

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INTRODUCCIÓN:

En el laboratorio de Fecundación in vitrodel Institut Universitari Dexeus lacriopreservación en los ciclos de DGP serealiza en estado de blastocisto y desdeel año 2004 se incorporó de formarutinaria la técnica de vitrificación.

Los embriones diagnosticados comoanormales o sin diagnóstico concluyenteson también vitrificados y son donadospor las parejas a través deconsentimiento informado para serincluidos en el proyecto de investigación“Derivación de líneas de células madreembrionarias humanas (CME) a partir deembriones anormales y caracterizaciónin vivo de su pluripotencialidad”, encolaboración con el Centro de MedicinaRegenerativa de Barcelona (CMRB).

El objetivo del presente estudio esanalizar los resultados obtenidos tras ladesvitrificación de los blastocistos noaptos para la transferencia en elprograma de DGP y su utilidad en laderivación de células madreembrionarias.


Durante el periodo de noviembre-2004a abril-2005, la vitrificación se realizómediante la utilización de medios“homemade” y con Hemi-strawinsertada en pajuela clásica comosoporte (Vanderzwalmen et al., 2003;Parriego et al., 2007) lo que evita elcontacto directo con el nitrógenolíquido. A partir del año 2005, elmétodo utilizado en nuestro centrosiguió basándose en la utilización de unsistema cerrado (HSV, Cryobiosystem) ymedios comerciales Irvine Scientific(USA). Tras la desvitrificación, losblastocistos se mantuvieron en cultivoun mínimo de 4 horas para evaluar susupervivencia.

Los blastocistos o grupos celularessupervivientes fueron sembradosdurante las 24-72 horas siguientes sobreuna monocapa de fibroblastos humanospara la obtención de células madreembrionarias, mediante la metodologíadescrita anteriormente (Aran et al.,2009).

RESULTADOS:

Se han desvitrificado un total de 103blastocistos con una tasa derecuperación de 82.5% (85/103). De los85 embriones recuperados sobrevivieronun total de 60 (70.6%). Se hanobservado diferencias estadísticamentesignificativas en cuanto a lasupervivencia en función de lamorfología del blastocisto previo a lavitrificación, estableciéndose tresgrupos (Blastocisto incial/expandido,blastocisto hatching y blastocistohatched), obteniéndose unas tasas desupervivencia del 87.8% (29/33),

68.3% (28/41) y 27.3% (3/11)respectivamente. También se observaron diferencias estadísticamentesignificativas en cuanto a lasupervivencia entre el grupo de medios“homemade” y el método comercial(44.7% versus 91.5%).

Se sembraron un total de 37 blastocistosy 8 grupos celulares a partir de los cualesse obtuvo una línea de CME.

CONCLUSIONES:

Se obtiene una tasa de supervivenciaadecuada al utilizar un método devitrificación mediante sistema cerradoque evita posibles contaminaciones.Este método es de especial interés parala criopreservación de blastocistosprocedentes de embriones biopsiadosque presentan una mayor vulnerabilidada la criopreservación. La diferenciaobtenida en función del método

utilizado podría ser debida a la curva deaprendizaje que requiere la técnica devitrificación.

La baja tasa de derivación observadapuede ser debida a la utilización deblastocistos de baja calidad, portadoresde anomalías cromosómicas en unelevado porcentaje de casos, como ya seha descrito por diversos autores.

La obtención de líneas de CME afectasde anomalías genéticas derivadas apartir de este tipo de embriones suponeuna fuente ilimitada de células para elestudio de los mecanismos molecularesde patologías y el desarrollo de posiblesterapias celulares.

018: BLASTOCISTOS VITRIFICADOS PROCEDENTES DE DIAGNÓSTICOGENÉTICO PREIMPLANTACIONAL (DGP) COMO FUENTE PARA LADERIVACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS (CME)

M. Solé, B. Aran, M. Parriego, I. Rodríguez-Pizà, J. Santaló, M. Boada, B. Coroleu, A. Veiga.Institut Universitari Dexeus y Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona




INTRODUCCIÓN:

El SGP ofrece ventajas a los pacientesque se someten a técnicas de FIV, ya queevita la transferencia de embriones conaneuploidías letales. El SGP empleandola técnica de FISH presenta unalimitación importante ya que sólo 9cromosomas pueden ser analizados. Estalimitación afecta tanto al diagnóstico,algunos embriones aneuploides sondiagnosticados erróneamente ya quetiene aneuploidías para otroscromosomas que no están incluidos enel test, así como a la indicación ya queen determinados casos (fallos deimplantación) otros cromosomaspodrían estar implicados. Por todo ello,las estrategias que se emplean para ladetección de aneuploidías en célulaúnica van encaminadas a incrementar elnúmero de cromosomas a estudiar.

La SC CGH (Hibridación genómicacomparada en célula única) es unatécnica que permite obtener el cariotipomolecular de una sola célula. Elinconveniente principal y limitante de latécnica es el tiempo. Nuestro objetivoconsiste en aplicar la técnica MDA(Amplificación por desplazamientomúltiple) para obtener suficientescantidades de ADN y poder reducir eltiempo de hibridación, que limita latécnica. Consiguiendo obtener eldiagnóstico sin necesidad decriopreservar los embriones, de modoque en el mismo ciclo se realizaría latransferencia embrionaria consiguiendono afectar a la viabilidad y capacidad

implantatoria del embrión.


Se emplearon líneas celulares euploides yaneuploides cultivadas. El cultivo celularse empleó para obtener el cariotipo, ADNe individualizar células. Se llevó a cabo laamplificación de todo el genoma (WGA) delas células individualizadas empleando latécnica de MDA. Como resultado del MDAse obtuvo ADN suficiente para amplificar,de la misma célula los polimorfismos dediferentes loci así como realizar lahibridación CGH. Para la reacción de CGHrealizamos el marcaje del ADN amplificadode una sola célula en verde y marcamos enrojo el ADN control. La hibridación serealizó a diferentes intervalos de tiempo.Posteriormente, se realizan los lavadosestándares y se observa al microscopio defluorescencia empleando DAPI comocontraste. Para la captura de las imágenesemplearemos el software Cytovision.

RESULTADOS:

Empleamos células con aneuploidías queafectaban a los autosomas (trisomías 15,16, 18 y 21), así como a los cromosomassexuales. Se amplificó el ADN y medianteel análisis de polimorfismoscomprobamos el origen de la célulaanalizada. Posteriormente mediante elprotocolo optimizado de SC CGHanalizamos una media de 15 metafasespor tipo celular. Capturamos cadafluorocromo de forma independiente eintegramos los niveles de fluorescencia. Elresultado final se representa junto al

ideograma de cada cromosoma. Pudiendoidentificar regiones cromosómicasduplicadas/seleccionadas mediante unavariación en el ratio 0.8 – 1.2. Se hanevaluado diferentes cantidades de ADN asícomo tiempos de hibridación. Para lascondiciones óptimizadas, en todos loscasos se pudo establecer el cariotipocelular. Todos los cromosomas estabanbien representados salvo las regionescentroméricas y teloméricas.

CONCLUSIONES:

Mediante la CGH se obtiene unarepresentación de todos los cromosomaspudiendo identificar ganancias opérdidas. Por tanto, la CGH es unaherramienta diagnóstica muyprometedora al poderse aplicar a unasola célula. Ya que permitiría detectarcualquier aneuploidía cromosómica enparejas con riesgo de embrionesaneuploides como portadoras dealteraciones cromosómicasestructurales. Mediante la metodologíadescrita evaluamos la fiabilidad,sensibilidad y limitaciones de este nuevoprotocolo de SC CGH para poder estudiarla totalidad de cromosomas en una únicacélula y para utilizarse esta metodologíacomo alternativa a la FISH en el SGP deembriones. Nuestro siguiente objetivoes aplicar la SC-CGH en SGP y conseguirtransferir embriones euploides,incrementando de este modo lacapacidad implantatoria del embrión asícomo disminuir las tasas de aborto.

019: HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA EN CÉLULA ÚNICA (SCCGH): NUEVA HERRAMIENTA PARA EL SCREENING GENÉTICOPREIMPLANTACIONAL (SGP)

B. Lledó1, J. A. Ortiz1, R. Morales1, R. Bernabeu2.1Instituto Bernabeu Biotech, 2Insituto Bernabeu, Alicante

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INTRODUCCIÓN:

Numerosos estudios han descrito elevadastasas de embriones cromosómicamenteanormales en parejas con infertilidadmasculina severa, con incremento de anomalías numéricas en susespermatozoides. Con el objetivo deofrecer un mejor consejo genético a estasparejas, hemos evaluado el efecto de losdos tipos más frecuentes de anomalíascromosómicas en espermatozoides(disomía de cromosomas sexuales ydiploidía) en el contenido cromosómico deembriones en día 3 de desarrollo.


En este estudio retrospectivo decohortes, realizado entre Julio de 1999y Diciembre de 2007, se analizaron losresultados de 73 ciclos de DiagnósticoGenético Preimplantacional (DGP)para estudio de aneuploidías en 55parejas con infertilidad masculinasevera y cariotipo normal, en las queun estudio de FISH (Hibridación in situfluorescente) en espermatozoidesprevio había revelado un incrementode anomalías cromosómicas numéricasal compararlos con 14 donantes fértilesnormozoospérmicos. Para valorar elimpacto en el embrión de las anomalíasobservadas en los espermatozoidesconsideramos dos grupos de estudio:

- Grupo 1: 46 ciclos de DGP en 37 parejascon un incremento únicamente deespermatozoides con disomía para loscromosomas sexuales.

- Grupo 2: 27 ciclos de DGP en 18 parejascon un incremento únicamente deespermatozoides diploides.

Como grupo control de DGP se incluyeron28 parejas fértiles con cariotipo normal,en las que se realizó DGP por enfermedadligada al sexo (33 ciclos). La edad de lamujer fue ≤37 años en todos los grupos.

Para el estudio de FISH en

espermatozoides, las muestras se fijaroncon metanol:ácido acético glacial (3:1), seextendieron en portaobjetos y se realizóuna hibridación dual para los cromosomas13 y 21, y una hibridación triple para loscromosomas 18, X e Y. (Vysis Inc. DownersGrowe, IL, USA). Para el DGP, se realizóbiopsia en el día 3 de desarrollo. Losnúcleos se fijaron utilizando el método deTarkowski modificado y se analizaron loscromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y en dosrondas de hibridación consecutivas (VysisInc.). Se realizó Chi-cuadrado y test exactode Fisher con la corrección de Bonferroni,considerando estadísticamente significativos valores de p<0,05.

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

Un incremento de disomías sexuales ydiploidías en los espermatozoides serefleja en una elevada producción de embriones cromosómicamente

anormales. Sin embargo, el tipo dealteraciones que se observan en losembriones difiere según las anomalíasdetectadas en los espermatozoides:

los varones con espermatozoides condisomía para los cromosomas sexualesproducen mayoritariamente embrionesaneuploides, así como una elevadaincidencia de embriones potencialmenteviables con anomalías sólo para loscromosomas sexuales.

los varones con espermatozoidesdiploides tienen un incremento deembriones triploides, alteraciones noviables relacionadas con abortos.

Por tanto, los estudios de FISH enespermatozoides pueden resultar deutilidad para ofrecer asesoramientoreproductivo más personalizado enparejas con infertilidad masculina severa.

020: CORRELACIÓN ENTRE LAS ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS OBSERVADASEN ESPERMATOZOIDES Y EN EMBRIONES PREIMPLANTATORIOS

L. Rodrigo, V. Peinado, E. Mateu, M. Milán, P. Mir, N. Al-Asmar, M. Gil-Salom, C. RubioInstituto Universitario - Instituto Valenciano de Infertilidad, IVI Valencia


Tabla 1. Correlación de anomalías cromosómicas en espermatozoides y embriones.

Tabla 2. Embriones con anomalías cromosómicas potencialmente viables.

Notas: SPZ= espermatozoides; EMB= embriones; *Hace referencia a disomía en espermatozoides y aaneuploidía en embriones;** Hace referencia a diploidía en espermatozoides y a triploidía en embriones;ap<0,05 comparado con los grupos control de espermatozoides o embriones.

a-bp<0,05



INTRODUCCIÓN:

Las anomalías durante el proceso demeiosis pueden producir gametosaneuploides. La meiosis masculina puedeestudiarse mediante análisis citogenéticode células germinales obtenidas porbiopsia testicular. Cuando la segregaciónmeiótica no es normal, losespermatozoides derivados de éstapueden producir embriones aneuploides.De ahí que se recomiende llevar a cabo unciclo de FIV-DPGI con el fin de seleccionarembriones euploides para la transferencia.Actualmente existe escasa informaciónque relacione alteraciones específicas enla meiosis con anomalías cromosómicas enlos embriones. El objetivo de este estudiofue determinar la relación existente entrelas anomalías cromosómicas encontradasal realizar DGPI y el tipo de alteraciónmeiótica observada para poderproporcionar un consejo genéticoadecuado a estas parejas.


Se incluyeron un total de 168 parejas enlas que se realiza un ciclo de FIV/FIV-DO -DGPI por meiosis alterada. Las alteracionesmeióticas se clasificaron en tres grupos enfunción del tipo de anomalía: Desinapsisde Bivalentes (DB); Mosaicismo (M)(existencia de dos líneas germinales unanormal y una alterada); y otrasalteraciones (O).Los embrionesprocedentes de estas parejas fueron

biopsiados en día 3 y se les realizó unestudio mediante FISH para 9cromosomas: X, Y, 13, 15, 16, 17, 18, 21, y22. El análisis estadístico utilizado fue elTest de Igualdad de Proporciones, siendoestadísticamente significativo cuando p<0.05

RESULTADOS:

De las 168 muestras de biopsia testiculardiagnosticadas como meiosis alterada seobtuvo la siguiente distribución: 78muestras tenían DB, 52 M y 38 O. La tasade embriones aneuploides fue del 46,2%en el grupo DB, 32,7% en M y 21,1% enel grupo O. No se encontrarondiferencias estadísticamentesignificativas entre los diferentesgrupos. Con relación al porcentaje deembriones anormales y al tipo deanomalía meiótica observada tampocose encontraron diferenciasestadísticamente significativas. La

tabla 1 resume los resultados del DGPIpara cada grupo de alteracionesmeióticas.

CONCLUSIONES:

Los resultados de este estudio muestranque (i) las anomalías sinápticas durantela meiosis dan lugar a un considerableporcentaje de embrionescromosómicamente anormales; y (ii) elpronóstico en estos pacientes nodepende del tipo de alteración meióticaencontrada y, por lo tanto, el consejogenético es independiente del tipo dealteración meiótica detectada. Estosresultados subrayan la importancia derealizar un ciclo de FIV-DGPI en parejascon meiosis masculina alterada.

021: ESTUDIO DE EMBRIONES CROMOSÓMICAMENTE ALTERADOSPROCEDENTES DE CICLOS DE FIV-DGPI Y SU RELACIÓN CON EL TIPODE ANOMALÍA MEIÓTICA

A. Colomar1, 3, S. Fernández1, 3, E. Toro1, 3, O. Serra1, F. Del Rio4, G. López4, M. Brassesco4, J. G. Álvarez2, M. López-Teijón1, 2, E. Velilla1, 3

1Institut Marquès, Barcelona; 2 Fundación Leonardo Marquès, Barcelona; 3Centro de Medicina Embrionaria, Barcelona, Madrid, 4 CIRH, Barcelona

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Tabla 1. Anomalías cromosómicas en embriones en día 3 vs. tipo de alteración meiótica.* test de igualdad de proporciones (p< 0.05)



INTRODUCCIÓN:

Las translocaciones Robertsonianas(TROB) son una de las reorganizacionescromosómicas más frecuentes enhumanos (1,23/1000). Los portadoresde reorganizaciones pueden producirgametos desequilibrados y, enconsecuencia, tienen un riesgoaumentado de fallos de implantación,abortos espontáneos y descendenciacon cromosomopatías. Además, loscromosomas implicados en lareorganización muestranfrecuentemente regiones asinápticasdurante la meiosis I, lo cual puedeinterferir con la segregación normal deotros cromosomas, produciendo unefecto intercromosómico (EIC).

Objetivos: 1) estudiar el tipo desegregación en embriones de portadoresde TROB analizados medianteDiagnóstico Genético Preimplantacional(DGP) según: a) el sexo del portador, b)la edad materna (<38 vs. ≥38 años), c)el grupo al que pertenecen loscromosomas implicados (D, G); y 2)observar si existe efectointercromosómico (EIC) derivado de latranslocación.


Se estudiaron 452 embrionesprocedentes de 88 ciclos de FIV-DGP. Labiopsia y fijación de los núcleos serealizó en D+3 de desarrollo embrionariosegún protocolos estandarizados ennuestro laboratorio. Se realizóhibridación in situ fluorescente (FISH)sobre los núcleos y se estudiaron loscromosomas implicados en lareorganización según cada caso.

Para observar el EIC, se compararon 193embriones de parejas portadoras deTROB (35 ciclos) con 329 embriones depacientes control (46 ciclos)

procedentes de parejas fértiles, concariotipo normal, edad materna < 38años y que realizaron DGP porenfermedades ligadas al sexo. Se realizóFISH para cromosomas no implicados enla translocación (entre 4 y 8cromosomas).

Para comparar los datos obtenidos seutilizó el test de Fisher (Graph PadInstat 3).

RESULTADOS:

No se observaron diferenciassignificativas en la segregación de loscromosomas implicados en latranslocación entre mujeres y hombresportadores; entre mujeres según suedad; ni entre los dos grupos detranslocaciones analizadas (D-D y D-G).En general, se observó que lassegregaciones alternante y la adyacenteson las preferentes, sin existirdiferencias significativas entre ellas(40.19% vs. 43.78%, respectivamente).

En relación al estudio de aneuploidías enlos casos de TROB, se observó un mayorporcentaje de embriones aneuploides enpacientes portadores de TROB respectoal grupo control (39.90% vs. 21.07%,respectivamente; p<0.0001). Estosresultados podrían explicarse debido alEIC producido por la translocación. Elincremento de aneuploidías observadoes del 47.27% en embriones derivadosde pacientes portadores de TROB.

Se dividieron estos pacientes con EICsegún el sexo del portador de latranslocación observándose que cuandolos varones son los portadores, elnúmero de embriones normales esmayor que cuando lo es la mujer (56.31vs. 38.82%, respectivamente;p=0.0194). Finalmente, se ha observadoque si la translocación sólo implicacromosomas del grupo D, el porcentaje

de embriones euploides (sin EIC) esmayor que si la translocación implicacromosomas de los grupos D con G(59.37 vs. 39.00%, respectivamente;p=0.0065).

CONCLUSIONES:

En este estudio, los pacientesportadores de translocacionesRobertsonianas presentan un 40% deprobabilidades de tener embrionesnormales o equilibrados para loscromosomas involucrados en latranslocación. No obstante, se haobservado un incremento del 47% deaneuploidías en estos pacientesrespecto a la población control. Losvarones portadores de TROB presentanmenor porcentaje de aneuploidías quelas mujeres. La fusión de cromosomasdel grupo D produce menor EIC que lafusión entre cromosomas de los gruposD y G.

Recomendamos a pacientes portadoresde TROB realizarse un ciclo de FIV-DGPpara la translocación junto con un testde aneuploidías para descartar lasanomalías derivadas del EIC.

022: TRANSLOCACIONES ROBERTSONIANAS:ESTUDIO DE SEGREGACIÓN Y EFECTO INTERCROMOSÓMICOEN EMBRIONES PREIMPLANTACIONALES.

A. R. Jiménez-Macedo, L. Rabinad, E. García-Guixé, C. Giménez, M. Sandalinas.REPROGENETICS SPAIN, Barcelona




INTRODUCCIÓN:

Se sabe que el huso meiótico es unaestructura subcelular muy sensible a lastemperaturas inferiores a 35º C. Losprocesos de criopreservación, como es lavitrificación, implican la exposición de losovocitos a temperatura ambiente por unperiodo prolongado de tiempo, con elconsiguiente efecto sobre la dinámicamicrotubular del huso. El objetivo de esteestudio fue valorar el efecto de losprocesos de vitrificación y desvitrificaciónsobre el huso meiótico, mediante elsistema de visualización con luzpolarizada Oosight® .


Se han incluído 47 ovocitos procedentes dedonantes con edad entre 18-35 años,sanas, con ciclos menstruales normales(21-35 días), con IMC normal (18-28Kg/m2). El análisis de los husos meióticosse ha realizado mediante microscopía deluz polarizada (Oosight®). Se hacuantificado la birrefringencia de losmismos previo a la vitrificación (fresco),durante el equilibrio (6min y 12 min),inmediatamente después de ladesvitrificación y tras 2 horas de cultivo “inVitro” a 37ºC y con 5,5% de CO2. Para lavitrificación se empleó el método Cryotop®. De los 47 ovocitos se han desvitrificado

20 ovocitos. Tanto la fase de equilibriocomo la de dilución de los crioprotectores,se realizaron a temperatura ambiente. Eltratamiento estadístico utilizado fuéUnianova para comparar medidasrepetidas (variaciones intragrupo), siendosignificativo cuando p<0,05; y de análisisde varianza univariante para compararmedias en distribución normal siendosignificativo cuando p<0,05.

RESULTADOS:

Las retardancias media, máxima ymínima de los husos meióticos a los6min y a los 12 min durante el equilibrio,e inmediatamente y a las 2 horas post-desvitrificación fueron:

CONCLUSIONES:

Los ovocitos no pierden los husosmeióticos en el equilibrio, durante lavitrificación. La depolimerización de lasfibras del huso ocurre en la fase dedilución de los crioprotectores durantela desvitrificación. Tras dos horas decultivo in vitro, tanto las mediciones deretardancia como la estimación del áreaque ocupa el huso son similares a lasobservadas en fresco, indicando que trasel proceso de criopreservación sereconstruye la estructura del husomeiótico mostrando parámetrossimilares a los observados previo a lavitrificación.

023: EFECTO DE LA VITRIFICACIÓN CON “CRYOTOP” SOBRE LACONFIGURACIÓN DEL HUSO MEIÓTICO “IN VIVO”

J. F. Zulategui, M. J. de los Santos, V. García, A. Galán, J. L. Romero, A. C. CoboIVI, Valencia

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Diferentes superíndices indica diferencias significativas



INTRODUCCIÓN:

La criopreservación de ovocitos permitepreservar la fertilidad en pacientes quepor diversas etiologías pueden sufrir unfallo ovárico prematuro. Los protocolosde congelación/descongelaciónconllevan una reducción lenta de latemperatura en el tiempo, resultando enel daño irreversible de estructurasvitales de los ovocitos. Losmicrotúbulos, que conforman el husomeiótico, y los microfilamentos,localizados en el córtex ovocitario, sonmuy susceptibles a la temperatura deenfriamiento (chilling) y a la exposicióna los crioprotectores. Una alineacióncromosómica incorrecta previa a laextrusión del corpúsculo polar puedeconducir a una segregacióncromosómica alterada, fecundaciónanómala y/o a una elevada incidencia deaneuploidías. La técnica de vitrificacióncombina tasas de enfriamientoultrarrápidas (23.000ºC/min) yconcentraciones elevadas decrioprotectores, aumentando lasupervivencia ovocitaria y la integridadde sus estructuras vitales. El objetivo fueevaluar el efecto de nuestro protocolo devitrificación sobre la integridad del husomeiótico y la organización cromosómicaen ovocitos humanos metafase II.


Se vitrificaron un total de 12 ovocitosprocedentes de pacientes incluidas en elPrograma de Fecundación in vitro delInstituto de Medicina Reproductiva(IMER) de Valencia que firmaron elcorrespondiente consentimientoinformado. Como grupo control(ovocitos no vitrificados), se incluyeron6 ovocitos procedentes de pacientesincluidas en el Programa de Fecundaciónin vitro de la Unidad de Reproducción delHU La Fe de Valencia, previa firma del

consentimiento de participación en unProyecto de Investigación desarrolladoen el Centro de Investigación PríncipeFelipe de Valencia (CIPF).

Para los procesos devitrificación/desvitrificación se empleóel protocolo descrito por Kuwayama ycols. (2005), comercializado por IrvineScientificÔ (Vit KitÔ-Freeze/Thaw) con elCryoTipÔ como contenedor. Tras ladesvitrificación se evaluaron la tasa desupervivencia y apariencia morfológicatras 4 horas de cultivo in vitro, valoradacomo integridad de la membranaplasmática y aspecto del ooplasma.Posteriormente, se realizó tincióninmunocitoquímica del huso meióticosiguiendo el protocolo descrito por Lin ycols., 2008, y se visualizaron pormicroscopía confocal (Servicio deMicroscopía Confocal, CIPF).

RESULTADOS:

Se vitrificaron/desvitrificaron un totalde 12 ovocitos metafase II. La tasa desupervivencia fue del 91,6% (11/12).Los que sobrevivieron mostraron unaapariencia morfológica normal tras 4horas de cultivo in vitro. Se fijaron untotal de 10 ovocitos metafase IIdesvitrificados y 6 ovocitos metafase IIno vitrificados (grupo control). Seconsideró una configuración normal delhuso meiótico a (1) una estructura enforma de barril, con polos ligeramenteseñalados y cromosomas formando ungrupo ordenado en el ecuador (placametafásica) cuando el complejohuso/cromosomas estaba orientadoparalelo al plano focal o a (2) unaestructura circular si el complejo estabaorientado perpendicular al plano focal.La configuración anómala del husomeiótico quedó representada por unadesorganización parcial o completa delos microtúbulos. Se consideró una

configuración cromosómica normalcuando los cromosomas se mostraronorganizados en el ecuador del barril(placa metafásica) o en un círculodependiendo del plano focal, y anormalcuando se observó dispersióncromosómica o apariencia cromosómicaaberrante o poco condensada(Vanhoutte y cols., 2007). El porcentajede ovocitos informativos fue del 100%para el grupo control (6/6) y del 70%(7/10) para los desvitrificados. Laproporción de ovocitos con unaconfiguración del huso meiótico normaly una alineación correcta de loscromosomas fue del 100% (6/6) paraovocitos no vitrificados (grupo control)y del 85,7% (6/7) para ovocitosdesvitrificados, resultados similares alos descritos en la bibliografía.

CONCLUSIONES:

La vitrificación de ovocitos, utilizandolos contenedores cerrados CryoTipÔ, esuna técnica eficaz, rápida y segura encuanto que mantiene la integridad delhuso meiótico, de la placa metafásica ydel anillo de microfilamentos tras sucriopreservación.

024: EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LAESTRUCTURA DEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓNCROMOSÓMICA EN OVOCITOS HUMANOS EN METAFASE II.

C. C. Duque1, J. Alfonso2, R. P. Cervera3, A. Monzó1, 2, V. Montañana1, 2, R. Moreno3, M. Stojkovic3 , A. Romeu1, 2.1Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER),Valencia. 3Laboratorio de Reprogramación Celular, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), Valencia.




INTRODUCCIÓN:

La maduración oocitaria consta de dosperiodos: 1) reanudación de la meiosis yprogresión a MII; 2) periodo desecuestro en MII hasta la activación.

Determinar el momento exacto en que seexpulsa el primer corpúsculo polar (1CP)podría hacerse mediante valoracionesperiódicas, lo que probablemente afectaal desarrollo además de ser time-consuming.

Con esta comunicación presentamos losprimeros estudios de dinámica demaduración en tiempo real mediantetecnología de análisis de imagenasociadas al cultivo (Embryoscope) paradefinir el momento exacto en que las VGprogresan con la rotura de la envolturanuclear (GVBD, Germinal vesiclebreakdown) y finalmente a MII. Tambiénevaluamos el efecto del envejecimientoin vitro de los MII sobre la competenciacitoplasmática.


Se incubaron 41 VG durante 48hr en 25μlde CCM en placas proporcionadas porBioSense mediante cultivo en elEmbryoscope. Se registraron imágenesde cada oocito en 9 planos diferentescada 15 minutos. El visionado yescrutinio manual de los registrospermitió anotar el tiempo real de GVBDy extrusión del 1CP. Los resultados seanalizaron con SPSS 17.0.

El efecto del tiempo de maduración eincubación previa a la activación sobrela competencia citoplasmática seestudió sobre 129 MII, obtenidos tras24hr ó 48hr de cultivo, activándose endos tiempos (grupo a0: activadosinmediatamente -jóvenes- y a1: tras 12-24hr de cultivo –envejecidos-). La

activación consiste en incubar enionóforo de calcio (A23187; 5mM/L)durante 5 minutos, seguido de 4-5hr enpuromicina (10μg/mL). Tras 16-20hr, seevaluó la respuesta de activaciónmediante presencia pronuclear.

RESULTADOS:

Tras 24hr de maduración, 65.8% de lasVG progresa a MII y 7.3% necesita42.7±2.4hr, observándose una tasaglobal de maduración nuclear del 73.2%.

a,b p<0.05

Las imágenes muestran que tras 4.4±4.6horas, las VG experimentan GVBD y semantienen secuestrados en MI durante11.5±5.9hr (VG a MII: 14.9±4.3hr).

No existen diferencias en las tasas deactivación a0 y a1 madurados en lasprimeras 24hr de cultivo (66.3%;p=0.668). En cambio, la tasa deactivación es mayor en a1 que en a0cuando MII se alcanza tras 48hr demaduración (69.2% vs. 6.7%;p=0.00228).

En los oocitos activados en a0, la tasa deactivación es significativamente mayoren los que maduran en las primeras 24hr(67.4% vs 6.7%; p=0.00003). En cambio

los activados en a1, responden igualindependientemente del momento demaduración (promedio 67.6%).

CONCLUSIONES:

Extender el periodo de maduración másallá de 24hr no incrementasignificativamente las tasas demaduración nuclear (65.7% vs 73.2%).

El Embryoscope permite determinar elmomento de reanudación de la meiosis

(GVBD:4.4±4.6hrs), así como el iniciodel secuestro meiótico en MII(11.5±5.9hr).

Los oocitos madurados in vitro durantelas primeras 24hrs son competentes

citoplasmáticamente (66.3%); losmadurados durante las siguientes 24horas parecen requerir de un periodo decultivo in vitro adicional al demaduración (envejecimiento) paraadquirir una competencia citoplasmáticacomparable a la de los primeros.

Estudios orientados hacia la dinámica demaduración en tiempo real porEmbryoscope permitirán optimizar lacompetencia oocitaria.

025: ESTUDIO MEDIANTE EMBRYOSCOPE DE LA MADURACIÓNNUCLEAR DE OOCITOS VG RECUPERADOS DE CICLO ESTIMULADO.EFECTO DEL ENVEJECIMIENTO OOCITARIO IN VITRO SOBRE LACOMPETENCIA CITOPLASMÁTICA.N. Grau, L. Escrich, T. Viloria, P. Gamiz, M. Borges, M. J. EscribáLaboratorio de Embriología Clínica. IU-IVI. IVI Valencia.

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INTRODUCCIÓN:

La Resonancia Magnética Nuclear (RMN)es una técnica basada en las propiedadesde los núcleos atómicos sometidos a uncampo magnético que proporciona unespectro que contiene informaciónestructural y de composición de lamateria así como datos cualitativos ycuantitativos. La RMN permite ladetección de trastornos metabólicos yuna distinción de gran variedad decomponentes orgánicos de manera quepuede proporcionar los perfilesmetabólicos de tejidos y biofluidos comopuede ser el líquido folicular.

OBJETIVO:

Determinar diferencias metabólicas enlos líquidos foliculares de mujeressometidas a ciclos de estimulaciónovárica convencional (EOC) frente a losciclos naturales comparando losespectros obtenidos por RMN de altaresolución. Analizar la influencia de lasgonadotropinas aportadas en los ciclosde EOC en el metabolismo de la glucosa yla producción de lactato.


Se realiza un estudio prospectivo decohortes emparejado que incluye untotal de 84 pacientes sometidas a laaspiración del líquido folicularutilizando únicamente el líquidoindependiente del primer folículo pre-ovulatorio encontrado. 39 fueron ciclosestimulados y 45 ciclos naturales. Laedad media en los dos grupos deestimulación fue de 32 años.

Los espectros de RMN fueron obtenidosprincipalmente en un espectrómetroBruker Avanç 600 MHz (14.1T) equipadocon una sonda QXI 1H/13C/15N/31P de5mm a una temperatura de 298 K.

Se realizaron experimentos de RMNmonodimensionales con atenuación dela señal del agua, presaturación yexperimentos Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG) spin-echo que fueron llevados acabo con un tiempo de echo total de136ms. CPMG usa las diferentespropiedades de relajación basadas en eltamaño de las moléculas, de este modo,se eliminan las resonancias de lasmacromoléculas. En este tipo deespectros, sólo las señales de losmetabolitos más pequeños o moléculascon grupos muy móviles (T2 largo)pueden ser observadas y la línea base esmejorada.

También se realizó un Análisis deComponentes Principales (PCA).Ninguna diferencia significativa fueobservada cuando los espectros fueronanalizados a través de la integración delas 200 o 500 bandas o de picos bienseparados en los espectros CPMG.

Se estudiaron metabolitos estrechamenteconectados entre si como son la glucosa,lactato, acetato, acetoacetato -hidroxibutirato y piruvato y que sonimportantes en las rutas energéticas delfolículo. Las correlaciones entre estosmetabolitos fueron analizadas a través dela integración de picos bien separados enlos espectros CPMG a TE 136 ms.

RESULTADOS:

Todos los espectros obtenidos,mostraron una resolución y ratioseñal/ruido adecuados.

Tanto en los ciclos estimulados como enlos naturales una correlación linealnegativa puede ser observada entrelactato y glucosa, acetato y –hidroxibutirato, mientras que lacorrelación entre la glucosa y el acetato,piruvato y acetoacetato es positiva.

Sin embargo en los ciclos estimuladosexiste una correlación positiva entre ellactato y piruvato, lo cual indica laexistencia predominante de una rutaaeróbica; mientras que en los ciclosnaturales existe una correlaciónnegativa, propio de una ruta anaeróbica.Además observamos un aumento de laconcentración de LH en el líquidofolicular de los ciclos naturales lo cualconlleva a una mayor acumulación delactato.

CONCLUSIONES:

El análisis de los líquidos folicularesmediante RMN de alta resolución,proporciona un perfil de correlacionesde los metabolitos más importantes enlas rutas energéticas, distinto entre losciclos naturales y estimulados. Lasgonadotropinas afectan a la glicólisis delas células de la granulosa del ovocito.

026: METABOLÓMICA DEL LÍQUIDO FOLICULAR PROCEDENTE DECICLOS NATURALES Y ESTIMULADOS MEDIANTE RESONANCIAMAGNÉTICA NUCLEAR DE ALTA RESOLUCIÓN.

V. García-Laez, E. Piñero-Sagredo, M. J. de los Santos, V. Esteve, B. Celda.IVI Valencia, CIBER-BBN de la Universitat de Valencia y Dept. Química-Física de la Universitat de Valencia (Valencia).




INTRODUCCIÓN:

El estudio de la tasa de aneuploidías enovocitos es muy importante paraoptimizar la selección de donantes deóvulos. El screening de aneuploidíasmediante FISH en mujeres jóvenes se harealizado en ovocitos donados porparejas que se someten a tratamientosde infertilidad (Gutiérrez-Mateo et al.,2004; Fragouli et al., 2006); en ovocitosque han madurado in vitro (Gutiérrez-Mateo et al., 2006) o en embriones endía 3 procedentes de programas dedonación (Munné et al., 2006). Sinembargo, estos resultados no sonrepresentativos de las tasas basales deaneuploidías en óvulos de donantes. Elobjetivo de este estudio fue analizar latasa de aneuploidías en ovocitos dedonantes tras el análisis del primer ysegundo corpúsculo polar medianteFISH con el fin de (i) evaluar la tasabasal de aneuploidías existentes enovocitos procedentes de mujeres jóvenesy fértiles candidatas a ser donantes deóvulos; y (ii) establecer la importanciade introducir el estudio genéticopreimplantacional en el screening de lasdonantes. Hasta la fecha, tan sólo existeuna publicación que haya estudiado lasanomalías cromosómicas en donantesutilizando la técnica CGH (hibridacióngenómica comparada) (Keskintepe etal., 2007). Por lo tanto, esta es laprimera vez que se realiza un estudio delas tasas de aneuploidías en donantestras el análisis de los corpúsculos polaresmediante FISH.


En este estudio se incluyeron un total de16 ciclos de FIV procedentes delprograma de donación de ovocitos deInstituto Marquès. El rango de edad delas donantes fue de entre 20 y 31 años(media de 26,06) y se analizaron untotal de 106 ovocitos. Se realizó biopsia

del primer y el segundo corpúsculo polarentre 16 y 18 h después de lamicroinyección por ICSI y se procedió alanálisis mediante la técnica de FISH paralos cromosomas 13, 16, 18, 21 y 22según el protocolo descrito porVerlinsky, 2005.

RESULTADOS: De 85 ovocitos analizados,25 (29,4%) presentaron alteracionespara alguno de los cromosomasestudiados y 60 (70,6%) resultaronnormales. La tasa de ovocitos euploidesosciló entre un 20 y un 100% porpunción. La tasa de aneuploidíasencontrada en ovocitos de donante eneste estudio concuerda con la publicadapor Keskintepe et al. (2007) para losmismos cromosomas analizados. Debidoa la existencia de núcleos incompletosprocedentes de corpúsculos polaresfragmentados no se pudo obtener undiagnóstico en 21 ovocitos. Tan solo dosdonantes tuvieron un elevado número deovocitos aneuploides mientras que las14 restantes tuvieron una tasa deovocitos euploides del 78%.

CONCLUSIONES:

Según estos resultados, el 29,4 % de losovocitos de donantes son aneuploides y,por lo tanto, debería considerarse laposibilidad de realizar el estudio decorpúsculos polares en los programas dedonación de ovocitos. Esto permitiría (i)seleccionar las donantes con el mayorporcentaje de ovocitos euploides y (ii)evitar el uso de ovocitos aneuploides.

027: RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA TASA DE ANEUPLOIDIAS ENOVOCITOS DE DONANTE TRAS ANALISIS DEL PRIMER Y SEGUNDOCORPÚSCULO POLAR MEDIANTE FISH

E. Velilla1, 3, A. Colomar1, 3, S. Fernández1, 3, E. Toro1, 3, A. Casanovas1, O. Serra1, R. Olivares1, M. López-Teijón1, 2.1Institut Marquès, Barcelona; 2Fundación Leonardo Marquès, Barcelona; 3Centro de Medicina Embrionaria, Barcelona, Madrid.

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INTRODUCCIÓN:

El sistema cannabinoide está implicadoen la modulación de varias fases delproceso de reproducción (Wang et al.,2006). Hasta la fecha, en los tractosreproductores femenino y masculinosólo se ha descrito la presencia delendocannabinoide anandamida (Schuelet al., 2002), sugiriendo que, tanto elespermatozoide como el ovocito,podrían estar expuestos a esa sustanciaen su tránsito hasta producirse lafecundación (Schuel and Burkman,2005). La idea de la implicación delsistema cannabinoide en lareproducción se ha visto reforzada conla reciente descripción de los receptoresde cannabinoides CB1 y CB2 en losespermatozoides humanos (Rossato etaal, 2005; Agirregoitia et al., 2009).También es sabido que los cannabinoidesejercen su influencia, vía receptor, en lafase de implantación del embrión (Wanget al., 2006). Sin embargo, poco o nadase sabe del papel de los cannabinoidesen la maduración de los gametosfemeninos.

OBJETIVO:

El interés del presente trabajo deinvestigación se centra por una parte, enla detección de los receptores decannabinoides CB1 y CB2 en ovocitoshumanos y por otra, en la localización dedichos receptores en las diferentes fasesde maduración ovocitaria: vesículagerminal (GV), metafase I (MI) ymetafase II (MII). En este sentido, elpropósito de este estudio sería resolversi existe presencia de componentes deeste sistema cannabinoide en losgametos femeninos y en caso afirmativo,poder discutir la viabilidad de iniciar unavía de investigación, para conocer lainfluencia de los cannabinoides en lamaduración in vitro de ovocitoshumanos.


En el estudio se incluyeron ovocitos depacientes pertenecientes al programa dereproducción asistida (FIV/ICSI) de laUnidad de Reproducción Humana delHospital de Cruces. Estas pacientes sesometieron a un protocolo dehiperestimulación folicular controlada.La presencia de los receptores decannabinoides en los ovocitos se analizóa varios niveles mediante tres técnicas:1) RT-PCR (para la detección de losmRNA de CB1 y CB2), 2) Inmunoblotting(para la detección de las proteínas deCB1 y CB2) y 3) Inmunocitoquímica(para la localización celular de losreceptores CB1 y CB2 en las diferentesfases de maduración del ovocito).

RESULTADOS:

Los resultados de la PCR, el inmunobloty la inmunocitoquímica dejan enevidencia la existencia de los receptoresde cannabinoides CB1 y CB2 en losovocitos humanos. Por otra parte, lalocalización de cada receptor varía en lasdiferentes fases de la maduraciónovocitaria. Así, la distribución delreceptor CB1 es homogénea en ovocitosen fase MI, mientras que en las fases GVy MII la localización es periférica. Por elcontrario, el receptor CB2 aparecedistribuido de forma homogénea enovocitos en fase MII y sin embargo en lasfases GV y MI la localización del receptores periférica.

CONCLUSIONES:

La presencia de los receptores decannabinoides CB1 y CB2 en ovocitoshumanos, confirma la presencia de uncomponente imprescindible del sistemacannabinoide en ese tipo celular.Además sugiere una posible acción deestas moléculas, vía receptor, en lamaduración del gameto, tanto en el

ovario como en el tracto reproductorfemenino. Por otra parte, la distintalocalización de cada receptor en lasdiferentes fases de maduración nosindica que cada receptor podría tener unpapel diferente en ese proceso y portanto, cada uno sería necesario en fasesdiferentes de la maduración. Teniendotodo esto en cuenta, la continuación deeste trabajo se debería centrar encomprobar cuál es el papel madurativoque tienen los compuestoscannabinoides in vitro, ya que es posibleque pudieran ayudar a una maduraciónovocitaria controlada y dirigida en ellaboratorio de reproducción humana.

BIBLIOGRAPHY:

Wang et al. Endocrine Reviwes. 2006,27(5):427-448

Schuel et al. Chem Phys Lipids. 2002, 121(1-2):211-27

Schuel and Burkman. Biol Reprod. 2005,73(6):1078-86.

Rossato et al. J Clin Endocrinol Metab. 200590(2):984-91;

Agirregoitia et al. Fetil Steril. 2009. Inpress.

028: LOS OVOCITOS HUMANOS EXPRESAN LOS RECEPTORESCANNABINOIDES CB1 Y CB2 Y SU LOCALIZACIÓN VARÍA EN LOSDIFERENTES ESTADOS DE MADURACIÓN OVOCITARIA

L. Peralta*, E. Agirregoitia*, R. Mendoza**, A. Expósito**, R. Matorras**, N. Agirregoitia**Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina y Odontología UPV/EHU, Leioa, Bizkaia. **Unidad de Reproducción Humana, Hospital de Cruces UPV/EHU. Barakaldo, Bizkaia.



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C O M U N I C A C I O N E S P O S T E R



NTRODUCCIÓN:

Existe una asociación entre el número deovocitos fecundables y los resultadosglobales de FIV. La baja respuesta (BR) alas gonadotropinas frecuentementeresulta en cancelación del ciclo,reducción en la cantidad de embrionesdisponibles para la transferencia y menorprobabilidad de éxito. La posibilidad deacumular ovocitos procedentes de varios ciclos de hiperestimulación ovárica controlada (HOC) mediante lavitrificación, podría contribuir a paliar losefectos del bajo número de ovocitos y/oembriones. El objetivo de este estudio esevaluar el valor de la vitrificación deovocitos en casos de BR.


Estudio ambispectivo de cohorte, queincluye 135 pacientes BR (≤ 5 ovocitos)con una media de edad de 35,9±2,9 añossometidas a 304 ciclos de HOC. Losovocitos (N=417) provenientes de 172ciclos fueron vitrificados. Mientras quelos 575 ovocitos frescos provenientes de132 ciclos fueron añadidos a loscriopreservados, con el fin de acumular una cohorte mixta (N=992ovocitos), compuesta por ovocitosvitrificados/desvitrificados y ovocitosfrescos resultantes de diferentes ciclos

HOC (grupo 1). La tasa de embarazo enel grupo 1 fue comparada con la tasa deembarazo acumulada en un grupocontrol formado por 965 pacientes BR(edad media: 36,6 ± 3,6) (grupo 2). Eneste grupo, 60 pacientes (8,6%) sesometieron a un segundo ciclo HOC y 2 aun tercero (0.3%). El resto de pacientesdeclinaron someterse a un nuevo HOC.En el grupo 2 se calculó la tasa degestación acumulada tras la realizaciónde estos ciclos en fresco. La vitrificaciónde ovocitos fue llevada a cabo medianteel método de Cryotop®. Para el análisisestadístico se usó el software de análisisestadístico SPSS 12,0. El test de la t-student de dos colas y el test de 2 fueronusados para comparar valores medios yproporciones respectivamente.

RESULTADOS:

La media de vitrificaciones y ciclosfrescos fueron 1,3± 0,5 y 1,0±0,2respectivamente. Un total de 362 de 417(86,6%) ovocitos sobrevivieron tras lavitrificación. En el grupo 1 el porcentajede pacientes sometidas a más de un ciclode HOC fue del 100% mientras que en elgrupo 2 el 9,2% se realizó más de unciclo de HOC (p<0,05). En el grupo 1 serealizaron el 91,8% de las transferenciasmientras que en grupo 2 el 80,9% de laspacientes fueron transferidas (p<0,05).

La media de embriones transferidos fuede 2,0±0,6 vs. 1,4±0,3 respectivamente(p<0,05). La tasa de gestación para elgrupo 1 fue 50,8% mientras que en elgrupo 1 tras el 1º ciclo fue de 28,3%;21,6% para el 2º ciclo. En el 3er cicloninguna paciente resultó embarazada.Las tasas de implantación y abortofueron de 29,6% vs. 24,1% y 12,2% vs.13,7% respectivamente (NS). La tasa degestación/ciclo en el grupo 1 (50,8%)fue similar a la tasa acumulada obtenidaen el grupo2 (50,9%) (NS).

CONCLUSIONES:

La tasa de gestación conseguida alconstruir una cohorte más numerosa deen casos de BR mediante la vitrificaciónde ovocitos, es similar a la tasa degestación acumulada obtenida con ciclosconsecutivos en fresco. Sin embargo,todas las pacientes que han vitrificadoovocitos han tenido la oportunidad deconseguir un 50,8% de éxito, mientrasque en fresco solo el 9,2% tuvieron estaoportunidad, debido al alto porcentaje deabandono del tratamiento o la derivaciónal programa de ovo-donación. Por otraparte, esta estrategia anima a laspacientes a realizar el tratamiento consus propios ovocitos antes de desistir otomar esta otra alternativa.

INTRODUCCIÓN:

FoxJ2 es un factor de transcripción,perteneciente a la familia Fork Head,que actúa como activador de laexpresión génica de dos proteínas de

interacción celular, Cx43 y Cad-E.Teniendo en cuenta que los ratonestransgénicos de sobreexpresión de Foxj2presentan espermatogénesis aberrantee infertilidad, nos planteamos estudiarsi existe una relación similar entre la

infertilidad humana y la sobreexpresiónde FoxJ2. Con este objetivo, analizamoslos niveles de expresión de FoxJ2 enpacientes con trastornos de infertilidadsometidos a ART.

001: ACUMULACIÓN DE OVOCITOS EN BAJAS RESPONDEDORAS.¿EXISTE UN BENEFICIO?

D. Castelló, A. Mifsud, A. Galán, C. Albert, A. Tejera, A. CoboInstitut Universitari IVI-València

002: DIFERENCIAS DE GÉNERO: LA SOBREEXPRESIÓN DE FOXJ2 SEASOCIA CON FALLO SEVERO DE ESPERMATOGÉNESIS PERO NO CONFALLO DE FOLICULOGÉNESIS

P. Sánchez-Aparicio1; R. Ramos2; S. Muñoz2; A. Palomo3; C. Romero4; M. Nieto1; E. R. Hernández1

FivMadrid1, UAM1, Instituto de Ginecología y Reproducción, Drs. Ordás y Palomo3, e Instituto La Cigüeña4, Madrid




METODOS:

En este estudio analizamos los niveles deARNm de FoxJ2 en células de lagranulosa de 35 mujeres sometidas apunción folicular, y en tejido testicularde 20 varones sometidos a TESE. Comocontrol se incluyeron donantes de óvulosy pacientes vasectomizados. Paradeterminar los niveles de ARNm seutilizaron técnicas de RT-PCRcuantitativa en tiempo real.

RESULTADOS:

Nuestros resultados indican que FoxJ2se expresa en todas las muestrasanalizadas, aunque el número detranscritos varía entre dichas muestras.

En el caso de los varones, los niveles máselevados de FoxJ2 corresponden apacientes azoospérmicos que carecen deespermatozoides en tejido testicular. Enel caso de las pacientes femeninas, elnivel de expresión de FoxJ2 en lascélulas de la granulosa no muestraasociación alguna con el número deoocitos maduros obtenidos tras punciónfolicular. Sin embargo, niveles elevadosde FoxJ2 en las células de la granulosacorrelacionan de forma significativa conbaja probabilidad de gestación.

CONCLUSIONES:

Este trabajo revela que FoxJ2 estádiferencialmente expresado en lasgónadas masculinas y femeninas.

Además, la sobreexpresión de FoxJ2 seasocia a pacientes azoospérmicos confallo severo de espermatogénesismientras que en el caso de las mujeres laexpresión de FoxJ2 es independiente delproceso de la foliculogénesis. Sinembargo, resulta sorprendente observarque la sobreexpresión de FoxJ2 en lascélulas de la granulosa correlaciona conuna reducción significativa de laprobabilidad de gestación. Estos datosson consistentes con el fenotipo deinfertilidad previamente observado enratones transgénicos de sobreexpresiónpara Foxj2. En conclusión, la expresiónmodificada del factor de transcripciónFoxJ2 podría explicar, a nivel molecular,algunos trastornos de infertilidadhumana.

INTRODUCCIÓN:

La calidad del ADN espermático ha sidouna cuestión de interés desde losprimeros problemas prenatalesencontrados tras el ICSI en comparacióna la población general. Este problema esaun más preocupante en aquellosvarones con factor masculino severo,donde por diversos motivos laespermatogénesis no está completada.

Por otro lado, sabemos que el estrésoxidativo se ha relacionado con ambosaspectos; el factor masculino y en laintegridad del ADN espermático.Mediante este estudio pretendemosdeterminar la relevancia que laoxidación del ADN causada por losradicales libres en los espermatozoidesde origen testicular obtenidos mediantebiopsia.

MATERIAL Y METODOS:

Realizamos un estudio prospectivo

observacional en el que analizamos losespermatozoides testiculares de 57varones azoospermicos (de origenobstructivo y secretor) en los que serealizó una extracción espermáticamediante biopsia de testículo abierta yun posterior tratamiento dereproducción asistida utilizandoovocitos donados, permitiendo unaestandarización de la calidad ovocitariay reduciendo el sesgo introducido por lamisma. Una pequeña alícuota deespermatozoides testiculares fueapartada, suspendida en Etanol 70% yguardada a -80ºC para su posterioranálisis. Para medir la oxidación del DNAse utilizó el OXI DNA assay kit (OxiDNAAssay, Calbiochem, Barcelona, España),basado el la unión directa de unanticuerpo fluorescente a la 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-0HdG) unproducto de la oxidación por el ataquede los radicales libres. Además paradeterminar la ploidía de las célulastesticulares (y poder distinguir losdistintos tipos celulares de la línea

germinal) se realizó un marcaje doblecon Ioduro de Propidio. La doblefluorescencia individualmente en cadaespermatozoide mediante citometría deflujo (Coulter Cytometry, Hialeah, FL).Los datos obtenidos se expresaron comoporcentaje de espermatoizoidespositivos e intensidad de fluorescencia.

RESULTADOS:

En la siguiente tabla presentamos laproporción de células en función de suploidía y la proporción de célulasoxidadas en función de su ploidía, enpacientes con azoospermiaobstructiva(AO) y azoospermia secretora(AS).

Encontramos una relación estadísticamuy débil entre la Oxidación del ADN, lafecundación y los parámetrosembrionarios de calidad morfológicaexistentes tanto en los primeros días dedesarrollo (2-3) como en los últimos (5-6). En referencia al embarazo el análisis

120

003: EFECTO DE LA OXIDACION DEL ADN EN EL ESPERMATOZOIDEDE ORIGEN TESTICULAR SOBRE LA CALIDAD EMBRIONARIA Y ELEMBARAZO EN CICLOS CON OVOCITOS DONADOS

C. Aguilar, N. Garrido, S. García-Herrero, E. O´Connor, T. Viloria, M. MeseguerInstituto Universitario IVI Valencia




de curvas ROC reveló que la oxidación delADN no tiene poder predictivo para elembarazo siendo el área bajo la curva =0.496 (IC95% 0.331-0.661).

CONCLUSIONES:

En nuestro conocimiento, este es uno delos pocos trabajos dedicados al análisis

de factores moleculares enespermatozoides de origen testicular. Laespermatogénesis deficiente se vereflejada en un aumento de la oxidacióndel DNA espermático, actuando comoindicador de mala calidad espermática.No obstante las diferencias en losniveles de oxidación del ADN no parecenafectar sustancialmente a la calidad

embrionaria ni a las probabilidades deembarazo, siendo la maquinaria dereparación ovocitaria uno de los posiblesfactores que explicarían este efecto.

INTRODUCCIÓN:

Mediante FISH, técnica que se utiliza deforma rutinaria en el DiagnósticoGenético Preimplantacional (DGP),podemos conocer el número de copias decada cromosoma analizado. Se empleapara determinar si el embrión esportador de una anomalía cromosómicanumérica (alteraciones en el número de cromosomas) o estructural (translocaciones recíprocasy Robertsonianas, inversiones,deleciones) y para la selección del sexoembrionario en pacientes portadores deenfermedades ligadas a los cromosomassexuales. De este modo podemosdiferenciar entre embriones aneuploidesy embriones normales para loscromosomas estudiados antes de sertransferidos al útero materno. Los fallosde diagnóstico pueden variar según elcentro, encontrándose una tasa defalsos positivos y falsos negativos del1,5% y del 19% respectivamente.

Una de las complicaciones másfrecuentes son las falsas monosomías,las cuales pueden deberse a fallos dehibridación o al solapamiento deseñales. El objetivo de este estudio esanalizar qué porcentaje de monosomíasson reconfirmadas como tales tras larehibridación con sondas teloméricas, ycuáles resultan en falsas monosomías.


En total se reanalizaron 339monosomías de 271 embriones. Estosembriones proceden de 136 pacientesincluidos en el programa de DiagnósticoGenético Preimplantacional de la clínica.El estudio se ha realizado durante elperíodo de tiempo comprendido entreoctubre de 2008 y mayo de 2009.

RESULTADOS:

En 205 casos (60,5%) se confirmaron lasmonosomías, y en 134 casos (39,5%) las

monosomías eran falsas. Estosporcentajes varían dependiendo delcromosoma analizado, de modo quecuando analizamos las falsasmonosomías procedentes de señalesoriginadas por sondas centroméricas(cromosomas 15, 16, 17 y 18) elporcentaje de monosomías reales es deun 50,6%.

CONCLUSIONES:

Para la mayoría de los cromosomas, elreanálisis con sondas teloméricasmejora la eficacia del diagnósticomediante FISH y disminuye la tasa deerror, por lo que se recomienda el uso deestas sondas como estrategia de mejorade resultados tras el análisis de FISH.Esta recomendación toma especialimportancia cuando tratamos conmonosomías detectadas con sondascentroméricas.

004: EL REANÁLISIS DE EMBRIONES MEJORA LA EFICACIA DEL DGPMEDIANTE FISH

A. Liñán, M. Gaytán, R. Herrer, E. Mártinez, M. Ariza, D. Cernuda, F. Bronet.IVI Madrid



INTRODUCCIÓN:

El uso de componentes animales no esdeseable para la derivación de líneas decélulas madre embrionarias humanas(ESCh). Entre los diferentes métodos para laderivación de ESCh se encuentra el métodomecánico, que no requiere de la utilizaciónde dichos componentes.

Nuestro objetivo es describir el métodomecánico para la derivación de ESCh a partirde blastocistos vitrificados procedentes deun programa de Diagnóstico GenéticoPreimplantatorio (PGD).


Hemos utilizado 44 blastocistosvitrificados procedentes del programade PGD y donados a un proyecto deinvestigación.

Los blastocistos son desvitrificados ycultivados hasta que alcanzan el estadio“hatching” o “hatched”.

El aislamiento mecánico se realiza deforma manual bajo estereomicroscopioutilizando dos agujas de insulinaestériles (25G), una para sujetar elpreembrión por el trofoectodermopresionando sobre el fondo de una placay la otra para seccionar separando lamasa celular interna (ICM). Eliminamoslos restos de trofoectodermo utilizandopipetas pasteur estiradas. La siembra serealiza sobre fibroblastos fetaleshumanos inactivados con mitomicina Ccultivados con medio K-SR.

RESULTADOS:

Tras la desvitrificación de los 44blastocistos superaron el proceso 31(70,5%). Evolucionaron a estadio deblastocisto hatching/hatched 18(58,1%), observándose ICM biendefinida en 6 de ellos. Tras elaislamiento mecánico constatamosfijación en 5 casos, que se correspondencon blastocistos con ICM definida, y seobservó crecimiento en 3 de ellos.Actualmente tenemos 1 línea estable

en pase 60-70, las otras dos aún se encuentran en proceso decaracterización.

CONCLUSIONES:

El aislamiento mecánico de la ICM es unprocedimiento simple y rápido, libre dexenoproductos y ofrece buenosresultados. La calidad de la ICM de losblastocistos es una cualidad crítica parael éxito en el establecimiento de unalínea de ESCh. Con la introducción de lavitrificación, hemos obtenido una altaeficiencia en la obtención de líneas deESCh procedentes de embrionescriopreservados a los que se les harealizado biopsia embrionaria. Estanueva línea estable será la segunda quenuestro centro deposita en el BancoNacional de Líneas Celulares.

INTRODUCCIÓN:

El desarrollo de los métodos dediagnósticos no-invasivos para laendometriosis requiere biomarcadoresde enfermedad sensibles y específicos.

OBJETIVOS:

Describir el uso de aspirado endometrialde mujeres con y sin endometriosis como

una nueva muestra biológica paradescubrir biomarcadores.


Evaluamos diferentes perfiles proteicos deaspirados de mujeres con endometriosistemprana (n=14), endometriosisavanzada (n=32) y sin evidencias deenfermedad (sanas) (n=32) mediante gelbi-dimensional de electroforesis (2-DE).

El estudio de la validación de unbiomarcador se realizó en un cohorteindependiente (endometriosis tempranan=6 y endometriosis avanzada n=14,controles n=159).

RESULTADOS:

El análisis ha permitido identificar 31 proteínas con diferenciasestadísticamente significativas en su

005: DERIVACIÓN DE ESCH A PARTIR DE BLASTOCISTOSVITRIFICADOS

M. D. Lozano Arana1, C. Moya-Alarcón1, Y. Aguilera2, K. Hmadcha2, G. Antiñolo1.1Unidad clínica de Genética y Reproducción. H.H.U.U. Virgen del Rocío. Sevilla. 2Centro Andaluz de Medicina Regenerativa y Biología Molecular.Sevilla

006: IDENTIFICACIÓN DE UN MÉTODO NO INVASIVO ENENDOMETRIOSIS

1A. Ametzazurra, 1D. Nagore, 2R. Matorras, 2A. Expósito A, 2L. Crisol, 2F. Azpichueta.1Proteómica SL. Parque Tecnológico de Vizcaya (Derio) 48160 Vizcaya. 2Unidad de Reproducción Humana, Hospital de Cruces (Baracaldo).Vizcaya.

122



expresión. Las proteínas identificadasestán relacionadas con la señalizacióncelular, muerte celular y movimientocelular. Las diferencias observadas en laexpresión para 14-3-3 (transducción deseñal) y “moesin” (estructura delcitoesqueleto) fueron confirmadas en ungrupo independiente de pacientes con

endometriosis.

CONCLUSIONES:

El fluido endometrial representa unanueva herramienta para análisisproteómicos ofreciendo informaciónespecífica en la expresión de proteínas,

facilitando el descubrimiento debiomarcadores para la endometriosis.Los resultados aquí descritoscomplementan estudios proteómicosprevios, añadiendo nuevas proteínasrelacionadas con la endometriosis paraser validados como marcadores dediagnóstico.

