respuesta inmune frente a antígenos de

Universitas Médica

ISSN: 0041-9095

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Pontificia Universidad Javeriana

Colombia

GÓMEZ, ALBERTO; ROMERO, MARÍA CONSUELO; TAMAYO, MARTALUCÍA

Respuesta inmune frente a antígenos de retina en pacientes con retinitis pigmentosa y síndrome de

Usher

Universitas Médica, vol. 50, núm. 1, enero-marzo, 2009, pp. 20-40

Pontificia Universidad Javeriana

Bogotá, Colombia

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Gómez A., Romero M.C., Tamayo M., Respuesta inmune frente a antígenos de retina en pacientes con retinitis pigmentosa

1 PhD, Profesor Titular, Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina, Pontificia UniversidadJaveriana, Bogotá, D.C., Colombia.

2 MSc, Grupo de Espondiloartropatías, Servicio de Reumatología e Inmunología, Hospital Militar Cen-tral. Docente, Universidad de la Sabana, Bogotá, Colombia.

3 MD, MSc, Profesor Titular, Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina, Pontificia Universi-dad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.

Recibido: 28-11-2008 Revisado: 01-12-2008 Aceptado: 19/01/2009

Resumen

Introducción. Diferentes tipos de reacciones inmunológicas han sido implicadas en laretinitis pigmentosa como causantes de degradaciones retinianas que pueden resultar enuna pérdida visual acelerada. Sin embargo, éstas no se han asociado a diferentes estados dela enfermedad y no existen reportes de respuesta inmune en el síndrome de Usher.

Objetivos. Analizar la respuesta inmune celular y humoral frente a antígenos de retina ypéptidos retinianos, tanto en pacientes con retinitis pigmentosa como con síndrome deUsher, y en un grupo control.

Materiales y métodos. Se prepararon extractos de retinas humanas y bovinas, y seaislaron sus proteínas para definir su capacidad antigénica mediante pruebas ELISA yWestern blot. Se analizó la blastogénesis celular (transformación morfológica de linfocitospequeños maduros en células grandes capaces de sufrir mitosis) frente a fracciones proteicasobtenidas por transferencia a papel de nitrocelulosa del gel posterior al corrido electroforético,así como frente a dos péptidos (M y D) derivados de la secuencia del antígeno S, reportadocomo generador de uveítis en modelos de ratón.

Resultados. Se encontraron reacciones significativas frente a algunos antígenos y sedeterminaron diferencias en la especificidad de la respuesta de linfocitos T (inmunidadcelular) en función de la patología.

Conclusiones. Los pacientes con retinitis pigmentosa presentan inmunidad celular activafrente a los extractos retinianos, frente a la fracción F1, la cual comprende antígenos debajo peso molecular (<36 kDa), y también frente a los péptidos M y D. Los pacientes consíndrome de Usher y con algunos subtipos genéticos de retinitis pigmentosa presentaronuna correlación entre el tipo de la enfermedad y el grado de inmunorreactividad frente a losantígenos utilizados en estos experimentos.

Palabras clave: retinitis pigmentosa, síndrome de Usher, autoinmunidad, linfocitos T,Colombia.

Respuesta inmune frente a antígenos deretina en pacientes con retinitis pigmentosa

y síndrome de Usher

ALBERTO GÓMEZ1

MARÍA CONSUELO ROMERO2

MARTALUCÍA TAMAYO 3

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Univ. Med. Bogotá (Colombia), 50 (1): 20-40, enero-marzo de 2009

Title:

Immune responses against retinal antigens inpatients with retinitis pigmentosa and Ushersyndrome

Abstract

Introduction: Immune reactions have beenimplicated in retinitis pigmentosa as the cause ofretinal degradations which may result in acceleratedvisual loss. However, these reactions have not beenassociated to different subtypes of thesepathologies, and they do not include studies on theUsher syndrome.

Objective: We tested both humoral and cellularimmune responses to isolated retinal antigens andpeptides in patients and controls.

Materials and methods: We prepared human andbovine retinal extracts, and fractioned their proteinsto define their corresponding antigenicity byELISA and Western Blot assays. We also analyzedthe proliferative response to protein fractionsobtained in nitrocellulose transferred proteins andto S-antigen derived peptides M and D, which werereported as uveitogenic in mice.

Results: Significant reactions were detected againstsome of the antigens in patients and not in controls,depending on the clinical subtypes.

Key words. retinitis pigmentosa, Usher’ syndrome,autoimmunity, T lymphocytes, Colombia.

Introducción

La retinitis pigmentosa, términocomún para las retinopatías pigmen-tarias heredadas, caracteriza diferen-tes enfermedades que involucrandegeneración retiniana. La retinitis pig-mentosa se ha definido de varias ma-neras con un común denominador: setrata de un grupo de alteraciones he-reditarias que afectan primariamente

las funciones de los fotorreceptores ydel pigmento epitelial[1-9].

Este conjunto de enfermedades ge-néticas implica la degeneración progre-siva de los fotorreceptores como unacaracterística principal[10-12]. El pa-ciente típico con retinitis pigmentosarefiere ceguera nocturna y muestra unapérdida progresiva de la visión perifé-rica, caracterizada clínicamente por ladisminución de su campo visual. Laduración de la enfermedad depende dela edad de aparición y de la gravedaddel tipo de retinitis pigmentosa corres-pondiente.

Otros hallazgos oftalmológicos ca-racterísticos son la despigmentación oatrofia del epitelio pigmentario retinia-no, los depósitos de pigmento en laretina (espículas de hueso) y el estre-chamiento de los vasos retinianos. Lasalteraciones pigmentosas sucedenprincipalmente en la periferia y pre-sentan un patrón perivascular[13,14].

Para entender las degeneracionesretinianas, es necesario entender laestructura de la retina normal, cuyafunción primaria es la fototransduc-ción o la detección de fotones segui-da de un adecuado envío de señales alcerebro. Las primeras etapas de estavía ocurren en las células de la capade fotorreceptores, conos y bastones,en donde las moléculas de opsina aso-ciadas a los cromóforos sensibles a laluz están incluidas en la membrana

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plasmática de cada célula. Cuando es-tas opsinas absorben un fotón, se acti-van y activan a su vez una proteína Gdenominada transducina. La transdu-cina activada hidroliza al GMP cíclicomediante la fosfodiesterasa (PDE) co-rrespondiente. Cuando bajan los nive-les de GMP cíclico no hidrolizado enel citoplasma, los canales iónicos dela membrana plasmática se cierran, locual conduce a un aumento de la po-larización de la membrana.

Otras proteínas especializadas inter-vienen en la modulación e inhibiciónde esta cascada funcional, hasta recon-vertir a las opsinas a su estado inacti-vo fotosensible. Aunque este procesotiene lugar tanto en conos como enbastones, las enzimas involucradas sonespecíficas de cada tipo celular[11,15].El proceso degenerativo se inicia cuan-do un fotorreceptor deja de ser fun-cional debido a un defecto que puedeser bioquímico o estructural. Si la en-fermedad afecta principalmente a losbastones, la pérdida visual progresadesde la periferia hacia el centro de laretina, causando al paciente una visiónen túnel y ceguera nocturna.

Por el contrario, las enfermedadesque afectan primariamente los conosusualmente destruyen primero la re-gión central de la retina o mácula, enla que los conos son más abundan-tes[16-18]. La apoptosis también hasido implicada en la degeneraciónretiniana, puesto que la desestabiliza-

ción de las membranas con proteínasmutantes y los niveles aumentados deGMP cíclico, causados por la interrup-ción de la cascada de fototransduc-ción, pueden activar la muerte celularprogramada[10,11,17]. Las proteínasoculares, en consecuencia, pueden fil-trarse al torrente sanguíneo y sensibi-lizar al paciente, induciendo unproceso autoinmune, el cual ha sidopropuesto con base en modelos ani-males de la enfermedad[19-23] y enestudios in vitro en el modelo huma-no[24-33]. En el presente estudio seprepararon extractos de retina huma-na y se aislaron las proteínas y pépti-dos correspondientes, con el propósitode definir su antigenicidad mediantepruebas de ELISA e inmunoelectro-transferencia o Western blot. Además,se analizaron las reactividades blasto-génicas celulares frente a fraccionesproteicas obtenidas en la transferen-cia a nitrocelulosa de las proteínas se-paradas por electroforesis, así comofrente a dos péptidos (M y D) deriva-dos de la secuencia del antígeno S, elcual había sido reportado anteriormen-te como generador de uveítis en elmodelo de ratón[20,23,34].

Materiales y métodos

Sujetos

Se estudiaron 21 pacientes conretinitis pigmentosa y 10 pacientes consíndrome de Usher (Usher tipo I –USH1: OMIM 276900; Usher tipo II

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– USH2: OMIM 276901, 276905 y605472; Usher tipo III – USH3: OMIM276902) de la consulta del Instituto deGenética Humana de la Facultad deMedicina de la Pontificia UniversidadJaveriana. El rango de edad de lospacientes de retinitis pigmentosa fuede 13 a 56 años, entre los cuales seincluyeron 10 hombres y 11 mujeres.Los pacientes con retinitis pigmento-sa se clasificaron de acuerdo con elpatrón de herencia de la enfermedadcomo: autosómica dominante (n=4),autosómica recesiva (n=9), sindrómica(n=3), esporádica (n=4) y recesiva li-gada a X (n=2). Los pacientes con sín-drome de Usher se clasificaron segúnla literatura mundial[38], en Usher tipoI (n=2), Usher tipo II (n=6) y Ushertipo III (n=2), y su rango de edad fuede 16 a 48 años. Se excluyeron lossujetos que presentaran enfermedadesautoinmunes de otro tipo. También seestudiaron 20 controles sanos que nopresentaban anomalías oculares en elexamen oftalmológico y que no teníanhistoria familiar de enfermedad ocu-lar (edades: 9 a 60 años). Todos losparticipantes firmaron el respectivoinforme de consentimiento y el pro-yecto fue avalado por el Comité deÉtica de la Facultad de Medicina de laPontificia Universidad Javeriana, y fi-nanciado por Colciencias. En términosgenerales, el diagrama de los proce-sos experimentales se describe en lafigura 3. Además, tuvimos acceso a 18retinas de individuos humanos y 4 debovinos que murieron por causas no