INTRODUCCIÓN:

Los oocitos en estadio de vesículagerminal (VG), recuperados tras punciónfolicular en un ciclo de estimulaciónovárica son capaces de reanudarespontáneamente la meiosis y madurarhasta un nuevo secuestro meiótico enMII en una amplia variedad decondiciones y medios de cultivo,rindiendo generalmente tasassuperiores al 60% de maduraciónnuclear.

Por su parte, la maduracióncitoplasmática incluye en sí, lacapacidad oocitaria de reanudar elsegundo bloqueo meiótico y culminar lameiosis con la extrusión del primercorpúsculo polar (1CP) y la formaciónpronuclear ante un estímulo eficientede activación. Generalmente, dichoestímulo es el espermatozoide,reportándose tasas de fecundación deoocitos madurados in vitro comparablesa las obtenidas con oocitos maduradosin vitro (70-80%). Los preembrionesgenerados a partir de oocitosmadurados in viro presentan una laelevada incidencia de aneuploidías,debidas principalmente a unasegregación alterada de los cromosomasmaternos mas que al propioespermatozoide.

En esta comunicación presentamos laactivación partenogenética artificialcomo método diagnóstico de la

competencia citoplasmática oocitaria,alternativo a la fecundación in vitro;evitando así, la validación de unatécnica de dudosa eficacia mediante lageneración de preembriones sin unafinalidad propiamente reproductiva.


Un total de 129 oocitos MII,procedentes de VG maduradas in vitrofueron sometidos a un tratamiento deactivación partenogenética artificial.En síntesis, los oocitos MII seincubaron en 1mL de solución deionóforo de calcio (A23187; 5 mM/L)durante 5 minutos. Trascurrido estetiempo, los oocitos se transfirieron auna solución de puromicina (10 μg/mL)donde permanecieron durante 4-5horas.

Tras el tratamiento de activación, losoocitos se cultivaron overnight en hTF encondiciones estándar de cultivo (37ºC y5% CO2 en aire). Tras 16-20 horas, seevaluó la presencia del segundocorpúsculo polar y los pronúcleos. Losoocitos fueron considerados comoactivados cuando presentan al menos unpronúcleo (PN), independientemente dela extrusión del segundo corpúsculopolar (2CP).

Del mismo modo, como grupo control,activamos 25 MII madurados in vivo ydonados a investigación.

RESULTADOS:

Todos los oocitos MII madurados in vivo(control) activaron, presentandoademás una respuesta normal deactivación (1CP+2CP+1PN). Esteporcentaje de activación fuesignificativamente superior alobservado en los oocitos madurados invitro (59.7%; p<0.05).

CONCLUSIONES:

La activación partenogenética es unbuen método diagnóstico para el estudiode la competencia citoplasmática tal ycomo sugieren las tasas de activaciónobservadas en oocitos MII madurados invivo (100%). Esta nueva herramientadiagnóstica presenta como particularventaja permitir evaluar la competenciaoocitaria sin la generación depreembriones potencialmente viables.

Las condiciones de maduración en lasque se ha realizado este estudiopreliminar parecen ser insuficientes parauna completa y correcta maduraciónoocitaria, ya que las VG maduradas espontáneamente in vitroson citoplasmáticamente menoscompetentes que los madurados in vivo.


007: ACTIVACIÓN PARTENOGENÉTICA COMO MÉTODO DIAGNÓSTICODE LA COMPETENCIA CITOPLASMÁTICA

L. Escrich, N. Grau, D. Castelló, A. Galán, S. Pérez, M. J. EscribáLaboratorio de Embriología Clínica. IU-IVI. IVI Valencia.



INTRODUCCIÓN:

Desde la aparición de la nueva técnica decriopreservación de embriones conocidacomo vitrificación, son numerosos losestudios que tratan de comparar susresultados con los obtenidos mediante lacongelación convencional. Las bajas tasasde éxito de la descongelación lentapueden ser debidas a los efectosdeletéreos producidos por la formación decristales de hielo intracelulares durante elenfriamiento. La vitrificación, sinembargo, también puede producirlesiones ocasionadas por los cambiososmóticos y la toxicidad originada por laalta concentración de los crioprotectores.

Objetivo: Analizar los resultadosobtenidos mediante las dos técnicas decriopreservación embrionaria.


El estudio incluye 303 casos depacientes sometidos a un ciclosubstituido para la recepción deembriones congelados. En el laboratoriode FIV de IVI Barcelona la congelación

lenta fue sustituida por la vitrificaciónen el primer trimestre del 2008 ydurante el resto del año sedescongelaron embriones por ambos

métodos para realizar transferencias.

Las técnicas que utilizamos para ellofueron la descongelación lenta en la quese utilizan soluciones de 0.2M SAC y1.5M PROH para embriones de D3 y 0.4MSAC y 10% Glicerol para embriones deD5. En la desvitrificación se utilizó elprotocolo “Cryotop Safety Kit-Thawing”.

A todos los embriones descongelados endía 3 se les hizo eclosión asistida y

aspiración de células degeneradas en elcaso que las hubiera.

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

Gracias a la introducción de lavitrificación, el rendimiento obtenido enel programa de congelación embrionariaes claramente superior al obtenido conla congelación lenta ya que necesitamosmenos embriones descongelados parapoder realizar una transferencia yconseguir una gestación.

INTRODUCCIÓN:

El lavado del semen en varonesseropositivos para virus de la hepatitis Cy el virus de inmunodeficiencia humanapermiten la utilización exclusiva de lafracción móvil de los espermatozoidespara las técnicas de reproducciónasistida, eliminando de este modo loscomponentes seminales con demostradapresencia de los virus.

Así pues, el lavado del semen seguidodel estudio posterior de la presencia delvirus por técnicas de PCR, hace posibledescartar aquellas muestras en lascuales el lavado no ha tenido éxito yaplicar en los negativos, sin presenciaviral, la técnica de reproducción asistidaque más se ajuste a las características delos pacientes y del semen lavado. De estamanera se consigue no infectar a lamujer ni a la descendencia, lo cual está

avalado por los resultados de diferentesgrupos de investigación. El objetivo denuestro trabajo es determinarretrospectivamente la tasa de éxito en eluso de este tipo de muestras para poderproveer de la información adecuada a lospacientes en estos casos acerca de lasexpectativas de estos procedimientos.


008: COMPARACIÓN ENTRE DESCONGELACIÓN LENTA YDESVITRIFICACIÓN DE EMBRIONES. UN AÑO DE RESULTADOS.

M. Bellés, J. M. Molina, E. Bonilla, A. Múgica, M. Esbert, M. Florensa, M. Riqueros, A. Ballesteros, G. Calderón.IVI Barcelona

009: RESULTADOS EN PAREJAS SERODISCORDANTES AL VIH Y/OVHC CON EL VARÓN INFECTADO.

A. Mencías, C. Rico, Y. Márquez, P. Rodríguez, A. Zurilla, N. Garrido IVI, Valencia

124



Hemos analizado retrospectivamentenuestra experiencia de 8 años, en untrabajo descriptivo, identificando loscasos de varones seropositivos a VIH yVHC, entre más de 50000 historiasclínicas en la clínica IVI Valencia.

En estos casos, los lavados fueronrealizados mediante capacitación dobledel semen, primero mediante gradientesde densidad, y luego por swim-up. Lafracción resultante fue dividida en dosmitades iguales, una de las cuales fuecongelada para su futuro uso enreproducción asistida, y la otra analizadamediante PCR anidada, de altasensibilidad, para determinar la presenciade partículas virales. En aquellosprocedimientos en los que no se detectópresencia viral en el semen lavado, seiniciaron los tratamientos de reproducciónasistida. Los tratamientos de reproduccióna los que se sometieron las parejas, sedecidieron según la calidad del semen traslavado, así como las característicasginecológicas de la mujer, y básicamentese dividen en fecundación in vitro conóvulos propios, con óvulos donados, ytransferencia de embriones congelados.

RESULTADOS:

Se identificaron un total de 370tratamientos, de los cuales, 221 fueron

con ovocitos propios, 86 con ovocitosdonados y 63 con la transferencia deembriones congelados.

Se lograron 105 gestaciones (47.5% porciclo) con propios, 48 (55,8% por ciclo)con donación de óvulos, y 21 (33,3% porciclo tras transferencia de congelados).

En función de la infección, los resultadospueden verse en la Tabla 1.

No se ha reportado hasta la fecha unatransmisión horizontal o vertical en loseguimientos de los recién nacidos o susmadres.

CONCLUSIONES:

El lavado de semen para pacientes conVIH y VHC es una opción segura para lamujer y el futuro recién nacido, así comoeficaz dados los resultados obtenidos,ya que son comparables a los que sepresentan en fecundación in vitro porotras indicaciones.

INTRODUCCIÓN:

La tasa de implantación embrionaria esuna de las limitaciones de las técnicas dereproducción asistida. La capacidad deidentificar a los embriones con mayorcapacidad implantatoria dentro de unacohorte, permitirá incrementar las tasasde éxito de las TRA así como disminuirlos embarazos múltiples. Actualmente,la clasificación morfológica es la únicaherramienta no invasiva paraseleccionar aquellos embriones con

mayor capacidad implantatoria. Sinembargo, algunos de los embrionesconsiderados de buena calidad noimplantan y sí otros catalogados de peorpronóstico. La metabolómica es unareciente disciplina que analiza, a nivelcelular, el conjunto de los metabolitos(moléculas de bajo peso molecular deorigen no protéico, pj: ATP, aminoácidos,glucosa…etc.) que representa elfenotipo funcional. Recientes estudiossugieren que el perfil metabólico delembrión puede influir en su potencial. El

metabolismo del piruvato y lactato comoprincipal fuente de energía enembriones hasta día 3 no aportanresultados concluyentes. Por otro lado,se ha visto que el consumo de glucosa seve incrementado en embriones queevolucionan hasta estadío deblastocisto. En cuanto al metabolismode los aminoácidos, se ha observado unacorrelación inversa entre su consumo yla viabilidad embrionaria. Nuestroobjetivo ha sido desarrollar técnicasanalíticas capaces de identificar y


010: ANÁLISIS METABOLÓMICO NO INVASIVO DEL MEDIO DECULTIVO EMBRIONARIO MEDIANTE HPLC Y RMN.

B. Lledó1, J. A. Ortiz1, C. Pérez2, M. Pérez2, R. Gonsálvez-Álvarez3, E. Martínez-Sabater3, F. Marhuenda-Egea3, R. Bernabeu4.1Instituto Bernabeu Biotech, 2Instituto Bernabeu Cartagena, 3Instituto Bernabeu Alicante, 4Universidad de Alicante

Tabla 1.



cuantificar aquellos aminoácidosrelacionados con la capacidadimplantatoria del embrión.


Se empleó medio de cultivo embrionarioG1.3 (Vitrolife) para optimizar lastécnicas analíticas. Previo al HPLC-MS/MS las muestras fueron diluidas(espectrómetro de masas Agilent,modelo 5973 Network). La columna fueuna Luna 5μ SCX 100 Å. Las muestraspara RMN se filtraron previamente con elobjetivo de eliminar la HSA ya queinterfería en el resultado (filtro de 5kDa). Se llevó a cabo una espectroscopiade resonancia magnética nuclear 1H dealto campo utilizando un espectrometroBrucker 400 Mhz con una secuencia depulso especial para la eliminar la señal

del agua, acumulando 2000 scans pormuestra. Los patrones se realizaron apartir de soluciones de los aminoácidospresentes en el medio de cultivo adistintas concentraciones.

RESULTADOS:

Mediante RMN se obtuvieron diferentesespectros. La fase y la línea base secorrigieron manualmente y las señalesse asignaron empleando datos previos.En aquellos espectros realizados conmuestras sin filtrar no se pudóidentificar de forma reproducible losdiferentes componentes del medio. Trasel filtrado se consiguió identificar losaminoácidos que constituyen el mediopara posteriormente observar lasvariaciones de concentración. Lacromatografía de HPLC,MS/MS permitió

reconocer todos los aminoácidospresentes en el medio de cultivo, asícomo la cuantificación de los mismos,con una gran sensibilidad.

CONCLUSIONES:

Se ha desarrollado un método analíticopara la identificación y cuantificación delos aminoácidos presentes en los mediosde cultivo embrionarios. A partir deestos resultados hemos iniciado unproyecto con el objetivo de estableceruna relación entre el metabolismo de losaminoácidos en embriones en cultivo ylas tasa de implantación y embarazoevolutivo. De este modo se podrádisponer de una nueva herramienta noinvasiva para la selección de embrionescon mayor capacidad implantatoria.

INTRODUCCIÓN:

Objetivo: Comparar de forma prospectivay randomizada la eficacia de la selecciónembrionaria cromosómica y morfológicaen pacientes con fallo repetido deimplantación. Los dos tratamientos quese compararon en el estudio fueron:ciclos con transferencia de embriones enel estadio de blastocisto, pero sinanálisis cromosómico (Grupo A) y ciclos con Diagnóstico GenéticoPreimplantacional (DGP) para screeningde aneuploidías con transferencia en día5 (Grupo B).


Selección de pacientes:

- Criterios de inclusión: Pacientes < 40años, con ≥3 ciclos previos de FIV/ICSI singestación, con transferencia en fresco deal menos 1 embrión de buena calidad encada ciclo. Se realizó una asignaciónaleatoria por bloques: cocultivo (grupo A)

y DGP (grupo B). Se calculó un tamañomuestral de 100 pacientes en cada grupoconsiderando relevante una diferencia enla tasa de implantación evolutiva entrelos grupos de 10-15%, con una potenciadel 80% y un error del 5%.

- Estudio previo: Ecografía vaginal (yeventual histerosonografía) y si fueranecesario histeroscopia, cariotipos de lapareja y estudio de trombofilias(anticuerpos anticardiolipina (lupusanticoagulans, antitrombina III,mutación factor V Leiden, proteína C y S,homocisteína sérica, mutación MTHFR,mutación factor II).

- Criterios de exclusión: Cualquieralteración del estudio previo de fallo deimplantación, cualquier anomalíamorfológica uterina, aunque se trate deun simple pólipo, presencia dehidrosálpinx, una transferencia previadificultosa y pacientes con abortos oembarazos ectópicos previos.

Tipo de intervención:

- GRUPO A: cocultivo con transferenciaen día 5-6 sin DGP. El cocultivo se realizósiguiendo el protocolo convencionalcultivando los embriones con unamonocapa de células epiteliales deendometrio desde el día 2 al día 5-6 dedesarrollo embrionario.

- GRUPO B: cocultivo con transferenciaen día 5 y con DGP. La biopsiaembrionaria se realizó en el tercer día dedesarrollo embrionario y se analizaronlos cromosomas 13, 15, 16, 17, 18, 21,22, X e Y mediante hibridación “in situ”fluorescente (FISH). Las sondas de ADNutilizadas fueron las comercializadas porVysis (Vysis Inc., Downers Grove, Illinois,USA). Se realizó el estudio de los 9cromosomas en 2 rondas consecutivasde hibridación y con rondas adicionalesde hibridación para descartar falsasmonosomías e incrementar la eficienciadel diagnóstico mediante el uso de sondassubteloméricas o específicas de locus.

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011: ESTUDIO PROSPECTIVO Y RANDOMIZADO SOBRE LA UTILIDADDEL DGP EN PAREJAS CON FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN:RESULTADOS PRELIMINARESC. Rubio, L. Rodrigo, A. Mercader, M. J. de los Santos, J. Domingo, J. Remohí, A. PellicerInstituto Valenciano de Infertilidad IVI-Valencia



CONCLUSIONES:

El análisis intermedio de los resultadosobtenidos en el estudio muestra mejoresresultados en el grupo en el que serealizó DGP, con tasas de implantación yembarazos evolutivos por ciclo 15puntos superiores a las obtenidas en elgrupo sin DGP. Las diferencias actualescoinciden e incluso mejoran nuestrahipótesis de partida y de mantenerseestas diferencias entre los grupos,podríamos obtener diferenciasestadísticamente significativas a favorde la aplicación de DGP en este grupoconcreto de pacientes con un tamañomuestral inferior al inicialmentecalculado.

INTRODUCCIÓN:

La Maduración In Vitro (MIV) de ovocitospuede ofrecerse como una alternativa ala Fertilización In Vitro (FIV) adeterminados grupos de pacientes:mujeres con riesgo de hiperestimulaciónovárica y aquellas diagnosticadas deSíndrome de Ovario Poliquístico (SOP).

Aunque se han descrito tasas deimplantación y embarazo adecuadas enciclos MIV, éstas son inferiores a lasobtenidas después de ciclos FIV. Se tratade embriones de baja calidad,sugiriéndose la disrupción del husomeiótico de los ovocitos MIV comoorigen de anomalías cromosómicasrelacionadas con un inadecuadodesarrollo embrionario.

El objetivo ha sido analizar laconstitución nuclear y cromosómica deembriones derivados de ciclos MIV noaptos para su transferencia y/ocriopreservación. Se procedió a evaluarla incidencia y el tipo de anomalíascromosómicas.


Estudio prospectivo de 12 ciclos MIVrealizados en Institut Dexeus desdefebrero del 2008 hasta mayo del 2009.Siete pacientes diagnosticadas comoSOP siguieron ciclos espontáneos o deestimulación suave con rFSH. La punciónovárica se realizó a las 36 horas posthCG. Los ovocitos inmaduros secultivaron In Vitro durante 24-48 horashasta alcanzar el estadio de metafase II(MII). Sólo los ovocitos maduros fueronmicroinyectados (ICSI).

Embriones bloqueados, con altoporcentaje de fragmentación y/oblastómeros multinucleados seconsideraron como no aptos paratransferir o congelar. Un total de 32embriones se descartaron e incluyeronen el estudio.

Los embriones fueron disgregados paraanalizar individualmente cada célula. Seanalizó la constitución nuclear ycromosómica de los blastómeros,determinándose la dotación cromosómica

mediante Hibridación In Situ Fluorescentepara los cromosomas 13, 16, 18, 21 y 22.

Se analizaron 132 blastómerosprocedentes de 32 embriones de 8 ciclosMIV.

RESULTADOS:

Una media de 14.9 ± 8.2 ovocitos porciclo fueron recuperados de los 8 ciclosMIV. El día de la punción ovárica, 2ovocitos se encontraban en estadio MIImientras que 117 en estadio de vesículagerminal. De los ovocitos inmaduros, 87(74.4%) alcanzaron el estadio de MIItras su cultivo In Vitro. La tasa defecundación tras ICSI fue 69.7%.

Treinta y nueve de los 62 embrionescorrectamente fecundados (62.9%)fueron clasificados como no aptos parala paciente. Este porcentaje es superioral obtenido en nuestro programa de FIV(32.2%).

Se analizaron 132 blastómeros de 32embriones analizados. Veintiocho de las


NS: Fisher´s exact test (p<0,05* Se definió como evolutivo el embarazo en curso con más de 12 semanas.

RESULTADOS:

012: ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS EN EMBRIONES PROCEDENTESDE CICLOS DE MADURACIÓN IN VITRO.

D. Tuñón1*, M. Parriego1, G. Arroyo1, M. Boada1, R. Tur1, P. N. Barri1, A. Veiga1,2.1 Servicio de Medicina de la Reproducción. Departamento de Obstetricia, Ginecología y Reproducción. Institut Universitari Dexeus. Barcelona.2 Banco de Líneas Celulares. Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona. Barcelona.



células (21.2%) mostraron un úniconúcleo después de la fijación, 55 de losblastómeros (41.7%) mostraron más deun núcleo o fragmentos de cromatina, en39 casos se observó ausencia de núcleo(29.5%), en 9 casos (6.8%) presencia decromosomas y un único blastómero seperdió durante la fijación (0.8%). El81.3 % de los embriones presentabacomo mínimo una célula multinucleada.

Sólo 3/32 embriones (9.4%) fue normalpara los cromosomas estudiados y éstosprocedían de ovocitos madurados tras 24

horas en cultivo. Todos los embriones enlos que se analizó más de una célula ydiagnosticados como anormalespresentaban una dotación cromosómicaal azar, siendo clasificados comomosaicos caóticos (24/32, 75%).

CONCLUSIONES:

La gran mayoría de los embrionesdescartados de ciclos MIV mostraronanomalías cromosómicas severas,observándose una alta incidencia demultinucleación y mosaicismo.

Las anomalías cromosómicas podríanestar relacionadas con el bajo potencialde desarrollo embrionario y con la bajatasa de implantación obtenida en MIV.Convendría conocer la constitucióncromosómica de los embrionestransferidos y establecer la utilidad delscreening de aneuploidias en ciclos MIVen ciclos con un mínimo de embriones aanalizar.

INTRODUCCIÓN:

Las variantes cromosómicas observadasen los cariotipos, son regiones deheterocromatina visibles al microscopioque afectan a un número de individuos yque se relacionan con diversos procesospatológicos, incluida la infertilidad.

Según nuestros estudios, un 11,86% delos cariotipos de pacientes, noseleccionados, que acuden a nuestrocentro presentan variantescromosómicas identificables quepudieran interferir de algún modo en elproceso reproductivo. El objetivo denuestro estudio es relacionar lapresencia de estas variantes con laeficiencia de los ciclos de ICSI.


Estudio prospectivo de 81 ciclos de ICSIrealizados en nuestro centro en los quealgún miembro de la pareja presentavariantes cromosómicas y 169 ciclos depacientes sometidos a la misma técnicapero con cariotipos normales.

En estos ciclos, se ha obtenido la mediade ovocitos metafase II recuperados,tasa de fertilización, porcentaje de fallos

de fertilización, porcentaje deembriones de grado A transferidos y tasade gestación y aborto.

RESULTADOS:

Los resultados muestran que lasvariantes cromosómica mas frecuentesson las que afectan al cromosoma 9,presentes en un 73% de los casos (el37% en mujeres y el 36% en hombres) ,seguida de la 21ps+, en un 11% de ellos(el 7% en mujeres y en un 4% enhombres). El resto de variantes está enun porcentaje inferior al 10%.

En estos ciclos, la media de ovocitosmaduros recuperados tras la punción fuede 9,78, valor muy similar al de los ciclossin variante (11,44). La tasa defertilización es también muy similar(61,64% vs. 64%); sin embargo, elporcentaje de fallos de fertilización estámás elevado cuando los pacientespresentan un cariotipo con variable queen los casos de cariotipo normal (14,8%vs. 8,30). La tasa de embriones con altopoder implantatorio transferidos en día+3 es muy inferior en los ciclos concariotipos alterados que en los ciclos concariotipo normal (48% vs. 77,78%); encuanto a la tasa de embarazo por ciclo,

observamos que es del 31,25% cuandoexiste alteración frente a un 43,09% enel resto de pacientes sometidos a lamisma técnica. La tasa de aborto es del15% y 9,75%, respectivamente.

CONCLUSIONES: Los resultadosmuestran que si bien el número deovocitos y tasa de fertilización es similaren ambos grupos, existe una mayor tasade fallos de fertilización en los ciclos enlos que uno de los miembros de la parejapresenta una variante cromosómica enel cariotipo. Además, en los ciclos convariantes de la heterocromatina, segeneran y transfieren un menorporcentaje de embriones de grado A, loque podría explicar la menor tasa deembarazo y mayor de aborto que hay enestos ciclos.

Por tanto, y aunque no podemos conocerel modo en que la presencia de estasvariables pueda afectar laembriogénesis, si observamos que losresultados de los ciclos de ICSIempeoran cuando existe algunavariante, sobretodo, en cuanto a fallosde fertilización y calidad embrionaria ypor consiguiente, a la tasa de embarazo.

128

013: LAS VARIANTES CROMOSÓMICAS AFECTAN LAS TASAS DEÉXITO EN PACIENTES SOMETIDAS A FIV-ICSI.

M. Poveda1, L. Gil1, T. Rubio3, J. M. Moreno1, J. J. López-Gálvez1, M. Lloret1, J. Rueda2, E. López3.1 Unidad de Reproducción y 2Genética, Hospital Clínica Vistahermosa de Alicante y 3 Unidad de Reproducción Clínica Virgen de la Vega de Murcia.



INTRODUCCIÓN:

La multinucleación se asocia a undesarrollo embrionario deficiente(ritmo de división lento, fragmentación,tamaño desigual de los blastómeros)correlacionado con una baja tasa deimplantación. Sin embargo, la presenciade multinucleación también se observaen embriones con un desarrollo óptimo.Según la clasificación embrionaria deASEBIR, la mera presencia demultinucleación en un solo blastómerose penaliza clasificando al embrióndirectamente en la categoría D. Anteesta situación, el objetivo del trabajo esinvestigar el impacto de lamultinucleación cuando se presentacomo única anomalía, a través delanálisis de la viabilidad y el potencial deimplantación en embriones de excelentedesarrollo embrionario aunque conblastómeros multinucleados.


Estudio retrospectivo de 1173 embrionescon desarrollo embrionario óptimo (DT:división temprana y estadío de 4- ó 5-células en día +2) pertenecientes a 515ciclos de FIV realizados entre 2005 y2008.

La media de edad de las pacientes enestos ciclos fue de 34,4 años [rango: 20-47]. El promedio de horas post-inseminación en el cual se observa la DT

es de 26,3 [rango: 23-29 h] y laobservación en día+2 se realiza entre las43 y las 45 horas post-inseminación. Apesar que las transferencias se realizanen día+3, en este estudio la nucleaciónse ha valorado en día+2 para garantizarla correcta evaluación de la nucleaciónen cada uno de los blastómeros.

Se comparan las tasas de viabilidad y deimplantación entre el grupo deembriones multinucleados (d+2-MNB) yel de embriones no multinucleados(d+2-noMNB). La tasa de implantaciónse calcula respecto a los embrionestransferidos en transferencias con 100%de implantación, transferencias con 0%de implantación y transferenciashomogéneas, en las que todos losembriones transferidos muestran lasmismas características. Análisisestadístico: Fisher exact test, P<0,001.

RESULTADOS:

De los 1173 embriones estudiados, 152 presentan algún blastómeromultinucleado en día+2 (12,9%). En latabla siguiente se muestran las tasas deviabilidad y de implantación en funciónde la presencia de multinucleación.

El porcentaje de embriones viables en elgrupo de embriones multinucleados esdel 37,5%, cifra significativamente muyinferior al 70,7% del grupo de no

multinucleados. Por el contrario, si losembriones multinucleados llegan a sertransferidos, observamos que la tasa deimplantación, aunque tiende adisminuir, no se diferencia respecto a lade los embriones no multinucleados(20% versus 28,9%). Los 8 embrionesdel grupo d+2-MNB que implantanpresentan un bajo grado demultinucleación: un único blastómerobinucleado frente al resto deblastómeros uninucleados.

CONCLUSIONES:

1/. La sola presencia de algúnblastómero multinucleado en embrionescon características óptimas de desarrollodetermina una marcada disminución enla viabilidad de dichos embriones.

2/. Los embriones multinucleados viablesque son transferidos poseen un potencialde implantación equivalente al de losembriones no multinucleados, debidoprobablemente a la baja proporción deblastómeros multinucleados.

3/. Deberíamos revisar la inclusión en lacategoría D de los embriones concaracterísticas óptimas de desarrollocuya única anomalía es lamultinucleación en algún blastómero.

014: VIABILIDAD Y POTENCIAL DE IMPLANTACIÓN DE LOSEMBRIONES MULTINUCLEADOS CON RITMO ÓPTIMO DE DIVISIÓNEN LOS PRIMEROS ESTADÍOS DEL DESARROLLO EMBRIONARIO.

M. C. Pons, M. Grossmann, I. Solvas, R. Noblom, X. Julve, J. Nadal.Centro Médico Teknon. Unitat Reproducció Assistida, Barcelona




INTRODUCCIÓN:

Los oocitos contenidos en folículosantrales se encuentran secuestrados enprofase I, en estadio de vesículagerminal (VG). La extracción de estosoocitos, supone la liberación delsecuestro meiótico y la reanudación dela meiosis espontáneamente. De entrelos factores que afectan a la maduración,el medio y condiciones empleadas sonlos que han suscitado mayor interés.

En esta comunicación se compara la tasade maduración oocitaria espontáneaobtenida en dos medios comerciales decultivo (HTF vs CCM) y dos sistemas deincubación (incubador convencional vs.Embryoscope).


El efecto de los medios de maduración seestudió sobre 254 VG que fueroncultivadas en 50μl de medio de cultivo(HTF ó CCM) en incubadoresconvencionales y en condicionesestándar de cultivo (37ºC; 5%CO2 enaire). Tras 24 horas, se evaluó el estadonuclear de los oocitos: GV, MI o MII.

El efecto de dos sistemas de incubaciónsobre la maduración se estudió en 67 VG;26 VG fueron cultivadas en 50μl de CCMen incubadores convencionales durante48 horas, realizando controlesdiscontinuos de maduración cada 24horas.

41 VG se incubaron en 25μl de CCM en elEmbryoscope. Durante 48 horas, seregistró cada 15 minutos, 9 fotogramas

correspondientes a 9 planos ecuatorialesdiferentes. El escrutinio de la filmaciónnos permite determinar el grado demaduración finalmente alcanzado.

Las tasas de maduración de losdiferentes grupos se analizaron por Chi-cuadrado mediante SPSS 17.0.

RESULTADOS:

La tabla 1 muestra los porcentajes demaduración en los diferentes medios. Untotal de 157 VG maduraron a MII(61.8%), independientemente del mediode cultivo empleado (p>0.05). El medioafectó a la distribución de los oocitosinmaduros, siendo más frecuente que lasVG se bloqueen en CCM que en HTF(44.4% vs. 18.6%, respectivamente;p=0.009).

La tabla 2 muestra la tasa de maduraciónde VG cultivadas en incubadoresconvencionales (n=26) o en elEmbryoscope (n=41) durante 24 y 48horas.

Tras 24 horas de maduración, 65.7% delas VG madura a MII,independientemente de las condicionesde incubación (p>0.05). Los oocitos quetras 24 de cultivo permanecían enestadios inmaduros (VG o MI) fueroncultivados durante 24 horas másmaduraron a tasas similares.

CONCLUSIONES:

El tipo de medio y las condiciones delcultivo no parecen influir en la tasa demaduración oocitaria nuclear.

Las tasas de maduración de VGrecuperados de ciclos de estimulaciónovárica controlada maduranespontáneamente con una eficacia demás del 50%, independientemente delmedio y condiciones de incubación, lo

que sugiere el carácter preprogramadode la maduración nuclear. Futurosestudios de competencia citoplasmáticaesclarecerán si ésta está igualmente pre-programada.

015: EFECTO DEL MEDIO Y CONDICIONES DE CULTIVO SOBRE LATASA DE MADURACIÓN NUCLEAR DE OOCITOS VG RECUPERADOS DECICLOS ESTIMULADOS.

L. Escrich, N. Grau, J. M. de los Santos, A. Tejera, C. Albert, M. J. EscribáLaboratorio de Embriología Clínica. IU-IVI. IVI Valencia.

130



INTRODUCCIÓN:

La valoración morfológica de losembriones y el timing de ocurrencia esuno de los principales hitos en eldesarrollo, es una de las herramientasdiagnósticas más utilizada enEmbriología para determinar viabilidady asistir a la selección embrionaria.

En esta comunicación presentamos losresultados preliminares de cultivo deTPN de ICSI en Embryoscope. ElEmbryoscope es un incubador, adaptadocon sistema de captura y análisis deimagen que permite obtener registroscada 15 minutos en 9 planos diferentessin alterar, además, las condiciones delcultivo.

Como control, incluimos las observacionesrealizados sobre preembriones TPNcultivados y observados de formadiscontinua (tradicional), alterandotransitoriamente las condiciones decultivo.


Un total de 43 cigotos TPN fueronidentificados y vitrificados usando lametodología de cryotop. Una vezobtenido el CI de los progenitores, 6 TPNfueron desvitrificados; todossobrevivieron. Tras 2 horas en medio delavado, los TPN se cultivaron en unasplacas proporcionadas por Biosense Inccon 20μl de medio. Durante los primeros3 días se usó IVF (Vitrolife), y hasta D5/6se usó CCM, en condiciones estándar(37ºC, 5%CO2) y constantes propias delEmbryoscope.

De los registros del desarrollo se obtuvoel número de células de la primera y

segunda división, tiempos en que seproducen las divisiones y desarrollo ablastocisto.

Como control del desarrollo, un total de37 TPN fueron igualmente vitrificados /desvitrificados y cultivados como sedescribe anteriormente con dosdiferencias importantes: (1) en microtasde 50μl (2) en incubadoresconvencionales, por lo que la evaluaciónno es continua sino discreta, alterando,

al menos transitoriamente lascondiciones del cultivo.

RESULTADOS:

Tras el cultivo en Embryoscope,observamos que el 33.3% de los TPNllegan a blastocisto, porcentajecomparable al grupo control (10.8%;P=0.39).

El número de blastómeros en día 2 y endía 3, escrutados de los datos delEmbryoscope a 24 y 48 horas soncomparables a los registrados trasobservación discontinua en el grupo control (P=0.54 y P=0.86respectivamente).

La observación de la primera división seproduce a las 35.5±10.8 horasgenerándose en todos los casos 2células. El 75% de los embriones de 2-

células progresan a 4-células(35.7±4.96), mientras que el 25%progresa a 3-células (34.2).

CONCLUSIONES:

El cultivo y valoración del desarrollo TPNen Embryoscope/incubador convencionalno afecta a las tasas globales de desarrolloa blastocisto.

El Embryoscope permite corroborar que

en los TPN de ICSI la primera divisiónocurre en base 2, según la fórmula 2n.

Antes de emitir conclusiones, esnecesario incrementar el tamañomuestral de los TPN cultivados en elEmbryoscope. Nuestros resultadospreliminares indican que pese a noexistir diferencias globales en las tasasde desarrollo a blastocisto, los TPNcultivados en Embryoscope que alcanzanel día 3 de desarrollo, prosiguen ablastocisto con mayor eficacia (2/2;100%) que aquellos cultivados yobservados de forma convencional ydiscontinua (4/28; 14.3%; p=0.044); esdecir, es posible que el cultivo yvaloración convencional pudieranpenalizar el desarrollo embrionariopost-transcripcional (día3-día6).

016: ESTUDIO DEL DESARROLLO DE PREEMBRIONESTRIPRONUCLEARES HUMANOS SEGÚN TECNOLOGÍA EMBRYOSCOPE OCONVENCIONAL

N. Grau, L. Escrich, J.Herrero, A. Mifsud, J. Zulategui , M. J. EscribáLaboratorio de Embriología Clínica. IU-IVI. IVI Valencia


Tabla 1. Número de especimenes TPN-ICSI



INTRODUCCIÓN:

La membrana plasmática delespermatozoide posee un papelimportante y decisivo en la fertilización,y su composición lipídica es esencial parala óptima motilidad, madurez y funcióndel espermatozoide. Así mismo, laactividad de diferentes enzimas lípido-dependientes unidas a la membranaespermática, así como la resistencia de lamembrana al estrés físico y químico,depende de su composición en ácidosgrasos. Se ha sugerido que la proporciónde ácidos grasos insaturados (AGI)influyen en la fluidez y flexibilidad de lamembrana, asimismo son precursores deprostaglandinas y leucotrienos, factoresclave tanto en la motilidad espermáticacomo en procesos inflamatorios. Elobjetivo del presente estudio es evaluarla relación existente entre la motilidadespermática y la composición de ácidosgrasos de la membrana deespermatozoides humanos pre-, y post-capacitados.


La población en estudio consistió en 50varones pertenecientes a parejasinfértiles adscritas al programa deFIV/ICSI de la Unidad de ReproducciónHumana del Hospital de Cruces(Vizcaya), entre Junio y Septiembre del2008. Los pacientes se clasificaron en

dos grupos dependiendo de su motilidadespermática, en el grupo I (n=25) seincluyeron todas aquellas muestras quepresentaban una motilidad progresiva(% a+b) mayor o igual del 40%,mientras que el grupo II (n=25)corresponde a las muestras con unamotilidad progresiva menor del 40%.Todas las muestras de semen serecogieron y se analizaron el día de lapunción folicular siguiendo los criteriosde la OMS. La capacitación in vitro serealizó por el método de Swim up. Seutilizó una alícuota de cada muestrapara el análisis de ácidos grasos. Paraello, se procederá a la metilación de losácidos grasos de las muestras de semenque se realizará siguiendo elprocedimiento de Lepage and Roy(1986). Los AG metilados se separarán ycuantificarán en un cromatógrafo degases Hewlett Packard GC 5890 equipadocon detector de ionización de llama. Lacuantificación de cada uno de ellos selleva a cabo mediante integraciónelectrónica y aplicación de sucorrespondiente factor de respuesta. Losresultados se expresan como nmol % deltotal de ácidos grasos identificados.

RESULTADOS:

Antes de la capacitación, losespermatozoides de pacientes del grupoII mostraron de forma significantemayores niveles de ácidos grasos

saturados (AGS), y una menorcontribución de ácidos grasosmonoinsaturados (AGMI) que losespermatozoides del grupo I. Elcontenido total de ácidos grasospoliinsaturados (AGPI) fue similar enambos grupos. Sin embargo, en lasmuestras de espermatozoidescapacitados, los niveles del ácidodocosapentaenoico (22:5 n-3),docosahexaenoico (DHA) (22:6 n-3),AGPI n-3 y el índice de insaturaciónfueron significativamente menores en elgrupo II comparado con el grupo I.Además, la familia n-3 es másrepresentativa que la familia n-6 enindividuos del grupo I, por lo tanto elcociente n3/n6 aumenta a favor de losespermatozoides con menos movilidad.

En el análisis de correlaciones, seencontraron correlaciones positivassignificativas entre el porcentaje deespermatozoides con motilidadprogresiva linear (%a) con los niveles deDHA, AGPI n-3 y el índice de insaturaciónen las muestras capacitadas.

CONCLUSIONES:

Los niveles adecuados de AGPI,especialmente los de la familia n-3, estáasociado a una óptima motilidadespermática, que es requerida para unaadecuada fertilización por parte delespermatozoide capacitado.

017: IMPLICACIONES DE LA COMPOSICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS Y LAMOTILIDAD DE ESPERMATOZOIDES HUMANOS ANTES Y DESPUÉS DELA CAPACITACIÓN IN VITRO.

L. Crisol1, A. Expósito1, J. I. Ruiz-Sanz2, M. B. Ruiz-Larrea2, C. Stoppani3, F. Azpichueta1, R. Matorras1.1Unidad de Reproducción Humana. Hospital de Cruces. Cruces, Vizcaya. 2Departamento de Fisiología Humana. Universidad del País Vasco, Leioa,Vizcaya. 3Departamento de Endocrinología, Universidad de Padova, Padova, Italia.

132



INTRODUCCIÓN:

La baja respuesta a la FSH es, en muchasocasiones, reflejo de una disminución dela reserva ovárica que se exacerba con laedad pero que también puede ocurrir enmujeres jóvenes. La falta de sensibilidadde los receptores de FSH, así como unadisminución de éstos en las células de lagranulosa podría explicar parcialmenteesta situación clínica.

OBJETIVO:

El objetivo de este estudio es analizarqué ambiente hormonal folicular seconsigue en pacientes con bajarespuesta en ciclos naturales ycompararlas con el conseguido ensituaciones de estimulación ováricaconvencional (EOC) en las que losfolículos son sometidos a elevadas dosisde FSH en la fase folicular, con el fin dearrojar algunas luces acerca del manejoclínico de estas pacientes.


Estudio prospectivo de cohortesemparejado que incluye un total de 68pacientes 42 fueron ciclos naturales (CN)y 26 ciclos de estimulación ováricacontrolada. La edad media fue de 36 ±3.5 años. Mediante la punción ovárica,el líquido folicular del único folículopreovulatorio de los ciclos naturales y ellíquido de uno de los folículosdominantes de los ciclos estimulados

fueron aspirados, centrifugados,alicuotados y almacenados a -80 C hastasu utilización.

Se midieron las siguientes hormonas:FSH, LH, androstendiona, testosterona,progesterona y estradiol medianteenzimoinmunoanálisis (MEIA). Losovocitos asociados a los folículosestudiados se analizaron medianteOosightTM para valorar el estado delhuso meiótico (posición y estructura) asícomo los valores medios debirrefringencia y fecundación. Losanálisis estadísticos utilizados fueronpruebas Chi Cuadrado para lacomparación de las variablescategóricas, t- Student para lacomparación de las medias y regresiónlogística lineal con el 95 % de intervalode confianza para estudiar la asociaciónentre los valores hormonales delambiente folicular y los valores debirrefringencia del huso.

RESULTADOS:

Los resultados del ambiente folicularvienen resumidos en la siguiente tabla:

Aunque no se encontró una mejora encuanto al porcentaje de husos bien

posicionados y estructurados entre CN yEOC (42.9% versus 46.9%), ni en la mediade birrefringencia de los husos observados(1.5 versus 1.4), ni en el porcentaje deovocitos fecundados (73,7% versus55.6%) respectivamente, en general seencontró una correlación positiva (R=0.4,p<0.04) entre la ratio LH/FSH y labirrefringencia de los husos meióticos.

CONCLUSIONES:

La elevación de las dosis degonadotropinas en la estimulación, noindujo cambios a nivel androgénico niestrogénico en los folículos dominantesa pesar de la disminución de la ratioLH/FSH intrafolicular observada en losciclos estimulados. No obstante, laexistencia de una correlación positivaentre la ratio LH/FSH y los valores debirrefringencia, signo de buenpronóstico para la calidad ovocitaria,apoya la idea de los efectos beneficiososde los ciclos naturales sobre la calidadovocitaria en este grupo de pacientespuesto que mayores valores de ratiosLH/FSH fue conseguida en la mayoría delos ciclos naturales.

018: EFICACIA DE LA ESTIMULACIÓN NATURAL EN PACIENTES CONBAJA RESPUESTA

V. García-Laez, J. Zulategui, J. M. de los Santos, P. Gámiz, M. Meseguer, C. Albert, M. J. de los Santos.IVI Valencia (Valencia)


*p<0.05



INTRODUCCIÓN:

La eficiencia de la reproducción en elvarón depende de la integridad del ADNespermático. En trabajos anteriores denuestro grupo, sabemos que elespermatozoide en varones infértilesposee mayor fragmentación y oxidacióndel ADN, causado por la presencia deespecies reactivas del oxígeno que envarones fértiles y que en distinto grado,afectan la calidad embrionaria y el éxitoreproductivo.

El objetivo de el presente estudio esanalizar la oxidación del ADN en elespermatozoide en alícuotas de lasmuestras de semen empleadas entratamientos de inseminación artificialintrauterina, comparando aquellas enlas que se logra gestación con aquellasen las que no.


Estudio de cohortes prospectivo, dondese analizaron espermatozoides demuestras de semen antes y después desu capacitación por swim-up (n=100), detratamientos de inseminación artificial,

utilizando el kit OXIDNA y mediantecitometría de flujo. Se crearon lasventanas correspondientes para analizarla oxidación del ADN, y se realizaronanálisis estadísticos de regresiónlogística de la media de oxidación delADN por célula y % de células oxidadasen cada muestra con la consecución dela gestación, controlando por edad,etiología femenina, calidad del semen, yprotocolos de estimulación ovárica.Finalmente, se realizaron curvas ROCpara determinar el valor pronóstico de laprueba.

RESULTADOS:

No se confirma ninguna relación ni del% de espermatozoides con el ADNoxidado ni de la media de oxidación porcélula y el logro de gestación, con unaodds ratio OR=0,997, y un intervalo deconfianza IC 95% 0,929-1,071, y 0,936IC 95% 0,867-1,009, respectivamentecon el análisis de los espermatozoides enel eyaculado.

Tras el swim up, similares resultadosfueron obtenidos, OR=1,003 IC 95%(0,909-1,107) y OR=0,953 IC 95%

(0,873-1,041), respectivamente el % deespermatozoides con ADN oxidado y lamedia de oxidación por célula.

El análisis con curvas ROC curvesconfirmó la ausencia de poder predictivode la oxidación de ADN en elespermatozoide con la consecución degestación con un valor del área bajo lacurva de AUC 0,432 95% IC (0,135-0,729) para semen fresco del % decélulas positivas para la oxidación, yAUC=0,222 95% CI 0,030-0,415 para lamedia de oxidación por célula.Resultados semejantes se obtuvierontras la preparación del semen,AUC=0,519 95% IC 0,291-0,746, yAUC=0,389 95%CI 0,150-0,628,respectivamente.

CONCLUSIONES:

Según nuestros resultados, la oxidacióndel ADN no posee valor predictivo parala gestación en tratamientos deinseminación artificial intrauterina. Apesar de constatar un grado deoxidación del ADN celular variable, notiene repercusión en las posibilidades delograr un embarazo en inseminación.

INTRODUCCIÓN:

La alta tasa de embarazos múltiplesobtenida con las técnicas dereproducción asistida es un fenómeno

preocupante por asociarse con unaumento de la morbi-mortalidadperinatal. Para reducir la tasa degestación múltiple la transferencia de unúnico embrión electivo es la solución,

pero debe acompañarse de la capacidadde crioconservar eficientemente losembriones sobrantes para obtener unacierta equivalencia con la transferenciade dos embriones.

019: LA DETERMINACIÓN DEL DAÑO OXIDATIVO EN EL ADN DELESPERMATOZOIDE NO PERMITE PREDECIR GESTACIÓN EN CICLOSDE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL INTRAUTERINA.

C. Aguilar, M. Meseguer, S. García-Herrero, L. Romany, J. Remohi, N. Garrido.Instituto Valenciano de Infertilidad, Instituto Universitario IVI, Universidad de Valencia, Centro de investigaciones Científicas Príncipe Felipe. Valencia.

020: LA TRANSFERENCIA DE UN EMBRIÓN ELECTIVO EN DÍA 3 SEGUIDODE UN CICLO DE VITRIFICACIÓN/DESVITRIFICACIÓN MEJORA LA TASADE EMBARAZO RESPECTO A LA TRANSFERENCIA DE DOS EMBRIONES;ESTUDIO PROSPECTIVO DE COHORTES EMPAREJADAS

A. Galán, M. Meseguer, C. Albert, A. Cobo, M. J. de los SantosIVI Valencia

134




Estudio preliminar prospectivo decohortes emparajadas realizado con 88pacientes sometidas a FIV-ICSI en nuestrocentro. Cuarenta y cuatro de ellasrecibieron un solo embrión en 74transferencias (embriones en fresco ycrioconservados). El grupo control seeligió seleccionando por emparejamiento44 pacientes con transferencia de dosembriones el mismo día, el anterior o elsiguiente que las pacientes incluidas enel estudio. Las pacientes de ambos grupostenían ≤37 años (media=34,14 años),tenían al menos 2 embriones de buenacalidad en D3 (6-8 células, menos de 10%de fragmentación y blastómerassimétricas) 72 horas post inseminación.Los embriones sobrantes de buenacalidad se vitrificaron usando el métodoCryotop®. La tasa de gestación evolutivaacumulada en el grupo de transfer únicotras 1, 2 ó 3 embriones transferidos (1 enfresco y 1 ó 2 desvitrificados) se comparacon la tasa de gestación evolutiva en el

grupo de transfer doble. La tasa degestación evolutiva se expresa junto conel intervalo de confianza 95% (IC95).

RESULTADOS:

Realizamos 74 ciclos de transfer únicotras FIV-ICSI. De los 44 realizados enfresco, 33 dieron resultado positivo deBeta-hCG, 4 de ellos fueron embarazosbioquímicos (12,1%) y 6 abortos clínicos(18,2 %) La tasa de gestación evolutivaes del 52,3 % (23/44)(IC95 37,5-67,1%).19 pacientes (43%) se sometieron a unprimer transfer de vitrificados, 8quedaron gestantes (1 embarazobioquímico, 2 abortos clínicos); 7pacientes se realizaron un 2ºcriotransfer en los que conseguimos 2embarazos más. La tasa acumulada degestación alcanza así el 86.6%, siendola tasa de embarazo evolutivo 75.0 %(33/44) (CI95 59,6-85,9%). Todos losembarazos son únicos. De las 44pacientes del grupo control (transfer dedos), 26 tuvieron resultado positivo en

el test de embarazo, 2 fueron embarazosbioquímicos (7,7%) y 4 sufrieron abortoclínico (15,4 %), con lo que la tasa degestación evolutiva resulta en un 4,.6 %(20/44) (CI95 30,7-59,1%). Nuevepacientes (45 %) tienen embarazosmúltiples (CI95 23,2-6,0%).

CONCLUSIONES:

La vitrificación de embriones con elmétodo Cryotop ha mejorado las tasasde supervivencia post desvitrificación.Por consiguiente, la transferencia únicade embriones seguida de lavitrificación/desvitrificación en losciclos sin éxito proporciona tasas degestación acumulada y totalsignificativamente mayores (comodemuestran los IC95) que lastransferencias de dos embriones.Mediante esta estrategia estamosaumentando el éxito reproductivo yademás eliminamos la incidencia degestaciones múltiples.

INTRODUCCIÓN:

La criopreservación de tejido ovárico esuna opción para mantener la funciónreproductiva y endocrina en pacientesoncológicas, cuyo tratamiento(quimio/radioterápico) supondrá unriesgo importante de Fallo OváricoPrematuro (FOP). Consiste en lapreservación de fragmentos (o latotalidad) de la corteza ovárica previa altratamiento, aislando al tejido de laagresión gonadotóxica.


En la criopreservación de tejido ováricoparticipan los Servicios de Ginecología(Unidad de Reproducción Humana) yAnatomía Patológica del Hospital

Universitario la Fe de Valencia, así comoel Centro de Tejidos de la ComunidadValenciana. En nuestro protocolo seincluyen mujeres con edad entre 13 y 35años, afectas de enfermedades benignaso malignas cuyo tratamiento pudieraproducir, como efecto secundario, unFOP. Se excluyen aquéllas que presentancontraindicaciones para la intervenciónquirúrgica o en las que elautotransplante ovárico pudierasuponer la reactivación de laenfermedad neoplásica. La obtencióndel tejido ovárico (exéresis ovárica) serealizó mediante laparoscopia. Ladisección de la cortical ovárica se realizóen láminas de un grosor de 1-2mm ytamaño 5x7mm aproximadamente. Unfragmento fue remitido al Servicio deAnatomía Patológica para verificar la

normalidad histológica (presencia defolículos primordiales y ausencia decélulas malignas) y el resto fueronenviados al Centro de Tejidos de laComunidad Valenciana para sucongelación (DMSO 10-12,5%;congelador programable; -0,3 y0,5ºC/min). Las pacientes fueron citadasa los 6, 12 y 24 meses del procesoquirúrgico para evaluar la función ováricaresidual mediante Recuento de FolículosAntrales (RFA) y determinación hormonal(FSH, LH, Estradiol, Inhibina y AMH).

RESULTADOS:

Durante el periodo de Marzo de 2008 aMayo de 2009 se realizaron 12criopreservaciones de corteza ovárica.La edad media de las pacientes fue de 25


021: REVISIÓN DE LA EXPERIENCIA CLÍNICA EN CRIOPRESERVACIÓNDE TEJIDO OVÁRICO EN LA UNIDAD DE REPRODUCCIÓN HUMANAASISTIDA DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO LA FE DE VALENCIA.

C. C. Duque, M. Romeu, J. M. Rubio, A. Monzó, A. Romeu.Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe de Valencia.



años (13-35). El motivo de lacriopreservación fue por linfoma deHodgkin en 4 casos (33%), linfoma noHodgkin en 1 caso (8,3%), neoplasia demama en 3 casos (25%), sarcoma deglúteo en 1 caso (8,3%), esclerosismúltiple con tratamiento quimioterápicoen 1 caso (8,3%), sarcoma de tibia en 1caso (8,3%) y carcinoma de cérvix en 1caso (8,3%). De las 12 pacientes, 2(16,6%), bajo supervisión oncológica,comenzaron con el tratamientoquimio/radioterápico antes de lacriopreservación ovárica con el fin deminimizar la posibilidad de metástasis.En 6 pacientes (50%) no pudieronrealizarse los controles ecográficos ydeterminaciones hormonales (salvoAMH) previas al proceso quirúrgico por

premura en la intervención. La duraciónmedia de las intervenciones fue de 44minutos y las pacientes permanecieronuna media de 24 horas ingresadas. En el75% de los casos (9/12) se realizó laexéresis del ovario izquierdo. El tiempode isquemia, definido como el tiempotranscurrido desde la extracción ováricahasta su criopreservación fue inferior de4 horas. En el 91,6% (11/12) de los casoslos fragmentos remitidos a AnatomíaPatológica presentaron folículosprimordiales y ausencia de célulasmalignas; solamente en un caso (linfomano Hodgkin) la criopreservación no pudollevarse a cabo por presencia deinfiltración de células linfoides en el tejidoestudiado. Cuando el tratamientooncológico lo permite se

ofrece la posibilidad de vitrificarovocitos/embriones antes de la exéresisovárica. Dos pacientes han sido incluidasen este protocolo, una con vitrificación deovocitos y otra de embriones. Hasta elmomento no ha sido solicitado ningúnautotransplante por parte de laspacientes.

CONCLUSIONES:

A pesar de que la criopreservación detejido ovárico no es una prácticaconsolidada para mantener la funciónreproductora y endocrina en pacientesoncológicas, los resultados obtenidos,tanto en modelos experimentales comoen las experiencias recientes en la especiehumana, ofrecen nuevas opciones en

INTRODUCCIÓN:

La hiperestimulación ovárica es unacomplicación derivada de la alta respuestade algunas pacientes a lasgondonadotropinas. Estas pacientespresentan bajas tasas de gestación eimplantación, y además aquellas queconsiguen un embarazo corren el riesgo dedesarrollar síndrome de hiperestimulacióntardío. Una estrategia novedosa y eficaz enpacientes con riego de hiperestimulaciónpodría ser la vitrificación de los ovocitoscon el fin de transferir los embrionesresultantes en un ciclo posterior.

El objetivo de este trabajo es presentarlas tasas de gestación conseguidas trasla transferencia de embrionesprocedentes de ovocitos vitrificados eneste tipo de pacientes.


Las pacientes incluidas en este estudiofueron clasificadas como “pacientes conriesgo de hiperestimulación” cuando elnivel de estradiol en sangre fue >4000pg/ml y/o se contaban >15 folículosmaduros en la última ecografíatransvaginal.

Durante el 2008, 94 de estas pacientesvitrificaron sus ovocitos madurossiguiendo el método del Cryotop(Kitazato). Posteriormente, en 38 deestas pacientes se procedió a ladesvitrificación de sus ovocitos parallevar a cabo un ciclo de microinyeción ytransferencia embrionaria. Losembriones resultantes fuerontransferidos en ciclos sustituidosposteriores al ciclo de vitrificación.

RESULTADOS:

Los resultados, totales y por grupos deedad, obtenidos tras la desvitrificaciónde los ovocitos de estas pacientes sonlos siguientes:

CONCLUSIONES:

Las tasas de gestación e implantaciónobtenidas tras la desvitrificacion ytransferencia de embriones en estaspacientes confirman que la vitrificaciónde ovocitos es una opción segura y eficazen pacientes con riesgo dehiperestimulación ovárica.

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022: VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS EN PACIENTES CON SÍNDROMEDE HIPERESTIMULACIÓN OVÁRICA: RESULTADOS IVI MADRID 2008

L. Herrero, C. Losada, S. Pareja, J. Fernández, M. Jiménez, Y. Mínguez.IVI MADRID



INTRODUCCIÓN:

La vitrificación es una nueva técnica de criopreservación de recienteimplantación en los laboratorios dereproducción asistida de nuestro país.Esta técnica ha permitido criopreservarembriones, blastocistos y ovocitos. La criopreservación de ovocitosanteriormente tenía muy bajo rendimientopor lo que no se podía implementar derutina en los laboratorios hasta la llegadade la vitrificación.

El objetivo de este trabajo es presentarlas tasas de gestación conseguidas tras la transferencia de embrionesprocedentes de ovocitos vitrif icados.


Desde que obtuvimos la acreditaciónpara poder vitrificar ovocitos (en Juniode 2008), un total de 65 pacientes deovocitos propios (no donantes) hanusado esta técnica para criopreservarsus ovocitos en nuestro centro. Larazón por la que estas pacientesvitrificaron parte o la totalidad de susovocitos fue diversa: riesgo dehiperestimulación, razones éticas a lahora de criopreservar embriones,problemas en la recogida de la muestra

de semen, postergar la maternidad…

La vitrificación se realizó por el métododel Cryotop (Kitazato biopharma,Japon). A las 2 horas de la captaciónovocitaria se procedió a decumular losovocitos. Seguidamente los ovocitosmaduros (MII) fueron vitrificadossiguiendo las instrucciones delfabricante y almacenados en tanques de

nitrógeno liquido.

La desvitrificación se hizo segúnprotocolo y 2 horas después de la mismase procedió a microinyectar los ovocitos.La fecundación se observó a las 16-19horas post-inyección y al tercer día de ladesvitrificación-microinyección serealizó la transferencia embrionaria conel catéter TDT (Laboratoire CCD,

Francia). El embarazo se confirmómediante –hCG en suero a los 12 días dela transferencia y la presencia de sacogestacional 10 días mas tarde.

RESULTADOS:

Hasta el momento 30 pacientes con unaedad media de 36.9 años handesvitrificado algunos de sus ovocitos:

CONCLUSIONES:

A la vista de los resultados preliminaresparece que la vitrificación de ovocitos esuna técnica segura y eficaz,consiguiendo tasas de embarazoequiparables a las que se consiguen conovocitos en fresco.

INTRODUCCIÓN:

El consumo de cigarrillos es uno de loshábitos tóxicos más comunes en lapoblación; éste, es potencialmentecapaz de inducir efectos deletéreos enlos gametos y además ha sido asociadocon un aumento del estrés oxidativo enel eyaculado. Nuestro grupo

previamente ha demostrado que elhábito de fumar afecta negativamentealgunas enzimas antioxidantesintracelulares como la GPx4 (isoformaespecífica del espermatozoide),alterando su actividad y expresión deARNm, probablemente produciendoperoxidación lipídica de la membranaespermática y afectando la calidad

seminal, pero no así, daño oxidativo alADN (origen primario de lafragmentación del ADN). Debido a ello,resulta interesante estudiar otroscambios moleculares en elespermatozoide. Adicionalmente,hemos demostrado que lasconcentraciones intracelulares de calcio(Ca+2) y la proporción del colesterol

023: VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS: NUESTRA EXPERIENCIA.J. Muñoz, G. Quea, E. Garijo, F. Galera, J. Herreros.Instituto Madrileño de Fertilidad (IMF), Madrid

024: EL CIGARRILLO AUMENTA LOS NIVELES DE COLESTEROL EN ELPLASMA SEMINAL Y REDUCE SIGNIFICATIVAMENTE EL CALCIOINTRACELULAR EN ESPERMATOZOIDES DE HOMBRES INFÉRTILES

T. Viloria, N. Garrido, J. A. Martínez-Conejero, J. M. De Los Santos, P. Gámiz, M. Meseguer.IVI-Valencia




(CH) en la membrana delespermatozoide son marcadoresimportantes de calidad seminal debido asu relación directa con la morfología y elpotencial de fertilidad; por otro lado, laactividad mitocondrial (AM) se ha vistofuertemente relacionada con lamovilidad espermática. Nuestro objetivocon este estudio fue correlacionarniveles de Ca+2, CH y AM en elespermatozoide, con el consumo detabaco en pacientes infértiles.

MATERIAL Y METODOS:

Estudiamos 135 muestras de semen dehombres infértiles. Los pacientes quehubieran consumido alcohol y/o drogasen los 3 meses previos al estudio fuerondescartados. Así mismo, fueronexcluidos aquellos pacientes quetuvieran una historia reciente de fiebre,exposición a gonadotoxinas comoquimioterapia, radioterapia, pesticidas,o exposición ocupacional a metalespesados. También se investigó sobre lapresencia de varicocele, torsióntesticular, y cualquier otra alteración enel tracto genito-urinario, y todos fueronexcluidos. Establecimos dos grupos

según el consumo de cigarrillo: nofumadores (n=73) y fumadores (n=62).Analizamos los parámetros seminalesbásicos según los criterios de la OMS; lasconcentraciones de Ca+2 y CH en elplasma seminal fueron determinadas porenzimoinmunoanálisis. El Ca+2intracelular, las concentraciones de CHen la membrana de espermatozoide y laAM, fueron determinados porfluorometría. El análisis estadístico fuerealizado utilizando la prueba T paradetectar diferencias significativas.

RESULTADOS:

No se encontró ninguna correlaciónentre los parámetros seminales básicosy el consumo de cigarrillo. Laconcentración de CH en el plasmaseminal de los hombres fumadores fuemás alta (27.40 [ET 6.82]) que en los nofumadores (13.78 [ET 2.70]) (p=0.044).Sin embargo, no se encontrarondiferencias significativas en laconcentración de CH en la membranaplasmática del espermatozoide entrefumadores y no fumadores. Lasconcentraciones de Ca+2 en el plasmaseminal fue comparable en los dos

grupos, pero el Ca+2 intracelular en lamembrana espermática resultóconsiderablemente disminuido en elgrupo de hombres fumadores (3.44 [ET1.41]) comparado con no fumadores(12.23 [ET 4.22]) (p=0.030). Laactividad mitocondrial presente enfumadores y no fumadores no resultóimportante.