relacionadas con patología ocular. Lasretinas humanas provenían de indivi-duos donantes post mortem a la Cor-poración Banco de Ojos de Colombia(COBANCOL), a quienes, siguiendoel protocolo de donación de órganosde dicha institución, se les tomó simul-táneamente muestra de sangre perifé-rica que fue procesada e incluida comocontrol del sistema autólogo. Los bo-vinos se utilizaron como fuente prin-cipal de antígenos retinianos.

Antígenos

Extractos retinianos

Las retinas humanas y bovinas seobtuvieron en condiciones de asepsiay se conservaron en PBS (phosphatebuffered saline) con suplemento deinhibidores de proteasas de serina parapreservar su capacidad antigénica(PMSF, Sigma, USA) a una tempera-tura de 4 a 8ºC, antes de ser procesa-das en nuestro laboratorio. Las retinasfueron homogeneizadas y fracciona-das por ultrasonido de acuerdo con elprotocolo descrito por Brinkman ycolaboradores[30]. La concentraciónde proteínas de los extractos retinia-nos se determinó por el método delácido bicinconínico y las solucionesresultantes se separaron y congelarona -80ºC, hasta su utilización.

Péptidos

Se prepararon péptidos sintéticos enun ensayo de fase sólida de síntesis

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múltiple. La pureza de los péptidos fuesuperior al 85% de acuerdo con su aná-lisis en HPLC (high performance liquidchromatography) (cromatografía líqui-da de alta eficiencia). El péptido M, des-crito por Yamaki et al.[34] comoderivado del antígeno S bovino (aa 303-320), presenta la siguiente secuencia:DTNLASSTIIKEGIDKTV. El péptido D(aa 352-362), descrito por Gregerson etal.[19], presenta la siguiente secuencia:TEVPFRLMHPQPED. El tercer pép-tido utilizado como control de espe-cificidad en la respuesta inmune invitro, fue derivado de la secuenciade un receptor de estrógenos, el cualpresentaba la siguiente secuencia:KSIQGHNDYMCPATNQCTIDKNRRKSCQACRLRKCYEVGM. Cadapéptido fue disuelto en PBS y esterili-zado por filtración.

Ensayo inmunoadsorbente enzimático(ELISA)

Los extractos proteicos se diluye-ron en solución tampón de carbona-to-bicarbonato para recubrir micropla-cas estériles (Linbro, USA) a unaconcentración de 1 µg/pozo, en incu-bación de una noche a temperaturaambiente. Después de 3 lavados conPBS, las placas fueron utilizadas in-mediatamente para las pruebas ELISAo congeladas a -20ºC para su poste-rior utilización. Los sueros de pacien-tes y controles se añadieron a cadamicropozo, y las placas se incubaronpor 1 hora a 37ºC. Después de 3 a 5lavados con PBS-Tween (0,05%), se

añadió el conjugado correspondiente(anti-IgG humana marcado conperoxidasa) y las microplacas se in-cubaron una vez más por 1 hora a37ºC. Después de lavados repetidos,se añadió el sustrato para la enzimaOPD (O-phenylenediamine dihydro-chloride) y 30 minutos después seagregó una solución de H

2SO

4 (1N)

para detener la reacción. La reacciónpara conocer la concentración de an-ticuerpos contra los antígenos de reti-na en cada pozo de las microplacas,se leyó y cuantificó (intensidad de laluz) en un fotómetro Dynatech 600,con una longitud de onda de 492 nm.

Electrofóresis SDS-PAGE

Las proteínas presentes en los extrac-tos proteicos se separaron según su pesomolecular en geles de poliacrilamidaSDS-PAGE (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis). Losextractos humanos y bovinos se proce-saron de manera independiente e indi-vidual en la electrofóresis (150 voltios/50 mAmp), incluyendo marcadores depeso molecular en cada gel. Las bandasproteicas separadas se pusieron en evi-dencia por coloración con azul deCoomassie.

Inmunoelectrotransferencia(Western blot)

Las bandas de proteínas obtenidasen la electrofóresis se transfirieron apapel de nitrocelulosa en un sándwichcatiónico-aniónico durante 1 hora (260

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voltios/20 mAmp). El papel transferi-do se recortó verticalmente en uno desus extremos y la tira separada se co-loreó con azul de Coomassie para ve-rificar la transferencia.

Elución de proteínas (extracción deproteínas a partir de membranas)

La membrana de nitrocelulosa res-tante se recortó horizontalmente en 5secciones correspondientes a los si-guientes rangos de peso molecular:F1<36 kDa, F2=36-66 kDa, F3=67-116 kDa, F4=117-200 kDa, F5>200kDa. Las áreas resultantes tenían 5 mmde ancho y 2 mm de largo, de acuer-do con las recomendaciones de Lambet al.[36]. Cada sección de nitrocelu-losa se disolvió y esterilizó en dimetilsulfóxido (DMSO) con agitación cons-tante y las partículas resultantes se pre-cipitaron en una solución tampón decarbonato-bicarbonato (0,05 mM,pH=9,6). La suspensión se diluyó enmedio de cultivo estéril RPMI 1640(Sigma, USA), el cual contiene, entreotros componentes, rojo de fenol y L-glutamina libre de bicarbonato desodio. La concentración de proteínasse ajustó a 0,01 µg/µl para utilizarsecomo estímulo antigénico en los aná-lisis de proliferación celular, siguien-do el protocolo descrito por Abou-Zeidet al.[35] y por Lamb et al.[36].

Ensayos de proliferación de linfocitos

Se obtuvieron células mononuclea-res a partir de sangre periférica anti-

coagulada por EDTA en gradiente dedensidad de Ficoll-Hypaque, y seresuspendieron en medio RPMI 1640con suplemento de 10% de suero fetalbovino en una concentración de 106

células/ml.

Los ensayos de proliferación se lle-varon a cabo en microplacas estérilesde 96 pozos de fondo plano, utilizan-do los siguientes estímulos antigéni-cos por separado: 3 µg/100 µl depéptidos sintéticos; 5 µg/100 µl de ex-tractos de retinas humanas o bovinas;2 µg/100 µl de fracciones disueltas (F1-F5); 1,5 µg/100 µl de concanavalina A(ConA) y 1 µg/100 µl de fitohemaglu-tinina (PHA). Las microplacas se in-cubaron por 6 días en 5% CO

2 y 90%

de humedad.

Los antígenos se añadieron en eldía 0 y los mitógenos, en el día 3 delos cultivos correspondientes. En eldía 5 del cultivo, se añadió 1 µCi detimidina tritiada a cada pozo y 18 ho-ras después las células de cada pozoson recolectadas en círculos indepen-dientes de papel de fibra de vidrio.Los círculos se secaron a temperaturaambiente y luego se transfirieron a tu-bos plásticos y su radioactividad se eva-luó en un contador de energía beta(Beckman, USA).

Los resultados se expresaron comoconteos por minuto (CPM). Se consi-deraron positivos los índices de esti-mulación mayores o iguales a 2,0, dato

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umbral obtenido por el método de grá-fico de control con límite de confian-za inferior y superior y el punto decorte de máxima verosimilitud. Estose hizo con base en el índice de proli-feración de cada uno de los experimen-tos realizados con los grupos decontroles sanos, de pacientes conretinitis pigmentosa, de pacientes consíndrome de Usher y de control posi-tivo con el mitógeno concanavalina A(ConA).

Análisis estadísticos

Se corrió una prueba preliminarunivariada de frecuencias simples,para cada grupo de estudio. Luego, seutilizó un análisis bivariado para com-parar la edad (varianza simple) y el sexo(valor alfa de ji al cuadrado =0,05). Elpunto de corte para determinar el ín-dice de estimulación se definió por elmétodo de gráfico de control con lí-mite de confianza inferior y superior,y el punto de corte de máxima verosi-militud, estableciéndose en 2,0. Lasdiferencias obtenidas en los índices deestimulación de cada grupo estudia-do se evaluaron por la prueba deKruskal-Wallis. Un análisis final pa-reado múltiple indicó diferencias es-tadísticas con un valor alfa de 0,016(0,05 en 3 grupos). La base de datosse elaboró en el programa LotusWorks y el análisis de esta informa-ción se hizo en el programa Stata ver-sión 7.0.

Resultados

Para la población incluida en esteestudio, el análisis bivariado no mos-tró diferencias estadísticamente signi-ficativas en edad (p=0,41) entre lostres grupos, ni según sexo (p=0,58).Dieciocho retinas humanas pertene-cientes a nueve individuos (edad me-dia de 30,4 años), y 4 retinas bovinasde 2 machos adultos, se prepararonpara utilizarlas como estímulo anti-génico en pacientes y controles. Lasretinas humanas y bovinas fueron con-vertidas a soluciones de 4 a -16 mg/mly 30-40 mg/ml, respectivamente, y lue-go, reunidas en una solución conjun-ta (pool) humana o bovina de 0,5 a 1mg/ml. Antes de hacer las solucionesconjuntas, tanto en humanos como enbovinos, se analizaron cada uno de losextractos sonicados de manera inde-pendiente en un gel de poliacrilamida(SDS-PAGE). Algunas de las prepara-ciones individuales se presentan en lafigura 1.