CONCLUSIONES:

Hemos observado un aumentosignificativo de niveles de CH en el plasmaseminal de los hombres fumadores (asícomo se ha descrito en sangre); pero no en la membrana espermática;probablemente preservando la función decapacitación en la cual ve implicado el CH.También hemos demostrado que fumarafecta negativamente el Ca +2 intracelularen el espermatozoide, y este fenómenopodría producir cambios importantes enla fisiología celular de los gametos dehombres fumadores, aunque su actividadmitocondrial no se vea alterada. Portanto, es necesaria investigaciónadicional para estudiar los efectosnegativos del cigarrillo en losespermatozoides.

INTRODUCCIÓN:

La integridad del ADN espermático esuno de los factores más importantes quese analizan actualmente en el estudio defertilidad masculina.

Existen numerosas publicaciones sobrela utilidad de diversos métodos en loscuales se analiza el estado de lacromatina espermática. Uno de lo mássencillos es el test de bromuro de etidioy naranja de acridina (AO), con el cual se comprueba el grado dedesnaturalización del ADN espermáticoen función de su unión al colorantenaranja de acridina. Sin embargo, la

técnica de AO está limitada a estaspropiedades metacromáticas, porcuanto nos aporta informaciónlimitada del estatus nuclear delespermatozoide.

Otras técnicas, como el Sperm ChromatinDispersión (SCD) analizan lafragmentación del ADN espermáticocomprobando roturas en la cadena.

El objetivo de este trabajo escomprobar si existen relación entre elgrado de fragmentación de ADN y lavitalidad espermáticas en muestras desemen de varones en estudio defertilidad.

MATERIAL Y METODOS:

Para el estudio se han incluido 82muestras de semen de varones enestudio de fertilidad en la ClínicaTambre.

Para el estudio de la vitalidad se haempleado el test de Bromuro de etidio ynaranja de acridina y para lafragmentación espermática el testHalosperm.

La técnica de AO detecta la proporciónde espermatozoides muertosdependiendo del grado dedesnaturalización del ADN nuclear.

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025: COMPARACIÓN ENTRE EL TEST DE FRAGMENTACIÓN DE ADNESPERMÁTICO MEDIANTE LA TÉCNICA DE SCD Y EL ÍNDICE DEVITALIDAD MEDIDA CON EL TEST DE NARANJA DE ACRIDINA.

E. Olaya, L. Ortega, P. López, A. Gabriel, I. Orozco, R. Núñez, P. CaballeroClínica Tambre, Madrid



Espermatozoides con fluorescencianaranja indican un ADN desnaturalizado,mientras que los que presentanfluorescencia verde contienen el ADNintacto.

El porcentaje de fragmentación se midiómediante el test SCD mejorado(Halosperm). Este test nos indica lapresencia de roturas de la cadena de ADNbasándonos en el tamaño del haloobtenido. En un espermatozoidefragmentado no observaremos este haloal analizar la muestra con microscopiode fluorescencia y el fluorocromo GelRedy por el contrario en un espermatozoidecon el DNA no fragmentado presenta unhalo mayor.

Se utilizó T de Student para comparaciónestática de medias entre ambos grupos.Se ha considerado como significativop<0,05

RESULTADOS:

La proporción de espermatozoides conDNA desnaturalizado detectado con eltest de AO se correlacionósignificativamente con la proporción deespermatozoides con DNA fragmentado,detectado con el test SCD (r = 0.84, P <0.001). El valor medio del índice devitalidad con AO fue de 21,1% (6 ± 50)frente al 21,9% (7,3 ± 40) defragmentación en las 82 muestrasanalizadas. Por otra parte, los dos

ensayos mostraron una correlaciónestadísticamente negativa con laconcentración espermática, movilidad ymorfología normal.

CONCLUSIONES:

Este estudio demuestra la correlaciónentre los resultados de vitalidadespermática medida con el test denaranja de acridina y el grado defragmentación de ADN con el SCD. Estosresultados sugieren que podría utilizarseel test de AO como primera opción paradeterminar el daño espermático a nivelde la cromatina antes de la realizaciónde test más costosos o complicados.

INTRODUCCIÓN:

Los prostasomas son pequeñas vesículassecretadas por la glándula prostática allíquido seminal. Los prostasomas sefusionan al espermatozoide transfiriendoal espermatozoide iones, lípidos yproteínas de superficie que mejoran sumovilidad, licuefacción y capacitación. Eldescenso de pH en la vagina (pH=5)incrementa la fusión permitiendo así laadquisición de nuevas proteínas queprotegen al espermatozoide de lasdefensas inmunitarias en el tracto genitalfemenino.

Las células NK uterinas son la principalpoblación de leucocitos en el tractogenital y juegan un papel importante enla defensa inmunológica. Sin embargouna elevada actividad de las células NKestá asociada a una pérdida recurrentedel embarazo.

En este trabajo planteamos la siguientehipótesis: “los prostasomas modulan lafunción efectora de las células NK através de ligandos de receptores NK”.Para confirmar esta hipótesis, hemos

caracterizado fenotípicamente laexpresión de ligandos moduladores de laactividad NK en los prostasomas asícomo las implicaciones funcionales deesta interacción.

Los prostasomas en pacientesnormozoospérmicos (según los criteriosde la OMS) se aislaron porultracentrifugación y cromatografía encolumnas de SEPHADEX G-200 y seanalizaron fenotípicamente por citometríade flujo después del acoplamiento conmicrosferas de carboxilato (polybeadcarboxylate®). Nuestros resultadosdemuestran que los prostasomas expresanlas proteínas vesiculares de membranaCD107a/b (LAMP-1/2) y HSP-70 (proteínade choque térmico). En cuanto a losligandos de receptores NK, expresan altosniveles de CD48 (ligando del receptoractivador CD244 de células NK y células T)y CD86 (ligando de la moléculacoestimuladora CD28 en células T y ligandode variantes de CD28 en células NK).

Las consecuencias funcionales de lainteracción de células NK conprostasomas se determinaron mediante

la incubación de linfocitos de sangreperiférica con prostasomas purificados.Tras 5 días de cultivo, se analizó laproliferación celular y los porcentajes deviabilidad, necrosis y apoptosismediante una tinción con anexina-V/ioduro de propidio. Los resultadosdemostraron que los prostasomaspurificados disminuyen la proliferacióny la viabilidad celular aumentando elporcentaje de células apoptóticas.

En conclusión, los resultados obtenidosin vitro apoyan el papel de losprostasomas en la inmunomodulaciónde la actividad NK que podría estarimplicado en el éxito reproductivo.

AGRADECIMIENTOS:

Este trabajo ha sido realizado gracias a lasayudas PDT08A015, GRU08077, (INPATT)de la Junta de Extremadura, cofinanciadopor European Regional Development Fund(FEDER) y Ayudas a los Grupos deInvestigación de la Universidad deExtremadura PPGRU08J2.


026: ANÁLISIS FENOTÍPICO DE PROSTASOMAS HUMANOS ENRELACIÓN CON SU PAPEL INMUNOMODULADOR

M. C. Guarnizo1, E. Delgado1, J. De Julián1, R. G. Roncero2, S. Morgado2, B. Sánchez-Correa2, J. J. Gordillo2, R. Tarazona2, J. G. Casado2

1Norba, Ginecología y Reproducción S.L., Cáceres. 2Universidad de Extremadura, Área de Inmunología, Universidad de Extremadura, Cáceres.



INTRODUCCIÓN:

Estudiar la influencia de doscaracterísticas morfológicas embrionariassobre la probabilidad de implantación deun embrión. Por un lado el hecho de vertodos los núcleos, por otro, la simetría delos embriones en estadio de 4 células.


Casos de FIV realizados a pacientesmenores de 39 años entre enero de 2005 yabril de 2009. Todos los embrionesincluidos en el estudio tenían 4 células y≤25% de fragmentación en día 2 y nopresentaban blastómeros multinucleados.

RESULTADOS:

De los 2895 embriones en los que seevaluaron correctamente ambascaracterísticas, se vieron todos los núcleosen un 70,3% y hubo un 81% de embrionescon simetría adecuada entre losblastómeros. Un 61,5% del total seclasificaron como de buena simetría y sevieron los 4 núcleos. En un 8,8% de loscasos se vieron los 4 núcleos pero lasimetría fue mala. En un 19,4% la simetríafue buena pero no se vieron los 4 núcleos yen un 10,2% de los embriones no se vieronlos 4 núcleos y la simetría fue inadecuada.

La tasa de implantación de losembriones con buena simetría fue 39,4%(364/923), mientras que la de los demala simetría fue: 33,0%(32/97)(p=0,22). La tasa deimplantación de los embriones contodos los núcleos visibles fue 40,9%(315/770) y la de los que no se vieron los4 núcleos 29,7% (65/219)(p<0,01).

La tasa de implantación de losembriones con buena simetría pero sin 4núcleos visibles fue 35,7% (75/210) y lade los embriones con mala simetría perocon los 4 núcleos visibles: 45,5%(20/44). La tasa de implantación de losembriones con buena simetría y 4núcleos visibles en día 2 fue del 39,7%(278/700), mientras que la de losembriones con mala simetría y no todoslos núcleos visibles en día 2 fue: 21,3%(10/47) (p<0,02)

CONCLUSIONES:

Hemos analizado embriones con 4células en día 2, sin multinucleación ycon bajo grado de fragmentaciónobtenidos a partir de oocitos depacientes menores de 39 años. Los quepresentan blastómeros semejantesmuestran mejor tasa de implantaciónque los que muestran mala simetría,

aunque la diferencia no es significativa.Los embriones en los que se pudieronobservar los 4 núcleos muestransignificativamente mejor tasa deimplantación que aquellos en que no sevieron los 4 núcleos. Los embriones conblastómeros semejantes y los 4 núcleosvisibles presentan claramente mayor tasade implantación que aquellos en los quelas células son de diferente tamaño y notodas permiten detectar su núcleo.Además, si comparamos los embrionescon una de las dos características en suversión más positiva y la otra en versiónmás negativa, obtenemos una ligeradiferencia en tasa de implantación (no estadísticamente significativa)favorable a la presencia de núcleo en las 4células frente a blastómeros de tamañosemejante. Los resultados apuntan a queambas características estudiadas demanera aislada tienen influencia sobre latasa de implantación. La observación o node los 4 núcleos de embriones con 4células en día 2 parece tener másrelevancia que la semejanza en el tamañode los blastómeros. Los embriones con 4células mononucleadas y de tamañosemejante en día 2 presentan muchamejor tasa de implantación que losembriones con células de tamañodiferente en que no se detectaron los 4núcleos en sus 4 células.

INTRODUCCIÓN:

La congelación de embrionesdesempeña un papel muy importante enlas técnicas de reproducción asistida.Actualmente, a las técnicas decongelación lenta hay que añadir una

nueva técnica, la vitrificación. Mientrasque la congelación tradicional enfría deforma lenta y progresiva los embriones,la vitrificación baja la temperatura deforma brusca. Debido a esteenfriamiento tan rápido, y a la altaconcentración de crioprotectores en el

medio utilizado para la vitrificación, seevita la formación de cristales dentro dela célula, lo cual podría ocurrir con lacongelación lenta, provocando, de estemodo, que los embriones se dañen ypierdan capacidad de implantar. Elobjetivo de este estudio es comparar la

027: POTENCIAL DE IMPLANTACIÓN DE LOS EMBRIONES ENFUNCIÓN DEL TAMAÑO RELATIVO DE SUS BLASTÓMEROS Y LAPRESENCIA DE NÚCLEOS VISIBLES EN CADA CÉLULA

F. Prados, G. Pérez-Bermejo, A. Díaz, Ó. Collado, M. Sánchez-Rivera, I. BrunaUnidad de Reproducción. Hospital Universitario Madrid-Montepríncipe. Madrid.

028: COMPARACIÓN DE LAS TASAS DE SUPERVIVENCIA EMBRIONARIASEN LOS CICLOS DE VITRIFICACIÓN VERSUS CONGELACIÓN LENTA

M. Sanchez de Burgos, L. Andrés Criado, M. Nieto Sánchez, J. Cuadros, E. HernándezClínica FIVMadrid

140



supervivencia embrionaria de ladescongelación, comparando las dostécnicas posibles: Congelación lenta yVitrificación.


Estudio prospectivo y randomizadorealizado en la clínica FIVMadrid desdeDiciembre de 2008 hasta Abril de 2009.Las técnicas de congelación utilizadasfueron la tradicional lenta con descensocontrolado de la temperatura y lavitrificación mediante el Cryotop. En cadapaciente se seleccionó una u otra técnicamediante el programa de aleatorizaciónResearch Randomizer Form v4.0.

Se llevaron a cabo un total de 75 ciclos dedescongelación tradicional vs 34 dedesvitrificación. De los 75 ciclos dedescongelación tradicional no hubotransferencia en 2 de los casos, mientrasque de los 34 ciclos de desvitrificación nohubo transferencia en 1 caso. Todos losembriones se mantuvieron en cultivo 24horas postdescongelación para observarsu desarrollo antes de transferir.

RESULTADOS:

Si consideramos como supervivenciaembrionaria aquellos embriones quepermanecen intactos tras ladescongelación y aquellos que tienen lamitad o más de sus células intactas, lasupervivencia en la descongelación fuede 59/94 (62,8%) y en ladesvitrificación de 57/63 (90,5%)siendo estadísticamente significativa(p<0,001).

De los 78 embriones procedentes de ladescongelación tradicional que no selisaron, 34 se dividieron a las 24 horas(43,6%), mientras que en los ciclos dedesvitrificación de los 59 embriones queno se lisaron se dividieron un total de 43embriones (72,9%), siendo la diferenciaestadísticamente significativa (p<0,01).

CONCLUSIONES:

La comparación mediante el test de lachi-cuadrado de los embriones con el100% de sus células, del total de losembriones supervivientes y de losembriones que se dividen a las 24 horasmostró diferencias estadísticamentesignificativas. Nuestros resultadossugieren que los embriones congeladosmediante la técnica de vitrificaciónpresentan mayores tasas desupervivencia que aquellos congeladosmediante la congelación lenta, por elloen nuestro centro estamos derivandopaulatinamente la congelación lentahacia la vitrificación con el Cryotop.

INTRODUCCIÓN:

Transferir varios embriones aumenta laprobabilidad de embarazo, aunqueincrementa el riesgo de gestaciónmúltiple. Igualmente, no todos losembriones poseen la misma calidad, ypor tanto, la misma capacidad deimplantar y desarrollarse. Buscando unequilibrio entre aumentar la tasa deembarazo simple y el riesgo deembarazo doble, comparamos la tasa deembarazo clínico obtenida entransferencias dobles con embriones dela misma calidad con la esperada,asumiendo que la probabilidad deembarazo clínico por embrión es unsuceso independiente.


Este es un estudio retrospectivo.Embriones obtenidos por FIV sonclasificados según una escala basada ensimetría celular y presencia de fragmentosen cuatro tipos, I a IV, de formadecreciente. A partir de los resultadosobservados en transferencias de unembrión de tipo I,II,III, y IV, se estimanvalores de probabilidad de embarazodoble y simple para transferencias de dosembriones. Los valores estimados soncomparados con los observados medianteanálisis de frecuencias con Chi-cuadrado,con corrección de continuidad paracomparaciones con dos grados delibertad.

RESULTADOS:

Se considera un total de 627 detransferencias de un solo embrión y1728 transferencias de dos embriones.Las transferencias de dos embrionesincluyen, pares de embriones del mismotipo (I a IV) y dos embriones de tipo I yIII. La probabilidad de embarazo clínicoobtenida en transferencias de unembrión de tipo I a IV es 15.4%, 13.9%,11.5% y 6.3% respectivamente. Lacomparación entre valores observados yestimados en transferencias de dosembriones se muestran en la tabla 1.


p<0,0001ns

029: COMPARACION ENTRE EL NÚMERO DE EMBARAZOS CLINICOSESTIMADO Y OBTENIDO EN TRANSFERENCIAS DOBLES. EFECTO DELA CALIDAD EMBRIONARIA

V. Moreno, F. Miró, E.Vidal, S. Cívico, J.M. Calafell, O. Sarrias, N. Brandi, M. Guimera, J. BalaschUnitat de Reproducció Assistida. Institut Clínic de Ginecologia, Obstetrícia i Neonatologia. Hospital Clínic de Barcelona



En todos los casos de transferencia de dosembriones, excepto en embriones tipo IV,la tasa de embarazo doble observada essignificativamente superior a la esperada(P<0.0001). En transferencia doble deembriones tipo I, la tasa de embarazosimple es también superior a la esperada(P<0.0001), en cambio, para tipos II, III yIV, ambos valores son similares. Cuandose transfieren conjuntamente embrionestipo I y III, la tasa de embarazo simpleobservada es también superior a laesperada (P=0.0067).

CONCLUSIONES:

La tasa de embarazo clínico dobleobservada en las transferencias de dosembriones es significativamente superiora lo esperado, asumiendo que laprobabilidad de obtener un embarazo porembrión es un suceso independiente. Estoes consistente con datos previamentepublicados (1) y sugiere la existencia dealguna forma de interacción positiva entrelos embriones transferidos.

La mayor tasa de embarazo simpleobservada en transferencias de dosembriones tipo I, y en transferencias deun embrión de tipo I y III no tiene unaexplicación clara. Estudios previosindican que la transferencia embrionariamúltiple aumenta la tasa de embarazoen casos de aborto de repetición (2). Esposible, pues, que este fenómeno estérelacionado con la producción defactores inmunológicos involucrados enimplantación.

REFERENCIAS

1. Matorras R et al. Hum. Reprod. 2005; 20:2923 – 31

2. Creus M et al. Am J Reprod Immunol 2003;50:420-6

INTRODUCCIÓN:

La criopreservación es una herramientade uso común en cualquier laboratoriode reproducción asistida. Las técnicas decriopreservación que utilizamos a diarioson mundialmente conocidas y de granimportancia, ya que un buen programade criopreservación permite sacar elmáximo rendimiento a los ciclos defecundación in vitro, mediante latransferencia de embriones congelados.En los últimos tiempos hemosintroducido en nuestros laboratorios laposibilidad de criopreservar ovocitosgracias a la vitrificación, lo que nos abreun mundo de posibilidades paranuestras pacientes.

En concreto la vitrificación de ovocitosen algunas pacientes nos permite evitarla congelación de embriones reduciendoel número de ovocitos a desvitrificar,pero aun así en algunos casos el día dela transferencia contamos con más de 2embriones de buena calidad, y tenemosque congelarlos.

El objetivo de este estudio es mostrar losresultados preliminares que obtenemosal trasferir los embriones descongeladosque provienen de ovocitos vitrificados,comparando estos resultados con losobtenidos con embriones descongeladosque provienen de ovocitos en fresco.


Tanto los ovocitos como los embrionesde las pacientes del grupo de estudio sehan vitrificado y desvitrificado medianteel método del Cryotop (Kitazato).

Entre enero y diciembre de 2008 hemosrealizado 216 ciclos de desvitrificación eICSI de ovocitos. No están incluidos eneste estudio ciclos de ovodovación. S ehan realizado 181 transferencias(83,8%), de las cuales han congeladoembriones 48 casos (26,5%).

RESULTADOS:

Los resultados conseguidos de estas 48pacientes son: 29 gestacionesbioquímicas (60,9%), 24 gestacionesclínicas (52,2%) con un 32,3% de tasa

142

Tabla 1. Comparación de los embarazos clínicos observados v estimados en transferencias dobles

030: RESULTADOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONESVITRIFICADOS PROVENIENTES DE OVOCITOS VITRIFICADOS.S. Pareja, C. Losada, L. Herrero, J. Fernandez, M. Jimenez, C. Bou.IVI Madrid

*p<0.001



de implantación. Las 19 pacientes queno gestaron con las transferencias enfresco, al descongelar sus embrionesobtuvimos los siguientes resultados quese comparan cuando el origen de losovocitos no es vitrificado.

CONCLUSIONES:

En nuestros ciclos de desvitrificación de

ovocitos a pesar de intentar desvitrificarel número mínimo posible para teneruna buena transferencia y no tener quecongelar embriones se dan casos muybuenos en los que se congelanembriones. Sin embargo en estosresultados preliminares hemosobservado que los embrionesdescongelados procedentes de ovocitosdesvitrificados presentan muy buenas

tasas de gestación e implantación.Aunque los casos que hemosdescongelado son pocos todavía, nosdan confianza ante la vitrificación delos embriones y nos hacen pensar que elhecho de pasar por dos vitrificaciones noafecta a su calidad y a su potencial deimplantación.

NTRODUCCIÓN:

Prácticamente en la totalidad de loslaboratorios y de forma mecánicarealizamos las capacitacionesespermáticas a 37º, cuando en realidadla Tª óptima de los espermatozoides esinferior a 32º.

OBJETIVO:

Nuestro objetivo es comparar las tasasde embarazo capacitando a 37º, y a 25º.


Seleccionamos al azar dos grupos depacientes que serán sometidos a un ciclo de Inseminación Artificial. Dentro de cada grupo de temperaturas, diferenciaremos entreNormozoospermicos, Oligozoospérmicos,Astenozoospérmicos, Teratozoospérmicos,y Oligoastenoteratozoospérmicos,Azosspérmicos no tenemos ningún caso,por lo que no lo tendremos en cuenta. Lascapacitaciones se realizan mediantelavado con centrifufación de 10 min a600g, y posterior Swim-up con SpermWash de Nicon, en el primer grupoincubamos a 37º, y en el segundo grupo a25º.

RESULTADOS:

Nuestros resultados reflejan claramenteque la tasa de embarazo en todos losgrupos, en los que hemos capacitado a25º, es significativamente superior 31%,

frente al 25% de B-Hcg positivas que nosale capacitando a 37º.

CONCLUSIONES:

Parece ser que aún sabiendo quecapacitando el semen a 37º los

resultados obtenidos son buenos,podríamos mejorar las tasas de éxitoincubando a 25º. Esta mejora puede serdebida a la detención de la ReacciónAcrosómica que se produce a Tªambiente, y que posteriormente se

reactiva en el Tracto genital femenino,puede ser que esta reactivación seproduzca con mayor intensidad osimplemente que los espermatozoidesincubados a 37º, vayan perdiendo con eltiempo su capacidad para realizar sufunción.


031: CAPACITACIÓN A 37º VS CAPACITACIÓN A 25º

I. Moragues, A. Brotons, A. A. Fernández-PeinadoClínica In Vitam Centro De Medicina Reproductiva, Elche



INTRODUCCIÓN:

La ley 14/2006, de 26 de mayo sobretécnicas de R.H.A. aclara los destinosposibles que podrán darse a lospreembriones crioconservados, siendoestos: la utilización por la propia pareja,la donación con fines reproductivos, ladonación con fines de investigación o elcese de su conservación sin otrautilización. En la U.R.H.A. del C.H. Jaén,incluimos en el C.I. preguntas a lapareja, que recogen los diferentesdestinos de dichos preembriones.

OBJETIVOS:

Analizar porcentaje de parejas que optanpor cada una de las tres opciones recogidasen la ley arriba citada, (siempre en el casode no ser utilizados por la propia pareja),en los siguientes supuestos:

En el supuesto de no renovación dedicho consentimiento previo intento endos ocasiones por parte del centro.

En caso de que transcurridos dos años decrioconservación, existiera desacuerdode la pareja sobre el destino de lospreembriones (por razón de separación,divorcio, etc.).

En el caso de incapacidad mental ofallecimiento de alguno de los miembroso de ambos.

Relacionar respuestas con nivel deestudios y nacionalidad, en cada uno delos tres supuestos.


Revisión retrospectiva mediante base dedatos informatizada (Access)procesando con el programa SPSS losdatos de los C.I. obtenidos de 245historias de parejas sometidas a ICSI,desde Mayo/06 hasta Abril/09. Datosanalizados: nivel de estudios,nacionalidad en las diferentes opciones:

desacuerdo de la pareja, incapacidadmental o fallecimiento de alguno de losmiembros de la pareja.

RESULTADOS:

De las 245 parejas con C.I. revisado,97de estas (39.6%) eligen en los tressupuestos la misma opción de las cuales9.3% (n=9) eligen donación a otrasparejas, 50.5% (n= 49) eligen donarlospara investigación, y 40.2% (n=39)delas parejas eligen la descongelación sinotra utilización..

El resto de las parejas 148 (60.4%) eligendistintas opciones según el supuesto y deestas el 89.2% (n=132) en ningúnsupuesto eligen descongelación, mientrasque 10.8% de estas parejas (n=16) enalguno de los tres supuestos eligen ladescongelación sin otra utilización.

Nivel de estudios:

Si analizamos los datos en relación conel nivel de estudios obtenemos lossiguientes porcentajes:

Nacionalidad

De las 245 parejas el 96.7% (n=237) sonde nacionalidad española y 3.3% (n=8)de nacionalidad extranjera alguno oambos miembros de la pareja.

CONCLUSIONES:

El C.I. para criopreservación y

almacenamiento de preembriones enR.A. es más que un simplerequerimiento. Es una toma de decisióninformada del destino de preembrionessobrantes de un ciclo.

Son mayoría las parejas (77.5%) queoptan por donación, ya sea a otrasparejas o investigación, frente al 15.9%que eligen la descongelación sin otrautilización. Sólo el 6.7% de las parejasse dejan influir por los supuestos yeligen distinta opción según cada uno deellos.

La nacionalidad no es significativa parael estudio por haber muy pocas parejasextranjeras.

Llama la atención que el 46.2% deparejas con estudios primarios eligen ladescongelación, frente al 10.2% y 12.8%de las parejas con estudios medios yuniversitarios respectivamente.

032: EMBRIONES CRIOCONSERVADOS ¿QUE HACER? LA PAREJADECIDE

M. L. García, C. Del Campo, I. Morales, P. Fuentes, M. J. Campos, V. Maldonado, M. J. Medina.U. R. H. A. del Complejo Hospitalario de Jaén, Jaén

144



INTRODUCCIÓN:

La valoración exhaustiva del potencialimplantatorio de los embrionesobtenidos de FIV-ICSI es un tema al quededicamos mucha atención en loslaboratorios, observándolos en todossus estadíos, desde el día de la punciónhasta el momento de la transferencia. Ennuestro laboratorio realizamos uncultivo individualizado de losembriones, observando el patrón depronúcleos que presentan en día 1 (verfigura 1) y su evolución y calidad (segúncriterios ASEBIR) hasta el día de latransferencia (día 2 o día 3). Dado que ladeterminación del patrón de pronúcleosconlleva un mayor tiempo deobservación y, por tanto, de exposiciónfuera de los incubadores y, teniendo encuenta que en otros laboratorios seobserva la fecundación sin determinar elpatrón de los PN observados obteniendotambién muy buenos resultados,decidimos estudiar si, en nuestro centro,hallábamos una relación entre patrónpronuclear y calidad embrionaria paradecidir si merecía la pena seguir con lavaloración de dichos patrones.


Observamos de forma retrospectiva 1730zigotos obtenidos en los ciclos de FIV-ICSI de nuestro centro durante el año2008. De éstos, 741 fueron observadoshasta día 2 y 989 hasta día 3.

Los patrones de pronúcleos queseguimos se muestran en la Fig.1,agrupándose en cuatro grupos (GI, GII,GIII, GIV) y la clasificación de calidadessigue la propuesta por ASEBIR (calidadA, B, C y D).

Los ovocitos maduros fueronmicroinyectados o inseminados. Tras lamicroinyección, se pasaron a microgotasde 20 microlitros de G1 plus v.5 en placasFalcon embriotestadas 60x15 para sucultivo individualizado. Los ovocitos

inseminados se pasaron a microgotas deG1 a las 3 – 5 horas post-inseminación.

Se valoraron los pronúcleos a las 18hpost ICSI o post inseminación. Sepasaron a placas nuevas de G1manteniendo su posición de cultivo. Seobservó su desarrollo hasta día 2 o día 3anotando las características de cadaembrión.

RESULTADOS:

La frecuencia general de patronespronucleares observados en nuestrolaboratorio es la siguiente: 24.9% GI;46.8% GII; 4.9% GIII; 23.4% GIV.

En embriones cultivados hasta día 2, ladistribución de frecuencias de calidadesobservadas fue la siguiente: 37.38%calidad A; 24.70% calidad B; 15.92%calidad C; 22.00% calidad D. Para día 3,la distribución observada fue: 30.94%calidad A; 13.35% calidad B; 15.37%calidad C; 40.34 calidad D.

Sería de esperar una distribución similarde dichas frecuencias cuando seanalizara conjuntamente patrónpronuclear y calidad embrionaria siambos factores no estuvierancorrelacionados. En cambio observamosuna tendencia al aumento de calidad Cen detrimento de la calidad A enembriones procedentes de patrón GIII.Así mismo, se observa mayor proporciónde embriones de calidad A así como debuena calidad (A+B) derivados de GI,especialmente en las observaciones dedía 3.

CONCLUSIONES:

Una conclusión desprendida del análisisrealizado es que en día 2 se observamayor porcentaje de embriones debuena calidad (A+B) que en día 3. Estoes debido sobretodo a embriones que,siendo de calidad óptima en día 2, nodividen o lo hacen en un grado muy bajo

(sólo una división) entre día 2 y día 3,pasando a calidad D. Con esto, nuestraelección inicial sería la de transferenciaen día 3, que permite seleccionar mejorlos embriones.

La tendencia observada en nuestrolaboratorio muestra que el patrónpronuclear GIII tienen un peorpronóstico de calidad embrionaria. Porel contrario, la observación de GI enpronúcleos da una mayor probabilidadde embrión de buena calidad.

Gráfico 1: Calidad embrionaria en D+3 en funcióndel patrón pronuclear (GI vs. GIII).

Fig.1: patrones pronucleares

033: RELACIÓN ENTRE LOS PATRONES PRONUCLEARES Y LACALIDAD EMBRIONARIA SEGÚN CRITERIOS ASEBIR

M. Brossa, X. Blanch, A. Yus, M. Antich.Fertilab, Barcelona




INTRODUCCIÓN:

En la literatura existen datoscontradictorios acerca de los efectos delos espermatozoides sobre el desarrolloembrionario y principalmente sobre laformación del blastocisto.

Una herramienta útil a la hora de evaluarla influencia del factor masculino en lostratamientos y posterior resultado de unciclos de Reproducción Asistida loconstituyen los programas de donación deovocitos, ya que en este caso se cuentacon un parámetros de control como sonlos ovocitos, lo que nos permite estudiarla influencia del factor masculino.

El objetivo de nuestro trabajo esdeterminar el efecto del factormasculino severo en la tasa de formaciónde blastocisto comparando un modelode ovodonación con un modelo deovocitos propios.


Se evaluó la tasa de formación deblastocisto de un total de 2467embriones procedentes de ciclos de

ovodonación (Grupo A) y/o ciclos deFIV/ICSI con ovocitos propios (Grupo B).En día 5 de desarrollo, se evaluaron losembriones según la expansión delblastocele y el número de células eintegridad tanto de la masa celularinterna como del trofoectodermo. Seexcluyen pacientes y donantes con PCO yendometriosis. El análisis de la muestrade semen se realiza en función de losparámetros normales según los criteriosde la OMS, de modo que aquellasmuestras con menos de 5 millones deespermatozoides por mililitro, se definencomo factor masculino severo (FMS).

El análisis estadístico incluye un testestratificado que permite comparar lavariable de estudio en muestras normalesy patológicas, tomando el origen de losovocitos como variable de control.

RESULTADOS:

La tasa de desarrollo hasta blastocistomejora en ciclos de ovodonación encomparación con los ciclos de gametospropios e incluso el factor masculinoafecta menos en dicha tasa OR= 0.39(CI95% 0.31-0.49)

Tras la aplicación del test estadístico deMantel-Haenszel, el valor de ORreferente a la tasa de desarrollo ablastocisto fue de 0,70 (CI 95% 0,67 –0,91 ) p>0.001; estos datos son similaresa los obtenidos en las tasas globales, porlo que podemos asumir el efecto delfactor masculino severo sobre eldesarrollo embrionario, siendo esteefecto más evidente en los ciclos conovocitos propios.

CONCLUSIONES:

El factor masculino severo es responsablede una baja tasa de desarrollo ablastocisto pero puede ser parcialmentecorregido por la calidad ovocitaria. Losovocitos procedentes de mujeres jóvenes yfértiles contrarrestan los problemasderivados de trabajar con muestrasseminales de baja calidad. Una posibleexplicación de este hecho reside en losmecanismos de reparación ovocitarioscapaces de subsanar los errores del DNAque aparecen como consecuencia de unaespermatogénesis defectuosa.

INTRODUCCIÓN:

En Noviembre de 1978 se instauró ennuestro país el primer banco de semenen un hospital de la red pública

(Hospital de Cruces), pero no fue hasta12 años más tarde (Julio de 1990),cuando en nuestro centro empezamos acongelar de forma habitual muestrasseminales en pacientes con patologías

susceptibles de recibir tratamientospotencialmente esterilizantes.

El propósito de este trabajo, es presentarnuestros resultados, analizar qué

034: INFLUENCIA DEL FACTOR MASCULINO SEVERO EN ELDESARROLLO EMBRIONARIO

M. Cruz, B. Gadea, M. Martínez, C. Lizán, M. A. López, Y. Ayllón, I. Pérez Cano, M. Muñoz, M. Meseguer.IVI Alicante

035: PACIENTES ONCOLOGICOS Y TECNICAS DE REPRODUCCIÓNASISTIDA EN EL HOSPITAL DE CRUCES

B. Corcóstegui, R. Mendoza, V. Aparicio, O. Ramón, R. Matorras, T. Martínez-Astorquiza.Unidad de Reproducción Humana. Servicio de Obstetricia y Ginecología. Hospital de Cruces (Vizcaya).

146



porcentaje de pacientes siguen a lo largo delos años en contacto con el banco desemen, evaluar si se realizan los controlescorrespondientes y cuántos de ellos hanrecurrido a una Técnica de ReproducciónAsistida.


Desde Julio de 1990 hasta Diciembre del2008, hemos recibido en el Laboratoriode Andrología de la Unidad deReproducción Humana del Hospital deCruces (Vizcaya) 638 pacientes remitidosfundamentalmente de los Servicios deUrología, Oncología Médica yHematología, tanto de nuestro hospitalcomo del resto de los hospitales del PaísVasco, Cantabria, La Rioja y Burgos.

Las enfermedades más frecuentes en losvarones que han acudido a nuestrobanco de semen para criopreservaciónespermática han sido: cáncer testicular(42.0%), enfermedad de Hodgkin(30.7%), linfoma no-Hodgkin (10.5%) yleucemia (4.0%). Otras indicacionesfueron el 12.7%. La edad de lospacientes osciló entre los 13 y 58 años,

estando la mayoría de ellos (65.6%), enel rango de 18 a 30 años.

RESULTADOS:

Del seguimiento de estos pacientesllama la atención la alta tasa de casos enque se desconoce su evolución, dado queno se han vuelto a poner en contacto conel banco (65.76%).

Hasta Abril del 2009, tan sólo en 31 deestos 638 pacientes se ha realizado unatécnica de Reproducción Asistida. En 27de ellos ha sido con sus muestrasseminales criopreservadas antes derecibir el tratamiento y en los 4restantes, a pesar de tener muestrascongeladas, con semen fresco.

Se han iniciado un total de 47 ciclosFIV/ICSI en 28 pacientes, de los cuáles 3han sido cancelados por baja respuesta. Sehan realizado 38 transferenciasembrionarias, consiguiendo 14 embarazos(36,84% embarazo/transfer).

Cuatro de estas pacientes, recibieron eltratamiento tras el fallecimiento de su

pareja y 2 de ellas, quedaron gestantes.

En 5 pacientes, se han realizado Inseminaciones Intrauterinas,obteniéndose embarazo en 3 de ellas.

CONCLUSIONES:

La criopreservación de semen deberíaconsiderarse en situaciones en las cuálesse va a aplicar un tratamiento queprobablemente afecte a la fertilidad,como en el caso de las enfermedadesmencionadas anteriormente.

Tan sólo un pequeño porcentaje de lospacientes que criopreservan semen enestas situaciones (<5%), utilizanposteriormente el mismo con finesreproductivos. Es más, la mayor parte deellos (65.76%), ni siquiera se ponen encontacto con el banco de semen pararealizarse los controles pertinentes trasel tratamiento.

No obstante, entre los pacientes queposteriormente recurren a una TRA, losresultados son alentadores.

INTRODUCCIÓN:

Dada la demanda creciente de visitasinformativas sobre donación de óvulosen las clínicas de reproducción asistida,el objetivo de este estudio prospectivono randomizado es conocer cuál es elperfil sociológico de las candidatas aovodonación en nuestro centro.


Durante el año 2008 hasta mayo del2009, con la colaboración de la unidadde enfermería, se realizó una encuestaescrita con preguntas relativas adiversos aspectos de la vida personal ysocial de las candidatas. De formavoluntaria, completaron dicha encuestael día de su visita informativa.

RESULTADOS:

Se obtuvo una participación de 302candidatas cuya edad media es de 27,1años, de las cuales, el 45% son europeas(30% españolas, 6% rusas), y el 55%sudamericanas (22% brasileñas, 6%ecuatorianas, 5% colombianas).

Respecto al nivel de estudios, un 37%han cursado el bachillerato, el 27%tienen estudios básicos, un 18%formación profesional, un 9% unadiplomatura y un 9% una licenciatura.

El 14% de ellas se dedican a los serviciosde limpieza, el 12% a la hostelería y el 6%a los servicios asistenciales. Cabe destacarque sólo un 7% son estudiantes y que un12 % se encuentran en desempleo.

En relación al estado civil, observamosque mayoritariamente son mujeressolteras con pareja (45%), seguidas delas solteras sin pareja (33%), casadas(16%) y separadas (6%).

Referente al número de personas con lasque han mantenido relaciones sexuales.,el intervalo que predomina es “de una atres personas” (42%), seguido por “másde cinco” (35%) y “entre tres y cinco”(21%). Señalar que cuatro candidatasafirman no haber mantenido relaciones.

Los métodos anticonceptivos másutilizados son el preservativo (34%) y laspastillas anticonceptivas (30%). Esllamativo que el 12% señalen prescindirde cualquier método.


036: PERFIL SOCIOLÓGICO DE LAS CANDIDATAS A DONACIÓN DEÓVULOS

M. García, S. Sánchez, A. Yus, M. Antich, M. Lafont.Fertilab (Barcelona)



Casi la mitad de las encuestadas sonmadres (41%) frente a un 59% que no loson. Muchas de ellas, el 35%, refierenhaber presentado algún aborto.

El 36% han sido donantes en algúnmomento, en el 47% de las ocasiones desangre, en el 46% de óvulos en otrocentro, y el 6% de ambos.

En cuanto a los hábitos tóxicos, el 71%bebe alcohol ocasionalmente y el 20%afirma haber probado drogas, siendo lamarihuana la más consumida (47%).

Finalmente, nos interesamos por lamotivación de las candidatas resultandoser en un 37% de los casos lacompensación económica, frente al 32%que afirma hacerlo de forma altruista y

el 24% por ambos motivos.

Es interesante el hecho de que el 38% delas encuestadas señalen tener conocidoscon problemas de fertilidad.

CONCLUSIONES:

Los resultados de esta encuestaestablecen un perfil de mujer de 27 años,española, con un nivel de estudios medio ytrabajadora en el sector de servicios.Suelen ser mujeres solteras con parejaestable, sin hijos y que tomanprecauciones a la hora de mantenerrelaciones sexuales. En general, no bebenalcohol regularmente ni consumen drogas.

Más allá del motivo económicoindudable, encontramos casi en la

misma proporción mujeres a las que lesmueve el altruismo y un sentimiento desolidaridad, pues suelen tener conocidoscon dificultades para tener hijos. Estadisposición altruista es evidenciada enel alto número de mujeres que sondonantes de sangre. Hemos observadomayor porcentaje en españolas y, adiferencia de lo que esperábamos,menor en mujeres con hijos o conabortos.

Observamos un gran número decandidatas que han realizadodonaciones previas de óvulos lo quepone de manifiesto la necesidad de lacreación del Registro Nacional dedonantes de gametos.

INTRODUCCIÓN:

La criopreservación embrionaria permitepreservar los embriones excedentes debuena calidad no transferidos en el cicloen fresco para su posterior transferencia,aumentando las tasas de gestación porciclo iniciado. La técnica de vitrificacióncombina tasas de enfriamientoultrarrápidas y concentraciones elevadasde crioprotectores, de forma que se evitala formación de cristales de hielo duranteel proceso, aumentando la supervivenciacelular. En este trabajo se presenta laexperiencia clínica en vitrificaciónembrionaria así como los resultadosobtenidos tras la desvitrificación y transferencia de embrionescriopreservados en la Unidad deReproducción del Hospital Universitariola Fe de Valencia.


Se incluyeron las vitrificaciones

embrionarias realizadas desde Octubrede 2007 hasta Abril de 2009. Duranteeste periodo se vitrificaron embrionesen 234 casos, con un total de 749embriones vitrificados. Se vitrificó untotal de 635 embriones en D+2 (84,8%),43 embriones en D+3 (5,7%) y 71embriones en D+5/6 (9,5%) de buenacalidad (grados a y b, categoríasASEBIR). En 6 de los casos sevitrificaron embriones en distintoestadio de desarrollo. Para los procesosde vitrificación/desvitrificación seempleó el protocolo descrito porKuwayama y cols (2005), comercializadopor Irvine ScientificÔ (Vit KitÔ-Freeze/Thaw) con el CryoTipÔ comocontenedor. Se realizaron un total de102 desvitrificaciones, con 253embriones desvitrificados. 67 parejasrealizaron un solo ciclo decriotransferencia, 16 pacientesrealizaron dos ciclos decriotransferencia y 1 pareja tuvo tresciclos de criotransferencia. Se

estudiaron las característicasmorfológicas de los embriones antes ydespués de la desvitrificación, así comoen el momento de la transferencia. Setransfirieron embriones catalogadoscomo viables (>50% blastómerasintactas) tras 3-4 horas de cultivo o losque mostraron al menos una divisióntras 18 horas de cultivo in vitro. Para latransferencia se utilizaron ciclossustituidos de preparación endometrialcon estradiol transdérmico yprogesterona natural por vía vaginal. Encaso de que la determinación de hCG(14 días después de la criotransferencia)fuera superior a 20UI/L se citó a lapaciente para el diagnóstico ecográficode gestación (saco embrionario conlatido cardiaco).

RESULTADOS:

Se realizaron 102 desvitrificaciones conun total de 253 embrionesdesvitrificados, 220 embriones en D+2

148

037: EXPERIENCIA CLÍNICA DE LA VITRIFICACIÓN DE EMBRIONESEN LA UNIDAD DE REPRODUCCIÓN HUMANA ASISTIDA DELHOSPITAL UNIVERSITARIO LA FE DE VALENCIA.

C. C. Duque, J. V. Martínez, I. Molina, A. Monzó, M. Romeu, A. Romeu.U. R. H. Hospital Universitario la Fe, Valencia.



(86,9%), 21 en D+3 (8,3%) y 12 enD+5/6 (4,7%). La tasa de recuperaciónembrionaria tras la desvitrificación fuedel 92,1% (233/253). La tasa global desupervivencia (>50% blastómerasintactas) fue del 78,5% (183/233), 78%en D+2, 90% en D+3 y 66,6% en D+5/6.Fueron transferidos 174 embriones en 87criotransferencias, anulándose en 15casos la transferencia pordegeneración/lisis y/o no recuperaciónembrionaria tras la desvitrificación.

La tasa de gestación bioquímica por

criotransferencia fue del 26,4% (23/87),siendo 27,9% (17/61) en D+2, 21,7%(5/23) en D+3 y 33,3% (1/3) para lastransferencias realizadas en D+5/6. Latasa de gestación clínica (sacoembrionario con latido cardiaco) fue del21,8% (19/87), siendo 24,6% (15/61)en D+2, 13% (3/23) en D+3 y 33,3%(1/3) para las transferencias realizadasen D+5/6. La tasa de implantaciónembrionaria fue del 12,1% (21/174),siendo 13,7% (17/124) en D+2, 6,8%(3/44) en D+3 y 16,6% (1/6) para lastransferencias realizadas en D+5/6. La

eficacia global del proceso, calculadacomo número de gestaciones clínicassobre el número total dedesvitrificaciones fue del 18,6%(19/102).

CONCLUSIONES:

La vitrificación de embriones es unaherramienta útil, rápida y segura quepermite prevenir la gestación múltipletras ciclos de estimulación ovárica,además de aumentar la tasa degestación acumulada por ciclo.

INTRODUCCIÓN:

La vitrificación es una técnica decriopreservación que consistebásicamente en la utilización desoluciones con altas concentraciones decrioprotectores, que al enfriarse aelevadas velocidades, alcanzan laconsistencia de un vidrio. De esta forma,se pasa rápidamente la franja crítica delefecto chilling y se evita la formación decristales de hielo tanto intracelularescomo en el medio extracelular.

La vitrificación se ha convertido en losúltimos años en una alternativa a lacongelación lenta dados los buenosresultados aportados por diversosgrupos y a la sencillez de la técnica.

El objetivo de este trabajo ha sido revisar nuestros resultados delprograma de vitrificación/desvitrificaciónde embriones durante el primer año deimplantación de ésta técnica en nuestro centro (2008) y compararlos con los resultados decongelación/descongelación deembriones durante 2007.


Se realizaron 36 ciclos devitrificación/desvitrificación conembriones vitrificados en D+2 ó D+3 debuena calidad durante 2008. Se

utilizaron los medios comerciales deIrvine Scientific cuya composición estábasada en DMSO y etilenglicol comocrioprotectores permeables y sacarosacomo no permeable. Como soporteembrionario se utilizaron las pajuelas dealta seguridad biológica deCryoBioSystem para vitrificación.

Durante 2007, se realizaron 49 ciclos decongelación/descongelación conembriones congelados en D+2 ó D+3 debuena calidad con el protocolo clásico.Se utilizó el medio comercial de Vitrolife(Freeze Kit 1®) con 1,2-propanodiol ysacarosa como crioprotectores. Para elcargado de los embriones se utilizaronlas pajuelas para congelación deembriones de CryoBioSystem. La curvade congelación se llevó a cabo con uncongelador programable de Minicool.

Tanto la descongelación como ladesvitrificación se llevaron a cabo el díaanterior a la criotransferencia para

valorar la evolución de los embriones.

RESULTADOS:

CONCLUSIONES: La vitrificación es unaexcelente alternativa a la congelaciónlenta, duplicando nuestras tasas degestación e implantación durante elprimer año de funcionamiento con estatécnica, que además es de aplicaciónsencilla, rápida y económica.

BIBLIOGRAFÍA:

Kuwayama, M., Vajta, G., Ieda, S. and Kato,O. (2005). Vitrification of human embryosusing the CryoTip® method. Reprod.BioMed. Online, 11:608-14.

Testart, J., Lassalle, B., Belaisch-Allart, J.,Hazout, A., Forman, R., Rainhorn, J.D. andFrydman, R. (1986) High pregnancy rateafter early human embryo freezing. Fertil.Steril., 46(2):268-72.


038: PROGRAMA DE CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES:VITRIFICACIÓN VS CONGELACIÓN LENTA.

P. Duque, L. M. R. Menes, F. Graña, V. Sánchez, A. Gutiérrez, C. Gutiérrez, A. Valles, M. Vázquez, Y. Ruano, N. Fernández, P. Fernández. P. E. dela Fuente, C. García-Ochoa.CEFIVA (Centro de Fertilización in Vitro de Asturias). Oviedo. Gijón. ANACER (Asociación de Clínicas de Reproducción Asistida)



INTRODUCCIÓN:

La microinyección intracitoplasmáticade espermatozoides (ICSI) requiere eluso de medios que ralenticen elmovimiento de los espermatozoides,facilitando así la angulación de la cola ysu posterior inmovilización. La mayoríade estos medios contienenpolivinilpirrolidona (PVP), polímero conposibles efectos tóxicos. Otros medioscomo el SpermCatchTM (Nidacon), quecontienen ácido hialurónico (HA),deberían tener una mayor eficacia yseguridad, ya que el HA participa deforma fisiológica en el proceso defecundación in vivo. El objetivo de esteestudio fue el de comparar la eficacia demedios utilizados en la selecciónespermática que contienen HA vs. PVP enlos resultados de ciclos de FIV-ICSI.


Se evaluaron un total de 20 ciclos de FIV-ICSI. La mitad de los ovocitos semicroinyectaron utilizando un medioque contiene PVP y la otra mitad con unmedio que contiene HA(SpermCatchTM). Los embriones seclasificaron siguiendo el sistema descoring embrionario recomendado porASEBIR. Se transfirieron una media de2,1 embriones por paciente en D+2 o enD+3 y los embriones sobrantes fueron

congelados. Se compararon las tasas defecundación, las tasas de división ycalidad embrionaria, y las tasas deembarazo obtenidas en ambos grupos. Elanálisis estadístico se realizó medianteStudent t-test y Chi-square.

RESULTADOS:

Las tasas de fecundación por ciclo, lastasas de división y calidad embrionariafueron más altas en el grupo deSpermCatchTM comparado con el grupode PVP, si bien estas diferencias nofueron estadísticamente significativas(Tablas 1 y 2). Las tasas de embarazo porciclo fueron similares en ambos grupos(66% y 50 %) Cabe destacar que en elgrupo de SpermCatchTM la tasa de

fecundación fue del 100% en un 53% delos ciclos mientras que en el de PVP tansolo en un 12% de los ciclos.

CONCLUSIONES:

Los resultados de este estudio indicanque el uso del medio SpermCatchTMmejora los resultados en ciclos de FIV-ICSI comparado con el PVP. La falta designificancia estadística en losparámetros evaluados probablementeesté relacionada con el número limitadode casos evaluados hasta ahora. Estosresultados preliminares deberán serconfirmados en una serie más amplia decasos.

INTRODUCCIÓN:

Se busca determinar si existe un umbralmínimo y máximo en el número deovocitos recuperados en punción en losque se optimice el ciclo de FecundaciónIn Vitro.


Se realiza un análisis retrospectivo de losciclos de estimulación ovárica llevados acabo en nuestro centro entre marzo de2007 y marzo de 2009, con un total de437 ciclos de estimulación ovárica en los

que se ha llegado a realizar punciónfolicular. Se agrupan las pacientes porfranjas de edades (<30, 31-33, 34-36,37-39 y >40), y para cada grupo serealizan distribuciones según el númerode ovocitos obtenidos (<4, 5-9, 10-14,15-19 y >20). Se emplea la técnica de

039: LA SELECCIÓN DE ESPERMATOZOIDES CON UN MEDIO QUECONTIENE ACIDO HIALURÓNICO MEJORA LOS RESULTADOS ENCICLOS DE FIV-ICSI. Cooper J1, Busquets A1, López-Teijón M1, 2, Álvarez JG1, 2.1Instituto Marques; 2Fundación Leonardo Marquès, Barcelona.

040: OPTIMIZACION DEL NUMERO DE OVOCITOS RECUPERADOS ENPUNCIONF. Guijarro, E. Garijo, M. Escudero, A. Guijarro, C. ÁlvarezUnidad de Reproducción Asistida, Hospital “La Moraleja” (Sanitas). Madrid.

150

Tabla 1

Tabla 2



ICSI en el 98,6% de los casos con una tasade fecundación del 80,4%. Se observantambién los ciclos en los que ha habidotransferencia de más de un embrióny con las transferencias de embriones

congelados asociados a cada ciclo.

La distribución final por edades ynúmero de ovocitos se refleja en lagráfica de barras:

RESULTADOS:

En todos los grupos de edades seencuentra un aumento significativo enlas tasas de embarazo cuando laobtención de ovocitos en punción se

sitúa entre 10 y 14. La baja tasa deembarazos obtenidos en aquellaspacientes menores de 30 años se debe alaumento de hiperestimulaciones ycancelaciones de la transferencia porriesgo de SHO.

CONCLUSIONES:

Las tasas de embarazo mantienen una tendencia ascendente hasta los 10-14 ovocitos recuperadosindependientemente de la edad de lapaciente, maximizándose en este margenlos resultados del ciclo de estimulación. Deigual forma, se concluye que no son

necesarias estimulaciones ováricasexcesivas para mejorar las tasas degestación.

INTRODUCCIÓN:

El diagnóstico genético preimplantacional(DGP) es una técnica habitual en loslaboratorios de fecundación in vitro quepermite seleccionar embriones antes desu transferencia al útero.

OBJETIVO:

El objetivo de este estudio ha sidodeterminar el número óptimo deovocitos y embriones que seríannecesarios obtener en un ciclo de DGPpara llegar a realizar transferenciasembrionarias electivas.


Se analizaron 94 ciclos de DGP, condiversas indicaciones. La biopsia (1 ó 2células) se realizó en día +3 deldesarrollo embrionario, utilizando unasolución ácida de Tyrode para elhatching asistido.

El fijado para hibridación in situfluorescente (FISH) de las célulasembrionarias se llevó a cabo medianteprotocolo modificado de Tarkowski(lavado de la célula en solución hipotónicaKCl 0.075 M y fijación con metanol-acético3:1). Se estudiaron 9 cromosomasX,Y,13,15,16,17,18,21,22 .

RESULTADOS:

Se realizaron 94 ciclos de ICSI/DGP conpunción ovocitaria en todos ellos,obteniéndose 632 ovocitos MII (6,72Ovocitos MII/punción). Fueron estudiados454 embriones (4,82 embrionesestudiados/punción) de los cuales 387tuvieron un diagnostico (4,29 embrionescon diagnóstico/punción). De ellos, 140embriones fueron normales (36,18%), loque supone una tasa de embrionesnormales por punción de 1.48.

CONCLUSIONES:

En el global de las indicaciones de DGP y


041: NÚMERO ADECUADO DE OVOCITOS Y EMBRIONES EN UN CICLODE DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL PARAASEGURAR TRANSFERENCIAS ELECTIVAS.

1P. Duque, 1L. M. R. Menes, 1F. Graña, 1V. Sánchez, 1A. Gutierrez, 1C. Gutierrez, 1A. Valles, 1M. Vázquez, 2Y. Ruano, 2N. Fernández, 2P. Fernández.2P. E. de la Fuente, 2C. García-Ochoa.1CEFIVA (Centro de Fertilización in Vitro de Asturias). Oviedo. Gijón. 2ANACER (Asociación de Clínicas de Reproducción Asistida)



con nuestra tasa de fertilización del71,83%, hace que necesitemos 6

ovocitos MII por punción, para poderrealizar DGP en 3-4 embriones (3.5) y

obtener al menos un embrión normalpara transferir. Para lograr que latransferencia sea electiva, necesitaríamosal menos 14 ovocitos MII por punción ylograr estudiar 10 embriones. Estosdígitos van a variar de una formasignificativa si tenemos en cuenta cadauna de las indicaciones del DGP.

BIBLIOGRAFÍA:

arkowski, A.K. (1966) An air drying methodfor chromosome preparations from mouseeggs. Cytogenetics, 5:394-400.

INTRODUCCIÓN:

Aunque el efecto de la edad en lafertilidad de la mujer está demostrado,aun no hay consenso sobre el efecto dela edad del varón en cuanto a lacapacidad reproductiva. Laespermatogénesis es un procesocontinuo hasta edades avanzadas,aunque la efectividad en la producciónde gametos podría disminuir,produciendo embriones con un poolgenético defectuoso. El ovocito tienecapacidad reparadora de daño genético,sin embargo su capacidad tambiénmerma con la edad.

Este estudio tiene como objetivo valorarel efecto de la edad del varón en losresultados de un programa de FIV segúnla edad de la mujer, y también según siprovenían de óvulos de una donantesana o de una paciente.


Este estudio incluye 2454 ciclos. Loscasos se dividieron en 6 grupos según elorigen de los ovocitos (de donante o depaciente) edad de las pacientes (≤ 35 o >35 años) y de los pacientes (≤ 40 o > 40

años). El número de embrionestransferidos por paciente fue el mismoen todos los grupos. El análisisestadístico se realizó mediante Chi-Cuadrado para datos categóricos yANOVA para los datos continuos. Lacorrección de Bonferronni paracomparaciones múltiples se usó para elanálisis post-hoc.

RESULTADOS:

Los resultados de los ciclos de FIV sedetallan en la tabla.

CONCLUSIONES:

Tanto la edad de la mujer como la edaddel hombre tienen impacto en elresultado clínico tras la realización de unciclo de FIV. Los datos obtenidos en esteestudio demuestran que los resultadosson peores cuando el varón es mayor, ysignificativamente peores cuando tantoel hombre como la mujer son añosos.Observando los resultados obtenidos enlos ciclos de mujeres jóvenes (tantodonantes como pacientes) el ovocitodebe tener un papel reparador de dañooriginado por la edad del varón.

152

042: EFECTO REPARADOR DEL OVOCITO EN CICLOS DE FIV CONVARONES JOVENES Y MAYORES.

M. Esbert, M. Florensa, M. Riqueros, M. Martín, A. Ballesteros, G. CalderónIVI-Barcelona

a b c Valores de las mismas filas con diferentes superíndices son distintos (p<0.05).



INTRODUCCIÓN:

El Complejo Mayor deHistocompatibilidad (MHC) conocido enhumanos como sistema HLA (AntígenosLinfocitarios Humanos), comprende unaregión de casi 4 Mb en el brazo corto delcromosoma 6. Contiene los loci máspolimórficos del genoma y es elresponsable de la respuesta inmune.

Esta respuesta es especialmenteimportante en los trasplantesalogénicos de células madrehematopoyéticas ya que la disparidadentre el donante y el receptor hace queexistan problemas como el rechazo delinjerto o la enfermedad injerto contrahuésped. Estos problemas aumentan elriesgo de complicaciones y la mortalidadde los receptores de este tipo detrasplantes. La dificultad de encontrardonantes con un HLA idéntico hagenerado la demanda social del usoconjunto de las técnicas de reproducciónasistida y diagnóstico genéticopreimplantación (DGP) para seleccionarembriones histocompatibles comofuturos donantes de células madrehematopoyéticas del cordón umbilicalpara el hermano que requiere eltrasplante. La complejidad aumenta si laenfermedad implicada es hereditaria yambos padres son portadores de lasmutaciones responsables.

El objetivo del presente trabajo esmostrar la estrategia seguida para loscasos de DGP-HLA. Utilizamos comoejemplo el caso de una pareja con un hijoafecto de Anemia de Fanconi. El niño esheterocigoto compuesto para lasmutaciones c.4130C>G yc.3788_3790delTCT en el gen FANCA,situado en el cromosoma 16. Laaplicación de estas técnicas requiere laautorización expresa previo informefavorable de la Comisión Nacional deReproducción Humana Asistida.


En estos casos, los estudios preclínicosson de radical importancia. En unaprimera fase se determina el haplotipo(conjunto de alelos) HLA de los padres ydel hijo enfermo. Para ello utilizamos unpanel de 55 marcadores molecularesmicrosatélites (STRs) distribuidos a lolargo de la región HLA mediante PCR-heminested. De estos marcadores, seseleccionan los 8-10 más informativosen la familia y que cubran toda la regiónHLA. Esto es importante para detectareventuales sucesos de recombinaciónsimple o doble que pueden ocurrir en losgametos, previos a la formación de losembriones. En estos casos el embrión nosería histocompatible. En segundo lugaradaptamos las técnicas de análisis defragmentos (c.3788_3790delTCT) yminisecuenciación (c.4130C>G) paraidentificar por métodos directos lasmutaciones familiares causantes de laenfermedad. Finalmente, se valida todoel proceso en linfocitos únicos de lapareja. Debido a la gran cantidad deregiones génicas estudiadas de formasimultánea, el DGP se realiza mediantela amplificación previa del genomacompleto de cada blastómero con elmétodo de MDA (Multiple DisplacementAmplification). Esto nos permiteobtener una cantidad de ADN de partidasuficiente para estudiar todas lasregiones implicadas.

Validado el proceso se inicia el ciclo deestimulación ovárica. La probabilidad deque un embrión sea histocompatible esdel 25% y de que sea histocompatible ysano (en caso de existir una enfermedadsanguínea hereditaria recesiva en lafamilia) es del 18’75%. El controlestricto de la estimulación ovárica y elperfecto funcionamiento del laboratoriode embriología son esenciales en estosciclos. Es necesario obtener un númerosuficiente de embriones para aumentar

al máximo la probabilidad de tener algúnembrión compatible y sano. En este sentido, el consejo genéticoreproductivo previo es especialmenteimportante en estas parejas.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES:

En nuestra experiencia el análisis de loshaplotipos HLA basado en STRscombinado con diferentes técnicas dedetección de mutaciones resulta unmétodo robusto y fiable. Nos permiteinterrogar de forma simultánea, almenos, 11 regiones génicas distintas,partiendo únicamente de dos copias deADN procedentes de cada blastómero.Además de la histocompatibilidad,conocemos el estatus genético (sano,portador o afecto) de cada embriónanalizado, en los casos que exista unaenfermedad sanguínea hereditaria.

043: SELECCIÓN DE EMBRIONES HISTOCOMPATIBLES CON FINESTERAPÉUTICOS

X. Vendrell1, T. Alberola1, R. Bautista-Llàcer1, M. Pardo1, E. García-Mengual1, M. Boada2, M. Parriego2, A. Veiga2, M. Pérez-Alonso1, 3.1Unidad de Genética Reproductiva. Sistemas Genómicos S.L, Paterna, Valencia. 2USP Institut Universitari Dexeus, Barcelona. 3Departament deGenètica. Facultat de Ciències Biològiques. Universitat de València. València.




INTRODUCCIÓN:

Las condiciones de cultivo sondeterminantes para optimizar eldesarrollo embrionario in vitro. Unascondiciones no adecuadas puedenafectar al desarrollo del embriónllegando incluso a provocar el bloqueode este. En el programa de DiagnósticoGenético Preimplantacional (DGP)realizamos la transferencia en el día 5 dedesarrollo por lo que necesitamosmantener al embrión en el laboratoriodurante varios días. El cultivoprolongado puede realizarse utilizandomedios secuenciales o cocultivando losembriones sobre una monocapa celular.Se ha sugerido que el cocultivo favoreceel desarrollo embrionario. El objetivo deeste estudio fue comparar el desarrollode los embriones en cultivo secuencial(CS) versus en cocultivo con células delepitelio endometrial humano (CC), enpacientes de edad avanzada (> 38 años)de nuestro programa de DGP.


Estudio retrospectivo que incluye 1.820ciclos de pacientes de edad maternaavanzada, del programa de DGP, desdeEnero del 2000 hasta Diciembre del2008. Las pacientes se dividieron en dosgrupos según el tipo de cultipo en el quese habían desarrollado sus embriones:1.585 ciclos de pacientes (media de edad(SD): 40,5 (1,9) años) cuyos embrionesfueron a CC y 235 ciclos de pacientes(media de edad (SD): 40,6 (1,7) años) enlos que los embriones estuvieron en CS.Analizamos el desarrollo embrionario de

un total de 6.759 embriones: 5.804 deCC y 955 de CS. Los embriones del grupode CC fueron cocultivados sobre unamonocapa de células del epitelioendometrial humano desde el día 2hasta el día 5. Durante las primeras 24horas (día 2), el medio de cultivo fueIVF:CCM (1:1) (Vitrolife AB, Kungsbacka,Sweden). Del día 3 al día 5, losembriones fueron cocultivados sólo conCCM. Los embriones del grupo de CSfueron cultivados en IVF hasta el día 3 dedesarrollo. Del día 3 hasta el día 5, día

del transfer, los embriones fueroncultivados en CCM. La biopsiaembrionaria fue realizada en día 3 dedesarrollo. Se realizó el análisis de 7-9cromosomas (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22,X e Y) por hibridación in situfluorescente (FISH) (MultiVyson PBpanel y 4CC panel, Vysis Inc. Downers Grove, IL, U.S.A.). Los embriones cromosómicamentenormales fueron transferidos y/o congelados/vitrificados. Lascomparaciones estadísticas se realizaronmediante el test c2 (p<0.05).

RESULTADOS:

El porcentaje de embriones en cocultivoque alcanzaron el estadio de blastocistofue significativamente superior alcompararlo con aquellos embriones quehabían sido cultivados en cultivosecuencial (51,6% vs. 40,0%(p<0.0001), respectivamente). En latabla podemos ver los resultadosobtenidos cuando comparamos la tasade blastocisto en función de losresultados del análisis cromosómico.

CONCLUSIONES:

- El cocultivo de embriones sobre célulasdel epitelio endometrial humano favoreceel desarrollo del embrión hasta el estadiode blastocisto en mujeres de edadavanzada donde la calidad embrionariasuele estar comprometida.

- Este aumento en el porcentaje deembriones que llegan a blastocisto esbeneficioso sobre todo en el caso de losembriones cromosomicamente normalesya que nos permite incrementar el númerode blastocistos candidatos a transfer.

044: EL COCULTIVO CON CÉLULAS DEL ENDOMETRIO FAVORECE ELDESARROLLO EMBRIONARIO EN CICLOS DE DIAGNÓSTICOGENÉTICO PREIMPLANTACIONAL POR EDAD MATERNA AVANZADA

A. Mercader, P. Buendía, A. Delgado, B. Gadea, L. Escrich, C. Rubio, C. SimónInstitut Universitari - IVI Valencia

154

NS: no significativo



INTRODUCCIÓN:

Objetivo: Analizar la fragmentación delADN espermático y los parámetrosseminales pre y post congelación yrecuperación espermática trasselección- capacitación de los donantesde semen (DS) utilizados eninseminación intrauterina y losresultados de gestación, teniendo encuenta los efectos del tiempo decongelación y la ubicación de los vialesen el contenedor criogénico.


Se valoraron muestras de 17 (DS)criopreservadas entre el 2003-2008 yque fueron utilizadas en 77 procesos deinseminación intrauterina. Para elestudio de la fragmentación espermáticalas alícuotas se descongelaron durante10min. a 36 ªC y se ajustaron a unaconcentración de 10 millones/mL enPBS. El índice de fragmentación del ADNespermático (IFS) se realizó mediante elmétodo SCD (Halosperm® modificado,Indas) por dos observadoresindependientes con la lectura de unmínimo de 500 espermatozoides. Seanalizó la pérdida relativa de la

motilidad progresiva postdescongelación y post selecciónespermática (centrifugación degradientes).También se evaluó la tasa degestación/ciclo. Todos los parámetros seanalizaron teniendo en cuenta el tiempode almacenamiento al descongelar (≥ 3o < 3 años) y ubicación relativa dealmacenamiento dentro del contenedor(1=más superficial, 11=más profundo)

RESULTADOS:

El tiempo de criopresevación fue 978±79días (media±EEM). El IFS fue en los 17 DSestudiados de 14.47±1.28. Cuandoanalizamos el IFS según el tiempo dealmacenamiento ≥ 3 o < 3 años losresultados fueron similares (13.50±2.63versus 15.85±2.66%) p=0.39. Cuando eltiempo de almacenamiento fue superiora 3 años la motilidad progresiva (a+b)post descongelación fue menor que losalmacenados menos de 3 años (34.7±2.6 versus 41.9±2.4%) p<0.05. El mismoefecto se observó post selecciónespermática (36.9±2.9 versus46.8±2.9%) p=0.019. La tasa global degestación/ciclo fue de 11.16%, los DSalmacenados más de 3 años tuvieron unatasa de gestación similar al grupo de DS

con menos de 3 años (13.14±5.31versus 8.33±3.57%) p=0.50. No seobservó diferencia significativa del IFSentre el nivel de más superficial a másprofundo del contenedor criogénico(15.89±2.33 versus 12.88±0.64%)p=0.25 ni tampoco de los parámetrosseminales de motilidad progresiva(33.19±3.97 versus 38.33±4.72%)p=0.40 Aunque la tasa degestación/ciclo de las muestrassuperficiales fue mayor (15.13±5.57%)que la de las muestras profundas(6.70±3.38%) la diferencia no fuesignificativa p=0.22.

CONCLUSIONES:

El índice de fragmentación espermático(IFS) y la tasa de gestación/ciclo no semodificaron con el tiempo decriopreservación ni por el nivel deubicación de las muestras en elcontenedor criogénico.

La motilidad progresiva (a+b) postdescongelación y post selecciónespermática empeoró con el tiempo dealmacenamiento pero no se vio influidapor el nivel de almacenamiento.

INTRODUCCIÓN:

El envejecimiento ovárico se traduce enuna disminución en la producción deandrógenos, así como en una menorcapacidad de respuesta a la

hiperestimulación ovárica controlada.Evidencias recientes sugieren que elpretratamiento con testosterona en gelo parches, con DHEA, o con inhibidoresde la aromatasa, que a su vez aumentanla concentración de andrógenos

intrafoliculares, pueden mejorar larespuesta a la FSH exógena,amplificando la respuesta a la FSH de lascélulas de la granulosa.

045: INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE CRIOPRESERVACIÓNDE UN BANCO DE SEMEN EN LA FRAGMENTACIÓN DEL ADNESPERMÁTICO, LA SUPERVIVENCIA Y LA EFICACIA BIOLÓGICA

A. Mata1, A. Monqaut1, A. Garcia1, O. Lopez1, O. Martinez- Pasarell1, R. Bordas2, L. Bassas1

1Laboratorio de Seminología y Reproducción Fundacio Puigvert. 2Servicio de Ginecología del Hospital de la Santa Creu y Sant Pau de Barcelona.

046: ANÁLISIS MEDIANTE RT-PCR DE LA EXPRESIÓN DEL RECEPTORDE FSH EN CÉLULAS DE LA GRANULOSA HUMANAS TRATADASPREVIAMENTE CON TESTOSTERONA Y HCG

D. Agudo, S. Rodríguez, J. A. García-Velasco, M. Martínez, J. Martínez-Salazar, A. PachecoIVI Madrid





Se obtuvieron muestras de líquidofolicular procedentes de mujeres sanassometidas a tratamiento de FIV/ICSI,cuya causa de esterilidad era de origenmasculina. Todas ellas firmaron elcorrespondiente consentimientoinformado y leyeron la hoja deinformación que se les entregó. Tras laidentificación de los complejos cumulus-ovocito, los líquidos foliculares selavaron, en gradientes de ficol,mediante centrifugación a 1500 rpmdurante 15 minutos. Las células de lainterfase se recogieron y se cultivaronen placas de 24 pocillos en medio M-199,con un 10% de suero bovino fetaldurante 3 días.

Estas células fueron tratadas condiferentes concentraciones de testosternay HCG. Tras la recolección de la monocapa

de células de la granulosa, se extrajo elRNA total, y se estudiaron los niveles deexpresión del receptor de membranan deFSH mediante RT-PCR semicuantitiativa.

RESULTADOS:

La expresión del receptor de membrana deFSH en células de la granulosa, puede serregulado in vitro mediante el empleo dediferentes concentraciones detestosterona y HCG. Si comparamos losniveles de expresión de este receptor enlos controles frente a los detectados en lascélulas de la granulosa tratadas contestosterona y/o HCG, podemos observarun efecto significativo de la testosteronaen los niveles de expresión del receptor deFSH, tanto dosis como tiempodependiente. En cuanto al tiempo detratamiento con testosterona, se observóun pico de la expresión del receptor deFSH a las 12-24 horas postratamiento.

Cuando se usó HCG como estímulo,también aumentó la expresión delreceptor de membrana de FSH.curiosamente, el efecto de la HCG fueleve a dosis bajas y altas, siendo mayoren dosis intermedias.

CONCLUSIONES:

Tanto la testosterona como la HCG, soncapaces de modular la expresión delreceptor de membrana de FSH en célulasde la granulosa humana crecidas in vitro.Este descubrimiento podría apoyar eluso de diferentes estrategias para aumentar la concentraciónintrafolicular de andrógenos enpacientes con ovarios envejecidos,sometidas a hiperestimulación ováricacontrolada.

INTRODUCCIÓN:

El desarrollo de un programa decriopreservación embrionaria eficaz esfundamental en los programas dereproducción asistida, ya que permiteincrementar las tasas de gestación con la congelación de embrionessupernumerarios. La incorporación de lavitrificación como técnica de rutina hapermitido aumentar las tasas desupervivencia, así como las tasas deembarazo. Sin embargo, la cuestión decual es el estadio de desarrollo óptimopara la congelación embrionaria todavíasuscita controversia. El objetivo de esteestudio es comparar la capacidadimplantatoria de embriones vitrificadosen día 3 y día 5.


Se analizan retrospectivamente 135ciclos de criotransferencia realizados en

nuestro Centro durante el año 2008, delos cuales 63 son ciclos de embrionesvitrificados en día 3 (grupo I) y 72 en día5 (grupo II). Se incluyeron tanto ciclosde estimulación ovárica como dedonación de ovocitos. Para lavitrificación de embriones se emplearonlos medios de Irvine Scientific y elsistema HSV de CryoBioSystem. Losparámetros analizados fueron la tasa desupervivencia embrionaria, tasa de -HCG positiva, y tasas de embarazo eimplantación. Los resultados seanalizaron mediante el test de t-studenty el test chi-cuadrado. Se consideróestadísticamente significativo un P valor<.05.

RESULTADOS:

La tasa de pacientes que tuvierontransferencia en el grupo I fue de 77,8%y en el grupo II 79,2% (no significativo).Los dos grupos no difirieron en términos

de días de estimulación endometrial(12,89 ± 0,45 en grupo I vs. 12,58 ± 0,36en grupo II), grosor endometrial (9,17 ±0,22 vs. 9,04 ± 0,21) y frecuencia depacientes procedentes de donación deovocitos (67,3% en grupo I vs. 57,9% engrupo II). Las tasas de supervivenciaglobales fueron similares en ambosgrupos (82,9% en grupo I vs. 74,2% engrupo II) así como el número deembriones transferidos (2,08 ± 0,64 vs.1,98 ± 0,44). El grupo I tuvo un númeromedio de embriones supervivientessignificativamente mayor (2.37 ± 0,10vs. 2,07 ± 0,07), aunque esto no setradujo en un incremento de la -HCGpositiva, que de hecho fue mayor en elgrupo de embriones vitrificados enestadio de blastocisto (38,8% vs.50,9%). La tasa de embarazo clínico(30,6% vs. 36,8%), tasa de implantación(19,6% vs. 23,9%) y tasa de abortoclínico (13,3% vs. 19,0%) fuecomparable en ambos grupos.

156

047: EVALUACIÓN CLÍNICA DE CRIOTRANSFERENCIAS DEEMBRIONES VITRIFICADOS EN DÍA 3 Y DÍA 5.

J. Guerrero, J. Ten, A. Rodríguez-Arnedo, M. A. Carracedo, J. Llácer, R. Bernabeu.Instituto Bernabeu Alicante



CONCLUSIONES:

Estos datos muestran que tanto lavitrificación de embriones en día 3 como

en día 5 son alternativas viables queofrecen unas tasas de éxito razonables.Observamos que existe una tendencia,aunque no significativa, hacía una

mejoría en los resultados clínicoscuando se vitrifican blastocistos, a pesardel mayor número de embrionessupervivientes en día 3.

INTRODUCCIÓN:

Objetivo: Las microdeleciones delcromosoma Y son la segunda causagenética más frecuente de infertilidadmasculina después del síndrome deKlinefelter. El objetivo de este estudiofue revisar las decisiones de las parejasy los resultados de los tratamientos dereproducción asistida (TRA) en pacientescon microdeleciones Yq estudiados ennuestro Centro.


La evaluación andrológica incluyóanamnesis, exploración física, dos o másseminogramas completos, hormonas deleje gonadal (FSH, LH, testosterona),cariotipo y biopsia testicular paradiagnóstico y recuperación espermáticaquirúrgica (REQ). En casos seleccionadosse realizaron estudios ultrasonográficoso microbiológicos. Se analizaron lasmicrodeleciones Yq en un total de 423pacientes infértiles evaluados entre elaño 2005 y marzo de 2009, ydiagnosticados de oligozoospermia(<5x106/mL) o azoospermia. Se realizóextracción de DNA genómico a partir desangre periférica de los pacientes,seguida de amplificación mediante dosPCRs multiplex de 8 Sequence TaggedSites (STSs), 2 de cada una de lasregiones AZFa, AZFb, AZFc, y también losgenes ZFY/ZFX (control interno) y SRY(Yp). El 4,5% de los pacientes (n=19)presentaron alguna microdeleción, queafectó a la región AZFc en 17 casos(89,5%), AZFabc en un hombre concariotipo diagnóstico de inversiónsexual, y AZFbc en otro individuo cuyo

cariotipo mostró cromosoma Yisodicéntrico. Los sujetosoligozoospérmicos (n=9) tenían entre0,002 y 1,2 millones deespermatozoides/mL en semen. En unpaciente azoospérmico se recuperaronaislados espermatozoides en testículo.Todos estos individuos presentabandeleción de AZFc.

RESULTADOS:

Tras completar el proceso diagnóstico 5pacientes (3 azoospérmicos, 2oligozoospérmicos) optaron por norealizar ninguna TRA o abandonaron elseguimiento. Una pareja(oligozoospermia) estaba pendiente deiniciar FIV y otras 2 (azoospermia) enfase de decisión terapéutica. Serealizaron TRA en 11 parejas (10 condelAZFc, 1 con delAZFbc), siendo la edadmasculina media de 41,6 años (rango34-53), y la edad femenina media de34,6 (rango 27-40).

Tres parejas decidieron diagnósticogenético preimplantacional (DGP) conselección de embriones de sexofemenino y estudio complementario deaneuploidías (5 cromosomas). Seiniciaron 5 ciclos y se biopsiaron un total22 embriones, resultando 14 no aptospor aneuploidías, 1 no pudo serdiagnosticado, 4 fueron varonesnormales (portadores obligados), yúnicamente se pudieron transferir 3embriones de sexo femenino en dosparejas, sin conseguirse gestación.

Tres parejas fueron sometidas a FIV/ICSIcon espermatozoides propios como

tratamiento inicial, y en otras dos seaplicó dicho tratamiento al no podersepracticar, o fracasar la técnica previstade DGP. Se realizaron 6 ciclos conespermatozoides procedentes deeyaculado (n=5) o testículo (n=1), con 3gestaciones (50% por ciclo) y dos partosa término (40% por pareja).

Cinco parejas optaron inicialmente porTRA con semen de donante. Además,otra pareja se sumó a esta opcióndespués de fracasar con DGP. Se realizóun ciclo de FIV-D (sin gestación) y 14ciclos de IAD, que produjeron 4gestaciones (28,5% por ciclo, 66,6% porpareja).

En conjunto, la aplicación de las diversasopciones reproductivas consiguiógestación a término o en curso en 6 delas 11 parejas (54,5%) sometidas atratamiento.

CONCLUSIONES:

En la infertilidad debida amicrodeleciones Yq se encontraronespermatozoides en semen o testículoen el 52% de los pacientes (todos elloscon delAZFc), aunque sólo el 31%optaron por intentar TRA con gametospropios en primera instancia. Losresultados clínicos globales sonsatisfactorios. Sin embargo, laaplicación de técnicas de DGP estálimitada por la baja disponibilidad deembriones cromosómicamente normalesde sexo femenino, que a menudo seañade a la dificultad de encontrar unnúmero adecuado de espermatozoides.


048: DECISIONES REPRODUCTIVAS Y RESULTADOS CLÍNICOS ENPAREJAS CON INFERTILIDAD MASCULINA POR MICRODELECIONESDEL CROMOSOMA YQ

A. García1, E. Ars 2, O. Martínez-Pasarell1, O. López1, A. Mata1, P. Viscasillas3, L. Bassas1

1Laboratorio de Seminología y Embriología, 2Laboratorio de Biología Molecular, 3Servicio Ginecología, Fundació Puigvert - Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona



INTRODUCCIÓN:

El líquido folicular (LF) representa uncomplejo compartimiento funcional en elque se integran distintas señalesendocrinas, inmunológicas y mitógenasque hacen que cada folículo ovárico seaúnico. Las células de la granulosaproducen distintas sustancias que puedenser valoradas en LF estableciendodistintos parámetros de calidad folicular.Algunas de ellas han sido ya descritas.Desde el punto de vista peptídico, existeuna familia sintetizada por la granulosa enrespuesta a la FSH y secretada hacia ellíquido folicular, como son la Inhibina, laActivina y la Folistatina, que han sido lasmás estudiadas. También han sidoensayados péptidos de la familia de laproopiomelanocortina: encefalinas yendorfinas, cuyo nivel aumenta antes dela ovulación. Aunque la función de éstosúltimos aún no está claramenteestablecida, nuestro equipo investigadorha descrito la importancia que tienen(tanto los péptidos opioides, como susreguladores y sus receptores) a nivelespermático y ovocitario.

Por ello, y con el fin de comprobar losposibles cambios que pudieranacontecer a lo largo de la vida fértil de lamujer, en la presente comunicacióndescribimos los niveles de actividad delos dos principales enzimas implicados

en la regulación encefalinérgica: la APN(insensible a puromicina) y la PSA(sensible a puromicina).


Las muestras de líquido folicular seobtuvieron de donantes voluntarias (queno presentaban patología de fertilidad)en la Clínica Quirón de Zaragoza,utilizándose exclusivamente las muestrasno hemolizadas. Tras centrifugación, las actividades se midieronfluorimétricamente utilizando sustratoscromogénicos del tipo de aminoacil-2-naftilamidas (345 nm de excitación, 412nm de emisión). Los líquidos seclasificaron de acuerdo con la edad de lasdonantes: 20-24 años (grupo A); 25-29(grupo B); 30-34 (C); 35-40 (D); > 40 (E).Los resultados obtenidos se presentancomo unidades de actividad por ml.Definimos una unidad como la cantidad deenzima que hidroliza un picomol de a.a.-2-naftilamida por minuto.

RESULTADOS:

La regulación de los nivelesencefalinérgicos es llevada a cabofundamentalmente por los dos enzimasensayados. Posibles modificaciones a lolargo de la edad fértil de mujeres sinpatologías asociadas a parámetros defertilidad nos indicarían la importancia del

metabolismo peptídico a nivel de líquidofolicular, lo que podría servir para ensayartratamientos “in vitro” con potenciadoresy/o inhibidores de la actividad, pero, ensegundo lugar, y asociándolos a tasas defertilidad, nos servirían como indicadoresfáciles, repetitivos y fiables del estadofértil de la mujer.

Los resultados obtenidos han sido lossiguientes (media + SEM):

A) APN: 277,5 + 7,3; PSA: 212,7 + 3,6; B)APN: 238,3 + 5,7; PSA: 217,7 + 11,3; C)APN: 298,4 + 5,2; PSA: 230,4 + 9,1; D)APN: 247,8 + 4,3; PSA: 274,3 + 8,6; E)APN: 282,8 + 3; PSA: 285,9 + 5,2.

CONCLUSIÓN:

No se aprecian modificacionessignificativas a lo largo de las diferentesetapas ensayadas, por lo que elmetabolismo encefalinérgico en LFparece no verse alterado con la edad. Apesar de ello, son de remarcar losincrementos que se observan en la PSA,por lo que se requieren nuevos ensayosque confirmen o no dicha tendencia.

AGRADECIMIENTOS:

Los autores desean agradecer lainestimable colaboración de MERCK-SERONO.

INTRODUCCIÓN:

El estudio de la Fagmentación del ADNEspermático (FAE) es un parámetro de

interés a la hora de evaluar la capacidadreproductora de un individuo. Losmecanismos que la provocan, cuál es suefecto real sobre la infertilidad de los

individuos, o tan siquiera qué incidenciapresenta esta anomalía dentro de ungrupo determinado, es información nomuy bien conocida en este momento.

049: NIVELES DE ACTIVIDAD DE LOS SISTEMAS DE CONTROLENCEFALINÉRGICO EN LÍQUIDO FOLICULAR DE MUJERES FÉRTILESDE DIFERENTES EDADES.C. Romeu, A. Urries, M. Lierta, J. Sánchez Rubio, J. A. Duque, B. Sanz*, I. Pérez* y L. Casis*. Reproducción Asistida Quirón Zaragoza, Grupo Hospitalario Quirón. *Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina y Odontología,Universidad del País Vasco/EHU.

050: INFLUENCIA DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN EN LA DINÁMICADIFERENCIAL DE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO ENMUESTRAS DE SEMEN PARA IACY. Cabello, P. Eibes, M. Nogales, M. Sánchez, J. Martín, J. P. Iglesias, R. Domínguez, A. Loroño, M. C. Torres, M. I. García-Nebreda, C. López-Fernández, M. A. Ramírez, A. García-Enguídanos, A. Santaolaya. FIV RECOLETOS

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El objetivo de este estudio, se centra enanalizar la influencia del tiempo quepasa la muestra capacitada en elincubador, y delimitar cuándo éstaalcanza valores críticos que pongan enriesgo la capacidad fecundante de lamuestra de acuerdo con los valoresestablecido por Evenson como críticosen el proceso de fertilización.


Tras el licuado del eyaculado, sesepararon 4 alícuotas iguales en frescoen sus correspondientes tubos. Losintervalos de tiempo de cada alícuotapara el estudio de la FAE fueron: 0’, 30’,2h y 4h, respectivamente, con el fin deestudiar su comportamiento dinámico.Por otro lado, en las muestrascapacitadas, se tomaron alícuotas trasswim-up, según el tiempo que éstaspasaron en el incubador a 37ºC: 0’, 30’ y60’ respectivamente. De cada una deéstas, y a medida que fueron pasando lostiempos descritos para estudiar ladinámica de la FAE, se retiraron nuevasalícuotas a intervalos de tiempo: 0’, 30’,2h y 4h. Todas las alícuotas tuvieron unvolumen final de 25μl, unaconcentración de 15-18 M spz/ml y se

congelaron a -20ºC, hasta suprocesamiento conjunto.

La determinación de la fragmentacióndel ADN, tanto del fresco como delcapacitado, fue realizada mediante latécnica Sperm Chromatin Dispersion(SCD) en su versión del kit halosperm®(Halotech DNA SL., España). Lasmuestras procesadas se tiñeron para servisualizas y valoradas mediantemicroscopía de fluorescencia conelección de campos aleatorios.

RESULTADOS:

El análisis dinámico individualizado dela fragmentación del ADN mostró unincremento en los niveles defragmentación basal, en la mayoría delos casos (con medias del 3% por hora),a medida que transcurrió el tiempo, conindependencia de si la muestra estaba ono capacitada. Los resultados indicaronla no existencia de un patrón, tanto enlo que se refiere a los niveles defragmentación basales como en loscomportamientos dinámicos, que seaplique de forma homogénea, si bien enla mayoría de los casos el proceso decapacitación espermática se ratifica

como una metodología muyrecomendable para mejorar los nivelesde fragmentación del ADN espermático.Esta situación no es generalizable; dehecho algunos individuos no respondena este comportamiento, alcanzandovalores similares a los de la muestra enfresco (que sirve como referencia), porlo un estudio previo personalizadoaporta una abundante informacióngráfica sobre cómo manipular la muestraen el laboratorio, priorizando unassobre otras, o bien modificando losparámetros internos del método decapacitación elegido.

CONCLUSIONES:

1) La FAE aumenta con los tiempos demanejo e incubación de la muestra porlo que es recomendable minimizarlos enla medida de lo posible.

2) Individuos distintos muestrancomportamientos dinámicos de la FAEdistintos.

3) La manera de capacitar una muestrainfluye en el resultado final de losxvalores de la FAE.

INTRODUCCIÓN:

La aprobación de la Ley 45/2003 y de susucesora 14/2006 ha comportado unabanico muy amplio de posibles destinosa los embriones supernumerarioscriopreservados procedentes detratamientos de FIV. Tanto es así, que sepermite la utilización de estosembriones para: destinarlos a usopropio, para finalidades reproductivasde otras parejas, para investigación, obien decantarse para su destrucción.

El presente estudio se centra en aquellaspacientes que, una vez finalizado suproyecto reproductivo, tienen que

decidir el destino de sus embrionessupernumerarios. Así se ha analizado sidiferentes parámetros influyen en latoma de decisión. Se ha realizado unseguimiento de aquellos embriones quese donaron para investigación. Así comouna revisión del programa de donaciónde embriones criopreservados a otrasparejas. Y finalmente una valoración delestado actual del banco de embriones denuestro centro.


Estudio retrospectivo de 87 pacientes (n= 285 embriones) desde enero del 2004hasta febrero del 2009. Se informó del

nuevo ámbito legal a todas las parejas aliniciar el tratamiento y en aquellos casosen que el Centro había perdido elcontacto con los pacientes conembriones criopreservados, se procedióa informarles por vía telefónica, y si estono era posible, se procedía al envio decartas certificadas.

Los embriones destinados ainvestigación lo fueron para el proyecto:“Derivación de Líneas de Células MadreEmbrionarias en condiciones libres deXenobióticos y caracterización in vivo desu pluripotencialidad” del “Banc delínies Cel.lulars del Centre de MedicinaRegenerativa” (CMRB) de Barcelona.


051: DONACIÓN DE EMBRIONES. NUESTRA EXPERIENCIA

M. Hugas1, M. Fernández 1, L. Julià1, B. Aran2, A. Veiga2, J. Sarquella Ventura1.1Unitat de Reproducció Humana i Diagnòstic Genètic. Clínica Girona. 2Banc de Línies Cel·lulars. Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona. (CMRB)



RESULTADOS:

La tendencia ha sido donarlos porinvestigación, representando un 64.37%frente a un 35.63% que se decantan porla donación hacia otras parejas confinalidades reproductivas. Ningunapareja ha optado por la descongelaciónsin ninguna finalidad.

La mediana de embrionescriopreservados por paciente en el grupode donación a otras parejas es de 3.8, yen la donación a investigación de 2.98(p≤ 0.05). Si nos fijamos en la medianade edad de las pacientes, en el grupo dedonación para otras parejas es de 37.13 yen el de investigación 34.89 (p≤ 0.05).

No se observaron diferenciasestadísticamente significativas en losparámetros tener o no descendencia yaños de criopreservación.

Los embriones donados parainvestigación (n=111), presentaron unatasa de supervivencia del 87.8% y se haconseguido una línea celular: ES[7].

De los 45 ciclos realizados en elprograma de donación de embriones

para otras parejas, con una media deedad de las pacientes receptoras de40,15 años y con una media deembriones transferidos por ciclo de2,39, la tasa de embarazo conseguidafue del 42.22% .

Actualmente, en nuestro banco,tenemos un total de 591 embriones, delos cuales 490 son para uso propio, 11destinados a otras parejas y 56destinados a investigación. Restan 34embriones procedentes de 9 pacientescon los cuales el Centro ha perdido elcontacto.

Los resultados se analizaronestadísticamente mediante el test de χ² yel paquete estadístico SPSS 11.5 decomparación de medias. Los valores conp≤ 0.05 se consideraron estadísticamentesignificativos.

CONCLUSIONES:

Se puede observar que la mayoría deparejas optan preferentemente por ladonación de embriones parainvestigación (Luna et al 2007;Hammarberg et al, 2006). El grupo depacientes con un número mayor de

embriones criopreservados, tienden adonarlos a otras parejas en lugar de lainvestigación. Así mismo, las pacientescon más edad también se decantan poresta opción.

Si bien valoramos positivamente elefecto de la nueva Ley 14/2006, ya quepermite dar salida a embriones quehasta ahora no la tenían, el efecto no estan positivo cuando se trata depacientes acogidas al programa dedonación de embriones con finalidadesreproductivas.

Un hecho relevante es que ningunapareja haya pedido la opción de ladestrucción. Este hecho se podríaatribuir, a una influencia indirecta a lahora de informar (Heng B.C. 2006 ;Fuscaldo et al 2007), o bien a que lacohorte estudiada es muy reducida.

Los buenos resultados en ladescongelación y el cultivo de estosembriones donados para investigación,animan a continuar colaborando enpróximos proyectos.

Palabras clave: Criopreservación,donación de embriones, investigación.

INTRODUCCIÓN:

Objetivo: Cuando transferimos embrionesen D+4 se obtienen iguales resultados queen D+3 (Pantos et. al, 2008). Al realizar latransferencia en D+4 sabemos que losmejores resultados los obtenemos cuandolos embriones están en mórula/compacta(Tao et. al, 2002), pero es interesantepoder evaluar los embriones, que en estedía todavía están en células.

El objetivo de este trabajo es poderclasificar mejor los embriones en D+4,tanto para su posible transferencia eneste estadío como para una mejorselección en un posible cultivo ablastocisto.


Se analizaron 88 ciclos con estimulaciónde la ovulación en pauta larga en los quese realizó la transferencia en D+4. Losembriones se clasificaron en D+3 segúncriterio ASEBIR y para D+4* con elsiguiente sistema:

Categoría A: Mórula/Compacta óembriones con incremento de más de un74% de células.

Categoría B: Embriones con incrementoen el número de células de 50 al 74%

Categoría C: Embriones con incrementoen el número de células de 33 – 49 %

Categoría D: Embriones con incrementoen el número de células menor al 33%

*Asignando la categoría más baja de lasobtenidas entre D+3/D+4.

Los ciclos se dividieron en 3 grupossegún la calidad de los embrionestransferidos:

Grupo I: Ciclos con transferencia deembriones de categoría A ó B (24 ciclos).

Grupo II: Ciclos con transferencia de unembrión de categoría A ó B y otro decalidad C ó D (31 ciclos).

Grupo III: Ciclos con transferencia de

160

052: CRITERIOS DE VALORACIÓN EMBRIONARIA EN D+4.

J. González, R. Blanes, R. Vaca, J. Velasco, J.C. Alberto.Unidad de Reproducción Humana. Hospital Universitario de Canarias (HUC).



embriones de categoría C ó D (33 ciclos).

El análisis estadístico se realizó con elprograma SPSS 15.0, aplicando el test deANOVA de un factor utilizando T2 Tamhane.

RESULTADOS:

La media de edad de las pacientes fue de34,1 ± 3,8, el número de embrionesdivididos fue de 7,1 ± 3,1 y el número deembriones transferidos de 1,9 ± 0,1.

No se encontraron diferenciassignificativas entre los tres grupos encuanto a la edad, número de embrionesfertilizados, embriones divididos ni

embriones transferidos.

Tampoco se encontraron diferenciassignificativas en la tasa de embarazoentre los grupos I y II (75,0 vs. 48,4, p =0.124), pero si entre los grupos I vs. III yentre el II vs. III (75,0 vs. 15,2 y 48,4 vs.15,2, p<0.01 y p<0.05 respectivamente).

Si hay diferencias significativas en latasa de implantación entre los tresgrupos (43,8% vs. 21% vs 6,2%; grupo Ivs. II y grupo II vs. III, p< 0.05 y grupo Ivs. III, p< 0.01).

CONCLUSIONES:

Con el sistema de clasificaciónpropuesto encontramos diferenciassignificativas en la tasa de implantación,por lo que podemos aceptar el valor dela clasificación a pesar de no encontrardiferencias significativas en la tasa deembarazo entre los grupos I y II.

Podemos mejorar este sistema declasificación en D+4 aumentando elnúmero de casos y valorando otrosposibles parámetros positivos como lacompactación celular en D+4 (según suevolución embrionaria o el número decélulas en el que se produce lacompactación).

INTRODUCCIÓN:

La interferencia farmacológica que seproduce durante la estimulación ováricacontrolada (EOC) puede estar afectandoa la fisiología del ovario ya que losfolículos están bajo el efecto de doscircunstancias muy especiales, por unlado la presencia de nivelessuprafisiológicos de gonadotropinas enla fase folicular y por otro unaprolongación en el tiempo de dichosniveles. Diferentes estudios hanpublicado la disminución deaneuploidías en embriones procedentesde ciclos con mínima estimulación y losbeneficios que una mínima interferenciaen la fisiología del ovario podría tenersobre la calidad embrionaria.

OBJETIVO:

Puesto que el huso meiótico es una piezaclave en la correcta segregacióncromosómica, el objetivo del presentetrabajo es estudiar el efecto que laestimulación ovárica tiene sobre elambiente folicular así como sobre el

estado del huso meiótico de los ovocitosasociados.


Estudio prospectivo de cohortesemparejado de 35 donantes, donde 17fueron sometidas a un ciclo natural y 18sometidas a un ciclo de EOC. Tras lapunción, el líquido folicular del únicofolículo preovulatorio de los ciclosnaturales y el líquido de uno de losfolículos dominantes de los ciclosestimulados fueron aspirados,centrifugados, alicuotados yalmacenados a -80 C hasta su utilización.Se midieron las siguientes hormonas:FSH, LH, estradiol, androstendiona,testosterona y progesterona mediante

enzimoinmunoanálisis (MEIA). Losovocitos asociados a los folículos

estudiados se analizaron medianteOosightTM para valorar el estado del husomeiótico (posición y estructura) así comovalores de birrefringencia, longitud yanchura. Los análisis estadísticosutilizados fueron pruebas Chi Cuadradopara la comparación de las variablescategóricas, t- Student para lacomparación de las medias y regresiónlogística lineal con el 95 % de intervalode confianza para estudiar la asociaciónentre el ambiente folicular y los valoresde birrefringencia del huso.

RESULTADOS:

Los resultados vienen resumidos en lasiguiente tabla:

No se encontraron diferenciassignificativas en el porcentaje de husos


053: ENTORNO HORMONAL FOLICULAR EN LOS CICLOS NATURALES YSU EFECTO SOBRE EL HUSO MEIÓTICO: IMPLICACIONES POTENCIALESDE LA ESTIMULACIÓN SOBRE LA SEGREGACIÓN CROMOSÓMICA.

V. García-Laez, C. Rubio, J. Zulategui, J. M. de los Santos, P. Gámiz, M. Meseguer, M. J. de los Santos.IVI Valencia (Valencia)

*p<0.05



que se consideraron anormales(desestructurados o mal posicionados)entre los ciclos naturales y estimuladossiendo del 47.6% en los ciclos naturalesy del 52.6% en los ciclos estimulados(IC=0.296-2.058).

Tampoco se observó diferencias enninguno de los valores debirrefringencia, longitud y anchura

entre los folículos crecidos ensituaciones naturales y crecidos bajoEOC.

CONCLUSIONES:

Los folículos de los ciclos naturalesmodificados mostraron mayores valoresde la ratio LH/FSH, androstendiona y deestradiol que los folículos de los ciclos

estimulados, sin embargo esa diferenciano se reflejó en la mejora de los valoresde los husos meióticos de los ovocitosasociados, indicando que los cambiosobservados por efecto de la estimulaciónen el ambiente folicular tengan unarepercusión mínima o inapreciable en laspacientes de buen pronóstico.

INTRODUCCIÓN:

La división temprana de los zigotos esconsiderada como un parámetro noinvasivo del potencial de desarrolloembrionario y se ha utilizado en losprogramas de fecundación in vitro paraidentificar embriones de mejor calidad.La transferencia de embriones que sedividen de manera temprana se asociacon mayores tasas de gestación eimplantación cuando se compara contransferencias de embriones quecomienzan la división posteriormente.

El objetivo de este estudio fue valorar lacalidad embrionaria dependiendo delpatrón de división temprana y suinfluencia en las tasas de gestación eimplantación en un programa dedonación de ovocitos.


La división temprana se estudió en 71ciclos de transferencias embrionarias deparejas incluidas en un programa dedonación de ovocitos, desde Julio de2008 a Marzo de 2009. Los gruposfueron comparables en edad, media deembriones transferidos y factormasculino.

El patrón de división temprana se observóen los embriones 25-26h post ICSI y 26-27h post FIV. Los embriones no divididosse clasificaron según la persistencia odesaparición de los pronúcleos.

Los embriones divididos se clasificaronen tres grupos:

Simétricos: aquéllos con dos células deigual tamaño

Asimétricos: aquellos embriones quetenían dos células de distinto tamaño

Fragmentados: si poseían más de un 20%de fragmentación independientementede la simetría.

El patrón de división temprana secorrelacionó con la calidad embrionariaen día 3, con las tasas de gestación eimplantación y se comparó con las deembriones que provenían de zigotos conpronúcleos persistentes o desaparecidos.

La selección de los embriones atransferir se realizó con los criterios declasificación de día 2 y 3 de ASEBIR sintener en cuenta la división temprana.

RESULTADOS:

La calidad embrionaria en día 3 fuesuperior en embriones con divisióntemprana que la de embriones condivisión tardía (el 56.7% de losembriones fueron aptos para sutransferencia o congelación vs. 32.5%;p<0.001). Entre los embriones condivisión temprana, los simétricospresentaron mejor calidad que losembriones con división asimétrica o losque presentaban fragmentación (60.0%,

52.2% y 24.6% respectivamente;p<0.001).

Por otra parte, los embrionesprocedentes de zigotos divididostempranamente tienen un 75% más deposibilidades de dar lugar a un embriónde buena calidad (RR= 1,75; IC: 95%(1.5-2.0); p<0.001).

Sin embargo, aunque existen diferenciasen la calidad embrionaria dependiendodel tipo de zigoto del que procedan, lastasas de gestación (TG) e implantación(TI) conseguidas con transferencias deembriones con división tempranasimétrica fueron similares a lasconseguidas con embriones con divisióntemprana asimétrica e incluso condivisión tardía (TG: 78.6%, 57.1% y66.65%; TI: 57.1%, 33.3% y 33.85%respectivamente, p>0.05).

CONCLUSIONES:

La división temprana parece estarasociada con el desarrollo de embrionesde calidad embrionaria óptima en día 3.Sin embargo, este parámetro no invasivode potencial embrionario parece noañadir información adicional en lapredicción de las tasas de gestación oimplantación. Deberían ser realizadosmás estudios para confirmar estosresultados.

162

054: DIVISIÓN TEMPRANA DE LOS ZIGOTOS COMO FACTORPRONÓSTICO EN UN PROGRAMA DE DONACIÓN DE OVOCITOS

M. Mollá PhD, L. Muriel PhD, M. Ojeda PhD, S. Portela MD, N. Prados PhD, E. Muñoz MD.IVI Vigo, Vigo. IVI Sevilla, Sevilla



INTRODUCCIÓN:

Los grandes avances en las técnicas deReproducción Asistida, tanto a niveltécnico como a nivel profesional, hansupuesto un aumento en las tasas degestación en los últimos años. Pero esteincremento lleva asociado un aumento,a su vez, de los embarazos múltiples,poniendo a la sociedad médica ycientífica en alerta, por sus efectosnegativos.

Con el fin de evitar este incremento degestaciones múltiples, la actuallegislación española limitó el númeromáximo de embriones a transferir a 3 y,a su vez, las clínicas, junto con ASEBIR,intentamos ejercer un auto-control,impulsando la transferencia selectiva deun único embrión.

Por otro lado, el éxito de lostratamientos se ve limitado, entre otrascosas, por la edad materna. Casi todoslos estudios coinciden en que la tasa degestación disminuye con la edad, y muyespecialmente a partir de los 37 años. Asu vez, las posibilidades que esagestación no llegue a términoaumentan.

En la práctica diaria, nuestros resultadosnos guían hacia donde establecer elpunto de corte a la hora de recomendara la paciente la transferencia selectivade un único embrión, ya que es unabuena opción para minimizar la tasa degestación múltiple pero solo cuando laedad de la paciente lo permita.


Estudio retrospectivo aleatorizado en elcual se analizan 70 pacientes que serealizaron ciclo de FIV, ICSI o técnicaMixta (combinación de las dosanteriores) con ovocitos propios entrelos años 2007 y 2008 en nuestro centro.Como único criterio de inclusión seseleccionaron al azar pacientes que se

transfirieron un único embriónprocedente de un pool de embriones.Los embriones sobrantes fueroncrioconservados.

Se separan las pacientes en 2 grupos poredades: GRUPO A: pacientes menores de37 años (N=40). GRUPO B: pacientes apartir de 37 años (N=30).

El día de la transferencia, los embrionesviables fueron clasificados en 4categorías en función del número,tamaño y simetría de las blastómeras, asícomo del porcentaje de fragmentación yposible multinucleación, siguiendo elprotocolo de ASEBIR.

Se analizan los resultados obtenidostanto a nivel de tasa de gestaciónbioquímica (detección de hormona -hCGen sangre a los 14 días post-transferencia), gestación clínica(detección de latido cardiaco fetal en la6ª semana de gestación) y tasa deaborto.

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

En el periodo comprendido entre el 1 deenero de 2007 y el 1 de enero de 2009,en nuestro centro, se realizaron 803transferencias en “fresco” a pacientesmayores de 37 años, de 1, 2 o 3embriones generados con ovocitospropios.

De esas 803 pacientes, el 25% resultarongestantes, mientras que si nos fijamosúnicamente en las que se transfirieronun único embrión procedente de un pullde embriones, la tasa de gestación fuede un 16,7%. Por el contrario, cuando setransferían 2 o incluso 3 embriones, lastasas de gestación clínica ascendían a un27,4 y a un 40% respectivamente. Eso si,la tasa de gestación múltiple tambiénaumenta, muy especialmente si setransfieren 3 embriones.

Por todo ello, concluimos que latransferencia selectiva de un únicoembrión es una buena opción parapacientes jóvenes. Por el contrario, si lapaciente es de edad avanzada, nosotrosrecomendaríamos la transferencia de 2embriones.

055: LA IMPORTANCIA DE LA EDAD EN LAS TRANSFERENCIASSELECTIVAS

S. Camacho, V. Badajoz, M.C. Cañadas, M. De La Casa, A.R. Díaz, J. Gragera, I. Lozano, L. Martínez, C. Urda, J. Gijón, M. Alcaraz, R. Bonache, J.Rodríguez, C. Pérez, A. Martínez de Arenaza.GINEFIV, Madrid


* p<0.05 y ** p<0.01



INTRODUCCIÓN:

Desde que podemos estudiar el estadocromosómico de los espermatozoidesmediante hibridación “in situ” (FISH)sentimos, pacientes y embriólogos, lanecesidad de saber cómo se relacionadicho resultado de FISH enespermatozoides (“espermFISH”) con lacalidad cromosómica embrionaria en unanálisis preimplantacional (PGS).

Con este estudio trataremos deencontrar, si existe, dicha relación.

Términos clave: FISH enespermatozoides (“espermFISH”), PGS,estado cromosómico.

MATERIAL & MÉTODOS:

Trabajo prospectivo que analiza, medianteFISH, 292 muestras de semen (entre 2006y 2008) para determinar su estadocromosómico (se analizan los cromosomas13, 18, 21, X e Y usando las sondas X:Xp11.1-q11.1 CEPX, Y: Yp11.1-q11.1 CEPYDY23, 13: 13q14 LSI 13, 18: 18p11.1-q11.1CEP18 y 21: 21q22.13-q22.2 LSI 21; seconsideran normales valores de disomíainferiores a los controles: Crom. sex.=0.22%, 13= 0.13%, 18= 0.24%, 21=0.13%, Diploid.= 0.24%)

Por otro lado se realiza un estudioretrospectivo de 680 embriones, biopsiadosentre 2007 y 2008, de los que 652 pudieronser diagnosticados. Se analiza la indicación y se relacionan mediante análisis descriptivos y de frecuencias(porcentajes, Chi cuadrado: p<0.05 indica diferencias significativas,…). Seconsideran normales los embrioneseuploides/equilibrados/sanos, en cadacaso.

RESULTADOS:

De las muestras analizadas sólo el27.40% resultaron anómalas; aunqueclasificando por indicación se observan

diferencias significativas con mayoría deanómalos en casos de “baja tasa/fallo defecundación” (12,86% norm.-28,20%anóm.; p=0.002) o “factor masculino”(11,43% norm.-20,51% anóm.;p=0.047). Esto se ratifica observando lastasas de “espermFISH” alterado según lacalidad seminal: muestras “malas”presentan aumento de resultadosanómalos (36.30%-62,50%,p=0.00005), la mayoría son normales enmuestras “buenas” (16,03%-6,25%,p=0.028) y no hay diferenciassignificativas en muestras “medias”.

Al informar a los pacientes del resultadoalterado del “espermFISH”, se ofrecen 3opciones: el uso de semen de donante,continuar usando esa muestra sinninguna otra precaución o realizar PGS,al considerar mayor el riesgo de formarembriones aneuploides.

Analizando las causas de biopsiaembrionaria, observamos que menos del10% (61) se debieron a un “espermFISH”

alterado. Aunque no hay diferenciassignificativas (48% norm.-52% anóm.,p=0.586), sí hay tendencias hacia unamayoría de embriones anómalos cuandoel “espermFISH” muestra anomalías en más de un valor y, centrándonos en loscromosomas aneuploides, las diferenciasson significativas (27%-73%, p=0.033)en autosomas (13, 18 ó 21).

CONCLUSIÓN:

Debido al reducido tamaño muestral depacientes que tras recibir un diagnóstico

de “espermFISH” alterado decidenrealizar PGS, no se observan diferenciassignificativas; sin embargo sí se apreciantendencias claras hacia una mayoría deembriones anómalos en algunos casosde FISH alterado, en las que sólo con unfactor de aumento de 2 serían inclusoaltamente significativas. Hay que seguiracumulando datos que permitan apoyarla información que ayude a los pacientesa tomar una decisión.

056: RESULTADO ANÓMALO DE FISH EN ESPERMATOZOIDES COMOINDICACIÓN PARA PGS. EXPECTATIVAS.

M. C. Cañadas1, J. Gijón1, M. Alcaraz1, R. Bonache1, S. Camacho1, M. de la Casa1, A. Díaz1, J. Gragera1, L. López1, I. Lozano1, L. Martínez1, M.Oter2, C. Pérez1, J. Rodríguez1, C. Urda1, E. Velilla2, V. Badajoz1, A. M. de Arenaza1

1GINEFIV. Madrid. 2Centro de Medicina Embrionaria. Madrid-Barcelona.

164

Tabla 1.- Resultado del “espermFISH” según calidad seminal.

Tabla 2.- Resultado del “espermFISH” según indicación.

Tabla 3.- Comparación de resultados del PSG. * El tercer decimal sigue siendo 0.

Tabla 4.- Resultados del PGS según el resultado del “espermFISH”.



INTRODUCCIÓN:

El cultivo embrionario hasta el estadiode blastocisto es una práctica habitualen los laboratorios de fecundación invitro, permitiendo no sólo seleccionarembriones con una mayor capacidad deimplantación sino también reducir elnúmero de embriones a transferir y acongelar. En nuestro centro, comonorma general, la transferenciaembrionaria y congelación se realizan endía 3 o en día 5/6 del desarrolloembrionario. Los embriones que, sin serde mala calidad, no son óptimos para latransferencia ni para la criopreservaciónen día 3 se dejan en observación encultivo largo. Los embriones queevolucionan con buena calidad en día 5 odía 6 son criopreservados.

OBJETIVO:

El objetivo de este trabajo es comprobarresultados en términos de tasas degestación, aborto e implantación de estosblastocistos una vez descongelados.


Estudio retrospectivo que incluye 55ciclos de transferencia de blastocistosdescongelados provenientes depacientes sometidas a tratamiento dereproducción asistida en el IVI Madrid en el año 2008. Sólo fueron

criopreservados aquellos blastocistoscon masa celular interna definida,

trofoectodermo con un númeroadecuado de células y bien organizado.

Comparamos dos grupos: un grupocontrol con blastocistos congeladospertenecientes a ciclos de FIV delprograma de cultivo prolongado contransferencia en día 5/6, y un segundogrupo estudio con blastocistoscongelados pertenecientes a ciclos deFIV con transferencia en D3 y que sedejan embriones en observación hastael estadio de blastocisto.

Utilizamos para ambos grupos lavitrificación con el método Cryotop(Kuwayama et al, 2005).

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

Con los resultados obtenidos, podemosconcluir que algunos de los embrionesque no son aptos para la transferencia ocongelación en día 3 sin que lleguen aser de mala calidad, consiguen alcanzarel estadio de blastocisto y sercongelados en este estadio logrando asítasas de gestación e implantacióncomparables estadísticamente con losblastocistos descongelados procedentesde nuestro programa de cultivo largo, sibien presentan una significativa tasa deaborto.

INTRODUCCIÓN:

La participación en programas deControl de Calidad Externos (CCE) está

recomendado por varias SociedadesCientíficas. La evaluación de la calidadembrionaria es de vital importancia a lahora de decidir cuántos y qué embriones

transferir, lo cual está directamenterelacionado con la efectividad de unciclo de FIV y con la probabilidad deembarazo múltiple.

057: CAPACIDAD DE IMPLANTACIÓN DE BLASTOCISTOSDESCONGELADOS PROCEDENTES DE EMBRIONES SUBÓPTIMOS.

A. P. de Souza, I. Cabañes, N. Basile, M. Martínez-Burgos, M. Aragonés, L. Herrero, C. Bou.IVI, Madrid

058: COMPARACIÓN DE MÉTODOS PARA DETERMINAR EL VALOR DEREFERENCIA EN UN PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNODE CLASIFICACIÓN EMBRIONARIA

R. Ruiz de Assin, R. López-Jurado, B. Romero, A. Fernández, B. Rabelo, R. P. Cotarelo, J. A. Castilla, M. A. Calderón.U. Reproducción Hospital Virgen de las Nieves


*p<0,05



OBJETIVO:

Este estudio pretende determinar cual esel valor de referencia adecuado, para laclasificación embrionaria, en unprograma de CCE; la clasificaciónrealizada por la mayoría los laboratoriosparticipantes en el programa de CCE o laclasificación realizada por el consensode los cinco expertos en clasificaciónembrionaria.


En este estudio se comparan losresultados obtenidos en el programaespañol de CCE entre 2003 y 2007, conlos de un grupo de cinco expertosmiembros del grupo de trabajo decalidad embrionaria de ASEBIR. Secompararon un total de 120 videos deembriones (20 cigotos, 50 Día 2 y 50 Día3) en los que se tenía que decidir entreBuena, Regular o Mala calidadembrionaria. Se consideró que existíaacuerdo entre laboratorios cuando másdel 75% de los participantes adjudicaba

la misma categoría para un mismoembrión. Se consideró que existíaacuerdo entre los expertos cuando loscinco expertos coincidían en la mismacategoría para un embrión.

RESULTADOS:

El porcentaje de embriones en los que seobtuvo acuerdo entre los laboratoriosparticipantes fue del 44.2% (53/120),mientras que entre los expertos fue del98.3% (118/120) (p<0.001).

Cuando se compararon los resultados dela clasificación realizada entre lamayoría de los laboratorios y el acuerdoentre expertos se obtuvo un índicekappa de 0.52 (IC: 0.38-0.65). Noexistiendo diferencias cuando se realizala clasificación sobre embriones en Día2 o en Día 3.

Si sólo tenemos en cuenta el 44.2% de losembriones en los que los laboratoriosparticipantes obtuvieron acuerdo el índicekappa es de 0.63 (IC: 0.44-0.82).

Cuando la clasificación asignada por lamayoría de los laboratorios no coincidíacon la asignada por los expertos, en el56.25% (18/32) de los casos, loslaboratorios sobreestimaron la calidaddel embrión.

CONCLUSIONES:

1º Existe un menor acuerdo entrelaboratorios que entre expertos.

2º El acuerdo entre laboratorios yexpertos es moderado aunque sólotengamos en cuenta los embriones en losque los laboratorios lograron acuerdo.

3º Los laboratorios tienden asobreestimar la calidad de un embrión.

4º Por todo esto se debería utilizar comovalor de referencia de un programa deCCE de clasificación embrionaria, laevaluación realizada por el consenso deun grupo de expertos.

INTRODUCCIÓN:

La zona pelúcida (ZP) es una capa deglucoproteinas que envuelve el ovocitoy el embrión protegiéndolo ymanteniendo su integridadtridimensional hasta el momento de laimplantación. Anomalías en suestructura pueden comprometer lafecundación, la viabilidad del embrión,el proceso de implantación y con ello laposibilidad de conseguir un embarazo.Las características de la ZP estáninfluenciadas por el ambiente hormonal,así como por particularidades propias decada individuo. La pauta hormonalseguida durante el tratamiento dereproducción asistida (TRA) podríaafectar a la misma.

La evaluación de los embriones se basa,

entre otros criterios, en el estudio dedistintas características morfológicas,pudiendo ser el de la ZP un criterio mása tener en cuenta. Otros autores hanpropuesto que el análisis de diferentesvariables (como el área, grosor,consistencia, color) de la ZP podríanservir como diagnóstico clínico para laselección embrionaria.

El objetivo del estudio fue observar sixexiste alguna correlación entre lavariación del área total de la ZP deembriones en día 2 de desarrollo (D2) yel embarazo. Además se analizó sifactores como la edad de la paciente, laFSH basal, el estradiol y laprogesterona el día de la HCG, la dosisde FSH y el tipo de frenado, tambiéntenían alguna influencia sobre el áreade la ZP.


Se realizó un estudio retrospectivo enpacientes sometidas a un TRA en elCentro de Reproducción Asistida FIVIA(Torrente, Valencia) entre Abril 2008 yMarzo 2009, de los que se analizaron untotal de 124 embriones. La media deedad de las pacientes era de 34,53 ± 4,6.Se midió el área total de los embrionesen D2, utilizando imágenes capturadasdigitalmente con el CRONUS3 (“videocapture and embryo analysis software”),mediante un microscopio invertido a 20aumentos y óptica Hoffman.

El análisis estadístico se hizo con elprograma estadístico SPSS 11.0 yaplicando el coeficiente de correlaciónde Spearman (p = 0.05) y el de Pearson(p = 0.01).

166

059: CORRELACIÓN ENTRE LA VARIACIÓN DEL ÁREA TOTAL DE LAZP DE EMBRIONES EN DÍA 2 DE DESARROLLO Y EMBARAZO

L. Mifsud, V. Sáez, I. Rubio, M. Lozano, I. Cuevas, J. ÍñiguezCentros de reproducción FIVIA, S.L. (Torrente, Valencia)



RESULTADOS:

Se vio que había correlación entre el áreatotal de la ZP y el test de embarazo ( p =0,036 ), indicando que aquellosembriones que dieron lugar a embarazopresentaban un área media de 7849,02μm2 ± 3081,99. En cambio, no seencontró ninguna relaciónestadísticamente significativa cuando seestudió la influencia de los distintosfactores (edad de la paciente, FSH basal,

estradiol el día de la HCG, dosis de FSH,progesterona día HCG, tipo de frenado)en relación con la variabilidad en el áreade la ZP.

CONCLUSIONES:

Según los resultados obtenidos connuestro estudio parece existir un rangorespecto al área total de la ZP donde losembriones podrían tener mayoresposibilidades de resultar en embarazo.

Por otra parte, según nuestrosresultados, ninguno de los factores quehemos estudiado influiría de formasignificativa en la relación entre la ZP yel embarazo.

A la vista de este trabajo, seríaconveniente realizar un estudioprospectivo randomizado con un tamañomuestral mayor para seguir con labúsqueda de parámetros no invasivos deevaluación embrionaria.

OBJETIVO:

Comparar tres medios de cultivocomerciales con el objetivo de implantaruno de ellos en el laboratorio de FIV enbase a sus mejores resultados.

Diseño: Estudio prospectivo randomizado


Desde Octubre a Diciembre de 2008incluimos 125 pacientes de ovocitospropios con edades comprendidas entre 28y 42 años. Todas las pacientes, con almenos un ovocito, fueron incluidas sinrestricciones por factor masculino ofemenino. Randomizadamente separamosa las pacientes en los grupos: Vitrolife G5Plus (Vitrolife, Sweden), Sage (SageMedia)y Global (LifeGlobal). La hiperestimulaciónovárica controlada fue iniciada con FSHr-HMG en día 2 ó 3 del ciclo menstrual y ladesensibilización hipofisaria se llevó acabo usando Cetrorelix 0.25 mg (Cetrotide,Merck-Serono) cuando el folículodominante media > 14 mm de diámetro ó

en el día 5-6 de estimulación. La ovulaciónfue inducida con hCGr (Ovitrelle, Merck-Serono) cuando la hiperestimulaciónovárica dio como resultado al menos dosfolículos > 18 mm de diámetro. Después dela extracción de los ovocitos utilizamos latécnica de ICSI y cultivo embrionario hastael día 3 de desarrollo. En cumpimiento dela ley española, un máximo de 3 embrionesfueron transferidos. Dos semanas despuésobservamos el latido cardiaco fetalmediante ecografía por ultrasonidosconstatando la gestación clínica. Lavaloración embrionaria se hizo en base alos criterios de ASEBIR. Los análisisestadísticos fueron realizados con G-Stat2.0 (GlaxoSmithKline).

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

No observamos diferenciasestadísticamente significativas enninguno de los parámetros analizadosen nuestros grupos de estudio. En base aestos resultados elegimos GlobalMedium como nuestro medio de cultivode rutina en el laboratorio de FIV debidoa su simplicidad en el set up, además dehaber observado un ligero incrementode la tasa de embarazo clínico.

INTRODUCCIÓN:

Si se considera un embrión de 8 célulascomo un lote con 8 items, podemos

determinar cual sería el plan demuestreo más adecuado para no aceptarembriones anormales durante el PGD-AS. ¿Es suficiente testar una

blastómera? ¿Cuántas blastoméras sedeben de analizar para estar seguro delresultado? En un PGD se pueden cometerdos clases de errores: cuando se clasifica


060: COMPARACIÓN ENTRE MEDIOS DE CULTIVO COMERCIALESJ. Herreros, G. Quea, E. Garijo, F. Galera, J. MuñozInstituto Madrileño de Fertilidad (IMF). Madrid.