La especificidad de los anticuerpospresentes en los sueros de pacientes ycontroles se analizó con pruebasELISA. A pesar de encontrarse clarasreactividades tanto en los ELISA comoen las inmunoelectrotransferencias, nose encontraron diferencias cualitativaso cuantitativas sistemáticas entre pa-cientes y controles en las reaccionesfrente a extractos totales. Al analizarlas especificidades de los anticuerpos

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en pruebas de inmunoelectrotransfe-rencia, no se encontraron patrones di-ferenciales que pudieran asociarse ala enfermedad ocular.

Analizamos luego la especificidadde la respuesta inmune celular (linfo-cito T) utilizando extractos totales ysus fracciones disueltas, tanto como lospéptidos sintéticos derivados de la se-cuencia del antígeno S, un reconoci-do inmunógeno en sistemas experi-mentales de enfermedades ocularestales como la uveítis autoinmune. Lastablas 1, 2 y 3, y las figuras 2a, 2b y2c, muestran los índices de estimula-ción en los tres grupos experimenta-les incluidos en nuestro trabajo: retinitispigmentosa (21 pacientes), síndromede Usher (10 pacientes) y controlessanos (20 individuos). Los resultadosobtenidos del análisis de las diferen-tes variables en los diferentes gruposde estudio frente a cada antígeno o

Figura 1. Corrido electroforético (SDS-PAGE) de extractos de retinas humanas.

Tabla 1Índices de proliferación de linfocitos de pacientes con retinitis pigmentosa.

Los pacientes fueron clasificados en dos categorías: 1- respondedores (negro)y 2- no respondedores (blanco)

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Figura 2a. Reactividad inmune celular frente a antígenos retinianos y mitógenos enpacientes con retinitis pigmentosa, expresada en índices de estimulación. ConA:

concanavalina; PHA: fitohemaglutinina.

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Tabla 2Índices de proliferación linfocitaria en pacientes con síndrome de Usher.

Los pacientes fueron clasificados en dos categorías: 1- respondedores (negro)y 2- no respondedores (blanco). ConA: concanavalina; PHA: fitohemaglutinina.

Figura 2b. Reactividad inmune celular frente a antígenos retinianos y mitógenos enpacientes con síndrome de Usher, expresada en índices de estimulación. ConA:

concanavalina; PHA: fitohemaglutinina.

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Tabla 3Índices de proliferación linfocitaria en controles sanos. Los controles fueron clasificados

en dos categorías: 1- respondedores (negro)y 2- no respondedores (blanco).

ConA: concanavalina); PHA: fitohemaglutinina.

Figura 2c. Reactividad inmune celular frente a antígenos retinianos y mitógenos encontroles sanos, expresada en índices de estimulación. ConA: concanavalina); PHA:

fitohemaglutinina.

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inmunógeno, muestran una reactivi-dad preferencial de los linfocitos a losextractos totales, frente a las fraccio-nes F1 y F5, y frente al péptido D.También encontramos una clara defi-ciencia en la respuesta a mitógenos enambos grupos de pacientes (retinitispigmentosa y síndrome de Usher), alcompararlos con los controles sanos(p=0,05 y p=0,12, respectivamente)(tabla 4).

Para evaluar la reproducibilidad delos triplicados de cada una de las va-riables, se aplicó un análisis de varianzaANOVA con un nivel de significanciade alfa de 0,05, utilizando la pruebaexacta de Fisher por el pequeño tama-ño de los datos analizados y, en casode no encontrar homocedasticidad, seremplazó el ANOVA por la prueba de

Kruskal-Wallis, obteniéndose unap>0,05, lo cual validó nuestros análi-sis triplicados de cada sistema de res-puesta antigénica in vitro (tabla 5). Lasrespuestas significativas frente a dife-rentes estímulos se compararon en am-bos grupos de pacientes frente a loscontroles sanos, y se encontraron cla-ras diferencias en la especificidad dela respuesta inmune. La tabla 4 mues-tra una síntesis de las reactividades ce-lulares frente al extracto total de retinaen los 3 grupos experimentales, y latabla 6 muestra los resultados de lacomparación de las medianas de larespuesta diferencial de proliferaciónen los tres grupos experimentales fren-te a cada fracción disuelta a partir dela separación electroforética del extrac-to total, lo cual confirma la asociaciónde la inmunogenicidad de los pépti-

Tabla 4Reacción media de cada grupo experimental frente a cada tipo de estímulo antigénico.El promedio de los índices de estimulación de las respuestas frente a los antígenos más

inmunogénicos, se incluye entre paréntesis

Antígeno RP (ie) SU (ie) Control ( ie)