061: ESTIMACIÓN TEÓRICA DEL ERROR DE MUESTREO EN PGD-AS

S. Zamora, A. Clavero, M. C. Gonzalvo, M. Roldán, B. Rabelo, R. P. Cotarelo, L. Martínez, B. Romero.U. Reproducción Hospital Virgen de las Nieves, Granada



a un embrión como anormal siendo éstenormal (error alpha o falso positivo) ocuando se concluye que un embrión esnormal siendo éste anormal (error beta ofalso negativo). Nosotros consideramosmás importante en un programa descreening tener una baja tasa de falsosnegativos (error beta) que de falsospositivos (error alpha). En este estudio sedeterminará el número necesario deblastómeras a estudiar para encontrar unequilibrio clínicamente útil de estos dostipos de errores.


Se considera un error alpha de 0.10 y unerror beta de 0.05. Además, AcceptableQuality Level (AQL), el número deblastoméras anormales con las que unembrión sería siempre aceptado seestima en <1, lo más próximo a cero. Sinembargo, LTPD (Lot quality assurancesampling), el número de blastómerasanormales que hacen que el embrión seadefinitivamente inaceptable, se estimasegún la bibliografía en ≥3, porque seconsidera que menos del 30% de

mosaicismo en el embrión es viable. LaOC (Operating Characteristics Curves)para los diferentes planes de muestreo secalculó mediante una distribuciónhipergeométrica. Una, dos o tresblastómeras biopsiadas en las que no sepermite que tengan ningún defecto (c=0).Un óptimo plan de muestreo será aquelque con una alta probabilidad (90%, 1-alpha) acepte (considere normales)embriones con menos de 1 blastómeraanormal (AQL<1, próximo a 0), al mismotiempo que con una baja probabilidad(5%, beta) acepte (considere normales)embriones que tengan 3 blastómerasanormales (LTPD³3).

RESULTADOS:

Se puede observar como con n=2, c=0 yn=3, c=0 se obtiene AQL <1 con valoressimilares de alpha (próximos a 0.10). Sinembargo se observan grandesdiferencias en el error beta según el plande muestreo y en todos los casosalejados del ideal 5%. Biopsiando 1célula y resultando su análisis normal deun embrión de 8 células (n=1, c=0), se

obtiene una probabilidad del 63% deaceptar embriones con ≥3 blastómerasanormales. De cualquier manera,biopsiando 2 ó 3 blastómeras resultandosus análisis normales de un embrión de 8células (n=2, c=0 o n=3, c=0,respectivamente) se tienen un 37% o18% de posibilidades de aceptarembriones con ≥ 3 blastómerasanormales, respectivamente.

CONCLUSIONES:

Aunque con los 2 últimos planes demuestreo se reduce considerablementeel error beta, se sigue cometiendo unelevado porcentaje de error aceptandocomo buenos embriones que aquellosque serán no viables. De este modo, conestas estrategias se obtendrá un bajonúmero de embriones buenosdesechados (bajos número de falsospositive o error alpha), pero un elevadonúmero de embriones anormalesaceptados (alto número de falsosnegativos o error beta). Esta limitaciónpuede explicar la escasa validez clínicadel PGD-AS.

INTRODUCCIÓN:

Es sobradamente conocida lacontroversia existente en el mundo de laReproducción en relación con ladisminución con los años de la calidadseminal humana. Esta disminución en lacalidad seminal presenta seguidores ydetractores y, en cualquier caso, existenen la literatura científica estudios afavor y en contra de la misma. En elBanco de semen CEIFER nos sumamos aeste debate presentando un estudioretrospectivo de calidad seminal. Hemosanalizado la concentración espermáticade los varones que se han presentado anuestro banco de semen con la intenciónde ser donantes de semen durante losaños 1999 a 2009.


Las muestras se han obtenido pormasturbación con un período deabstinencia sexual de 3 a 5 días. Hansido analizadas mediante microscopio decontraste de fases y cámara Makler porun observador inscrito desde el año1999 al Programa de Control de CalidadExterno de Análisis de Semen del Grupode Interés en Andrología de la ESHRE yde ASEBIR

Se ha estudiado una sola muestraseminal por cada candidato a donante desemen (n = 1823). La población objetode estudio tiene una edad media de22.02 años (+ 4.01 SD).

RESULTADOS:

Tras la eliminación de los outliers por elmétodo del recorrido intercuartílico,hemos obtenido una concentraciónmedia de 78.7 x 106/ml (+ 48.77 SD)

El volumen medio ha sido de 3.7ml (+ 1.5SD), y la media del total deespermatozoides por eyaculado ha sidode 267.9 x 106 (+ 178.1 SD).

El análisis del intervalo de 11 años querecoge este estudio da como resultadounas rectas de regresión lineal en las quese aprecia una disminución de laconcentración seminal a lo largo de losaños. Tras aplicar un análisis decorrelaciones entre la concentración

168

062: EVOLUCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA EN UNAPOBLACIÓN DE JÓVENES ESPAÑOLES DURANTE LOS AÑOS 1999 Y 2009.

A. Yoldi, J. P. Ramírez, A. Vaquero, J. A. Castilla.Banco de semen CEIFER, Granada



espermática y los años del estudio vemosque esta disminución del 0.07% por año esestadísticamente significativa (p<0.01).

Por otro lado, las rectas de regresiónevidencian un aumento en el volumenseminal del 0.085% anual con (p<0.01)de significación.

Finalmente, la cantidad total deespermatozoides por eyaculadopresenta una recta sin pendienteaparente. Su análisis de correlaciónmuestra una disminución del 0.013%anual sin significación estadística (n.s.).

CONCLUSIONES:

Tras estudiar una población de 1823aspirantes a donantes de semen,durante los años 1999 a 2009, noapreciamos un descenso en la calidadseminal en cuanto a cantidad total deespermatozoides por eyaculado serefiere.

INTRODUCCIÓN:

El éxito de las técnicas de reproducciónasistida depende esencialmente de laoptimización de los protocolos deestimulación ovárica controlada y de lacalidad de los gametos ya que estos dosfactores van a determinar el número deembriones con altas tasas deimplantación. Por ello, dentro delestudio de la pareja estéril la valoraciónhormonal y ecográfica del ovario sonuna parte indispensable y el estudio dela reserva ovárica es realizadosistemáticamente.

Estudios recientes aseguran que losvalores elevados de FSH basal (indicadorde baja reserva ovárica) reflejan lacantidad de ovocitos pero no su calidad.

El objetivo de este trabajo es determinarla calidad ovocitaria de las pacientes conbaja reserva ovárica de una maneraobjetiva, estudiando los ovocitosobtenidos mediante un sistema de luzpolarizada.


Se realiza un estudio retrospectivo denuestra casuística entre noviembre del2008 y mayo del 2009.

Se determina un grupo control (A) de 12pacientes cuya reserva ovárica esnormal. Se les somete a un tratamientoestándar de estimulación ováricacontrolada. Los ovocitos MII

recuperados son analizados mediante elsistema OOSIGHT, obteniéndose valoresde la densidad de la zona pelúcida y delhuso meiótico así como la desviación delos microtúbulos.

El grupo de pacientes con baja reservaovárica (B), está formado por 5pacientes que presentaban un FSH basal> de 8mUI/ml y un recuento basal defolículos antrales de ≤ 3. En este grupose realizó una estimulación ováricaacorde a su patología y los ovocitosfueron analizados de igual manera quelos del grupo control.

En todos los casos se realizó una I.C.S.I.y para la valoración embrionaria sesiguieron los criterios de ASEBIR. El díade la transferencia se seleccionaron losembriones de mejor calidad y frente amisma calidad elegimos el que procedede un ovocito con mejores valores en susestructuras.

RESULTADOS:

Los datos obtenidos fueron lossiguientes:

CONCLUSIONES:

Los datos presentados apoyan lahipótesis de que las mujeres con bajareserva ovárica no presentan unacalidad ovocitaria ni embrionariainferior a la de un grupo de mujeres desimilar edad con reserva ovárica normal.Por tanto la tasa de gestación no se veafectada por la reserva ovárica de lamujer.


063: EVALUACIÓN DE LA CALIDAD OVOCITARIA MEDIANTE UN SISTEMADE LUZ POLARIZADA EN PACIENTES CON BAJA RESERVA OVÁRICA

I. Martínez Arcos, F. Gallego Terris, R. Devesa Hermida, A. Durán Boo, F. López-Roibal, T. García Barral, M. Ortiz Cachón.USP Hospital Santa Teresa. Equipo Ron



INTRODUCCIÓN:

La formación de fragmentos en lospreembriones humanos es unfenómenos que ocurre con ciertafrecuencia en los embriones cultivadosin vitro, su presencia se considera signode mal pronóstico ya que puede serindicativo de procesos de apoptosis opuede afectar a los patronesdistribución de moléculas de adhesión olas los dominios polarizados de lasmembranas de las blastómeras.Históricamente la evaluación de lafragmentación embrionaria se basabaen cálculo subjetivo del porcentaje delvolumen del preembrión afectado confragmentos. Sin embargo, otrosaspectos como son el tamaño y ladistribución de éstos fueronañadiéndose a la evaluación de lospreembriones. En el presente trabajoqueremos validar este aspectoanalizando si el potencial deimplantación de los preembrioneshumanos fragmentados puede estarmodificado por el tamaño o ladistribución que los fragmentos.


Estudio retrospectivo que comprendióun total 2728 embriones transferidos

entre 4 y 5 células en d2 y entre 6 y 10células en d3 procedentes de 358 deciclos de ovocitos propios y 348 de ciclosde donación de ovocitos. La relaciónentre el porcentaje de fragmentaciónembrionaria en d2 y d3, el tipo de

fragmentación (variables de exposición)y la tasa de implantación (variablerespuesta) fue analizada mediante unmodelo de regresión lineal. Valores dep< 0.05 fueron consideradasestadísticamente significativas.

RESULTADOS:

Tanto el porcentaje de fragmentación end2 como d3 resultó tener una correlaciónnegativa con la tasa de implantaciónr=0.19 p<0,002, Beta= -1.55, IC 95% (-1,93, -0.42); . r=0.1 p<0,0004, Beta= -0.101, IC 95% (-0,93, -0.42)respectivamente. Tras la inclusión en elmodelo de regresión lineal de los tres

tipos de fragmentación 2, 3 y 4 paraconocer su relevancia en la implantaciónjunto con el porcentaje de la misma,únicamente el tipo $ tipo 4 mostrarontener una influencia directa como serepresenta en la siguiente tabla (Tabla 1).

Tabla1

CONCLUSIONES:

Estos resultados indican que ladistribución de los fragmentos noinfluye sobre la disminución de laviabilidad del embrión debido a lafragmentación, sin embargo, laaparición de fragmentos grandes en lospreembriones humanos en d3 tiene unefecto negativo sobre la viabilidadembrionaria que puede ser indicativo deun mecanismo diferente en elpreembrión que influya en elcompromiso de su viabilidad.

INTRODUCCIÓN:

Tras realizar una revisión bibliográficade morfología pronuclear, se planteó ennuestro laboratorio un nuevo sistema declasificación para los zigotos observados

18-19 horas post – ICSI. Se comenzarona clasificar básicamente en dos gruposatendiendo a la simetría y yuxtaposiciónde los pronúcleos. En el tipo A seincluyeron los zigotos cuyos pronúcleostenían el mismo tamaño y además se

encontraban juntos. Los zigotos conpronúcleos de diferente tamaño oseparados fueron clasificados tipo B.Además se contabilizó el número deprecursores nucleolares en cada uno delos pronúcleos y se hicieron 3 subgrupos

064: REFLEXIONES SOBRE EL IMPACTO DEL PORCENTAJE DEFRAGMENTACIÓN Y SUS TIPOS SOBRE LA IMPLANTACIÓN DE LOSPREEMBRIONES HUMANOS CULTIVADOS IN VITRO.

M. Borges, A. Galán, C. Albert, A. Tejera, P. Romero, M. Meseguer, M. J. de los SantosIVI Valencia

065: EVALUACIÓN DEL ESTADÍO PRONUCLEAR COMO CRITERIO DESELECCIÓN EMBRIONARIA

I. Cuevas, J. Íñiguez, I. Rubio, L. MifsudHospital General Universitario de Valencia

170



según su distribución. Los A1 o B1,alineados, los A2 o B2 dispersos por elpronúcleo, y los A3 o B3, uno alineadosy el otro dispersos.

Se comenzaron a recopilar estos datosdesde Mayo de 2005, aunque al no tenerevidencias de la idoneidad de estaclasificación, las transferenciasembrionarias se realizaron atendiendo acriterios morfológicos en día 2 o 3 decultivo.


Se analizaron de forma retrospectiva 393pronúcleos de los embrionestransferidos que implantaron (nº sacosgestacionales = nº embrionestransferidos) (n = 57) y los que noimplantaron (nº sacos = 0) (n 336) entreJunio de 2005 y Diciembre de 2008.Fueron excluidos del estudio los casos

que dieron una gestación bioquímica. Laedad media de las pacientes fue de 34.07± 3.72. Los datos fueron analizados conel programa SPSS 11.0.

RESULTADOS:

Las tasas de implantación de los gruposA y B fueron significativamentediferentes. Los embriones del grupo Apresentaron una tasa de implantacióndel 15.7% frente al 4,7% del grupo B conun p-valor del 0.033 (ic. 95%).

Cuando se analizó la disposición(subgrupos 1,2 o 3) y número deprecursores nucleolares, no seencontraron diferenciasestadísticamente significativas, nisiquiera cuando al menos uno de los 2pronúcleos presentaba 1 sólo precursornucleolar.

La probabilidad de implantación de unembrión procedente de un zigoto tipo Acon respecto a uno tipo B se calculósiendo la OR 3.82 (p= 0.033).

No se encontraron diferenciasestadísticamente significativas entre laedad de la mujer y la de que el zigotopertenezca al grupo A o B.

CONCLUSIONES:

Ya que según estos resultados losembriones procedentes de zigotos tipoA tienen casi 4 veces más probabilidadde implantar que los tipo B,comenzaremos a incluir este sistema declasificación de forma prospectiva en laselección embrionaria, esperando deeste modo continuar mejorandonuestras tasas de implantación.

INTRODUCCIÓN:

La conservación de embriones juega unpapel muy importante en lareproducción humana asistida. Elproceso de estimulación ovárica seintenta optimizar al máximo,procurando obtener un númerosuficiente de embriones dondeseleccionar los de mejor calidad paratransferir y el resto poder congelar paraun segundo intento.

El objetivo de este estudio es lacomparación de los porcentajes deembarazo por transferencias deembriones procedentes de ciclos enfresco y de vitrificados.

La vitrificación es un método decriopreservación en el que se enfrían lassoluciones a altas velocidades parasolidificarlas sin formar cristales dehielo, esto minimiza los inconvenientesde la congelación lenta.

MATERIAL Y METODOS:

Se realizó un análisis retrospectivo de lastasas de embarazo de los ciclos en frescorealizados en la clínica desde enero de2007 hasta septiembre de 2008 con lastasas obtenidas en transferencias deembriones vitrificados. Se incluyerontodos los ciclos en los que huboembriones para transferir en fresco. Entransferencias de vitrificados, incluimostodas aquellas en las que había habidotransferencia en fresco y no habíanquedado embarazadas.

La vitrificación se realizó con la técnica deCryotop. Los embriones fueron vitrificadosen día +2,+3 ó +5 en función del día que serealizó la transferencia en fresco.

El análisis estadístico se obtuvoaplicando contraste de hipótesis deigualdad de proporción poblacional conun nivel de significación <0.05 con elsoftware comercial SigmaStat 3.1.

RESULTADOS:

Se realizaron 1279 transferencias enfresco consiguiendo una tasa deembarazo del 49,8%. Tras la congelaciónde los embriones sobrante de estosciclos, se realizaron 184 ciclos devitrificados consiguiendo una tasa deembarazo del 41%. Con respecto a lastasas de embarazo en función delnúmero de embriones de buena calidadtransferidos no obtenemos diferenciassignificativas cuando se transfieren almenos 1 embrión de buena calidad enfresco y en vitrificados. Tampocoencontramos diferencias con respecto ala tasa de embarazo en función de laedad de las pacientes ni de la medida delendometrio en fresco y vitrificados.

CONCLUSIONES:

Este estudio compara ciclos en fresco sinseleccionar con embriones que no hansido seleccionados para ser transferidos


066: LA VITRIFICACIÓN PERMITE OBTENER TASAS DE EMBARAZOSCOMPARABLES A LAS OBTENIDAS CON EMBRIONES EN FRESCO.

M. Dorado, M. González, M. Hebles, B. Migueles, L. Aguilera, P. Sánchez, F. Sánchez.Clínicas Ginemed, Sevilla



en fresco y han sido vitrificados. Portanto estos embriones considerados “notan buenos” deberían dar una tasa menorde embarazo si hubieran sido transferidosen fresco y aún más baja al haber sufridoel proceso de vitrificación/ thawing. Sinembargo esto no se observa, lo que noshace pensar, dado que la funcionalidad

del embrión tras la desvitrificaciónpermanece intacta, que la tasaligeramente inferior de embarazos envitrificados se puede deber únicamente ala calidad de esos embriones.

La vitrificación es una técnica que nospermite conservar los embriones

sobrantes de ciclos de reproducciónasistida manteniendo intacta lafuncionalidad de embriones. Nospermite cancelar ciclos por riesgo dehiperestimulación o por mala calidadendometrial sin comprometer la calidadembrionaria y las tasas de embarazo.

INTRODUCCIÓN:

Actualmente, existe la tendencia arealizar la transferencia embrionaria end+3, bajo el supuesto de que, sipretendemos seleccionar los embrionescon mayor potencial de implantación, elretrasar la transferencia de d+2 a d+3podría aportar más argumentos parallevar a cabo dicha selección. Sinembargo, algunos autores defienden que la probabilidad de embarazotransfiriendo en d+2 escomparativamente similar a la de d+3.Además, teniendo en cuenta que en d+2es más probable que haya embrionessusceptibles de ser congelados, si seacumularan los embarazos en ladescongelación a los embarazos enfresco, la probabilidad de embarazo porciclo transfiriendo en d+2 y en d+3 seigualaría. Por lo tanto, en este estudiocomparamos la tasa de embarazoacumulada de las transferencias en

fresco más los embarazos endescongelación, según si la transferenciaen fresco se realiza en d+2 o en d+3.


Se analizaron retrospectivamente 456ciclos de FIV-ICSI realizados en mujeresmenores de 39 años. Estos casos fueronseleccionados como de buen pronóstico,dado que en todos ellos se congelaronembriones. 147 transferencias en fresco sellevaron a cabo en d+2 y 309 transferenciasen fresco se realizaron en d+3.

RESULTADOS:

En el grupo de transferencias en frescoen d+2, 72 de las 147 transferenciasfueron embarazos clínicos (48,9%).Sumando los 21 embarazos clínicosproducto de las descongelaciones de losciclos en los que no hubo embarazo enfresco, la tasa de embarazo acumulada

en el grupo de d+2 fue de 63,3%(93/147). En el grupo de transferenciasen fresco en d+3, 156 de las 309transferencias fueron embarazos clínicos(50,5%). La tasa de embarazoacumulada en d+3 con los 30 embarazosen la descongelación fue de 60,2% (186/309). El análisisestadístico mediante chi-cuadrado nomostró diferencias estadísticamentesignificativas entre las tasas deembarazo en fresco ni en la acumuladacon la congelación.

CONCLUSIONES:

Los resultados de nuestro estudiomuestran que las tasas de embarazotanto en fresco como la acumulada conla descongelación son similares si secompara la transferencia en d+2 con latransferencia en d+3.

INTRODUCCIÓN:

En nuestro centro, empezamos a utilizarla vitrificación de manera rutinaria a

mediados de 2007. Pero no fue hastafinales de 2008 que empezamos a tenerdemanda de transferencias conembriones vitrificados, de manera que

nos pareció interesante estudiar elrendimiento global de esta nuevatécnica. La vitrificación se lleva a cabocon medios Irvine®, siguiendo el

172

067: COMPARATIVA DE LA TASA ACUMULADA DE EMBARAZO PORCICLO (EN FRESCO + DESCONGELACIÓN) EN FUNCIÓN DEL DÍA DELA TRANSFERENCIA EN FRESCO (D+2 VS D+3) J. Cuadros, L. Andrés Criado, M. Sánchez de Burgos, M. Nieto Sánchez, E. HernándezClínica FivMadrid

068: ¿ES REALMENTE LA VITRIFICACIÓN MÁS EFECTIVA QUE LACONGELACIÓN LENTA? PRIMEROS RESULTADOS EN CIRH

M. Rodríguez, L. Prats, O. Cairo, S. Rovira, F. del Río, A. BrassescoC.I.R.H, Barcelona



protocolo que marca la casa comercial,utilizando como soporte un sistemacerrado, el Cryotip®. Posteriormente,estos se almacenan en tanques denitrógeno líquido hasta el momento desu descongelación. Se descongela conmedios Irvine®, siguiendo también elprotocolo de la casa comercial, dejandolos embriones en medio de cultivo hastael momento de la transferencia,aproximadamente 16 horas después.


Se analizaron todos los ciclos detransferencia de embrionescriopreservados entre el 1 de octubre de2008 y el 31 de marzo de 2009,obteniéndose 216 ciclos. Se separaronen función de la técnica decriopreservación utilizada: congelaciónlenta (196 ciclos) y vitrificación (20ciclos), tanto si se congelaron en día 2como en día 3 post-punción. Seexcluyeron aquellos ciclos en los que lacriopreservación del embrión se realizóen estadio de blastocisto.

Se valoraron los siguientes parámetros:la tasa de supervivencia (embriones que

resisten a la descongelación respecto altotal de embriones descongelados), elporcentaje de embriones queevolucionaron del día de ladescongelación al día de latransferencia, el rendimiento de latécnica (considerando el nº deembriones transferidos respecto al nº deembriones que se descongelaron);porcentaje de embarazo portransferencia y por ciclo, porcentaje deimplantación y por último tasa deaborto.

Todos los valores obtenidos seanalizaron mediante el test Chi Cuadradoconsiderándose como índice designificancia cuando p< 0.05.

RESULTADOS:

Una vez analizados los datos obtuvimosun porcentaje de supervivencia del67.3% en congelación lenta y un 92.6%en vitrificación (p=0.0002).Elporcentaje de embriones evolutivos fuedel 70.6 % vs. 78% (p= 0.3496),elrendimiento de las técnicas fue del 46%vs. 72,2% (p=0.0004). El porcentaje deembarazo por transferencia fue del

38.4% vs. 40% (p=0.9163) y por ciclo del31.1% vs.40% (p=0.5744). La tasa deimplantación fue del 19.6% vs.23.1%(p=0.7609) y por último la tasa deaborto fue del 29.5% vs.25%(p=0.8803).

Al comparar estos parámetros, sóloencontramos diferencias significativasen las tasas de supervivencia yrendimiento, que fueron mayores en lavitrificación.

CONCLUSIONES:

Aunque el número de casos deembriones vitrificados y posteriormentetransferidos hasta el momento sea bajo,los resultados observados nos indicanque esta técnica presenta una mayorgarantía de supervivencia embrionaria,dando lugar a un menor número detransferencias canceladas, y por tanto,un rendimiento global dedescongelación superior. Podemosconcluir que con la vitrificación senecesita descongelar un menor númerode embriones para obtener la mismatasa de embarazo, implantación y abortoque con la congelación lenta.

INTRODUCCIÓN:

Ante el incremento de ciclos de FIV-ICSIsin causa masculina evidente y laimportancia que tiene la multinucleaciónen la viabilidad embrionaria, el objetivodel trabajo es investigar la incidencia demultinucleación en función de la técnicade fecundación utilizada y la calidadseminal.


Estudio retrospectivo de 1173 embrionescon desarrollo embrionario óptimo (DT:división temprana y estadío de 4- ó 5-

células en día +2) pertenecientes a 515ciclos de FIV realizados entre 2005 y2008.

La media de edad de las pacientes enestos ciclos fue de 34,4 años [rango: 20-47]. El promedio de horas post-inseminación en el cual se observa la DTes de 26,3 [rango: 23-29 h] y laobservación en día+2 se realiza entre las43 y las 45 horas post-inseminación. Apesar que las transferencias se realizanen día+3, en este estudio la nucleaciónse ha valorado en día+2 para garantizarla correcta evaluación de la nucleaciónen cada uno de los blastómeros.

Del total de embriones estudiados, 323embriones proceden de FIV convencional(27,5%) mientras que 805 (72,5%)proceden de FIV-ICSI, en 533 debido acalidad seminal baja (CSBaja) mientrasque en los 317 embriones restantes lacalidad seminal era normal (CSNormal)y las indicaciones son varias (bajarespuesta folicular, edad maternaavanzada, fallo de inseminaciónprevio...). Se analiza la incidencia demultinucleación en día+2 según latécnica de fecundación y según lacalidad seminal. Análisis estadístico:Fisher exact test, P<0,001.


069: LA INCIDENCIA DE MULTINUCLEACIÓN EN EMBRIONES CONÓPTIMO DESARROLLO EMBRIONARIO ES SUPERIOR TRAS FIV-ICSI.

M. C. Pons, I. Solvas, M. Grossmann, R. Noblom, X. Julve, J. Nadal.Centro Médico Teknon. Unitat Reproducció Assistida, Barcelona



RESULTADOS:

De los 1173 embriones analizados, 152presentan algún blastómeromultinucleado en día+2 (12,9%). En latabla se muestra que la incidencia demultinucleación en embrionesprocedentes de FIV-ICSI essignificativamente superior (14,9%) queen embriones procedentes de FIVconvencional (7,7%). Por otro lado, alanalizar la incidencia de multinucleaciónen los 2 subgrupos de FIV-ICSI no seobservan diferencias entre ambos(13,7% en CSBaja y 17% en CSNormal).Sin embargo al comparar la incidenciaentre el grupo de FIV convencional y

cada subgrupo de FIV-ICSI sí seencuentran diferencias significativas.

CONCLUSIONES:

En esta población seleccionada deembriones:

1/. El aumento en la incidencia demultinucleación se atribuye a la técnicade ICSI per se.

2/. La incidencia de multinucleación nose ve afectada por la calidad seminal

INTRODUCCIÓN:

El fallo total de fecundación en ciclos deFIV/ICSI sigue siendo un gran problemaen el laboratorio de reproducciónasistida. La conjunción de factormasculino severo, escaso número deovocitos, baja calidad de estos o inclusofactores idiopáticos pueden ser la causa.El que se de fallo en un ciclo no implicaque vuelva a repetirse en el siguientepero, para tratar de prevenirlo, esrecomendable realizar estudios másespecíficos del factor masculino. Ya quela fragmentación del ADN espermático oun resultado de FISH alterado puedecausar infertilidad en muestrasaparentemente buenas. Laincorporación de estas técnicas comopruebas de rutina en el laboratorio deFIV ayudan a tomar decisiones, a vecescomplicadas, come el cambio de gameto.

MATERIAL Y METODOS:

Seguimiento, hasta diciembre de 2008,de los ciclos posteriores a los quesufrieron fallo total de fecundaciónentre octubre de 2004 y junio de 2007 enla clínica Ginefiv, de Madrid.

RESULTADOS:

De 206 parejas estudiadas, con edadmedia materna de 35,71 ± 4,44 años, el38.83% (80) no volvieron a realizarningún ciclo pero en el seguimiento delos casos se confirmaron 4 gestacionesespontáneas, una de ellas acabada enaborto. De las restantes, 125 realizan almenos un ciclo de FIV-ICSI (1 se cancelópor baja respuesta) y otra se hizo unciclo de IAD. Hasta 24 parejas de las 124(19,35%) hicieron más de un tipo de

ciclo (de gametos propios y dedonación). Al analizar el total de ciclosposteriores a fallo de FIV (207) seobtienen los valores expresados en la

tabla (1): 121 ciclos se realizan congametos propios y 86 con gametosdonados (bien sólo uno bien ambos). En178 (85.99%) hubo transferencia. En el17.36% (21) de los “ciclos propios” seobservó un nuevo fallo de FIV perotambién se dieron 28 embarazos(23,14%), con un 61.71% (17) deevolución a término. De los 86 ciclosrestantes, “de donación”, se consiguieron32 embarazos (37,21%), con un 78.13%(25) de evolución a término.

Atendiendo al gameto donadodividimos los 86 ciclos y comparamostasas de embarazo y evolución atérmino (tabla 2).

174

070: CICLOS POSTERIORES EN PAREJAS CON FALLO TOTAL DEFECUNDACIÓN

J. A. Gragera, M. C. Cañadas, V. Badajoz, S. Camacho, M. de la Casa, A. R. Díaz, I. Lozano, L. Martínez, C. Urda, J. Gijón, M. Alcaraz, R. Bonache,J. Rodríguez, C. Pérez, A. Martínez de Arenaza.GINEFIV, Madrid

a: P=0,0009; b: ns; c: P=0,0078; d: P=0,0004

Tabla 1: Comparación entre ciclos homólogos y heterólogos.

Tabla 2: Comparación entre ciclos con gametos donados

070: CICLOS POSTERIORES EN PAREJAS CON FALLO TOTAL DEFECUNDACIÓN

J. A. Gragera, M. C. Cañadas, V. Badajoz, S. Camacho, M. de la Casa, A. R. Díaz, I. Lozano, L. Martínez, C. Urda, J. Gijón, M. Alcaraz, R. Bonache,J. Rodríguez, C. Pérez, A. Martínez de Arenaza.GINEFIV, Madrid



CONCLUSIONES:

Aunque hay diferencia estadísticamentesignificativa en el porcentaje deembarazo (p: 0,028), no se da en la tasade evolución (p: 0,14) si comparamosciclos posteriores con gametos propioso donados en parejas con fallo defecundación. Cuando se produce dichofallo puede recomendarse un nuevo ciclo

con gametos propios (hasta el 82.64%consigue embriones) si no se objetiva unresultado de FISH o de fragmentación deADN espermático alterado. Hay queintentar agotar todas las posibilidadespara conseguir un hijo biológico, perocon dos fallos de fecundación lo másrecomendable es cambiar de gameto,aunque es necesario ayudar a la parejaen esta difícil toma de decisión.

BIBLIOGRAFIA:

1.- Habilidades de comunicación enreproducción asistida. Grupo de interésde Psicología de la Reproducción.Sociedad Española de Fertilidad. Coord:Agustín Moreno Sánchez. Edikamed, SL.2008. Madrid.

INTRODUCCIÓN:

Las nuevas técnicas de diagnóstico delespermatozoide como la determinación dela fragmentación del DNA o la observacióndel mismo con técnicas de microscopíaelectrónica, nos dan una informaciónvaliosa sobre patologías espermáticas queel seminograma de rutina es incapaz dedetectar. Hasta hace bien poco, los datosque nos ofrecían las técnicas dedeterminación de la fragmentación delDNA tenía escasa validez a la hora de suaplicación en la rutina del laboratorio.

La aparición de microscopios de últimageneración que nos dan la posibilidad deobservar el espermatozoide con mayordetalle, nos dan la oportunidad derelacionar esta fragmentación del DNApara la que, aunque conocíamos suexistencia, no sabíamos como tratar hastaahora. Diferentes grupos han relacionadoen sus trabajos la existencia de vacuolasen el núcleo de espermatozoides confragmentación del DNA. Un semendiagnosticado como “NORMAL” por unseminograma rutinario puede presentaruna fragmentación alterada que nos va adar lugar a embriones que si bien no venalterada su tasa de fecundación ni en lacalidad embrionaria, si van a presentardiferencias como una menor tasa deimplantación y de división a partir de día+3 y una mayor tasa de aborto.


Se seleccionaron tres parejas contratamientos previos en reproducciónasistida ya fuese en nuestro centro ó

proveniente de otro.

A todas ellas se les realizó el test defragmentación medido por SCD con el kitHalosperm® y en los tres casos superabael 25%, sólo una de ellas presentaba unsemen con OTA severa, en los otros doscasos el recuento y la motilidad eran“aceptables” según el seminogramarutinario.

RESULTADOS:

Los embriones transferidos en el ciclo enel que obtuvimos embarazo no eran demejor calidad que los transferidos enciclos anteriores (salvo en el caso A, delque no tenemos datos anteriores ya queprovenían de otro centro).En las tresparejas obtuvimos embarazo tras laselección de espermatozoides conmorfología normal y libres de vacuolas.

CONCLUSIONES:

El hecho de que una fragmentación delDNA espermático nos dé igual tasa de

fecundación, división y fragmentaciónembrionaria, nos puede llevar a error enla determinación al tratamiento a aplicaren fallos de implantación previos. Laselección de espermatozoides de buena

morfología libres de vacuolas, van a darlugar a embriones con una mayor tasa deimplantación.

BIBLIOGRAFÍA:

1.The morfological normalcy of the spermnucleus and pregnancy rate ofintracytoplasmic injection withmorphologically selected sperm. ArieBerkovitz, Fina Eltes, Sholomit Yaari,Nathan Katz, Ilya Barr, Ami Fishman,Benjamin Bartoov. Human Reproduction.Vol 20 Nº1, pp185-190, 2005

2. Does the presence of nuclear vacuoles inhuman sperm selected for ICSI affectpregnancy outcome?. Arie Berkovitz, FinaEltes, Adrian Ellenbogen, Sigal Peer, DovFeldberg, Benjamin Bartov. HumanReproduction Advance Access publishedFebruary 23, 2006

3. Blastocyst development after spermselection at high magnification isassociated with size and number of nuclearvacuoles. Pierre Vanderzwalmen, Antje

Hierner, Paul Rubner, Magnus Bach, AntonNeyer, Astrid Stecher, Petr Uher, MartinZintz, Bernard Lejeune, SabineVanderzwalmen, Guy Cassuto, Nicolas HZech. RBMOnline- Vol 17, Nº 5. 2008, 617-62


071: SUPER-ICSI: NUEVO TRATAMIENTO EN FACTOR MASCULINO

B. Migueles, M. Dorado, M. Hebles, M. González, L. Aguilera, P. Sánchez, F. Sánchez.Clínica Ginemed, Sevilla



INTRODUCCIÓN:

La implantación es sin duda uno de losprocesos más trascendentes en eldesarrollo, y en consecuencia, uno de losperiodos más estudiados en el ámbito dela reproducción. La activación de ErbB4define la capacidad implantatoria delembrión y es por tanto un factordeterminante en la sincronización delútero con el embrión. Aunque lacapacidad de ErbB4 para unirse a suligando EGF está sujeta al periodocompetente para la implantación delembrión, su expresión se remonta a losprimeros estadios de desarrollopreimplantacional, habiéndose podidocomprobar la presencia de dichosreceptores desde el segundo día dedesarrollo (2 células). No hay evidenciassin embargo de la manifestación deErbB4 antes de la primera división o enel proceso de fecundación.

El propósito de este estudio esdeterminar el patrón de expresión deErbB4 desde la fase de vesícula germinalhasta el momento de la implantaciónembrionaria. Así mismo, y mediante lautilización de técnicas de reproducción

asistida, se pretende comprobar siexisten o no diferencias en la expresiónde dichos receptores entre embrionesobtenidos por fecundación “in vitro” obien obtenidos directamente del utero.


La expresión de ErbB4 ha sidodeterminada por inmunofluorescencia apartir de oocitos y embriones de ratón dela cepa B6D2-F1 en diferentes estadios demaduración y desarrollo. Las hormonasutilizadas para estimular la producción deoocitos han sido: GonadotropinaCoriónica Equina (eCG) y GonadotropinaCoriónica Humana (hCG). La obtención devesículas germinales se procuró porovariectomía, 46h después de laestimulación con eCG y los oocitos en faseMetafase I a partir de la maduración invitro de dichas vesículas germinales 11hpost incubación. Por otra parte, losoocitos en metafase II fueron obtenidos apartir del ámpula del oviducto 14h tras laestimulación de la ovulación con hCG. Losembriones desde el estadio de pronúcleoshasta el estadio de blastocisto seobtuvieron por fecundación “in vitro”.

RESULTADOS:

En este trabajo se presentan por primeravez, evidencias de la expresión de ErbB4en diferentes estadios de desarrollo deloocito así como una serie completa de laexpresión de dicho receptor a partir deembriones obtenidos por fecundación “invitro” y hasta el estadio de blastocisto.

CONCLUSIONES:

Nuestros resultados confirman que laexpresión de ErbB4 es evidente en eloocito incluso antes de la fecundación.El significado de la presencia de estereceptor en etapas previas a lafecundación esta por determinar,aunque podría suponer un indicador delfuturo potencial implantatorioembrionario. Por otra parte, no parecehaber diferencias en la presencia deestos receptores entre embrionesobtenidos in vivo y los producidos porfecundación “in vitro”.

INTRODUCCIÓN:

Desde que se vienen aplicando lastécnicas de capacitación seminal en TRA,los efectos de las mismas han sido untema discutido por numerosos autores.Las más empleadas son los gradientes dedensidad y el Swim-Up. Un paso comúnen ambas técnicas es la centrifugación,en el Swim-Up además se concentrantodos los componentes del eyaculado.

Aunque en la bibliografía no hayconsenso sobre los efectos adversos dela centrifugación y concentración en elSwim Up, algunos autores indican queaumenta el estrés oxidativo provocandoun incremento de los ROS que afecta a laintegridad de la membrana, a lamovilidad y a la estructura del DNA delnúcleo espermático.

Para comprobar los efectos indirectos

del Swim-Up se ha realizado un estudiode los resultados obtenidos en los ciclosde ICSI de la Unidad de Reproducción deCentro Gutenberg (2006-2009),empleando como técnicas decapacitación seminal, el Swim-Upconvencional (con centrifugación) ySwim-Up directo (sin centrifugación).


072: EXPRESIÓN DEL RECEPTOR DE EGF (ERBB4) EN OOCITOS YEMBRIONES DE RATÓN.

M. J. Perianes, E. M. Miguel-Lasobras, E. Pozo-Guisado, F. J. Martín-Romero, I. Santiago Álvarez.Dpto. Anatomía, Biología Celular y Zoología. UEX, Badajoz

073: INFLUENCIA DE LA CENTRIFUGACIÓN DEL SEMEN EN LOSRESULTADOS DE LOS CICLOS DE ICSI

R. Garnica, M. Lara, C. Alonso, B. Buch, C. Segura, M. Martínez-Moya.Unidad de Reproducción Centro Gutenberg. Málaga

176



Estudio retrospectivo de 846 ciclos deICSI realizados durante los años 2006-2009 en mujeres menores de 38 años ysin factor masculino severo asociado (seconsidera factor masculino severocuando la concentración deespermatozoides en el eyaculado es <1x10 6esp/cc y/o los espermatozoidescon movilidad A+B < 100.000 esp/cc.).

El total de ciclos realizados se hadividido en dos grupos en función de latécnica empleada para la capacitacióndel semen. Grupo A: Swim-Up estándar(semen centrifugado) y Grupo B: Swim-Up directo (sin centrifugar). Dentro decada grupo se ha diferenciado entrenormozoospermias y factor masculinono severo.

Se han comparado las tasas defecundación, implantación, embarazo yaborto en ambos grupos; empleándoseel test de Chi cuadrado para el estudioestadístico de los datos obtenidos.

RESULTADOS:

Los resultados muestran una tasa defecundación y de embarazo superior enel grupo B (70.4% y 64.6%) respecto a

los del grupo A (67% y 50.4%). La tasade aborto del grupo B es inferior a la degrupo A (9.52 % versus 19.52%). Sinembargo no hay diferenciasestadísticamente significativas en latasa de implantación entre ambosgrupos (B: 36.8% versus A: 31.6%).

Cuando se comparan sólonormozoospermias o sólo factor masculinoen ambos grupos los resultados sonsimilares, aunque no se encuentran diferencias estadísticamentesignificativas en las tasas de aborto.

* Existen diferencias estadísticamente significativas

CONCLUSIONES:

Según los resultados que se presentan yteniendo en cuenta las posiblesinfluencias de otros factores noestudiados, se pueden observar mejoresresultados en los ciclos de ICSI en losque no se centrifuga la muestra de

semen para su capacitación.

Varios autores han estudiado los efectosque la centrifugación y concentraciónpueden tener sobre los espermatozoides.Entre los efectos adversos estudiadosaparece un aumento de ROS comoconsecuencia del estrés oxidativo queprovoca daños en el espermatozoide,pudiendo alterar la integridad del DNA.Aunque en este trabajo no se haprofundizado en el estudio de losespermatozoides y no se presentan datossobre esos factores, se ha utilizado como

referencia indirecta los resultados de losciclos de ICSI, puesto que una alteraciónen el espermatozoide puede dar lugar aun bajo rendimiento del ciclo.

A partir de los resultados obtenidos, sepuede concluir que cuando la calidad dela muestra lo permita, es aconsejablehacer Swim Up directo frente a Swim Upconvencional.

INTRODUCCIÓN:

Durante los últimos 20 años se haobservado una disminución de lafertilidad en países industrializadosdebido, al menos en parte, a unadisminución de la calidad seminal.Aunque las anomalías cromosómicas delos espermatozoides se relacionanprincipalmente con una disminución enel recuento de espermatozoides(oligozoospermia), algunas parejas con muestras normozoospérmicaspresentan bajos resultados en técnicasde reproducción asistida debido a lapresencia de aneuploidías en losespermatozoides. Estos dos factores

combinados sugieren que la elección dedonantes de semen basada únicamenteen los criterios estándar esinsuficiente. El principal objetivo deeste estudio fue evaluar la importanciadel análisis de espermatozoidesmediante FISH en el screening dedonantes de semen.


Se incluyeron un total de 22 candidatosa donantes en el Banco de SemenBiosperm SL (Instituto Marquès SLP,Barcelona) que cumplían con todos losrequisitos legales y de parámetros decalidad seminal. Las muestras de semen

se fijaron para realizar la técnica deFISH. Para su análisis se utilizaronsondas locus específicas (LSI) para loscromosomas 13 y 21 y sondascentroméricas (CEP) para loscromosomas 18, X e Y. La serie controlutilizada consta de 5 varones fértilesnormozoospérmicos con un cariotiponormal. Un total de 101.855 núcleos deespermatozoides fueron evaluados. Elanálisis estadístico utilizado fue el testChi –Cuadrado. Las diferencias en lasaneuploidías espermáticas entre elgrupo control y el grupo de donantes seconsideraron significativas cuando elvalor de p <0.05.


074: IMPORTANCIA DEL ANALISIS DE ESPERMATOZOIDES MEDIANTEFISH EN EL SCREENING DE DONANTES: RESULTADOS PRELIMINARES

A. Colomar1, 3, S. Fernández1, 3, E. Toro1, 3, M. Elbaile1, 4, M. López-Teijón1, 2, E. Velilla1, 31Institut Marquès, Barcelona; 2 Fundación Leonardo Marquès, Barcelona; 3 Centro de Medicina Embrionaria, Barcelona, Madrid; 4 Biosperm, Sabadell



RESULTADOS:

El 4,5% de los donantes que cumplían contodos los requisitos presentaronaneuploidías en espermatozoideseyaculados (1 de 22 donantes testados).Se observó un aumento estadísticamentesignificativo de espermatozoidesdiploides en la muestra de este donante(p<0,05).

CONCLUSIONES:

Los donantes de semen aceptados en unbanco de semen proporcionan unelevado número de muestras de semendurante su período de donación. Losresultados de este estudio indican queun 4,5% de los donantes pudieranpresentar aneuploidías en losespermatozoides que posteriormenteserán utilizados en tratamientos de

reproducción asistida, pudiendocomprometer los resultados obtenidos.Por consiguiente, el estudio deaneuploidías en los bancos de semenmediante FISH debería incluirse en laselección de donantes para optimizarlos resultados en técnicas dereproducción asistida. Para confirmarestos resultados preliminares esnecesario ampliar el número de casos.

INTRODUCCIÓN:

Existe cierta controversia acerca de laposible relación entre la presencia deaneuploidías espermáticas y la edadpaterna. Mientras que en algunosestudios se encuentra una correlaciónentre edad y aneuploidías espermáticas(Bosch et al., 2001), en otros no seencuentra tal relación (Wyrobek et al.,2006; Martin et al., 1995; Luetjens etal., 2002). Publicaciones recientessugieren que las aneuploidías en losespermatozoides pueden estarpredeterminadas desde el desarrollofetal por exposición a disruptoresendocrinos (Skakkebaek et al., 2005) yque, por lo tanto, la tasa de aneuploidíasen espermatozoides no deberíaaumentar con la edad. El objetivo deeste estudio fue el de determinar larelación entre la tasa de aneuploidías enespermatozoides y la edad paterna.


Se incluyeron un total de 828 muestras desemen procedentes de varones con uncariotipo normal que se encontrabandentro de un programa de reproducciónasistida. Se establecieron 3 grupos enfunción de la edad: 25-35 años, 36-45años y ≥46 años. Las muestras de semense fijaron para su análisis mediante latécnica de FISH. Se utilizaron sondaslocus-especificas (LSI) para loscromosomas 13 y 21 y sondascentroméricas (CEP) para los cromosomas18, X e Y. Se analizaron un mínimo de1000 espermatozoides por ronda dehibridación. El análisis estadístico serealizó mediante el test Chi Cuadrado y el Test de comparación de proporciones, considerando lasdiferencias significativas cuando p<0.05

RESULTADOS:

El 69,4% de las muestras analizadaspresentaron un resultado de FISHnormal en espermatozoides (575/828).El porcentaje de varones con FISHalterado fue del 11,1% en el grupo deedades entre 25-35 años, 16,3% en el de36-45 años y del 3,1% en el grupo ≥46años. No se encontraron diferenciasestadísticamente significativas entre losdiferentes grupos.

CONCLUSIONES:

Los resultados de este estudio indicanque la tasa de aneuploidías enespermatozoides no aumenta con laedad. Con el fin de confirmar estosresultados es recomendable realizar unaserie con un mayor número de casos.

INTRODUCCIÓN:

Son numerosos los artículos quedestacan la importancia de la división

temprana (DT) como indicador deimplantación embrionaria y embarazo.Algunos autores atribuyen las primerasdivisiones mitóticas del embrión a la

activación de factores maternos en elovocito. Nosotros nos hemos propuestoestudiar si existe relación entre ladivisión temprana y la edad de la

178

075: LA TASA DE ANEUPLOIDIAS EN ESPERMATOZOIDES NOAUMENTA CON LA EDAD PATERNAA. Colomar3, S. Corral1, M. Oter1, S. Fernández3, E. Toro3, C. Cañadas2, V. Badajoz2, V. Verdú2, M. López-Teijón3, E. Velilla1

1Centro de Medicina Embrionaria, Barcelona, Madrid; 2 GINEFIV-Clínica Belén, Madrid; 3 Fundación Leonardo Marquès, Barcelona

076: ESTUDIO DEL PAPEL DE LA DIVISIÓN TEMPRANA Y SU RELACIÓNCON LA EDAD DE LA PACIENTE Y LA ESTIMULACIÓN OVÁRICA A. Ortiz, F. Monllor, I. M. Baena, G. Lozano, M. I. Jiménez.Centro Extremeño De Reproducción Humana Asistida (CERHA). Hospital Materno Infantil. Badajoz



paciente. También nos hemos planteadola posibilidad de que la divisióntemprana pueda estar influida por eltipo de hormonas empleado en laestimulación ovárica.


De los ciclos FIV-ICSI realizados entrenoviembre de 2008 y abril del 2009 seseleccionaron aquellos en los que secomprobó la aparición o no de divisióntemprana entre las 25-27 horas trasinseminación. En total fueron 165pacientes, con edades comprendidasentre 26 y 42 años, de las cuales 120fueron estimuladas mediante protocolocon antagonistas de la GnRH, y 45mediante protocolo con agonistas.

El análisis estadístico se realizóutilizando el programa SPSS 15.0 paraWindows. Se buscó relación entrepresencia o no de división temprana y eltratamiento previo de estimulación, asícomo con la edad de la paciente.

RESULTADOS:

No encontramos diferenciasestadísticamente significativas entre lapresencia o no de división temprana y laedad de la paciente. Tampocoencontramos diferencias entre el grupode pacientes estimuladas con agonistasy el grupo de pacientes estimuladas conantagonistas.

Estudiando la tasa de gestación en estaspacientes vemos que hay mayor númerode embarazos en aquellas que presentandivisión temprana (57,8%) con respectoa las que no (42,2%) (p = 0,021).

CONCLUSIONES:

Verificamos que la aparición de divisióna las 25-27h post-inseminación esmarcador de buen pronóstico, por lo quepuede servir de herramienta para elegirembriones a transferir de la mismacategoría.. No parece que la edad de lapaciente influya en la activación de losmecanismos que desencadenan lasprimeras divisiones mitóticas en elembrión. El tratamiento hormonalempleado en la estimulación ovárica noafecta a la presencia o no de divisióntemprana.

INTRODUCCIÓN:

Tras un periodo de prueba en nuestrolaboratorio, en el que se utilizanmuestras de donante capacitadas ycongeladas para inseminación, sepretende valorar su efectividad frente alas muestras congeladas según elmétodo tradicional.


Se realiza estudio retrospectivo desde elaño 2008 hasta abril del 2009. Seestudian un total de 258 ciclos deinseminación con donante, de los cuales:

- Grupo I: n=215 (83.3%) ciclosrealizados con muestra congelada trassu recogida en fresco y capacitada trasdescongelación, y

- Grupo II: n=43 ciclos (16.7%) ciclosrealizados con muestra capacitada trassu recogida en fresco y congeladaposteriormente. El medio utilizado eneste último grupo fue SpermCryoprotectII (Nidacon ®).

Se han tenido en cuenta los siguientesparámetros para realizar el estudio: edad de la paciente, nº embarazos y nº embarazosevolutivos. Se controlaron tambiénvariables como el tipo de medicación y elresultado de espermatozoides A+B en elpost-capacitado.

Se realiza estudio estadístico medianteprograma PASW Statistics 17.0.

RESULTADOS:

Se compara el porcentaje de embarazo

evolutivo en cada grupo (Grupo I: 12.1%vs. Grupo II: 17.2%), siendo mayor elporcentaje en el grupo de muestrascapacitadas antes de la congelación.

No se observaron diferenciasestadísticamente significativas entregrupos en cuanto a la edad de laspacientes.

CONCLUSIONES:

Aunque se trata de un estudio preliminar,la opción de congelar las muestrascapacitadas parece ser efectiva teniendoen cuenta los resultados. Además se logramejorar de forma importante la gestióndel banco de esperma, ya que se reduce elvolumen de pajuelas a congelar y sefacilita la preparación de las muestras enel día de la inseminación.


077: ¿ES VIABLE LA CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA ANTES DE LACONGELACIÓN EN DONANTES DE SEMEN?G. López, R. Lafuente, J. Canals, D. Rey, M. Brassesco.CIRH Clínica Corachan, Barcelona



INTRODUCCIÓN:

Durante el embarazo, feto y placentasintetizan distintas proteínas yesteroides (Proteína PlasmáticaAsociada al Embarazo - PAPP-A;Gonadotropina Coriónica Humana -HCG; Alfa Fetoproteina - AFP, InhibinaA, Estriol Libre…) que se han utilizadopara monitorizar distintos aspectos dela gestación. En el Área Hospitalaria deValme (Sevilla), está implantado desdeel año 2005 un Programa de CribadoPrenatal de Aneuploidias. Esteprograma se basa en la realización de un Cribado Combinado de PrimerTrimestre (determinamos lasconcentraciones de PAPP-A, Beta-HCGlibre y medimos Translucencia Nucal -TN). A partir de la base de datos quehemos configurado estos años noshemos planteado ver la relación entreestos parámetros y otros que tenemosrecogidos (semana de gestación, edadmaterna…) y el riesgo de aborto.


- Se han estudiado entre enero 2005 ydiciembre 2007 un total de 12918embarazadas que se encontraban elprimer trimestre de gestación.

- De cada gestante se han recogido:edad y edad gestacional en le momentode la muestra; medidas de PAPP-A, BetaHCG libre y TN; medidas expresadascomo múltiplos de mediana (MoM) parala semana de gestación de estosmismos parámetros; si se ha producido aborto no voluntario o si la gestación ha llegado a termino. -Las determinaciones bioquímicas serealizaron en un analizador Inmulite2000 (Siemens) que utiliza un ensayoinmunométrico quimioluminiscente enfase sólida. La medición de la TN serealizo en ecógrafos de alta resolucióny por ecografistas autorizados (segúnnormas de Fetal Test Fundation).

- Para el cálculo de los MoM se utilizo elsoftware Prisca V 4.0 (Siemens).

-Análisis estadístico: las variables seresumieron con medias y desviacionestípicas o si las distribuciones eranasimétricas con medianas y percentiles.Para relacionar la variable dependienteaborto (si/no) con las variablespredictoras se genero un modelo deRegresión Logística Binaria quepermitió el cálculo de las odds ratio y desus respectivos intervalos de confianzaal 95%.

RESULTADOS:

De los 12918 embarazos controlados657 (5,1%) terminaron en abortoespontáneo y 12261 (94.9%) llegaron atermino.

Las variables cuantitativas seresumieron al seguir distribucionesasimétricas por medianas y percentiles(P25 y P75).

Se estableció que sólo la edad maternay los MoM corregidos de PAPP-A seasociaban con la variable dependienteaborto (en ambos casos con unaP<0,0005).

PAPP-A: Odds Ratio 1.1 con un intervalode confianza al 95% de 1.03-1.17

Edad Materna: Odds Ratio 1.07 con unintervalo de confianza la 95% de 1.05-1.08

CONCLUSIONES:

- Tal como se describe en la bibliografía,los valores de beta HCG libre no serelacionan caso con un mayor riesgo deaborto.

- Por el contrario los niveles de PAPP-Asi están asociados junto a la edadmaterna con un mayor riesgo de

perdida gestacional. Esta asociación seda únicamente cuando consideramoslos MoM corregidos y no laconcentración como tal de la PAPP-A.Tal como refleja la bibliografía unosniveles bajos de PAPP-A condicionanpor la actividad proteasa de de estasobre el complejo IGF- BP unos bajosniveles de los factores de crecimientoIGF-I e IGF-II que podrían condicionarentre otros efectos adversos un mayorriesgo de aborto.

- Observamos que menor edadgestacional en el momento del cribadose asociaba a mayor riesgo de aborto.Probablemente es un sesgo del estudioya que no por hacerse lasdeterminaciones en un semana másinicial hay más riesgo de aborto. Comoes sabido en esas primeras semanas seproduce un mayor número de abortosespontáneos por lo que aquellasmujeres que se estudian mástardíamente dentro de este primertrimestre tienen menor probabilidad deabortar.

078: UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DE PAPP-A DURANTE ELPRIMER TRIMESTRE DE EMBARAZO COMO FACTOR DE RIESGORELACIONADO CON EL ABORTO

I. Peral Camacho, R. Ruiz Macias, M. M. Viloria Peñas, A. Moro Ortiz.Servicio de Bioquímica Clínica. Hospital Universitario de Valme. Sevilla

180



INTRODUCCIÓN:

El Síndrome de ovario poliquístico(SOPQ), es el trastorno endocrino-reproductor más frecuente en mujeresen edad fértil. Su prevalencia se cifraentre un 5-10%. Alrededor de un 60% deestas mujeres tienen problemas deesterilidad de origen anovulatorio.

SOPQ se asocia a una alta recuperaciónde ovocitos, calidad ovocitaría pobre,baja tasa de fecundación y un riesgoincrementado de abortos.


Estudio descriptivo retrospectivorealizado en el Centro Ginecológico deLeón durante los años 1999 y 2007.

En el grupo de estudio se incluyen 23pacientes con SOPQ (Criterios analíticos,ecográficos y clínicos) a las que serealizaron 30 ciclos.

El grupo control esta constituido por 30pacientes con diagnóstico de Factormasculino.

El análisis estadístico se realiza con elprograma SPSS 12.

RESULTADOS: MORFOLOGÍA OVOCITARIA yEMBRIONARÍA

La tasa de fecundación, desarrollo y tasade embarazo fue similar en pacientesSOPQ y en pacientes normovuladoras,independientemente de la causa deinfertilidad.

Morfológicamente el grado de todos losovocitos maduros fue:

.144 ovocitos eran normales (54.5%)

.87 ovocitos presentaron una anomalía(33%)

. 33 ovocitos presentaron más de unaanomalía (12.5%)

No existen diferencias en cuanto a losdos grupos de pacientes.

La tasa de inmaduros es mayor enpacientes con SOPQ.

La tasa de fecundación es menor enestos pacientes.

TASAS DE FECUNDACIÓN, EMBARAZO,ABORTO...

. SOPQ precisaron menos medicación yla media de ovocitos recuperados fuemayor .

. La tasa de MII, de vesículas germinalesy de fecundación fue similar en los dosgrupos.(PCOS muestra un nº mayor de ovocitosfecundados, pero esto se debe a que larecuperación también es mayor).

. La tasa de embarazo y de embarazomúltiple fue similar en ambos grupos.

. La tasa de aborto fue más baja en elgrupo control

FIV FRENTE A ICSI EN SOPQ:

La tasa de fecundación fue menor en losCOC inseminados por FIV que en losmicroinyectados (Fallo de Fiv del 15%).

ASPECTOS GENÉTICOBaja calidad ovocitaría y embrionaria hasido estadísticamente relacionada conaltas tasas de aneuploidia.

Estudio genético de los ovocitos:

La tasa de fecundación fue más baja enpacientes con SOPQ a pesar de que latasa de recuperación fue mayor. Losanálisis citiogenéticos se realizaron enlos ovocitos no fecundados y normalesmorfológicamente. Se analizaron 74óvulos de pacientes con SOPQ y 73 depacientes control, y no se encontrarondiferencias significativas

Estudio genético de los embriones:

Se analizaron los embriones porhibridación in situ para los cromosomasX, Y,13, 15, 16, 17, 18, 21 y 22.

Las pacientes con SOPQ necesitaronmenos dosis de medicación, yprodujeron un mayor número deovocitos. El análisis genético de losembriones reveló que en pacientes conPCOS el % de embriones euploides essimilar al del grupo control, aunque elnúmero absoluto de embrioneseuploides y aneuploides fuesignificativamente mayor en pacientescon SOPQ.

Al hacer el estudio por edades, laspacientes con SOPQ < 38 años,mostraron una tasa de embrioneseuploides similar a la de pacientescontrol. En pacientes ≥ 38 si se observóun mayor número de embrioneseuploides que en el grupo control

CONCLUSIONES:

1- La tasa de recuperación de ovocitos esmayor en estas pacientes, pero la tasa deinmaduros también es mayor. Estoexplicaría porque la tasa de fecundaciónpor FIV es menor que en el grupocontrol; pero al realizar ICSI la tasa defecundación es similar.

2- En cuanto a la calidad de los ovocitosy embriones no hay diferenciassignificativas.

3- La tasa de embarazo por embrióntransferido o por paciente es similar enambos grupos, pero la tasa de aborto sies mayor en estas pacientes. Así mismola tasa de implantación también esmenor, ya que el nº de embrionestransferidos en estas pacientes esmayor.

4- Pacientes SOPQ con altas respuestasa las gonadotropinas producen másembriones aneuploides y euploides. Estopodría ser la causa de la alta incidenciade abortos espontáneos asociados a estapatología, más que el grado de

079: CALIDAD OVOCITARIA Y EMBRIONARIA EN PACIENTES CON SOPQ

E. Suárez, F. Garrido, A. Luengos, C. Fernández Fernández, B. Suárez Álvarez. Centro Ginecológico de León




inmadurez del ovocito.

Los altos niveles de LH parecen afectar ala fecundación y al grado de madurez de

los ovocitos.

La presencia de Hiperandrogenemia(incremento en la expresión de los

receptores de andrógenos) en las célulasepiteliales endometriales parece estarasociado a fallos de implantación y aabortos espontáneos.

INTRODUCCIÓN:

Se han analizado los resultados de IVIMadrid en ciclos de ICSI con muestras desemen “patológicas” en fresco ydescongeladas en las que solo se pudorealizar un lavado, y las comparamos conlos datos de ciclos de biopsia de testículoen fresco y descongelada de los años2007 y 2008. Además analizamos elempleo de pentoxifilina (ptx) en estetipo de muestras.


Se incluyeron 187 casos de biopsia detestículo (33 en fresco y 154congeladas)y 221 casos de muestras de semen demuy baja calidad (188 en fresco y 33congeladas) que recibieron tratamientoentre 2007 y 2008 en nuestra clínica.Ambos tipos de muestras se lavaron conHTF, centrifugando 5min a 2000rpm, yresuspendiéndolas en poco volumen(0.2-0.3ml aproximadamente) de HTF.En ningún caso se incluyeron muestrasde semen destinados a ciclos deovodonación. El análisis estadístico serealizó empleando el test chi-square.