Extracto humano 2.919 (2,2) 4.056 (2,5) 506 (0,7)Extracto bovino 2.777 2.104 806Péptido 1 (M) 3.430 (2,7) 4.256 (2,9) 927 (1,6)Péptido 2 (D) 2.858 (2,0) 3.926 (2,6) 884 (1,2)Péptido 3 2.158 2.152 702Fracción 1 2.033 (1,8) 3.206 (1,0) 641 (1,0)Fracción 2 2.423 2.643 710Fracción 3 1.753 1.944 849Fracción 4 1.853 1.856 1154Fracción 5 2.794 (1,9) 1.219 (0,9) 665 (1,2)ConA 8.258 (6,4) 15.29 (3,9) 14.01 (26,1)PHA 10.71 (8,1) 19.73 (8,0) 18.93 (22,3)

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dos y de las fracciones disueltas conlos diferentes tipos de cada enferme-dad analizada.

Se analizaron, además, controles dereacción autoinmune, utilizando sangrede donantes cadavéricos en fase tem-prana post mortem, con el fin de ex-cluir la posibilidad de una reacciónfisiológica de base en cualquier tipo deindividuo contra antígenos retinianosen un sistema autólogo, y también, conel fin de excluir la posibilidad de unareacción heteróloga contra componen-tes del medio de cultivo. Ninguno delos sistemas de reacción autóloga oheteróloga mostró niveles significativosde respuesta de proliferación. Los ín-

dices de estimulación en los diferentessubtipos clínicos de la retinitis pigmen-tosa difieren y parecen ser mayores enlos tipos síndrome, esporádico yrecesivo, que en los tipos ligados a X yautosómico dominante (tabla 7a). Losíndices de estimulación en los diferen-tes tipos de síndrome de Usher no pu-dieron asociarse a sus diferentessubtipos clínicos (tabla 7b).

Discusión

La heterogeneidad clínica en lasenfermedades retinianas no ha sido biensustentada, hasta el momento, en me-canismos moleculares definitivos. Sinembargo, ésta implica que tanto el am-

Tabla 5Análisis de validez de los triplicados frente a cada estimulación antigénica en uno

de los individuos incluidos en la investigación

KW: Kruskal-Wallis; F: prueba exacta de Fisher.

Estímulo Test gP

Medio de cultivo (a) KW= 0,46 0,8Extracto humano KW= 1,15 0,56Extracto bovino F= 0,33 0,72Péptido 1 (M) F= 0,12 0,89Péptido 2 (D) F= 0,39 0,67Péptido 3 KW= 0,4 0,82Medio de cultivo (b) F= 0,27 0,77Fracción 1 KW= 0,33 0,85Fracción 2 KW= 0,04 0,98Fracción 3 F= 0,16 0,85Fracción 4 KW= 0,09 0,96Fracción 5 KW= 0,35 0,84ConA F= 0,29 0,75PHA KW= 0,14 0,93

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Tabla 6Significancia de las reactividades celulares frente a algunos de los antígenos

estimulantes en los diferentes grupos experimentales

Antígeno RP vs. Control SU vs. Control RP vs. SU

Extracto humano P= 0,0025 P= 0,015 P> 0,016Péptido 1 (M) P> 0,016 P> 0,016 P> 0,016Péptido 2 (D) P> 0,016 P= 0,011 P> 0,016Fracción 1 P= 0,0041 P> 0,016 P> 0,016Fracción 5 P= 0,012 P> 0,016 P> 0,016ConA P= 0,0004 P= 0,008 P> 0,016PHA P= 0,005 P> 0,016 P> 0,016

Tabla 7aÍndices de estimulación en diferentes subtipos clínicos de retinitis pigmentosa.

ConA: concanavalina; PHA: fitohemaglutinina; AR: autosómica recesiva;S: síndrome; E: esporádica; LX: ligada al sexo)

Subtipo RP Extracto Péptido 2 Fracción 1 ConA PHAhumano

Síndrome 1/2 1/2 2/2 2/2 1/2Esporádica 1/4 2/4 2/4 3/4 2/4Autosómica dominante /4 0/4 0/4 4/4 4/4Ligada a X 0/2 0/2 0/2 0/2 2/2Autosómica recesiva /9 4/9 3/9 6/9 3/9

Tabla 7bÍndices de estimulación en diferentes subtipos clínicos de síndrome de Usher.

Síndrome de Usher Extracto Péptido 2 Fracción 1 ConA PHAhumano

Tipo I 1/2 1/2 1/2 2/2 2/2Tipo II 3/6 3/6 0/5 3/6 3/6Tipo III 1/2 1/2 0/2 1/2 2/2

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biente como un probable trasfondogenético pueden jugar un papel decisi-vo en su expresión fenotípica. Una delas razones para la complejidad de estasasociaciones es la amplitud implícita enla definición de las “degeneracionesretinianas”. Este término incluye enfer-medades periféricas de la retina, comola retinitis pigmentosa y la ceguera noc-turna, enfermedades de la retina cen-tral, como la degeneración macular, yvarias otras en las que el patróndegenerativo es muy variable.