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

Según los resultados obtenidos,podemos concluir que los mejoresresultados se obtienen en los casos enlos que el ciclo se realiza con muestra debiopsia de testículo en fresco, suposterior congelación merma losresultados en 10 puntos, tanto en tasade gestación clínica como deimplantación. Los cual se repite en el

caso de muestras de semen de bajacalidad aunque no de una manera tanacusada. En función del número deespermatozoides, destacan los pobresresultados en los casos en los que secongelaron muestras con menos de200.000 esp/ml, lo que nos haceplantearnos no congelar este tipo demuestras, salvo en casos excepcionales,y recurrir a muestras en fresco parafuturos ciclos. Además en el caso demuestras solo lavadas, existe unacorrelación casi significativa (p=0.07) sila muestra presenta más de 200.000esp/ml con altas tasas de gestación eimplantación, respecto a muestras conmenos de 200.000 esp/ml.

El empleo de pentoxifilina en casos debiopsia en fresco está asociado a biopsiasde mala calidad, por lo que los resultadosson menores que en los casos en los queno necesitamos emplearla, siendo

recomendable su uso en las biopsiascongeladas, ya que nos permite elegirespermatozoides de mejor calidad.

Existe una correlación estadísticamentesignificativa cuando comparamos losresultados de muestras de semen sololavadas con y sin ptx (p=0.01), de talmanera que cuando en este tipo demuestras necesitamos usar ptx notenemos gestaciones, recomendándosebiopsia de testículo en fresco paraasegurar mejores resultados.

182

080: ESTUDIO COMPARATIVO DE SÉMENES PATOLÓGICOS FRENTEA BIOPSIAS DE TESTÍCULO.

E. Huguet, M. Testillano, D. Becerra, M. Alonso, C. López, Y. Mínguez, C. Bou, D. Agudo.IVI Madrid



INTRODUCCIÓN:

Las pacientes de edad materna avanzadaconstituyen un grupo de pacientes conuna tasa de éxito muy limitada entécnicas de reproducción asistida (TRA).Generalmente en este tipo de pacientesla respuesta a la estimulación ovárica espobre, por lo que no se recupera un grannúmero de ovocitos tras la punciónovárica. Por otra parte, cuando seaplican técnicas de Diagnóstico GenéticoPreimplantacional (DGP) es muyrecomendable disponer del máximonúmero de embriones para biopsiar conel fin de tener más embriones normalesgenéticamente y poder seleccionarembriones en función de su morfologíaen el mismo ciclo. Por lo tanto parecelógico pensar que mediante laacumulación de ovocitos tras variosciclos de TRA obtendremos una mejoraen los resultados, ya que dispondremosde más embriones con los que trabajar.La pregunta que nos hacemos es si estaestrategia es más efectiva o no querealizar varios ciclos independientes conDGP.


Se han incluido en este estudio 48pacientes, en el período de tiempo

comprendido entre enero de 2008 y marzode 2009, del programa de DGP por edadmaterna avanzada que acumularonovocitos mediante vitrificación y queposteriormente desvitrificaron yrealizaron DGP. Como grupo control seemplearon 17 pacientes que obtuvieron 5o menos ovocitos en punción, y realizaronmás de un ciclo durante este período detiempo, es decir, al menos realizaron dosciclos de DGP sin ningún tipo deacumulación. Las medias se estudiaronmediante una Anova de un factor y las

tasas fueron analizadas mediante una T deStudent, con el programa SPSS.

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

Aunque no se encuentran diferenciassignificativas en ningún parámetro, existeuna clara tendencia al aumento de lastasas de gestación e implantacióndespués de acumular ovocitos. Se ha deincrementar el tamaño muestral de estosgrupos con el fin de aclarar si estastendencias finalmente se confirman o porel contrario las diferencias se diluyen.

INTRODUCCIÓN:

En nuestro laboratorio seguimosrealizando la FIV convencional siempreque el caso lo permita, pero no comotécnica única de inseminación (50%ICSIy 50%FIV). Realizar las dos técnicas nosasegura la fecundación en los casos enque pudiera producirse un fallo de FIV ouna fecundación anómala.

El objetivo de este estudio es observar siexisten diferencias en la calidad

embrionaria (según criterios ASEBIR)entre los embriones procedentes de ICSIy los de FIV convencional, tanto en día2 como en día 3 para ver si la técnica defecundación influye en la calidad dedichos embriones.


En este estudio retrospectivo a partir deun total de 1.753 zigotos. De los 1322embriones procedentes de ICSI, 690siguieron en cultivo hasta día 3 y de los

431 embriones inseminados con FIVconvencional 176 continuaron hasta día 3.

La inseminación o la ICSI se realizaronentre las 5-7 horas desde larecuperación ovocitaria. La fecundaciónse valoró a las 16-20 horas, la calidadembrionaria en día 2 a las 44 horas, y endía 3 a las 67 horas post inseminación.

En la FIV convencional se utilizan placasde 4 pocillos (Nunc embriotestadas) enmedio IVF (Medicult) a una

081: ACUMULACIÓN DE OVOCITOS EN PACIENTES DE EDADMATERNA AVANZADA

F. Bronet, L. Herrero, R. Herrer, E. Martínez, M. Ariza, M. Gaytán, A. Liñán, C. Losada, S. Pareja.IVI Madrid

082: ¿EXISTE MEJOR CALIDAD EMBRIONARIA CON FIVCONVENCIONAL?X. Blanch, M. Brossa, A. Yus, M. Antich.FERTILAB. Institut Català de Fertilitat, Barcelona




concentración de 300.000espermatozoides GIII /ml (máximo 6oocitos/pocillo). En Fertilab desde hacemas de 10 años no realizamosincubación overnight sino que retiramoslos óvulos a las 3 y 5 horas postinseminación, lavamos en un pocillo conmedio limpio abundante y pasamos losoocitos a microgotas de medio de cultivo(G1 serie 5, Vitrolife) observándose unatasa similar a la de ICSI.

RESULTADOS:

Los resultados nos muestran una altaproporción de embriones óptimos (A+B)en día 2, tanto en ICSI (61%) como enFIV (64%) Fig. 1. En día 3 disminuye elporcentaje de embriones óptimos conrespecto día 2, observándose mayorproporción de embriones óptimos (A+B)en FIV convencional (Fig. 2). (43% vs.51%) La disminución de embrionesóptimos en día 3 respecto día 2,corresponde mayoritariamente aembriones que no han seguido el ritmode división adecuado.

CONCLUSIONES:

En día 2 no parece existir diferencias en lacalidad de los embriones obtenidos entreambas técnicas (FIV e ICSI). En cambio endía 3 parece evidenciarse una tendencia aobtener mayor porcentaje de embrionesóptimos con FIV convencional. Este hechonos hace plantearnos si deberíamosmodificar la proporción de oocitosinseminados a favor de la fecundaciónmás fisiológica es decir la FIV clásica,siempre y cuando la calidad seminal y elnúmero de óvulos lo permitan.

Así mismo corroboramos la prácticahabitual de aconsejar a nuestrosginecólogos el cultivo embrionariohasta día 3, sobre todo cuandodispongamos de embriones suficientespara realizar una mejor selecciónembrionaria en el momento de latransferencia.

Los gráficos nos muestran el porcentajecalidad embrionaria ASEBIR en cada una delas técnicas, tanto en día 2 como en día 3.

INTRODUCCIÓN:

Las pacientes con Baja Respuestaovárica se caracterizan por tener unosniveles de FSH basal elevados. A su vez,estos niveles de FSH son consecuenciade un envejecimiento ovárico que puedeafectar a la calidad ovocitaria y, portanto, a un deterioro de sus estructuras,entre ellas la zona pelúcida.

Para que se dé el proceso deimplantación, el blastocisto debeeclosionar al llegar al útero y que seproduzca la unión entre las células deltrofoblasto y las células del endometrio.Si la zona pelúcida del ovocito seencuentra afectada, es posible que latasa de gestación de este tipo depacientes disminuya debido a laimposibilidad de eclosionar delblastocisto.

Cohen y cols (*) demostraron que este tipode pacientes se veían beneficiadas por larealización de un orificio en la zona pelúcidade los embriones (Assisted Hatching) previaa la transferencia de los mismos.

MATERIAL Y METODOS:

Estudio transversal retrospectivoaleatorizado y unicéntrico, donde seseleccionan al azar 40 pacientes con FSHbasal mayor de 10 que se hayan realizadoun ciclo de Fecundación in Vitro (FIVconvencional, ICSI o técnica MIXTA) conovocitos propios en el periodocomprendido entre enero de 2006 y

diciembre de 2007. La media de edad delas pacientes es de 35,7 ± 3,7 años.

Hatching asistido de tipo Químico,mediante el uso de una solución de ácidoTyrode en Dia+3 post inseminación, 30minutos antes de la transferencia.

GRUPO A: CON HATCHING: 18 pacientes.

GRUPO B: SIN HATCHING: 22 pacientes

Se comparan las tasas de gestación,implantación y aborto en ambos grupos.

RESULTADOS:

184

083: EL HATCHING ASISTIDO BENEFICIA A LAS PACIENTES CONBAJA RESPUESTAS. Camacho, V. Badajoz, M. C. Cañadas, M. De La Casa, A. R. Díaz, J. Gragera, I. Lozano, L. Martínez, C. Urda, J. Gijón, M. Alcaraz, R. Bonache, J.Rodríguez, C. Pérez, A. Martínez de ArenazaGINEFIV, Madrid



CONCLUSIONES:

La realización de la técnica de HatchingAsistido previa a la transferencia enpacientes con FSH basal elevadaaumenta su tasa de gestación eimplantación respecto a las pacientes a

las que no se les realiza.

Por tanto, los niveles de FSH, sonimportantes a la hora de valorar larealización de Hatching Asistido demanera rutinaria en el laboratorio de FIV.

BIBLIOGRAFIA:

(*) Cohen J, Alikani M, Trowbridge J et al.Implantation enhancement by selectiveassisted hatching using zona drilling ofhuman embryos with poor prognosis. HumReprod. 1992 May; 7(5):685-91.

INTRODUCCIÓN:

En el Laboratorio de DGP Molecular lasestrategias de trabajo deben cumplir lascondiciones de:

Rapidez: la transferencia embrionariadebe realizarse entre los días +4 y +5.

Sensibilidad: el diagnóstico se realiza apartir de una única célula embrionaria

Robustez: para diagnosticar el mayornúmero posible de embriones

Fiabilidad: La tasa de error dediagnóstico debe ser lo más baja posible

Se pueden distinguir dos tipos deaproximaciones en el DGP molecular: losestudios directos y los indirectos.


En ambos tipos de estudios se utiliza laPCR heminested fluorescente. En losmétodos directos se amplifica la región aestudiar y dos marcadores microsatélite(STRs) informativos en la pareja, uno a

cada lado del gen como apoyo aldiagnóstico. La detección de la mutaciónse realiza por análisis de fragmentos ominisecuenciación dependiendo del tipode mutación. En el caso de estudiosindirectos se amplifican cuatro STRsinformativos en la familia, dos a cada ladodel gen al que está ligado la enfermedad.

RESULTADOS:

En nuestro laboratorio utilizamos losmétodos directos siempre que el caso lopermite y utilizamos únicamente losestudios indirectos cuando los directos noson factibles como en los siguientes casos:

Grandes deleciones/inserciones

Regiones ricas en G/C refractarias a laamplificación

Presencia de pseudogenes con unasimilitud elevada al gen a estudiar

Cuando se conoce el gen causante de laenfermedad pero no la mutación concreta

Tipaje HLA

En estudios de exclusión

Presentamos casos clínicos de nuestrolaboratorio como ejemplo de cadaestrategia.

CONCLUSIONES:

Para la realización del DGP molecular esimprescindible que la pareja tenga undiagnóstico genético de la enfermedad.

Las ventajas de la utilización de los métodosdirectos respecto a los indirectos son:

Menor tasa de error de diagnóstico quees <1% si se utilizan dos STRs de apoyo

No son necesarios 4 STRs informativos

El estudio de informatividad se puederealizar con menos familiares disponibles

La única desventaja de los métodosdirectos es que cada pareja requiere unapuesta a punto en el laboratorio específicapara su caso.

INTRODUCCIÓN:

Debido a la severidad y la alta prevalenciaen la población general de determinadasalteraciones genéticas como la fibrosis

quística (FQ) y el síndrome de X-frágil sedecidió realizar estas pruebas a lascandidatas del programa de donación deovocitos de nuestro centro. El objetivo fueestablecer la incidencia de portadoras de

estas y otras alteraciones genéticas en lapoblación de donantes para determinar siestá justificada la incorporación dedichas determinaciones en el cribadorutinario al que se someten las donantes.


084: DGP MOLECULAR DIRECTO VERSUS DGP MOLECULAR INDIRECTO:APLICACIONES, VENTAJAS, INCONVENIENTES Y CASOS CLÍNICOS

T. M. Alberola1, X. Vendrell1, R. Bautista-Llácer1, M. Pardo1, M. Pérez-Alonso2.1Unidad de Genética Reproductiva, Sistemas Genómicos S.L. Valência.2Dirección Científica, Sistemas Genómicos S.L., València.

085: INCIDENCIA DE ALTERACIONES GENÉTICAS EN DONANTES DE OVOCITOS.R. Morales1, B. Lledó1, J. A. Ortiz1, J. Quintana2, R. Bernabeu2

1Instituto Bernabeu Biotech, Alicante; 2Instituto Bernabeu, Alicante



El síndrome de X-frágil es una de lascausas genéticas de retraso mentalhereditario más frecuente y la segundacon base genética después del Síndromede Down. Se trata de una enfermedaddominante ligada al cromosoma X. Lacausa es una expansión en la región 5’UTR del gen FMR1. Existen 4 alelos: laexpansión completa (<200 repeticiones)con manifestaciones clínicas, las formaspermutadas (50 – 200 repeticiones) eintermedias (45-50 repeticiones) y lasformas normales (<45 repeticiones). Laspacientes portadoras de las formaspermutadas e intermedias tienen unriesgo de transmitir la expansióncompleta a la siguiente generacióndando lugar a retraso mental.

La fibrosis quística es una enfermedadhereditaria recesiva que afecta a lospulmones y el páncreas. Es el desordengenético más común en la poblacióncaucasiana con una incidencia de 1 en2.500 y portadores 1 de 25. Debido a laalta incidencia de portadores existe unriesgo elevado de que la descendenciapresente una combinación de diferentesmutaciones y variantes del gen CFTR, locual podría dar lugar a un fenotipo deFibrosis Quística.

Además, mediante la realización de uncariotipo podemos detectar anomalíascromosómicas numéricas y estructurales,

y también la presencia de polimorfismosque a pesar de que se consideranvariantes sin consecuencias fenotípicasaparentes, en algunos casos se asocian aun mayor riesgo de infertilidad, abortosde repetición y anomalías congénitas enla descendencia.


Se han analizado los resultados de X-frágil, FQ y cariotipo de 300 mujerescandidatas para ser incluidas en elprograma de donación del InstitutoBernabeu desde enero a mayo del 2009.A partir de linfocitos de sangreperiférica se extrajo el ADN que fueempleado para la amplificación ydetección de mutaciones en el gen CFTRutilizando el kit comercial CF V.3(Abbott). Asimismo se realizó laamplificación de las repeticiones CGG dela región 5´UTR del gen FRMR1 (X-frágil)mediante el kit de Abbott. El cariotipo serealizó a partir de un cultivo delinfocitos siguiendo las técnicas clásicasde citogenética.

RESULTADOS:

De las donantes rechazadas porpresentar alguna de estas alteraciones,3 resultaron ser portadoras demutaciones en el gen CFTR responsablede causar FQ (2 para la F508 y una para

G542X). En cuanto al polimorfismolocalizado en el intrón 8, nuevedonantes fueron portadoras de lavariante 5T.

Respecto al síndrome de X-frágil, 3donantes resultaron portadoras delalelo permutado del Síndrome X-frágil y4 portadoras de la forma intermedia.

Se rechazaron tres donantes porpresentar alteraciones en el cariotipo.Dos de ellas eran 46,XX,+mar y otrapresentaba el polimorfismo 46,XX,inv(9)(p12q13) que se asocia ainfertilidad, abortos de repetición yanomalías en la descendencia. Ademástambién se encontraron 2 donantes conun incremento en la heterocromatinacentromérica del cromosoma 1, lascuales no se descartaron porque noexiste en la bibliografía una asociaciónclara entre dicho polimorfismo einfertilidad.

CONCLUSIONES:

Debido a la elevada prevalencia de estasalteraciones en las candidatas alprograma de ovodonación serecomienda el cribado de las mismascomo parte del estudio realizado endonantes de gametos previamente a suinclusión en el programa.

INTRODUCCIÓN:

En la actualidad existe escasainformación disponible sobre cómo poderpredecir la madurez ovocitaria antes de ladecumulación. La predicción de lamadurez ovocitaria es de granimportancia a la hora de seleccionar losovocitos para la FIV convencional. En esteestudio se describe un nuevo sistema descoring para predecir la madurezovocitaria antes de la decumulación.


Un total de 452 ovocitos fueronevaluados en parejas sometidas a ciclosde in vitro en nuestro centro. De estos452, 127 se obtuvieron de la paciente y325 eran de donantes de óvulos. Tras lamaduración ovocitaria in vitro y antes dela decumulación, un sistema de scoringfue aplicado para predecir la madurezovocitaria, basado en los siguientescriterios por orden de importancia: (i)

se observa una doble línea de 1-1.5 mm,entre la membrana del ovocito y lacorona; (ii) el citoplasma del ovocito hade ser claro y visible sin tener queexpandir las células del cúmulo; (iii)células del cúmulo expandidas (de 5 a 10veces el diámetro del ovocito); (iv) lacorona ha de ser fácilmente disociabledel ovocito; (v) ausencia de inclusionesoscuras en las células del cúmulo.Después de la predicción del grado demadurez ovocitario (vesícula germinal,

186

086: ALTO VALOR PREDICTIVO DE UN NUEVO SISTEMA DE SCORING PARALA VALORACION DE LA MADUREZ OVOCITARIA PREDECUMULACIONA. Rabanal, C. Castelló, A. Busquets, A. Farreras, C. Puche, J. Cooper, J. M. Capdevila, M. López-Teijón, J. G. Álvarez. Institut Marquès, Barcelona.



metafase I, metafase II) aplicando estoscriterios, los ovocitos fueron denudadosy el grado real de madurez obtenido.

RESULTADOS:

De los 452 ovocitos evaluados, 401 fueronpredecidos como maduros y 51 comoinmaduros. De los 401 predecidos comomaduros, 400 fueron confirmados comomaduros después de la decumulación(99,7% valor predictivo positivo). De los51 predecidos como inmaduros, 46 fueronconfirmados como inmaduros después de

la decumulación (90% valor predictivopositivo). De los 46 ovocitos inmadurosevaluados, 26 se encontraban en estadíode metafase I (56,5%) y 20 en estadío devesícula germinal (43.5%). El análisisestadístico mediante el test decorrelación de Pearson indica que existeuna correlación estadísticamentesignificativa entre la predicción de lamadurez ovocitaria predecumulación y elvalor real observado tras ladecumulación, tanto en el grupo deovocitos maduros como en el deinmaduros (p< 0.001).

CONCLUSIONES:

Los resultados de este estudio muestranque este nuevo sistema de scoring demadurez ovocitaria predecumulacióntiene un alto valor predictivo. Por lotanto, este scoring podría utilizarse paraseleccionar ovocitos madurospredecumulación y optimizar las tasas defecundación en FIV convencional.

INTRODUCCIÓN:

En un ciclo de FIV la inseminación es elmétodo de fecundación recomendadocuando no hay factor masculinodetectable. En esta estrategia, en un 5-10% de los casos se presenta fracasocompleto de la fecundación, y ante unfallo total de fecundación hay tresopciones: cancelar el ciclo, reinseminaro realizar ICSI en día+1: sólo esta últimaha dado embarazos evolutivos.

Se revisan, retrospectivamente, todoslos ciclos de FIV convencional congametos propios y con fallo total defecundación entre los años 2000 y 2008,y se describe el rendimiento de la técnicade rescate conocida como ICSI en día+1.


La inseminación convencional se realizaovernight en medio FERT/IVF (Vitrolife)en concentraciones de 200.000 -250.000 espermatozoides/ml.Definimos “fallo total de fecundación”como aquella situación en la queninguno de los ovocitos madurosmuestra signos de fecundación normal(2CP 2PN) entre las 17 y las 20h post-inseminación. Por tanto, excluimos delestudio aquellos casos que presentan

fecundaciones anómalas (1PN, 3PN o>3PN) o sólo indicio de fecundación(2CP).

La edad de las pacientes (28 a 41años),el número de ovocitos recuperados (3 a15) y el protocolo de estimulación paraestos 20 casos no difieren de los de la población general de nuestraspacientes.

Cuando detectamos fallo total defecundación y la morfología ovocitarialo permite programamos ICSI de rescateusando espermatozoides de la mismamuestra con la que se inseminó el díaanterior. En los dos primeros años (años2000 y 2001) la microinyecciónespermática se realizaba lo antes posible(p.ej. 20 horas post-inseminación)aunque después modificamos esteesquema y realizamos ICSI unas 24 horaspost-inseminación.

Los embriones con 2CP-2PN después deICSI en día+1 se cultivaron 24h en medioG1 (Vitrolife), se seleccionaron los demejor desarrollo, a los que se practicóeclosión asistida mediante soluciónácida de Tyrode inmediatamente antesde la transferencia ecoguiada.

RESULTADOS:

Los ciclos con fallo total de fecundaciónpor inseminación fueron 20 (un 3% delos 644 ciclos de FIV convencionaliniciados) repartidos equilibradamentea lo largo de los años.

Se realizó ICSI en día+1 en 17 de estoscasos, y en un único caso tampoco seobtuvo fecundación tras la ICSI en día+1.La tasa de fecundación fue del 62%.

Se pudieron hacer 16 transferencias enlas que se transfirieron 35 embriones(media de embriones transferidos de 2,2y media de blastómeros por embrióntransferido de 3,9).

Se obtuvieron 6 determinacionespositivas de bhCG, de las cuales dos nose confirmaron ecográficamente, unafue una gestación ectópica, una fue unaborto de primer trimestre y las dosrestantes fueron gestaciones evolutivascon un niño nacido en cada una.

Las tasas de implantación y de gestacióna término fueron del 11,4% y del 12,5%respectivamente.

CONCLUSIONES:

1/. Aunque las tasas de fecundación,implantación y gestación evolutiva son


087: TÉCNICA DE RESCATE DE ICSI EN DIA +1 POR FALLO TOTAL DELA FECUNDACIÓN MEDIANTE INSEMINACIÓNM. Grossmann, M. C. Pons, I. Solvas, R. Noblom, E. Castellanos, J. Unzueta, J. Nadal.Centro Medico Teknon, Unitat de Reproducció Assistida, Barcelona



significativamente inferiores a lasglobales en nuestro centro, el protocolode ICSI en día+1 se demuestra como unabuena herramienta de rescate de losciclos con fracaso total de fecundaciónpor inseminación.

2/. El éxito de esta técnica depende de larigurosa selección de los ovocitos nofecundados que serán micrinyectados en día+1.

3/. A pesar de que en la literaturacientífica existe cierta preocupación por

el riego de esta técnica de rescate sobrelas anomalías cromosómicas, todos losnacimientos comunicados hasta la fechason normales.

INTRODUCCIÓN:

La inseminación intrauterina, siempreque esté indicada, es el paso previo aotras Técnicas de Reproducción Asistidamás complejas. La tasa de gestación deesta técnica depende de numerososfactores pero, posiblemente, la muestraseminal y la edad de las pacientes seanlos más importantes. La introducción demuestras de semen de donante permiteduplicar las tasas de gestación. Elobjetivo del presente trabajo esdeterminar los factores predictores degestación de forma independiente paralas muestras con semen homólogo y consemen de donante.

MATERIAL Y METODOS:

Para evaluar estos factores se realizó unestudio retrospectivo de cohortes en elque se incluyeron 1900 ciclos deinseminación intrauterina; 1340 consemen homólogo y 560 con semen dedonante, realizados en nuestro centrodesde Enero de 2000 hasta Septiembre

de 2006. En ambos casos, se incluyeronvariables de la pareja como duración dela esterilidad, edad de la mujer y delvarón (solo en IAH), índice de masacorporal, número y diámetro folicular eldía de la hCG, niveles de FSH el día 3 delciclo, unidades de FSH administradas,duración del estímulo y niveles deestradiol y grosor endometrial el día dela hCG. También se incluyeron variablesseminales como concentración ymotilidad de los espermatozoides antesy después de la capacitación, así comorecuento de espermatozoides móvilespor mililitro de la muestra capacitada.

RESULTADOS:

La tasa de gestación fue del 10.9% paralas muestras homólogas y del 23.9%para las de donante. La incidencia degestación múltiple fue similar enpacientes tratadas con IAC y con IAD. Enlas muestras de semen homólogo, laconcentración, la motilidad de lamuestra en fresco y la duración de laestimulación fueron las únicas variables

que presentaron diferenciassignificativas entre las mujeres quegestaron y las que no. En las muestras dedonante no se observaron efectos de lasvariables seminales. Las variables quepresentaron diferencias significativas eneste último grupo fueron la duración dela esterilidad, la edad de la mujer y losniveles de estradiol el día de la hCG.

CONCLUSIONES:

Los factores predictores de gestación enIUI-H serían la concentración y lamotilidad en fresco, aunque, lapatología de base, tanto masculinacomo femenina, no permite determinarcon suficiente fiabilidad estos factores.

En el caso de la IUI-D, en la que se utilizanmuestras seminales procedentes devarones seleccionados, que se suponen defertilidad probada, los factores asociados ala gestación serían la duración de laesterilidad, la edad de la mujer y losniveles de estradiol el día de la hCG.

INTRODUCCIÓN:

La clínica IVI-Alicante seleccionadonantes de semen para tratamientos de

reproducción asistida en parejas dondeel varón tiene problemas de infertilidadprincipalmente por azoospermia, o enaquellas mujeres sin pareja. Con este fin

la clínica recluta varones sanosmanteniendo congeladas sus muestrasdurante 6 meses en cuarentena antes deser utilizadas para que no puedan

088: FACTORES PREDICTORES DE GESTACIÓN EN INSEMINACIÓNINTRAUTERINA HOMÓLOGA (IUI-H) Y DE DONANTE (IUI-D).I. Molina, C. C. Duque, J. Alfonso, J. V. Martínez, V. Montañana, A. Romeu Unidad de Reproducción Humana Asistida. Hospital Universitario La Fe, Valencia.

089: FACTORES DE RECHAZO MÁS FRECUENTES EN EL PROGRAMADE DONACIÓN DE SEMENE. Sellés, N. Salinas, L. Palomares, B. Losa, N. Garrido, M. Muñoz.IVI, Alicante

188



transmitir ninguna enfermedad en caso deseroconversión. La Ley de Reproducciónasistida exige para este tipo de donacionesuna serie de requisitos en cuanto aanalíticas referentes a enfermedadesinfecciosas de transmisión sexual yevaluación psicológica, sin embargo noexiste una mención específica sobre losresultados genéticos. El objetivo delpresente estudio fue conocer cuál es elmotivo de mayor rechazo según losdistintos parámetros evaluados exigibleso no por la Ley.


Se evaluaron 129 donantes con edadescomprendidas entre 18 y 35 años.

Los donantes fueron sometidos a unaentrevista seguida de unos controlespara evaluar su calidad espermática, sucapacidad de congelación ydescongelación, así como analíticas desangre y estudio psicológico.

- Entrevista: con inclusión en el historialde sus antecedentes personales yfamiliares.

- Analíticas de sangre: grupo sanguíneo,factor Rh, detección de sífilis, hepatitis,VIH, citomegalovirus, Neisseriagonorrhoeae y Chlamydia trachomatis.

Los estudios genéticos consistieron en

un screening de Fibrosis quística (FQ)donde se estudiaron en sangre 36mutaciones del gen de fibrosis quística(CFTR). Y el estudio del Cariotipomediante el análisis cromosómico de 15metafases mediante bandas GTG. Estosanálisis genéticos fueron realizados enel laboratorio de genética de IVI-Murcia.

- Estudio psicológico: el estadopsicofísico de los progenitores donantesdebían cumplir las exigencias de unprotocolo obligatorio de estudio queincluía sus características fenotípicas ypsicológicas.

RESULTADOS:

Un 64% de los donantes fueronrechazados por diferentes motivos. El89,65% fue por alteraciones en elespermiograma. El 7,69% estuvorelacionado con una alteración genética,de donde el 5,13% fue por FQ anormal. Yel 2,56% fue por otros motivosrelacionados con una entrevistapsicológica no apta o por serologíaspositivas.

CONCLUSIONES:

La mala calidad espermática en losvarones sigue siendo la causa queorigina una mayor tasa de rechazo en laselección de donantes de semen, siendola astenozoospermia el principal motivo.

la FQ es el factor con mayor incidenciadentro de los estudios genéticos queorigina una importante tasa de rechazo.De ahí la importancia de que en labatería de analíticas de sangre en losdonantes se incluyan estos screening yaque así se pueden detectar estasalteraciones que nos aportan unasdonaciones más seguras, ya quealrededor del 3% de la población blancaes portadora de FQ, una alteracióngenética que se transmite de formaautosómica recesiva. Es por esto que sedebe aconsejar en los donantesportadores de la mutación el screeningen la pareja para fines reproductivos, yaque en el caso de que los dosprogenitores sean portadores de laenfermedad, la probabilidad de tener unhijo afectado son del 25%.

INTRODUCCIÓN:

El cultivo embrionario en atmósferas conun menor porcentaje de oxígeno (O2),podría ser una de las opciones paramejorar la eficacia de los tratamientosde Reproducción Asistida.

La utilización de incubadores no

específicos para el cultivo embrionarioes una práctica habitual en loslaboratorios de embriología clínica detodo el mundo, siendo utilizadosidénticos modelos en otros campos comopor ejemplo la microbiología.

Conseguir una atmósfera estable, con unporcentaje del 5% de O2 y un 6% de CO2

y a una temperatura adecuada, esprácticamente imposible, en la rutinadiaria de un laboratorio de embriologíaclínica, si se utilizan estos incubadoresconvencionales con grandes volúmenesinteriores.

Actualmente, existen incubadoresespecíficos para el cultivo de embriones


090: COMPARACIÓN ENTRE EL CULTIVO DE EMBRIONES ENINCUBADORES DE SOBREMESA CON 5% DE OXÍGENO EINCUBADORES CONVENCIONALES CON 21% DE OXÍGENO.

M. Ruiz Jorro, E. Ferrer, M. Ferrer, C. Calatayud, M. Vila.CREA (Centro Medico de Reproducción Asistida) - Valencia



humanos, especialmente diseñados paramantener estas condicionesambientales, en volúmenes muypequeños. Son los llamados incubadoresde sobremesa, de carga superior o detipo “sandwichera”.

En este estudio hemos querido compararel porcentaje de embriones de ratón dela cepa B6C3F1 x B6DF1 que alcanzan elestadio de blastocisto, al ser cultivadosen dos tipos diferentes de incubadoresde sobremesa y con mezcla de gases (6%CO2 y 5% O2 en aire), respecto al que lohacen al ser cultivados en un incubadorconvencional con un 6% de CO2 en aire.


Para cada experimento, se utilizaron 54 embriones descongelados,correspondientes a 6 pajuelas,

conteniendo al menos 9 embriones deratón de la cepa B6C3F1 x B6DF1, enestadio de pronúcleos. Se repartieron 3embriones de cada una de las 6 pajuelas,para cada uno de los 3 incubadores. Encada incubador se cultivaron, por tanto, 18embriones, procedentes siempre a 6pajuelas diferentes. El mismo experimentose repitió 3 veces.

Los incubadores comparados fueron:

K-SYSTEMS G-85 BENCHTOP INCUBATOR

MINC COOK BENCHTOP INCUBADOR

INCUBADOR CONVENCIONAL HERACELL150 (3 puertas).

RESULTADOS:

La tasa media de formación de

blastocistos fue similar entre los dostipos de incubadores de sobremesacomparados, (96,3% vs. 92,6%),oscilando entre un 89% y un 100%.

Los resultados fueron superioresutilizando los incubadores de sobremesacon un 5% de O2, respecto a los obtenidoscon el incubador convencional con un 21%de O2 (tasa media de formación deblastocistos de un 79,6%, oscilando entreun 78% y un 83%.

CONCLUSIONES:

El cultivo de embriones de ratón de lacepa B6C3F1 x B6DF1 en incubadores desobremesa con un 5% de O2, mejora latasa de formación de blastocistosrespecto al cultivo en incubadoresconvencionales con un 21% de O2.

OBJETIVO:

El objetivo de este trabajo es relacionarlas calidades embrionarias de nuestrolaboratorio con las calidades seminalesde las que partíamos.


nuestro grupo de estudio estaba formadopor 14 pacientes de entre 33 y 42 años deedad con una respuesta normal altratamiento hormonal, a las cuales se lesrealizaron los pertinentes análisishormonales, de serología y revisiónginecológica previas. En todos los casosel protocolo de estimulación fue cortocon antagonistas y se realizó ICSI entodos los ovocitos maduros. Se realizó latransferencia de los mejores embrionesen día 2. Los embriones sobrantes secongelaron mediante vitrificación.

La calidad embrionaria se estudió en día2 siguiendo la clasificación de Remohí(2005):

Grado I: Calidad embrionaria excelente.Preembriones con zona pelúcida integra,blastómeras simétricas, sin fragmentaciónni vacuolas.

Grado II: Buena calidad embrionaria.Zona pelúcida integra, blastómerassimétricas, con menos del 10 % defragmentación, sin vacuolas.

Grado III: Calidad embrionaria regular.Zona pelúcida deformada, blastómerasasimétricas y con vacuolas y de un 10 aun 50 % de fragmentación.

Grado IV: Embriones de mala calidad.Zona pelúcida deformada, blastómerasasimétricas y con vacuolas y más de un50 % de fragmentación.

190

091: RELACIÓN DE LA CALIDAD EMBRIONARIA CON LA CALIDADSEMINALA. Brotons; M. I. Moragues; A. A. Fernández-PeinadoClínica In Vitam Centro de Medicina Reproductiva, Elche



RESULTADOS:

De todos los embriones obtenidos, el 56% eran de calidad embrionaria 1, el 24%de calidad 2, el 14% de calidad la 3 y el4% de calidad 4. El 46.2 % de losembriones obtenidos a partir de sémenesnormozoospérmicos eran de calidad 1 y el46.2% de calidad 2. Al partir de sémenesoligozoospérmicos obteníamos un 40% y

un 40% de embriones de calidad 1 y 2respectivamente. El 76.5 % de losembriones obtenidos con sémenesastenozoospérmicos y el 54.5 % de los obtenidos con sémenesteratozoospérmicos eran de calidad 1.Sólo vimos disminuida levemente lacalidad embrionaria con los sémenes conOTA, con los que sólo conseguimos el33.3% de calidad 1.

CONCLUSIONES:

Sólo en el caso de sémenes con OTAvemos disminuida la calidadembrionaria. En el resto de casos losembriones de calidad 1 y 2 superan concreces al número de embriones de malacalidad.

INTRODUCCIÓN:

Teóricamente, la transferencia enestadio de blastocisto ofrece ventajasrespecto al estadio de células: mejorestasas de implantación, menor número deembriones a transferir, mejor selecciónembrionaria, sincronización entre elembrión y el endometrio y, en el caso deldiagnóstico genético preimplantacional(DGP), prolongar el cultivo hasta tenerel diagnóstico de los embriones. Lamejora de los medios de cultivosecuenciales ha llevado a muchoscentros a cambiar su política detransferencia hasta el estadio deblastocisto.

Sin embargo, la transferencia enblastocisto tiene sus limitaciones. Existeun riesgo de cancelación del ciclo por notransferencia. Las tasas de gestaciónacumuladas por ciclo (transferencia enfresco más transferencia decriopreservados) pueden versedisminuidas, bien por no tener laposibilidad de congelar embriones, bienporque los embriones en estadio deblastocisto no sobreviven a lacongelación-descongelación. El objetivode este estudio consiste en determinarqué día es el más apropiado para latransferencia embrionaria: estadio decélulas (día 3) o estadio de blastocisto(día 5).


Análisis retrospectivo de 105 ciclos deFIV/ICSI con transferencia de dosembriones, realizados en el año 2008 ennuestro Centro. Se establecen dosgrupos de estudio: grupo A (n=31):ciclos transferidos en día 3 con al menos3 embriones categoría A (criteriosASEBIR) en el día de la transferencia, ygrupo B (n=74): ciclos transferidos endía 5 con al menos 3 embrionescategoría A en día 3. Las variablesanalizadas son: edad materna, tasas defecundación, embarazo clínico,implantación y embarazo evolutivo trasel 1º trimestre, % de ciclos conembriones criopreservados, tasa deembarazo clínico acumulada (ciclo enfresco más ciclo criopreservado) y tasade embarazo evolutivo acumulada tras el1º trimestre.

RESULTADOS:

Para las variables edad materna (33.6vs. 34.0), tasa de fecundación en FIV(62.8 vs. 67.0) e ICSI (74.9 vs. 70.3),tasa de embarazo clínico (51.6 vs. 54.0)y tasa de implantación (33.9 vs. 39.2) noexisten diferencias entre los dos gruposen estudio (grupo A vs. grupo B). La tasade embarazo evolutivo tras el 1ºtrimestre está incrementada en el grupoA (45.36 vs. 39.05). El porcentaje deciclos con embriones congelados cuandose transfiere en día 3 es mayor quecuando se dejan los embriones hasta día5 (96.8% vs. 33.8%). Si comparamos

ambos grupos tras el ciclo en fresco y elciclo con embriones criopreservados,tanto la tasa de embarazo clínicoacumulada (64.52 vs. 54.05) como latasa de embarazo evolutivo tras el 1ºtrimestre acumulada (58.27 vs. 39.05)los resultados en día 3 son mayores quelos obtenidos en día 5.

CONCLUSIONES:

Con los criterios de inclusiónestablecidos, la transferenciaembrionaria en día 3 proporcionamejores resultados que la transferenciaen día 5. Se recomienda la transferenciaen día 5 en situaciones concretas como:≥ 3º ciclo de reproducción asistida,transferencias de un único embrión yDGP.


092: TRANSFERENCIA EMBRIONARIA EN DÍA 3 VERSUS DÍA 5

M. A. Carracedo, J. Guerrero, A. Rodríguez-Arnedo, A. Vieira, R. Bernabeu, J. TenInstituto Bernabeu, Alicante



INTRODUCCIÓN:

La FSH en el varón interviene tanto en lamaduración de los espermatocitossecundarios hacia espermátides comosobre las células de Sertoli, activando laproducción de la proteína fijadora deandrógenos, ABP, la cual se secreta allumen de los túbulos seminíferos y setransporta al epidídimo, contribuyendoa proporcionar la concentración deandrógenos necesaria para lamaduración de los espermatozoides.

OBJETIVO:

Evaluar el efecto de la FSH exógenasobre los parámetros seminales depacientes con oligozoospermiaidiopática con niveles de FSH e InhibinaB normales.

Analizar si se puede establecer comoprotocolo de acción la administraciónde FSH exógena en pacientes con dicha patología en función de las tasasde gestación tras inseminaciónintrauterina (IA).


Los criterios de inclusión en el estudiofueron tamaño, consistencia ylocalización testicular normal; unaconcentración espermática inferior a 20millones/mL y superior a 5 millones/mL,y niveles hormonales basales normales(FSH, Inhibina B, Estradiol).

Se incluyeron en el estudio 80 pacientes,dividiéndose en 2 grupos: al grupo 1(n=40) se le suministro FSH 150 u.i.(GONAL f 900) a días alternos durante unperiodo de tres meses; al grupo 2 (n=40)no se le suministró tratamiento.

Previo al inicio del estudio, se realizarondos seminogramas diagnósticosevaluando los distintos parámetrosseminales (volumen, recuento, motilidad,morfología, viabilidad y supervivencia)para así descartar una mejora espontánea.Una vez finalizado el tratamiento serealizó un nuevo seminograma así como unciclo de inseminación intrauterina.

RESULTADOS:

Entre ambos grupos no se observarondiferencias estadísticamente significativasen los parámetros seminales. Sin embargo,en el grupo 1 hay un subgrupo deindividuos (n=17, 42.5%) en los que existeuna tendencia al aumento del recuento(antes del tratamiento 12.5 mil/ml,después 23.3 mil/ml). Además, al compararlas tasas de embarazo tras realizar un ciclode IAC, se puede observar que el subgrupoque mejora presenta una tasa mayor (3/17(17.6 %)) con respecto al grupo contratamiento que no ha respondido (2/23(8.6 %)) y al grupo sin tratamiento (4/40(10 %)) respectivamente.

CONCLUSIONES:

Aunque el tratamiento con FSH enpacientes con oligozoospermiaidiopática no es todo lo efectivo quequisiéramos, sí se observa un grupo depacientes donde aumenta laconcentración espermática y se mejoranlos resultados en IAC, evitando el pasode estas parejas por TRAs más agresivas.

INTRODUCCIÓN:

La congelación de embriones excedentesde los procesos de FIV y su posteriordescongelación y transferencia (TEC)forman parte de la rutina del laboratoriode embriología. Sin embargo, las tasasde embarazo de los ciclos de TEC puedenser hasta 40% inferiores a los ciclos deFIV en fresco (Hurtado de Mendoza y col.2008). En nuestro laboratorio hemosanalizado retrospectivamente losresultados obtenidos en nuestro

programa de congelación-descongelación de embriones durante unperíodo amplio, con el fin de actualizarlos criterios de selección de embrionespara criopreservación y de establecer losparámetros que sirvan para la selección ytransferencia de embriones congelados.


La muestra comprende todos losprocesos de descongelación deembriones desde enero de 2007 a julio

de 2008, con embriones congeladosmediante congelación lenta entre enerode 2006 y diciembre de 2007. Losembriones fueron criopreservados enD+2 / D+3 de cultivo embrionario (2-10células), con buena calidad morfológica(categorías 1 y 2). Post-descongelación,los embriones se mantenían en cultivo24 h para valorar la reactivación de suactividad metabólica. Se analizaron losdatos observados pre-congelación ypost-descongelación, así como las tasasde gestación e implantación obtenidas

093: EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN EXÓGENA DE FSH ENVARONES CON OLIGOZOOSPERMIA IDIOPÁTICA

F. J Oltra, M. Carracedo, P. PosadillaFIV-LEON

094: VARIABLES EMBRIONARIAS Y RESULTADOS DEL PROGRAMADE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES CONGELADOS.O. Martínez-Pasarell1, S. López1, A. Mata1, A. García1, O. López1, A. Polo2, L. Bassas1

1Laboratorio de Seminología y Embriología, 2Servicio Ginecología, Fundació Puigvert-Hospital de la Santa Creu i Sant Pau.

192



(Statistical Package for the SocialSciences, v15.0.1).

RESULTADOS:

Se revisaron 161 procesos decongelación/descongelación lenta (92de D+2 y 69 de D+3), realizados a 142parejas. La edad media de las pacientesen el ciclo de descongelación era 34,7 ±4,0 años. Se descongelaron 435embriones (252 de D+2 y 183 de D+3) yse obtuvo un 85,1% de supervivenciaembrionaria global. La tasa desupervivencia celular fue del 71,1%,siendo mayor en los embrionescriopreservados en D+2 versus los deD+3 (77,7% vs 62,5%; p<0,001). Seobservó también mayor supervivencia enlos embriones con ritmo de divisiónsincrónica respecto a los asincrónicos(75,1% vs. 65,4%; p<0.001). A las 24hde cultivo post-descongelación, la tasade crecimiento embrionario secorrelacionaba negativamente con el

número inicial de células (r: -0,126;p<0,01).

Se realizaron 152 transferencias(94,4%); 89 de D+2 y 63 de D+3. Lamedia de embriones transferidos fue de2,03 (rango 1-3). Se consiguieron 40gestaciones (26,3% por transferencia;28,2% por paciente). La probabilidad deconseguir gestación fue independientedel número de embriones transferidos.Las tasas de implantación y abortoobservadas fueron del 14,6% y 20%,respectivamente. Las tasas de gestaciónclínica en ciclos de transferencia deembriones criopreservados en D+2 eransignificativamente mejores a las deembriones de D+3 (31,4% vs. 19,0%;p<0,01). Al relacionar los datos degestación con la supervivencia ycrecimiento embrionarios, se observóuna correlación débilmente positivaentre la supervivencia celular y laprobabilidad de implantación delembrión (r: 0,137; p<0,05), pero no se

observó relación con el crecimientoembrionario. No se consiguió gestaciónevolutiva en transferencias conembriones con una supervivencia celularinferior al 50%. Tampoco con embrionesde más de 9 células al criopreservar.

CONCLUSIONES:

En nuestro laboratorio deberíamospriorizar la criopreservación deembriones en D+2 con divisiónsincrónica y evitar la criopreservación deembriones de más de 9 células en D+3.Post-descongelación, la supervivenciadebe de ser el primer criterio a tener encuenta al seleccionar embriones paratransferir, además de evitar latransferencia de embriones consupervivencia inferior al 50%. Lareanudación de la división embrionariano parece ser un índice predictivo de lacapacidad de implantación, por lo que elcultivo post-descongelación podríaeliminarse.

INTRODUCCIÓN:

Objetivo: Evaluar la necesidad eimportancia de realizar cariotipos deforma rutinaria a los pacientes querealizan tratamientos de fecundación invitro (FIV). Determinar las diferentesanomalías detectadas, así como realizarun seguimiento de los tratamientosrealizados por estos pacientes.


Se tienen en cuenta, en estudioretrospectivo, pacientes que comienzantratamiento de FIV desde el año 2006hasta mayo de 2009.

RESULTADOS:

Se han realizado sistemáticamentecariotipos a un total de 2995 parejas

diagnosticadas para comenzar untratamiento de FIV en nuestro centrodesde el 2006 hasta mayo del 2009. Sedetectan un total de 72 cariotiposcorrespondientes a 69 parejas conalguna anomalía en alguno de los dosmiembros, lo que supone un 2,3 % de lasparejas atendidas en este periodo. Cabedestacar 3 parejas en las que ambosmiembros presentan alguna anomalía enel cariotipo que hasta ese momentodesconocían.

Las anomalías detectadas han sido: 34translocaciones; 14 inversiones; 4trisomías; 7 mosaicismos; 12 incrementosde la heterocromatina o regionessatélites; y 1 cromosoma Y en anillo.

CONCLUSIONES:

La importancia de algunas alteraciones

detectadas no representa un problemamayor a criterio del genetista, perosorprende la frecuencia relativamentealta de pacientes con problemasgenéticos que, en muchas ocasiones,eran desconocidos por ellos mismos.

A raíz de estos resultados, algunos deestos pacientes han recurrido a técnicasde FIV con DGP, a otros se les harealizado FISH confirmándose lanaturaleza genética de sus problemas deinfertilidad y, en los casos dealteraciones más severas, han acabadorealizando tratamientos con gametosdonados. En definitiva, esta prueba estáal alcance de cualquier centro, teniendoun coste relativamente bajoconsiderando la información queproporciona y, en ocasiones, puede serdeterminante para un correctodiagnóstico de los pacientes.


095: INCIDENCIAS EN EL CARIOTIPO EN PACIENTES DE FIV

R. Lafuente, G. López, M. Sala, F. del Río, M. Gómez y M. BrassescoCIRH-Clínica Corachan. Barcelona



INTRODUCCIÓN:

Las translocaciones cromosómicasequilibradas aparecen en un 0.2% de lapoblación neonatal. Este porcentajealcanza el 0.6% en el caso de parejasinfértiles. Las translocaciones estánrelacionadas con la producción de ungran número de gametos con dotacionescromosómicas desequilibradas que segeneran tras la segregación meiótica.Por lo tanto, las parejas portadoras detranslocaciones presentan un mayorriesgo de sufrir abortos espontáneos odescendencia fenotípicamente alterada.En consecuencia, estas parejas formanuno de los grupos más amplios depacientes que se benefician del DGP.

El objetivo del presente trabajo espresentar los resultados de 51 ciclos deDGP obtenidos en nuestro laboratorio,entre octubre 2005 y abril 2009.


Previo al DGP, se llevó a cabo el estudiomediante FISH de metafases e interfasesde linfocitos procedentes de sangre de lospacientes portadores de las

translocaciones. Para ello se utilizaronsondas centroméricas y/o teloméricasmarcadas con diferentes fluoróforos con elfin de determinar el patrón de señales dehibridación esperado en los embriones.

La biopsia de uno o dos blastómeros porembrión se llevó a cabo mediante ácidoTyrodes o láser en día +3 de cultivoembrionario in vitro. La fijación de losblastómeros se realizó siguiendo elmétodo de Tarkowski, y los núcleos fueronanalizados mediante FISH utilizando lacombinación específica de sondas de ADNcomerciales para cada caso. Latransferencia de los embrionesnormales/equilibrados al útero materno serealizó en los días 4 ó 5 de cultivo in vitro.

RESULTADOS:

Un total de 37 parejas se sometieron a 51ciclos de DGP, de las cuales 23 eranportadoras de translocacionesreciprocas y 14 lo eran detranslocaciones robertsonianas. Seanalizaron individualmente 392blastómeros de los cuales 339 fuerondiagnosticados (86.5%), quecorresponden al 92.7% de los

embriones analizados (301). De los 279embriones diagnosticados 88 (31.5%)resultaron ser normales o equilibradospara la translocación estudiada. En el68.6% (35/51) de los casos se realizó latransferencia al útero de embrionesnormales o equilibrados para latranslocación analizada. En el 31.4%restante no se dispuso de embrionesaptos para la transferencia debido a suestatus genético o a criteriosembriológicos. Finalmente un 20%(7/35) de las pacientes obtuvo unembarazo, de las cuales 5 (14.3%)llegaron a término con el nacimiento deniños fenotípicamente normales.

CONCLUSIONES:

El DGP ofrece la posibilidad deseleccionar en estos casos embrionesnormales o equilibrados permitiendoreducir así la elevada tasa de abortosespontáneos que caracteriza a estegrupo de pacientes y aumentar lasposibilidades de embarazos viables. Enmuchos casos el factor limitante es,entre otros, encontrar embrionesnormales o equilibrados aptos paratransferir.

INTRODUCCIÓN:

En los últimos años se ha observado unaumento de parejas extranjeras que sedesplazan a nuestro país para recibirtratamientos de fertilidad. La legislaciónque regula las técnicas de reproducciónhumana asistida es muy variable entre

los distintos países europeos. Laproximidad de los países conlegislaciones más permisivas así como lafacilidad actual de desplazamiento entreellos ha propiciado este aumento quepopularmente se conoce como “turismoreproductivo”. Este hecho, junto con elcarácter progresista de la legislación

española sobre TRA ha generado un granflujo de pacientes internacionales hacianuestro país. En muchos casos el flujohacia otros países ha constituido laúnica solución para que los pacientespuedan llevar a cabo el tratamientonecesario.

096: DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIÓN EN PORTADORESDE TRANSLOCACIONES CROMOSÓMICAS

E. García-Mengual1, R. Claramunt1, A. Ruíz1, X. Vendrell1, M. Pérez-Alonso2

1Unidad de Genética Reproductiva. Sistemas Genómicos S. L, Paterna (Valencia). 2Departament de Genètica. Facultat de CiènciesBiològiques. Universitat de València.

097: FLUJO REPRODUCTIVO: ESTUDIO DE LAS MOTIVACIONES YCARACTERÍSTICAS DE LAS PACIENTES EXTRANJERAS DELINSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS

O. Oliana1, L. Echeverria1, M. Boada1, B. Coroleu1, A. Veiga1,2, P. Nolasc Barri1

1Departament d’Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció USP Institut Universitari Dexeus. Barcelona. 2 Centre de Medicina Regenerativa deBarcelona (CMRB). Barcelona.

194



OBJETIVO:

En el presente estudio se analizan lascaracterísticas de las pacientes recibidasen el Institut Universitari Dexeus por elperiodo de un mes.


Durante todo el mes de noviembre del2008 y a través del servicio de atenciónal paciente internacional del centro, sedistribuyó entre todas las pacientesextranjeras un cuestionario anónimocon preguntas de tipo personal y médicoelaborado por la Task Force on Ethics andLaw y que forma parte del estudiomulticentrico Cross-border reproductivecare de la ESHRE.

RESULTADOS:

Los resultados de los 72 cuestionarioscontestados ponen de manifiesto que elperfil de las pacientes recibidas eraheterosexual, con estudios universitariosy de una media de edad de 39 años,

superior a la media de edad (36.5 años)del programa de FIV del centro.

El 91.7% de las parejas eran de origenitaliano, casadas o viviendo en pareja. El20.7% de las pacientes manifestaronhaber realizado anteriormente ciclos deFIV sin resultados satisfactorios. Por loque al tratamiento se refiere, sedesplazaron mayoritariamente paraciclos de FIV/ICSI y donación de gametosy embriones (54.2% y 37.5% de laspacientes respectivamente). La eleccióndel centro fue por recomendaciónmédica (47.2%) o por consejo de amigosy familiares (36.1%) principalmente.

En cuanto al motivo principal deldesplazamiento, las respuestas de laspacientes manifestaron un problema detipo legal (43.8%) y en segundo lugar labúsqueda de una mejor calidad en eltratamiento (26.9%).

CONCLUSIONES:

Las características de las pacientes que se

desplazan a nuestro centro desde elextranjero son de mayor edad que la mediade nuestras pacientes del programa de FIVy con una formación académica superior,lo que denota una posición socio-económica media-alta que permiteafrontar el elevado coste de estos ciclos(tratamiento+desplazamiento).

Por lo que se refiere a la motivación, losaspectos legales son la principal causade desplazamiento de las parejas lo queapunta a que la promulgación de leyesrestrictivas no impide la realización delos tratamientos sino que promueven eldesplazamiento de determinadasparejas a otros países.

La gran dimensión que ha adquirido estefenómeno en los últimos tiemposaconseja una reflexión y análisis de losdatos globales y las condiciones en lasque se realiza para poder adaptarlos alas necesidades específicas de estospacientes y, sobretodo garantizar lacalidad y la seguridad de lostratamientos.

INTRODUCCIÓN:

Durante el los tratamientos defecundación in vitro (FIV) la selección delos embriones para transferir está amenudo basada en criterios morfológicosy en la velocidad de división. En algunasespecies de mamíferos se ha demostradomayor velocidad de desarrollo y división enlos embriones masculinos que femeninos(1). En humanos hay diversidad deopiniones, aunque la mayoría de losautores defienden que la transferencia deblastocistos parece estar asociada con unincremento en el nacimiento de niños (2).El objetivo de este trabajo fue determinarla posible relación entre las tasas decrecimiento embrionario en fasestempranas de desarrollo (≤ 8-10 células) ysu diferenciación sexual.

MATERIAL Y METODOS:

Se realizó un estudio retrospectivo en elque se analizaron 205 transferenciasembrionarias (TE) que finalizaron con elnacimiento de un niño, transfiriéndoseun total de 458 embriones que dieronlugar a 264 niños ( : 135, : 129). Seestudió la relación de la tasa de divisiónembrionaria con el sexo de los reciénnacidos (RN).

Los embriones se dividieron en tresgrupos según el número de blastómerosque tenían en el momento de latransferencia: ≤3, 4 y ≥ 5 blastómeros.Sólo se consideraron las transferenciasen las que se transfirió un solo tipo deembriones para poder valorar el sexo delos niños nacidos en función del número

de blastómeros de los embrionestransferidos.

Se comparó entre los grupos, el sexo y elpeso de los RN. Los embriones secultivaron en G1 hasta su transferencia enEmbryoGlue. La significación de lasdiferencias se estimó utilizando el test de t-Student y el análisis de c2. Las diferencias se consideraronestadísticamente significativas parap<0,05.

RESULTADOS:

De las 205 TE (edad media: 34,0±3,5años), se transfirieron exclusivamenteembriones con ≤3 blastómeros en 18 TE,con =4 en 116 y con ≥ 5 en 71. Tras latransferencia de embriones con ≤3


098: RELACIÓN ENTRE LAS TASAS DE CRECIMIENTO DEL EMBRIÓNEN FASES TEMPRANAS DE DESARROLLO Y SU DIFERENCIACIÓNSEXUAL

C. Álvarez, R. Taronger, C. García, M. Sánchez, G. González de MerloUnidad de Reproducción. Hospital General Universitario, Albacete.



blastómeros nacieron: 11 niños (pesomedio: 2911,4±451,4 g) y 12 niñas(peso: 2792,2±630,4 g); de embrionescon 4 blastómeros: 71 niños(2693,0±717,8 g) y 78 niñas(2574,2±758,9 g) y de embriones ≥ 5: 46niños (2789,9±694,6 g) y 46 niñas(2724,7±630,5 g). Al comparar elnúmero de niñas y niños nacidos segúnel número de blastómeros de losembriones transferidos no se

observaron diferencias significativas. Elpeso medio de los niños y niñas nacidosen cada uno de los grupos tampocomostró diferencias significativas.

CONCLUSIONES:

La tasa de crecimiento de los embrionesen fases de desarrollo más temprano (≤8-10 células) no determina ni el sexo niel peso del RN.

REFERENCIAS:

1. Avery B, Madison V, Greve T. Sex anddevelopment in bovine in vitro-fertilizedembryos. Theriogenology 1991; 35: 953-63.

2. Luna M, Duke M, Copperman A, GrunfeldL, Sandler B, Barritt J. Blastocyst embryotransfer is associated with a sex-ratioimbalance in favour of male offspring. FertilSteril 2007; 87: 519-23.

INTRODUCCIÓN:

Estudio comparativo entre los criteriosde valoración embrionaria de ASEBIR ylos criterios utilizados en el laboratoriode Fecundación in vitro (FIV) de laClínica de Reproducción AsistidaEmbriogyn. Los objetivos de esteestudio son, en primer lugar, compararlos dos métodos de valoraciónembrionaria de Embriogyn y ASEBIR. Yen segundo lugar, ver si existe unatendencia lineal creciente significativaen la tasa de implantación de lasdiferentes categorías embrionariaspropuestas por ASEBIR utilizando laprueba chi-quadrado de tendencialineal (X2TL) de Mantel-Haenzel.


Los datos analizados corresponden a683 embriones procedentes de 106ciclos tanto FIV Convencional como deICSI, con gametos propios o de donante,y con transferencia embrionariarealizada a dia+2 o dia+3, realizados enEmbriogyn durante el año 2008. Losembriones se han revaloradoasignándoles la categoría que lescorrespondería según los criterios declasificación de ASEBIR. Se ha analizadosi existe concordancia entre el destinoque le dio Embriogyn a cada embrión(transferido/congelado /descartado) y

el destino que tendrían aplicando laclasificación de ASEBIR. A los embrionesque presentan dicha concordancia se lesha asignado un nº 1, y por tanto, un nº 0a los que no concuerdan.

RESULTADOS: La comparativa muestraun 92,83% de similitud entre los doscriterios de valoración embrionaria. Deltotal de embriones transferidos(n=261), un 72,63% corresponden a lacategoría A de ASEBIR. Del total deembriones congelados (n=117) un22,53% son de categoría A. Respecto alos embriones descartados (n=305), un79,94% corresponden a la categoría D.Por otra parte, la prueba estadística chi-quadrado de tendencia lineal (X2TL) deMantel-Haenzel, muestra unaX2TL=11,27 con un grado de libertad(p<0.001).

CONCLUSIONES:

Hay ciclos en los que se encuentrandiscrepancias (7,17%) en la decisión decuales son los mejores embriones paratransferir, congelar, o los que sedescartan. El 55% de las discrepanciascorresponden a ciclos en que después detransferir los embriones de mejorcalidad sólo queda un posible embriónpara congelar, si éste no es de óptimacalidad, en Embriogyn, se deja encultivo, y únicamente en el caso de que

llegue a desarrollar un blastocisto secongela. Los principales aspectosmorfológicos que han generadodiscrepancias (28,5%) entre las dosclasificaciones, es la valoración de lamorfología citoplasmática y nuclear.Estos parámetros morfológicos son: el“pitting”, la compactación a día+3, lapresencia de retículo endoplasmáticoliso (REL), citoplasma granular (CG) ogranulosidad central (GC), distribucióny número de vacuolas y el grado demultinucleación. Otro parámetro que hagenerado un 16,5% de las discrepancias,es que la clasificación ASEBIR nocontempla la posibilidad de ascender decategoría a día+3, a los embrionespenalizados a día+2. Por otro lado,después de calcular las tasas deimplantación de cada categoría deASEBIR y realizar-se la pruebaestadística X2TL de Mantel-Haenzel, seha visto que sí existe una tendencialineal creciente estadísticamentesignificativa en la tasa de implantación amedida que mejora la categoríaembrionaria de ASEBIR. Entendemos,pues, que la clasificación de ASEBIR sípermite seleccionar cualitativamente losembriones y, por tanto, ceñirse a éstapuede pronosticar la capacidad degestación de cada embrión.