La retinitis pigmentosa, por su par-te, es también genéticamente heterogé-nea e incluye patrones de herenciaautosómico dominante (20% a 25%),generalmente asociada con mutacionesen los genes de rodopsina o periferina,autosómico recesivo (20%) y recesivoligado a X (5% a 10%), o bien puedeencontrarse aislada en pacientes sin fa-miliares afectados (45% a 50%)[5]. Enla población general, la retinitis pig-mentosa presenta una frecuencia com-binada de 1 en 5.000 en la poblaciónmundial[5]. La retinitis pigmentosapuede presentar alteraciones específicaso no hacerlo, lo que permite hablar dedos grandes grupos: la retinitis pigmen-tosa como hallazgo único o sindrómico(aislada, esporádica) o la asociada aotras manifestaciones conformando al-gún síndrome como, por ejemplo, elsíndrome de Usher, caracterizado porsordera bilateral congénita no progre-siva[37,38]. La clasificación genéticaes dispendiosa y difícil, debido a la

existencia de numerosos casos aislados,a su “penetrancia” reducida y a unaconsiderable variabilidad en la expre-sividad de la enfermedad, y al hechode que se han reportado ya más de 100genes que pueden estar asociados a laenfermedad[5].

En la población colombiana, de lacual provienen los casos incluidos enel presente estudio (21 pacientes conretinitis pigmentosa y 10 pacientes consíndrome de Usher), se han reportadolas siguientes frecuencias de acuerdocon su patrón de herencia: autosómicadominante (19%), autosómica recesiva(43%), recesiva ligada a X (9,5%) y,también, grupos de herencia de tipoesporádico (19%) y tipo síndrome(9,5%)[38,39]. La heterogeneidad clí-nica fue también evidente en la respues-ta inmune cuando se evaluaron los pa-cientes con retinitis pigmentosa ysíndrome de Usher. Aunque no se en-contró un patrón único de reactividadde anticuerpos en estos pacientes, fueevidente que los sueros de cada uno deellos reaccionaban contra antígenos di-ferentes en los experimentos de inmu-noelectrotransferencia. Los antígenosseleccionados en anteriores estudiospara definir la participación del siste-ma inmune en la patología, son anali-zados en función de su inmunogenici-dad serológica, pero es claro que lasproteínas que son inmunodominantespara células B no necesariamente pre-sentan el mismo comportamiento paracélulas T.

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La activación y el número elevadode linfocitos T, un incremento en laexpresión del receptor de la IL-2 y unpotencial papel de los linfocitos T CD8en reacciones de autoinmunidad a reti-na, sugieren mecanismos inmunes ce-lulares que pueden contribuir a lapatogénesis de alteraciones degenera-tivas de retina[4,42]. Es así como bus-camos evaluar en este estudio el estadoinmunológico celular de cada pacien-te, y logramos determinar reaccionesproliferativas asociadas a ambos tiposde la enfermedad y a sus respectivossubtipos, tal y como se ha demostradoen modelos animales equivalentes[40].Las reactividades más fuertes y especí-ficas in vitro se dirigían contra el extrac-to retiniano humano y se presentarondiferencias estadísticamente significa-tivas entre los pacientes con retinitispigmentosa o con síndrome de Ushery el grupo control, en el cual ningúnindividuo respondió in vitro a este es-tímulo antigénico, mientras que lamayoría de los controles respondie-ron de manera clara al estímulo conmitógenos.

Otros investigadores han encontra-do resultados similares en huma-nos[25,28]. En éstos se había reporta-do una respuesta celular específicaaumentada en la retinitis pigmentosa alcompararla con otro tipo de entidadesoculares y con controles normales, con-cluyendo que el sistema inmune pue-de contribuir a estos procesos degene-rativos y, posiblemente, participar en

mecanismos de autoinmunidad, ya seacomo iniciadores o como potenciadoresde la patología, a partir de una posibleruptura del equilibrio anatómico endonde normalmente son liberados losantígenos secuestrados[24,25].

Los péptidos 1 y 2 también indu-jeron una respuesta mayor de proli-feración en los pacientes que en loscontroles. Estas secuencias correspon-den a los sitios inmunodominantes delantígeno S bovino, proteína retinianainvolucrada en procesos visuales conuna homología a la humana del 80%.Dentro de esta proteína se han descri-to tres sitios inmunopatogénicos de-nominados péptidos M, N y K, loscuales han demostrado la inducción deuveítis alérgica experimental en ratasLewis, cobayos y micos.

Una de las secuencias utilizadas ennuestro estudio correspondió al sitiodenominado M, el cual presenta unasecuencia idéntica en los antígenos Stanto de humano como de bovino[19].La evaluación de la respuesta frente afracciones proteicas demostró unamayor respuesta a la fracción F1, quecontiene proteínas en un rango de 0 a36 kDa. Este hallazgo parece contra-decir los informes clásicos en los quese reporta al antígeno-S de 45 kDacomo el principal inmunógeno, perocorresponden bien a la propuesta deGery y Streinlein[9], quienes reporta-ron un antígeno inmunodominante de23 kDa en casos de uveítis.

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El hecho de encontrar en nuestroestudio reactividades específicas mayo-res frente a algunas fracciones que fren-te al extracto global, se puede explicarpor la exposición de epítopos que pue-den encontrarse enmascarados en laspreparaciones iniciales y que se reve-lan en las preparaciones derivadas.También en el caso de los péptidos seconsidera que en la proteína de origenpueden existir efectos alostéricos queimpidan el reconocimiento de éstos ensu estado natural. En este último caso,la degradación in vivo de la proteínapor parte de células del tejido corres-pondiente, sería la fuente del péptidoinmunogénico. Otro hallazgo de inte-rés en nuestro modelo es la presenta-ción de una clara respuesta inmunefrente a estímulos mitogénicos, talescomo la ConA y la PHA en los contro-les, pero ésta es comparativamente de-ficiente en pacientes con retinitis pig-mentosa y síndrome de Usher. Enefecto, solamente 20% a 40% de lospacientes mostraban una respuesta im-portante (IE> 7,0) frente a estos estí-mulos policlonales, con una media de1,9 y 6,4 ó 3,9 y 8, respectivamente,mientras que 70% a 80% de los con-troles mostraron gran proliferaciónfrente a los mismos estímulos, conmedias de 27,5 y 22,3 para la ConA yla PHA, respectivamente. En conse-cuencia, las respuestas específicas delas células mononucleares de los pa-cientes resultan muy significativas ydebe considerarse el compromiso glo-bal de la respuesta inmune a mitóge-

nos en estas enfermedades, tal comose ha reportado en trabajos previos,como una característica de la retinitispigmentosa[28]. Uno de los principa-les aportes de la presente investigaciónfue el reporte de la asociación entre res-puesta inmune celular disminuida endos de los subtipos clínicos de la retinitispigmentosa, la forma autonómica do-minante y la ligada a X. Este hecho tie-ne, al menos, un antecedente en el re-porte de Chant y colaboradores, porcuanto en éste ningún paciente con laforma dominante respondió in vitro alextracto retiniano, y sólo 1 de 6 con laforma ligada a X presentó una activi-dad blastogénica débilmente positi-va[25]. Una respuesta inmune positivacontra la retina en los otros subtipospodría explicar la gravedad de la dege-neración retiniana en estos pacientes y,en contraste, una reacción inmune ne-gativa podría ser el fundamento de lacaracterística progresión lenta en lossubtipos ligados a X.

El estado inmunológico de los pa-cientes con retinitis pigmentosa o sín-drome de Usher podría, en consecuen-cia, ser evaluado en experimentoscomplementarios en otras poblacionespara definir su utilidad en la clasifica-ción clínica de este tipo de enfermeda-des y, eventualmente, para introducirnuevas aproximaciones terapéuticas,como la utilización de agentes inmu-nosupresores cuyos beneficios se handemostrado ya en el modelo de ra-tón[41,42], que podrían controlar el

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desbordamiento inmunitario y su co-rrespondiente efecto deletéreo en lacámara ocular.

Conclusiones

Se encontraron reacciones significa-tivas frente a antígenos retinianos, inclu-yendo péptidos y fracciones derivadasde éstos, y se determinaron diferenciasen la especificidad de la respuesta celu-lar en función del tipo de la enfermedadclínica de cada paciente. Nuestros ha-llazgos indican que los pacientes conretinitis pigmentosa, según su clasifi-cación genética, presentan inmunidadactiva frente a los extractos retinianostotales o no lo hacen, así como frente ala fracción diluida F1, la cual compren-de antígenos de bajo peso molecular(<36 kDa), y también, frente a los pépti-dos M y D. Los pacientes con algunossubtipos genéticos de retinitis pigmen-tosa presentaron una correlación entreel tipo de la enfermedad y el grado deinmunorreactividad frente a los antíge-nos utilizados en estos experimentos.

Agradecimientos

Los autores agradecen especialmen-te a los pacientes que participaron enel estudio, así como a los miembros deCobancol y del Instituto de GenéticaHumana que colaboraron amablemen-te en el proyecto. También expresan sugratitud a sus instituciones de origen:la Pontificia Universidad Javeriana y elHospital Militar Central.

Conflicto de intereses

Los autores manifiestan expresa-mente que durante la realización delpresente trabajo no existió conflicto deinterés alguno que pudiera afectar losresultados obtenidos.

Financiación

El presente proyecto fue financiadopor Colciencias No. 1203-05-003-92.

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