196

099: CLASIFICACIÓN EMBRIONARIA DE ASEBIR, EXPERIENCIADESDE EL LABORATORIO DE FECUNDACIÓN IN VITRO

R. Bonet, C. Vives, P. Feliu, T. Planella, F. Vidal, I. SaumellEmbriogyn Centre de Reproducció Assistida i Diagnòstic Prenatal, Tarragona



INTRODUCCIÓN:

En el Centro de Infertilidad yReproducción Humana (CIRH)vitrificamos embriones de manerarutinaria desde finales de 2007, así quenos propusimos poner a punto estatécnica para criopreservar ovocitoshumanos. Comenzamos a vitrificarovocitos en abril de 2008, utilizandomedios comerciales de Irving Scientific®y Cryotip® como soporte. Los ovocitosincluidos en este estudio provienen dedonantes.

OBJETIVO:

Mostrar los resultados obtenidos en lavitrificación de ovocitos utilizando unsoporte cerrado, como es el Cryotip®.


Se incluyen 11 donantes cuyos ovocitosfueron destinados a 11 receptorasdurante el año 2009. Parte de losovocitos de la receptora fueronvitrificados y desvitrificados el mismodía de la punción folicular, mientras elresto se inseminaron en fresco.

Se utiliza un protocolo con antagonistas

de la GnRH, estimulando a las donantescon FSH urinaria e induciendo lamaduración ovocitaria con agonistas dela GnRH. Dos horas después de la punciónfolicular se procede a decumular losovocitos recuperados y a revisar el gradode madurez. Tan sólo aquellos ovocitosmetafase II y con buen aspecto seránvitrificados. Al menos 45 minutosdespués de la denudación, los ovocitosson vitrificados siguiendo el protocolo dela casa comercial. Tras mantenerlos ennitrógeno líquido para su correctaconservación se procede a realizar ladesvitrificación, siguiendo igualmente elprotocolo de la casa comercial. Dos horasdespués se procede a realizar lamicroinyección. La morfología ovocitariase valora tanto tras la decumulación,como después de la desvitrificación y enel momento de la ICSI.

RESULTADOS:

Hasta el momento (mayo de 2009) sehan desvitrificado 58 ovocitos, 45 de loscuales resistieron el proceso (77.58%),siendo todos ellos microinyectados. Deéstos, 33 ovocitos fecundaroncorrectamente (73.33%) y se obtuvieron28 embriones, 25 de los cuales fueronevolutivos. Estos datos son muy

similares a los obtenidos en elLaboratorio de FIV habitualmente(78.73% de fecundación por ICSI y 97%de división en 2009).

Se han realizado cuatro transferenciasen las que todos los embrionesprovienen de ovocitos vitrificados,quedando dos pacientes embarazadas yuna tercera está pendiente de resultado.Además, se han realizado trestransferencias mixtas, en las que unembrión proviene de ovocitosvitrificados y el otro de un ovocito novitrificado, quedando embarazada unapaciente.

Todos los embriones sobrantes de buenacalidad fueron vitrificados.

CONCLUSIONES:

Aunque el número de casos es pequeño,la utilización de un sistema cerradocomo el Cryotip no compromete las tasasde supervivencia y desarrollo de losovocitos y de los futuros embriones.Además, se elimina el riesgo potencialde contaminaciones cruzadas durante sualmacenamiento en nitrógeno líquido.

INTRODUCCIÓN:

El presente estudio está basado en unabúsqueda sistemática en PubMed ycompara la validez clínica de losparámetros clásicos de semen (CSP) conla evaluación de la estructura de la

cromatina espermática (SCSA) endiferentes contextos clínicos. El objetivode este estudio es evaluar la validezclínica del SCSA frente a CSP.


La base de datos de PubMed fue revisadautilizando palabras clave (testdiagnóstico, semen, espermatozoide,embarazo) en tres escenarios clínicos:parejas que buscan embarazo; parejasque han estado buscando durantes 12meses sin resultado; y parejas tratadas

100: PRIMEROS RESULTADOS EN LA VITRIFICACIÓN DE OVOCITOSCON SISTEMA CERRADO. NUESTRA EXPERIENCIA EN CIRH.

F. del Río, O. Cairó, A. Brassesco, S. Rovira, M. Rodriguez, L. Prats, M. BrassescoCentro de Infertilidad y Reproducción Humana (CIRH)

101: INTERPRETACIÓN DE TESTS DIAGNÓSTICOS DE INFERTILIDADMASCULINA: POOLED ANÁLISIS DE SPERM CHROMATIN STRUCTUREASSAY (SCSA) Y PARÁMETROS CLÁSICOS DE SEMEN (CSP)S. Zamora, M. A. Calderón, M. C. Gonzalvo, A. Fernández, B. Rabelo, J. Fontes, R. Ruiz de Assin, B. Romero.U. Reproducción H. U. Hospital Virgen de las Nieves, Granada




con inseminación intrauterina. Existíauna alta heterogeneidad entre losestudios incluidos.

RESULTADOS:

Para parejas que buscan concebir con unresultado anormal del SCSA, laprobabilidad de factor masculino varía deun valor pre-test de 7,5% a un valor post-test de 32,1% (CI 15.7-54.5) cuando seobtiene un resultado anormal de SCSA,mientras que tras un resultado anormal en

los CSP la probabilidad post-test es de17,3% (CI 11.8-24.5). Para parejas quehan estado buscando durante 12 mesessin resultado la prevalencia pre-test deinfertilidad por factor masculino es del50%, y la probabilidad post-test deinfertilidad de factor masculino despuésde un resultado anormal del test es muysimilar para SCSA y CSP (79,75%; CI: 41,5-95,6 vs. 79,67%; CI: 75-83,7). En parejastratadas con inseminación intrauterinaaunque la validez clínica del SCSA esmayor que la de la morfología espermática

sola (97,2%; CI: 93,6-98,8 vs. 91,2%; CI:86,6-94,5) no parece suficiente paraindicar la inclusión de esta técnica en elestado del varón infértil.

CONCLUSIONES:

No existe evidencia clínica pararecomendar el uso del SCSA en eldiagnóstico de esterilidad de causamasculina. Su validez clínica no es mayorque la de los parámetros clásicos desemen.

INTRODUCCIÓN:

La combinación del diagnóstico deFragmentación del DNA en elespermatozoide con la aparición demicroscopios más potentes que los queactualmente tenemos en loslaboratorios de Reproducción Asistidanos ha permitido obtener embarazos encasos en los que con una FIV-ICSI clásicano lo hubiésemos conseguido. Un semencon la fragmentación del DNA alteradanos da la misma tasa de fecundación,misma calidad embrionaria y misma tasade división embrionaria hasta día +2,por lo que si el fallo de FIV de debe a estetipo de patología, ninguno de losparámetros anteriores nos va a darinformación al respecto.

La incorporación de ambas técnicas ennuestro laboratorio (tras la adquisicióndel microscopio Leyca AM6000 en Mayode 2008) nos ha permitido eltratamiento de esta FragmentaciónAlterada del DNA del espermatozoidemediante su selección con altamagnificación.


Paciente de 30 años que viene a consultade esterilidad tras fallo de FIV en otrocentro. Vienen diagnosticados como:síndrome de ovario poliquístico y astenoleve y terato severa (presentando el

seminograma un recuento de 31x106 yuna motilidad tipo A de 16%). Se realizaun primer ciclo en nuestro centro en elque se obtiene una buena respuestaovárica, con un buen número deembriones y una buena transferenciacon embriones tipo A (según laclasificación de ASEBIR); no quedaembarazada. Se realizan dostransferencias posteriores con losembriones vitrificados sobraron de esteprimer ciclo en las que tampoco seobtuvo un resultado positivo. Antes derealizar un segundo ciclo indicamos alpaciente la realización de un Test deFragmentación del DNA en el queobtenemos un resultado de un 45% defragmentación en la muestra en fresco.Se realiza un segundo ciclo con idénticaestimulación y similar número deovocitos MII que se microinyectan conespermatozoides seleccionados a 6000aumentos debido a la fragmentacióndiagnosticada.

RESULTADOS:

Obtuvimos embarazo tras la realización

del segundo ciclo de microinyecciónrealizada con alta magnificación. Lacalidad de los embriones no fuediferente a las transferenciasanteriormente realizadas. El resultadode la ß-hCG a los 12 días post-transferencia fue de 148 UI. La pacientedio a luz en Abril a las 39 semanas deembarazo; el bebé pesó 3.400gr y seencuentra en perfecto estado de salud.

CONCLUSIONES:

El uso de SUPER-ICSI para intentarmejorar las tasas de embarazo enaquellos casos que presentan un factormasculino severo nos está ofreciendoresultados que con la microscopíaconvencional usada hasta ahora no noshabría sido posible solucionar.

BIBLIOGRAFÍA:

1.The morfological normalcy of the sperm

nucleus and pregnancy rate ofintracytoplasmic injection withmorphologically selected sperm. Arie

198

102: PRIMER NACIMIENTO EN GINEMED TRAS SUPER-ICSI

B. Migueles, M. Dorado, M. Hebles, M. González, L. Aguilera, P. Sánchez, F. Sánchez.Clínicas Ginemed, Sevilla



Berkovitz, Fina Eltes, Sholomit Yaari,Nathan Katz, Ilya Barr, Ami Fishman,Benjamin Bartoov. Human Reproduction.Vol 20 Nº1, pp185-190, 2005

2. Does the presence of nuclear vacuoles in

human sperm selected for ICSI affectpregnancy outcome?. Arie Berkovitz, FinaEltes, Adrian Ellenbogen, Sigal Peer, DovFeldberg, Benjamin Bartov. HumanReproduction Advance Access publishedFebruary 23, 2006

3. Blastocyst development after spermselection at high magnification is associatedwith size and number of nuclear vacuoles.Pierre Vanderzwalmen, Antje Hierner, PaulRubner, Magnus Bach, Anton Neyer.

INTRODUCCIÓN:

El objetivo de los ciclos de reproducciónasistida es conseguir un embarazo atérmino. En muchas ocasiones esteresultado no ocurre tras la transferenciade embriones en fresco y es necesariorecurrir a embriones congelados en ciclosprevios. La incertidumbre que produce elrealizar un nuevo ciclo con embriones dela misma cohorte nos lleva al objetivoprincipal de este trabajo, evaluar elpronóstico de un ciclo decriotransferencia (CT) tras la realizaciónde un ciclo fallido con transferenciaembrionaria (TE) en fresco, tanto en ciclosFIV/ICSI como en donación de ovocitos.


Se llevaron a cabo dos grupos: A (n=79):pacientes que habían realizado unprimer ciclo de FIV/ICSI con TE, bien conresultado de β-HCG negativa (n=54), ocon resultado de aborto bioquímico o deprimer trimestre (n=25), realizando unciclo posterior de criotransferencia, ygrupo B (n=109): pacientes que habíanrealizado un primer ciclo de donación deovocitos con TE y resultado de β-HCGnegativa (n=73), o con resultado deaborto bioquímico o de primer

trimestre (n=36) y posterior ciclo decriotransferencia. Para cada uno de losgrupos se analizó el porcentaje de cicloscon transferencia, la tasa de embarazoclínico, aborto bioquímico y de primertrimestre. Se analizaron los datos con elpaquete estadístico SPSS.

RESULTADOS:

Se comprobó que tanto el número deembriones desvitrificados, como elnúmero de embriones que sobrevivieronal proceso y el número de embrionestransferidos en ambos grupos (FIV/ICSIy receptoras) presentaron los mismosresultados.

En el grupo de pacientes de FIV/ICSI conabortos en los ciclos previos en fresco,se observó un incremento en la tasa seembarazo clínico, así como un aumentodel aborto de primer trimestre, siendo latasa de aborto global superior a la de losciclos de FIV/ICSI con resultado de -HCGnegativa en el ciclo en fresco. Noobstante, ninguno de estos resultadosfue estadísticamente significativo.

En el grupo de los pacientes de donaciónde ovocitos se observó un efecto similaren cuanto a la tasa de abortos del primer

trimestre, produciéndose un incrementosignificativo de éstos en los ciclos de CTque provenían de ciclos en fresco conabortos, respecto a los provenientes deβ-HCG negativa (p=0.020). Sin embargo,y a diferencia del grupo de FIV/ICSI,también observamos un descenso en latasa de embarazo clínico (p= 0.062) trascomparar estos mismos grupos.

CONCLUSIONES:

Existe una tendencia al aumento de lasposibilidades de éxito tras CT cuando elciclo de FIV/ICSI en fresco ha tenido comoresultado implantación embrionariaaunque se haya producido un aborto,bien sea bioquímico o clínico. En cuanto alos ciclos de CT tras donación de ovocitos,se observa un mejor pronóstico en el casode que el ciclo en fresco haya tenido comoresultado -HCG negativa. Esto podría serdebido al aumento en la tasa de abortodel primer trimestre cuando se producenabortos previos en fresco, sugiriendo queexisten otros factores que influyen en laevolución favorable del embarazo y queno están relacionados directamente conel embrión.

El análisis de un número de casos mayornos permitirá validar estos resultados.

INTRODUCCIÓN:

El factor etario junto a una FSH elevadason algunas de las limitaciones que

presentan no pocas mujeres en un ciclo.Si además se añade un factor masculino,las posibilidades de que haya un pobreresultado son muy elevadas. En los

pocos casos en los que sólo se recupera 1ovocito tras la punción, se podríaplantear la duda de si merece la penaseguir adelante con el proceso.


103: PRONÓSTICO DE LOS CICLOS DE CRIOTRANSFERENCIA ENFUNCIÓN DEL RESULTADO DEL CICLO EN FRESCOA. Rodríguez-Arnedo, J. Ten, J. Guerrero, M. A. Carracedo, R. Bernabeu.Instituto Bernabeu, Alicante

104: ¿MERECE LA PENA REALIZAR UN CICLO CON 1 SOLO OVOCITOJ. A. Gragera, M. C. Cañadas, C. Urda, V. Badajoz, S. Camacho, M. De La Casa, A. R. Díaz, I. Lozano, L. Martínez, J. Gijón, M. Alcaraz, R.Bonache, J. Rodríguez, C. Pérez, A. Martínez de Arenaza.GINEFIV, Madrid



Con este estudio intentaremos determinarla rentabilidad de dichos ciclos.


Análisis retrospectivo sobre los ciclosrealizados en Ginefiv, entre enero 2006 ydiciembre 2008, con resultado de 1ovocito/punción.

Se descartaron los ovocitos atrésicos,pero sí se contabilizaron los que estabaninmaduros. Se utilizó el protocolo deASEBIR en la clasificación embrionaria1.

RESULTADOS:

Se analizaron 97 ciclos de 96 pacientes (1paciente realizó 2 ciclos con un únicoovocito) con edad media 37,86 ± 4,26 añosy FSH 9,73 ± 4,88 (UI/l); la media defolículos puncionables (FP) fue de 3,94 ±4,61 y sólo el 18,56% (18) tenían 1 FP en elúltimo control pre-punción. Seprogramaron 87 ciclos con microinyecciónespermática (ICSI), y 10 con fecundación“in Vitro” convencional (FIV); pero en 21de los ciclos de ICSI se observó que elovocito estaba inmaduro (15 en M-I y 6 enP-I). Sólo 7 evolucionaron en incubación,por lo que se realizaron 73microinyecciones (68 ICSI y 5 TESE+ICSI).

La muestra de semen procedía de lapareja en un 93,98% de los casos (78) yfue de donante en 5 ciclos (6,02%). Elsemen era criopreservado en 14 casos(16,87%) y fresco en 69 (83,13%).

Para la mayoría de las pacientes suponíasu primer ciclo: 56,7% (55).

Los resultados se presentan en lassiguientes tablas:

CONCLUSIÓN:

Aunque según la bibliografía2 con unúnico ovocito maduro es aconsejable larealización de ICSI, según nuestrosdatos, pese al tamaño de la muestra, nohay diferencia significativa entremicroinyección y FIV convencional(52%-40% p: 0,47) pero no es apropiadala inyección de ovocitos madurados “inVitro” (0% fecundación).

Por otro lado, hasta el 6,19% (6) deestos ciclos evolucionó en embarazo atérmino, por lo que deberían ser lasparejas, clara y exhaustivamenteinformadas de sus posibilidades, las que

deberían decidir si merece la pena seguiradelante con el ciclo al recuperar unúnico ovocito tras la punción.

BIBLIOGRAFÍA:

1.- Cuadernos de Embriología Clínica.ASEBIR. II.- Criterios de ValoraciónMorfológicos de Oocitos, Embrionestempranos y Blastocistos Humanos.Comisión de Trabajo ASEBIR. Coordinadores:M. Ardoy y G. Calderón. Madrid. 2007.

2.- Comparing intracytoplasmic sperminjection and in Vitro fertilization inpatients with single oocyte retrieval. GozlanI et al. Fertil Steril. 2007 Mar; 87(3):515-8.

INTRODUCCION:

El éxito de los programas deReproducción Asistida es conseguirgestación reduciendo el número degestaciones múltiples.

La práctica habitual es la transferenciaen día 2 ó 3 de cultivo. Para aumentar latasa de implantación, se tiende aaumentar el número de embrionestransferidos en edades medias.

El cultivo hasta blastocisto proporciona

una selección embrionaria, reduciendoel número de embriones a transferir,consiguiendo disminuir el número deembarazos múltiples.

Realizamos estudio prospectivo paradeterminar si las transferencias en día 3

200

Tabla 1: Factor masculino

Tabla 2: Inseminación

Tabla 3: Causas de no fecundación.

Tabla 4: Transferencias

Tabla 5: Embarazos

105: ESTUDIO COMPARATIVO DE TRANSFERENCIAS EN DÍA +3FRENTE A DÍA +5 EN CASOS SELECCIONADOSM. Hebles, M. Dorado, B. Migueles, M. González, L. Aguilera, J. Lara, A. Rodríguez, F. Sánchez, P. Sánchez.Clínicas Ginemed, Sevilla



ó 5 tienen diferencia significativa en lastasas de implantación, estudiando almismo tiempo qué factores afectan.


Se realiza estudio prospectivo a 114parejas que acudieron a la ClínicaGinemed para realizar un ciclo deFecundación in Vitro entre septiembrede 2008 y abril de 2009.

Los pacientes fueron randomizados endos grupos según se realizara latransferencia en día 3 o 5 de cultivo:

Grupo Estudio: incluye un total de 60pacientes en los que se realizó latransferencia en día 5 de desarrollo.

Grupo Control: incluye un total de 54pacientes que fueron transferidos en día3 de desarrollo.

Los embriones fueron cultivados enFertilization medium (SAGE) y CleavageMedium (SAGE) hasta el día 3 dedesarrollo. El día 3 son cambiados aBlastocyst medium (SAGE) hasta el díade la transferencia.

La transferencia embrionaria, tanto endía 3 como en día 5 se realizó utilizando

Blastocyst medium (SAGE) suplementado.

El número de blastómeras, simetría ygrado de fragmentación fueronevaluados diariamente.

Los criterios de inclusión en este estudiofue la existencia de 5 o más embriones conal menos 7 u 8 células en día 3 dedesarrollo y una fragmentación < del 20%.

Los blastocistos fueron graduados deacuerdo al sistema de Gardner andSchoolcraft, según el grado deexpansión.

El análisis estadístico revela la noexistencia de diferencia significativa enla edad de las pacientes ( 33.30 vs33.46), el protocolo de estimulación y elgrosor endometrial entre ambos grupos.

RESULTADOS:

En la Tabla 1 observamos que aplicandola prueba de Mann-Whitney observamos

diferencia significativa en la tasa degestación entre ambos grupos:

Aplicando la prueba de Kruskal-Wallis noobservamos diferencia en relación alprotocolo utilizado (p=0.25) ni respectoal grosor endometrial (p=0.28) entreambos grupos.

CONCLUSIONES:

El cultivo largo al estadio de blastocistopuede ser una herramienta útil en losprogramas de Reproducción Asistidapara disminuir el número de embriones atransferir sin bajar por ello la tasa deimplantación.

Con los resultados mostrados en nuestroestudio, el grupo de pacientestransferidos en estadio de blastocistopresenta mayor tasa de implantaciónque el grupo con transferencia en día +3.

INTRODUCCIÓN:

Aunque se ha intentado correlacionarpatologías seminales con distintosproblemas de salud y hábitos socialescomo el consumo de alcohol y tabaco ocon factores ambientales como lacontaminación o el manejo depesticidas, no existen prácticamenteestudios que analicen una posiblerelación entre los parámetrosbioquímicos rutinarios de un análisissanguíneo y los valores del seminogramapara un mismo paciente.

En este trabajo nos hemos propuestoanalizar la posible correlación entre 10parámetros obtenidos del suerosanguíneo de pacientes de reproducciónasistida con cuatro de los parámetrosbásicos de un seminograma (volumen,concentración, movilidad y REM).


Para este estudio se utilizaron 100pacientes de reproducción asistida queacudieron al centro IERA entre los años2008 y 2009 y que fueron informados del

proyecto. Las muestras de semen seobtuvieron por masturbación en elcentro y se analizaron en el laboratorioparámetros macro y microscópicos antesde una hora. También se les realizó unaextracción de sangre (siempre a lamisma hora) que posteriormente secentrifugó a 700 G durante 10 min y lafracción sérica se mantuvo refrigeradahasta el momento de su análisisbioquímico, siempre antes de 1 semana.Para el análisis de los parámetrosbioquímicos se utilizo un robotautomatizado (RAL) siguiendo las


106: RELACIÓN ENTRE PARÁMETROS BIOQUÍMICOS SÉRICOS YPARÁMETROS SEMINALES EN PACIENTES DE REPRODUCCIÓNASISTIDAJ. R. Ortiz de Galisteo, L. Subías*, N. Toledo, V. Gallego, M. Á. Fajardo, I. S. Álvarez.Instituto Extremeño de Reproducción Asistida (IERA). Badajoz. * Laboratorio de Análisis Luis Subías. Villafranca de los Barros.



instrucciones del fabricante. El análisisestadístico se llevo a cabo medianteestimaciones MCO (Mínimos CuadradosOrdinarios) utilizando un softwareespecífico (GretL).

RESULTADOS:

En un primer abordaje de los datosobtenidos, no hay una relación directaentre la mayoría de los parámetrosbioquímicos analizados y la calidad delsemen en los pacientes. Sin embargo,existe una regresión linealestadísticamente significativa (p<0.01)entre volumen y glucosa de forma que amedida que se incrementa laconcentración de glucosa disminuye elvolumen de eyaculado.

Otros dos indicadores presentan uncierto grado de correlación conparámetros seminales aunque conmenor significación (p<0.05); lacreatinina tiene una correspondencianegativa con el volumen y movilidadprogresiva (a+b), es decir, a mayorconcentración de creatinina, menorvolumen y movilidad; la aspartatoaminotransferasa la presenta positiva,aumentando la concentración deespermatozoides por ml según seincrementa la concentración de estaenzima. Curiosamente, no hemosencontrado relación entre ninguno delos valores bioquímicos y el REM.

CONCLUSIONES:

En este trabajo se presentan datospreliminares que parecen indicar unarelación entre algunos parámetrosbioquímicos y la calidad del semen. Enconcreto, un aumento de glucosa podríasuponer una disminución en el volumen,mientras que la creatinina influyetambién en éste y en la movilidad. Porotra parte, la presencia de algunasenzimas puede influir en laconcentración espermática, como ocurrecon algunas transaminasas. En cualquiercaso, se necesitan más estudios paraestablecer una relación clara entre labioquímica sanguínea y los valores delseminograma.

INTRODUCCIÓN:

En tratamientos de InseminaciónArtificial generalmente se consideracomo condición para su realización, larecuperación mínima de 3 millones deespermatozoides móviles progresivos,sin embargo hay casos en los que el díade la inseminación intrauterina seobtiene menos del Recuento deEspermatozoides Móviles Progresivos(REM) del estimado previamente en eldiagnóstico.

OBJETIVO:

Nuestro objetivo es comparar en lostratamientos de Inseminacionesartificiales intrauterinas, los resultadosclínicos obtenidos de tasa de gestaciónen función del Recuento deEspermatozoides Móviles Progresivosconseguidos.

MATERIALES Y MÉTODOS:

En nuestro trabajo presentamos unanálisis retrospectivo en el que seincluyen 300 ciclos de Inseminacionesintrauterinas, realizadas en la clínicaIVI-VIGO durante el 1 de enero de 2006hasta 31 diciembre de 2008.

RESULTADOS:

se incluyen 300 ciclos de IA con unatasa total de gestación del 24.3%. Latasa de embarazo en ciclos donde sehan transferido entre 1 y < 3 millonesde espermatozoides es del 19,04%, latasa gestacional cuando se transfieren

entre 3 millones y < 8millones, de de30,08% y cuando se transfieren >8millones de espermatozoides móviles esde 20,51.

CONCLUSIONES:

nuestros resultados indican que inclusocuando se transfieren menos de 3millones de espermatozoide móvilesprogresivos, obtenemos una buena tasade gestación, lo que nos hace concluirque no se aconseja abortar la realizaciónde una inseminación artificial si seobtienen menos del REM recomendado ala hora de la inseminación.

202

107: TASA DE GESTACIÓN DE INSEMINACIONES ARTIFICIALES ENFUNCIÓN DEL RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES MÓVILESPROGRESIVOS. IVI-VIGO

D. Pabón, N. Torres, M. Martínez, S. Portela, E. Muñoz.IVI, Vigo



INTRODUCCIÓN:

Se entiende como trazabilidad aquellosprocedimientos preestablecidos yautosuficientes que permiten conocer elhistórico, la ubicación y la trayectoria deun producto o lote de productos a lolargo de la cadena de suministros en unmomento dado, a través de unasherramientas determinadas. El RealDecreto 1301/2006, que regula todo loconcerniente al funcionamiento deBancos de Células y Tejidos Humanosestablece la obligatoriedad de latrazabilidad de las células, así como delos productos y materiales que entren encontacto con dichas células. Dentro dellaboratorio de reproducción elmantenimiento de la trazabilidad es máscomplejo en el caso del Banco de semen,ya que además de lo comentadoanteriormente, la información debeestar disponible para otros laboratoriosusuarios del Banco de semen.

Se ha tratado de establecer un modelode Informe de Trazabilidad para

muestras de semen de donante. Ademáshacerlo visualizable a través de Internetpara los Centros de Reproducciónautorizados a los cuales e lessuministran muestras.


El informe de trazabilidad se haestablecido a través de la página web deCEIFER, www.ceifer.com. Se han debidoinformatizar todos los datosconcernientes a producción demuestras, pruebas analíticas del procesode selección de donantes, así los datosrelativos a información de embarazos yresolución de estos. Se hace uso deconexiones seguras a través de SSL y deCertificados Digitales emitidos porEntidad Certificadora.

RESULTADOS:

Se ha conseguido a través de la páginaweb establecer una zona de usuarios. Laemisión e instalación de un certificadodigital nos permite realizar conexiones

seguras y nominadas con los usuariosautorizados. Sólo están autorizados losCentros de Reproducción clientes delBanco de semen y sólo para visualizacióndel informe de trazabilidad de lasmuestras pedidas y recibidas por suCentro. El Centro podrá ver informe queconsta: Productos y fungibles utilizadospara los procesos de congelación,Aparataje utilizado para congelación,Aparataje utilizado para transporte,Informes de analíticas de los procesos deaceptación de donantes, Notificación deembarazos y resolución de estos a travésdel mismo método.

CONCLUSIONES:

Hemos establecido un sistema quepermite poner a disposición delaboratorios usuarios de banco desemen informes que garantizan latrazabilidad de las muestras de semencongelado de donante.

INTRODUCCIÓN:

La calidad seminal es un factor quepreocupa mucho en nuestra sociedad.Los hábitos de vida actuales (stress,sedentarismo, tóxicos…) parecendeterminantes en dicha calidad. Coneste trabajo pretendemos analizar si laactividad laboral influye en losparámetros estudiados. Para ellorealizamos un estudio retrospectivo conlos datos que disponemos de pacientesque han acudido a nuestra Unidad de

Reproducción Asistida hasta diciembrede 2008. Nuestro objetivo es valorar si lacalidad seminal de nuestros pacientes seve condicionada por la profesión quedesempeñan.


Hemos clasificado las diferentesprofesiones en cuatro grupos de riesgo:

Posible elevación de la Tª testicular:aquellos profesionales que pasan mucho

tiempo sentados (p.e. trabajos deoficina, conductores de vehículos…) ytrabajos en los que la temperaturaambiente sea más elevada (p.e.fundiciones, panaderías…)

Posible exposición a agentes tóxicos:pesticidas, pinturas, barnices,trabajadores industria química…

Posible stress excesivo: profesionesrelacionadas con la docencia y diferentescuerpos de seguridad.

108: TRAZABILIDAD EN LABORATORIO DE REPRODUCCIÓN: BANCODE SEMEN

J. P. Ramírez, J. L. Del Pico, A. Yoldi, A. Vaquero, J. A. CastillaCEIFER S.L., Granada

109: INFLUENCIA DE LA ACTIVIDAD LABORAL EN LA CALIDADSEMINAL EN PAREJAS CON PROBLEMAS DE ESTERILIDAD

L. Rodríguez, M. Mandiola, A. Guembe, M. Soubelet, K. Carbonero, F. Atutxa, Y. Alvarez, A. García-Barberena.Hospital Quirón Donostia. Unidad de Reproducción Asistida. San Sebastián.




Grupo control: profesionales que notienen un riesgo identificado.

Estudiamos mediante análisisestadísticos con el programa SPSS untotal de 1692 casos. Los casos dedistribuían de la siguiente manera:

Analizamos las siguientes variables:

volumen de eyaculado.

concentración de espermatozoides (spz).

nº total de espermatozoides en eyaculado.

porcentaje de espermatozoidesprogresivos totales a+b.

porcentaje de espermatozoides vivos(Hos Test).

Porcentaje de espermatozoides conmorfología normal.

RESULTADOS:

Los resultados obtenidos se resumen en

la siguiente tabla:

- La edad media del grupo de Tª elevaday del grupo stress son significativamentemayores que en el grupo control.

- El volumen medio de eyaculado delgrupo de tóxicos es significativamentemayor que en el control.

- Hay diferencias significativas entre elgrupo stress y el grupo control, siendo elvolumen medio significativamentemenor y la concentración media deespermatozoides significativamentemayor en el grupo stress.

CONCLUSIONES:

A pesar de observar diferenciassignificativas entre el grupo stress y elgrupo control en el volumen medio deeyaculado y en la concentración mediade espermatozoides, pensamos que louno compensa lo otro, ya que no se

observan diferencias significativas en laconcentración total de espermatozoidesen el eyaculado.

Como no observamos diferenciassignificativas en el número total deespermatozoides, ni en el porcentaje deespermatozoides progresivos a+b entreninguno de los grupos estudiados,concluimos que la profesión del pacienteno es clínicamente relevante.

No obstante, no podemos descartar queotros agentes específicos no estudiadosaquí puedan tener un efecto directo endicha calidad.

Nuestra conclusión definitiva es que nila elevación de la Tª testicular, niexposición a agentes tóxicos, ni el stressexcesivo van a causar a priori una peorcalidad seminal en los varones queacuden a nuestra Unidad deReproducción a consulta de esterilidad.

INTRODUCCIÓN:

Al igual que la viabilidad de losespermatozoides utilizados para ICSI escrucial, también el origen de losespermatozoides puede ser un factorlimitante. En la bibliografía se reporta

que la motilidad de los espermatozoidesinyectados y su origen testicular oeyaculado es un factor predictivoimportante en términos de fecundación,embarazo y tasa de gestación, aunqueno se reportan diferencias significativasen los valores resultantes. Así mismo, el

uso de espermatozoides testicularespara ICSI está indicado exclusivamenteen pacientes azoospérmicos.


Estudio descriptivo retrospectivo de

204

110: RESULTADOS TRAS ICSI EN MUJERES CON FUNCIÓN REPRODUCTORANORMAL. ¿INFLUYE EL ORIGEN DE LOS ESPERMATOZOIDES?

M. de la Orden, I. Peinado, P. Torres, J. Morera, J.M. Rubio, A. PellicerServicio de Ginecología y Reproducción Humana. Hospital Universitario La Fe. Valencia



2754 ciclos realizados entre enero de2005 y abril de 2009 en el Servicio deReproducción Humana del HU La Fe deValencia. Se analiza la tasa de gestación ytasa de aborto dependiendo del origen delos espermatozoides (eyaculado,testículo y epidídimo) de mujeresdiagnosticadas con Función ReproductoraNormal a las que se les practicó la técnicade ICSI. Para el análisis estadístico seutilizó el SPSS 15.0 (Se ha realizado unChi cuadrado (p>0.05) resultando p valorigual a 0.098)

RESULTADOS:

El análisis estadístico de la muestra revelauna media de edad de las mujeres de

33.87±3.42 y los hombres de 36.21±4.83con un REM medio de 23.94±23.82. Seevidencia la no existencia de diferenciassignificativas respecto a la tasa degestación y tasa de aborto dependiendodel origen de los espermatozoides deeyaculado frente a espermatozoides deorigen testicular que incluyeespermatozoides de testículo y epidídimo(31.7% vs. 41.8% p valor 0.059). La tasade gestación en el grupo de pacientescriptozoospérmicos comparada con latasa de gestación con espermatozoides

de epidídimo y de testículo es 24% vs.30.8% vs. 48.1% y se obtienen diferenciassignificativas respecto al grupo detestículo (p valor 0.011).

CONCLUSIONES:

La elevada tasa de gestación en el grupode espermatozoides testiculares podríaexplicarse según la bibliografía ya que laincidencia de fragmentación de DNA esmenor con espermatozoides testicularescomparado con eyaculado. Si bien escierto que no se observan diferencias enla tasa de gestación y aborto según elorigen del gameto masculino, cuandoacotamos los resultados en el eyaculadoal grupo de pacientes criptozoospérmicos(concentración <1mill spz/ml) y lacomparamos con la tasa de gestación conespermatozoides de epidídimo y detestículo se obtienen diferenciassignificativas respecto al grupo detestículo. A la vista de los resultados yen pacientes seleccionadas el uso de spztesticulares para IVF/ICSI podríaconsiderarse incluso cuandoespermatozides móviles se identificanen el eyaculado.

INTRODUCCIÓN:

En el año 2007 ASEBIR elaboró unaclasificación embrionaria, basada en lacalidad y capacidad de implantación delos preembriones, en la que seestablecen 4 categorías (A: óptimacalidad; máxima capacidad deimplantación; B: buena calidad; elevadacapacidad de implantación; C: regularcalidad; posibilidad de implantaciónmedia; D: mala calidad; posibilidad deimplantación baja). Tras su publicaciónhan sido varios los grupos que hanevaluado la eficacia de esta clasificacióntras su aplicación en el laboratorio(Torelló et al., 2006; Ten J. et al., 2007).El objetivo de este trabajo es verificar lavalidez de esta clasificación embrionariadesde nuestra propia experiencia.


Se trata de un estudio retrospectivo enel que se comparan las tasas deembarazo clínico e implantación de lascategorías de clasificación embrionariaASEBIR. Se llevaron a cabo un total de184 transferencias puras, sin mezcla deembriones de distintas categorías,procedentes de ciclos FIV/ICSIrealizados en nuestro centro desdeEnero de 2008 a Marzo de 2009. Seexcluyen los ciclos de donación deovocitos. El análisis estadístico fuellevado a cabo con el paquete SPSS.

RESULTADOS:

La edad materna y paterna y el númeromedio de embriones transferidos encada categoría fueron homogéneos. Lastasas de embarazo clínico fueron lassiguientes: A: 45.6%, B: 39.2%, C:20.8% y D: 17.1%, habiendo diferencias

estadísticamente significativas entre lacategoría A con la C y con la D y lacategoría B con la D. Por su parte, lastasas de implantación fueron: A: 34.1%,B: 33.3%, C: 16.3% y D: 11.1%,encontrándose diferencias significativasentre la categoría A con la C y con la D yla categoría B con la C y con la D. Cuandoconsideramos una tasa de implantacióndel 100% más el 0% dentro de cadacategoría, observamos que las tasas deimplantación fueron: A: 28,0%, B:26,7%, C: 8,3% y D: 4,4%, habiendotambién diferencias significativas entreA con C y D y B con C y D. Solamente el5,8% de los embriones tipos A y Bconsiguieron implantar.

CONCLUSIONES:

Nuestros datos indican que losembriones catalogados como A y B


111: EXPERIENCIA DE LA CLASIFICACIÓN EMBRIONARIA ASEBIR ENEL INSTITUTO BERNABEU DE CARTAGENA

C. Pérez, M. Pérez, F. Araico, R. Bernabeu, J. TenInstituto Bernabeu, Cartagena, Murcia



presentan posibilidades similares deimplantar. Lo mismo ocurre con losembriones C y D, los cuales no difierenen su capacidad implantatoria.

La clasificación embrionaria de ASEBIRnos permite, por tanto, discernir losembriones óptimos de los de malacalidad, pero no “afina” en discriminarlos óptimos de los buenos y los regulares

de los malos. Un nuevo análisis conmayor número de casos nos permitirávolver a evaluar los criterios ASEBIR yvalidarlos.

INTRODUCCIÓN:

El resultado de los ciclos FIV/ICSI dependede variables relacionadas con la pareja(edad de la mujer, causa de esterilidad,etc.) y de otras variables que dependenlos tratamientos de estimulación de laovulación (tipo, dosis, etc.), existiendocontroversia sobre si la duración de dichostratamientos se relaciona con losresultados de FIV/ICSI.

En este estudio nos proponemos conocerlos resultados de ciclos de fecundaciónin vitro (FIV-ICSI) en función a los díasde estimulación.


Se han analizado los resultados de 910ciclos de inducción de la ovulación porcausa masculina, tubárica o esterilidad deorigen desconocido en mujeres de 35 añoso menos en nuestro Hospital entre los años2006 y 2008, distinguiendo 3grupos:

-< 10 días de estimulación (8±1,2): 372 ciclos

-entre 10 y 14 días de estimulación(11,24±1,2): 508 ciclos

->14 días de estimulación (16,9±2,7): 30ciclos

Los resultados se analizan por separadoen función a si se trata de ciclos conanálogos o con antagonistas.

RESULTADOS:

De los 755 ciclos con análogos, en 298 laestimulación duró menos de 10 días, en434 duró entre 10 y 14, y en 23 duró másde 14 días. Las tasas de gestación fueronpara cada grupo respectivamente:

-gestación por ciclo: 24,2% vs. 23,3%vs. 17,4%

-gestación por punción: 33,6% vs.25,8% vs. 20%

-gestación por transferencia: 38,3% vs.30,3% vs. 20%

De los 155 ciclos con antagonistas, en 74la estimulación duró menos de 10 días,

en 74 duró entre 10 y 14 días, y en 7 durómás de 14 días. En los 7 ciclos con másde 14 días no se consiguió ningúnembarazo. Para los otros dos

-grupos, las tasas de gestación fueronrespectivamente:

-gestación por ciclo: 31,3% vs. 25,7%

-gestación por punción: 35,9% vs.26,7%

-gestación por transferencia: 41,8% vs.28,8%

No hubo diferencias estadísticamentesignificativas entre los 3 grupos deestimulación.

CONCLUSIONES:

A partir de 15 días de estimulación, losresultados empeoran considerablemente,aunque sería necesario un mayor númerode muestra para obtener diferenciasestadísticamente significativas. No seencuentran diferencias entre los gruposde <10 días y de 10-14 días.

INTRODUCCIÓN:

En las unidades de ReproducciónHumana es imprescindible mejorar los

conocimientos sobre el potencial deimplantación de los embriones parapoder elegir los realmente mejores antesde su transferencia. A través de la

valoración de sus característicasmorfológicas podemos establecer unranking que permita su selección deforma que se reduzcan las tasas de

206

112: INFLUENCIA DE LOS DIAS DE ESTIMULACIÓN EN LOSRESULTADOS DE ICSIA. Fernández, R. P. Cotarelo, A. Clavero, R. Ruiz de Assin, S. Zamora, J. Fontes, M. Roldán, R. López-Jurado.U. Reproducción Hospital Virgen de las Nieves, Granada

113: CALIDAD EMBRIONARIA: UNA PROPUESTA METODOLOGICAPARA SU MEDICIÓN Y EVALUACIÓNI. Molina, A. DebonUnidad de Reproducción Humana. Hospital Universitario La Fe, Valencia



embarazos múltiples sin disminuir lastasas de gestación.

MATERIAL Y METODOS:

En el presente trabajo se realiza unestudio retrospectivo de 5242 ciclos deFIV-ICSI con transferencia de 1, 2 o 3embriones en día 2 realizados en laUnidad de Reproducción Humana denuestro centro desde enero de 2003hasta enero de 2007. Los embriones seclasificaron en función del número decélulas con valores 2, 3, 4, 5 y 6 y elgrado de fragmentación y simetría delas blastómeras con valores 1, 2, 3 y 4.El destino exacto o potencial deimplantación de cada embrión solo sepuede conocer en las gestacionessimples de un solo embrión transferido,en las gemelares de dos embrionestransferidos o en las triples de tresembriones transferidos. Por esta razónde los 5242 ciclos considerados seseleccionaron las mujeres que noconsiguieron gestación conindependencia del número deembriones transferidos (1, 2 o 3embriones; n= 3577) y las queconsiguieron gestación con el mismo

número de sacos que de embrionestransferidos (n= 326).

RESULTADOS:

De los resultados del modelo se deduceque el paso de 2 a 3 células no produceincremento significativo en el logit de laprobabilidad y por tanto pueden unirse enuna misma categoría, lo mismo puededecirse del grado 2 respecto del 1. De laecuación de nuestro modelo puedeobtenerse una puntuación asociada acada combinación de variablesembrionarias que nos permite ordenarlosen base a su calidad medida en términosde implantación, el cálculo delembrionary quality index (EQI)correspondiente a cada mujer se realizapor suma de dichas puntuaciones. Lavalidación de nuestro modelo en el totalde los datos se ha realizado mediante lacurva de ROC que proporciona unarepresentación global de la exactitud delmétodo. El efecto del embrionary qualityindex (EQI) y la edad de la mujer sobre laimplantación se evaluó utilizandogeneralised linear models (GLM) withcontinuous predictors. La metodologíaaquí empleada nos ha permitido no tener

que realizar trasformaciones en lasvariables e identificar diferencias entrevalores de la variable, lo que simplifica elmodelo a la vez que supone una ventajafrente a las propuestas de otros autores.

CONCLUSIONES:

Sugerimos una puntuación de losembriones incorporando sólo dosvariables que permite optimizar laselección de los embriones, sobretodoen casos dudosos donde no poseemosembriones de 4 células grado1. Tantonuestra metodología como losresultados mejoran los ya obtenidos porotros autores. En conclusión, nuestromodelo proporciona una herramientaque permite tomar decisiones rápidas enel momento de elegir los mejoresembriones para su posteriortransferencia. Además hemos propuestola curva ROC como herramienta gráfica yel valor AUC como medida numérica parala validación y comparación de distintosmodelos. Este modelo puede tambiénser utilizado en aquellas bases de datosen las que, al igual que la nuestra, lasvariables igualdad y simetría estánagrupadas en la variable grado.

INTRODUCCIÓN:

Objetivos: Determinar si en mujeres conE2 preHCG moderadamente elevado(3000-5000 pg/ml), la probabilidad deconseguir embarazo clínico tras FIV varíaen función del estadio embrionario(D+4/D+5 vs D+3) y otras variablesdefinidas en material y métodos.


Estudio observacional retrospectivorealizado en las Unidades deReproducción de Clínica Vistahermosa

de Alicante y Clínica Virgen de la Vega deMurcia. Se revisan nuestros últimosciclos de FIV/ICSI, excluyendo ciclos dedonación de ovocitos, donación deembriones y criotransferencias. De losciclos iniciales se encontraron 50 con E2preHCG > 3000 pg/ml. De este grupo seseleccionaron 30 ciclos con E2 entre3000 y 5000 pg/ml (no superando lamayoría de ellos los 4000 pg/ml), queconstituyen nuestro grupo de estudio,Grupo A. Y se seleccionó otro grupo comocontrol, Grupo B, constituido por 30ciclos con valores de E2 <3000 pg/ml,aleatorizados. Se analiza : edad, días de

cultivo (D+4/D+5 vs D+3) , días deadministración de progesterona, nº deovocitos MII, nº de embriones obtenidos,calidad de los embriones transferidossegún criterios ASEBIR, nº de embrionestransferidos, % de implantación, %embarazo clínico/transfer, % SHO.Significación estadística: Chi Cuadrado yT de Student.

RESULTADOS:

Los grupos A y B son similares respectoa edad, días de administración deprogesterona, calidad y número de los


114: TRANSFERIR EN D+4/D+5 VS D+3 MEJORA LA TASA DEEMBARAZO CLÍNICO TRAS ICSI EN MUJERES CON E2 PREHCGELEVADO DE DUDOSO PRONÓSTICO IMPLANTATORIO

T. Rubio2, L. Gil1, M. Poveda1, J. Manuel Moreno1, J. J. López-Gálvez1, M. Lloret1, J. Rueda 3, C. Carrascosa 2, E. López2,1Unidad de Reproducción y 3Genética Hospital Clínica Vistahermosa, Alicante y 2Unidad de Reproducción Hospital Clínica Virgen de La Vega, Murcia.



embriones transferidos. El número deovocitos MII recuperados y embrionesobtenidos fue superior en el grupo deestradiol elevado comparado con elcontrol, pero no significativo. Al calcularla tasa de embarazo clínico/transferentre ambos grupos, no observamosdiferencias significativas (grupo A33.3% vs grupo B 23.3%, p>0.05)).Tampoco se han observado diferenciasen la tasa de implantación entre los dosgrupos. Sin embargo, al relacionar latasa de embarazo en función de lavariable días de cultivo dentro denuestro grupo de estudio, grupo A,observamos que al transferir en

D+4/D+5, el grado de embarazo/transfer(41,1%) es superior comparado con eltransfer en D+3 (23%), aunque lasdiferencias no son significativas(p>0,05). En el grupo control esta tasade embarazo/transfer-días de cultivo essimilar (D+4/+5, 25% vs D+3, 22,2%,p>0,05). No hemos observado SHOsevero en ninguna paciente de nuestrosgrupos.

CONCLUSIONES:

La realización de transferenciaembrionaria D+4/D+5 en pacientes concifras de E2 preHCG comprendidas entre

3000 y 5000 pg/mg , comparado contransferir en D+3 , mejora notablementela tasa de embarazo clínico/transfer(41%), aunque no alcanza criterio de significación estadística,probablemente debido a los pocos ciclosanalizados hasta la fecha actual . Estosresultados, sugieren la importancia dediferir la transferencia en uno o dos díasmás de lo habitual en pacientes conestradiol elevado (3000-5000 pg/ml) yde dudoso pronóstico endometrial,sobretodo al comprobar que la calidadde los embriones transferidos en ambosgrupos fue similar.

OBJETIVOS:

Pretendemos mediante una cohorteretrospectiva, analizar los distintosprotocolos de estimulación ovárica quecondujeron a embarazo. Comprobaremossi ciertos protocolos de estimulaciónproducen mayor tasa de embarazo.


Para realizar este estudio disponemos delos datos de la Unidad de ReproducciónAsistida del Hospital Quirón de Valenciareferentes a todas las pacientes que sesometieron a técnicas de fecundación invitro mediante ICSI (Intra-CitoplasmaticSperm Inyection), entre Enero de 2006 yDiciembre de 2008, obteniéndose unembarazo clínico tras el tratamiento. Eneste estudio incluimos 314 pacientes deedades comprendidas entre 27 y 49años, con infertilidad de origentubárico, Sindrome de ovariopoliquístico, endometriosis, falloovárico o esterilidad de origendesconocido como principales causas deinfertilidad. Han sido excluidas delestudio las pacientes con antecedentesde síndrome de hiperestimulaciónovárica, las sometidas a tratamientos

oncológicos, las pacientes con patologíamaterna grave y aquellos pacientescuyos sémenes no fueron obtenidos deeyaculado en fresco.

La cohorte fue dividida principalmenteen dos grupos A y B en función de si lasupresión hipofisaria había sido llevadaa cabo por un antagonista de la GnRH opor un agonista. A su vez, tanto A comoB fueron subdivididas en grupos del 1 al5 dependiendo de si las pacientesrecibieron: 1) FSH recombinante, 2) FSHurinaria ultra purificada, 3) (FSH+LH)recombinante 4) (FSH+LH) urinaria ultrapurificada y 5) FSH+LH mixto.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para analizar los datos se recurrió a unestudio de cohorte retrospectiva. En élse identificó una cohorte expuesta en elpasado a un factor de riesgo (tipo deprotocolo de estimulación ováricacontrolada), y otra cohorte no expuesta.Para comparar los resultados se usó elRiesgo Relativo (RR). Es una medida deasociación en el estudio de cohortes quemide la incidencia en expuestos frente ala incidencia en no expuestos. Cuando elvalor es igual a la unidad lo

consideraremos indiferente. Si essuperior a la unidad diremos que laexposición constituye un factor deasociación positiva, y si es inferior a launidad diremos que la exposición es unfactor de asociación negativa.

Además calcularemos la FracciónAtribuible en Expuestos (FAE), que es elporcentaje de embarazo debido a laexposición y que por tanto seria elporcentaje de nuevos casos de embarazo,entre los expuestos, que perderíamos sino usásemos ese protocolo deestimulación. Dicho factor se calcularestando la incidencia en expuestosmenos la incidencia en no expuestos.

RESULTADOS:

Para los grupos que recibieron LH, tantorecombinante como urinaria, no seobservó asociación positiva. Tampoco enlos grupos mixtos. Sin embargo, sí seobtuvo una asociación positiva en elgrupo de antagonistas de la GnRH querecibió FSH recombinante (RR=1,33) yen los grupos de agonistas querecibieron FSH recombinante (RR=2,53)y FSH urinaria ultra purificada(RR=1.91) y la fracción atribuible en

208

115: ¿INFLUYEN NUESTROS PROTOCOLOS DE ESTIMULACION ENLAS TASAS DE ÉXITO?

C. Olmedo, J. Díaz García-Donato, M. J. Catalá, E. Pau, B. Ramos, M. Benavent, V. Martín.Unidad de Reproducción Asistida Hospital Quirón Valencia



expuestos para estos grupos fue de un8%, 38% y 24% respectivamente.

CONCLUSIONES:

A la vista de los resultados, podemosconcluir que aquellos protocolos deestimulación que incluyen FSHrecombinante para el grupo de agonistasy antagonistas, o FSH urinaria para el

grupo de agonistas producen una mayortasa de embarazo. Además, el no usartales tipos de protocolos implicaría unareducción considerable en el porcentajede nuevos casos de embarazo.

INTRODUCCIÓN:

Objetivos: Disminuir la tasa degestaciones múltiples en los ciclos deFIV-ICSI. Para ello analizamos en esteestudio el impacto que tiene laTransferencia Embrionaria Selectiva dedos embriones (TSE) en las tasas degestación y embarazo múltiple en losciclos de FIV/ICSI.


Se estudiaron retrospectivamente 1998transferencias embrionarias realizadasen nuestra Unidad de Reproduccióndesde enero de 2004 hasta abril de2009. Se analizaron número detransferencias totales, nº detransferencias selectivas, tasas degestación por transferencia y tasas degestación múltiple. Las transferenciasselectivas se llevaron a cabo los años2007 y 2008 en pacientes en primerciclo, menores de 36 años y que teníanmás de 2 embriones de Tipo A. A partirde enero de 2009 se modifican loscriterios de transferencia selectiva demanera que a las pacientes < 33 años, en1º ciclo se transfieren 2 Embrionessiempre, salvo que sean de Tipo D y a las

pacientes de 33 a 37 años en 1º ciclo, 2Embriones Tipo A o B.

RESULTADOS:

Se expresan en la siguiente tabla.

Durante el primer periodo detransferencia selectiva de embriones(TSE inicial 2007-2008) no encontramosdiferencias entre las tasas de embarazopor transferencia ni en las tasas degestación múltiple con respecto a losdatos de los años 2004 a 2006. Sinembargo, cuándo cambiamos loscriterios de transferencia selectiva (TSE

ampliada enero-abril 2009), disminuyensignificativamente, p<0.05, tanto latasa de embarazo por transferenciacomo la tasa de gestaciones múltiple.

CONCLUSIONES:

La aplicación de los criterios ampliadosde TSE se asoció a una significativadisminución de los embarazos múltiples,pero también a un descenso en las tasasde embarazo. No obstante, habidacuenta de las implicaciones delembarazo múltiple, la TSE se debeaplicar con los mencionados criterios.

INTRODUCCIÓN:

La criopreservación terapéutica de semen(CTS) para su posterior utilización en

Técnicas de Reproducción Asistida (TRA) esuna alternativa eficaz para aquellos varonesque van a ser sometidos a tratamientosgenotóxicos y/o esterilizantes.

MATERIAL Y METODOS:

Se estudiaron 70 CTS que acudieron acontrol a los 6, 12 y 18 meses tras


116: TRANSFERENCIA SELECTIVA DE DOS EMBRIONES: NUESTRAEXPERIENCIAR. Mendoza, V. Aparicio; B. Corcóstegui, L. Crisol, A. Expósito, R. Matorras, T. Mnez-AstorquizaUnidad de Reproducción Humana. Hospital de Cruces-Baracaldo. Vizcaya

117: CRIOPRESERVACIÓN TERAPÉUTICA DE SEMEN EN VARONESONCOLÓGICOSI. Molina, C. C. Duque, J. V. Martínez, J. Morera, J. M. Rubio.Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia

a: p<0.05: NO TSE vs TSE inicialb: p<0.05: NO TSE vs TSE ampliadac: p<0.05: TSE inicial vs TSE ampliada



finalizar el tratamiento. Solo seincluyeron las muestras que presentaronespermatozoides móviles en el eyaculadoy se criopreservaron con independenciadel tratamiento oncológico recibido.

Se evaluó la concentración y movilidadde la muestra en el momento de la CTS.Los varones acudieron al primer controla los 6 meses tras finalizar eltratamiento valorándose de nuevo laconcentración y la movilidad de lamuestra. Los varones que fueronazoospérmicos en el primer control,fueron citados 6 y 12 meses después.

RESULTADOS:

En el momento de la CTS 58 varones(83%) presentaron unaoligoastenozoospermia (Concentración <20 millones /ml y movilidad a+b < 50%) y

solo 12 varones (17%) fueronnormozoospérmicos. A los 6 meses definalizar el tratamiento el 36 % de losvarones fueron oligoastenozoospérmicos,el 43 % normozoospérmicos y solo un 21% de los varones presentaron unaazoospermia post tratamiento.

De los 15 varones azoospérmicos 3(20%) recuperaron la fertilidad a los 12meses post tratamiento y los 12restantes seguían siendo azoospérmicosa los 18 meses. De los 12 varonesazoospérmicos, 4 utilizaron la muestracriopreservada para TRA realizándose 8ciclos de ICSI. La edad media de lasmujeres fue de 31.25 años,

obteniéndose una tasa de gestación del25% y una tasa de implantación del11.76%.

CONCLUSIONES:

El estado clínico y emocional del varóninfluye notablemente sobre laconcentración y sobre la movilidad. Sinembargo se observa una mejoraimportante de estos parámetrosseminales a los 6 meses tras finalizar eltratamiento. La tasa de recuperación dela fertilidad es muy elevada hasta los 6-12 meses y no se ve incrementada en loscontroles de los 18 meses.

INTRODUCCIÓN:

Existen numerosos estudios que asocianla transferencia en estadio deblastocisto con un incremento en lastasas de implantación debido,probablemente, a una selecciónembrionaria más objetiva una vez se haproducido la activación del genomaembrionario. Esto permitiría transferirmenos embriones, reduciendo el riesgode embarazo múltiple sin comprometerel éxito del tratamiento. Uno de losinconvenientes del cultivo largo es lasobrecarga de trabajo que supone parael laboratorio ya que, además de sernecesarias un mayor número deobservaciones, hay que pasar losembriones de un medio de cultivo iniciala un medio específico que cubra lasnecesidades metabólicas y nutricionaleshasta el estadio de blastocisto. De formarutinaria este proceso se realiza en el

tercer día de cultivo. En ocasiones, ennuestro laboratorio se lleva a cabo endía 2 con el fin de evitar un exceso detrabajo en momentos puntuales. Elobjetivo de este estudio es evaluar siesta estrategia tiene algún efectonegativo sobre el potencial deimplantación embrionario y las tasas degestación.


Se trata de un estudio retrospectivo enel que se analizan 91 transferencias endía 5 de embriones que previamente sepasaron a CCM® (Vitrolife, Goteborg,Suecia) en día 3 (grupo I, n = 48) oalternativamente en día 2 (grupo II =43)dentro de nuestro programa de FIV/ICSI.Para el análisis estadístico empleamos elpaquete SPSS.

RESULTADOS:

La edad materna (34,40 ± 3,67 vs. 34,02± 4,13), número de ovocitos recuperados(16,58 ± 6,44 vs. 17,42 ± 7,34), númerode embriones que se llevan a cultivolargo (9,75 ± 4,60 vs. 9,02 ± 3,63) y elnúmero de blastocistos formados en día5 (4,74 ± 3,21 vs. 4,68 ± 2,52) fueronsimilares en el grupo I comparados conel grupo II. El número de embrionestransferidos fue mayor en el grupo II(2,05 ± 0,49) que en el grupo I (1,83 ±0,56), aunque no alcanzó significaciónestadística. No se observarondiferencias en los parámetros clínicosmás relevantes, como la tasa de -HCGpositiva (64,6% vs. 65,1%), tasa deembarazo clínico (52,1% vs. 55,8%) ytasa de implantación (40,6% vs. 39,9%).Las tasas de aborto en el primertrimestre entre ambos grupos fueroncomparables.

CONCLUSIONES:

210

118: EFECTO DEL CAMBIO DE MEDIO EMBRIONARIO EN DÍA 2 EN UNPROGRAMA DE CULTIVO PROLONGADO.

J. Guerrero, J. Ten, A. Rodríguez-Arnedo, M. Á. Carracedo, J. Llácer, R. BernabeuInstituto Bernabeu Alicante



El cambio de medio de cultivo desde eldía 2 no supone un estrés metabólicopara el embrión y, por tanto, no afecta alas tasas de éxito. Los criterios

morfológicos en día 2 son tan válidoscomo predictores de la formación deblastocistos como los de día 3. Estotambién proporciona una mayor

flexibilidad a la hora de organizar lastareas del laboratorio.

INTRODUCCIÓN:

La inseminación artificial con semen dedonante anónimo es una técnica dereproducción asistida empleadas desdehace décadas para solventar losproblemas de infertilidadprincipalmente a causa de la presenciade un factor de infertilidad masculinosevero, o en mujeres sin parejamasculina.

Las posibilidades de éxito encontradasen la literatura son muy distintas, perosuelen variar entre un 10% y un 25% porintento, y aproximadamente el 70% detasa de gestación acumulada en 4intentos.

El hecho de que un porcentajeimportante de los tratamientos notengan éxito, así como la alta tasa derechazo de potenciales donantes desemen, que obliga a optimizar lasmuestras de semen disponibles, hacenque sea de gran interés determinar quevalores del semen influyen en losresultados de los tratamientos.

Nuestro objetivo con el presente estudioes determinar que parámetros del semende donante repercuten en lasposibilidades de lograr una gestación eninseminación artificial con semen dedonante.


Estudio de casos y controlesretrospectivo, donde se identificaron ennuestra base de datos informatizadainseminaciones artificiales con semen

de donante, donde se obtuvieron losdatos de los parámetros básicos delsemen, para ser posteriormentecomparados entre los tratamientos quelograron una gestación y los que no.

Se utilizaron tests estadísticos de T deStudent para la comparación de lasmedias de la combinación deconcentración, movilidad, volumen en eltotal de espermatozoides móvilesprogresivos, y del porcentaje de formascon movilidad A+B en fresco y trascapacitar, en ambos días de lainseminación.

RESULTADOS:

de un total de 1587 inseminaciones, seobtuvo gestación en 428 de ellas(26,96%).

CONCLUSIONES:

Si se cumplen unos criterios mínimos paragarantizar las máximas tasas de gestaciónen inseminación artificial con semen dedonante, no hay ningún parámetro delsemen que influya en la consecución deuna gestación desde el punto de vista clínico, aunque el elevado número de casos confirme una diferenciaestadísticamente significativa.


119: CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN DE DONANTE QUE AFECTAN ALOS RESULTADOS DE LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL

A. Zurilla, A. Mencías, C. Rico, Y. Márquez, P. Rodríguez, N. GarridoIVI, Valencia



INTRODUCCIÓN:

Entre los objetivos principales de laMedicina Reproductiva se encuentra lautilización a medio plazo de sistemas máscompletos de valoración de la calidadembrionaria basados en parámetros nomorfológicos. Tecnologías como laproteómica aportan una imagen dinámicade todas la proteínas expresadas por losembriones in Vitro.

OBJETIVO:

Cuantificación simultánea de citoquinas enlos sobrenadantes de cultivos embrionariosmediante el kit High Sensitivity HumanMilliplex TM MAP (Millipore).


Se han analizado 20 muestras (25 μlcada una) de sobrenadante de cultivo deembriones tras 24 horas de incubaciónen el mismo.

Se estudian simultáneamente en elmedio de cultivo la siguiente batería decitoquinas humanas: IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IFNg, GM-CSF y TNFa.

El kit incluye un estándar de cadacitoquina (citoquina stock a unaconcentración conocida, a partir de lacual se realiza una curva estándar), ycomo control de calidad, una mezcla detodas las citoquinas a la concentraciónmínima detectable (QC-1) y máximadetectable (QC-2). Como controlnegativo se ha utilizado el buffer en elque se han diluido las muestras, loscontroles de calidad y los estándares.

La concentración de cada citoquinapresente en la muestra se obtieneextrapolando la fluorescencia emitida enla curva estándar de cada citoquina.

RESULTADOS:

En general, la fluorescencia obtenidapor las distintas citoquinas analizadasha sido muy baja y en la mayoría de loscasos por debajo del límite de deteccióndel ensayo. Tan sólo hemos obtenidovalores cuantificables para lascitoquinas IL-4, IL-5, IL-8 y IL-10.

CONCLUSIONES:

El análisis de citoquinas en elsobrenadante de cultivo de embrionescomo método cuantitativo no invasivopara la selección de embriones esinviable bajo las condicionesexperimentales utilizadas en esteensayo. Debemos seguir investigando enesta línea para desarrollar métodosembrionarios no invasivos ni subjetivospara la evaluación de la calidadembrionaria, que permitan la seleccióndel embrión óptimo para sutransferencia al útero.

INTRODUCCIÓN:

La transferencia de un único embrióncon el fin de minimizar la posibilidad delembarazo múltiple se está volviendoalgo común, pero es menos habitual conembriones descongelados. Se ha vistoque la tasa de embarazo con embrionesdescongelados es mas baja que usando embriones en fresco, sinembargo la transferencia de embrionesdescongelados aumentan la tasa deembarazo acumulativa, reduce los costesy es un proceso mucho más sencillo quese realiza en un periodo de tiempo máscorto comparado con los ciclos enfresco. Por supuesto, se debe disponer de un buen programa decriopreservación de embriones.

Este estudio pretende valorar el númeroóptimo de embriones a transferir enciclos de descongelación, con el fin deminimizar las posibilidades de embarazomúltiple.

MATERIAL Y METODOS:

Se estudiaron retrospectivamente losciclos de descongelación de embrionesrealizados en la Clínica Tambre duranteslos años 2007 y 2008. El criterio para lacongelación fué: al menos 2 blastómerasen día +2, al menos 4 blastómeras en día+3, seleccionando solo aquellos debuena calidad. No se incluyeronblastocistos. Los embriones fueroncongelados con medios Vitrolife(Sweden), y congelador NiCool (Air

Liquide), siguiendo los protocolos delfabricante. La descongelación se realizócon los mismos medios, el mismo día dela transferencia.

El protocolo de ciclo de descongelaciónfué: comenzó con estrógenos(Progynova, Schering 6mg/día) el día 2del ciclo. Se valoró el grosor endometrialel día 8, y se comenzó con laProgesterona (900 mg/día) 2 ó 3 díasantes de la transferencia, dependiendodel día en que los embriones fueroncriopreservados. Se realizó -hCG séricaa los 14 días post-transfer. Si el test deembarazo fué positivo, se continuó conlos estrógenos y progesterona hasta lasemana 14 de embarazo.

120: PROTEÓMICA: UNA PODEROSA HERRAMIENTAA. Expósito1, R. Matorras1, L. Crisol1, R. Mendoza1, D. Nagore2, A. Ametzazurra2

1Unidad de Reproducción Humana, Hospital de Cruces, Barakaldo (Bizkaia) España. 2Proteomika S.L., Parque Tecnológico de Bizkaia, Derio España.

121: TRANSFERENCIAS DE EMBRIONES CRIOPRESERVADOS: ¿CUÁLES EL NÚMERO ÓPTIMO A TRANSFERIR?

C. Luna, B. Péramo, E. Olaya, C. Muñoz, A. García, C. Cordero, S. Cortés, M. Gago, R. Núñez, P. Caballero Peregrín.Clínica Tambre - Madrid

212



RESULTADOS:

Se realizaron 690 descongelaciones, delos que se realizó transferencia en 636(92% de los ciclos).

Se separaron en 3 grupos: Gr. 1(transferencia de 1 embrión); Gr. 2(transferencia de 2 embriones); Gr. 3(transferencia de 3 embriones).

Se realizó un test 2 para comparar losgrupos, el valor de p<0,05 se consideróestadísticamente significativo.

Los resultados obtenidos se muestran enla Tabla 1:

De los 636 ciclos realizados seobtuvieron 195 embarazos (30,7%). Lastasas de embarazo según los embrionestransferidos se muestran en la Tabla 2.Cuando se transfirieron 3 E la tasa deembarazo fue más alta (p<0,05) yademás no se obtuvo ningún embarazotriple. Además, la tasa de gemelares fuesimilar, sin diferencias significativas.

CONCLUSIONES:

Consideramos que en ciclos de cong-descongelación de embriones es unabuena elección, siempre que sea posible,la transferencia de 3 E, ya que aumentala posibilidad de embarazo, mientrasque la de embarazo múltiple es similarque si transferimos 2 E, a la vez que unembarazo triple no ha sido observadohasta el momento.

INTRODUCCIÓN:

Hasta ahora diversas SociedadesCientíficas, como ASEBIR, han tratadode estandarizar criterios a la hora derealizar la evaluación embrionaria, comose hace patente en la publicación de lasdos ediciones del Cuaderno deEmbriología Clínica II. Esto, unido a lapolítica de reducción del número deembriones a transferir para evitar elembarazo múltiple, establece una seriede criterios para la elección del númeroy el tipo de embriones a transferir.

OBJETIVO:

Este estudio pretende llamar la atención

sobre la falta de criteriosestandarizados a la hora de decidir si unembrión debe o no, ser congelado.


Se compararon los resultados obtenidosen el programa español de control decalidad externo de evaluaciónembrionaria, con los de un grupo decinco expertos miembros del grupo detrabajo de calidad embrionaria deASEBIR. Se compararon las imágenes decigotos y embriones en Día 2 y 3 y se lespreguntó, en el caso de los cigotoscuales mantendría en cultivo, congelaríay desecharía; y en el caso de losembriones, cuales transferiría,

congelaría y desecharía. Consideramosque existía acuerdo entre laboratorioscuando más del 75% adjudicaba lamisma categoría a un embrión. Seconsideró que existía acuerdo entreexpertos cuando los cinco coincidían enla misma categoría para un embrión.

RESULTADOS:

Se observa un menor porcentaje deembriones con acuerdo entre loslaboratorios cuando se decide Congelar(30.8%, 8/26) que al Transferir (42.9%,18/42) o Desechar (66.7%, 18/27).

También se observa que el acuerdo entrelaboratorios y expertos en la decisión


Tabla 1. Número de embriones transferidos, y número de sacos gestacionales.

Tabla 2. Tasa de embarazo dependiendo delnúmero de embriones transferidos, y tasa deembarazo múltiple.

122: ¿DEPENDE LA DECISIÓN DE CRIOPRESERVAR UN EMBRIÓN DELOBSERVADOR?R. Ruiz de Assin, J. A. Castilla, B. Romero, S. Zamora, A. Fernández, M. Roldán, R. P. Cotarelo, R. López-Jurado.U. Reproducción Hospital Virgen de las Nieves, Granada



clínica presenta un índice kappa de 0.51(IC: 0.36-0.66) y que existe menoracuerdo a la hora de Congelar unembrión (54.5%, 18/33) que al decidirTransferirlo (78.9%, 30/38) oDesecharlo (72.2%, 13/18).

Cuando no tenemos en cuenta losembriones que se deciden Transferir, loslaboratorios deciden Congelar el 87.5%(21/24) de los embriones clasificadoscomo Regular, mientras que los expertosel 100% (24/24). Además los expertosdeciden Congelar más embriones Malosque los laboratorios (28.0% vs. 4.0%;7/25 vs. 1/25) (p<0.05).

CONCLUSIONES:

La decisión de congelar o no un embrióndepende del observador.

No existe acuerdo entre laboratorios a lahora de decidir qué embriones congelar, ya su vez tampoco se ponen de acuerdocon los expertos que presentan mayortendencia a congelar embriones que notransfieren. Esta diferencia nos llevaría aque las tasas de gestación por ciclocongelado serían porcentualmentemayores en el grupo de laboratorios queen el de expertos, pues los primeroscongelan mejores embriones. Por estocreemos que la manera de evaluar un

programa de congelación embrionariadebería ser analizando la tasa deembarazos por ciclo con embrionesfrescos y congelados de manera conjunta.

También creemos que estas diferenciasen la decisión de Congelar van adepender de la política de cadalaboratorio que estará asociada a losresultados de sus técnicas decongelación/descongelación.

Creemos necesario establecer unasrecomendaciones claras por parte de lasSociedades Científicas sobre queembriones deberían Congelarse y cualesno.

INTRODUCCIÓN:

Los riesgos patológicos tanto maternoscomo feto-neonatal de los embarazosmúltiples han forzado a crear en lamayoría de los centros de reproducciónasistida una política a favor de latransferencia de un máximo de 2embriones. A pesar de seguir estasrestricciones existe un riesgo potencialde gestación triple debido al desarrollode gemelos monocigóticos (GMZ), quepueden derivar tanto de una divisióntemprana del embrión como de unapartición/ fragmentación de la masacelular interna del blastocisto. Se handescrito posibles factores in vitro queincrementan su aparición como lainducción a la ovulación, la inyecciónintracitoplasmática del espermatozoide(ICSI), el cultivo secuencial (CS) y laeclosión asistida (EA).


Estudio retrospectivo en el que seincluye 3055 casos realizados contransferencia de 2 embriones en elHospital Universitario La Fe de Valenciadesde el 1/01/2006 hasta el

31/12/2008, quedando excluidos losciclos de ovodón y criotransferencia. Al27% de los casos se les realizó FIV clásicay al 73% restante ICSI. Otras técnicascomo la EA y el CS se llevaron a caboesporádicamente (0,59% y 0,56%respectivamente).

RESULTADOS:

Se obtuvo una tasa de gestación (latidocardiaco positivo) del 35%, tasa deimplantación de 16% y tasa de niño encasa de 20%. De los 510 casos en los quese logró recién nacido vivo, el 28%resultó en gestación múltiple. En cuatrocasos (1 de FIV y 3 de ICSI) se obtuvierongestaciones triples tras la transferenciade sólo 2 embriones D+2 (tasa de GMZ =0,42%). Las característicasmorfométricas de los embrionestransferidos en D+2 que dieron lugar aGMZ no muestran diferencias con losembriones implantados quedesarrollaron un único feto. (Ver fotos)

CONCLUSIONES:

La tasa de gestación de GMZreferenciadas por algunos autores en la

bibliografía tras la realización detécnicas de reproducción asistida es de0,95% (n=731), superior a la tasaobtenida en este estudio (0,42%). Sinembargo, ésta es comparable a laestimada en las gestacionesespontáneas (0,4%). A partir de estosdatos se puede concluir que tanto laestimulación con gonadotropinas, comola ICSI, no influyen en la divisiónintrauterina del embrión. Por elcontrario, no se puede confirmar sitécnicas como la EA y/o CS tienenrelación con la aparición de GMZ.

214

123: VALORACIÓN DE GESTACIONES GEMELARES MONOCIGÓTICASTRAS TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDAP. Torres, I. Peinado, M. De la Orden, M. Romeu, A. Monzó, JM Rubio, A. Pellicer.Servicio Ginecología (Reproducción Asistida), Hospital Universitario La Fe, Valencia.



INTRODUCCIÓN:

Diferentes estudios han analizado elIndice de masa corporal (IMC) de lasreceptoras de óvulos en un programa deOvodonación. Styne–Gross A et al., en2005 refiere que no existe ningún efectonegativo del elevado IMC de lasreceptoras en la receptividadendometrial y éxito reproductivo,mientras que los estudios publicados porBellver et al., en 2007 revelan que el IMCinterfiere en la receptividad uterina. Sinembargo, no existe en la actualidad,bibliografía de la influencia del IMC delas donantes en las tasas de gestación eimplantación de sus receptoras.

Objetivos: Valorar si el IMC de la donantey receptora, afecta a los resultadosFIV/ICSI en un programa de donación deovocitos.


Estudio retrospectivo realizado en elIVI-Murcia, del 1 de Enero de 2007 al 31de Diciembre de 2007.

El IMC fue calculado automáticamenteusando el programa informático. Lafórmula es peso (Kg)/altura (m2).

Los ciclos fueron divididos en grupossegún el IMC: Menor de 20, entre 20-24.9, entre 25-29.9 y mayor o igual de30. Se excluyeron ciclos de DGP y demujeres mayores de 45 años.

Se estudiaron 205 ciclos: 30corresponden a aspiraciones folicularesde donantes con IMC < 20.Otros 121ciclos correspondieron a donantes conIMC entre 20-24.9.Otros 41 a donantescon IMC entre 25-29.9. Las 12 restantesaspiraciones foliculares pertenecen aIMC ≥ 30.

Los datos referentes al IMC de lasreceptoras de óvulos fueron lossiguientes:

Receptoras con IMC menor de 20 con 7ciclos, pacientes con IMC entre 20-24.9con 114 ciclos, 42 ciclos de pacientes conIMC entre 25-29.9 y 23 pacientescorrespondientes al grupo de IMC ≥ 30.

Se compraron tasas de gestación eimplantación entre los diferentesgrupos.

Los grupos fueron homogéneos encuanto a edad y calidad embrionaria delas receptoras.

El análisis estadístico se realizó con eltest de Chi cuadrado con valorsignificativo cuando p< 0.05.

RESULTADOS:

Un total de 2189 ovocitos fueroninseminados. Las tasas de fecundaciónen los cuatro grupos fueron: 74%,71%,66% y 71% respectivamente con unamedia de 1.9 embriones transferidos enlos cuatro grupos.

Las tasas de gestación por transferenciaen los cuatro grupos fueron:44%,48%,53% y 58% respectivamente.

Las receptoras con IMC entre 20-24.9que reciben ovocitos de donantes con elmismo IMC tienen una tasa de gestaciónde 48.5% y una tasa de implantación de31.2%

Las tasas de implantación fueron:26.4%, 29.7%, 36.9% y 36,4%respectivamente.

En relación al IMC de las receptoras, enel grupo IMC ≤ 20, de los 7 casos seobtuvo un 33.3% de tasas de gestacióny 28.5% en implantación. En el grupo deIMC entre 20-24.9 se valoraron 114casos, con una tasa de gestación de52,7% y 35% de implantación. En elgrupo de IMC entre 25-29.9, con 42casos, se obtuvieron tasas de gestacióne implantación de 51.2% y 30.5%. Elúltimo grupo de receptoras con IMC≥30

las tasas de gestación y de implantaciónfueron 40% y 21.6% respectivamente.

CONCLUSIONES:

Refiriéndose a las donantes, tanto en latasa de gestación como en la deimplantación no se observan diferenciasestadísticamente significativas.

Respecto al grupo de las receptoras conun IMC entre 20-24.9, observamos unatendencia a una óptima receptividaduterina.

Consideramos que debemos continuarcon el estudio a través del aumento deltamaño muestral para llegar a datos másconcluyentes en cuanto a la selección delas donantes de óvulos y determinar siéste grupo son de mejor pronósticoreproductivo en un programa dedonación de ovocitos.

124: ¿AFECTA EL IMC DE LA DONANTE A LOS RESULTADOS FIV/ICSIEN UN PROGRAMA DE DONACIÓN DE OVOCITOS?

A. Sánchez, D. Gumbao, J. Marcos, D. López, J. Landeras, B. AmorochoIVI Murcia




INTRODUCCIÓN:

La cancelación de un ciclo defecundación in vitro (FIV) conlleva unelevado desgaste físico y psicológicopara los pacientes, además del costeeconómico que supone. Cuando nosencontramos ante una baja respuesta ala estimulación ovárica, en lugar deoptar por la cancelación del ciclo,podemos plantear continuar el ciclo y

realizar inseminación artificialintrauterina (IA), una técnica sencilla ymínimamente invasiva.


En este estudio retrospectivo (2007-2009) se evaluaron 41ciclos de IArealizados tras la cancelación de un ciclode FIV. En 30 ciclos se utilizó semen delcónyuge (IAC) y en 11 semen de banco(IAD). De acuerdo al protocolo utilizadoen el Instituto Marquès para bajasrespondedoras, el ciclo de FIV se cancelasi hay menos de 3 folículos con undiámetro ≥ 14 mm tras 8-9 días con

gonadotropinas o después de 4 - 5 díasde tratamiento adicional. Pacientes confactor tubárico bilateral o factormasculino severo fueron excluidas delestudio. Las muestras de semen se

procesaron mediante gradientes dedensidad. La IA se llevó a caboaproximadamente 40h post-hCG. Dossemanas después de la IA se realizó laprueba de embarazo en orina y laconfirmación ecográfíca del embarazo10 días después.

RESULTADOS:

La media de estradiol el día de laadministración de la hCG fue de 554 pg/L

en IAC y 438 pg/L en IAD, con una mediade folículos ≥18mm de 1.5 (0-4) y 1.4 (1-3) respectivamente. En la Tabla 1 seindican los resultados obtenidos en losciclos de IAC e IAD.

Tabla 1

CONCLUSIONES:

Los resultados de este estudio indicanque la IA es una buena alternativa a lacancelación de ciclos de FIV por bajarespuesta, aprovechando así eltratamiento hormonal al que ha sidosometida la paciente. Estos resultadospreliminares deberán confirmarse enuna serie más amplia de casos.

INTRODUCCIÓN:

En el año 2004 ASEBIR creó una comisióncon el fin de unificar criterios devaloración embrionaria entre los centrosde reproducción asistida de España. Paraello, ésta comisión se basó en unarevisión bibliográfica, una encuestamulticéntrica y en la propia experienciade los miembros de la comisión.

Se estableció una clasificaciónembrionaria en 4 categorías:

-Categoría A: embrión de óptima calidadcon máxima capacidad de implantación.

-Categoría B: embrión de buena calidadcon elevada capacidad de implantación.

-Categoría C: embrión con unaprobabilidad de implantación media.

-Categoría D: embrión de mala calidad conuna probabilidad de implantación baja.

En CEFIVA desde el año 2003 clasificamoslos embriones según criterios clásicos

con algunas variaciones, que nospermiten evaluar los embriones endiferentes categorías a partir devaloraciones morfológicas y cinéticasque observamos desde la fertilizaciónhasta la transferencia embrionaria. Asíclasificamos:

-Embrión tipo 1, 2a: embrión de buenacalidad y buena capacidad implantadora.

-Embrión tipo 2b, 3: embrión concapacidad de implantación media.

125: LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL INTRAUTERINA COMOALTERNATIVA A LA CANCELACIÓN POR BAJA RESPUESTA ENCICLOS DE FECUNDACIÓN IN VITROJ. Massó1, A. Busquets1, L. Zamora1, M. López-Teijón1, 2, J. G. Álvarez1, 2. 1Institut Marquès; 2Fundación Leonardo Marquès, Barcelona

126: ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE LA CLASIFICACIÓN EMBRIONARIADE ASEBIR Y NUESTRO SISTEMA DE CLASIFICACIÓN.

L. M. R. Menes, P. Duque, F. Graña, V. Sánchez, M. Vázquez, Y. Ruano, N. Fernández, P. Fernández. P. E. de la Fuente, C. García-Ochoa.CEFIVA (Centro de Fertilización in Vitro de Asturias). Oviedo. Gijón.ANACER (Asociación de Clínicas de Reproducción Asistida)

216



-Embrión tipo 4, 5: embrión de malacalidad y baja capacidad implantadora.


Se trata de un estudio prospectivo desdeenero de 2008 hasta marzo de 2009, deembriones transferidos en ciclos deFIV/ICSI utilizando simultáneamente los2 criterios de clasificación.

Para ello, seleccionamos transferencias enlas que todos los embriones eran decalidad similar, bien sea según nuestraclasificación ó según los criterios deASEBIR, observando que el resto de losparámetros fueron homogéneos encuanto a indicación, edad, dificultad de latransferencia. El análisis estadísticoutilizado fue la prueba de la Chi-cuadrado.

RESULTADOS:

Nuestra clasificación

Clasificación ASEBIR

** p < 0,01

En la siguiente tabla se detalla un grupode transferencias del total, en las que lacalidad embrionaria difería de unaclasificación embrionaria a otra.

Cambio de clasificación de la nuestra ala de ASEBIR:

CONCLUSIONES:

A la vista de éstos resultados podemosconcluir que no existen grandesdiferencias entre una clasificación y otra.Ambas distinguen bien entre embriones debuena y mala calidad, pero al comparar loscasos en los que hay discrepancias entreambas clasificaciones, parece discriminarmejor la calidad embrionaria laclasificación de ASEBIR, por lo que trasestos resultados, debe de ser éste nuestrocriterio a la hora de la selecciónembrionaria.

BIBLIOGRAFÍA:

Cuadernos de embriología clínica. CriteriosASEBIR de valoración morfológica deoocitos, embriones tempranos y blastocistoshumanos (II edición).

INTRODUCCIÓN:

En la última década, diversos estudioshan demostrado que los ciclos de FIV-ICSI en los que se transfieren embrionescon blastómeras multinucleadas tienentasas de embarazo y de implantaciónsignificativamente inferiores que las delos ciclos donde se transfierenembriones sin blastómerasmultinucleadas. Sin embargo, lacomplejidad del tema, sobre todo enrelación con la presencia de una o másde una célula multinucleada, de si la

multinucleación aparece en d+2 o end+3, o de si la célula multinucleada tiene2 o más de 2 núcleos, hace necesarioabordar este parámetro diferenciandoentre estas posibilidades, paradistinguir el potencial de implantaciónde los diferentes embrionesmultinucleados. En este estudio,comparamos las tasas de implantaciónde los embriones que presentan unablastómera binucleada en d+2 vs losembriones que presentan unablastómera binucleada en d+3.


Se analizaron retrospectivamente 111embriones transferidos en ciclos de FIV-ICSI que presentaban sólo unablastómera binucleada, y en los que sedemostró 0-100% de implantación. 68de estos embriones fueron transferidosen d+2 y 43 fueron transferidos en d+3.

RESULTADOS:

En el grupo de transferencias en d+2, delos 68 embriones binucleados


127: COMPARATIVA DE LAS TASAS DE EMBARAZO EN LOS CICLOSEN LOS QUE SE TRANSFIEREN EMBRIONES CON BLASTÓMERASBINUCLEADAS EN FUNCIÓN DEL DÍA DE LA TRANSFERENCIA.

J. Cuadros, L. Andrés Criado, M. Sánchez de Burgos, M. Nieto Sánchez, E. HernándezClínica FivMadrid, Madrid



transferidos, 8 dieron lugar a laformación de un saco gestacional(11,8% de tasa de implantación). En elgrupo de transferencias en d+3, de los43 embriones binucleados transferidos,8 originaron un saco gestacional (18,6%de tasa de implantación). El análisisestadístico mediante chi-cuadradomostró que la diferencia entre las tasas

de implantación en d+2 y en d+3 no esestadísticamente significativa.

CONCLUSIONES:

En este estudio, la tasa de implantaciónde los embriones que presentan sólo unablastómera binucleada en d+2 es másbaja que la encontrada en los embriones

con sólo una blastómera binucleada end+3. Sin embargo, esta diferencia no esestadísticamente significativa, con locual, probablemente, el compromiso delpotencial de implantación por labinucleación afecte de manera similartanto en d+2 como en d+3.

INTRODUCCIÓN:

Los medios de cultivo embrionarioreproducen las necesidades fisiológicasde los embriones en cada etapa de sudesarrollo mediante el aporte denutrientes, oligoelementos y hormonas.Es continúa la investigación acerca de laformulación ideal de dichos medios, yaque pequeñas diferencias en lacomposición, molaridad, pH, etc. de losmismos puede influir en la calidad ysupervivencia embrionaria y por tanto,variar significativamente el resultado deun ciclo de Fecundación In Vitro.

El presente trabajo plantea comoobjetivo la comparación de dos mediosde cultivo embrionarios complejos quepresentan dos casas comercialesdiferentes: Medicult® y Cook®.Valorando el resultado mediante lacalidad embrionaria, tasa de gestación,implantación y aborto.


Estudio prospectivo que incluye 70pacientes a las que se les realizó un cicloFIV/ICSI del 22 de Octubre al 5 deNoviembre del año 2008 en el HospitalUniversitario La Fe de Valencia. Laselección de las pacientes en cada grupode estudio estuvo condicionada por ladisponibilidad de los medios de cultivoutilizados en el trabajo, así se asignó 6días consecutivos para la utilización delos medios del grupo experimental(Cook® n=32) y 4/3 días

antero/posteriores para el grupo control(Medicult® n=38). Los parámetrosrecogidos en el estudio son:características físicas de las pacientes,parámetros básicos de la estimulación,calidad embrionaria y resultado de losciclos. La valoración morfométrica de losembriones se efectuó con el programa deanálisis de imagen CRONUS 3.1.,mientras que el análisis estadístico delos datos se realizó mediante elprograma SPSS 15.0.

RESULTADOS:

Se observa homogeneidad de los gruposcon respecto al diagnóstico deesterilidad de cada uno de los miembrosde la pareja, índice de masa corporal yedad de las mujeres que participan en elestudio, días de estimulación, grosor delendometrio y estradiol el día de hCG,recuento de espermatozoides móviles(REM), nº folículos puncionados,ovocitos recuperados, técnica empleada(FIV/ICSI) y embriones transferidos.

Los resultados no muestran diferenciassignificativas en relación a la Tasa degestación (TG: 40% vs 46%; p-valor =0.408), Tasa de Implantación (TI: 26% vs39%; p-valor = 0.072) y Tasa de aborto(TQ: 19% vs 20%; p-valor = 0.641). Noobstante, se obtienen diferenciassignificativas a favor de los medios deCook® si comparamos la Calidad de losembriones transferidos (clasificaciónrecomendada por ASEBIR (p-valor =0.015)). El análisis estadístico de los

datos morfométricos obtenidosmediante el CRONUS®, señala igualdaden el número de células de los embrionesde ambos grupos, pero mayor área,perímetro y nº de fragmentos en losembriones cultivados con MediCult® vsCook®, llegando esta última diferenciaa ser significativa (p-valor = 0.015).

CONCLUSIONES:

La variabilidad en la TG y TI según elmedio de cultivo utilizado estáextensamente referenciado y losresultados varían según el laboratoriodonde se efectúe el estudio. En elpresente trabajo la utilización de losmedios de CooK® presenta de formasignificativa: una mejor calidadembrionaria y una mayor tasa degestaciones múltiples, sin embargo,esta diferencia no alcanza lasignificación estadística en lo queconcierne a la Tasa de Gestación.Probablemente el aumento del tamañomuestral aclararía estas diferenciasencontradas.

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128: A DEBATE COOK® VS MEDICULT®: CALIDAD EMBRIONARIA YTASA DE GESTACIÓN.I. Peinado, P. Torres, M. De la Orden, T. García-Gimeno, V. Montañana, JM. Rubio y A. PellicerServicio Ginecología (Reproducción Asistida), Hospital Universitario La Fe, Valencia.



INTRODUCCIÓN:

Comparar los resultados obtenidos en laevaluación de la morfología espermáticamediante la técnica tradicional detinción Diff-Quik y la microscopía de altamagnificación.


Material y Métodos: En estudioprospectivo, se analizaron 45 muestrasmediante dos métodos distintos: Diff-Quik y Alta Magnificación.

Se evaluó el porcentaje deespermatozoides normales, en muestrasteñidas y fijadas según técnica Diff-Quik,siguiendo el criterio estricto de Kruguer(400x). Los resultados se compararon conlos obtenidos tras determinar lascaracterísticas morfológicas de la cabezadel espermatozoide mediantemicroscopía de alta magnificación (Leica

AM6000) a 8000x.

Se contaron un total de 100espermatozoides por muestra. Se realizóanálisis estadístico mediante programaPASW Statistics 17.0.

RESULTADOS:

Se dividieron las muestras en dos gruposde comparación:

I) Muestras con morfología normal(>15% de espermatozoides normalessegún la OMS) (n=6):

- Media formas normales mediante altamagnificación: 9.8%

- Media formas normales mediante Diff-Quik: 20.6%

II) Muestras teratozoospermicas (<15%espermatozoides con forma normal) (n=39):

- Media formas normales mediante altamagnificación: 4.1%

- Media formas normales mediante Diff-Quik: 9.4%

En ambos grupos el porcentaje deespermatozoides con formas normalesfue significativamente menor (p=0.05)cuando se realizó el contaje mediantemicroscopía de alta magnificación (AM).

CONCLUSIONES:

La aplicación de la microscopía de altamagnificación a 8000x para el análisisde la morfología espermática es muchomás precisa que el método tradicionalDiff-Quik. Además, la alta magnificaciónes una técnica que permite realizar elcontaje in vivo, no afectando laviabilidad espermática y permitiendo laselección para técnicas in vitro.

INTRODUCCIÓN:

Sabemos que la morfología espermáticainfluye directamente en la calidadembrionaria, y que ésta a su vez serelaciona con una gran cantidad decasos de abortos de repetición.

OBJETIVOS:

Relacionar la morfología espermática con abortos en el primer trimestre, enpacientes sometidos a ciclos deInseminación Artificial.


Analizamos todos los pacientes de

129: VALORACIÓN DE LA MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA MEDIANTEMICROSCOPÍA DE ALTA MAGNIFICACIÓN

G. López, R. Lafuente, O. Cairó, S. Rovira, M. BrassescoCIRH Clínica Corachan, Barcelona

130: RELACIÓN ENTRE LA MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA Y ABORTOSEN EL PRIMER TRIMESTREI. Moragues Espinosa de los Monteros, A Brotons, A. Fernández-PeinadoClínica In Vitam Centro de Medicina Reproductiva, Elche




Inseminación Artificial, y los separamos según DiagnósticoSeminal, en Normozoospérmicos (n=65), Oligozoospérmicos (n=26),Astenozoospérmicos (n=29), yTeratozoospérmicos (n=27).Hacemos todoel seguimiento desde la Inseminaciónhasta el final del embarazo.

RESULTADOS:

Ver tabla y gráfico

CONCLUSIONES:

Observamos que en todos los grupoencontramos casos de abortos en el

primer trimestre, sin embargo, elnúmero de casos aumenta en el grupocon Teratozoospermia.

INTRODUCCIÓN:

El Modelo de Excelencia EFQM proponecomo objetivo mejorar cualquier aspectode un servicio sanitario, para ellorequiere el examen continuo de todoslos componentes del sistema deorganización, aplicable en Laboratoriosde Reproducción Asistida.

En este informe presentamos laexperiencia de un laboratorioacreditado, antes y depués, de lasmejoras propuestas por el Modelo deExcelencia EFQM.

El objetivo de este estudio es compararlos resultados obtenidos en el laboratoriode FIV, antes y después de una auditoríaexterna llevada a cabo en 2006.


Durante la visita, el consultor realizó lassiguientes actividades:

Observación detallada de los procesosdel laboratorio, incluyendo todo tipo deprocedimientos, así como otrasactividades de laboratorio.

Presentación al equipo de Laboratoriode los siguientes temas: El caráctergeneral de los sistemas de acreditaciónde laboratorio, formación básica ensistemas de análisis, y en su diseño yaplicación; los procesos básicos en lagestión de la calidad, incluyendocontrol de la calidad, garantía de lacalidad y mejora de la calidad (“Ciclo de

Calidad”); la evaluación comparativa,indicadores y control de procesos;solución de problemas (identificando laraíz del problema); los fundamentos dela gestión de riesgos(incluyendo el usode modelos fallidos y el análisis de esosefectos); y el control de documentos.

El auditor en su revisión de lasoperaciones como parte del programadel Modelo de Excelencia EFQM, realizó92 recomendaciones: 23 relacionadascon el manejo y funcionamiento, 48relacionadas con procesos técnicos, 15con procesos de organización clínica, y6 relacionadas con recursos humanos.

Tras la auditoría, los principales cambiosque se realizaron en el Laboratorio deFIV se resumen así:

Sistema de alarmas para informar alpersonal adecuado de cualquier problemacon cualquier equipo fuera del horario detrabajo. El equipo que debe sercontrolado incluye el suministro de gas,todos los incubadores con cultivos deovocitos y embriones, y todos loscriobancos utilizados en almacenamientode gametos y embriones.

Se ha sustituido el uso de PBS como medioen la captación de ovocitos por un mediosin fosfato, que puede dañar los mismos.

En la captación ovocitaria se utilizantermopares y un termómetro electrónicopara investigar los cambios detemperatura experimentados por elfolículo durante el proceso.

Un incubador situado en la salaadyacente a la bomba de aspiración,para mantener el suficiente número detubos precalentados, estará disponiblecon un dispositivo para mantener lostubos calientes mientras se llenan.

El estudio se basó en la recuperaciónovocitaria durante el período 2006-2008. Los resultados obtenidos en 2007(n=935) y 2008(n=1056) se compararoncon los obtenidos en 2006 (n=906),utilizando el test de chi-cuadrado. Losprimeros resultados fueron embarazoclínico, definido por al menos un latidofetal. También comparamos la tasa deutilización de embriones.

RESULTADOS:

La tasa de embarazo clínico aumentósignificativamente hasta 49,8% y 48% enel estudio de cohortes comparado con elcohorte control histórico (30%).(p<0,01).

CONCLUSIONES:

La implantación y el trabajo basado enun sistema de control de calidadacreditado en unidades de ReproducciónAsistida es un trabajo sin fin, y es unsistema que ha mejorado el ambiente enel que los gametos y embriones depacientes son manipulados. Estos datosapoyan la hipótesis de que el uso de unsistema de calidad, puede, como en estecaso, tener repercusiones positivas en latasa de embarazo.

220

131: MEJORA DE RESULTADOS EN FIV OPTIMIZANDO LA CALIDADDE LABORATORIOC. Muñoz, M. Gago, S. Cortes, A. García, M. Reguera, C. Luna, R. Núñez, P. CaballeroClínica Tambre, Madrid



INTRODUCCIÓN:

La criopreservación de semen es unapráctica clínica habitual en los centrosde reproducción asistida. Susindicaciones más frecuentes sonconservar las muestras durante unperiodo ventana de conversión endeterminadas infecciones víricas deacuerdo con el RD 412/1996 de donantesde semen con fines reproductivos,preservación de muestras “valiosas”,conservación previa aquimioterapia/radioterapia, vasectomíao condicionantes personales.

Tras una exposición gradual a loscrioprotectores (fase de adición), sesomete a las células a curvas deenfriamiento hasta alcanzartemperaturas de -196º C. Tras sualmacenamiento, se procede a ladescongelación, para lo que hay queeliminar totalmente los crioprotectores(fase de dilución), hasta el retorno acondiciones isosmóticas para la célula.

En procesos de manipulación de tejidos ycélulas humanas, la utilización decomponentes de origen animal ohumano es controvertido, tal y comopropone la F.D.A, (Food and DrugAdministration) tendiendo al uso deproductos de origen recombinante o ensu defecto altamente purificados, paraminimizar o suprimir el riesgo decontaminaciones a partir de estos.

El objetivo de este estudio es comparar laeficacia y la bioseguridad en lacriopreservación de muestras de semen detres crioprotectores comerciales condiferente composición (Freezing Medium-Test Yolk Buffer (TYB) with Glycerol andGentamicin (IrvineScientific): glicerol +yema de huevo + Tris-TES; Sperm FreezingMedium (Medicult): glicerol + sacarosa +hSA; Sperm CryoProtec II™; (Nidacon):

glicerol + hSA), para poder seleccionaraquel que mejor se adecue a la prácticaclínica, teniendo en cuenta tanto labioseguridad, la eficacia y el costegenerado.


Se analizaron un total de 23 muestras desemen procedentes de estudiosdiagnósticos, tanto de parejas incluidasen el programa de reproducciónasistida (n = 14; 9 normozoospérmicas,1 oligozoospérmicas, 4astenozoospérmicas), como de donantes(n = 9) del banco de semen del Institutode Medicina Reproductiva (IMER),Valencia. Cada muestra se dividió en tresalícuotas, criopreservando cada una deellas con un crioprotector distinto. Lasmuestras permanecieron almacenadasun mínimo de 48h, tras las que seprocedió a su descongelación, dilucióndel crioprotector y recuperación de lascondiciones isosmóticas. Se valoró elrecuento y motilidad espermática,viabilidad, test de capacitación (REM) ysupervivencia a las 24h. Tras el análisislas muestras fueron desechadas.

RESULTADOS:

Las muestras seminales de cónyugecriopreservadas no mostrarondiferencias significativas (p>0.05) parala viabilidad espermática, recuento ymotilidad en condiciones isosmóticas,REM y supervivencia a las 24h, para loscrioprotectores ensayados. En el caso delas muestras de donante, tampoco seobservaron diferencias significativas(p>0.05) para los parámetros analizadosentre los tres crioprotectoresestudiados. Bajo nuestras condicionesde trabajo, Sperm CryoProtec II™(Nidacon) resultó ser el crioprotectormás eficiente debido a su bajo coste y ala dilución utilizada (1:3), a pesar de ser

el protocolo más largo (90min).

CONCLUSIONES:

La ausencia de diferencias estadísticasque permitan la discriminación entrecrioprotectores en base a los parámetrosanalizados, hace que, para la elección delcrioprotector debamos basarnos encriterios como el coste por muestracriopreservada (precio del crioprotectory tiempo empleado), o el protocolo quemejor se adapte a la rutina del nuestrolaboratorio (almacenamiento, caducidad,tipo de presentación, etc.)

132: EFICACIA Y BIOSEGURIDAD EN LA CRIOPRESERVACIÓN DEESPERMATOZOIDES HUMANOS: COMPARACIÓN DE CRIOPROTECTORESCOMERCIALES CON DIFERENTES FUENTES PROTEICAS.

M. C. Fuentes1, J. Alfonso2, C. C. Duque3, I. Navarro1, 2, A. Monzó1, 2, 3, V. Montañana1, 2, 3.1Fundación IMER de la Comunidad Valenciana. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER) Valencia.3Unidad de Reproducción Asistida, Hospital Universitario La Fe, Valencia.




INTRODUCCIÓN:

Los fragmentos son componentes decitoplasma rodeados de membranacitoplasmática que no contienenmaterial nuclear (ADN). Alikani, et al.,1999. Suelen producirse entre el estadode cigoto y en las siguientes divisionesembrionarias.

Las causas pueden ser debido a Factoresexternos como condiciones de cultivo,estimulación ovárica. Factores internoscomo la integridad genética,desequilibrio cromosómico,alteraciones de la cariocinesis ycitocinesis (Juriscova A, et al., 1996)

Objetivos: Determinar la evoluciónembrionaria, tasa de congelación,descongelación, supervivencia ygestación de acuerdo al grado defragmentación embrionaria en día 3hasta blastocisto


Se llevó a cabo un análisis retrospectivode 810 ciclos del laboratorio defecundación in vitro del IVI Murcia conembriones en observación entre enerode 2002 y diciembre de 2008. La mediade edad de las pacientes fue de 35 años± 2.0. Se excluyó del estudio a laspacientes del programa de ovodonación.

1968 embriones fueron observados ycultivados hasta el día cinco dedesarrollo en un medio secuencial(Vitrolife), y se les dividióposteriormente en dos grupos: el GrupoA - con una tasa de fragmentación de<20% - y el Grupo B - con una tasa defragmentación entre 20-40%. Acontinuación, cada grupo se dividió endiez subgrupos adicionales según elnúmero de células presentes en día tresde desarrollo. Los embriones que en enestado de blastocisto cumplieron lascaracterísticas adecuadas fueroncriopreservados por el método decongelación lenta (Cook).

RESULTADOS:

La tasa global de congelación fue del17,37%. La tasa de evolución hastablastocisto fue similar en el subgrupo deembriones de ocho células en ambosgrupos, siendo del 24,4% en el Grupo A ydel 27,8% en el Grupo B. La tasa degestación en el Grupo A fue del 38,6% ydel 30% en el Grupo B. La tasa de abortoen el Grupo A fue del 36,4% y del 46,7%en el Grupo B.

CONCLUSIONES:

Con este estudio podemos concluir quesi un blastocisto cumple los criterios decongelación, la tasa de supervivencia esindependiente del porcentaje defragmentación en D3 y del número decélulas. Pocos embriones observadosson finalmente congelados y sus tasasde supervivencia y gestación soncomparables a las de los embriones noobservados pero dan lugar a tasas másaltas de aborto.

INTRODUCCIÓN:

Con el fin de optimizar el trabajo y losrecursos de nuestro laboratorio, seunificaron las horas de recepción de lasmuestras de semen de las parejassometidas a ciclos de InseminaciónArtificial Conyugal (IAC). El objetivo deeste estudio es determinar si afecta enlas tasas de gestación el tiempotranscurrido desde la entrega hasta elmomento de la inseminación en losresultados del centro.


Estudio retrospectivo de 207 ciclos,realizados en los últimos 6 meses. Elanálisis se ha llevado a cabo en parejas enlas que la mujer presentaba una edad ≤38años, y sin causa aparente de esterilidad.Los varones mostraban un recuento deespermatozoides móviles totales (REMT) ³5 mill (valores recomendados por la OMSpara la realización de IAC), y en función desu calidad seminal se estructuraron en 3grupos:

Grupo I: Varones con un REMTcomprendido entre 5 – 10 mill.

Grupo II: Varones con un REMTcomprendido entre 10-20 mill.

Grupo III: Varones con un REMT superiora 20 mill.

Se ha realizado análisis estadísticoutilizando ANOVA, P< 0.05 y t – Student,P< 0.05.

133: EVOLUCIÓN DE EMBRIONES EN OBSERVACIÓN EN CULTIVOPROLONGADO EN FUNCIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y NÚMERO DECÉLULAS

D. López, B. Amorocho, D. Gumbao, P. Albero, L. Fernández, M. Nicolas, J. Landeras.IVI Murcia

134: ¿INFLUYE EL TIEMPO TRANSCURRIDO ENTRE LA ENTREGA DELA MUESTRA Y EL MOMENTO DE LA INSEMINACIÓN?

M. Lierta, C. Romeu y A. Urries. Reproducción Asistida Quirón Zaragoza, Grupo Hospitalario Quirón.

222



Los resultados se han analizado en baseal tiempo transcurrido entre la entregade la muestra y el momento de lainseminación.

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

Los mejores resultados se han obtenidocuando no han transcurrido más de 3horas entre la entrega de la muestraseminal y la inseminación intrauterina,

ya que el 80% de los embarazosobtenidos se realizaron durante esteperiodo de tiempo. A partir de la tercerahora las tasas de gestación desciendenconsiderablemente (Tabla I). Teniendoen cuenta estos resultados, como datoañadido, hemos realizado un segundoanálisis en el que se ha estudiado la tasade gestación dentro del periodo de lastres primeras horas en función de lacalidad espermática del varón, hallando diferencias significativamenteestadísticas entre muestras con un REMTde 5-10mill y las que presentaban más de20mill (Tabla II). En consecuencia, seconsiguen mejores resultados cuando laIAC está indicada por un claro factormasculino frente a Esterilidades SinCausa (ESCA).

INTRODUCCIÓN:

El Desarrollo Folicular Múltiple (DFM) hademostrado influir favorablemente en elaumento de las tasas de gestación entratamientos de inseminación artificial,no obstante con la estimulación ováricase aumenta el riesgo de obtenergestaciones múltiples, además de lascomplicaciones adicionales que estoconlleva. Gran parte de los estudios(Verhulst et al, 2006; Rumste Van et al.,2008) encuentran una relación positivaente el desarrollo folicular y las tasas deembarazo, sin embargo el DFM siguesiendo polémico en tratamientos deinseminación artificial.

OBJETIVO:

El propósito de este trabajo es evaluarnuestros resultados en tratamientos de

inseminaciones artificiales, teniendo encuenta la tasa de gestación en funcióndel número de folículos desarrollados.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Se realiza un análisis retrospectivo,donde se incluyen desde 01/01/2006Hasta el 31/12/2008, 285Inseminaciones artificiales, tantohomólogas (IAH) como de donante(IAD). Se evalúa la tasa de gestación conrespecto al número de folículos mayoreso iguales a 17mm desarrollados con laestimulación.

RESULTADOS:

La tasa de embarazo total es del 23,85%.La tasa de embarazo en ciclos concrecimiento monofolicular fue del: 19,66% y las tasas gestacionales para 2 y 3

folículos mayores o iguales a 17mm fuerespectivamente del 30,5% y 31,8%. Latasa de embarazo aumentó al fomentarel crecimiento folicular de por lo menos2 folículos y el riesgo de embarazomúltiple aumentó de acuerdo aldesarrollo multifolicular en 7,69% para2 folículos y 14,28% para 3 folículos,mientras que en el desarrollomonofolicular la tasa de gestaciónmúltiple fue de 2,86%.

CONCLUSIONES:

El desarrollo folicular múltiple mejora latasa de gestación comparado con eldesarrollo monofolicular eninseminaciones intrauterinas. Las tasasde embarazo se mejoran cuando sedesarrollan 2 folículos ≥17mm y serecomienda no superarlos para prevenirel aumento de gestaciones múltiples.


Tabla I. Porcentaje de gestación según el tiempo transcurrido entre la entrega de la muestra y la inseminaciónREMT = Recuento de espermatozoides móviles totales (mill) T.T.= Tiempo transcurrido (h)

Tabla II. Porcentaje de gestación en función de la calidad espermáticaREMT = Recuento de espermatozoides móviles totales (mill)T.T.= Tiempo transcurrido (h)* P < 0.05

135: EVALUACIÓN DE LA TASA DE GESTACIÓN DE INSEMINACIONESARTIFICIALES EN FUNCIÓN DEL NÚMERO DE FOLÍCULOS CONESTIMULACIÓN OVÁRICA (IVI-VIGO).D. Pabón, M. Martínez, N. Torres, S. Portela, E. Muñoz.IVI, Vigo



INTRODUCCIÓN:

La existencia de variacionesinterobservador es un hecho constatadoen diferentes campos de la ciencia, en elcampo de la embriología tambiénencontramos este fenómeno. Laparticipación en programas de controlde calidad externo, la adecuadaformación de los miembros de un mismoequipo y las reuniones de consensopueden disminuir estar diferencias.

OBJETIVO:

El objetivo de este estudio es ver cuándose observa una mayor variabilidad entrelaboratorios, no sólo a la hora declasificar un embrión, sino también aldecidir su destino.


Todos los datos utilizados pasa elanálisis fueron obtenidos del programaespañol de control de calidad externopara el laboratorio de reproducción,programa auspiciado por Asociaciónpara el Estudio de la Biología de laReproducción (ASEBIR), con más de 40

laboratorios de toda Españaparticipando en el programa entre 2003y 2007. Consistente en el envío deDVD/CD-ROM, con videos de Cigotos yembriones en Día 2 y Día 3, cada envíoestaba dividido en 5 punciones con 5embriones cada uno; una punción enestadío de Cigoto, 2 punciones en Día 2y 2 punciones en Día 3. Se debíaclasificar cada embrión como Bueno,Regular o Malo y decidir de cada punciónqué dos embriones se transferirían, y delos no transferidos, cuales secongelarían y cuales se desecharían. Seconsideró que existía alto grado deacuerdo en clasificación cuando más del75% de los laboratorios adjudicaban lamisma categoría para un mismoembrión. Se consideró que existía altogrado de acuerdo en decisión clínicacuando más del 75% de los laboratorioscoincidían en la decisión clínica para unmismo embrión.

RESULTADOS:

Observamos un mayor porcentaje deembriones con alto grado de acuerdocuando la evaluación se realiza sobreembriones de Día 3 (58.0%, 29/50) que

cuando se evalúan embriones de Día 2(32.0%, 16/50) (p<0.05) o Cigotos(40.0%, 8/20).

También observamos un mayorporcentaje de embriones con alto gradode acuerdo cuando la categoría másescogida fue Mala (72.4%, 21/29)calidad, que cuando la categoría másescogida fue Regular (28.6%, 12/42)(p<0.05) o Buena (41.4%, 12/29)(p<0.05).

El porcentaje de embriones en el que seobtuvo un alto grado de acuerdo fuemayor cuando la decisión clínica másescogida para un embrión fue Desechar(66.7%, 18/27) que a la hora deCongelar (30.8%, 8/26) (p<0.05) oTransferir (42.9%, 18/42).

CONCLUSIONES:

La mayor variabilidad entre laboratoriosse produce a la hora de evaluarembriones en Día 2; cuando se clasificacomo Regular o Malo; y cuando se decideCongelar.

INTRODUCCIÓN:

Siguiendo la tendencia de implantarprogramas de control y sistemas decalidad en el laboratorio dereproducción asistida, los embriólogosdel Centro Extremeño de ReproducciónAsistida diseñamos los protocolos detrabajo con la ayuda de las guías depráctica clínica y las instrucciones de usoproporcionadas por las casas

comerciales para los medios de cultivo.Para la elaboración del protocolo detransferencia embrionaria (TE),realizamos un estudio analizando eltiempo que los embriones permanecíanen el medio de transferencia(Embryoglue, Vitrolife). La casacomercial recomienda un intervalo entre10 y 30 minutos pero es difícil respetarese intervalo debido a varios factorestales como descoordinación con el

ginecólogo, pacientes que no estánpreparadas en el último momento,etc.…


Se han incluido 100 TE al azar, realizadasentre Enero y Marzo de 2009, a parejasque acuden al centro por problemas dereproducción. La edad de la mujer estácomprendida entre 25 y 40 años. En un

136: ¿CUÁNDO OCURRE LA MAYOR VARIABILIDAD ENTRELABORATORIOS EN LA EVALUACIÓN EMBRIONARIA?

R. Ruiz de Assin, J. Fontes, M. C. Gonzalvo, A. Fernández, M. Roldán, B. Rabelo, R. P. Cotarelo, J. A. Castilla.U. Reproducción Hospital Virgen de las Nieves, Granada

137: INFLUENCIA DEL TIEMPO DE PERMANENCIA EN EMBRYOGLUESOBRE LAS TASAS DE GESTACIÓN EN EL CERHA DE BADAJOZ

F. Monllor, A. Ortiz, G. Lozano, I. M. Baena, M. I. Jiménez.Centro Extremeño De Reproducción Humana Asistida (CERHA). Hospital Materno Infantil. Badajoz

224



9% de los casos se utilizó semen dedonante y en un 8% se realizó un ciclomixto; el resto de TE correspondían aciclos conyugales de ICSI. El 42% de lasTE se realizaron en D+2 y el 58% restanteen D+3. El tiempo de permanencia enEmbryoglue se cronometró desde elmomento de pasar los embriones a estemedio, hasta el momento de pulsar elémbolo para descargarlos en el útero.

RESULTADOS:

*el tiempo máximo de permanencia enEmbryoglue es de 88 minutos.

No se observan diferenciassignificativas entre el intervalorecomendado (10-30 minutos) y el quesobrepasa este intervalo (p=0,697); sibien, intentamos ajustarnos alprotocolo de Embryoglue y por eso eltiempo de permanencia máximo en estemedio ha sido de 1 hora y 28 minutos.Para el intervalo por debajo de los

10 minutos tampoco encontramosdiferencias.

CONCLUSIONES:

El intervalo de permanencia de losembriones en Embryogluerecomendado por Vitrolife (10-30 min.)nos parece demasiado estricto dadoque el no cumplimiento de este periodode tiempo no afecta a nuestrosresultados. Por tanto, el cambio de losembriones a este medio puederealizarse cuando sea mejor para laorganización del trabajo en ellaboratorio, aunque la casa comercialaconseja no sobrepasar las 3 horas.

INTRODUCCIÓN:

En un estudio paralelo a éste, llevado acabo en nuestro centro, hemoscomprobado que aquellos embrionesque proceden de ciclos dedesvitrificación presentan mayorestasas de supervivencia embrionaria quelos que proceden de la descongelacióntradicional. (90,5% vs. 62,8%). Estosugeriría la posibilidad de que losembriones desvitrificados podrían darlugar a mayores tasas de embarazo eimplantación. El objetivo de este estudioes comparar las tasas de embarazo,implantación y de abortos en los ciclosde descongelación tradicional vs losciclos de desvitrificación.


Se realizó un estudio prospectivo yrandomizado desde Diciembre de 2008hasta Marzo de 2009. La técnica decongelación en cada paciente se hizo deforma aleatoria mediante el programaResearch Randomizer Form v4.0.

Se llevaron a cabo un total de 65

descongelaciones vs 24 desvitrificaciones.

RESULTADOS:

Los resultados obtenidos fueronsimilares con ambas técnicas, tanto enlas tasas de hCG+, como en las deembarazo clínico. La tasa deimplantación fue algo superior enaquellas pacientes en las que setransfirieron embriones procedentes dela desvitrificación, sin embargo elanálisis estadístico mediante chi-cuadrado no mostró diferenciassignificativas. Hasta la fecha, no se hanproducido abortos en las gestacionesobtenidas con los embrionesdesvitrificados.

CONCLUSIONES:

El presente estudio muestra que la

probabilidad de embarazo y la tasa deimplantación embrionaria sonestadísticamente similares sicomparamos la descongelación

tradicional con la desvitrificación,aunque de momento no se hanproducido abortos con los embrionesdesvitrificados. Consideramos necesariocontinuar con este estudio, y reevaluarlocon un número mayor de casos.


138: TASAS DE EMBARAZO EN LOS CICLOS DE DESCONGELACIÓNVERSUS DESVITRIFICACIÓN

M. Sánchez de Burgos, M. Nieto Sánchez, L. Andrés Criado, J. Cuadros, E. HernándezClínica FivMadrid



INTRODUCCIÓN:

durante la foliculogénesis las células dela granulosa (CGs) son esenciales para lamaduración del ovocito y la adquisicióngradual de su competencia. Así mismo,las células del cúmulus (CCs) debensecretar factores de crecimientoparacrinos o expresar moléculas deadhesión en sus membranas que tienenun papel relevante en la maduraciónnuclear y/o citoplasmática. Previo alICSI, los complejos cumulus-ovocito(CCO) son decumulados, yposteriormente son clasificados enfunción de su estado de maduración. Elhecho de no eliminar todas las células dela granulosa en la decumulación, podríasuponer una oportunidad de maduracióncompleta, sin que ello implicaradesventajas en el momento de lamicroinyección.

Nuestro objetivo fue evaluar si ladecumulación parcial o total delcomplejo cúmulus-ovocito influíasignificativamente sobre las tasas degestación, embarazo bioquímico,ectópicos y aborto de 1er trimestre delas pacientes incluidas en el estudio.Además se estudió si el proceso demicroinyección también se veía afectadoen función del método seguido aldecumular.


realizamos un estudio retrospectivo paraevaluar las diferencias entre ladecumulación total o parcial de los CCOsantes del ICSI. Se analizaron un total de312 pacientes sometidas a untratamiento de fecundación in vitro enel Hospital General Universitario deValencia en el periodo comprendidoentre mayo del 2005 y diciembre del2008 (decumulación parcial, n = 148;decumulación total, n = 164), siendo laedad media de las pacientes de 33,9 ±3,6 años. En los casos de decumulaciónparcial se incluyeron aquellos en los quela granulosa o bien estaba distribuida deforma homogénea, o en grupos. De losovocitos microinyectados setransfirieron aquellos embriones demejor calidad según parámetrosmorfológicos en día 2 o 3 de cultivo. Elanálisis estadístico se realizó medianteun test Chi-Cuadrado con el programaSPSS11.0.

RESULTADOS:

No se encontraron diferenciassignificativas en las tasas de embarazoen función del tipo de estrategia seguidaen el momento de la decumulación,siendo un 48,6% cuando los CCOs sedecumularon parcialmente y un 43,9%cuando se eliminaron las células de la

granulosa por completo (P<0,05).Igualmente no hubo diferenciassignificativas cuando las variablesanalizadas eran embarazo bioquímico,ectópicos y aborto de 1er trimestre. Encuanto a la microinyección, tampoco seencontraron diferencias significativasen la tasa de fecundación entre aquellosCCOs decumulados parcial o totalmente.Con respecto a la microinyección,quisimos analizar si el método dedecumulación seguido suponía unamayor o menor complicación técnica a lahora de microinyectar, pero se vio que nohabía diferencias en estos casos(P<0,05).

CONCLUSIONES:

a la vista de los datos obtenidosencontramos que las células de lagranulosa, según el método de trabajode nuestro laboratorio, no ejercen unafunción ni positiva ni negativa sobre elovocito, de manera que para nosotrosambos protocolos de decumulaciónserían igualmente válidos. Aún así,creemos que sería necesario realizar unestudio prospectivo en el que seestandarizasen los protocolos dedecumulación según el grupo de estudioy con un tamaño muestral mayor parapoder confirmar estos resultados.

OBJETIVO:

Reportar el embarazo en una pacienteincluida en el programa de donación deovocitos después de vitrificar losovocitos y los embriones.

Diseño: Case report


La hiperestimulación ovárica controladaen la donante de ovocitos se inició conFSHr-HMG en día 2 ó 3 del ciclo

menstrual y la desensibilizaciónhipofisaria fue llevada a cabo usandocetrorelix 0.25 mg (Cetrotide, Merck-Serono) cuando el folículo dominantetenia > 14 mm de diámetro, ó en día 5 –6 de estimulación. La ovulación fueinducida con hCGr (Ovitrelle, Merck-

139: EFECTO DE LA DECUMULACIÓN TOTAL O PARCIAL DELCOMPLEJO CÚMULO-OVOCITO SOBRE LA TASA DE EMBARAZO

M. I. Rubio Palacios, L. Mifsud Elena, J. Iñíguez Tornero, I. Cuevas Sáiz.Hospital General Universitario de Valencia

140: EMBARAZO TRAS VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS Y RE-VITRIFICACIÓN EMBRIONES EN UNA RECEPTORA DE OVOCITOS

J. Herreros, G. Quea, E. Garijo, F. Galera, J. Muñoz Instituto Madrileño de Fertilidad (IMF). Madrid.

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Serono) cuando la hiperestimulaciónovárica dio como resultado al menos dosfolículos > 18 mm de diámetro. Losovocitos fueron vitrificados mediante elmétodo Cryotop (Kitazato BiopharmaCo. Japan). En la receptora de ovocitosla evaluación uterina se realizómediante ecografía transvaginal conultrasonidos (Voluson E8/ GeneralElectric). La paciente recibió estradioloral para la preparación endometrial(600 mg/día). Previamente seadministró análogos de la GnRH debido ala presencia de ciclos menstrualesregulares. El día de la desvitrificación delos ovocitos se le empezó a suministrarprogesterona micronizada.

El siguiente ciclo (de la trasferencia decongelados) fue realizado siguiendo elmismo protocolo.

RESULTADOS:

Nueve ovocitos fueron obtenidos traspunción folicular y fueron vitrificados untotal de 6 ovocitos metafase II. Dos horasdespués de la desvitrificación de losovocitos realizamos el ICSI. Tras valorarla fecundación, observamos 4 ovocitosfecundados y dos embriones fuerontransferidos mientras que los otros dosembriones fueron vitrificados de nuevo.A los 12 días de la transferencia de losembriones evaluamos la beta-hCG en

suero sin lograr embarazo, por lo que enel siguiente ciclo le fueron transferidoslos embriones vitrificados consiguiendoembarazo en este caso.

CONCLUSIONES:

Desde la implantación del método de lavitrificación, se ha especulado sobre elefecto deletéreo de utilizar altasconcentraciones de crioprotectores, sinembargo, nosotros hemos comprobadola eficacia del método de la vitrificaciónmanteniendo la viabilidad de ovocitos yembriones.



A G R A D E C I M I E N T O S

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PRINCIPALES PATROCINADORES

PLATINO

OTROS PATROCINADORES


N O T A S


revista asebir diciembre 2009

Health & Medicine